WO2013122321A1 - Ｈｄａｃ６의 간암 진단용 마커 및 치료제로서의 용도 - Google Patents

Ｈｄａｃ６의 간암 진단용 마커 및 치료제로서의 용도 Download PDF

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liver cancer
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남석우
정광화
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • HDAC 6 is a Marker for Diagnosing Liver Cancer and as a Therapeutic Agent
  • the present invention relates to a novel liver cancer diagnostic marker that can effectively diagnose and predict liver cancer early, a liver cancer diagnostic kit, a method for diagnosing liver cancer using the liver cancer diagnostic marker, a composition for treating liver cancer using the marker substance, and a screening method thereof. All-
  • Liver cancer is the fifth most common cancer in the world, but the resulting mortality is the third most aggressive cancer (Ahn J, Flamm SL. Hepatocellular carcinoma. Dis Mon 2004; 50: 556-573).
  • Therapeutic surgery is only possible in 15% to 25% of patients, and most liver cancer patients die in a relatively short time due to locally advanced or metastatic disease (Roberts LR, Gores GJ. Hepatocellular carcinoma: molecular pathways and new therapeutic targets.Semin Liver Dis 2005; 25: 212-225).
  • Hepatitis B virus, hepatitis C virus, and aflatoxin BKaflatoxin B1 are known as major causes of liver cancer.
  • HDACs Histone deacetylases
  • corepressors or multi-protein transcriptional complexes where they do not bind DNA directly but instead bind chromatin. Regulate transcription through transformation (Thiagalingam S, Cheng KH, Lee HJ, Mineva N, Thiagalingam A, Ponte JF.Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code.Ann NY Acad Sci 2003; 983: 84-100 ).
  • HDAC11 human HDACs
  • HDAC11 class IV enzyme
  • HDACs pathological activity and deregulation of HDACs can cause various diseases such as cancer, immune disease, and muscular dystrophy (Yang XJ, Seto).
  • HATs and HDACs from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention.Oncogene 2007; 26: 5310-5318).
  • HDACs the specific roles played by individual HDACs in the regulation of cancer development are not yet known.
  • HDAC6 is a member of the class lib family of HDACs, acts as a cytoplasmic deacetylase associated with microtubules (MTs), and deacetylates alpha-tubulin. (Hubbert C, Guardiola A, Shao R, Kawaguchi Y, Ito A, Nixon A, et al. HDAC6 is a microtubule-associated Misl8a. Nature 2002; 417: 455-458).
  • Microtubule-related HDAC6 is a key component in the lysosomal protein breakdown pathway and directly reacts with misfolded or poly-ubiquitated proteins to prevent aggresome ( Aggresome formation / autophagy leads to lysosomal-mediated protein degradation (Kawaguchi Y, Kovacs JJ, McLaurin A, Vance JM, Ito A, Yao TP.The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell 2003; 115: 727-738, Boyault C, Zhang Y, Fritah S, Caron C, Gilquin B, Kwon SH, et al.
  • HDAC6 controls major cell response pathways to cytotoxic accumulation of protein aggregates. Genes Dev 2007; 21: 2172-2181. Recently, it has been shown that HDAC6 regulates autophagosome maturation and is involved in autophagy regulation in the autophagosome-lysosomal fusion phase (Lee JY, Koga H, Kawaguchi Y, Tang W, Wong) E, Gao YS, et al. HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin-selective quality-control autophagy. EMBO J; 29: 969-980).
  • HDAC6 plays a role in the transport of misfolded proteins during aggresome proteolysis, thereby protecting cells from the harmful effects of protein coagulation (Kwon S, Zhang Y, Matthias P).
  • the deacetylase HDAC6 is a novel critical component of stress granules involved in the stress response.Genes Dev 2007; 21: 3381-3394).
  • HDAC6 has also been reported to regulate epithelial-mesenchymal transition in several cancers through the regulation of several key cellular functions (Lee YS, Lim KH, Guo X, Kawaguchi Y, Gao Y).
  • HDAC6 for transforming growth factor—betatal induced epithelial ⁇ mesenchymal transition.J Biol Chem 2008; 283: 21065-21073), expression of HDAC6 results in oncogenic transformation, anchorage-independent proliferation, and tumor There is a lot of evidence to support the fact that it is related to tumor aggressiveness.
  • HDAC6 up-regulation of HDAC6 in various tumors and cell lines has shown that HDAC6 will play an important role in cancer.
  • HDAC6 showed down-regulation in liver cancer compared to normal tissue, and according to the initial analysis of HDAC6 in human liver cancer tissue, It was confirmed that expression was reduced. Therefore, the present inventors measured HDAC6 expression in tumors and normal tissues using a tissue microarray (TMA) assay to elucidate the biological function of HDAC6 as a tumor suppressor in liver tumorigenesis.
  • TMA tissue microarray
  • the present invention has been completed. Tumor inhibitory activity of HDAC6 was also confirmed by in vivo experiments using cell lines stably overexpressing HDAC6.
  • An object of the present invention is to provide a use of the HDAC6 (Histone deacetylase 6) gene or a protein encoded from the gene as a marker for diagnosing liver cancer.
  • HDAC6 Histone deacetylase 6
  • another object of the present invention is to provide a method for predicting and diagnosing liver cancer comprising measuring the amount of HDAC6 gene expression or protein.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a substance capable of preventing or treating liver cancer.
  • Another object of the present invention to provide a composition for treating liver cancer using HDAC6.
  • the present invention provides a marker for diagnosing liver cancer consisting of HDAC6 (Histone deacetylase 6) gene or HDAC6 protein encoded from the gene.
  • HDAC6 Histone deacetylase 6
  • the HDAC6 gene may be one having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a kit for diagnosing liver cancer comprising a substance for measuring the level of HDAC6 (Histone deacetylase 6) gene or the level of HDAC6 protein.
  • the material for measuring the level of the HDAC6 gene may be a primer or probe that can amplify the HDAC6 gene.
  • the substance for measuring the level of the HDAC6 protein may be an antibody that specifically recognizes the HDAC6 protein.
  • the present invention comprises the steps of (a) measuring the amount of expression or protein amount of HDAC6 (Histone deacetylase 6) gene present in a biological sample; And (b) provides a method for predicting and diagnosing liver cancer comprising the step of comparing the measurement results of the step (a) with the amount of expression or protein amount of the HDAC6 gene of the control sample.
  • HDAC6 Histone deacetylase 6
  • the biological sample may be selected from the group consisting of tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva and urine.
  • the method for measuring the expression amount of the HDAC6 gene or the amount of HDAC6 protein but is not limited thereto, reverse transcriptase-polymerase chain reaction, Real time one polymerase chain reaction, western blot, northern blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot analysis, immunohistochemical staining, radioimmunoassay (RIA), It may be selected from the group consisting of radioimmunodif fusion and immunoprecipitation assay.
  • the present invention (a) contacting a sample to be analyzed to liver cancer cells containing HDAC6 (Histone deacetylase 6) gene or HDAC6 protein; (b) measuring the expression level of the HDAC6 gene, the amount of HDAC6 protein, or the activity of HDAC6 protein Doing; And (c) determining that the sample is a material for preventing or treating liver cancer when the measurement result of step (b) increases the expression level of HDAC6 gene, the amount of HDAC6 protein, or the activity of HDAC6 protein.
  • HDAC6 Histone deacetylase 6
  • the method for measuring the expression amount of the HDAC6 gene, the amount of HDAC6 protein or the activity of the HDAC6 protein is not limited thereto, reverse transcriptase-polymerase chain reaction ), real-time polymerase chain banung (real time-polymerase chain reaction), Western blot, Northern blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), immune, tablet: (immunoblot) analysis, the surface station staining, radioimmunoassay analysis ( RIA: may be selected from the group consisting of radioimmunoassay, radioimmunodif fusion, and immunoprecipitation assay.
  • the present invention includes HDAC6 (Histone deacetylase 6) or a substance that promotes its expression, and activates the JNK-mediated Beclin 1 pathway to prevent cell death by autophagy It provides a composition for treating liver cancer, characterized by having a mechanism to promote.
  • HDAC6 Histone deacetylase 6
  • a substance that promotes its expression and activates the JNK-mediated Beclin 1 pathway to prevent cell death by autophagy It provides a composition for treating liver cancer, characterized by having a mechanism to promote.
  • HDAC6 gene according to the present invention was confirmed that the amount of expression in the tissues or cells of liver cancer compared to normal tissues or cells. Therefore, when the HDAC6 gene is used as a marker for diagnosing liver cancer, liver cancer can be rapidly and accurately diagnosed and predicted early, and further, it can be used as a target for the development of liver cancer therapeutics.
  • HDAC6 expression in human liver cancer tissues and liver cancer cell lines shows downregulation or elimination of HDAC6 expression in human liver cancer tissues and liver cancer cell lines.
  • A Gene expression of HDAC6 mRNA based on microarray analysis of preneoplastic nodules.
  • LGDN low-grade dysplastic nodule
  • HGDN highgrade dysplastic nodule
  • Gl-3 Edmondson grades ⁇
  • B HDAC6 expression in human liver cancer and adjacent non-tumor tissues was analyzed by Western blot.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • C Immunohistochemical staining for HDAC6 in human liver cancer and adjacent non-tumor tissue pairs loaded into tissue microarrays.
  • D Endogenous HDAC6 expression in human liver cancer cell lines by Northern and Western blot analysis. Beta-actin probes and GAPDH were used to regulate RNA and protein loading, respectively. Each experiment was performed at least twice.
  • FIG. 2 shows that topic expression of HDAC6 in Hep3B cells induces caspase-independent : apoptosis.
  • A Cells were transduced with control (None), empty vector (Mock), or lg HDAC6 expression vector (pcDNA ⁇ HDAC6).
  • the left panel measures the levels of HDAC6 and acetylated alpha leubulin (Ac ⁇ ⁇ -tubulin) by Western blot analysis. Alpha-tubulin was used as loading control.
  • the right panel shows growth for a control (Mock or None) of Hep3B cells overexpressing HDAC6. Cell counts were determined by nuclear staining with trypan blue. Data is expressed as mean and standard deviation of three independent experiments.
  • C Flow cytometry results of Hep3B cells transduced with control (None), empty vector (Mock), or 1 or 2 HDAC6 expression vector (pcDNA_HDAC6). FITC-labeled Annexin V-positive cells (upper right and lower right) were considered apoptotic cells. Two independent experiments were performed.
  • FIG. 3 shows that topic expression of HDAC6 in Hep3B cells induces apoptosis by autophagy.
  • A Cells were transduced with a control (None), empty vector (Mock), or 1 or 2 HDAC6 expression vector (pcDNA_HDAC6).
  • the left panel is a Western blot analysis of the levels of HDAC6, LC3B-II, and acetylated alpha-leuulin (Ac- ⁇ —tubulin).
  • the right panel shows the alpha-leubulin to LC3B-II ratio measured by densitometric analysis.
  • HDAC6 induces apoptosis by autophagy in liver cancer cell lines.
  • HDAC6 overexpressing cell lines were established as described in the Examples of the present invention. Left panel, immunoblot analysis shows persistent HDAC6 overexpression, which is confirmed by hypoacetylation of alpha-tubulin in HDAC6 overexpressing cell lines (Hep3B_HDAC6 clone # 1 and clone # 2) versus control (Hep3B_Mock) . Right panel, cell growth analysis of established HDAC6 overexpressing cell lines (Hep3B_Mock, Hep3B_HDAC6 clones # 1 and # 2). Relative growth was measured via the MTT assay.
  • FIG. 6 shows that HDAC6 overexpression activates autophagy by upregulating Beclin 1 expression.
  • Beclin 1 expression was examined by Western blot analysis in control (Hep3B_Mock) and HDAC6 overexpressing cell lines (Hep3B_HDAC6 clones # 1 and # 2). Hep3B cells treated with 20 uM ceramide for 24 hours were used as a positive control for Beclin 1 transduction.
  • graph bar shows LC3B-II to ⁇ -tubulin ratio (unpaired student's t test, * P ⁇ 0.05 vs. Mock).
  • HDAC6 overexpressing cells Hep3B_HDAC6 clone # 1 were transfected with control (None), 100 nM scrambled siRNA (Scr), or 100 nM or 200 nM HDAC6-specific siRNA. Thereafter, Beclin 1 and LC3B-II expression levels were measured by Western blot analysis.
  • graph bar shows Beclin 1 to a-tubulin ratio (unpaired student's t test, * P ⁇ 0.05 vs. Scr).
  • FIG. 7 shows JNK / c-Jun activity by HDAC6 mediated Beclin 1′-dependent autophages in liver cancer cells.
  • A JNK, phospho— JNK (p-JNK), c-Jun and the control (Hep3B_Mock) and HDAC6 overexpressing cell lines (Hep3B_HDAC6 Clone # 1 and # 2) The expression level of phospho-c-Jun (p— c-Jun) was measured by immunoblotting.
  • B HDAC6 overexpressing cells (Hep3B ⁇ HDAC6 Clone # 1) were transduced with control (None), 100 nM scrambled siRNA (Scr), or 50 nM or 100 nM HDAC6-specific siRNA.
  • HDAC6 transduced with specific siRNA followed by immunoblotting HDAC6, JNK, phospho-JNK (p-JNK), c-Jun, phospho— c— Jun (pc-Jun), Beclin 1, and LC3B-II
  • C HDAC6, JNK, phospho-JNK (p-JNK), with or without 10 uM SP600125 in control (Hep3B_Mock) and HDAC6 overexpressing cell clones (Hep3B_HDAC6 Clone # 1) to inhibit JNK signaling
  • Expression levels of c-Jun, phospho-c-Jun (pc-Jun), Beclin 1 and LC3B-II proteins were measured by immunoblotting. All membrane blots were reprobed for alpha-leubulin to confirm balanced loading.
  • HDAC6 shows the effect of HDAC6 on ROS accumulation.
  • Hep3B cells were either untreated (None), or transduced for 48 hours with empty mock vectors (Mock), 1 and 2 / g of pcDNA 3.1-HDAC6 expression vector (pcDNA_HDAC6). Cells were then stained with H2DCFDA for 30 minutes and cell ROS levels were observed by flow cytometry.
  • B Graph bars indicate relative levels of ROS compared to control (None).
  • HDAC6 a cytoplasmic deacetylase
  • HDAC6 can function as a tumor suppressor in human liver cancer cells by mediating cell death by caspase-independent autophagy via a dependent pathway of JNK-activated Beclin 1. Said that. Expression of HDAC6 is inhibited or lost in liver cancer, and according to an embodiment of the present invention, ectopic expression of HDAC6 inhibited tumor growth in both in vitro and in vivo experiments. In addition, HDAC6 activated JNK / cJ Jun signaling pathway in liver cancer cells to activate Beclin 1 / LC3B-II dependent autophagy.
  • HDAC6 plays an important role in the pathogenesis of liver cancer, suggesting that HDAC6 may have important therapeutic effects in the treatment of liver cancer.
  • Acetylation of histones by lysine is a major epigenetic regulator of chromatin conformation and gene expression.
  • the dynamic nature of histone acetylation is determined by the balance between histone acetyltransferase activity and HDAC enzymes (Thiagalingam S, et al. Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann NY Acad Sci 2003; 983: 84-100).
  • HDACs are involved in a variety of cellular activities such as gene transcription, protein expression, protein-protein interactions, protein intracellular localizations, and cellular signaling (Witt O, et al. HDAC family: What are the cancer relevant targets? Cancer Lett 2009; 277: 8-21).
  • HDACs regulate the expression and activity of several proteins associated with the development and progression of cancer (Marks P, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK.Histone deacetylases and cancer: causes and therapies.Nat Rev Cancer 2001; 1: 194-202, and Glozak MA, Seto E. Histone deacetylases and cancer.Oncogene 2007; 26: 5420-5432).
  • HDAC family members are aberrantly expressed in some tumors and have a non-incidental function of regulating the signs of cancer cells (Witt 0, et al, 2009 and Marks P, et al, 2001). Since abnormal HDAC activity was initiated during the tumorigenization process, considerable effort has been put into developing HDAC inhibitors that can modify histone acetylation status and promote the re-expression of tumor suppressor genes that have stopped abnormal expression. It was.
  • HDAC6 is overexpressed in many human cancer cell lines and mouse tumor models.
  • HDAC6 has been regarded as a therapeutic target because cancer cells play an important role in many of the signaling pathways necessary for survival and appearance (Aldanai Masangkay GI, Sakamoto KM.The role of HDAC6 in cancer J Biomed Biotechnol; 2011: 875824).
  • HDAC6 expression can be expressed in squamous cell cancer (Sakuma T, et al. Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 2006; 29: 117-124), human breast cancer tissues ( Yoshida N, et al.
  • HDAC6 has anti-tumor function in liver cancer production process.
  • the present inventors found that the ectopic expression of HDAC6 inhibits the growth and proliferation of liver cancer cells without affecting cell cycle progression or apoptosis (FIG. 2).
  • the above findings suggest that HDAC6 acts as a tumor suppressor in the development of liver cancer, and thus is contrary to previous reports on the tumorigenic function of HDAC6 in the development and progression of cancer.
