WO2013151314A1 - 비멘틴을 포함하는 탈모 억제 또는 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

비멘틴을 포함하는 탈모 억제 또는 발모 촉진용 조성물 Download PDF

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WO2013151314A1
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hair
protein
mentin
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nucleic acid
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PCT/KR2013/002743
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정지형
장양수
장홍선
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연세대학교 산학협력단
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    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inhibiting hair loss or promoting hair growth comprising bimentin.
  • Human hair is primarily responsible for the protective function to protect the scalp from external stimuli such as ultraviolet rays and aesthetic functions to express the external image of the individual.
  • external stimuli such as ultraviolet rays and aesthetic functions to express the external image of the individual.
  • hair loss is frequently caused by natural factors such as environmental pollution, strong ultraviolet rays, and physiological factors such as stress and hormonal imbalance. Therefore, the need for materials for the prevention and treatment thereof is urgently needed.
  • Hair follicles the physiological organs in the body that make up the hair, form the hair during the postnatal development, the anagen phase in which the hair grows actively, the catagen phase in which the hair degenerates, and the hair fall out.
  • the hair cycle is divided into a telogen phase, an exogen phase in which hair loss is maintained, and is involved in hair growth, maintenance, and dropout.
  • the activity of the hair follicles is caused by dermal papilla cells, in particular the proliferation and differentiation of the dermal papilla cells is primarily involved in the progress of the hair growth cycle and hair formation (Botchkarev VA, Kishimoto J, Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions).
  • the prolonged growth phase by inhibiting the proliferation of the dermal papilla cells or the inhibition of cell death and the shortening of the degenerative stage, resting period, and alopecia will be improved and treated. It is feed.
  • cell division and migration near the nipple are closely related to the growth of the hair. During the growth phase, new hair is generated from the nipple, which is activated by various cytokines and hormones, resulting in cell migration to the nipple.
  • growth factors such as vertican, IGF-1, and VEGF are most strongly expressed in the growth phase and decreased in the degenerative and resting phases to induce the growth of dermal papilla cells and to maintain the hair growth phase.
  • Vertican a versatile extracellular matrix proteoglycan in cell biology.Current Opinion Cell Biol 14, 617-623, 2002, Kulessa H, Turk G, Inhibition of Bmp signaling affects growth and differentiation in the anagen hair follicle, EMBO J 19, 6664-6674, 2000).
  • minoxidil and finasteride which are currently approved by the FDA, have side effects such as systemic hair growth and decreased sexual function, and the specific mechanism of action of minoxidil is not clear. Therefore, it is necessary to develop a biological material that promotes proliferation of dermal papilla cells in hair follicles and increases expression of growth factors while having less concern about side effects.
  • the present inventors have completed the present invention by experimentally confirming that the non-mentin protein promotes the growth and migration of dermal papilla cells and increases the expression of growth factors such as IGF-1.
  • an object of the present invention is to provide a new use of non-mentin to promote the growth and migration of dermal papilla cells and to increase the expression of growth factors such as IGF-1.
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising a non-mentin protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising a fusion protein combined with a non-mentin protein and a protein delivery domain as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising a nucleic acid encoding a non-mentin protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising a nucleic acid encoding a fusion protein combined with a non-mentin protein and a protein delivery domain as an active ingredient.
  • the present invention is a hair loss prevention or hair growth comprising at least one selected from the group consisting of non-mentin protein, protein delivery domain-non-mentin fusion protein and a nucleic acid encoding the protein as an active ingredient Provide accelerators.
  • the present invention is a hair loss prevention or hair growth comprising at least one selected from the group consisting of non-mentin protein, protein delivery domain-non-mentin fusion protein and the nucleic acid encoding the protein as an active ingredient Providing promotion cosmetics.
  • non-mentin promotes the growth and migration of dermal papilla cells and expression of growth factors, and can be usefully used as a drug or cosmetic material for the purpose of inhibiting hair loss and treating hair growth with this effect.
  • Figure 1 shows a cleavage map of the pHis / TAT- non-mentin expression vector.
  • Figure 2 is transformed in Escherichia coli by introducing a non-mentin gene of human in a pHis / TAT expression vector and stained with Coomassie brilliant blue of the protein delivery domain-non-mentin recombinant protein obtained through protein expression and purification One result is shown.
  • 3 is a cell proliferation ELISA analysis using BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) for the degree of cell proliferation when the protein delivery domain-non-mentin fusion protein is treated by concentration in the dermal papilla cells isolated from the rats. It is a graph obtained through [1, control; 2, non-mentin 10 nM treatment; 3, non-mentin 100 nM treatment; 4, non-mentin 1 uM treatment; 5, non-mentin 10 uM treatment; 6, GFP 1 uM treatment].
  • Figure 4 shows the result of measuring the degree of cell migration when treated with protein delivery domain-non-mentin fusion protein concentration to the dermal papilla cells [wound healing assay] [1, immediately after wound healing; 2, non-mentin 10 nM treatment; 3, non-mentin 100 nM treatment; 4, non-mentin 1 uM treatment; 5, non-mentin 10 uM treatment; 6, GFP 1 uM treatment].
  • Figure 5 shows the results of the reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis of the expression levels of growth factors IGF-1 and VEGF by treating the protein delivery domain-non-mentin fusion protein to the dermal papilla cells [lane 1 , Control; Lane 2, non-mentin 10 nM treatment; Lane 3, non-mentin 100 nM treatment; Lane 4, non-mentin 1 uM treatment].
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • Figure 6 is a photograph confirming the hair growth effect by applying the TAT- non-mentin fusion protein to the rat hair root removed.
  • FIG. 7 is a photograph showing the hair growth effect after saline, TAT-GFP, minoxidil, TAT- non-mentin fusion protein of Example 1 were respectively treated in a mouse model from which hair root was removed.
  • Figure 8 was treated with saline, TAT-GFP, minoxidil, TAT- non-mentin fusion protein of Example 1 in the mouse model from which the hair root was removed, and after 23 days, the mouse head, torso, tail, etc. It is the photograph which photographed the thickness of the hair of the site (up) and the graph which shows the thickness of the hair of the torso (bottom).
