KR102042332B1 - 간암의 재발 및 예후 예측용 tcirg1 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암의 재발 및 예후 예측용 TCIRG1 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 TCIRG1 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 간암 진단 또는 예후 진단용 키트 및 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TCIRG1 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는 간암 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 TCIRG1의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

간암의 재발 및 예후 예측용 TCIRG1 마커 및 이의 용도{TCIRG1 biomarker for diagnosing recurrent and prognosis of liver cancer and use thereof}

본 발명은 간암의 재발 및 수술 후 예후를 예측하고 진단할 수 있는 TCIRG1 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

암은 인류의 건강을 위협하는 대표적인 질병으로서 산업화된 국가에서 단일 질병으로는 가장 대표적인 사망 원인이다. 암의 발생원인은 아직도 규명되지 않고 있으나 내적 요인인 유전적 요소와 외적 요인인 암 발생 유발요소로 작용되는 발암화학물질, 계속적인 염증과 손상, 암 유발 바이러스 감염의 복합적 요소가 작용하는 것으로 간주된다.

그러나 암은 불치의 병으로 단정할 만큼 절망적인 것은 아니며 조기진단과 함께 적극적인 치료에 임하면 완치될 수 있다. 따라서 조기발견과 조기치료가 암치료의 효과를 높이는 데 결정적으로 중요하며, 진행된 암에서도 다각적이고 적극적인 방법들을 동원한다면 완치 내지 생명을 연장시키고 괴로운 증세를 호전시킬 수 있다.

암 중에서도 간암은 세계적으로 가장 치명적인 암의 하나로 알려져 있으며, 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서 해마다 약 오십만 명 이상이 간암으로 사망하고 있는 것으로 보고되고 있다. 간암은 크게 간세포 자체로부터 발생한 원발성 간암 (간세포암; hepatocellular carcinoma)과 다른 조직의 암이 간으로 전이되어 온 전이성 간암으로 구분할 수 있는데, 간암의 약 90% 이상은 원발성 간암이다. 이러한 간암의 발병 원인 중 대다수는 B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 의한 급성 또는 만성적인 감염이라는 것이 보고되고 있지만, 간암의 발병 및 진행에 관한 세포 내의 분자적 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 못한 상태이다. 종래의 연구에 따르면 각종 성장인자 유전자와 같은 전-종양형성유전자 (protooncogene)가 다양한 원인에 의하여 종양형성유전자(oncogene)로 돌연변이되어 과발현하거나 과활성을 갖는 경우, 또는 Rb 단백질이나 p53 단백질과 같은 종양형성 억제 유전자 (tumor suppressor gene) 가 다양한 원인에 의하여 돌연변이 되어 저발현하거나 기능을 잃는 경우 간암을 비롯한 다양한 암의 발병과 진행을 유발하는 것으로 보고되어 있다. 최근에는 간암을 비롯한 대부분의 암의 발병 및 진행은 특정 몇몇 유전자들에 의하여 이루어지는 것이 아니라 세포주기, 신호전달 등과 관련된 다양한 각종 유전자들의 복합적인 상호작용에 발병하는 것으로 인식되고 있으며, 따라서 개별적인 유전자나 단백질의 발현이나 기능에만 중점을 두는 것에서 벗어나 다양한 유전자나 단백질에 대한 총체적인 연구의 필요성이 대두되고 있다.

간암의 예후 (prognosis)는 간암이 진단된 이후에 간암의 완치가능성, 치료 후 재발가능성, 환자의 생존가능성 등 간암에 따른 환자의 각종 상태를 예측하는 것을 일컫는데, 이는 질병의 심각성, 진단 시점, 치료경과 등의 다양한 조건에 의존하여 달라진다. 간암은 그 예후에 따라 적합하게 다양한 치료방법이 적용되어야만 효율적인 치료가 가능하다. 예를 들어, 예후가 양호할 것으로 추정되는 환자들에 대해서는 공격적인 화학치료나 수술, 방사선 치료 등 환자에게 심각한 부작용을 야기할 가능성이 있는 위험한 치료방법은 지양할 필요가 있고, 상대적으로 온건하고 보존적이며 안전한 치료방법을 선택하여야 한다. 반대로 예후가 불량할 것으로 추정되는 환자들에 대해서는 화학치료나 수술, 방사선 치료와 같은 치료방법을 적극적으로 동원하여 생존의 기간이나 확률을 높이고자 시도하여야 한다. 그러나 간암의 예후를 정확하게 진단하고 판단할 수 있는 기술이 부족한 상태이며, 현재까지의 연구에 따르면, 이미 진행되어버린 간암은 그 예후가 극히 불량하여 진단 후 6개월 이내에 사망하여 평균 생존 기간이 4개월밖에 되지 않는 높은 치명율을 보이는데 비해, 크기가 3cm 미만인 작은 간암은 예후가 양호하여 특별한 치료 없이도 1년간 생존할 확률이 90%에 이르고 수술을 한 경우 5년 생존율이 40-50% 정도가 되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 간암 환자의 예후를 정확하게 추정하는 것은 종래의 기술로는 매우 어렵다. 예후의 정확한 추정을 위해서는 환자들을 위험군별로 분류하는 분석방법이 필요한데, 현재까지는 간암의 예후를 정확하게 추정할 수 있는 수단 없이 진단 시의 병리임상학적인 간암의 단계와 1차적 외과 치료에만 의존하여 예후를 판단하고 있는 실정이다. 그러나, 불행하게도 간암의 단계만으로는 각 간암 환자에 대한 예후를 정확하게 판단할 수 없다.