  • HDAC6 is located only in the cytoplasm that can be associated with microtubules and actin cytoskeleton. In addition, HDAC6 is believed to play an important role in the intracellular management of protein pools. Unlike other HDAC family members, HDAC6 has ubiquitin ⁇ binding activity and is associated with both microtubules and F ⁇ actin cytoskeleton (Hubbert C, et al. HDAC6 is a microtubule associated associated deacetylase. Nature 2002; 417: 455 -458 and Zhang X, Yuan Z, Zhang Y, Yong S, Salas' Burgos A, Koomen J, et al.
  • HDAC6 modulates cell motility by altering the acetylation level of cortactin.Mol Cell 2007; 27: 19 he 213). Recently, it has been reported that HDAC6 regulates the fusion of autophagosomes and lysosomes, an evolutionarily conserved protein-degradation pathway in eukaryotes, and regulates autophagy, which is essential for cell survival in nutrient-restricted conditions.
  • Lee JY, et al. HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin— selective quality-control autophagy. EMBO J; 29: 969-980 and Levine B, Klionsky DJ. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.
  • Autophagy has a variety of pathways, and abnormalities in the autophagy signaling pathway have been found in cancer and many other diseases. Paradoxically, autophagy has been reported to promote cell death in the course of cell survival and cancer development and in cancer treatment (RosenfeWt MT, Ryan KM. The multiple roles of autophagy in cancer. Carcinogenesis; 32: 955—963). , Bonn. Examples of the invention show that HDAC6 functions as a tumor suppressor agent by activating apoptosis by autophagy in liver cancer.
  • mTOR mimalian target of rapamycin
  • AIF apoptosis-inducing factor
  • ROS reactive oxygen species
  • CDK cyclin-dependent kinase
  • Beclin 1 overexpresses HDAC6 in mouse tumor tissue. Induced from Hep3B cells (FIG. 5F).
  • Beclin 1 may play an important role in binding proteins from the cell to the autophagy or providing an autophagy pathway to membrane constructs (Liang XH, et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin Nature 1999; 402: 672-676), and can also be an important 'molecular switch' of autophagy and apoptosis in mammals (Kang R, Zeh HJ, Lotze MT, Tang D. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis.Cell Death Differ; 18: 571 ⁇ 580). In addition, Beclin 1 dysfunction has been observed in various diseases including cancer, and therefore, it is thought to be able to function as a tumor suppressor by promoting macroautophagy of cells.
  • HDAC6 overexpression in Hep3B cells promoted Beclin 1 expression in a manner similar to ceramide, a potential autophagy inducer.
  • siRNA silencing of HDAC6 blocked Beclin 1 induction and autophagy, which was confirmed by reduced LC3B-II conversion (FIGS. 6A and B).
  • the link between Beclin 1 induction and HDAC6 ⁇ induced autophagy was further enhanced by the fact that 3—MA inhibited Beclin 1 expression in HDAC6 overexpressing cells (FIG. 6C).
  • the present inventors focused on the relationship between JNK pathway activity and Beclin 1 expression in HDAC6-induced autophagy.
  • the JNK pathway is activated during HDAC6—induced autophagy in liver cancer cell lines, which has been shown to induce Beclin 1 expression.
  • siRNAs targeting the JNK-specific inhibitors SP600125 and HDAC6 inhibited Bedin 1 up-regulation and autophagy induction (FIGS. 6B and 7C).
  • c-Jun was also shown to be related to Beclin 1 regulation of HDAC6—induced autophagy (FIG. 7).
  • the present invention provides a method of inhibiting or inhibiting HDAC6 expression in liver cancer; Efficacy expression of HDAC6 shows that it inhibits tumor growth in vitro and in vivo by promoting autophagy apoptosis and activating the JNK-mediated Beclin 1 pathway. It demonstrates that it functions as a tumor suppressor by activating caspase—independent autophagy apoptosis, thus suggesting the clinical potential of HDAC6 as a therapeutic agent for liver cancer. Accordingly, the present invention provides a marker for diagnosing liver cancer comprising an HDAC6 (Histone deacetylase 6) gene or an HDAC6 protein encoded from the gene.
  • HDAC6 Histone deacetylase 6
  • diagnosis refers to confirming a pathological condition.
  • diagnosis means confirming the presence or absence of expression of a liver cancer diagnostic marker and confirming the occurrence of liver cancer.
  • Diagnosis in the present invention includes determining whether liver cancer diagnostic markers are expressed and the degree of expression, and determining whether the liver cancer is developed, developed, and alleviated.
  • the diagnostic marker refers to a substance capable of distinguishing the cells of liver cancer from the normal cells and diagnosed, a polypeptide or nucleic acid (for example, mRNA that shows an increase or decrease in cells of liver cancer compared to normal cells) Organic lipid molecules, such as lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides), and the like.
  • the marker for diagnosing liver cancer provided by the present invention may be an HDAC6 gene or a protein whose expression amount is reduced in cells of liver cancer compared to normal cells, and preferably, the HDAC6 gene has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides a composition for diagnosing liver cancer comprising a substance for measuring the level of HDAC6 gene or the level of HDAC6 protein.
  • the level of the HDAC6 gene preferably, the mRNA level of the HDAC6 gene is expressed, that is, the amount of mRNA, and the substance capable of measuring the level may include a primer or probe specific for the HDAC6 gene.
  • the primer or probe specific for the HDAC6 gene may be a primer or probe capable of specifically amplifying the entire HDAC6 gene represented by SEQ ID NO: 1 or a specific region of the gene, and the primer or probe may be You can design through the public way.
  • primer refers to a single that can serve as an initiation point for template—indicative DNA synthesis under suitable conditions (ie, four different nucleoside triphosphates and polymerases) at a suitable temperature and in a complete bedrock. -Refers to stranded oligonucleotides. Suitable lengths of primers can vary depending on the use of various factors such as silver and prima. In addition, the sequence of the primer does not need to have a sequence that is completely complementary to some sequences of the template, and may be divided if it has a broad complementarity within a range capable of being unique with the template to allow the primer to function uniquely.
  • the primers of the present invention do not need to have a sequence that is perfectly complementary to the nucleotide sequence of the HDAC6 gene, which is a template, and is sufficient to have a sufficient complementarity within a range capable of hybridizing to the gene sequence and acting as a primer. .
  • the primer according to the present invention can be used for gene amplification reaction.
  • the amplification reaction refers to reactions that amplify nucleic acid molecules, and the amplification reactions of such genes are well known in the art, for example, polymerase chain reaction (PCR), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), Ligase chain reaction (LCR), electron mediated amplification (TMA), nucleic acid sequence substrate amplification (NASBA), and the like.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • LCR Ligase chain reaction
  • TMA electron mediated amplification
  • NASBA nucleic acid sequence substrate amplification
  • the term probra is a natural or modified monomer or chain It refers to a linear oligomer of (linkages), including deoxyribonucleotides and ribonucleotides, and can specifically hybridize to the target nucleotide sequence, present naturally or artificially synthesized.
  • the probe according to the invention may be a single chain, preferably oligodioxyribonucleotides.
  • Probes of the invention may include natural dNMPs (ie, dAMP, dGMP, dCMP and dTMP), nucleotide analogues or derivatives.
  • the probes of the present invention may also comprise ribonucleotides.
  • the probes of the present invention may be backbone modified nucleotides such as peptide nucleic acids (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365: 566-568 (1993)), phosphorothioate DNA, phosphorodithioate DNA, phosphoramidate DNA, flax-linked DNA, MMI-linked DNA, 2'-0-methyl RNA, alpha -DNA And methylphosphonate DNA, sugar modified nucleotides such as 2 ' ⁇ O-methyl RNA, 2'-fluoro RNA, 2'-amino RNA, 2'-0-alkyl DNA, 2'- O-allyl DNA, 2′-0—alkynyl DNA, nuclear source DNA, pyranosyl RNA and anhydronucleophilic DNA, and nucleotides with base modifications such as C-5 substituted pyrimidines (substituents are MO—, Chloro-, Iodo-, Methyl ⁇ ,
  • the substance capable of measuring the level of the HDAC6 protein in the present invention may include a polyclonal antibody, a monoclonal antibody and a recombinant antibody round antibody that can specifically bind to the HDAC6 protein.
  • a method for generating an antibody using the protein may be known by a person skilled in the art. It can be manufactured easily.
  • HDAC6 antigen can be injected into an animal and collected from the animal to obtain a serum containing the antibody, and the polyclonal antibody can be produced by a method well known in the art.
  • the hybridoma method is well known in the art. Can be prepared using the method (Kohler et al, European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976) or phage antibody library (Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991).
  • the antibodies according to the invention may comprise not only a complete form having two full length light chains and two full length heavy chains, but also functional fragments of antibody molecules.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that retains at least antigen binding functions and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv rounds.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing liver cancer comprising a composition for diagnosing liver cancer capable of measuring the expression level of an HDAC6 protein or a gene encoding the same.
  • Liver cancer diagnostic composition included in the liver cancer diagnostic kit of the present invention may include a primer, a probe or an antibody that can measure the expression level of the HDAC6 protein or a gene encoding the same, the definition thereof is as described above.
  • the kit of the present invention may optionally contain reagents necessary for PCR amplification, such as complete fluid, DNA polymerase (eg, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus ( Tth), Thermus filif ormis, Thermis flavus, Thermococcus liter alis or Pyrococcus to furiosus (Pfu) '' a thermal stability resulting from DNA jeunghap enzyme), may include a DNA polymerase joinja and dNTPs, in the invention of liver cancer diagnostic kit
  • the kit of the present invention may optionally comprise a secondary antibody and a substrate of the label.
  • the kits according to the invention can be produced in a number of separate packaging or compartments comprising the reagent components described above.
  • the present invention provides a liver cancer diagnostic microarray comprising a composition for diagnosing liver cancer capable of measuring the expression level of HDAC6 protein or a gene encoding the same.
  • a primer, probe or antibody capable of measuring the expression level of an HDAC6 protein or gene encoding it is used as a hybridizable array element and immobilized on a substrate:
  • Preferred substrates are suitable rigid or semi-rigid supports, for example membranes, filters, chips, Slides, wafers, fibers, magnetic beads or nonmagnetic beads, gels, tubing, plates, polymers, microparticles and capillaries.
  • the hybridization array element is arranged and immobilized on the substrate, and such immobilization can be performed by chemical bonding methods or covalent binding methods such as UV.
  • the hybridization array element can be bonded to a glass surface modified to include an epoxy compound or an aldehyde group, and can also be bonded by UV at the polylysine coated surface.
  • the hybridization array element can be coupled to the substrate via a linker (eg, ethylene glycol oligomer and diamine).
  • sample to be applied to the microarray of the present invention is a nucleic acid label
  • the present invention can provide a method for diagnosing liver cancer by measuring the expression level or HDAC6 protein level of the HDAC6 gene, the method (a) the amount of expression of the HDAC6 (Histone deacetylase 6) gene present in the biological sample or Measuring the amount of protein; And (b) comparing the measurement result of step (a) with the expression amount or protein amount of the HDAC6 gene of the control sample.
  • the method of measuring the expression level or HDAC6 protein level of the HDAC6 gene in the above may be carried out including a known process for separating mRNA or protein from biological samples using known techniques.
  • the "biological sample” refers to a sample collected from a living body, which is different from the normal control, in which the expression level or protein level of the HDAC6 gene according to the liver cancer occurrence or progression is used.
  • it may include tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva and urine.
  • the expression level of the HDAC6 gene is preferably to measure the level of mRNA, the method of measuring the level of mRNA reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time reverse transcription polymerase chain reaction, RNase protection assay, Northern blots and DNA chips, but are not limited thereto.
  • the HDAC6 protein level may be measured using an antibody.
  • the HDAC6 marker protein and a specific antibody in the biological sample form a conjugate, that is, an antigen-antibody complex, and the amount of the antigen-antibody complex is detected. Quantitative measurements can be made through the magnitude of the signal on the label.
  • the detection label may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules, and radioisotopes, but is not limited thereto.
  • the present invention can determine the amount of HDAC6 mRNA expression or protein in the control group and the amount of HDAC6 mRNA expression or protein in liver cancer patients or suspected liver cancer patients through the above-described detection methods, and the degree of expression By comparing with, we can predict and diagnose the development, progression or prognosis of liver cancer.
  • the present invention further comprises the steps of: (a) contacting a sample to be analyzed with a liver cancer cell comprising a HDAC6 (Histone deacetylase 6) gene or an HDAC6 protein; (b) measuring the expression amount of the HDAC6 gene, the amount of HDAC6 protein or the activity of HDAC6 protein; And (c) determining that the sample is a material for preventing or treating liver cancer when the measurement result of step (b) increases the expression level of HDAC6 gene, the amount of HDAC6 protein, or the activity of HDAC6 protein.
  • a method for screening a substance for preventing or treating liver cancer is provided.
  • a sample to be analyzed may be contacted with liver cancer cells containing the HDAC6 gene or protein.
  • the sample refers to an unknown substance used in screening to examine whether the expression of HDAC6 gene, the amount of HDAC6 protein, or the activity of HDAC6 protein is affected.
  • the sample may include, but is not limited to, chemicals, nucleotides, antisense-RNA, small interference RNA (siRNA), and natural product extracts.
  • the expression level of the HDAC6 gene, the amount of HDAC6 protein or the activity of the HDAC6 protein can be measured in the cells treated with the sample.
  • the sample may be determined as a substance capable of treating or preventing liver cancer.
  • the method of measuring the expression amount of HDAC6 gene, the amount of HDAC6 protein or the activity of HDAC6 protein in the above can be carried out through various methods known in the art, for example, but not limited to reverse transcriptase polymerase Reverse transcriptase-polymerase chain reaction, real time—polymerase chain reaction, western blot, northern blot, enzyme linked immunosorbent assay, immunoblot analysis, immunohistochemical staining , Radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, and immunoprecipitation assays.
  • the present 'invention provides a composition for treating liver cancer comprising a gene or HDAC6 protein HDAC6 (Histone deacetylase 6) as an active ingredient.
  • the HDAC6 gene is inserted into an animal cell expression vector.
  • the HDAC6 protein is characterized in that it has a mechanism for promoting cell death by autophagy by activating the JNK-mediated Beclin 1 pathway.
  • the composition contains the HDAC6 gene or HDAC6 protein as an active ingredient for use as a pharmaceutical composition.
  • the HDAC6 gene included in the pharmaceutical composition of the present invention is inserted into an expression vector such as a plasmid or a viral vector, and then introduced into the target cell by a method known in the art, such as transfectic. Can be used for gene therapy.
  • a gene delivery method using a plasmid expression vector is a method for delivering plasmid DNA directly to human cells, which can be used by a person approved by the FDA (Nabel, E. G., et al., Science, 249: 1285-1288, 1990).
  • Plasmid DNA has the advantage of being able to be homogeneously purified, unlike viral vectors.
  • mammalian expression plasmids known in the art can be used.
  • mammalian expression plasmids known in the art can be used.
  • pRK5 European Patent No. 307,247
  • pSV16B Counter Patent Publication No. 91/08291
  • pVL1392 PharMingen
  • pCDNA3.1 Invitrogen
  • a plasmid expression vector comprising a nucleic acid according to the present invention is a method known in the art, for example, but not limited to, transient transfection, microinjection, transduction ), Cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection transfection, electroporation, gene guns and other known methods for introducing DNA into cells (Wu et al., J. Bio. Chem., 267: 963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263: 14621-14624, 1988).
  • known suitable viral vectors can be used in the pharmaceutical compositions of the present invention.
  • a cell line stably overexpressing HDAC6 was produced through liposome-mediated transfection.
  • the HDAC6 expression vector synthesizes the full-length HDAC6 coding sequence insert that can express the HDAC6 protein by PCR and inserts it into the pcDNA 3,1 (invitrogen) vector to produce the HDAC6_pcDNA 3,1 vector. It was.
  • HDAC6 ⁇ pcDNA 3,1 vector was transiently transfected using liposome (lipofectamine 2000, invitrogen) to Hep3B liver cancer cell line where HDAC6 expression was inhibited, and in fact, HDAC6 overexpressed in Hep3B and various liver cancer cell lines. It was confirmed that the inhibition of cell growth. This phenomenon was thought to be caused by the overexpression of HDAC6 caused by autophagic cell death in liver cancer. Then, to investigate the tumor suppression effect of HDAC6 in liver cancer suppression in animal experiments, cells that stably overexpress HDAC6 were prepared. The method is as follows. The HDAC6_pcDNA 3,1 vector is transiently transfected into liver cancer cells.
  • liver cancer cells are selected using geneticin (antibiotic). Since HDAC6_pcDNA 3,1 vector is resistant to geneticin, cells containing HDAC6 ⁇ pcDNA 3,1 vector will continue to grow without geneticin killing. Single cells containing HDAC6NA pcDNA 3,1 vector continue to grow and call When one colony is extracted and each cell is grown again, one cell becomes a clone in which HDAC6 is stably overexpressed. After the production of the HDAC6 overexpressing cells, it was confirmed that the effect of transfection with the HDAC6 transient, and then the animal experiments. Finally, HDAC6 siRNA (Dharmacon) transient transfection was performed to stably overexpressed cells to determine whether autophagic cell death caused by HDAC6 overexpression was suppressed again.
  • HDAC6 siRNA Dharmacon
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not cause allergic reactions or similar reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness, etc. when administered to humans. Examples include stable oral carriers such as lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, and stearic acid and parenteral administration carriers such as water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycol dung.