  • the present invention is characterized by the fact that non-mentin can promote the proliferation of papillary cells and increase the expression of growth factors, thereby affecting the hair cycle and preventing and treating hair loss diseases.
  • non-mentin shows the effect of promoting the growth of dermal papilla cells.
  • non-mentin significantly increases dermal papilla cell proliferation.
  • the papilla cells experimental group treated with the protein delivery domain-non-mentin fusion protein showed a significant effect on the dermal papilla cell proliferation compared to their control group, and showed an increase in cell proliferation efficiency up to 300% or more compared to the control group (see FIG. 2).
  • When measuring the papillary cell proliferation effect of each non-mentin protein concentration showed the greatest effect at 1 uM concentration (see Figure 2).
  • the present invention shows the cell migration activation effect of non-mentin dermal papilla cells.
  • non-mentin significantly increases cell migration of dermal papilla cells.
  • the dermal papilla cells treated with the protein transfer domain-non-mentin fusion protein showed a significant effect on the dermal papilla cell migration compared to their control group (see FIG. 3).
  • the present invention shows the effect of promoting the expression of growth factor IGF-1 in non-mentin dermal papilla cells.
  • non-mentin increases the expression of growth factor IGF-1 in dermal papilla cells.
  • the dermal papilla cells treated with the protein transfer domain-non-mentin fusion protein showed an increase in IGF-1 expression compared to their controls (see FIG. 4).
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising non-mentin protein as an active ingredient.
  • the non-mentin protein included in the pharmaceutical composition of the present invention may be derived from a mammal including a human, and according to the individual to be treated, the origin of the non-mentin may be appropriately selected.
  • the non-mentin of the present invention may be derived from a human, and the amino acid sequence of the non-mentin derived from humans is known (SEQ ID NO: 1: GenBank acession no. NP — 003371.2).
  • non-mentin protein included in the pharmaceutical composition of the present invention may include both natural or recombinant non-mentin proteins or proteins having physiological activities substantially equivalent thereto. Proteins having substantially equivalent physiological activity include functional equivalents and / or functional derivatives of naturally occurring proteins or recombinant non-mentin proteins.
  • the “functional equivalent” is an amino acid sequence variant in which some or all of the naturally occurring protein amino acids are substituted, or a part of the amino acids are deleted or added, and at least 70%, preferably 80% or more, more preferably, with the non-mentin protein.
  • it refers to a protein having a sequence homology of 90% or more and exhibiting substantially homogeneous physiological activity with non-mentin protein.
  • the “functional derivative” refers to a protein in which some chemical structures have been modified to increase or decrease physicochemical properties while maintaining the basic skeleton and physiological activity of the non-mentin protein.
  • functional derivatives include proteins whose structure has been altered to alter the stability, shelf life, volatility or solubility of the non-mentin protein.
  • non-mentin protein represented by SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising a fusion protein combined with a non-mentin protein and a protein delivery domain as an active ingredient.
  • the protein delivery domain may include a trans-activating transcriptional activator (TAT) derived from human immunodeficiency virus type I (HIV-1); Antp (Antennapedia or penetratin) peptide, which is an antennapedia Homeodomain of Drosophila; Mutant phenotype protein 1 (Mph-1) of the mouse transcription factor, VP22 (viral protein 22) of Herpes simplex virus (HSV-1); Human protamine P4 (HP4) from herring protamine; Transportan, MAP (Model amphipathic peptide), TP10 (Transportan-10), CTP (Cardiac targeting peptide), K5-FGF (K5-fibroblast growth factor, AAVALLPAVLLALLP [SEQ ID NO: 11]), HAP-1 (Huntingtin) associated protein 1, SFHQFARATLAS [SEQ ID NO: 12]), 293P-1 (SNNNVRPIHIWP [SEQ ID NO: 13]), CADY (cystea a
  • TAT- non-mentin fusion protein SEQ ID NO: 2 was used.
  • the PTD-non-mentin fusion protein of the present invention obtains DNA fragments from non-mentin genes by PCR and then introduces them into plasmid vectors (such as prokaryotic expression vector pET or eukaryotic expression vector pcDNA) containing PTD. After transforming the cells to express the protein, it can be prepared through an appropriate protein purification process.
  • plasmid vectors such as prokaryotic expression vector pET or eukaryotic expression vector pcDNA
  • the present invention also includes a composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising a nucleic acid encoding a non-mentin protein or a nucleic acid encoding a fusion protein in which a non-mentin protein and a protein delivery domain are bound.
  • Nucleic acids encoding the non-mentin protein or PTD-non-mentin fusion protein include DNA or RNA.
  • the nucleic acid encoding the non-mentin protein may be derived from a mammal, more preferably a human.
  • the human nonmentin gene is known (SEQ ID NO: 3, GenBank accession no. BC000163).
  • the nucleic acid encoding the PTD-non-mentin fusion protein includes a gene represented by SEQ ID NO: 4.
  • the nucleic acid is introduced into an expression vector, such as a plasmid or viral vector, by known methods and then the expression vector is expressed phenotypicly by infection or transduction by various methods known in the art. Can be introduced.
  • an expression vector such as a plasmid or viral vector
  • the plasmid expression vector is a method of delivering plasmid DNA directly to human cells by FDA's approved gene transfer method for human use (Nabel, E. G., et al., Science, 249: 1285-1288, 1990). Plasmid DNA has the advantage that it can be homogeneously purified unlike viral vectors.
  • mammalian expression plasmids known in the art can be used as the plasmid expression vector that can be used in the present invention.
  • mammalian expression plasmids known in the art can be used.
  • pET, pcDNA, pRK5 European Patent No. 307,247)
  • pSV16B International Patent Publication No. 91/08291
  • pVL1392 PharMingen
  • the pHis / TAT plasmid prepared by the present team was used.
  • Plasmid expression vectors comprising the nucleic acid are methods known in the art, such as, but not limited to, transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, Calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroinvasion It can be introduced into tumor cells by electroporation, gene guns and other known methods for introducing DNA into cells (Wu et al., J. Bio. Chem., 267: 963-). 967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263: 14621-14624, 1988). Preferably, transient transfection methods can be used.