따라서 간암의 예후를 판단할 수 있고, 나아가 수술 후 재발 가능성 여부를 판단할 수 있는 진단 마커의 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-0964193호

이에 본 발명자들은 간암의 재발 가능성 여부 및 예후를 정확하게 예측하고 진단할 수 있는 바이오마커로서 TCIRG1를 사용할 수 있음을 규명하였고 나아가 TCIRG1의 정량적인 발현양의 분석을 통해 간암의 발병여부, 수술 후 재발여부, 간암 진행 단계 및 수술 후 예후를 예측할 수 있는 TCIRG1의 컷오프 값을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 TCIRG1 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 조성물을 포함하는, 간암 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TCIRG1의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, TCIRG1 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 TCIRG1 유전자는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 것이고, TCIRG1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 TCIRG1에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 간암 진단 또는 예후 예측은 간암의 진행, 재발, 전이 및 예후 평가를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 조성물을 포함하는, 간암 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 키트는 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TCIRG1 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 시료는 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계는 표준 또는 컷오프(cut-off) 값에 의해 수행되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 TCIRG1의 발현수준이 대조군 시료에서의 발현수준보다 증가한 경우, 간암의 재발, 종양성장 또는 전이 가능성이 높아 예후가 좋지 않을 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제공방법은 간암의 전이 가능성 판단에 대한 컷오프 값이 11.0112인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제공 방법은 조기 간암 판단에 대한 컷 오프 값이 6.2821이고, 중기 간암 판단에 대한 컷 오프 값이 6.4371이며, 말기 간암 판단에 대한 컷 오프 값이 11.3794인 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 정보 제공 방법은 간암 재발 가능성 판단에 대한 컷 오프 값은 2.5687인 것일 수 있다.

나아가 본 발명은 TCIRG1의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 억제제는 TCIRG에 특이적인 siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머 또는 항체일 수 있다.