  • suitable preservatives include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid
  • suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl—para Ben and chlorobutanol
  • Other pharmaceutically acceptable carriers include Reference may be made to Hunt (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995.)
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be combined with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in various parenteral or oral dosage forms according to known methods, for parenteral administration
  • Representative formulations are preferably injectable formulations, preferably isotonic aqueous solutions or suspensions
  • injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • Each component may be formulated for injection by dissolving in saline or buffer, and, including but not limited to, oral dosage forms. , Granules, tablets, pills and capsules.
  • compositions formulated in such a manner may be administered in an effective amount via a variety of routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, which is intended to introduce certain substances into a patient in any appropriate manner.
  • the route of administration of the substance may be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the effective amount in the above means an amount exhibiting a prophylactic or therapeutic effect when administered to a patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on various factors such as the type and severity of the patient, age, sex, weight, sensitivity to the drug, type of current treatment, administration method, target cells, and the like. It can be easily determined by experts in the field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in combination with a conventional therapeutic agent, may be administered sequentially or simultaneously with the conventional therapeutic agent, and may be administered singly or multiplely.
  • all of the above factors can be administered in an amount that can achieve the maximum effect in a minimum amount without side effects, more preferably riOOOO ⁇ g / weight kg / day, even more preferably 10 ⁇ 1000mg / weight
  • the effective dose of kg / day may be repeated several times a day.
  • HDAC6 protein levels in liver cancer samples immunohistochemical staining was performed using monoclonal antibodies against HDAC6 (1: 100, Santa Cruz, Delaware, CA) on tissue microarray samples. Prior to immunostaining, paraffin was removed from the tissue microarray (TMA) slides and hydrated using a series of staged ethanol up to DI water. Endogenous peroxidase activity was blocked by incubating 3% hydrogen peroxide methane in the buffer for 5 minutes. Antigens were diluted by steaming the slides for 20 minutes in a steamer containing boiling sodium citrate buffer (pH 6.0).
  • Human liver cancer cell lines HepG2, Hep3B, PLC PRF / 5, SNU ⁇ 182, SNU-387, SNU-423, and SNU-449 were purchased from American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA), and human liver cancer cell lines SNU—354. And SNU-368ol from Korean Cell Line Bank (KCLB, Korea).
  • the cells were stored in RPMI 1640 or DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Sigma, St Louis, MO) and 1 mg / ml penicillin / straptomycin (Invitrogen, Grand Island, NY).
  • N-acetyl-D-sphingosine (ceramide), 3-methyladenine (3-MA), and SP600125 were purchased from Sigma.
  • HDAC6 overexpression was confirmed by Western blot analysis.
  • the cells were placed in 6 mm 3 well plates at a concentration of 1> ⁇ 10 5 cells / well in RPMI 1640 medium containing 10% FBS and left for 16-18 hours. After 4 hours of transfection, the medium was replaced with fresh RPMI 1640 medium containing replaced 10% FBS. Cells were then incubated with 5 mg / ml MTT- [3 ⁇ (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliu ⁇ bromide] solution (Sigma) for 1 hour.
  • Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Diego, Calif.) was used to quantify apoptosis levels. Briefly, after trip Xin (tr psinized) the cells, washed twice with cold PBS, IX binding buffer (binding buffer) was suspended (resuspension) reproduction in a concentration of ⁇ ⁇ ⁇ 6 cells / m ⁇ as. Then the above cell suspension containing the 100 ⁇ 5 ⁇ culture ryubeu ( ⁇ ⁇ ⁇ 5 cells to include a) was added to 5 / annexin (annexin) V-FITC and 10 PI (propidium iodide) solution. After 15 minutes of incubation at room temperature in the dark, 400 / ⁇ IX binding buffer (binding buffer) was added to each tube, and apoptosis was measured using a FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences).
  • HDAC6 and Beclin 1 ON-TARGET plus SMART pool human siRNA (HDAC6 and Beclin 1) and Silencer Negative Control siRNA (scrambled siRNA) were purchased from Dharmacon (Lafayette, CO) and Ambion (Austin, TX), respectively.
  • Stable HDAC6 overexpressing Hep3B cells were obtained using trypsin EDTA, plated 1.5> 10 5 cells in a 60 mm dish and grown overnight in incubator. 16-18 hours after plate culture, cells were treated with 100 nmol / L and / or 200 nmol / L HDAC6 and Beclin 1-specific siRNA Transfection was performed with a finite Opti-MEM (Invitrogen). Introduction was performed using lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. Four to six hours after transduction, the medium was replaced with fresh RPMI 1640 medium containing 10% FBS (Lonza, Basel, Switzerland).
  • Cells were plated with RPMI / 10% FBS on poly-L-lysine coated glass coverslips and then transduced with empty mock HDAC6 expression vector or subject vector. Cells were then washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde solution in silver for 10 minutes, washed with PBS and permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 15 minutes. After blocking the nonspecific binding site with 4% bovine serum albumin in PBS, the cells were washed three times, incubated with LC3B antibody (1: 100) at 4 ° C, and Alexa Fluor 488-linked secondary antibody ( 1: 1000, Invitrogen) was treated for 1 hour at room temperature.
  • LC3B antibody 1: 100
  • Alexa Fluor 488-linked secondary antibody 1: 1000, Invitrogen
  • Hep3B cells stably overexpressing Hep3B cells were cultured in plastic flasks as monolayers, and fixed in 0.1M PBS with 4% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde overnight. Cells are then subjected to 1% osmium tetroxide post-fixation, dehydrated with 5 to 100% alcohol series, stained with 0.5% uranyl acetate, and Poly / Bed 812 resin (Pelco, Redding, CA). ), And then thickened. Samples were cut using Ultracut S (Leica, Wetzetlar, Germany) and ultrathin sections were stained with 1% uranyl acetate and 0.2% lead citrate. Cells were observed and photographed with a transmission electron microscope (JEM-1010, Tokyo). ⁇ 1-12> Tumor Xenograft Assay
  • xenograft tumorigenesis assays For xenograft tumors tested (xenograft tumorigenesis assays), it was mixed with ⁇ ⁇ ⁇ (phosphate buffer saline) for 7 cells coming 2 PBS (PH 7.4) and matrigel matrix (BD Biosciences) at the aforementioned target cell line. Cell suspensions were then subcutaneously injected into 4 week old male nude mice. Group 1 was injected with Hep3B cells incorporating a mock, and Groups 2 and 3 were injected with cells introducing Hep3B clones 1 and 2 stably overexpressing HDAC6. Tumor formation at the injection site of mice was examined twice a week. Tumor volume was calculated using the formula 0.5 X length (L) X width 2 (W 2 ). Each experimental group consisted of 5 mice, and tumor growth was quantified by measuring the size of the tumor in three orthogonal directions using calipers. Results are expressed as mean of tumor volume and have a 95% confidence interval.
  • Hep3B cells were plated in 60-mm dishes at a concentration of 5 ⁇ 5 each, allowed to attach overnight, and then transduced. The cells were then treated with PBS containing 10 uM of 5- (and-6) -carboxy-2 ⁇ 7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy— H2DCFDA; Invitrogen, Carls bad, CA) for 30 minutes, and CellQuestPro software Flow cytometry was performed with a fitted FACSCalibur (BD Biosciences, San Diego, Calif.).
  • HDAC6 Effect of HDAC6 Expression on Liver Cancer Growth
  • Overexpression of HDAC6 has been reported in many types of cancer cell lines and is known to be required to maintain the transformed traits of many oncogenic cell lines (Aldana-Masangkay GI, Sakamoto KM.The role of HDAC6 in cancer J Biomed Biotechnol; 2011: 875824).
  • the present inventors previously analyzed the HDAC6 expression by microarray analysis based on large-scale transcript change during the development of liver cancer (Nam SW, Park JY, Ramasamy A, Shevade S, Islam A, Long PM, et al.
  • HDAC6 was significantly down-regulated at the site of liver cancer compared to lesions before tumor expression ( Figure 1A). ). Therefore, in order to investigate abnormal expression of HDAC6, the present inventors performed an immunooblot analysis of HDAC6 in human liver cancer tissues. As shown in FIG. 1B, HDAC6 was significantly downregulated in all selected liver cancers as compared to the control non-hepatic cancer tissues. In line with this decrease in HDAC6 expression, the accumulation of alpha-tubulin in a highly acetylated form was observed in liver cancer.
  • HDAC6 expression is downregulated in liver cancer
  • the present inventors measured HDAC6 expression by immunohistochemistry using HCC TMA. Immunostaining results are shown in Table 1, and representative immunostaining results are shown in FIG. 1C.
  • HDAC6 was mostly located in the cytoplasm. Of the 32 normal hepatocellular samples tested, 30 (93.7%) had moderate or strong immunopositive responses to HDAC6 expression, while 15 (46.9%) of 32 liver cancer cases tested Weak stained or negative. In addition, liver cancer (HCC) was never strongly stained for HDAC6. Also found in nine different hepatocellular carcinoma cell lines first established in hepatoblastoma or hepatocellular carcinoma (HepG2, Hep3B, PLC / PRF / 5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU423, and SNU449). Endogenous expression of HDAC6 was measured by Northern and Western blot analysis (FIG. ID). There were some exceptions, but as expected, human liver cancer cell lines showed relatively low HDAC6 expression (FIG. 1D). These results show that the regulation of HDAC6 was deregulated during cancer development.
  • HDAC6 full-length human HDAC6 cDNA
  • pcDNA_HDAC6 full-length human HDAC6 cDNA
  • HDAC6 did not affect the expression of cell cycle proteins such as pl5INK4B, P 21WAF1 / Cipl, or cyclin-dependent kinase 2 (FIG. 2F). These results indicate that HDAC6 overexpression induces mitotic defects that can be mediated by caspase-independent cell death.
  • HDAC6 a ubiquitin-binding deacetylase
  • HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin-selective quality-control autophagy.EMBO J; 29: 969—980), we believe that the ethical expression of HDAC6 induces cell death by autophagy in liver cancer. I found out.
  • LC3-II phosphatidylethanolamine
  • Atg8 microtubule-associated protein 1 light chain 3
  • HDAC6 histone deacetylase 6
  • SNU182, SNU368, and SNU449 cell lines with little or no expression of HDAC6 from Northern and Western blot analysis (FIG. 1D).
  • Each cell line was transfected with pcDNA_HDAC6.
  • the growth rate of HDAC6 and expressing cells was lower than the control (non- or mock introducing cells).
  • all cell lines overexpressing HDAC6 showed increased LC3B-II conversion, which was a tumor suppressor due to caspase-independent autophagy cell death of HDAC6. It suggests the function as.
  • Hep3B_HDAC6 clones # 1 and # 2 that stably overexpress HDAC6. Reduction of acetylated alphavtubulin in the cells was detected to confirm overexpression of active HDAC6 (FIG. 5A, left). In addition, gastric cells showed lower growth than mock cells (Hep3B ⁇ Mock) (FIG. 5A, right). In addition, the immunofluorescence assay showed that LC3B accumulation was observed in HDAC6 overexpressing cells (Hep3BAC HDAC6), and LC3B accumulation was hardly observed in control cells (Hep3B ⁇ Mock) (FIG. 5B).
  • Beclin 1 was involved in the early stages of autophagy, promoting the crystallization of autophagy vesicles and the recruitment of proteins from the cytoplasm.
  • Beclin 1 was involved in the early stages of autophagy, promoting the crystallization of autophagy vesicles and the recruitment of proteins from the cytoplasm.
  • Beclin 1 expression is directly related to autophagosome production and that Beclin 1 interacts with antiapoptotic Bel-2 family members Bcl-2 and Bcl-xL ( Liang XH, Jackson S, Seaman M, Brown K, Kempkes B, Hibshoosh H, et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1.Nature 1999; 402: 672—676).
  • the present invention shows that HDAC6 overexpression in Hep3B cells mediates cell death by autophagy via the activity of the Beclin 1 and LC3 ′ II pathways.
  • HDAC6 overexpressing cells expressed much more Beclin 1 and LC3B-II than Hep3B_Mock cells. This effect of HDAC6 on autophagy was confirmed by treating cells with ceramide, which potentially induces apoptosis by gastric cell lines.
  • HDAC6 was inactivated with siRNA directed to it. As expected, HDAC6 knockdown significantly inhibited Beclin 1 expression and conversion of LC3B—I to LC3B-II (FIG. 6B).
  • 3—MA On HDAC6 overexpressing cells.
  • Hep3B_HDAC6 cells treated with 3-MA inhibited Beclin 1 and LC3B-II expression.
  • Beclin 1 knockdown on HDAC6-mediated autophagy we examined the effect of Beclin 1 knockdown on HDAC6-mediated autophagy.
  • Beclin 1 knockdown in HDAC6 overexpressing cells (Hep3B_HDAC6 clones # 1 and # 2) significantly inhibited LC3B-II production.
  • HDAC6 shows tumor suppression effects through Beclin 1 and LC3—II processing dependent autophagy in liver cancer cells.

Landscapes

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Abstract

본 발명은 간암 진단용 마커로서의 HDAC6 (Histone deacetylase 6)의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 HDAC6 유전자 또는 단백질을 이용한 간암 진단용 마커, 이를 이용한 간암 진단용 키트, 및 간암의 진단 방법에 관한 것이고, 또한 HDAC6 유전자의 발현을 회복시켜 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 물질을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 HDAC6 유전자는 비-간암의 조직 또는 세포에 비해 간암의 조직 또는 세포에서 발현양이 감소되는 것으로 확인됨에 따라 HDAC6 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 나아가 간암 치료제로 이용될 수 있다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
HDAC 6의 간암 진단용 마커 및 치료제로서의 용도 【기술분야】
본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 간암 진단용 마커， 간암 진단용 키트, 상기 간암 진단용 마커를 이용한 간암의 진단 방법， 상기 마커 물질을 이용한 간암 치료용 조성물 및 이의 스크리닝 방법에 관한 것이 다-
【배경기술】
간암은 전 세계적으로 다섯 번째로 빈발하는 암이지만 그로 인한 사망를은 3 위에 해당하는 공격적인 암이다 (Ahn J, Flamm SL. Hepatocellular carcinoma. Dis Mon 2004；50：556-573). 치료목적의 수술은 단지 15%에서 25% 정도의 환자에게만 가능하고 대부분의 간암 환자들은 국부적으로 진행하거나 전이되는 질병들에 의해 비교적 단기간 내에 사망한다 (Roberts LR, Gores GJ. Hepatocellular carcinoma: molecular pathways and new therapeutic targets. Semin Liver Dis 2005；25：212-225). 간암의 주요 원인으로 B형 간염 바이러스 (hepatitis B virus), C형 간염 바이러스 (hepatitis C virus), 및 아플라톡신 BKaflatoxin B1) 둥이 잘 알려져 있다. 하지만, 지난 20년간 간암 환자의 전체적인 생존율은 크게 증가하지 않았고, 간암의 발달 (development) 및 진전 (progression) 기작은 여전히 잘 알려져 있지 않은 상태이다 (Bruix J, et al. Focus on hepatocellular carcinoma. Cancer Cell 2004；5：215-219). 지금까지， 분자표적치료 (molecular targeted therapy)가 성숙한 간암 의 치료에 효과적인 것으로 나타났지만 (Shen YC, Hsu C, Cheng AL. Molecular targeted therapy for advanced hepatocellular carcinoma: current status and future perspectives. J Gastroenterol;45:794— 807), 어떻게 이러한 유전적 변화가 간암 환자 들 개개인에게 관찰되는 임상적 특징들을 야기하는지는 불명확하다. HDACs (Histone deacetylases)는 종종 보조억제자 (corepressors)나 다증 -단백 질 전사복합체 (multi— protein transcriptional complexes)들에 의해 유전자 프로모터 에 붙을 수 있으며， 그곳에서 DNA에 직 접 결합하지 않고 크로마틴 (chromatin) 변형을 통해 전사를 조절한다 (Thiagalingam S, Cheng KH, Lee HJ, Mineva N, Thiagalingam A, Ponte JF. Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann N Y Acad Sci 2003;983:84-100). 암호화된 사람 HDACs는 18개가 있으며 , 이들은 클래스 I (HDAC 1, 2， 3 및 8)， 클래스 II (HDAC 4, 5， 6， 7， 9 및 10)， 클래스 III (SIRT 1—7)， 및 클래스 IV (HDAC11) 효소들로 분류 된다 (Yang XJ, Seto E. The Rpd3/Hdal family of lysine deacetylases'- from bacteria and yeast to mice and men. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:206-218). 히스 톤 아세틸화 효소 (acetyltransf erases) 및 HDACs 모두 세포 증식， 분화 및 세포주기 조절에 관여 한다는 사실이 알려져 있다 (Witt 0， Deubzer HE, Milde T, Oehme L ; HDAC family: What are the cancer relevant targets? Cancer Lett 2009;277:8一 21). 또한， HDACs의 병 리학적 활성 및 조절감소 (deregulation)가 암， 면역 질환， 및 근이 영 양증 (muscular dystrophy)과 같은 여러 질병들을 야기 할 수 있다는 사½이 보고되 었 다 (Yang XJ, Seto E. HATs and HDACs: from structure, function and regulation to novel strategies for therapy and prevention. Oncogene 2007;26:5310-5318). 하지 만, HDACs의 암 발달에의 관여 에도 불구하고， 암 발달의 조절과정에서 개별적 인 HDACs가 수행하는 구체적 인 역 할들은 아직 밝혀져 있지 않다.