  • viral expression vectors including the nucleic acid include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, adenoviruses, herpes viruses, avidoxviruses, and the like.
  • the retroviral vector is constructed such that all of the viral genes have been removed or altered so that non-viral proteins are made in the cells infected by the viral vector.
  • the main advantages of retroviral vectors for gene therapy are to deliver large quantities of genes in cloned cells, to correctly integrate genes transferred into cellular DNA, and to not cause subsequent infections after gene transfection (Miller, AD, Nature). , 1992, 357: 455-460).
  • FDA-certified retroviral vectors were prepared using PA317 amphoteric retrovirus package cells (Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6: 2895-2902, 1986).
  • Non-retroviral vectors include adenoviruses as mentioned above (Rosenfeld, MA, et al., Cell, 68: 143-155, 1992; Jaffe, HA et al., Nature Genetics, 1: 372- 378, 1992; Lemarchand, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6482-6486, 1992).
  • the main advantage of adenoviruses is that they carry large amounts of DNA fragments (36 kb genomes) and have the ability to infect non-replicating cells with very high titers.
  • Herpes viruses can also be usefully used for human gene therapy (Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1: 379-384, 1992).
  • suitable known viral vectors can be used in the compositions of the present invention.
  • composition for inhibiting hair loss and promoting hair growth may be prepared as a pharmaceutical composition or a cosmetic composition, and may be prepared as a medicine or cosmetics, and when prepared as a medicine, orally or intravenously, subcutaneously, intranasally or intraperitoneally. It is administered quadrature. Oral administration also includes sublingual application. Parenteral administration includes injection and drip methods such as subcutaneous injection, intramuscular injection and intravenous injection.
  • composition comprising the non-mentin protein, PTD-non-mentin fusion protein or nucleic acid encoding the protein as an active ingredient according to the present invention may be prepared and administered in the form of various formulations by further including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be prepared and administered in the form of various formulations by further including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition which is physiologically acceptable and does not cause an allergic reaction or similar reaction, such as gastrointestinal disorders, dizziness or the like, when administered to a human.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments and flavoring agents for oral administration, and in the case of injections, buffers, preservatives, analgesics Solubilizers, isotonic agents and stabilizers can be used in combination, and in the case of topical administration agents, bases, excipients, lubricants and preservatives can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration in the case of oral administration, it may be prepared in the form of tablets, tpoky, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, may be prepared in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared according to techniques commonly used in the form of various formulations.
  • Hair loss prevention or hair growth promoting composition according to the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the 'pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment. Effective dose levels are well known in factors such as disease type, severity, age, sex, drug activity, drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, drugs used concurrently, and other medical fields in a patient. It can be determined according to the factor.
  • the composition of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents.
  • the active ingredient preferably comprises 0.01 to 30 parts by weight, more preferably 0.1 to 20 parts by weight based on 100 parts by weight of the total hair loss prevention or hair growth promoting composition.
  • the present invention may include a hair loss prevention or hair growth promoting agent comprising at least one selected from the group consisting of a non-mentin protein, a protein delivery domain-non-mentin fusion protein, and a nucleic acid encoding the protein.
  • the present invention may include a cosmetic for preventing hair loss or promoting hair growth comprising at least one selected from the group consisting of a non-mentin protein, a protein delivery domain-non-mentin fusion protein, and a nucleic acid encoding the protein.
  • the cosmetics of the present invention further contain a cosmetically acceptable carrier to be prepared in conventional formulations such as creams, lotions, tonics, sprays, aerosols, oils, solutions, suspensions, gels, ointments, emulsions, waxes, pastes and the like.
  • a cosmetically acceptable carrier to be prepared in conventional formulations such as creams, lotions, tonics, sprays, aerosols, oils, solutions, suspensions, gels, ointments, emulsions, waxes, pastes and the like.
  • Cosmetically acceptable carrier to be prepared in conventional formulations such as creams, lotions, tonics, sprays, aerosols, oils, solutions, suspensions, gels, ointments, emulsions, waxes, pastes and the like.
  • the composition of the present invention usually contains a base, and other components generally used as cosmetic raw materials may be appropriately blended as necessary.
  • the base of the composition of the present invention may be used as long as
  • composition of the present invention examples include, but are not limited to, surfactants, emulsifiers, thickeners, preservatives (eg, methyl paraoxybenzoate), antioxidants, fragrances, and the like.
  • the cosmetics of the present invention may include components that may serve to supply nutrients to hair follicles or hair growth promoting auxiliary components that are commonly used.
  • vitamins, amino acids, animal and vegetable oils, sodium chloride And the like but are not limited to these. Their amount is preferably 0.0001 to 10% by weight, in particular 0.01 to 1% by weight of the total composition.
  • the vitamins include, but are not limited to, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, niacin (nicotinic acid), vitamin C, vitamin E, sodium pantothenate, potassium pantothenate, biotin H (vitamin H), and the like.
  • Amino acids include, but are not limited to, waveguides.
  • Animal and vegetable oils include, but are not limited to, horse oil, egg oil, olive oil, camellia oil, rapeseed oil, sesame oil, germ oil, and the like.
  • the cosmetic of the present invention can be used by a method such as applying or spreading directly on the hair or the scalp.
  • Hair to which the composition of the present invention is applied includes hair follicles and hair follicles of the head, hair and eyelashes, and eyelashes, beards, armpits, pubic hair, and all parts of the hair root and hair follicles throughout the body. Therefore, the present invention hair tonic, hair lotion, hair cream, hair spray, hair mousse, hair gel, hair conditioner, hair shampoo, hair rinse, hair pack, hair treatment, eyebrow hair regrowth agent, eyelash regrowth agent, eyelash nutrient, pet shampoo , Pet rinse, and the like.
  • the protein delivery domain-non-mentin protein used in the present invention was prepared by recombinant protein expression and purification using a pHis / TAT expression vector (Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun., 363, 399-404). Was done.