본 발명에서 제공하는 TCIRG1 바이오 마커는, 간암의 발병 여부, 재발 여부 및 진행 단계를 보다 정확히 판별함으로써 환자의 암 진단 정확도를 향상시킬 수 있고, 병변에 대한 상태 및 치료 후 환자의 임상적 결과를 보다 잘 예측할 수 있도록 하여 적절한 치료 방법을 결정하도록 하거나 간암 발병 후의 생존율을 높이는 데 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 간세포암의 재발과 관련된 유전자들의 동정 및 선택 결과들을 나타낸 것으로, 1a는 7,550 유전자의 차별적 발현수준을 2차원 다이어그램으로 나타낸 것으로 간 절제술 후, 비재발 또는 재발된 HCC 환자 유래의 조직을 대상으로 분석한 데이터를 나타낸 것으로 Dendrograms은 총 간 절제술(TH)과 부분적 간 절제술 (PH) 환자의 클러스터링으로부터 유래된 것이다. 1b는 TH와 PH 그룹 간의 유전자 특성에 대한 벤 도식분석 결과를 나타낸 것이고, 1c는 총 간 절제술 환자에서 비재발 및 재발군 사이의 상향 조절된 유전자의 차별적인 특성을 Volcano 플롯으로 나타낸 것이며, 1d는 TH 전이성 특성 및 GSE39791 전이성 특징 간에 공통적으로 상향 조절된 953개의 유전자를 나타낸 것이고, 1e는 MSigDB로 분석된 953개의 명백한 전이성 분자로부터 상위 10개의 유전자 세트에 대한 막 대형 차트를 나타낸 것이고, 1f는 TH 특성 및 LIAO_METASTASIS 유전자 세트로 분석한 GSEA를 나타낸 것으로, 바코드는 유전자의 위치를 나타낸 것이고 y 축은 해당 유전자의 함량(발현정도)을 나타낸 것이다.
도 2는 간세포암(HCC)에서 TCIRG1의 과발현 및 이의 임상학적 관련 분석결과를 나타낸 것으로서, 2a는 TCGA_LIHC 데이터 분석을 나타낸 것으로 TCGA_LIHC 데이터는 총 세트 (n = 423, 왼쪽결과) 및 쌍 세트 (n = 100, 중간결과) 와 비교하여 HCC에서 유의하게 과발현되어 있는 것으로 나타났고, 종양 진행단계가 중증일수록(higher tumor grade) (오른쪽 결과)에서 과발현되는 것으로 나타났다(평균 ± SD; * P <0.05; *** P <0.001).
도 2b는 전반 생존 (왼쪽)과 무병 생존 (오른쪽)에 대한 TCGA_LIHC에서 TCIRG1 mRNA 발현수준을 Kaplan-Meier 생존 곡선으로 나타낸 것으로, P 값은 log-rank test를 통해 도출하였다.
도 2c는 TCGA_LIHC (왼쪽)와 GSE39791 (오른쪽)에서의 TCIRG1 ROC 곡선 분석결과를 나타낸 것으로, AUC의 통계적 유의한 차이는 대조군과 비교하였다(* P <0.05; *** P <0.001).
도 2d는 HCC 조직에서 TCIRG1의 mRNA 발현수준을 qRT-PCR 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 비종양 조직 또는 종양 조직의 면역화학적 분석(왼쪽) 및 TCIRG1의 발현율(오른쪽)을 분석한 결과를 나타낸 것이다(***P< 0.001).
도 2f는 HCC 조직들(NT : 인접한 비 종양 조직, T : 종양 조직)에서 TCIRG1의 발현수준을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 글리세롤 알데히드 -3- 인산 탈수소 효소 (GAPDH)는 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 2g는 TCIRG1의 양성발현 또는 음성발현에 따른 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이고(왼쪽), 비 이식 코호트에서 TCIRG1 발현에 의한 종양 범위의 강도를 나타낸 것이다(오른쪽).
도 2h는 TCIRG1의 양성발현 또는 음성발현에 따른 Kaplan-Meier 생존 곡선을 나타낸 것이고(왼쪽), 이식된 코호트에서 TCIRG1 발현에 의한 종양 범위의 강도를 나타낸 것이다(오른쪽).
도 2i는 Gene Expression Omnibus (GEO) 데이터베이스 (accession number: GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE36411, GSE45436 및 GSE89337)를 이용하여 TCIRG1 mRNA 발현수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다(mean ± SD; **P< 0.01; ***P< 0.001).
도 2j는 NCBI GEO 데이터베이스(accession number: GSE39791 및 GSE77314; mean ± SD; **P< 0.01; ***P< 0.001, paired ttest)의 HCC 공개 게놈 데이터에서 TCIRG1 발현에 대한 평행 좌표를 도표로 나타낸 것이다.
도 2k는 간세포 암 환자에서 TCIRG1의 발현 (좌측) (N : 정상, eHCC : 초기 간암, ovHCC : overtHCC) 및 TCIRG1의 발현 (우측) (accession number : GSE89337, 평균 ± D, ** P <0.01)을 나타낸 것이다.
도 3은 간암 세포주에서 TCIRG1을 타겟팅으로 한 항암 효과를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 3a는 2개의 정상 세포주(THLE3 및 MIHA) 및 12개의 간암 세포주(Hep3B, HepG2, Huh7, PLC/PRF/5, SK-Hep1, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449, and SNU475)에서의 TCIRG1 발현을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 것이고, 3b는 세포에서 내재적으로 발현되고 있는 TCIRG1을 웨스턴 블럿으로 수행한 결과를 나타낸 것으로, GAPDH는 로딩 대조군으로 사용한 것이며 각 밴드 하단의 숫자는 발현수준을 나타낸 것이다. 3c는 SNU475 및 Huh7 세포주에서 콜로니 형성능을 분석한 결과를 나타낸 것이고, 3d는 TCIRG1 특이적 siRNA 및 음성대조군 siRNA로 SNU475 및 Huh7 세포주를 형질감염 시키고 트립판 블루 염색을 통해 세포수를 측정한 결과를 나타낸 것이며, 3e는 TCIRG1 특이적 siRNA 및 음성대조군 siRNA로 SNU475 및 Huh7 세포주를 형질감염 시키고 MTT 분석으로 세포 성장 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이고, 3f는 SNU475 및 Huh7 세포주에 대해 BrdU(Bromodeoxyuridine) 유입 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 3g는 TCIRG1 특이적 siRNA 및 음성대조군 siRNA로 세포를 형질감염 시키고 FACS 분석을 수행한 것으로, SNU475 및 Huh7 세포주에서 TCIRG1의 넉다운은 G1/S 어레스트를 유도하는 것으로 나타났고, 각 퍼센트는 해당 세포수의 분포도를 나타낸 것이다. 3h는 TCIRG1 특이적 siRNA(siTCIRG1) 및 음성대조군 siRNA(N.C)로 세포를 형질감염 시키고 PI 및 아넥신 V 염색으로 FACS 분석을 수행한 것으로, 바 그래프는 아넥신 V 양성 세포수의 퍼센트를 나타내는 것이다. 3i는 형질감염 후, 세포에 3-MA (5mM)을 처리한 다음 FACS 분석을 수행한 것으로, 바 그래프는 아넥신 V 음성 및 PI 양성 세포수의 퍼센트를 나타낸 것이다.
도 4는 간암 세포주에서 TCIRG1을 타겟팅으로 한 암전이능 억제 효과를 분석한 것으로, TCIRG1 넉다운에 의한 SNU475 및 Huh7 세포주에서의 이동 억제(4a) 및 전이 억제(b)를 나타낸 결과이다. 4c는 상처 치유능 분석을 수행한 것으로, 바 그래프는 세포이동으로 회복된 정도를 나타낸 것이며, 4d 및 4e는 ras-형질전환된 NIH-3T3 마우스의 섬유아세포에서 TCIRG1 넉다운에 의한 세포이동 억제(4d) 및 전이 억제(4e) 정도를 분석한 결과를 나타낸 것이다. 4f는 EMT와 관련된 인자들인 TCIRG1, E-cadherin, N-cadherin, Fibronectin, Vimentin, Snail 및 Slug에 대한 발현수준을 웨스턴블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다. 4g는 NCBI GEO 데이터베이스 분석 결과로서, accession numbers GSE39791 및 GSE77314의 GEO 데이터 세트는 TCIRG1 및 CDH1 간의 발현 분석에 사용하였고, 왼쪽 패널은 GSE39791 및 GSE77314에서 CDH1의 발현을 나타낸 것이고, 오른쪽 패널은 GSE39791 (Pearson correlation coefficient r = -0.21, **P<0.01) 및 GSE77314 (Pearson correlation coefficient r = -0.36, ***P< 0.001)에서 TCIRG1 및 CDH1 발현의 음성적 관계를 나타낸 것이다.
도 5는 암 전이에서 TCIRG1이 미치는 영향을 분석한 것으로, 5a는 TCIRG1의 발현 억제 후, ras-transformed NIH-3T3 세포의 CT 이미지를 나타낸 것이고(왼쪽), 각 종양 부피를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다(오른쪽). 5b는 ras-transformed NIH-3T3 세포를 이식한 마우스 동물 모델에서 음성 대조군 siRNA (n=5) 및 TCIRG1 siRNA (n=5)을 주입한 후, 폐로의 암 전이를 분석한 결과를 나타낸 것이다(왼쪽). 이때 마우스의 폐 결절(nodules)의 수를 막대 그래프로 나타내었다(오른쪽).
도 6a는 비종양조직 (Non tumor, n=50)과 진행성 간세포암 (G2,G3,G4, n=301)을 대상으로 분석한 TCIRG1 cut-off 분석 결과를 나타낸 것이고, 6b는 GSE39791에서 간 절제술을 받은 동일 환자의 비종양조직 (Non tumor, n=72)과 재발성 간세포암 (Tumor, n=72)에 대한 TCIRG1의 발현량의 cut-off 분석 결과를 나타낸 것이며, 6c는 간세포암 단계별(G1, G2, G3, G4) TCIRG1의 발현량의 cut-off 분석 결과를 나타낸 것이고, 6d는 정상-> 조기간암(eHCC) -> 중증간암(avHCC)에 따른 TCIRG1의 발현량의 cut-off 분석 결과를 나타낸 것이고, 6e는 간절제술 후 암이 재발된 조직과 재발되지 않은 조직에서의 TCIRG1 발현양 컷오프 값을 분석한 결과이다.

본 발명은 간암의 발병, 재발 및 예후를 예측하고 진단할 수 있는 바이오마커로서 TCIRG1의 사용 가능성을 규명한 점이 특징이 있다.

간암은 세계적으로 가장 치명적인 암으로 알려져 있으며 발병되면 예후가 좋지 않아 사망률이 높은 암이다. 따라서 간암을 예방하고 치료 효과를 높이기 위해서는 간암의 발병여부, 진행 단계, 수술 후 재발여부, 예후 등을 정확히 판단할 수 있어야 하며, 이러한 판단에 근거한 적절한 치료방법이 적용되어야 한다.

이에 본 발명자들은 간암을 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 연구하던 중, TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1)의 간암 진단 마커로서의 사용 가능성을 확인하였고, 나아가 간암 수술 후 재발여부 및 예후를 판단할 수 있는 용도로도 사용가능함을 확인하였다.

특히 본 발명에서 발굴한 간암 진단용 마커인 TCIRG1은 간암 환자로부터 수득한 시료를 대상으로 발굴된 마커로서, 실제적인 사용 가능성이 임상 수준에서 확보되었다고 볼 수 있다.

