JP6916318B2 - 尿細胞からケラチノサイト幹細胞への直接逆分化方法および逆分化したケラチノサイト幹細胞を利用した皮膚再生促進用組成物の製造方法 - Google Patents
尿細胞からケラチノサイト幹細胞への直接逆分化方法および逆分化したケラチノサイト幹細胞を利用した皮膚再生促進用組成物の製造方法 Download PDFInfo
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Description
好ましくは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、レトロウイルス(Retrovirus)、例えばHIV(Human immunodeficiency virus)MLV(Murine leukemia virus)ASLV(Avian sarcoma/leukosis)、SNV(Spleen necrosis virus)、RSV(Rous sarcoma virus)、MMTV(Mouse mammary tumor virus)など、アデノウイルス(Adenovirus)、アデノ関連ウイルス(Adeno−associated virus)、単純ヘルペスウイルス(Herpes simplex virus)などに由来したベクターを含むが、これに制限されない。本発明の具体的な実施例では、MMLV−基盤−ウイルスベクター(Murine Moloney leukemia virus based virus vector)としてpMXsベクターを利用した。
(a)尿から尿細胞を分離培養する段階;
(b)前記培養した尿細胞にBmi1およびdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を導入する段階;
(c)前記核酸配列が導入された尿細胞を培養槽件で培養して、ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する段階;および
(d)前記ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導した細胞でケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞株を選別する段階;を含むことができる。
(a)尿から尿細胞を分離培養する段階;
(b)前記培養した尿細胞にBmi1およびdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸を導入する段階;および
(c)前記核酸配列が導入された尿細胞を培養槽件で培養して、ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する段階;
(d)前記ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導した細胞でケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞株を選別する段階;および
(e)前記選別された逆分化ケラチノサイト幹細胞を無血清培地で培養して、コンデイションド培地またはその培養液を得る段階を含む、尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法を提供する。
尿細胞は、尿を容器に200ml収集して2000rpmで10分間遠心分離後、上澄み液(supernatant)を除去した。抗生剤が含まれたPBSでペレットを洗浄した後、2000rpmで10分間遠心分離後、上澄み液を除去した。抗生剤が含まれたDMEM/F12 1:1+10%FBS培地で細胞ペレット再懸濁(cell pellet resuspension)して、ゼラチン(gelatin)コーティングされた12ウェルプレートにシーディングした。
逆分化ケラチノサイト幹細胞株を取得するために、尿細胞にRetroviral vector systemを利用して逆分化因子Bmi1(B、NCBI ID:648、RefSeq:NM_005180.8)、dNP63a(N、NCBI ID:8626、RefSeq:NM_001114980.1)およびKlf4(K、NCBI ID:9314、RefSeq:NM_001314052.1)を組み合わせ別(BNK、BN、BK、NK、B、NおよびK)に導入して、逆分化ケラチノサイト幹細胞で誘導した。具体的な方法は、次の通りである:
実施例2で誘導された細胞のうちケラチノサイト幹細胞と類似したコロニーをcolony−picking方法を利用してケラチノサイト幹細胞特異的マーカーであるKRT15/ITGA6にco−positiveしたコロニーを選別した後、1% L−グルタミン、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、インスリン5ug/ml、ヒドロコルチゾン0.5ug/ml、コレラトキシン8.3ng/ml、T3 1.37ng/ml、アスコルビン酸 52.8ug/ml、EGF 20ng/mlおよび10% FBSが含まれたハイグルコースDMEM/F12 3:1培地で拡張培養して逆分化ケラチノサイト幹細胞株BN28−2、BN28−5、BN28−6を確立した(図2A)。
10%ホルムアルデヒド(formaldehyde)または4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyde)でコロニーを20分固定後、蒸留水で2回洗浄した後、0.05%クリスタルバイオレット溶液を利用して20分間反応させた後、水で10回程度洗浄した後、一晩中乾燥させた後、コロニーを顕微鏡または肉眼で観察した。
実施例3で確立された逆分化ケラチノサイト幹細胞株をCa2+1.2mMを追加した前記実施例3の培地に7日間培養した後、逆分化ケラチノサイト幹細胞の分化実験を進めた。ケラチノサイトへの分化の有無を確認するために、qPCR実験を利用してmRNA水準でのケラチノサイトマーカー(ITGA6、KRT14、KRT18、KRT8、KRT1、InvolucrinおよびFilaggrin)に特異的なプライマー(KRT18−Forward:AGACCATGCAAAGCCTGAAC(配列番号17);KRT18−Reverse:GCAGTCGTGTGATATTGGTGTC(配列番号18);KRT8−Forward:CTCAGAGATCAACCGGAACA(配列番号19);KRT8−Reverse:TTCATCAGCTCCTGGTACTCAC(配列番号20);KRT1−Forward:TCTGGCTCTGCTGGGATCATCA(配列番号21);KRT1−Reverse:TCCGACTTCCAAATCCACCACC(配列番号22);Involucrin−Forward:CTCCTCCAGTCAATACCCATCAG(配列番号23);Involucrin−Reverse:ACATTCTTGCTCAGGCAGTCC(配列番号24);Filaggrin−Forward:TTCGGCAAATCCTGAAGAATC(配列番号25);Filaggrin−Reverse:CTTGAGCCAACTTGAATACCATC(配列番号26);)を利用して前記マーカーの発現を確認した。
実施例3で確立された逆分化ケラチノサイト幹細胞株を利用して100mmディッシュで95%以上コンフルーエント(confluent)されたとき、DMEM/F12 3:1無血清培地で3日間培養して、コンデイションド培地を製造する。コンデイションド培地の濃度を様々なパーセンテージで区別した後、繊維細胞に処理して5日間細胞成長を前記培地が処理された逆分化ケラチノサイト幹細胞株にcck−8溶液を1時間処理後450nmに吸光度を測定するcck−8方法で確認した。その結果、50%および75%濃度のコンデイションド培地を処理したとき、あまり差異なく、最も高い成長速度を示し、50%逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地を皮膚再生効果の検証に使用した(図4A)。
逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地のin vivo皮膚再生効能を検証するためにICRマウスを使用した。ICRマウスの背中に毛を除去した後、皮膚に物理的に8mmの傷を作る。各傷に毎日羊水由来間葉系幹細胞由来コンデイションド培地、50%逆分化ケラチノサイト幹細胞由来したコンデイションド培地およびDMEM/F12 3:1基本培地を7日間処理して皮膚再生状況を観察した。結果によれば、傷回復状況がDMEM/F12 3:1基本培地より50%逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地を処理したとき、顕著に良好な効果を確認することができ、この傷回復効果は、すでに皮膚再生の良い効果と知られた羊水由来間葉系幹細胞由来コンデイションド培地と類似した結果を確認した(図5A〜B)。組織学的にH&E染色で確認して、50%逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地を処理したとき、羊水由来間葉系幹細胞由来コンデイションド培地と同様に上肢組織を形成することを確認することができた(図5C)。
逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地の成分分析のためにR&D ARY007サイトカインアレイキットを使用してサイトカインアレイを行った。逆分化ケラチノサイト幹細胞に由来したコンデイションド培地でActivin A、ANG(Angiogenin)、Coagulation Factor III、CXCL16、DPPIV、Endostatin/Collagen XVIII、bFGF(basic Fibroblast Growth Factor)、GM−CSF(Granulocyte macrophage colony−stimulating factor)、IGFBP−1(Insulin−like growth factor−binding protein 1)、IGFBP−2、IL−1β、IL−8、CCL2/MCP−1、CCL3/MIP1α、PTX3(Pentraxin3)、PDGF−AA(Platelet−derived Growth Factor)、PIGF(Placental growth factor)、Serpin B5/Maspin、Serpin E1/PAI−1、TIMP−1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1)、TSP−1(Thrombospondin−1)、uPA(Urokinase−type plasminogen activator)およびVEGF(Vascular endothelial growth factor)など多様な成長因子およびサイトカイン(cytokine)が組成物であることが確認された(図6)。
Claims (11)
- (i)Bmi1タンパク質またはBmi1タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸;および
(ii)dNP63aタンパク質またはdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸;
を含む、尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物。 - 前記尿細胞は、尿に由来した体細胞である、請求項1に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物。
- 前記組成物は、Bmi1タンパク質およびdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挿入された発現ベクターを含む、請求項1に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物。
- 前記組成物は、Bmi1タンパク質およびdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が導入されたウイルスを含む、請求項1に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する組成物。
- (a)尿から尿細胞を分離培養する段階;
(b)前記培養した尿細胞にBmi1タンパク質およびdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸を導入する段階;および
(c)前記核酸配列が導入された尿細胞をケラチノサイト幹細胞培養条件で培養して、ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する段階;
(d)前記ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導した細胞でケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞株を選別する段階;
を含む、尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する方法。 - 前記段階(b)でBmi1タンパク質およびdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸の導入は、前記核酸配列が挿入されたレトロウイルス(Retrovirus)を前記尿細胞に感染させたものである、請求項5に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する方法。
- 前記段階(c)で前記培養条件は、FBS(Fetal Bovine Serum)、インスリン(insulin)、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、コレラトキシン(cholera toxin)、T3、アスコルビン酸(ascorbic acid)、EGF(Epidermal Growth Factor)、L−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むハイグルコースDMEM/F12 3:1培地で培養するものである、請求項5に記載の尿細胞からケラチノサイト幹細胞への逆分化を誘導する方法。
- (a)尿から尿細胞を分離培養する段階;
(b)前記分離培養された尿細胞にBmi1タンパク質およびdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸を導入する段階;および
(c)前記核酸配列が導入された尿細胞をケラチノサイト幹細胞培養条件で培養して、ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導する段階;
(d)前記ケラチノサイト幹細胞に逆分化を誘導した細胞でケラチノサイト幹細胞と類似した特性を有している逆分化ケラチノサイト幹細胞株を選別する段階;および
(e)前記選別された逆分化ケラチノサイト幹細胞を無血清培地で培養してコンデイションド培地またはその培養液を得る段階を含む、尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法。 - 前記段階(b)でBmi1タンパク質およびdNP63aタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸の導入は、前記核酸が挿入されたレトロウイルスを前記尿細胞に感染させたものである、請求項8に記載の尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法。
- 前記段階(c)で前記培養条件は、FBS(Fetal Bovine Serum)、インスリン(insulin)、ヒドロコルチゾン(hydrocortisone)、コレラトキシン(cholera toxin)、T3、アスコルビン酸(ascorbic acid)、EGF(Epidermal Growth Factor)、L−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含むハイグルコースDMEM/F12 3:1培地で培養するものである、請求項8に記載の尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法。
- 前記コンデイションド培地は、逆分化ケラチノサイト幹細胞から生成されたVEGF、PDGF−AAおよびbFGFを含むものである、請求項8に記載の尿細胞から逆分化したケラチノサイト幹細胞コンデイションド培地またはその培養液製造方法。
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