  • PCR fragments were obtained by DNA fragments (SEQ ID NO: 3), cut into respective restriction enzymes (BamHI / SalI), and put into a pHis / TAT expression vector to prepare a recombinant expression vector pHis / TAT-Vimentin [FIG. ) Was transduced.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thio-galactoside
  • SEQ ID NO: 2 protein-transfer domain-nonmentin fusion protein
  • Example 2 Proliferation effect of dermal papilla cells by non-mentin
  • the dermal papilla cells obtained from the back skin of SD-rat were identified morphologically, and were identified as the dermal papilla cells by measuring ALP activity (alkaline phosphatase activity), vertican and nexin expression as biological markers.
  • the cells were cultured in DMEM medium containing 10% FBS and antibiotics (penicillin streptomycin). On day 3 of culture, the cells were transferred to 96-well plates in a culture dish. After attaching the cells, the protein delivery domain-non-mentin protein was added to the medium by concentration, and then cultured for 2 hours, and then changed to a new medium, and further cultured for 72 hours under conditions of 5% CO 2 and 37 °C.
  • each papillary cell group treated with non-mentin protein concentration was cultured for 24 hours, and cell proliferation was performed using BrdU enzyme immunoassay kit (Millipore). After completion of the reaction, it was confirmed that the amount of dermal papilla cells increased significantly with concentration compared to the control group by reading with a 450 nm absorbance meter [FIG. 3].
  • the TAT-GFP protein treatment prepared in the same manner as the TAT-non-mentin protein preparation is a control to show that the hair growth effect is due to the entering non-mentin, not the effect of TAT.
  • Example 3 migration effect of dermal papilla cells by non-mentin
  • a wound healing assay was performed to observe the effect on the movement of dermal papilla cells.
  • the dermal papilla cells were incubated in 6-well plates with DMEM medium containing 10% FBS, treated with non-mentin for 2 hours in DMEM medium containing 5% FBS, and wound with a pipette tip. The cells were further incubated for 24 hours under conditions of 5% CO2 and 37 ° C in DMEM medium and observed under a microscope. As a result, it was confirmed that as the concentration of the TAT- non-mentin fusion protein increases, the flow of all the flow cells increases [FIG. 4].
  • mRNA was extracted using the mRNA extraction kit (Geneol). CDNA was synthesized using reverse transcriptase (Gendepot, M-MLV) and PCR was performed using Taq polymerase.
  • Primers used for PCR to confirm the expression of IGF-1 were 5-TCAACAAGCCCACAGCAACAGGGTAT-3 (SEQ ID NO: 7), 5-ACTCGTGCAGAGCAAAGGAT-3 (SEQ ID NO: 8).
  • Primers used for PCR to confirm the expression of VEGF were 5 '-GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGA-3' (SEQ ID NO: 9), 5'-GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA-3 '(SEQ ID NO: 10).
  • the result of the PCR reaction was confirmed by electrophoresis on 1.3% agarose gel, through which the expression levels of growth factors IGF-1 and VEGF were confirmed. As a result, it was confirmed that the expression of IGF-1 and VEGF is promoted as the concentration of the TAT- non-mentin fusion protein is higher [Fig. 5].
  • the skin of the mouse (C57BL / 6 mouse) was applied with a depilatory cream (Veet, Oxy Rekitbenzer, Korea) and after 3 minutes, the spatula was scraped off to remove hair and hair roots, and then wiped with buffer PBS.
  • the surface of the epidermis of the rat was pushed to remove dead skin cells, and then further dead skin cells were removed using a transparent tape.
  • 20 ⁇ g of the TAT-non-mentin fusion protein of Example 1 was applied thereto, and then beated for 30 seconds to be absorbed.
  • the saline (saline) treatment group, TAT-GFP treatment group, minoxidil (Minoxidil) 1% 50 ⁇ treatment group was also tested at the same time.
  • FIG. 7 shows photographs of the results after 23 days of treatment.
  • the TAT-non-mentin fusion protein treatment group of Example 1 had the best hair growth effect.
  • Figure 8 is a photograph taken by taking the thickness of the hair in the middle of each group of mice, the thickness of the TAT- non-mentin fusion protein treatment group of Example 1 was the thickest, hair follicles through H & E staining after sacrifice As a result of confirming the hair follicle, it was confirmed that the number of activated round follicles of round shape was increased in the TAT-non-mentin fusion protein treatment group of Example 1 [FIG.

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Abstract

본 발명은 모유두세포(dermal papilla cell)의 증식 촉진과 세포 이동 및 성장인자 발현 증가 기능을 갖는 비멘틴(vimentin)의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 모낭에서 각화세포(keratinocyte), 멜라닌 세포(melanocyte) 등으로 분화되어 머리카락을 자라게 하고, 모낭을 유지시켜 탈모를 예방할 수 있도록 하는 모유두세포의 증식을 촉진시키는 비멘틴의 새로운 용도에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 비멘틴의 증식을 통한 탈모 억제 및 발모 치료 효과에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

비멘틴을 포함하는 탈모 억제 또는 발모 촉진용 조성물
본 발명은 비멘틴을 포함하는 탈모 억제 또는 발모 촉진용 조성물에 관한 것이다.
사람의 모발은 일차적으로는 자외선 등의 외부 자극요인으로부터 두피를 보호하기 위한 방어 기능을 담당하며 개인의 외적 이미지를 표현하는 미적 기능을 담당한다. 그러나 현대 사회에서는 환경 오염과 강한 자외선 등의 자연적인 요인, 스트레스 및 호르몬 불균형 등의 생리학적인 요인에 의해 탈모가 빈번히 발생되고 있으며 성인 남성에 국한되던 과거와 다르게 남녀노소를 불문하고 탈모 현상이 나타남에 따라 이의 예방 및 치료를 위한 소재의 필요성이 절실해졌다.