우선적으로 본 발명자들은 간암을 정확하게 예측하고 진단할 수 있는 바이오마커 발굴을 위해, 간 절제술을 시행한 환자로부터 간암 조직을 확보하여 간암이 재발된 군과 재발되지 않은 군으로 구분한 후, 각 조직에서 발현되는 유전자들에 대해 클러스터링 분석을 수행하였다. 그 결과, 간 절제수술 후, 간암이 재발된 환자의 조직에서 특이적으로 과발현되는 TCIRG1 유전자를 확인하였다.

이에, TCIRG1 유전자가 간암 특이적으로 과발현되는 양상을 보이는지를 검증하기 위해, 간암 환자로부터 수득한 비종양 간조직과 간암조직에 대해 TCIRG1 발현수준을 분석하였는데, 그 결과, 비종양 간조직에 비해 간암 조직에서 월등히 발현이 증가되어 있는 것으로 확인되었다.

따라서 TCIRG1은 간암 발병 시, 특이적으로 과발현되는 양상을 나타냄을 알 수 있었고, TCIRG1을 간암 진단을 위한 특이적 바이오마커로 사용 가능함을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 일실시예에서는 TCIRG1의 발현수준과 간암의 재발 및 예후와의 상관성을 분석하였는데, TCIRG1 발현 양성 환자군이 TCIRG1 음성 환자군에 비해 무병생존율이 낮은 것으로 나타났고, 예후가 좋지 않은 것을 확인할 수 있었다.

따라서 TCIRG1은 간암의 발병여부 뿐만 아니라 간암 수술 후 재발 가능성 여부 및 환자의 예후까지도 예측할 수 있는 용도로 사용 가능함을 알 수 있었고, TCIRG1이 정상에 비해 과다 발현될 경우, 간암이 발병되었거나, 수술 후 다시 재발되었거나, 전이 가능성이 있거나, 환자의 예후가 좋지 않은 것으로 예측할 수 있다.

그러므로 본 발명은 TCIRG1 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 TCIRG1단백질로 이루어지는 간암 진단용 마커를 제공할 수 있으며, 또한 TCIRG1 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서, 상기“진단”이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 “진단”은 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

본 발명에서, 상기 "예후"는 암이 진단된 이후에 암의 완치 가능성, 치료 후 재발 가능성, 환자의 생존 가능성 등 암에 따른 환자의 각종 상태를 예측하는 것을 말한다. 암의 예후는 다양한 관점에서 추정될 수 있지만, 대표적으로 재발가능성, 생존가능성, 무병생존가능성의 관점에서 판단될 수 있다. 본 발명의 목적상 예후는 간암의 진단 이후 생존의 예후를 의미할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 바이오 마커를 사용하면, 간암 환자의 생존 예후를 보다 용이하게 예측할 수 있어, 고 위험군의 환자를 분류하거나, 추가 필요한 치료 방법의 사용 여부를 결정하는 데 활용할 수 있고, 이로써 간암 발병 후의 생존율을 높이는 데 기여할 수 있다.

또한, 상기 "예측"이란 환자가 치료법에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응하여 환자의 치료 후 생존할 여부 및/또는 가능성과 관련된다. 본 발명의 추정 방법은 암 발병 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 예측 방법은 환자가 예를 들어 소정 치료제 또는 조합물, 외과적 개입, 화학요법 등의 투여를 비롯한 소정 치료 처방과 같은 치료 처방에 선호적으로 반응하는지를 확인하거나, 치료 처방 후 환자의 장기 생존이 가능한지 여부를 예측하는 데 사용될 수 있다.

또한, 상기 “진단용 마커(diagnosis marker)”란 간암의 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포(또는 조직)에서 발현양이 증가하는 TCIRG1 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 TCIRG1 유전자는 서열번호 1 및 2로 기재된 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 TCIRG1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 TCIRG1 유전자의 수준은, 바람직하게 TCIRG1 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 TCIRG1 유전자에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기“프라이머”란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 TCIRG1 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기“프로브”라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 TCIRG1 단백질의 수준은, 바람직하게 TCIRG1 유전자가 발현된 mRNA로부터 번역과정을 거쳐 생성된 TCIRG1 폴리펩티드를 의미하며, 상기 TCIRG1 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 TCIRG1 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 “항체”를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 TCIRG1 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 TCIRG1 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

한편, 본 발명은 TCIRG1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 함유하는 조성물을 포함하는 간암 진단 또는 예후 진단용 키트를 제공할 수 있다.

발명의 키트에 포함되는 간암 진단 또는 예후 진단용 조성물은 TCIRG1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브, 앱타머, 항체 또는 기질을 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

한편, 본 발명은 TCIRG1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, TCIRG1 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

한편, 본 발명은 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TCIRG1 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.

상기에서 TCIRG1 유전자의 발현수준 또는 TCIRG1 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 검출 또는 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 TCIRG1 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 TCIRG1 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 TCIRG1 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 TCIRG1 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 TCIRG1 mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 TCIRG1 mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군, 즉, 정상인의 샘플과 비교함으로써 간암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 간암 환자로부터 수득한 간암 조직과 정상 간 조직을 대상으로 조직 용해물을 수득한 다음, TCIRG1에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 방법을 수행하여 각 시료로부터 TCIRG1의 단백질 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 정상의 대조군과 비교 분석하는 과정을 통해 수행하였다.

또한 본 발명은 간암의 진단, 구체적으로는 간암의 발병여부, 재발여부, 진행단계 또는 예후를 예측할 수 있는 TCIRG1 발현양에 대한 컷오프 값(cut off value)을 제공한다.

상기 컷오프 값(cut off value)은 본 발명에 따른 시료, 예를 들면, 조직, 혈청, 혈장 등의 시료에서 TCIRG1에 대한 컷오프 값이다.