HDAC6는 HDACs의 클래스 lib 패밀리 멤버 이 고, 미 세소관 (MTs)과 관련 있 는 세포질내 탈아세틸화효소 (cytoplasmic deacetylase)로 작용하며， 알파—류불린 (α -tubulin)을 탈아세틸화시 킨다 (Hubbert C, Guardiola A, Shao R, Kawaguchi Y, Ito A, Nixon A, et al. HDAC6 is a microtubule-associated Misl8a. Nature 2002；417：455-458). 반면에， 미 세소관 -관련 HDAC6는 리소좀에 의한 단백 질 분해 경 로에서 핵심 적 인 구성요소이 며， 잘못 접 히 거 나 폴리—유비 퀴 틴화된 단백 질들과 직 접 적으로 반웅하여 아그레좀 (aggresome) 형성 /오토파지 (autophagy)를 통해 리소좀一매 개 단백질 분해과정을 거치도록 한다 (Kawaguchi Y, Kovacs JJ, McLaurin A, Vance JM, Ito A, Yao TP. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell 2003;115:727-738, Boyault C, Zhang Y, Fritah S, Caron C, Gilquin B, Kwon SH, et al. HDAC6 controls major cell response pathways to cytotoxic accumulation of protein aggregates. Genes Dev 2007;21:2172-2181). 최 근에는 HDAC6가 오토파고좀 (autophagosome) 성숙을 조절하여 오토파고좀-리소좀 융합 단계에서 오토파지 (autophagy) 조절에 관여 한다는 사실이 밝혀졌다 (Lee JY, Koga H, Kawaguchi Y, Tang W, Wong E, Gao YS, et al. HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin-selective quality-control autophagy. EMBO J;29:969-980). 또한 HDAC6가 아그레좀 단백질 분해 과정 에서 잘못 접 힌 단백 질들의 수송에 증요 한 역 할을 함으로써， 세포를 단백질 웅집 체의 유해한 효과로부터 방어 한다는 사실이 보고되 었다 (Kwon S, Zhang Y, Matthias P. The deacetylase HDAC6 is a novel critical component of stress granules involved in the stress response. Genes Dev 2007；21：3381-3394). 또한 HDAC6는 여러 핵심 적 인 세포 기 능 조절을 통해 여 러 암 들의 상피 -중간엽 전이 (epithelial— mesenchymal transition)를 조절하는 것으로 보고 되 었으며 (Lee YS, Lim KH, Guo X， Kawaguchi Y, Gao Y, Barrientos T, et al The cytoplasmic deacetylase HDAC6 is required for efficient oncogenic tumorigenesis. Cancer Res 2008;68:7561-7569, Shan B, Yao TP, Nguyen HT, Zhuo Y, Levy DR, Klingsberg RC, et al. Requirement of HDAC6 for transforming growth factor— betal一 induced epithelialᅳ mesenchymal transition. J Biol Chem 2008;283:21065-21073)， HDAC6의 발현이 종양 변환 (oncogenic transformation), 비 정착적 증식 (anchorage-independent proliferation), 및 종양 공격 성 (tumor aggressiveness)과 관련이 있다는 사실을 뒷받침 하는 여 러 증거들이 있다. 또한， 유전적 제거 또는 특정 siRNA 단편에 의 한 HDAC6의 불활성 화는 종양 변환 에 대한 저항성을 증가시 키 고 시 험관 및 생체 내 실험 모두에서 사람 유방 및 자궁 암 세포주의 성장을 감소시 킨다고 보고되 었다 (Sakuma T, Uzawa K, Onda T, Shiiba M, Yokoe H, Shibahara T, et al. Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 2006; 29: 117—124， Rey M, Irondelle M, Waharte F, Lizarraga F, Chavrier P. HDAC6 is required for invadopodia activity and invasion by breast tumor cells. Eur J Cell Biol;90:128-135). 추가로, 다양한 종양 및 세포주에서의 HDAC6의 상향조절 (up-regulation)은 HDAC6가 암에서 중요한 역할을 할 것이라는 점을 보여주었다. 하지만， 본 발명자들의 전사체 (transcriptome) 분석 데이터에 따르면 HDAC6 는 정상조직과 비교해서 간암에서 하향조절 (down-regulation)을 나타내었으며， 사람 간암 조직에서의 HDAC6의 초기 분석 결과에 따르면 간암에서 HDAC6의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명자들은 간 종양발생과정에서의 HDAC6 의 종양 억제자로서의 생물학적 기능을 밝히기 위하여, 조직 마이크로어레이 (TMA) 분석방법을 이용하여 종양 및 정상 조직에서의 HDAC6 발현을 측정하였다. 그 결과 HDAC6 과발현은 간암 세포에서 Beclin 1/LC3-II 의존적 오토파지 (autophagy)가 일 어나도록 오토파지 JNK/c-Jun 활성 신호전달 경로를 거쳐 전ᅳ오토파지 (pro— autophagic) 세포사멸을 매개한다는 사실을 밝히고 본 발명을 완성하게 되었다. 또한 HDAC6의 종양 억제 활성은 안정적으로 HDAC6를 과발현하는 세포주를 사용 한 생체 내 실험을 통해서도 확인되었다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 HDAC6(Histone deacetylase 6) 유전자 또는 상기 유전자 로부터 코딩되는 단백질의 간암 진단용 마커로서의 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 HDAC6 유전자의 수준 또는 HDAC6 단백질 의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 HDAC6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 간암 예측 및 진단방법을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크 리닝 하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 HDAC6를 이용한 간암 치료용 조성물을 제공 하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서， 본 발명은 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 HDAC6 단백질로 이루어 진 간암 진단용 마커를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서， 상기 HDAC6 유전자는 서열번호 1의 염기서 열을 갖는 것일 수 있다.
또한， 본 발명은 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 수준 또는 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 있어서， 상기 HDAC6 유전자의 수준을 측정하는 물질 은 HDAC6 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서， 상기 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질 은 HDAC6 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.
또한， 본 발명은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측 정결과를 대조군 시료의 HDAC6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단 계를 포함하는 간암 예측 및 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서， 상기 생물학적 시료는 조직， 세포， 혈액， 혈청， 혈장， 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다. ' 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC6유전자의 발현양 또는 HDAC6 단 백질의 양을 측정하는 방법은， 이에 제한되는 것은 아니나， 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실入 1간 증합효소 연쇄반응 (real time一 polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿， 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏 (immunoblot) 분석， 면역조직화학염색법， 방사선면역 분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodif fusion) 및 면역침전 분석법 (immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것일 수 있다. 또한, 본 발명은， (a) HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자 또는 HDAC6 단백질을 포함하는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 HDAC6 유전자의 발현양, HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측정 하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과， HDAC6 유전자의 발현양， HDAC6 단 백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 간암의 예 방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는， 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 HDAC6 유전자의 발현양， HDAC6 단백 질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측정하는 방법은， 이에 제한되는 것은 아니 나, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실 시간 중합효소 연쇄반웅 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿， 노던 블럿， ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역'블릿: (immunoblot) 분석， 면 역조직화학염색법， 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodif fusion) 및 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay)으로 이루어 진 군증에서 선택되는 것일 수 있다.
또한， 본 발명은 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 또는 이의 발현을 촉진하 는 물질을 포함하며， JNK—매개 Beclin 1 경로 (JNK-mediated Beclin 1 pathway)를 활성화시켜 오토파지 (autophagy)에 의한 세포사멸을 촉진하는 기작을 갖고 있는 것 을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물을 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명에 따른 HDAC6 유전자는 정상 조직 또는 세포에 비해 간암의 조직 또는 세포에서 그 발현양이 감소되는 것을 확인하였다. 따라서 HDAC6 유전자를 간 암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며， 나아가 간암 치료제의 개발을 위한 표적으로 활용할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 사람 간암 조직 및 간암 세포주에서 HDAC6 발현의 하향조절 또는 제거를 보여준다. (A) 간암 종양전 결절 (preneoplastic nodules)의 마이크로어레이 분 석에 기초한 HDAC6 mRNA의 유전자 발현. (LGDN, low-grade dysplastic nodule; HGDN, highgrade dysplastic nodule; Gl-3, Edmondson grades ΓΊΠ.) 'P값은 unpaired t test (*P = 0.0124， **P = 0.0001, ***P < 0.0001； two-tailed)를 이용하여 산출했다. (B) 사람 간암 및 인접한 비 -종양 조직에서의 HDAC6 발현을 웨스턴 블 랏으로 분석하였다. (T, 간암 조직; N, 인접한 비 -종양 조직) 알파-류블린 및 GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 를 로딩 컨트를 (internal loading controls)로 사용하였다. (C) 조직 마이크로어레이에 로딩한 사람 간암 및 인 접한 비 -종양 조직 쌍에서 HDAC6에 대한 면역조직화학 염색. (a) HDAC6에 대해 강하게 염색된 대표적인 비 -종양 간세포. (b) HDAC6에 대해 약한 양성 염색을 보 인 간암의 예 (원본 배율 x200). (D) 노던 및 웨스턴 블랏 분석에 의한 사람 간암 세 포주에서의 내생적 HDAC6 발현. RNA 및 단백질 로딩을 조절하기 위해 베타 -액틴 프로브 (β— Actin probe) 및 GAPDH를 각각 사용하였다. 각각의 실험은 적어도 2반복 씩 수행하였다.
도 2는 Hep3B 세포에서 HDAC6의 에토픽 발현이 카스파아제—비의존적인 : 세포사멸을 유도한다는 것을 보여준다. (A) 세포를 대조군 (None), 빈 백터 (Mock), 또는 l g의 HDAC6 발현백터 (pcDNAᅳ HDAC6)로 형질도입시켰다. 왼쪽 패널은 HDAC6 및 아세틸화된 알파 류불린 (Acᅳ α-tubulin)의 수준을 웨스턴 블랏 분석으로 측정한 것이다. 알파-튜뷸린을 로딩 컨트롤로 사용하였다. 오른쪽 패널은 HDAC6를 과발현하는 Hep3B 세포의 대조군 (Mock 또는 None)에 대한 성장를을 보여준다. 세 포 수는 트립판 블루를 이용한 핵 염색으로 측정하였다. 데이터는 세 번의 독립된 실험들의 평균과 표준편차로 표시하였다. (B) 세포증식를을 A570에서의 MTT 흡광 도로 측정하였다. 데이터는 세 번의 독립된 실험들의 평균士표준편차로 나타내었다 (unpaired student t test, *P < 0.05 vs. Mock). (C) 대조군 (None), 빈 백터 (Mock), 또는 1 또는 2 의 HDAC6 발현백터 (pcDNA_HDAC6)로 형질도입 시킨 Hep3B 세 포들의 유세포분석 결과. FITC-표지된 Annexin V-양성 세포들 (오른쪽 위와 오른쪽 아래)을 세포사멸 세포로 간주하였다. 두 번의 독립적인 실험들을 수행하였다. (D) 대조군 (None), 빈 백터 (Mock), 또는 1 또는 2 의 HDAC6 발현백터 (pcDNA_HDAC6)로 형질도입시킨 Hep3B 세포들에서 세포사멸 단백질에 대한 웨스 턴 블랏 분석. 알파—류블린을 로딩 컨트롤로 사용하였다. (E) 세포주기 분포를 측정 하기 위해 유세포분석을 사용하였다. 대조군 (None), 빈 백터 (Mock), 또는 1/«의 HDAC6 발현백터 (pcDNA_HDAC6)로 형질도입 시킨 Hep3B 세포들을 수집하여 PI 로 염색하였다. (F) 대조군 (None), 빈 백터 (Mock), 또는 1 또는 2 /^의 HDAC6 발 현백터 (pcDNA_HDAC6)로 형질도입 시킨 Hep3B 세포에서 세포주기 단백질의 발현 을 측정하기 위해 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 알파-튜블린을 로딩 컨트를로 사 용하였다.
도 3은 Hep3B 세포에서 HDAC6의 에토픽 발현이 오토파지에 의한 세포사멸 을 유도한다는 것을 보여준다. (A) 세포들을 대조군 (None), 빈 백터 (Mock), 또는 1 또는 2 의 HDAC6 발현백터 (pcDNA_HDAC6)로 형질도입시켰다. 왼쪽 패널은 HDAC6, LC3B-II, 및 아세틸화된 알파-류블린 (Ac-α— tubulin)의 수준을 웨스턴 블랏 분석으로 측정한 것이다. 오른쪽 패널은 densitometric 분석으로 알파—류불린 대 LC3B-II 비율을 측정한 것이다. 평균 LC3— II 밴드 강도를 평균 알파-류불린 밴드 강도에 대해 표준화하였다 (unpaired student's t test, *P < 0.05 vs. Mock). (B) Hep3B 세포들을 5 mM 의 3-MA 를 첨가하거나 첨가하지 않고 1시간 동안 전처리 한 후， 1 ^의 HDAC6 발현백터 (pcDNA_HDAC6)를 형질도입 시켰다. LC3B— II 의 수 준은 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다. 균등한 단백질 로딩을 확인하기 워해 막을 알파-류불린에 대해 탐지하였다. 위 실험은 반복적으로 수행되었고 유사한 결과들을 얻었다. (C) 상기 (B)에서와 같은 방법으로 세포들을 전처리하고 형질도입시켰다. 살 아 있는 세포들을 트립신화하고 형질도입 24시간 후에 트립판 블루 염색으로 수를 세었다. 표시된 결과들은 3번의 독립적인 실험들의 평균이며 에러 막대는 평균값의 표준편차를 나타낸다 (unpaired student's t test, *P < 0.05 vs. Mock, **P < 0.05 vs. pcDNA_HDAC6). (D) 상기 (B)에서와 같은 방법으로 Hep3B 세포들을 전처리하 고 형질도입시킨 후， 고정하고， 투명화하고 (permeabilized), LC3B 항체로 면역염색하 고， 형광현미경으로 관찰하였다. 관찰된 이미지에서， 녹색 형광은 오토파고좀의 LC3-FITC 염색을 나타내며， 파랑 형광은 Hoechst-염색된 핵을 나타낸다. 세포질 내의 LC3— FITC 염색의 패턴은 확산형 (diffuse)에서 주로 점 (punctate)/수포 (vesicular)형으로 바뀌었다.
도 4는 간암 세포주에서 HDAC6가 오토파지에 의한 세포사멸을 유도한다는 것을 보여준다. 위쪽 패널， (A) HepG2, (B) SNU182, (C) SNU368, 및 (D) SNU 449 세포들을 대조군 (None), 빈 백터 (Mock), 또는 1/ 의 HDAC6 발현백터 (pcDNA_HDAC6)로 형질도입. 간암 세포주의 증식률은 A570 에서의 MTT 흡광도 로 측정하였다. 에러 막대는 적어도 3반복으로 수행한 실험들의 표준편차를 보여준 다. 모든 측정은 3반복으로 수행하였으며， 각각의 실험들은 적어도 2번씩 반복하였 다. 아래쪽 패널， 웨스턴 블랏 분석으로 측정한 LC3Bᅳ II 변환 수준. 알파-류블린을 로딩 컨트를로 사용했다. 실험은 반복적으로 수행했다.
도 5는 HDAC6의 지속적인 과발현이 시험관 및 생체 내 실험에서 Hep3B 세 포의 종양생성 능력을 소멸시킨다는 사실을 보여준다. (A) 안정적인 HDAC6 과발현 세포주를 본 발명의 실시예에 기재한 바와 같이 확립하였다. 좌측 패널， 면역블랏 (immunoblot) 분석은 지속적인 HDAC6 과발현을 보여주며， 이것은 HDAC6 과발현 세포주 (Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 클론 #2) 대 대조군 (Hep3B_Mock)에서의 알파- 튜블린의 저아세틸화에 의해 확인된다. 우측 패널, 확립된 HDAC6 과발현 세포주 (Hep3B_Mock, Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)의 세포성장 분석. MTT 어세이를 통 해 상대적인 성장를을 측정하였다. 데이터는 세 번의 실험의 평균과 표준편차로 나 타내었다. (B) 면역형광현미경은 LC3 스팟 분포가 HDAC6 과발현 세포 (Hep3B_HDAC6 클론 #1)에서 달라짐을 보였다. 위 실험은 2반복으로 수행되었고 유사한 결과가 나왔다. (C) 투과전자현미경으로 관찰한 (a) 대조군 (Mock) 및 (b) HDAC6 과발현 세포 (Hep3Bᅳ HDAC6 클론 #1)의 정상 성장 조건 하에서의 미세구 조. 화살표는 오토파고좀 (autophagosomes) 또는 오토파고리소좀 (autophagolysosomes)과 같은 오토파지 액포 (autophagic vacuoles)의 존재를 의미한 다. (c-d) 화살표로 나타낸 영역은 더 높은 배을에서 나타낸 것이고 오토파고좀과 오토파고리소좀의 상세 구조를 보여준다. 실험은 3반복으로 수행하였다. (D) 빈 백 터 (Mock) 또는 (Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)를 안정적으로 발현하는 Hep3B 세 포의 종양세포 성장률. 종양의 크기는 캘리퍼스 (calipers)를 사용하여 3차원적으로 측 정하였다. 종양의 부피 (腿 3)는 길이 X/ 2 로 계산하였다. 표준 에러막대는 평균의 표준 편차를 나타낸다. (E) 각각의 시간 지점에서의 마우스 모습 (위)과 절개한 종양 (아래). (F) 종양에서 발현된 HDAC6, Beclin 1， 및 아세틸화된 알파-튜블린 (Ac— a— tubulin) 의 웨스턴 블랏 분석. 결과는 임의로 선택한 이종이식 종양에서의 HDAC6 수준， 알 파-튜블린의 아세 틸화 상태， 및 Beclin 1 발현을 나타낸다.