모발을 만들어내는 신체 내의 생리학적 기관인 모낭(hair follicle)은 출생 후의 발생 과정동안 모발의 생성 및 생성된 모발이 활발히 성장하는 성장기(anagen phase), 모발이 퇴화하는 퇴행기(catagen phase), 모발 탈락 때까지 유지되는 휴지기(telogen phase), 탈모가 일어나는 탈모기(exogen phase)로 나뉘는 모발성장 주기(hair cycle)를 반복하며 모발의 성장과 유지 및 탈락에 관여한다. 많은 연구에 의해 이 모낭의 활성은 모유두세포에 의해 일어나며, 특히 모유두세포의 증식 및 분화가 모발성장 주기의 진행과 모발형성에 일차적으로 관여한다(Botchkarev VA, Kishimoto J, Molecular control of epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle cycling. J Iinvestig Dermatol Symp Proc 8, 46-55,2003). 활발히 모발이 성장하는 성장기에는 모유두세포의 활발한 증식 및 분화가 활발하게 일어나며 모발의 성장이 중단되며 탈모현상이 일어나는 퇴행기, 휴지기, 탈모기에는 이 세포가 사멸된다(Botchkarev V.A, Batchkareva N.V., Nakamura M, Noggin is required for induction of the hair follicle growth phase in postnatal skin. FASEB J 15, 2205-2214, 2001). 따라서 발모 및 탈모에는 모유두세포의 증식 및 사멸이 밀접하게 연관되어 있으므로 이의 증식을 유도함으로써 성장기를 길게 하거나 혹은 세포 사멸을 억제하고 퇴행기, 휴지기, 탈모기를 짧게 하는 것이 탈모를 개선, 치료 방안이 될 것으로 사료된다. 또한, 모유두 부근의 세포 분열과 이동은 머리카락의 성장과 밀접한 관련을 갖고 있는데, 성장기에서 모유두로부터 모발이 새롭게 생성되는데, 여러 가지 사이토카인, 호르몬 등에 의해서 세포가 활성화 되어 모유두로 세포의 이동이 나타나 모발의 성장에 영향을 주게 된다(Eva M.J. Peters, Desmond J Tobin, Migration of melanoblasts into developing murine hair follicle is accompanied by transient c-kit expression, J Histochem Cytochem, 50, 6751-766, 2002 , Jahoda CA, Cell movement in the hair follicle dermis-more than a two-way street? J Invest Dermatol, 1221, 1523-1747, 2003).
또한, 모낭의 활성화 인자들 가운데 베르시칸(versican), IGF-1, VEGF 등의 성장인자는 성장기에서 가장 강하게 발현되며, 퇴행기와 휴지기에서는 감소함으로써 모유두세포의 증식을 유도하고 성장기를 유지시킴으로서 모발이 정상적으로 유지될 수 있도록 돕는 것으로 알려져 있다(Wight T, Versican: a versatile extracellular matrix proteoglycan in cell biology. Current Opinion Cell Biol 14, 617-623, 2002, Kulessa H, Turk G, Inhibition of Bmp signaling affects growth and differentiation in the anagen hair follicle, EMBO J 19, 6664-6674, 2000).
현재 FDA에서 승인된 대표적인 약물 미녹시딜(minoxidil)과 피나스테라이드(finasteride)는 전신의 발모 및 성기능 저하 등의 부작용이 따르고 미녹시딜의 구체적인 작용 기전 또한 명확하게 밝혀지지는 않은 상태이다. 따라서, 모낭에서 모유두세포의 증식을 촉진하고 성장인자의 발현을 증가시키면서 부작용 우려가 적은 생물학적 소재의 개발이 필요한 실정이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 모유두세포의 증식과 이동, 그리고 모발의 성장에 관련된 성장인자들은 정상적인 모발 유지, 탈모 억제 및 발모에 있어서 매우 중요한 인자이다. 이에 대해 본 발명자들은 비멘틴 단백질이 모유두세포의 증식과 이동을 촉진시키고 IGF-1과 같은 성장인자들의 발현을 증가시킴을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 모유두세포의 증식과 이동을 촉진시키고 IGF-1과 같은 성장인자들의 발현을 증가시키는 비멘틴의 새로운 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은 비멘틴 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 비멘틴 단백질과 단백질전달도메인이 결합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 비멘틴 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물를 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 비멘틴 단백질과 단백질전달도메인이 결합된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 비멘틴 단백질, 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진제를 제공한다.
상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 비멘틴 단백질, 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료를 제공한다.
본 발명에서 비멘틴은 모유두세포의 증식과 이동 및 성장인자의 발현을 촉진시키며, 이러한 효과로 탈모 억제 및 발모 치료를 목적으로 하는 약물 또는 화장품 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 pHis/TAT-비멘틴 발현 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 사람의 비멘틴 유전자를 pHis/TAT 발현 벡터에 도입하여 대장균에 형질전환한 후 단백질 발현 및 정제를 통해 얻은 단백질전달도메인-비멘틴 재조합 단백질의 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 쥐로부터 분리한 모유두세포에 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질을 농도별로 처리했을 때의 세포 증식 정도를 BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine)을 이용한 세포 증식(Cell Proliferation) ELISA 분석을 통해 얻은 그래프이다[1, 대조군; 2, 비멘틴 10 nM 처리; 3, 비멘틴 100 nM 처리; 4, 비멘틴 1 uM 처리; 5, 비멘틴 10 uM 처리; 6, GFP 1 uM 처리].
도 4는 모유두세포에 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질을 농도별로 처리했을 때의 세포 이동 정도를 상처 치유 분석(wound healing assay)으로 측정한 결과를 나타낸 것이다[1, Wound healing 직후; 2, 비멘틴 10 nM 처리; 3, 비멘틴 100 nM 처리; 4, 비멘틴 1 uM 처리; 5, 비멘틴 10 uM 처리; 6, GFP 1 uM 처리].
도 5는 모유두세포에 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질을 농도별로 처리하여 성장인자 IGF-1 및 VEGF의 발현 정도를 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 분석한 결과를 나타낸 것이다[레인 1, 대조군; 레인 2, 비멘틴 10 nM 처리; 레인 3, 비멘틴 100 nM 처리; 레인 4, 비멘틴 1 uM 처리].
도 6은 모근이 제거된 랫트에 TAT-비멘틴 융합 단백질을 도포하여 발모 효과를 확인한 사진이다.
도 7은 모근이 제거된 마우스 모델에 식염수(saline), TAT-GFP, 미녹시딜, 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질을 각각 처리하고, 23일 후 발모 효과를 나타낸 사진이다.
도 8은 모근이 제거된 마우스 모델에 식염수(saline), TAT-GFP, 미녹시딜, 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질을 각각 처리하고, 23일 후 마우스 머리쪽, 몸통쪽, 꼬리쪽 등 각 부위의 털의 두께를 촬영한 사진(상)과 몸통 부위의 털의 두께를 나타낸 그래프(하)이다.