본 발명에 따른 상기 간암 진단 또는 예후 추정 방법에서 상기 유전자 발현 수준 측정 결과를 대조군에 대한 측정 결과와 대비하여 암을 진단하거나 예후를 추정할 수 있다. 또는 미리 결정된 기준치(cut-off) 값과 대비하여 암을 진단하거나 예후를 추정할 수 있다. 대조군으로는, 음성 대조군으로 정상 시료, 또는 암에 걸린 후 치료된 환자 유래의 시료, 예컨대 비종양 시료를 사용할 수 있고, 양성 대조군으로는 간암으로 판정된 환자 유래의 시료를 사용할 수 있다. 일례로, 정상인 유래의 시료, 암 판정 환자에서 채취한 정상 조직 시료, 암으로 판정 후 치료를 받은 환자 유래의 시료가 대조군으로 사용되어, 수득된 프로파일의 비교에 사용될 수 있다.

대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 당해 분야에서 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교를 참조할 수 있다. 본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 일례로 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있다. 또한 본 발명에 따른 간암 진단 및 예후 추정 방법의 유의성을 확인하기 위하여, 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일구현예에서는 로지스틱 회귀분석 방법이 사용될 수 있다. 또한, 통계처리를 통해 암으로 진단하기 위해 시험물질과 대조군간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다. 이러한 통계적 분석 방법은 바이오 마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상 적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.

이에 본 발명자들은 간암의 진단을 위한 TCIRG1 컷오프 값을 분석하였는데, 본 발명의 일실시예에서는 비간암 환자의 간조직과 간암 환자의 간조직에서의 TCIRG1 발현양을 정량 측정하였고, 또한, 간암 환자의 비종양조직과 진행성 간세포암 조직에서의 TCIRG1 발현양을 정량 측정한 후, 간암 환자 조직에서의 발현양을 비간암 환자 조직의 발현양에 기초하여 컷오프 값을 도출하고, 간세포암 조직에서의 발현양을 비종양조직에서의 발현양에 기초하여 컷오프 값을 도출한 결과, 컷오프 값이 11.0112인 것으로 나타났다.

따라서 시료의 TCIRG1의 컷오프 값이 11.0112 이상인 경우, 간암이 발병된 것으로 예측할 수 있고, 또한 발병 간암의 전이 가능성이 있는 진행성 간암으로 예측할 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 간 절제술을 받은 환자의 비종양조직과 재발된 간세포암 조직에서의 TCIRG1 컷오프 값 분석 결과, 컷오프 값이 2.5687로 나타났다.

따라서 수술 후 환자의 시료에서 TCIRG1의 컷오프 값이 2.5687 이상인 경우, 수술적 치료 후 간암이 재발될 가능성이 있는 것으로 예측할 수 있다.

다른 일실시예에서는, 간암 1기(G1), 간암 2기(G2), 간암 3기(G3) 및 간암 4기(G4) 환자의 암 조직에서 TCIRG1 발현양을 정량분석하고 TCIRG1 컷오프 값을 분석하였는데, 정상과 조기간암(eHCC)에서의 컷오프 값이 6.2821인 것으로 나타났고, 조기간암(eHCC)와 중기간암(avHCC)에서는 컷오프 값이 6.4371인 것으로 나타났고, G3(3기 간암) 및 G4(4기 간암)에서는 컷오프 값이 11.3794인 것으로 나타났다.

따라서 TCIRG1 컷오프 값이 6.2821인 경우에는 조기 간암으로 판단할 수 있고, 6.4371인 경우에는 중기간암으로 판단할 수 있으며, 11.3794인 경우에는 말기 간암으로 판단할 수 있다.

나아가 본 발명자들은 TCIRG1을 억제할 경우, 간암을 억제할 수 있는지 확인하기 위해, TCIRG1에 대한 siRNA로 TCIRG1을 넉다운 시킨 후, 간세포암의 성장 및 증식을 분석한 결과, TCIRG1의 발현 또는 활성 억제시 암세포의 성장과 증식이 억제되는 것으로 나타났고, 세포주기 이상이 초래되고 세포사멸이 유도되어 궁극적으로 간암을 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

따라서 TCIRG1의 활성 및 발현을 억제할 수 있는 물질은 간암 치료제로 사용할 수 있다.

따라서 본 발명은 TCIRG1의 억제제를 유효성분으로 포함하는, 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에는 TCIRG1의 발현을 억제할 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 TCIRG1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 TCIRG1에 대한 siRNA를 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 TCIRG1의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 TCIRG1 mRNA에 상보적이고 TCIRG1 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, TCIRG1 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "siRNA”용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(TCIRG1 mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(TCIRG1 mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 TCIRG1 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

또한, 상기 TCIRG1 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 TCIRG1 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 “투여”란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 “유효량”이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) TCIRG1 유전자 또는 TCIRG1 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 TCIRG1 유전자의 발현양, TCIRG1 단백질의 양 또는 TCIRG1 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, TCIRG1 유전자의 발현양, TCIRG1 단백질의 양 또는 TCIRG1 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, 먼저 TCIRG1 유전자 또는 TCIRG1 단백질을 포함 또는 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기“시료”는 TCIRG1 유전자의 발현양, TCIRG1 단백질의 양 또는 TCIRG1 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 TCIRG1 유전자의 발현양, TCIRG1 단백질의 양 또는 TCIRG1 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, TCIRG1 유전자의 발현양, TCIRG1 단백질의 양 또는 TCIRG1 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 TCIRG1의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<준비예>

조직준비

간암조직은 1995년 1월부터 2006년 5월까지 서울대학교 병원에서 HCC 환자를 대상으로 수술과정에서 제출된 것을 수집하여 사용하였다. 간암조직은 즉시 급속 동결시켰고 액체 질소에 저장하였다. 또한 본 실험에 등록한 환자로부터 정보 제공 동의를 얻었다. 헬싱키 선언에 따라 각 피험자로부터 서면 동의를 얻었으며, 가톨릭 대학교 의과 대학의 기관 검토위원회 (IRB 승인 번호 : MC12SNMI0184)의 승인을 받아 하기 실험에 본 간암 조직을 사용하였다.

<실험방법>

① 분자경로 마이닝 및 유전자 세트 농축분석(Molecular pathway mining and gene set enrichment analysis)

공지된 분자 데이터베이스에서 유전자 특성을 조사하기 위해 Broad Institute Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)의 MSigDB (http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)에서 유전자 세트를 다운로드 하였다(http : // www. broadinstitute.org/gsea). GSEA는 LIAO_METASTASIS 유전자 세트와 명백한 전이성 유전자 시그널의 존재에 엑세스(access)하기 위해 수행하였다. 유전자가 관심 표현형에 의한 발현 수준의 상관 관계에 의해 순위가 매겨진 데이터 세트를 감안할 때, 기본 GSEA 테스트는 주어진 유전자 세트가 최상위 (양성 상관관계) 또는 최하위 (음성 상관관계)에 농축되는 정도를 정량화한 점수를 나타낸다. 유전자 세트의 근접성은 Kolmogorov-Smirnoff (KS) 점수를 사용하여 측정하였고, 점수가 높을수록 근접성이 높다는 것을 의미한다. 분석된 KS 점수는 유의성을 평가하기 위해 모든 유전자 세트에 대한 1000개의 치환된 KS 점수 분포와 비교하였다.