도 6은 HDAC6 과발현이 Beclin 1 발현을 상향조절함으로써 오토파지를 활성 화시 킨다는 것을 보여준다. (A) 좌측 패널， Beclin 1 발현을 대조군 (Hep3B_Mock) 및 HDAC6 과발현 세포주 (Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)에서 웨스턴 블랏 분석으로 조 사하였다. 20 uM 의 세라미드 (ceramide)를 24시간 처 리 한 Hep3B 세포를 Beclin 1 도 입 에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. 우측 패널， 그래프 막대는 LC3B-II 대 α -tubulin 비을을 나타낸다 (unpaired student's t test, *P < 0.05 vs. Mock). (B) 좌측 패널， HDAC6 과발현 세포 (Hep3B_HDAC6 클론 #1)들을 대조군 (None), 100 nM의 scrambled siRNA (Scr), 또는 100 nM 또는 200 nM 의 HDAC6-특이 적 siRNA로 형 질도입 시 켰다. 그 후 Beclin 1 및 LC3B-II 발현수준을 웨스턴 블랏 분석으로 측정하 였다. 우측 패널， 그래프 막대는 Beclin 1 대 a— tubulin 비을을 나타낸다 (unpaired student's t test, *P < 0.05 vs. Scr). (C) 좌측 패널， 오토파지를 막기 위해 HDAC& 를 안정 적으로 발현하는 Hep3B 세포주 (Hep3Bᅳ: HDAC6 Clone #1 및 #2) 및 빈 백터 (Hep3B_Mock)를 형질도입 한 세포들에 5 mM 3-MA 를 처 리하였다. Beclin 1 및 LC3B-II 의 발현수준을 면역블랏팅으로 측정하였다. 우측 패널， 그래프 막대는 Beclin 1 대 a— tubulin 비을을 보여준다 (unpaired student's t test, *,**P < 0.05 vs. None in Hep3Bᅳ HDAC6 Clone #1 및 #2 ). (D) 좌측 패널， 대조군 (Hep3B_Mock) 및 HDAC6 과발현 세포주 (Hep3B_HDAC6 Clone #1 및 #2)를 100 nM scrambled siRNA (Scr) 또는 100 nM Beclin 1-특이 적 siRNA로 형 질도입시 켰다. Beclin 1 및 LC3B-II 의 발현수준을 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다. 우측 패널， 그래프 막대는 LC3-II 대 Q-tubulin 비을을 보여준다 (unpaired student's t test, * **P < 0.05 vs. Scr in Hep3B_HDAC6 Clone #1 및 #2 ). 알파—튜불린을 모든 실험 에서 로딩 컨트롤 로 사용하였다. 단백질 밴드들의 신호 강도는 세 번의 독립 적 인 웨스턴 블랏 실험 의 이 미지들로부터 스캔해서 정 량했다. 모든 실험에서， Beclin 1및 LC3-II 밴드의 평균 강도는 평균 알파—류불린 밴드의 강도에 대해 표준화하였다.
도 7은 간암 세포에서 HDAC6 매 개 Beclin 1ᅳ의존적 오토파지 에 의 한 JNK/c-Jun 활성을 보여준다. (A) 대조군 (Hep3B_Mock) 및 HDAC6 과발현 세포주 (Hep3B_HDAC6 Clone #1 및 #2)에서 JNK, phospho— JNK (p-JNK), c-Jun 및 phospho-c-Jun (p— c-Jun)의 발현수준을 면역블랏팅으로 측정하였다. (B) HDAC6 과발현 세포 (Hep3Bᅳ HDAC6 Clone #1)를 대조군 (None), 100 nM scrambled siRNA (Scr), 또는 50 nM 또는 100 nM HDAC6-특이적 siRNA로 형질도입 시켰다. HDAC6—특이적 siRNA로 형질도입한 후에 면역블랏팅으로 HDAC6, JNK, phospho-JNK (p-JNK), c-Jun, phospho— c— Jun (p-c-Jun), Beclin 1, 및 LC3B-II 단 백질의 발현수준을 측정하였다. (C) JNK 신호전달을 억제하기 위해 대조군 (Hep3B_Mock) 및 HDAC6 과발현 세포 클론 (Hep3B_HDAC6 Clone #1)에 10 uM의 SP600125를 처리하거나 처리하지 않고， HDAC6, JNK, phospho-JNK (p-JNK), c-Jun, phospho-c-Jun (p-c-Jun), Beclin 1 및 LC3B— II 단백질의 발현 수준을 면역 블랏팅으로 측정하였다. 균둥한 로딩을 확인하기 위해 모든 막 블랏은 알파-류블린 에 대해 재탐침 (reprobed)되었다.
도 8은 HDAC6가 ROS 축적에 미치는 영향을 보여준다. (A) Hep3B 세포들 을 각각 처리하지 않거나 (None), 빈 mock 백터 (Mock), 1 및 2//g의 pcDNA 3.1-HDAC6 발현백터 (pcDNA_HDAC6)로 48시간 동안 형질도입시켰다. 그 후 세포 들을 H2DCFDA로 30분간 염색하고, 세포 ROS 수준을 유세포 분석기로 관찰하였 다. (B) 그래프 막대는 대조군 (None)과 비교한 ROS의 상대적인 수준을 나타낸다.
[발명의 실시를 위한 형태】
본 발명자들은 세포질내 탈아세틸화효소인 HDAC6가 JNK활성 Beclin 1 의 존적 경로를 거쳐 카스파아제 (caspase)-비의존적 오토파지 (autophagy)에 의한 세포 사멸을 매개함으로써 사람 간암 세포에서 종양 억제제로 기능할 수 있음을 밝혔다. HDAC6의 발현은 간암에서 억제되거나 상실되며， 본 발명의 실시예에 따르면， HDAC6의 에토픽 (ectopic) 발현은 시험관 및 생체 실험 모두에서 종양 성장을 억제 하였다. 또한， 간암 세포에서 HDAC6는 JNK/cᅳ Jun 신호전달 경로를 활성화시켜， Beclin 1/LC3B-II 의존적 오토파지를 활성화시켰다. 이러한 발견들은 간암 발병기작 에서 HDAC6가 중요한 역할을 한다는 것을 보여주며， HDAC6가 간암 치료에 있어 중요한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다. 라이신 (lysine)에 의 한 히스톤의 아세틸화는 크로마틴 컨포메 이 션 (conformation) 및 유전자 발현의 주된 후성 학적 (epigenetic) 조절요소이다. 히스톤 아세틸화의 동적 인 특성은 히스톤 아세틸화효소 (acetyltransferase)의 활성과 HDAC 효소들 사이 의 균형 에 의 해 결정 된다 (Thiagalingam S, et al. Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann N Y Acad Sci 2003；983：84-100). HDACs는 유전자 전사， 단백질 발현， 단백 질ᅳ단백질 상호작용， 단 백 질의 세포내 위치지 정 (localizations), 및 세포 신호전달과 같은 다양한 세포 활동 에 관여 한다 (Witt O, et al. HDAC family: What are the cancer relevant targets? Cancer Lett 2009;277:8-21). HDACs가 암의 발병 및 진전과 관련이 있는 여 러 단백 질들의 발현 및 활성을 조절한다는 증거들이 축적 되 고 있다 (Marks P, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nat Rev Cancer 2001 ;1： 194-202, 및 Glozak MA, Seto E. Histone deacetylases and cancer. Oncogene 2007；26：5420-5432). 여 러 연구들에서 특정 HDAC 패밀리 멤버가 일부 종양들에서 이상 발현되고 암 세포의 징표를 조절 하는 비-부수적인 기능을 갖고 있음이 밝혀졌다 (Witt 0， et al, 2009 및 Marks P, et al, 2001). 비 정상적 인 HDAC 활성 이 종양형성 과정 에서 시작되었으므로， 히스톤 아 세틸화 상태를 변형시 켜 비 정상적으로 발현이 멈춘 종양 억 제제 유전자들의 재발현 을 촉진할 수 있는 HDAC 억 제제를 개발하려는 상당한 노력 이 투입 되 었다.
또한, HDAC6는 다수의 사람 암 세포주 및 마우스 종양 모델에서 과발현된 다는 사실이 밝혀졌다. 또한， HDAC6는 암 세포가 생존하고 형 질을 나타내기 위 해 필요한 많은 신호전달 경로에서 중요한 역 할을 하기 때문에 치료의 목표물로 여겨 져 왔다 (Aldana一 Masangkay GI, Sakamoto KM. The role of HDAC6 in cancer. J Biomed Biotechnol;2011:875824). 예를 들어， HDAC6 발현은 구강 편평 세포 (squamous cell) 암 (Sakuma T, et al. Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma. Int J Oncol 2006;29:117-124)， 사람 유방암 조직 (Yoshida N, et al. Prediction of prognosis of estrogen receptor-positive breast cancer with combination of selected estrogenregulated genes. Cancer Sci 2004；95：496-502)? 및 급성 골수성 백혈병 세포 (Bradbury CA, et al. Histone deacetylases in acute myeloid leukaemia show a distinctive pattern of expression that changes selectively in response to deacetylase inhibitors. Leukemia 2005;19:1751-1759) 둥에서 상향조절되는 것으로 보고되었다.
하지만， 지금까지 사람 간암에서는 HDAC6의 생물학적 기능을 상세히 분석 한 연구가 없었다. 본 발명자들은 이전 연구를 통해 사람 간암에서 병리조직학적 단 계 사이에 나타나는 대규모의 유전자 발현 변화를 조사하였다 (Nam SW, et al. Molecular changes from dysplastic nodule to hepatocellular carcinoma through gene expression profiling. Hepatology 2005;42:809ᅳ 818). 이 실험의 마이크로어레이 데이터에 기초하여， 종양전 병변 (preneoplastic lesions), 이형성결절 (dysplastic nodules), 및 Edmoson's grades I~III 의 간암 세포에서의 HDAC6 발현을 재조사함 으로써 (도 1A), 본 발명자들은 HDAC6가 간암에서 하향조절된다는 것과， 다양한 간 암 세포주에서도 하향조절 또는 소멸한다는 것을 발견하였다 (도 1B-D). 이러한 결 과를 통해 본 발명자들은 HDAC6가 간암 생성과정에서 항 -종 기능을 갖고 있다 고 생각하게 되었다. 또한， 본 발명자들은 HDAC6의 에토픽 발현이 세포주기 진행 이나 세포자살 (apoptosis)에 영향을 미치지 않고 간암 세포의 성장과 증식을 억제한 다는 사실을 밝혔다 (도 2). 결론적으로 위 결과들은 간암 발병과정에서 HDAC6가 종양 억제제로 작용한다는 것을 암시하므로, 암의 발달 및 진전에 있어서의 HDAC6 의 종양 형성 기능에 관한 이전의 보고들과 배치된다.
HDAC6는 미세소관 및 액틴 세포골격과 연결될 수 있는 세포질에만 위치한 다. 또한， HDAC6는 단백질 웅집의 세포내 관리에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨 진다. 다른 HDAC 패밀리 멤버와 달리， HDAC6는 유비퀴틴ᅳ결합 활성을 가지며 미 세소관 및 Fᅳ액틴 세포골격 모두와 관련이 있다 (Hubbert C, et al. HDAC6 is a microtubule一 associated deacetylase. Nature 2002;417:455-458 및 Zhang X, Yuan Z, Zhang Y, Yong S, Salasᅳ Burgos A, Koomen J, et al. HDAC6 modulates cell motility by altering the acetylation level of cortactin. Mol Cell 2007;27:19그 213). 최근에， HDAC6가 오토파고좀과 리소좀의 융합을 조절하여, 진핵생물에서 진화적으 로 보존되어 있는 단백질 -분해 경로이며， 영양분이 제한된 조건에서 세포 생존에 필 수적인 오토파지를 조절한다는 보고가 있었다 (Lee JY, et al. HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin— selective quality-control autophagy. EMBO J;29:969-980 및 Levine B, Klionsky DJ. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev Cell 2004;6:463-477). 종양 발달의 초기 단계 동안에는 오토파지가 종양 성장을 억 제하며， 종양 치료 중에 많은 세포들에서 오토파지 에 의 한 세포사멸이 일어 난다 (Levine B. Cell biology: autophagy and cancer. Nature 2007;446:745-747). 본 발명 의 일실시 예 에서 HDAC6의 에토픽 발현은 LC3B-II 전환을 촉진시 키고 살아 있는 Hep3B 세포수를 감소시 켰으며， 이 것은 오토파지 의 특이 적 억제제 인 3— MA에 의 해 억제되 었다 (도 3). 또한, 유사한 결과를 다른 간암 세포주 (도 4)와 생체 내 마우스 종양 이종이식 실험 에서 (도 5D 및 E) 얻었다. 오토파지는 다양한 경로를 갖고 있으 며 암과 많은 다른 질병들에서 흔히 오토파지 신호전달 경로의 이상이 발견되 었다. 역설적으로 오토파지가 세포 생존과 암 발달 과정 에서 그리고 암 치료에서 세포 사 멸을 촉진한다는 사실이 보고되 었으나 (RosenfeWt MT, Ryan KM. The multiple roles of autophagy in cancer. Carcinogenesis;32:955— 963)， 본 . 발명 의 실시 예는 HDAC6가 간암에서 오토파지 에 의 한 세포사멸을 활성화시킴으로써 종양 억 제제로 서 기 능한다는 것을 보여준다.
mTOR (mammalian target of rapamycin), AIF ( apoptosis - inducing factor), ROS (reactive oxygen species), and the CDK (cyclin-dependent kinase) 경 로를 포 함한 많은 신호전달 경로들이 오토파지를 조절하는데 중요한 역할을 한다 (Levine B, Klionsky DJ, 2004). 이 것이 HDAC6—유도 오토파지를 매 개하는 기작의 기초가 되는 지를 알아보기 위 하여， 본 발명자들은 Hep3B 세포에서 HDAC6의 에토픽 발현에 의 한 ROS 유도를 조사하였다. 하지 만， HDAC6 과발현은 H2DCFDA-기 반 유세포 분 석 에서는 발견되지 않았다 (도 8). 한편， JNK의 활성 이 Beclin 1 발현을 매개할 수 있고, 이 것은 암 세포의 오토파지 에 의 한 세포사멸에 있어 핵심 적 인 역 할이 라는 것 이 알려져 있다 (Li DD, Wang LL, Deng R, Tang J, Shen Y, Guo JF, et al. The pivotal role of c-Jun NH2— terminal kinase— mediated Beclin 1 expression during anticancer agents-induced autophagy in cancer cells. Oncogene 2009;28:886ᅳ 898). 본 발명 의 일실시 예에 따르면 마우스 종양 조직 에서 Beclin 1이 HDAC6 과발현 Hep3B 세포로부터 유도되었다 (도 5F). Beclin 1은 오토파지에 의한 분해를 위해 세 포질로부터 단백질을 결합시키거나 막 구성물에 오토포지 경로를 제공하는데 중요 한 역할을 할 수 있으며 (Liang XH, et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1. Nature 1999;402:672-676)， 또한 포유동물에서 오토파지 및 세포자살 (apoptosis)의 중요한 '분자 스위치 '가 될 수 있다 (Kang R, Zeh HJ, Lotze MT, Tang D. The Beclin 1 network regulates autophagy and apoptosis. Cell Death Differ;18:571ᅳ 580). 또한， Beclin 1 기능이상이 암을 포함한 여러 질병들 에서 관찰되고 있으며， 따라서 세포의 매크로오토파지를 촉진함으로써 종양 억제제 로 기능할 수 있다고 생각된다. Beclin 1의 종양—억제효과가 오토파지에 의한 세포 사멸과 연관될 수 있지만， 어떻게 오토파지에 의한 세포사멸 과정에서 Beclin 1 발 현이 조절되는지는 아직 밝혀져 있지 않다. 본 발명의 일실시예에서 Hep3B 세포에 서의 HDAC6 과발현은 잠재적인 오토파지 유도제인 세라미드 (ceramide)와 유사한 방식으로 Beclin 1 발현을 촉진시켰다. 대조적으로， HDAC6의 siRNA 사일런싱 (silencing)은 Beclin 1 유도 및 오토파지를 차단했고, 이것은 감소된 LC3B-II 전환 으로 확인할 수 있었다 (도 6A 및 B). Beclin 1 유도와 HDAC6ᅳ유도 오토파지 사이 의 관련은 3— MA가 HDAC6 과발현 세포에서 Beclin 1 발현을 억제한다는 사실에 의해 더욱 강화되었다 (도 6C).