도 9는 모근이 제거된 마우스 모델에 식염수(saline), TAT-GFP, 미녹시딜, 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질을 각각 처리하고, 23일 후 모낭을 촬영한 사진이다.
본 발명은 비멘틴이 모유두세포의 증식을 촉진하고 성장인자 발현을 증가시킴으로써 모발 성장 주기(hair cycle)에 영향을 주어 탈모 질환 예방 및 치료할 수 있음을 규명하였다는 데에 특징이 있다.
본 발명에서 비멘틴의 모유두세포 증식 촉진 효과를 나타낸다. 즉, 비멘틴은 모유두세포 증식을 유의적으로 증가시킨다. 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질을 처리한 모유두세포 실험군은 그들의 대조군에 비해 모유두세포 증식에 유의적인 효과를 보이며, 대조군에 비해 최대 300% 이상의 세포증식 효율 증가를 보이고 있다 (도 2 참조). 비멘틴 단백질의 농도별 모유두세포 증식 효과를 측정하였을 때, 1 uM 농도에서 가장 큰 효과를 보였다 (도 2 참조).
본 발명은 비멘틴의 모유두세포의 세포 이동 활성화 효과를 나타낸다. 즉, 비멘틴은 모유두세포의 세포 이동을 유의적으로 증가시킨다. 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질을 처리한 모유두세포 실험군은 그들의 대조군에 비해 모유두세포 이동에 유의적인 효과를 보였다 (도 3 참조).
본 발명은 비멘틴의 모유두세포에서 성장인자 IGF-1의 발현 촉진 효과를 나타낸다. 즉, 비멘틴은 모유두세포에서 성장인자 IGF-1의 발현을 증가시킨다. 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질을 처리한 모유두세포 실험군은 그들의 대조군에 비해 IGF-1 발현의 증가를 보였다 (도 4 참조).
따라서, 본 발명은 비멘틴 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 비멘틴 단백질은 인간을 포함한 포유동물로부터 유래된 것일 수 있으며 치료하고자 하는 개체에 따라, 비멘틴의 기원은 적합하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 비멘틴은 인간으로부터 유래된 것일 수 있으며, 인간 유래 비멘틴의 아미노산 서열은 공지된 바 있다(서열번호 1: GenBank acession no. NP_003371.2).
또한, 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 비멘틴 단백질은 천연형 또는 재조합 비멘틴 단백질 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 모두 포함할 수 있다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형 단백질 또는 재조합 비멘틴 단백질의 기능적 동등물(functional equivalent) 및/또는 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.
상기 "기능적 동등물"이란 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 상기 비멘틴 단백질과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 가지며, 비멘틴 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
상기 "기능적 유도체"는 상기 비멘틴 단백질의 기본골격과 생리활성을 유지하면서 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위해 일부 화학 구조가 변형된 단백질을 말한다. 예들 들면, 기능적 유도체로는 비멘틴 단백질의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위해 구조가 변경된 단백질이 포함된다.
본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1로 표시되는 비멘틴 단백질을 사용하였다.
또한, 본 발명은 비멘틴 단백질과 단백질전달도메인이 결합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 단백질전달도메인(PTD)은 인간 면역결핍 바이러스 타입 I(HIV-1)에서 유래한 TAT(trans-activating transcriptional activator); 초파리의 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia Homeodomain)인 Antp(Antennapedia 또는 penetratin) 펩타이드; 쥐의 전사인자의 Mph-1(Mutator phenotype protein 1), HSV-1(Herpes simplex virus)의 VP22(viral protein 22); 청어 프로타민의 HP4(human protamine P4); 트랜스포탄(Transportan), MAP(Model amphipathic peptide), TP10(Transportan-10), CTP(Cardiac targeting peptide), K5-FGF(K5-fibroblast growth factor, AAVALLPAVLLALLP[서열번호 11]), HAP-1(Huntingtin-associated protein 1, SFHQFARATLAS[서열번호 12]), 293P-1(SNNNVRPIHIWP[서열번호 13]), CADY(cysteamidation PTD, Ac-GLWRALWRLLRSLWRLLWRA-Cya[서열번호 14]), PF6(PepFect6, Stearyl-AGYLLGK(εNH)INLKALAALAKKIL-NH2), RXR(arginine rich peptide), 폴리아르기닌(poly-arginine, Rn(n = 6~12)), 폴리라이신(poly-lysine), 또는 이들의 변형 펩타이드(예를 들면, TAT 단백질의 47-57 아미노산 잔기를 변형한 펩타이드 등)로 이루어진 군에서 선택된 하나 바람직하나, 세포 내로 단백질을 전달할 수 있는 것이라면 모두 사용 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는 TAT-비멘틴 융합 단백질(서열번호 2)을 사용하였다.
본 발명의 PTD-비멘틴 융합 단백질은 비멘틴 유전자를 PCR 방법으로 DNA 단편을 얻어 PTD가 포함된 플라스미드 벡터(원핵세포 발현용 벡터 pET 등 또는 진핵세포 발현용 벡터 pcDNA 등)에 도입한 후 발현용 세포에 형질전환시켜 단백질 발현한 후 적절한 단백질 정제 과정을 통해 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 비멘틴 단백질을 암호화하는 핵산 또는 비멘틴 단백질과 단백질전달도메인이 결합된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물을 포함한다.
상기 비멘틴 단백질 또는 PTD-비멘틴 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 바람직하게는 상기 비멘틴 단백질을 암호화하는 핵산은 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 인간 비멘틴 유전자는 공지되어 있다 (서열번호 3, GenBank accession no. BC000163). 상기 PTD-비멘틴 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호 4로 표시되는 유전자를 포함한다.
상기 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 감염(infection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.
상기 플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pET, pcDNA, pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명팀에서 제조한 pHis/TAT 플라스미드(Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun., 363, 399-404)를 사용하였다.
상기 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 바람직하게는, 일시적 형질감염방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 등이 포함된다.
상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다(Miller, A.D., Nature, 1992, 357:455-460). FDA에서 인증받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986).