② TCIRG1에 대한 조직마이크로어레이

헤마토크실렌과 에오신(H & E) 슬라이드를 재확인하고 한시적으로 포르말린 - 고정하고 파라핀 - 임베디드(FFPE)된 기록 블록을 각 케이스별로 선택하였다. 코어 조직 생검 (직경 2mm)을 개별 FFPE 블록 (공여체 블록)에서 채취하고 트레핀을 사용하여 수혜 파라핀 블록 (조직 배열 블록)에 배치시켰다. 302 개의 HCC 암 조직을 포함하는 8개의 어레이 블록을 준비하였다(Superbiochips Laboratories, Seoul, Korea).

③ 세포배양 및 형질감염

Hep3B, HepG2, Huh7, PLC/PRF/5, SK-Hep1, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449 및 SNU475의 간암세포주는 Korean Cell Line Bank(KCLB, Seoul, South Korea)로부터 입수하여 사용하였다. THLE3 정상 간 세포주는 American-Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)로부터 입수하였고, MIHA 불멸 인간 간세포는 Dr. Roy-Chowdhury (Albert Einstein College of Medicine, NY, USA)로부터 제공받아 사용하였다. 이들 모든 세포주들은 10% FBS(GenDEPOT, Barker, TX, USA) 및 100 units/ml의 penicillin-streptomycin (GenDEPOT, Barker, TX, USA)이 첨가된 RPMI1640, DMEM (GenDEPOT, Barker, TX, USA) 또는 EMEM (ATCC, Manassas, VA, USA) 배지를 사용하여 배양하였다. 모든 세포주들은 37℃의 온도 및 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 형질감염을 위한 siRNA 및 음성 조절 RNA duplexes는 바이오니아(대전, 한국)에 의뢰하여 합성한 것을 사용하였다. RNA duplexe는 100nM의 농도로 세포주에 형질감염시켰고, 모든 형질감염은 Lipofectamine RNAiMAX 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하였으며 제조사의 제공방법에 따라 수행하였다(TCIRG1 siRNA 서열은 서열번호 4, 대조군 siRNA 서열은 서열번호 5에 나타내었다).

④ TCGA 및 GEO 데이터 분석

HCC에서 TCIRG1 mRNA의 발현 수준을 재구성하기 위해 Cancer Genome Atlas 간세포 암 (TCGA_LIHC) 프로젝트와 NCBIGEO 데이터베이스 (Accession No. GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE36411, GSE45436, GSE77314 및 GSE89337)로부터 자료를 수집하였다. 또한 Cancer Genomics 웹 사이트 (http://www.cbioportal.org/public-portal/)에 대한 cBioPortal을 사용하여 TCGA mRNA 발현 데이터에 액세스 하였다. 각 유전자에 대해서 provisional RNASeq V2 RSEM z-score를 사용하였다. z 점수는 정규화 된 상대적인 발현 수준을 나타낸 것이며 mRNA 수준 대용으로 사용하였다.

⑤ RNA 분리 및 qRT - PCR 분석

총 RNA는 동결된 간암 조직 및 간암 세포주로부터 TRIzol 시약을 이용하여 분리하였다. mRNA 특이적 cDNA 합성은 Tetro cDNA 합성키트 (Bioline)를 사용하여 수행하였다. qRT-PCR은 SensiFAST™ SYBR® NoROX Kit (Bioline)을 이용하여 수행하였다. 각 반응에 첨가된 총 cDNA 양의 차이를 정상화시키기 위해 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)를 내인성 대조군으로 사용하였다.

⑥ 웨스턴 블럿 분석

조직 단백질 및 전체 세포 용해물은 PMSF(phenylmethane-sulfonylfluoride) 및 1X 복합 프로테아제 억제제 칵테일 타블렛(protease inhibitor cocktail tablets; Roche, Indianapolis, IN, USA)이 함유된 RIPA 버터를 이용하여 제조하였다. 총 단백질은 SDS-PAGE 상에서 전기영동하였고, PVDF 막으로 전기이동시킨 후, 블록킹 버퍼(5% skimmed milk in Tris-buffered saline, 0.1% Tween-20)로 블록킹 반응을 수행한 다음, anti-TCIRG1, anti-Snail (both from Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-GAPDH, anti-fibronectin (both from Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-E-cadherin, anti-N-cadherin (both from BD Transduction, San Jose, CA, USA), anti-Vimentin 및 anti-Slug (both from Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)의 항체를 사용하여 반응시켰다. 이후 Immobilon^TMhorseradish peroxidase 기질(Millipore, Billerica, MA, USA)을 이용하여 화학적 발광신호를 검출하였으며, aLAS-4000 이미지 분석기(FujiPhoto Film Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 가시화 하였다.

⑦ 집락형성 분석( Clonogenic assay)

60mm² 세포배양 플레이트에 배양된 세포에 TCIRG1 siRNA을 처리하여 세포를 형질감염 시켰다. 형질감염 후, 12시간이 지난 다음 1 X 10³ 및 2 X 10³ 세포수로 다시 6 웰 플레이트에 분주하였고, 2주간 추가 배양하였다. 이후 PBS 버퍼로 세포들을 세척하였고 1% 파라포름알데히드로 30분간 상온에서 고정시켰다. 고정된 세포들은 0.5% 크리스탈 바이올렛으로 1시간 동안 상온에서 염색하였고, 형성된 콜로니의 수는 클론 카운터 프로그램을 이용하여 분석하였다.

⑧ 세포 가시화(Cell viability)

세포들을 6웰 플레이트에 분주한 뒤, 음성 대조군 siRNA 또는 TCIRG1 siRNA로 형질감염 시킨 후, 72시간 동안 배양한 다음, 트립신 처리로 세포들을 수집하였다. 이후 트립판 블루 용액으로 세포들을 염색한 후, 헤마토사이토미터(Marienfeld Superior, LaudaKonigshofen, Germany)를 이용하여 염색된 세포를 관찰하여 카운팅 하였다.