암 세포의 오토파지 조절 기작에 관한 이전의 연구들은 오토파지가 class II PI3K, 단백질 키나아제 mTOR, 세포외 신호—조절 키나아제 (kinase), 및 p38 경로와 같은 다양한 신호전달 경로에 의해 조절된다는 것을 보고하였다 (Levine B. Cell biology: autophagy and cancer. Nature 2007;446:745— 747). 오토파지에 있어 JNK의 역할에 관한 이러한 연구들은 암세포에서 항암제—유도 오토파지를 조사함으로써 수 행되었고 (Li DD, Wang LL, Deng R, Tang J, Shen Y, Guo JF, et al. The pivotal role of c-Jun NH2— terminal kinase-mediated Beclin 1 expression during anticancer agentsᅳ induced autophagy in cancer cells. Oncogene 2009;28:886ᅳ898)， 그것은 세라미드 (ceramide)에 의한 JNK 경로의 활성이 Beclin 1 발현을 증가시킨다 는 것을 보여주었다. 따라서， 본 발명자들은 간암 세포에서 HDAC6가 JNK 경로를 활성화시키고 Beclin 1 의존적 오토파지를 매개한다는 가설을 세웠다. 이와 관련하 여 본 발명자들은 HDAC6-유도 오토파지에서 JNK 경로활성과 Beclin 1 발현 사이 의 관계에 중점을 두었다. 본 발명의 일실시예에서， 간암 세포주에서 HDAC6—유도 오토파지 동안에 JNK 경로가 활성화되고， 이것은 Beclin 1 발현을 유도한다는 것을 보였다. 반면에， JNK-특이적 억제제인 SP600125 및 HDAC6를 표적으로 하는 siRNA는 Bedin 1 상향조절 (up— regulation) 및 오토파지 유도를 저해하였다 (도 6B 및 7C). 또한， 본 발명의 일실시예에서 c-Jun 역시 HDAC6—유도 오토파지에 대웅한 Beclin 1 조절과 관계된다는 것을 보였다 (도 7). 이러한 결과들은 간암의 HDAC6一유 도 오토파지에 있어 Beclin 1 발현을 조절하는 새로운 기작올 제시한다. HDAC6가 직접적으로 JNK/c-Jun 신호전달을 활성화시키는지는 아직 불명확하지만， 간암 세포 에서 HDAC6 과발현이 JNK 매개 Beclin 1 발현을 통해 오토파지 세포사멸을 야기 하는 것은 분명하다.
이러한 점들을 종합하면, 본 발명은 간암에서 HDAC6 발현이 억제되거나 상; 실되고， HDAC6의 에토픽 발현은 오토파지 세포사멸을 촉진하고 JNK-매개 Beclin 1 경로를 활성화함으로써 시험관 및 생체 실험에서 종양 성장을 억제한다는 사실을 보여준다ᅳ 따라서 본 발명은 처음으로 HDAC6가 간암 발병 과정에서 카스파아제 (caspase)—독립적인 오토파지 세포사멸을 활성화시킴으로써 종양 억제자로 기능한다 는 것을 설명하며， 따라서 HDAC6의 간암 치료제로서의 임상적 가능성을 제시한다. 따라서 본 발명은 HDAC6(Histone deacetylase 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 HDAC6단백질로 이루어지는 간암 진단용 마커를 제공한다.
본 발명에서, 상기진단이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서， 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한， 본 발명에서의 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부， 발전 및 경감 둥을 판 단하는 것도 포함한다.
또한, 상기 진단용 마커 (diagnosis marker)란 간암의 세포를 정상 세포와 구 분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예컨대， mRNA등)， 지질, 당지질， 당단 백질， 당 (단당류， 이당류， 올리고당류 둥) 둥과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포에서 발현 양이 감소하는 HDAC6 유전자 또는 단백질일 수 있으며， 바람직하게 상기 HDAC6 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는다. 또한， 본 발명은 HDAC6유전자의 수준 또는 HDAC6 단백질의 수준을 측정 하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 HDAC6 유전자의 수준은， 바람직하게 HDAC6 유전자가 발현된 mRNA수준， 즉， mRNA의 양을 의미하며， 상기 수준을 측정할 수 있는 물질 로는 HDAC6 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명 에서 상기 HDAC6 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타 내는 HDAC6 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며， 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려전 방법을 통해 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완층벡 내에서 적합한 조건 (즉， 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에 서 주형—지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 -가닥 올리고뉴클레오타 이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 은도와 프라이마 의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한， 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며， 주형과 흔성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 층분한 상보성을 가지면 층분하다. 따라서 본 발 명에서의 프라이머는 주형인 HDAC6 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상 보적인 서열을 가질 필요는 없으며， 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 층분한 상보성을 가지면 층분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반웅에 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반웅을 말하며， 이러한 유전자의 증폭 반웅들에 대해서는 당 업계에 잘 알려져 있고， 예컨대， 중합효소 연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소 연쇄반 웅 (RT-PCR), 리가아제 연쇄반웅 (LCR), 전자 중재 증폭 (TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭 (NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서， 상기프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄 (linkages)의 선형 올리고머를 의미하며， 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오 타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며， 자 연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브 는 단일쇄일 수 있으며， 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP (즉， dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한， 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이 드도 포함할 수 있다ᅳ 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드， 예 컨대， 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993))， 포스포 로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이 드ᅳ연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-0-메틸 RNA, 알파 -DNA 및 메틸포스포네 이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대， 2'ᅳ O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'— 0—알킬 DNA, 2'—ᄋ-알릴 DNA, 2' -0—알카이닐 DNA, 핵소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로핵시를 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이 드 예컨대， C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로ᅳ， 브로모—， 클로로-， 아이오도-， 메틸ᅳ， 에틸-, 비닐ᅳ， 포르밀—， 에티틸—， 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴ᅳ， 이미다조 릴ᅳ, 피리딜- 포함)， C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-， 브로모 -， 클로로-， 아이오도-， 메틸—， 에틸—， 비닐-， 포르밀-， 알카이닐-， 알켄일-， 티아조릴 -， 이미다조릴—， 피리딜 -)， 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
또한， 본 발명에서 상기 HDAC6 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 HDAC6 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체， 단일클론 항체 및 재조합 항체 둥의 항체를 포함할 수 있다. 또한， 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바 와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 HDAC6 단백질이 규명되었으므로， 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대， 다클론 항체의 경우에는 HDAC6 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수 득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며， 이러한 다클론 항체는 염소， 토끼， 양， 원숭이， 말， 돼지， 소， 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능 하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 (hybridoma) 방 법 (Kohler et al, European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리 (Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991， Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1—597， 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라， 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있 다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 둥이 있다. 또한， 본 발명은 HDAC6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준 을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 간암 진단용 키트에 포함되는 간암 진단용 조성물은 HDAC6 단백 질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머， 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며， 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.
본 발명의 간암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우， 본 발 명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약， 예컨대, 완층액， DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filif ormis, Thermis flavus, Thermococcus liter alis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로'' 부터 수득한 열 안정성 DNA 증합효소)， DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함 할 수 있으며， 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로， 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가， 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한， 본 발명은 HDAC6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준 을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서， HDAC6 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머， 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소 (hybridizable array element)로서 이용되며, 기질 (substrate) 상에 고정화된다： 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반ᅳ견고성 지지체로서， 예컨대， 막， 필터， 칩， 슬라이드， 웨이퍼， 파이버， 자기성 비드 또는 비자기성 비드， 겔， 튜빙， 플레이트， 고 분자， 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며， 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어， 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있 고， 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한， 상기 혼성화 어레이 요소는 링커 (예: 에틸렌 글리콜 을리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.
한편， 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지
(labeling)될 수 있고， 마이크로어레이상와 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며， 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하 게 실시될 수 있다. 또한， 본 발명은 HDAC6 유전자의 발현수준 또는 HDAC6 단백질 수준을 측 정하여 간암을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데， 상기 방법은 (a) 생물학적 시료 에 존재하는 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HDAC6유전자의 발현양 또는 단백질 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기에서 HDAC6 유 전자의 발현수준 또는 HDAC6 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용 하여 생물학적 시료로부터 mRNA또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료' '란 간암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 HDAC6유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른， 생체로부 터 채취된 시료를 말하며， 상기 시료로는 예를 들면， 이에 제한되지는 않으나， 조직， 세포， 혈액， 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.
상기 HDAC6 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측 정하는 것이며， mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반웅 (RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반웅, RNase 보호 분석법， 노던 블럿 및 DNA칩 등이 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 상기 HDAC6 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데， 이러한 경우， 생물학적 시료 내의 HDAC6 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물， 즉， 항원 —항체 복합체를 형성하며， 항원ᅳ항체 복합체의 형성량은 검출 라벨 (detection label) 의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소， 형광물， 리간드, 발광물， 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며， 이에 제한되는 것은 아니다ᅳ 단백질 수준 을 측정하기 위한 분석 방법으로는， 이에 제한되지는 않으나， 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석， 방사선 면역 확산법， 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영 동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법， 보체 고정분석법， FACS, 단백질 칩 등이 있다. 따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여， 대조군의 HDAC6 mRNA 발 현양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 HDAC6 mRNA 발 현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고， 상기 발현양의 정도를 대조군과 비교함으 로써 간암의 발병여부， 진행단계 또는 예후 둥을 예측 및 진단할 수 있다. 나아가 본 발명은 (a) HDAC6(Histone deacetylase 6) 유전자 또는 HDAC6 단백질을 포함하는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 HDAC6유전자의 발현양， HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성을 측장 하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과， HDAC6유전자의 발현양， HDAC6 단 백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 간암의 예 방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는， 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면， 먼저 HDAC6 유전자 또는 단백질을 포함하는 간 암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기시료는 HDAC6 유전자의 발현양， HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성에 영향을 미치 는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질， 뉴클레오티드， 안티센스— RNA, siRNA( small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 HDAC6유전자의 발현양， HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활 성을 측정할 수 있으며， 측정 결과， HDAC6 유전자의 발현양， HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성이 증가되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.
상기에서 HDAC6 유전자의 발현양， HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백 질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는 데， 예를 들면， 이에 제한되지는 않으나， 역전사 증합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 증합효소 연쇄반웅 (real time— polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿， 노던 블럿， ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏 (immunoblot) 분석， 면역조직화학염색법， 방사선면 역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion) 및 면역 침전분석법 (immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다. 또한, 본 '발명은 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자 또는 HDAC6 단백 질을 유효성분으로 포함하는 간암 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에 있어서， 상기 HDAC6 유전자는 동물세포 발현 백터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다. 또한 상기 HDAC6 단백질은 JNK-매개 Beclin 1 경로 (JNK-mediated Beclin 1 pathway)를 활성화시켜 오토파지 (autophagy)에 의 한 세포사멸을 촉진하는 기작을 갖고 있는 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 약학적 조성물로서 사용되기 위해 HDAC6 유전자 또는 HDAC6 단백질을 유효성분으로 함유하게 된다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되 는 HDAC6 유전자는 플라스미드 또는 바이러스 백터와 같은 발현 백터 내로 삽입 시킨 후， 상기 발현 백터를 형질도입 (transfectic ) 등의 당업계에 공지된 방법에 의 해 표적 세포 내에 도입시켜 유전자 치료에 사용할 수 있다. 예컨대， 플라스미드 발 현 백터를 이용한 유전자 전달 방법은 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로서， FDA로부터 승인받은 사람에게 사용할 수 있는 방법이다 (Nabel, E. Gᅳ， et al., Science, 249： 1285- 1288, 1990). 플라스미드 DNA는 바이러스 백터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 백터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면， 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제 307，247호)， pSV16B (국 제특허공개 제 91/08291호)， pVL1392(PharMingen), 및 pCDNA3.1 (Invitrogen) 등이 대표적이다. 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 폴라스미드 발현 백터 (plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법， 예를 들어 이에 한정되지는 않으나， 일 시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사， 형질도입 (transduction), 세포융합， 칼슘 포스페이트 침전법， 리포좀 매개된 형질감염 (liposome— mediated transfection), DEAE 덱스트란—매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브 렌—매개된 형질감염 (polybrene-mediated trans fection), 전기침공법 (electropora tion), 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방 법에 의해 표적 세포 내로 도입할 수 있다 (Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967， 1992； Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624， 1988). 이외에도， 공지된 적절한 바이러스 백터가 본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예에서는， pcDNA 3.1(Invitrogen) 백터를 이용하여 리포좀 매 개된 형질감염을 통해 안정적으로 HDAC6을 과발현하는 세포주를 제작하였다. 그 과정을 구체적으로 설명하면， HDAC6 발현 백터는 HDAC6 단백질을 발현시킬 수 있는 (full length HDAC6 Coding sequence) insert를 PCR로 합성하여 pcDNA 3,1 (invitrogen) 백터에 삽입하여 HDAC6_pcDNA 3,1 백터를 제작하였다. 그리고 HDAC6의 발현이 저해되어 있는 Hep3B liver cancer cell line에 HDAC6ᅳ pcDNA 3,1 백터를 liposome (lipofectamine 2000, invitrogen)을 이용하여 transient로 transfection하여 실제로 Hep3B 및 여러 종류의 liver cancer cell line에서 HDAC6이 과발현되는지 확인하고 세포성장을 저해 하는 것을 확인하였다. 이와 같은 현상은 HDAC6의 과발현이 간암에서 autophagic cell death를 야기시킴으로써 일어나는 것 으로 판단하였다. 그 다음 간암억제에서의 HDAC6의 종양억제 효과를 동물실험에서 알아보기 위하여， HDAC6가 안정하게 과발현되는 세포를 제작하였다. 방법은 다음 과 같다. HDAC6_pcDNA 3,1 백터를 간암세포에 transient로 transfection을 한다. 그 리고 48~72시간 이후 geneticin (항생제)을 이용하여 간암세포를 선별한다. HDAC6_pcDNA 3,1 백터는 geneticin에 대한 내성을 가지고 있기 때문에 따라서， HDAC6ᅳ pcDNA 3,1 백터가 들어간 세포는 geneticin에 의한 사멸 없이 계속 성장을 하게 된다. 이렇게 HDAC6ᅳ pcDNA 3,1 백터가 들어간 단일세포는 계속 성장하여 콜 로니를 만들게 되며， 이러한 콜로니를 하나하나 추출하여， 세포를 다시 키우게 되면， 그 세포 하나가 하나가 HDAC6가 안정하게 과발현 되는 하나의 클론 (clone)이 된다. 이렇게 HDAC6 과발현 세포를 제작한 후에 HDAC6 transient로 transfection의 효과 를 똑같이 가진다는 것을 확인하였고， 이어서 동물실험을 진행하였다. 끝으로 HDAC6가 안정하게 과발현되는 세포에 다시 HDAC6 siRNA (Dharmacon) transient로 transfection하여 HDAC6 과발현에 의해 야기되었던 autophagic cell death가 다시 억제되는지 확인하였다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는' '이란 생리학적으로 허용되고 인간 에게 투여될 때， 통상적으로 위장 장애， 현기증 등과 같은 알레르기 반웅 또는 이와 유사한 반웅을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면， 락토스， 전분， 셀를로스 유도체， 마그네슘 스테아레이트， 스테아르산 둥과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일， 식염수， 수성 글루코스 및 글리콜 둥과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적 합한 안정화제로는 아황산수소나트름， 아황산나트름 또는 아스코르 브산과 같은 항 산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드， 메틸- 또는 프로필—파라 벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물 은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따 라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉， 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법 에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며， 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하 다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공 지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면， 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용 해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한， 경구 투여용 제형으로는， 이에 한정되지 는 않으나， 분말， 과립， 정제, 환약 및 캡슐 둥이 있다. 상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구， 경피， 피하ᅳ 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데， 상기 투여란 어떠한 적 절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.
또한, 상기에서 유효량 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도， 연령, 성별， 체중, 약물에 대한 민감도， 현재 치료법의 종류, 투여방법， 표 적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며， 당 분야의 전문가들에 의해 용이 하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며， 단일 또 는 다증 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최 소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양올 투여할 수 있으며， 더욱 바람직하게 는 riOOOO^g/체중 kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000mg/체증 kg /day의 유효용량 으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예 는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 범위가 이들 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
실험재료 및 방법
<1-1> 조직 샘플 및 조직 마이크로어레이 분석
9개의 냉동 간암 (HCCs) 및 그에 대응하는 9명의 간암 환자들로부터 얻은 주 변 (background) 정상 간 조직 샘플을 본 발명의 실시예에서 사용하였다. 모든 경우 에서 주변 간 샘플들은 만성 간염에 걸렸었고 모든 샘플들에서 HBV가 검출되었다. 사람 조직의 이용에 대한 승인은 카롤릭대학교 IRB 로부터 받았으며 (IRB No. CUMC09U117), 위 9명의 환자들의 동의를 얻었다. 분자적 실험에 앞서 위 냉동 조 직을 액체질소에서 미세 가루로 갈아서 보존하였다. 조직 마이크로어레이 (tissue microarray; TMA) 제작을 위하여， 포르말린 고정， 파라핀 -포매 간 샘플들 중 총 32 개의 간 샘플들 (32개의 간세포 암 및 대응되는 정상 간 조직들)을 준비했다.0.6 mm 직경의 스타일렛 (stylet)을 사용하여 각각의 기증 (donor)—종양 블럭에서 2반복의 종 양 조직 및 정상 간 조직 샘플들을 뚫어서 수용 (recipient) 파라핀 블록에 놓았다.