비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다(Rosenfeld, M.A., et al., Cell, 68:143-155, 1992; Jaffe, H.A. et al., Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 탈모 억제 및 발모 촉진용 조성물은 약학적 조성물 또는 화장료 조성물로서, 의약품 또는 화장품으로 제조될 수 있으며, 의약품으로 제조할 경우 경구적으로 또는 정맥 내, 피하, 비강 내 또는 복강 내 등에 비경구적으로 투여된다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육 내 주사 및 정맥 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명에 따른 비멘틴 단백질, PTD-비멘틴 융합 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함함으로써 각종 제형의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료를 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 및 안정화제를 혼합하여 사용할 수 있으며 국소투여용 제제의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트포키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼(wafer) 등의 형태로 제조할 수 있으며 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 이외에도 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 본 발명에서 상기 '약학적으로 유효한 양'이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류, 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 특히, 상기 유효성분이 전체 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물 100 중량부에 대하여 0.01 내지 30 중량부를 포함하는 것이 바람직하며, 0.1 내지 20 중량부를 포함하는 것이 보다 바람직하다.
따라서, 본 발명은 비멘틴 단백질, 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진제를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 비멘틴 단백질, 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료는 화장학적으로 허용되는 담체를 추가로 함유하여, 크림, 로션, 토닉, 스프레이, 에어로졸, 오일, 용액, 현탁액, 젤, 연고, 에멀젼, 찰제, 페이스트 등의 통상적인 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 통상 기제(基劑)를 함유하고, 필요에 따라서 일반적으로 화장품 원료로서 사용되는 기타 성분이 적절히 배합될 수 있다. 본 발명의 조성물의 기제는 통상적으로 사용되는 한 어떠한 것도 사용 가능하며, 그 예는 정제수, 미네랄 워터, 에탄올, 글리세린, 스쿠알렌, 1,3-프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 피마자유, 츠바키유 및 리퀴드 페트롤레이텀(liquid petrolatum)을 포함한다. 본 발명의 조성물에 배합되는 기타 성분의 예는 계면활성제, 유화제, 증점제, 방부제(예를 들어, 파라옥시안식향산메틸), 산화방지제, 향료 등을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료에는 상기 성분 이외에도 모낭에 영양소를 공급하는 역할을 할 수 있는 성분이나 통상적으로 사용되는 모발성장 촉진 보조성분을 포함할 수 있는 바, 예를 들면 비타민류, 아미노산류, 동식물유, 염화나트륨 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이들의 양은 전체 조성물의 0.0001 내지 10 중량%, 특히 0.01 내지 1 중량%가 바람직하다. 이 경우 비타민류는 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 나이아신(니코틴산), 비타민 C, 비타민 E, 판토텐산 나트륨, 판토텐산 칼륨, 비오틴 H(비타민 H) 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 아미노산류는 도파를 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 동식물유는 마유, 난유, 올리브 유, 동백유, 유채기름, 참기름, 배아유 등을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료는 모발 또는 두피에 직접 도포 또는 산포하는 등의 방법에 의해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물이 적용되는 모발이란, 머리의 모근 및 모낭, 머리카락 및 속눈썹과 겉눈썹, 수염, 겨드랑이, 음모, 신체 전반에 모근 및 모낭이 있는 모든 부위를 포함한다. 따라서 본 발명은 헤어토닉, 헤어로션, 헤어크림, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어젤, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹발모제, 속눈썹영양제, 애완동물용 샴푸, 애완동물용 린스 등으로 사용될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질 제조
본 발명에서 사용한 단백질전달도메인-비멘틴 단백질의 제조는 pHis/TAT 발현 벡터(Kwon JH et al., 2007, Biochem Biophys Res Commun., 363, 399-404)를 이용하여 재조합 단백질 발현 및 정제에 의해 이루어졌다. 사람의 cDNA를 주형으로 하여 두 가지 프라이머 5'-ATCTACGGATCCACCAGGTCCGTGTCCTCG-3'(서열번호 5, 밑줄 BamHI site), 5'-AGTGTGGTCGACTTATTCAAGGTCATCGTC-3' (서열번호 6, 밑줄 SalI site)를 이용하여 PCR 하여 DNA 단편(서열번호 3)을 얻어 각각의 제한효소(BamHI/SalI)로 잘라 pHis/TAT 발현 벡터에 넣어 재조합 발현벡터 pHis/TAT-Vimentin을 제작하였고[도 1], 이를 대장균 BL21(DE3)에 형질도입시켰다. 단백질 발현을 위해 일정한 시간 배양한 후 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactoside)를 첨가하여 4시간 추가 배양하였다. 배양된 대장균을 원심분리로 회수하여 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 Ni-NTA 친화 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography) 방법으로 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질(서열번호 2)을 분리하였다. 정제된 단백질은 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하여 확인하였다[도 2].
실시예 2: 비멘틴에 의한 모유두세포의 증식 효과
SD-rat의 등가죽으로부터 얻은 모유두세포를 형태학적으로 확인, 생물학적인 표지인자로서 ALP 활성(alkaline phosphatase activity) 측정, 베르시칸(versican), 넥신(nexin) 발현양을 통해 모유두세포임을 확인하였고, 10% FBS와 항생제(penicillin streptomycin)가 첨가된 DMEM 배지에 배양을 하였다. 배양 3일째, 배양접시에서 세포를 96-웰 플레이트에 옮겼다. 세포가 붙은 후 단백질전달도메인-비멘틴 단백질을 농도별로 배지에 넣어 준 후 두 시간 배양시키고 새로운 배지로 바꾸어 주었으며, 5% CO2, 37 ℃의 조건 하에서 72시간 추가 배양하였다. 비멘틴 단백질이 농도별로 처리된 각 모유두세포 실험군들은 24시간 배양되었으며, 세포 증식은 BrdU 효소면역반응분석키트(Millipore)를 사용하였다. 반응이 끝난 후 450nm의 흡광 계측기로 읽어 대조군에 비해 농도에 따라 유의적으로 모유두세포의 양이 증가하는 것을 확인하였다[도 3]. 이때, TAT-비멘틴 단백질 제조와 동일한 방법으로 제조된 TAT-GFP 단백질 처리한 것은 발모 효과가 TAT의 영향이 아니라 들어간 비멘틴 때문이라는 것을 보여주기 위한 대조군이다.