⑨ 세포증식 분석

세포들을 형질감염을 위해 12-웰 플레이트에 분주하였다. 형질감염 후, 세포들을 5 mg/ml의 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 시약으로 1시간 동안 반응시켰다. 살아있는 세포에 의해 형성된 진한 파란색 포르마잔 생성물은 디메틸 술폭시드 (DMSO; Sigma-Aldrich)에 용해시키고 VICTOR3 ™ Multilabel 플레이트 판독기 (PerkinElmer, Boston, MA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하여 세포증식 정도를 분석하였다.

⑩ FACS 분석(Fluorescence-activated cell sorting)

세포분포의 분석을 위해, 60mm² 세포배양 플레이트에 세포들을 분주하였고, 음성 대조군 siRNA 및 TCIRG1 siRNA로 각각 세포를 형질감염 시킨 후, 72시간 동안 배양한 다음, 트립신 처리를 통해 세포들을 수집하였다. 수집된 세포들은 70% 에탄올로 고정시켰고 PBS 버퍼로 세척한 다음, 1 mg/mL RNase (Sigma-Aldrich), 0.05% Triton X-100 및 50 ug/mL propidium iodide (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 함유한 200ul의 PBS 버퍼로 현탁시켰다. 현탁된 세포들은 이산화탄소가 없는 조건에서 37℃의 온도로 1시간 동안 배양한 다음, FLOWJO software (Tree Star, Ashland, OR, USA)가 장착된 FACS Caliburflow cytometer (BD Biosciences)로 분석을 수행하였다.

또한, Annexin V-fluorescein isothiocynate (FITC) Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)를 이용하여 프로그램화된 세포사멸 정도를 분석하였다. 이를 위해 상기와 같이 음성 대조군 siRNA 및 TCIRG1 siRNA로 각각 세포를 형질감염 시킨 후, 트립신으로 세포를 수집한 다음, PBS로 세척 후 1 × 바인딩 버퍼(1 × 106cells/mL)로 세포를 현탁시켰다, 이후 1 × 10⁵ 세포수를 함유한 100uL를 5mL의 세포배양 튜브로 이동시켰다. 이후, 5 ul의 Annexin V-FITC 및 5 ul의 propidium iodide (PI) 용액을 상기 세포배양 튜브에 첨가하고, 15분 동안 상온에서 암 조건하에 배양하였다. 배양 후, 400 ul 의 1 × 바이딩 버퍼를 각각의 튜브에 넣고 세포사가 유발되는 분획을 FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences)를 이용하여 확인하였다.

⑪ 세포 이동 및 침윤 분석( Motilityand invasion assay)

In vitro 상에서 세포 이동 및 침윤 분석을 수행하였는데, 세포 이동은 수정된 Boyden chamber 분석(BD Bioscience)으로 수행하였고, 침윤 분석은 Matrigel (BD Biosciences)을 이용하여 수행하였다. 침윤 분석을 위해 Matrigel을 0.3mg/ml의 농도가 되도록 코팅 버퍼로 희석하였다. 이후 100ul로 분주한 희석된 Matrigel 용액을 트랜스웰 세포 배양 삽입물의 일부분으로 덮었고, 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 삽입물(인서트)을 시드할 준비를 하였다. 이렇게 인서트 준비가 완료되면 세포들을 트랜스웰 인서트의 상부 표면에 도포하였고 세포가 도포된 인서트를 24 웰 플레이트에 두었다. 하단의 세포들에는 화학유인물질로서 2%의 FBS를 첨가하여 사용하였다. 세포들은 밤새도록 배양한 후, Diff-Quik 염색 키트(Sysmex, Chuo-ku, Cobe, Japan)를 이용하여 염색하였다. 세포 이미지는 ×200배 배율로 Axiovert 200 inverted microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany)를 이용하여 관찰하였고, 3개의 무작위 이미지 필드에서 세포수를 카운팅하였다.

⑫ 폐 전이 마우스 모델

폐 전이 마우스 모델 제조를 위해, 음성 대조군 siRNA 및 TCIRG1 siRNA로 각각 형질감염된 ras- transformed NIH-3T3 세포 3ul를 PBS 0.1 ml과 혼합한 다음, 5 주령의 흉선이 없는 수컷 누드 마우스 꼬리에 정맥주사 하였다. 주사 후 마우스의 상태를 매일 검사하였고, 정맥 주사한지 12 일 후, 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (micro-computed tomography, Micro-CT) 영상을 위해 마우스를 마취시켰다. 마우스를 스캐너 베드에 놓고 Triumph II PET / CT System 장비 (Trifoil Imaging, Chatsworth, CA, USA)를 사용하여 마이크로 CT 이미지를 획득하였다. 이미지를 재구성하고 MicroView 분석 소프트웨어 (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA)를 사용하여 마우스 당 총 폐의 종양 부피를 정량화 하였다. CT 영상 촬영 후 폐 영상을 얻기 위해 마우스를 희생시켰고, 폐 표면의 결절수를 계산하였다.

⑬ 통계분석

모든 실험은 적어도 3 회 수행하였고, 모든 샘플은 3 중으로 분석하였다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (SD)로 나타내었다. Graphpad ™ 5.0 (GraphPad software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 unpaired 양측 스튜던트 t- 테스트에 의해 그룹 간의 통계적 차이를 평가하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였고, Receiver operating characteristic curve (ROC) 분석은 MedCalc 버전 12.1.4.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Belgium)으로 수행하였다. 연속 변수는 평균 ± SE 및 사분 범위(interquartile range)로 판단하였고, 범주 형 변수는 수와 백분율로 판단하였다. 범주 형 변수는 수와 백분율로 판단하고, 간질 및 다 변수 회귀 분석을 시행하여 간세포 암 환자의 시술 전 독립 예측 인자를 확인하였다. 단 변량 회귀 분석에서 2-테일의 명목 확률 값 <0.05에서 유의한 것으로 확인된 모든 수술 전 예측 변수는 다변량 로지스틱 회귀 분석 모델에 입력하였다.