<1-2> HDAC6에 대한 면역조직화학염색
간암 샘플들의 HDAC6 단백질 수준을 측정하기 위하여, 조직 마이크로어레 이 샘플 상에서 HDAC6에 대한 모노클로날 항체 (1:100, Santa Cruz, Delaware, CA)를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 면역염색에 앞서， 조직 마이크로 어레이 (TMA) 슬라이드에서 파라핀을 제거하고 DI 수까지의 단계적 에탄올 시리즈 를 사용하여 수화시켰다. 내생적 퍼옥시다아제 (peroxidase) 활성은 3% 과산화수소一 메탄을 버퍼에서 5분간 배양시켜 차단하였다. 끓는 구연산 나트륨 버퍼 (pH 6.0)를 함유한 스티머 (steamer)에 슬라이드를 20분간 듬으로써 항원을 희복시켰다. 그 후 슬라이드를 HDAC6에 대한 모노클로날 항체로 4°C에서 오버나잇 배양하고， 비오틴 화 (biotinylated) 염소 항-마우스 항체 (1:500; Sigma, St Louis, MO)를 처리하고， 퍼 옥시다아제 (peroxidase)-연결 아비딘ᅳ비오틴 복합체 (avidinᅳ biotin complex)로 배양 한 뒤, 디아미노벤지딘 (diaminobenzidine)을 처리하고， 메이어 헤마톡실린 (Mayer's hematoxylin)으로 가볍게 대조염색 (counterstain)하였다. 음성 대조군으로， 슬라이드 를 동일한 방법으로 처리하였으나 1차 항체를 비 -면역 혈청으로 대체하였다.
<1-3> 세포배양
사람 간암 세포주 HepG2, Hep3B, PLC PRF/5, SNU一 182， SNU— 387， SNU-423, 및 SNU— 449를 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA)으로부터 구입하였으며， 사람 간암 세포주 SNU— 354 및 SNU-368올 한국세포주 은행 (KCLB, Korea)에서 구입하였다. 상기 세포들을 10% 소태아혈청 (Sigma, St Louis, MO) 및 1 mg/ml 페니실린 /스트랩토마이신 (Invitrogen, Grand Island, NY)을 첨가한 RPMI 1640 또는 DMEM 배지에 보관하였다. N—아세틸—D-스핑고신 ( N- acetyl-D- sphingosine) (ceramide), 3-메틸아데닌 (methyladenine) (3—MA), 및 SP600125 을 Sigma사에서 구입하였다. < l-4> 안정적으로 HDAC6를 과발현하는 세포주의 확립 (Establishment) 전장 사람 HDAC6 cDNA를 준비하고 Hindlll- EcoRI 제한효소를 사용하여 pcDNA 3.1(Invitrogen) 백터 에 접합시켰다. 모든 형질도입 (transfection)에는 Lipofectamine 2000을 생산자의 지시 (Invitrogen)에 따라 사용하였고， 0.5mg/ml G418 (Geneticin, Invitrogen)을 사용하여 안정적 인 형질도입체를 선별하였다. 개별적 인 콜로 니로 성장하는 단일 세포들을 접시 에서 제거하고 24-웰 플레이트에 옮겼다. 그 후 리 버견 (reversion)을 막기 위해 각각의 세포주를 동일한 G418을 사용하여 확장시켰다.
HDAC6 과발현은 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다.
<1 -5> 웨스턴 블랏 분석
세포들을 얼음 냉각시 킨 PBS로 씻고， 50 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Na2P2O7, 1 mM Na3VO4, 1 mM 페닐메틸-설포닐 플루오라이드 (phenylmethyl-sulfonyl fluoride), 5 ug/ml 류펩 틴 Geupeptin), 및 5 ug/ml 아프로티닌 (aprotinin)을 함유한 프로테아제 (protease) 억 제제 (Roche, Indianapolis, IN)에 녹였다. 그 후 위 용해물을 원심분리하고 그 단백질 함량을 정 량하였다. SDS— PAGE (10~15% 젤)로 동일한 양의 단백질 (ΚΓ20 ug/레 인) 을 분리하고 폴리 비 닐리 덴 디플루오라이드막 (polyvinylidene difluoride membranes) 에 옮겼다 (Bio— rad, Hercules, CA). 아세틸화된 알파-튜불린, 알파—류불린， HDAC6, 및 세포자살 및 오토파지 관련 항체들을 Santa Cruz and Cell Signaling (Danvers, MA)사에서 구입 하였다. 연결된 항체들을 검출하기 위 해 ImmobikmlM Western blotting detection system (Millipore, MA)을 사용하였다. 막을 LAS 3000 (Fuji Photo Film Co. Ltd, Tokyo)에 노출시 켰다.
< l-6> 세포증식 측정
세포들을 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 배지 에서 1><105세포 /웰의 농도로 6ᅳ 웰 플레이트에 넣고， 16~18 시간 동안 두었다. 형 질도입 (transfection) 4시간 후에, 배 지를 교체된 10% FBS를 함유한 신선한 RPMI 1640 배지로 교체하였다. 그 후 세포 들을 5 mg/ml 의 MTT-[3ᅳ (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliu^ bromide] 용액 (Sigma)으로 1시간 동안 배양하였다. 입수한 질은 파란색의 포르마잔 (formazan) 산물을 DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma)에 녹이고 VICTOR3 1 Multilabel plate reader (PerkinElmer, Boston, MA)를 사용하여 흡광도를 측정하였다.
<1ᅳ7> 세포자살 (Apoptosis) 측정
세포자살 (apoptosis) 수준을 정량하기 위해 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Diego, CA)을 사용하였다. 간략히， 세포들을 트립신화 (tr psinized)하고， 찬 PBS로 두 번 씻은 후， IX 결합 버퍼 (binding buffer) 로 ΙχΙΟ6 세포 /m^의 농도로 재현탁 (resuspension)시켰다. 그 후 위 세포 현탁액을 (ΙχΙΟ5 세포를 포함하도록) 100 ≠ 5ι 배양류브에 담고 5/ 아넥신 (annexin) V-FITC 및 10 PI (propidium iodide) 용액을 첨가하였다. 어두운 곳에서 실온으 로 15분간 배양시킨 뒤， 400/ ^의 IX 결합버퍼 (binding buffer)를 각각의 튜브에 첨가 하고， FACSCalibur 유세포분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 세포자살 부분을 측 정하였다.
<1-8> 세포주기 분석
형질도입 후 48시간 째 세포들을 트립신화 (trypsinization)시켜 수득하고， 찬 PBS로 세척한 뒤， 70% 알콜에서 -20°C로 1일간 고정시키고， 찬 PBS로 두 번 세척 한 뒤， 100 €/mC의 RNase A를 함유한 PBS에서 37°C로 30분간 배양시켰다. 핵은 50 /g/m£의 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide) (PI)로 염색했고， 염색된 세포 분획은 FACSCalibur 유세포분석기 (BD Biosciences)를 사용하여 측정하였다. 데이터 는 Cell— Quest FACS 분석 소프트웨어 (BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
<1-9> siRNA에 의한 HDAC6 및 Beclin 1의 넉다운 (Knock-Down)
ON-TARGET plus SMART pool human siRNA (HDAC6 및 Beclin 1) 및 Silencer Negative Control siRNA (scrambled siRNA)를 Dharmacon 사 (Lafayette, CO) 및 Ambion 사 (Austin, TX)에서 각각 구입하였다. 안정적인 HDAC6 과발현 Hep3B 세포들을 trypsin EDTA를 사용하여 수득하고， 60 mm 접시에 1.5> 105 세포 를 평판하고， 배양기에서 오버나잇으로 자라게 하였다. 평판배양 후 16~18시간 째， 세포들을 100 nmol/L 및 /또는 200nmol/L HDAC6 및 Beclin 1-특이적 siRNA를 함 유한 의 Opti-MEM (Invitrogen)으로 형 질도입 (transfection)시켰다. 형 질도입은 의 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000) 시 약 (Invitrogen)을 생산자의 지시 에 따 라 사용하여 수행하였다. 형 질도입 후 4~6시간째， 배지를 10% FBS (Lonza, Basel, Switzerland)를 함유한 신선한 RPMI 1640 배지로 교체하였다.
< 1 - 10> 형광현미경 관찰
세포들을 폴리 -L—라이신 코팅 유리 커버슬립 위에서 RPMI/10% FBS로 평판 배 양한 후， 빈 mock HDAC6 발현백터나 대상백터를 형 질도입 하였다. 그 후 세포들 을 PBS로 씻고， 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde) 용액으로 실은에서 10분간 고정시 킨 후， PBS로 씻고， 0.2% Triton X— 100로 15분간 투명화 (permeabilization)시 켰다. 비특이 적 결합부위를 PBS에서 4% 소 혈청 알부민으로 차단한 후에 , 세포들을 3번 씻고， 4°C에서 LC3B 항체 (1:100)로 오바나잇 배양하고， Alexa Fluor 488-연결 2 차 항체 (1:1000， Invitrogen)를 1시간 동안 실온에서 처 리하였다. 그 후 세포들을 PBS 로 씻고， 핵 이 보이도록 10 μ & Hoechst 33342로 대조염색 (counterstain)하고 (1:5000)， Gel Mount 용액 (Biomeda, Foster City, CA)으로 마운트 (mount)하였다. 모 든 이미지들은 Zeiss Axio Imager wide field 형광현미 경 (Carl Zeiss Microimaging, Oberkochen, Germany)을 사용하여 얻었고 AxioVision 4.3 소프트웨어로 분석하였다.
< 1 - 11 > 투과전자현미경 (Transmission Electron Microscopy) 관찰
안정 적으로 HDAC6를 과발현하는 Hep3B 세포들을 플라스틱 플라스크에서 단일막 (monolayer)으로 배 양하고， 0.1M PBS에 4% paraformaldehyde, 2.5% glutaraldehyde을 overnight 고정시 켰다. 그 후 세포들을 1% osmium tetroxide post-fixation 시 키고， 5으 100% 알콜 시 리즈로 탈수시 키고， 0.5% 아세트산 우라늄 (uranyl acetate)으로 염 색하고， Poly/Bed 812 resin (Pelco, Redding, CA)에 포매한 후， 증합시켰다. Ultracut S (Leica, Wetzetlar, Germany)를 사용하여 샘플들을 절단 하고， 초박절편 (ultrathin sections)을 1% uranyl acetate 및 0.2% lead citrate로 염 색하였다. 세포들은 투과전자현미 경 (transmission electron microscope) (JEM— 1010， Tokyo)으로 관찰 및 촬영 하였다. <1-12> 종양 이종이식 실험 (Tumor Xenograft Assay)
이종이식 종양발생 시험 (xenograft tumorigenesis assays)을 위해， 상술한 대 상 세포주들에서 ΙχΙΟ7 세포를 으2 PBS (phosphate buffer saline) (PH 7.4) 및 matrigel matrix (BD Biosciences)와 혼합하였다. 그 후 세포 현탁액 (suspensions)을 4주령된 수컷 누드 마우스에 피하주사하였다. 그룹 1은 mock을 도입한 Hep3B 세포 를 주사하였고， 그룹 2 및 3은 HDAC6를 안정적으로 과발현하는 Hep3B 클론 1 및 2를 도입한 세포를 주사하였다. 마우스의 주사 부위의 종양 형성 여부를 일주일에 두 번씩 조사하였다. 종양의 부피는 0.5 X 길이 (L) X 너비 2 (W2)의 식을 사용하여 계산하였다. 각각의 실험군은 5마리의 마우스로 구성되고, 종양의 성장은 캘리퍼스 (calipers)를 사용하여 직교하는 세 방향의 종양의 크기를 측정하여 정량하였다. 결과 는 종양 부피의 평균으로 표시하였고， 95% 신뢰구간을 갖는다.
<1-13> ROS 측정
Hep3B 세포들을 각각 5 ΐθ5 의 농도로 60— mm 접시에 평판하고， 오버나잇 으로 부착되게 한 후， 형질도입시켰다. 그 후 세포에 10 uM의 5-(and-6)-carboxy-2\7' -dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy— H2DCFDA; Invitrogen, Carls bad, CA)이 포함된 PBS를 30분간 처리하고， CellQuestPro 소프트 웨어가 장착된 FACSCalibur (BD Biosciences, San Diego, CA)로 유세포분석을 수 행하였다.
<1-14> 통계분석
간암 조직 마이크로어레이의 면역조직화학 염색은 카이—스퀘어 테스트로 검 증하였다. 세포계수 (cell counting), 증식측정 (proliferation assay), 및 상대적인 단백 질 수준 결과는 서 1 번의 실험의 평균 士 표준편차 (SD)를 계산하거나 Prism 4.00 (GraphPad Software)의 unpaired two tailed Student t test 를 사용하여 분석하였 다. P 값 < 0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
<실시예 2>
HDAC6 발현이 간암 성장에 미치는 영향 많은 종류의 암 세포주에서 HDAC6의 과발현이 보고되었고， 이는 다수의 발 암 (oncogenic) 세포주들의 변형된 (transformed) 형질을 유지하는데 필요한 것으로 알려졌다 (Aldana-Masangkay GI, Sakamoto KM. The role of HDAC6 in cancer. J Biomed Biotechnol;2011:875824). 하지만， 앞서 본 발명자들이 간암 발병 동안의 대 규모 전사체 변화에 기초한 마이크로어레이 분석으로 HDAC6 발현을 분석한 결과 (Nam SW, Park JY, Ramasamy A, Shevade S, Islam A, Long PM, et al. Molecular changes from dysplastic nodule to hepatocellular carcinoma through gene expression profiling. Hepatology 2005;42:809-818)， 종양발현 전의 병변 (lesions)과 비교하여 간암 부위에서 HDAC6는 상당히 하향조절 (down-regulated)되 었다 (도 1A). 따라서 HDAC6의 이상발현을 조사하기 위하여， 본 발명자들은 사람 간암 조직에서 HDAC6의 이뮤노블랏 (immunoblot) 분석을 수행하였다. 도 1B에서와 같이， HDAC6는 선택된 모든 간암에서 대조군인 비 -간암 조직들에 비해 상당히 하 향조절된 것으로 나타났다. 또한， 이러한 HDAC6 발현 감소와 일치하게， 간암에서 매우 아세틸화된 형태의 알파-튜블린 (α-tubulin)의 축적을 관찰하였다.
간암에서 HDAC6 발현이 하향조절되는 것을 확인하기 위해， 본 발명자들은 HCC TMA를 이용하여 면역조직화학염색법으로 HDAC6 발현을 측정하였다. 면역염 색 결과는 표 1과 같고， 대표적인 면역염색 결과물을 도 1C에 나타내었다.
【표 1】
간암 조직 마이크로어레이 내의 HDAC6에 대한 면역조직화학염색 결과
Figure imgf000033_0001
- 정상 및 암 조직 샘플에서 다른 면역조직화학 스코어의 수 및 백분율
* 카이—스퀘어 테스트 실험한 모든 간암 조직에서 HDAC6는 대부분 세포질에 위치하였다. 실험한 32개의 정상적인 간세포 샘플들 중에, 30개 (93.7%) 는 HDAC6 발현에 대해 증간 (moderate) 또는 강한 (strong) 면역양성 반응을 보인 반면， 실험한 32개 간암 증 15 개 (46.9%) 는 약하게 (weak) 염색되거나 음성이었다. 또한， 간암 (HCC)은 HDAC6에 대해 강하게 염색된 경우가 없었다. 또한 간모세포종 (hepatoblastoma)이나 간암 (hepatocellular carcinoma)에서 처음 확립된 (established) 9개의 서로 다른 간암 세포 주 (HepG2, Hep3B, PLC/PRF/5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU423 및 SNU449)에서 HDAC6의 내생적 (endogenous) 발현을 노던 및 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다 (도 ID). 몇몇의 예외는 있었으나， 예상한대로 사람 간암 세포주들은 상 대적으로 낮은 HDAC6 발현을 나타냈다 (도 1D). 이러한 결과는 암 발생 과정에서 HDAC6의 조절이 완화 (deregulation)되었음을 보여준다.
이러한 간암발병 과정에서의 HDAC6 발현 감소가 미치는 생물학적 영향을 알아보기 위해， 전장 (full— length) 사람 HDAC6 cDNA (pcDNA_HDAC6)를 제작하고 HepSB 간암 세포에 도입하였다 (알파ᅳ튜불린 (a— tubulin)의 저아세틸화 (hypoacetylation)를 검출함으로써 HDAC6의 기능적 과발현올 확인하였다). 그 후 HDAC6 과발현 Hep3B 세포들의 성장률을 측정한 결과， pcDNA_HDAC6 도입 세포 가 대조군 (mock 도입 또는 Hep3B 모 세포주)더 낮은 성장률을 나타내었다 (도 2A). 유사하게， MTT측정결과 HDAC6의 에토픽 (ectopic) 발현도 세포 증식의 상당한 제를 나타냈다 (도 2B). 이러한 성장억제 효과는 부분적으로 HDAC6복구에 의한 세 포 성장 조절의 손상에 의해 설명될 수 있다. 따라서， 본 발명자들은 HDAC6가 세 포주기 분포 (distribution) 및 Hep3B 세포의 세포자살에 미치는 영향을 조사하였다. 도 2C에서와 같이， Annexin V 염색 세포의 유세포분석 (flow cytometry) 결과 대조 군 (비— 또는 mock 도입) 세포들에 비해 유의할 만한 세포자살 유도 결과는 나타나 지 않았다. 또한， HDAC6 과발현은 AIF, Bax, 또는 Apaf-1과 같은 전-세포자살 종 (pro-apoptotic species)의 발현에도 영향을 미치지 않았고， (세포자살의 징표인) caspase-3나 PARP절단도 일으키지 않았다 (도 2D). 다음으로， 본 발명자들은 PI—염 색 HDAC6 도입세포에서 유세포 분석으로 세포주기 분석을 수행하였는데， 대조군 세포와 비교할 때 세포주기 이동에 있어서 유의할 만한 변화는 관찰되지 않았다 (도 2E). 유사하게， 에토픽 과발현 HDAC6는 pl5INK4B, P21WAF1/Cipl, 또는 사이클린 -의존적 키나아제 2(cyclin-dependent kinase 2) 와 같은 세포주기 단백질의 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 2F). 이러한 결과들은 HDAC6 과발현이 카스파아제 (caspase)-독립적 세포 사멸에 의해 매개될 수 있는 유사분열 결함을 유도한다는 것 을 의미한다.