실시예 3: 비멘틴에 의한 모유두세포의 이동 효과
모유두세포의 이동에 대한 효과를 관찰하기 위해 상처 치유 분석(wound healing assay)을 실시하였다.
모유두세포를 10% FBS 함유된 DMEM 배지로 6-웰 플레이트에서 배양한 후 5% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 비멘틴을 2시간 처리하고 피펫 팁(pipette tip)으로 상처(wound)를 주었다. DMEM 배지에서 5% CO₂, 37℃의 조건 하에서 24시간 추가 배양하여 현미경으로 관찰하였다. 그 결과, TAT-비멘틴 융합 단백질의 농도가 높을수록 모두유세포의 이동이 증가하는 것으로 확인되었다[도 4].
실시예 4: 비멘틴에 의한 성장인자 발현 촉진 효과
모유두세포에 비멘틴을 처리하여 24시간이 지난 후 mRNA 추출 키트(Geneol)를 이용하여 mRNA를 추출하였다. 역전사 효소(Gendepot,M-MLV)를 이용하여 cDNA를 합성한 후 Taq 중합효소를 이용하여 PCR을 수행하였다.
IGF-1의 발현 확인을 위해 PCR에 사용한 프라이머는 5-TCAACAAGCCCACAGCAACAGGGTAT-3(서열번호 7), 5-ACTCGTGCAGAGCAAAGGAT-3(서열번호 8) 였다. VEGF의 발현 확인을 위해 PCR에 사용한 프라이머는 5‘ -GACCCTGGTGGACATCTTCCAGGA-3’(서열번호 9), 5‘-GGTGAGAGGTCTAGTTCCCGA-3’(서열번호 10) 였다.
PCR 반응의 결과물은 1.3% 아가로스 겔에서 전기 영동하여 확인하였으며, 이를 통해 성장인자 IGF-1 및 VEGF의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과, TAT-비멘틴 융합 단백질의 농도가 높을수록 IGF-1 및 VEGF의 발현이 촉진됨을 확인하였다[도 5].
실시예 5: 탈모 억제 및 발모 촉진 효과 확인
랫트(SD rat)의 등가죽 부위를 제모크림(Veet, 옥시레킷벤키저, 대한민국)을 바르고 3분 후에 spatula로 긁어 털과 모근을 제거한 후 70% 에탄올로 제거한 부위를 닦아내었다. 쥐의 피부 표피 부분 표면을 밀어 각질을 제거한 후 투명 테이프를 이용하여 추가로 각질을 제거하였다. 여기에 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질 10 ㎍, 20 ㎍을 각각 도포한 후 흡수되도록 30초간 두들겨 주었다. 이틀 후부터 발모를 육안으로 관찰할 수 있었고, 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질 처리 4일 후의 결과를 사진 촬영한 것이다[도 6].
실시예 6: 마우스 이용한 발모 촉진 효과 및 모낭 활성화 확인
마우스(C57BL/6 mouse)의 등가죽 부위를 제모크림(Veet, 옥시레킷벤키저, 대한민국)을 바르고 3분 후에 spatula로 긁어 털과 모근을 제거한 후 완충용액 PBS로 닦아내었다. 쥐의 피부 표피 부분 표면을 밀어 각질을 제거한 후 투명 테이프를 이용하여 추가로 각질을 제거하였다. 여기에 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질 20 ㎍을 각각 도포한 후 흡수되도록 30초간 두들겨 주었다. 이때 대조군으로 식염수(saline) 처리군, TAT-GFP 처리군, 미녹시딜(Minoxidil) 1% 50㎕ 처리군도 동시에 실험하였다.
3주 후부터 실험군간의 발모의 차이를 육안으로 관찰할 수 있었고, 도 7은 처리 23일 후의 결과를 사진 촬영한 것으로 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질 처리군이 가장 발모 효과가 우수하였다. 또한, 도 8은 각 실험군 마우스의 등 한가운데의 털을 뽑아 두께를 촬영한 사진으로 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질 처리군의 털의 두께가 가장 두꺼웠으며, sacrifice 후에 H&E 염색을 통해 모낭(hair follicle)을 확인한 결과, 실시예 1의 TAT-비멘틴 융합 단백질 처리군에서 둥근 모양의 활성화된 모낭의 숫자가 증가된 것을 확인하였다[도 9].

Claims (20)

  1. 비멘틴 단백질을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 비멘틴 단백질이 포유동물 유래인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 포유동물이 인간인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 비멘틴 단백질은 천연형 비멘틴 단백질 또는 재조합 비멘틴 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 비멘틴 단백질은 천연형 비멘틴 단백질 또는 재조합 비멘틴 단백질의 기능적 동등물(functional equivalent) 또는 기능적 유도체(functional derivative)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 비멘틴 단백질은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 비멘틴 단백질과 단백질전달도메인이 결합된 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 단백질전달도메인은 TAT, Antp 펩타이드, VP22, HP4, 트랜스포탄(Transportan), MAP, TP10, K5-FGF, HAP-1, 293P-1, CADY, PF6, RXR, 폴리아르기닌, 폴리라이신 또는 이들의 변형 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 비멘틴 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 비멘틴 단백질을 암호화하는 핵산은 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 비멘틴 단백질과 단백질전달도메인이 결합된 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 조성물.
  13. 제 10 항 또는 제 12 항에 있어서,
    상기 핵산이 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 발현 벡터가 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 플라스미드가 pET, pcDNA, pRK5, pSV16B, pVL1392(PharMingen) 및 pHis/TAT로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 허피스바이러스 벡터 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제 12 항에 있어서,
    상기 핵산은 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 비멘틴 단백질, 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 발모 촉진제.
  19. 비멘틴 단백질, 단백질전달도메인-비멘틴 융합 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 화장료는 헤어토닉, 헤어로션, 헤어크림, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어젤, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹발모제, 속눈썹영양제, 애완동물용 샴푸 또는 애완동물용 린스인 탈모 예방 또는 발모 촉진용 화장료.
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