<실시예 3〉
HDAC6 발현의 회복에 따른 오토파지 세포사멸의 활성화
간암 세포에서 HDAC6 발현의 감소와 에토픽하게 발현되는 HDAC6에 의한 성장 억제를 관찰하였기 때문에， 본 발명자들은 HDAC6가 조절 받지 않는 종양 세 포의 성장에 기능적으로 관여할 것이라 생각하였다. 하지만， HDAC6 과발현은 세포 주기 조절 또는 세포자살 (apoptosis)에 영향을 미치지 않았다. 유비퀴틴—결합 탈아세 틸화효소 (ubiquitin-binding deacetylase)인 HDAC6가 단백질 웅집체 (aggregates)를 표적으로 하는 기본적인 오토파지 (autophagy)의 핵심적인 구성요소이며 미토콘드리 아에 손상을 입힌다는 발견 (Lee JY, et al. HDAC6 controls autophagosome maturation essential for ubiquitin - selective quality-control autophagy. EMBO J;29:969— 980)으로부터, 본 발명자들은 HDAC6의 에토픽 발현이 간암에서 오토파지 에 의한 세포 사멸을 유발하는지 알아보았다. 오토파지는 진화적으로 보존적인 단백 질 분해 과정이며， 세포에 따라 세포 생존 또는 사멸에 핵심적인 역할을 하는 것으 로 알려져 있다. 또한, LC3 의 PE (phosphatidylethanolamine)-연결형 (conjugated form) (LC3-II), (Atg8로도 알려진) 미세소관 (microtubule) 연관 단백질 1 경쇄 (light chain) 3의 총량이 오토파고좀 (autophagosomes)의 수와 깊은 관련이 있다는 사실이 알려져 있다 (Levine B. Cell biology: autophagy and cancer. Nature 2007;446:745-747).
본 발명에서는， Hep3B 세포에서 HDAC6의 에토픽 발현이 LC3B-I 의 LC3B-II 로의 전환을 상당히 증가시킨다는 것을 보였다 (도 3A). 반면에， 3-메틸아데 닌 (methyladenine) (3— MA; 오토파지의 특이적 억제제)의 전-처리는 암 세포에서 HDAC6 과발현에 의한 LC3B-I 의 LC3Bᅳ II 로의 전환을 억제했다 (도 3B). 이러한 결과에 일치하게， 3-MA 전-처리에 의해 에토픽한 HDAC6 발현에 의한 세포 생존 률 감소는 효과적으로 차단되었다 (도 3C). 또한， LC3B에 대한 면역형광염색은 HDAC6 과발현이 세포질 전체에 균일하게 분포된 고리 모양 점들을 발생시킨 것을 보여주는데， 이는 LC3 와 오토파고좀 막 사이의 관련을 나타내 이러한 관련은 3一 MA에 의해 완전히 차단된다 (도 3D). 이러한 결과들은 HDAC6 발현의 희복이 간 암 세포에서 오토파지에 의한 세포사멸을 활성화시킨다는 것을 보여준다.
다음으로， 상기 결과들을 일반화하기 위해， 본 발명자들은 HDAC6가 4개의 서로 다른 간암 세포주에 미치는 영향을 실험하였다. 본 발명자들은 노던 및 웨스턴 블랏 분석 결과 HDAC6를 거의 발현하지 않거나 전혀 발현하지 않은 HepG2, SNU182, SNU368, 및 SNU449 세포주를 선정하였다 (도 1D). 각각의 세포주는 pcDNA_HDAC6와 함께 형질도입 (transfection) 되었다. 도 4에서와 같이, HDAC6과 발현 세포들의 성장률은 대조군 (비- 또는 mock 도입 세포들) 보다 낮았다. 또한， Hep3B 세포에 대한 앞선 관찰 결과들과 일치하게， HDAC6를 과발현하는 모든 세포 주는 증가된 LC3B— II 전환을 보였으며， 이는 HDAC6의 카스파아제 (caspase)-독립적 오토파지 세포 사멸에 의한 종양억제자로서의 기능을 시사한다.
<실시예 4>
HDAC6의 과발현에 따른 Hep3B 세포의 생체 내 종양 형성 감소
HDAC6의 안정적인 과발현이 간암 발병을 억제하는지를 알아보기 위하여， 본 발명자들은 HDAC6를 안정적으로 과발현하는 두 개의 세포주 (Hep3B_HDAC6클 론 #1 및 #2)를 확립하였다. 세포에서 아세틸화된 알파ᅳ튜블린의 감소를 검출하여 활성적인 HDAC6의 과발현을 확인하였다 (도 5A, 좌측). 또한 위 세포들은 mockᅳ도 입 세포 (Hep3Bᅳ Mock) 보다 더 낮은 성장를을 나타냈다 (도 5A, 우측). 또한， 면역형 광 분석 결과 HDAC6 과발현 세포 (Hep3Bᅳ HDAC6)에서 LC3B의 축적을 관찰할 수 있었고， 대조군 세포 (Hep3Bᅳ Mock)에서는 LC3B의 축적을 거의 관찰할 수 없었다 (도 5B). HDAC6의 안정적인 과발현이 오토파지에 의한 세포사멸을 야기시키는지 알아 보기 위하여， 본 발명자들은 TEM (transmission electron microscopy)을 이용하여 세포의 초미세구조 (ultra structures)를 관찰하였다. 예상한 바와 같이， 약 4으 45%의 Hep3B_HDAC6 세포들이 오토파지 액포 (autophagic vacuoles)를 나타냈고， 그 증 일 부는 더 큰 세포질 액포를 형성하기 위해 뭉쳤으며 (도 5C-b), 더 높은 배을에서 대 부분의 액포들이 전자집중물질 (electron dense material)과 분해된 세포소기 관들을 함유한 것을 관찰하였다 (도 5C— c 및 d). 대조적으로， 대조군 세포들 (Hep3Bᅳ Mock)에 서는 적은 수의 액포를 관찰하였고， 이들은 전자집중물질 또는 분해된 세포소기 관들 을 갖고 있지 않았다 (도 5C-a).
마지막으로， HDAC6 과발현이 생체 내에서 vivo) 종양 억 제 효과를 갖고 있는지 알아보기 위하여， 본 발명자들은 위 확립된 세포주들 (Hep3Bᅳ HDAC6 클론 #1 및 #2)을 마우스 (athymic nude mice)에 피하주사하였다. 주사 후 45일째， Mock 도입 세포 (Hep3B_Mock)를 주사한 동물들에서 종양이 검출되 었다. 반면에， Hep3B_HDAC6 클론 #1 또는 #2 세포들을 주사한 동물에서는 종양이 주사 후 55일째 검출되 었다 (도 5D). 또한， 전체적 인 종양 성 장은 Hep3B_Mock 세포들보다 Hep3B_HDAC6 세포들에 서 상대적으로 상당히 낮았으며 (尸 < 0.05) (도 5D), 안락사 시켰을 때의 평균적 인 종양 부피는 Hep3B_Mock 그룹에서 보다 Hep3B_HDAC6 그룹에서 훨씬 더 작았다 (P ≤ 0.05) (도 5E). 또한， 안정 적으로 형 질도입 한 세포들을 처 리 한 동물들의 종양 조직에서 HDAC6의 과발현 및 알파ᅳ류블린의 감소된 아세틸화를 확인하였다 (도 5F). 또한， Hep3Bᅳ HDAC6 그룹에서 종양 조직 의 증가된 Beclin 1 발현을 관찰하였으며， Beclin 1이 오토파지 의 초기 단계에 관여하여， 오토파지 소포의 결정화 (nucleation) 및 세포질로부터 단백질의 결합 (recruitment)을 촉진한다는 사실을 확립하였다 (Kihara A, et al. Beclin-phosphatidylinositol 3一 kinase complex functions at the trans -Golgi network. EMBO Rep 2001;2:330-335). 또한， Beclin 1 발현이 오토파고좀 생성과 직 접 적으로 관련이 있으며， Beclin 1이 항세포자살 (antiapoptotic) Bel— 2 패밀리 멤버 Bcl-2 및 Bcl-xL와 상호작용한다는 사실이 보고되 었다 (Liang XH, Jackson S, Seaman M, Brown K, Kempkes B, Hibshoosh H, et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1. Nature 1999;402:672— 676). 따라서， 본 발명은 Hep3B 세포에서 HDAC6 과발현이 Beclin 1 및 LC3ᅳ II 경로의 활성을 통해 오토파지 에 의 한 세포 사멸을 매개한다는 사실을 보여준다.
<실시 예 5〉
HDAC6에 의한 c-Jun NH- 2 -Terminal Kinase -Mediated Beclin 1 발현 경로를 통한 오토파지의 활성화 최근의 연구들은 다양한 세포 유형들에서 오토파지 과정 동안 Beclin 1의 유 도가 발생한다는 사실을 밝혔다. 하지만, 어 떻 게 Beclin 1 발현이 조절되는지는 아직 밝혀지지 않았다 (Chu CT, Zhu J, Dagda R. Beclin 1 -independent pathway of damage-induced mitophagy and autophagic stress: implications for neurodegeneration and cell death. Autophagy 2007;3:663-666). 간암 세포의 오토파지 과정에서 HDAC6가 Beclin 1 발현을 유도하는지 알아보기 위하여， 본 발명자들은 HDAC6를 안정 적으로 발현하는 Hep3B 세포들에서 Beclin 1 및 LC3B— Π 의 발현을 조사하였다. 도 6A에서와 같이， HDAC6 과발현 세포들은 Hep3B_Mock 세포들에서보 다 훨씬 더 많은 Beclin 1 및 LC3B-II 를 발현하였다. HDAC6가 오토파지 에 미치는 이 러 한 효과는 잠재적으로 위 세포주의 오토파지 에 의 한 세포사멸을 유도하는 세라 미드 (ceramide)를 세포들에 처 리 함으로써 확인하였다. Hep3B_HDAC6 세포의 오토파 지 과정 동안의 HDAC6에 의 한 Beclin 1 유도를 확인하기 위하여， HDAC6를 그것을 향하는 siRNA로 불활성 화시켰다. 예상한대로， HDAC6 넉다운 (knockdown)은 Beclin 1 발현과 LC3B— I 의 LC3B-II 로의 전환을 상당히 억 제시켰다 (도 6B). 또한 본 발명 자들은 HDAC6 과발현 세포에서 3— MA 의 영 향을 조사하였다. 도 5C에서와 같이， 3-MA를 처 리 한 Hep3B_HDAC6 세포들은 Beclin 1 및 LC3B— II 발현을 억 제하였다. Beclin 1이 HDAC6—유도 오토파지 에서 핵심 적 인 역할을 하는지 알아보기 위 하여， 본 발명자들은 Beclin 1 넉다운이 HDAC6—매개 오토파지 에 미치는 영 향을 알아보았다. 도 5D에서와 같이， HDAC6 과발현 세포 (Hep3B_HDAC6 클론 #1 및 #2)에서 Beclin 1 넉다운은 LC3B-II 생성을 상당히 억제하였다. 전체적으로， 위 결과들은 HDAC6가 간암 세포들에서 Beclin 1 및 LC3— II 프로세싱 의존적 오토파지를 통해 종양 억 제 효 과를 보인다는 것을 나타낸다. 최근의 연구들은 그 기작은 밝히지 못했지만 JNK가 오토파지 과정 에서 활성화되고， 이 것은 오토파고좀 형성 에 필요하다는 사실을 밝혔다 (Scherz-Shouval R, Shvets E, Fass E, Shorer H, Gil L, Elazar Z. Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. EMBO J 2007；26：1749-1760). 또한， 항암제에 의 한 JNK—매개 Beclin 1 발현의 활성 이 암 세포에서 오토파지에 의 한 세포사멸을 유도한다는 사실이 밝혀졌다 (Li DD, Wang LL, Deng R, Tang J, Shen Y, Guo JF, et al. The pivotal role of c-Jun NH2ᅳ terminal kinaseᅳ mediated Beclin 1 expression during anticancer agents— induced autophagy in cancer cells. Oncogene 2009;28:886一 898). 본 발명은 HDAC6-유도 오토파지 과정에서 Beclin 1 발현이 상당히 상향조절된다는 사실을 보 여준다 (도 6). 처음 본 발명자들은 HDAC6 과발현 세포들에서 JNK 경로가 활성화되 는지를 알아보기 위하여 p-JNK (phosphorylated-JNK) 수준을 조사하였다. 도 7A에 서와 같이， p-JNK 수준은 대조군 (Hep3B— Mock) 세포들에 비해 HDAC6 과발현 세포 (Hep3B_HDAC6 클론 #1및 #2)에서 상향조절되었다. 또한 본 발명자들은 JNK의 표 적 기질인 전사인자 c— Jun의 인산화가 HDAC6 과발현 세포에서 증가되었다는 것을 발견하였다. JNK 활성화가 HDAC6-매개 오토파지 과정에서 Beclin 1 발현에 관계되 고 필요한 것인지를 알아보기 위하여， siRNA를 이용하여 HDAC6 발현을 억제시켰 다. 예상한대로， HDAC6 넉다운은 JNK 및 c— Jun의 기본적인 수준을 변화시키지 않 고 JNK 및 C— Jun의 인산화를 감소시켰으며 Beclin 1 상향조절 및 LC3B— II 형성을 억제하였다 (도 6B). 마지막으로， 본 발명자들은 JNK-특이적 억제제인 SP600125 가 Beclin 1의 상향조절 (upregulation) 및 HDAC6 유도 오토파지를 억제하는지 알아보았 다. 도 7C에서와 같이， SP600125 처리는 HDAC6 과발현 세포들에서 Beclin 1 상향 조절과 LC3B— II 변환을 억제하였다. 종합적으로， 위 결과들은 HDAC6가 간암 세포들 에서 JNK 매개 Beclin 1 경로를 통하여 오토파지에 의한 세포사멸을 유도한다는 것 을 보여준다. 이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본 질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관 점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며， 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으 로 해석되어야 할 것이다.

Claims

【청구의 범위】
[청구항 1]
HDAC6(Histone deacetylase 6) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 HDAC6단백질의 간암 진단용 마커로서의 용도.
【청구항 2】
제 1항에 있어서，
상기 HDAC6 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 마커로서의 용도.
【청구항 3】
HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 수준 또는 HDAC6 단백질의 수준 을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 키트.
【청구항 4】
제 3항에 있어서，
상기 HDAC6유전자의 수준을 측정하는 물질은 HDAC6유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
【청구항 5】
제 3항에 있어서，
상기 HDAC6 단백질의 수준을 측정하는 물질은 HDAC6 단백질을 특이적으 로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 키트.
【청구항 6】
(a) 생물학적 시료에 존재하는 HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자의 발 현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 대조군 시료의 HDAC6 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암 예측 및 진단을 위한 정보제공방법.
【청구항 7】
제 6항에 있어서，
상기 생물학적 시료는 조직， 세포， 혈액， 혈청， 혈장， 타액 및 뇨로 이루어진 군증에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암 예측 및 진단을 위한 정보제공방법.
【청구항 8】
제 6항에 있어서,
상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반웅 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨 스턴 블럿, 노던 블럿， ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역불랏 (immunoblot) 분석, 면역조직화학염색법， 방사선면역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodif fusion) 및 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암 예측 및 진단을 위한 정보제공방법.
【청구항 9】
(a) HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자 또는 HDAC6 단백질을 포함하 는 간암 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계';
(b) 상기 HDAC6 유전자의 발현양， HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백 질의 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 측정 결과， HDAC6 유전자의 발현양 HDAC6 단백질의 양 또는 HDAC6 단백질의 활성이 증가되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는， 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리 닝 하는 방법.
[청구항 10】
제 9항에 있어서，
상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반웅 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time— polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿， 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역블랏 (immunoblot) 분석， 면역조직화학염색법， 방사선면 역분석 (RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion) 및 면역 침전분석법 (immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징 으로 하는 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법.
【청구항 11】
HDAC6 (Histone deacetylase 6) 유전자 또는 HDAC6 단백질을 유효성분으 로 포함하는 간암 치료용 조성물.
[청구항 12】
제 11항에 있어서，
상기 HDAC6 유전자는 동물세포 발현 백터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.
【청구항 13】
제 11항에 있어서,
상기 HDAC6 단백질은 JNK一매개 Beclin 1 경로 (JNK-mediated Beclin 1 pathway)를 활성화시켜 오토파지 (autophagy)에 의한 세포사멸을 촉진하는 기작을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 간암 치료용 조성물.
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