< 실시예 1>

간세포 암의 재발과 관련된 대규모 유전자 동정

간 이식은 HCC(간세포암)에 대한 가장 이상적인 치료법이지만 간 이식 후 재발 및 전이가 가장 흔한 치명적인 문제가 남아있다. 따라서 원발 종양 시 HCC의 전이 및 재발 가능성을 판단할 수 있는 분자마커의 개발이 필요하다. 이를 위해 본 발명자들은 부분적 또는 전체적인 간 절제술을 받은 환자로부터 56개의 HCC 조직을 확보하였고 간 절제술 후, 재발과 관련된 유전자 발현 양상을 확인하기 위해 전사체 분석(transcriptomic analysis)을 수행하였다. 56개의 간세포 암 조직은 총 36명의 전체 간 절제술 환자 유래의 재발된 암 조직 9개를 포함하고 있고, 20명의 부분 간 절제술을 받은 환자 중에서 암이 재발된 환자 유래의 암 조직 15개를 포함하고 있다(하기 표 1 참조).

[표 1] 간 절제술을 받은 재발 환자의 수

분석을 위해 7,550 유전자 요소의 계층적 클러스터링 분석을 수행하였고, 비재발 그룹(하기 도 1a, 녹색표기 그룹) 및 재발 그룹(도 1a, 노란색 표기 그룹) 사이의 통계적 분석을 수행하였으며(1 차 ANOVA test, p <0.05), 그 결과, dendrogram 내에서 두 개의 구별된 서브클러스터 그룹, 즉 암 비재발 그룹 및 암 재발 그룹으로 그룹핑 되었다. 두 개의 간 절제술 군 모두를 이용한 재분석은 dendrograms에서 두 개의 재발군 모두에서 재발 관련 분자 표지를 나타내는 뚜렷한 군집을 보였다(도 1a, 오른쪽 상단 및 하단 참조). 이러한 분석으로 Welch 's ttest에 의한 전체 간 절제술 (6,682 유전자 요소)과 부분 간 절제술 (2,036) 그룹에서 각 환자에서 차별적으로 발현되는 유전자 (DEG) 특징을 확인할 수 있었다. 이후, 전체 간 절제술 및 부분 간 절제술로부터 수득한 조직들을 대상으로 Venn 다이어그램 분석을 통해 유전자 발현양상을 분석한 결과, 이들 그룹 모두에서 422개의 유전자 요소가 공동적인 발현양상을 갖는 분자들로 확인되었다(도 1b 참조). 그리고 간암 전 전막 병변의 퇴행성 결절의 암세포에서 부분적인 간 절제술 후 재발이 발생할 수 있으므로, 이들 422개의 유전자 요소를 6,682 개의 유전자 요소들로부터 제외시켰다. 또한 총 간세포암 조직을 대상으로 수행한 화산 플롯 분석(p <0.05 및 1.3-fold up-regulated) 결과, 간 세포암이 재발되지 않은 군에 비해 암이 재발된 군에서 총 2,760 개의 유전자가 과발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 1c 참조). 마지막으로, 간암의 재발에 특이적인 유전자 요소를 확인하기 위해, NCBI GEO 데이터베이스에서 간암의 재발 패턴에 대한 유전적 예측 인자를 확인하기 위해 GSE39791 데이터 세트와 비교 분석을 수행하였다. 분석 결과, 953 개의 유전자 요소를 검증된 재발 연관 분자로 확인할 수 있었다(도 1d 참조).

다음으로, 상기 분석에 의해 확인된 암 재발 관련 유전자와 생물학적 관련성을 조사하기 위해, 953 개의 유전자 요소를 대상으로 GSEA(gene set enrichment analysis) 분석을 수행하였다. 이 분석은 HCC의 재발과 관련된 953 유전자의 세포 내 신호 전달 경로를 확인할 수 있었고, LIAO_METASTASIS는 재발성 분자 표지로서 매우 중요한 유전자로 확인되었다(도 1e 및 1f 참조).

< 실시예 2>

간 절제술 후 간세포암 재발 조직에서의 TCIRG1 발현양상 분석

953개의 간세포암 재발 연관 분자 표지 중, TCIRG1 유전자가 TCGA_LIHC 데이터에서 유의적으로 과발현되는 것으로 나타났다. 이러한 데이터베이스는 50개의 비 종양 간 조직과 373개의 HCC 조직의 유전자 발현(mRNA) 데이터 세트를 포함하며, 50쌍의 일치된 세트(50개의 HCC는 비조양 조직과 상응함)를 포함한다. 또한 매칭되는 세트는 비종양(non-cancer) 군과 HCC 군 사이에서 유의한 차이를 보였다. 흥미롭게도 Edmondson 등급 I-II (G1-G2, n = 225) 및 III-VI (G3-G4, n = 132)에 의해 정의된 간세포암의 하위 집합(subset)에서 TCIRG1 유전자의 발현은 G1-G2와 비교하여 G3-G4에서 유의적으로 과발현되는 것으로 나타났다(도 2a 참조). HCC 에서 TCIRG1의 과발현은 다양한 GEO 데이터세트(accession numbers GSE14520, GSE16757, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE36411, GSE45436 및 GSE89337)에서 TCIRG1 유전자의 발현정도를 비교하였고, 데이터는 scatter polts로 표시하였다(도 2i 참조). TCIRG1 발현이 TCGA_LIHC 종양 환자에서 상향 조절(과발현) 되었기 때문에, 본 발명자들은 cBioPortal (www.cbioportal.org)에서 TCGA_LIHC 데이터를 이용하여 HCC 환자의 TCIRG1 발현 예후 관련성을 분석하였고, 그 결과, HCC 환자의 9 %가 TCIRG1유전자가 과발현되는 것으로 나타났다. HCC 환자의 Kaplan-Meier 생존 곡선은 TCIRG1 발현이 증가한 환자의 5 년 무병 생존율 (DFS)이 TCIRG1 발현 변화가 없는 HCC 환자보다 유의적으로 낮았다(도 2b 참조).

나아가 본 발명자들은 간 절제술 이후 HCC에 대한 예후 예측용 바이오마커로서 TCIRG1을 사용할 수 있는지를 검증하기 위해 ROC 곡선을 비교 분석 하였다(도 2c 참조). 그 결과, AUC(area under curve)은 TCGA_LIHC 군에서는 0.74, GSE39791 군에서 0.74인 것으로 나타났다. 이는 HCC의 진단을 위한 잠재적 바이오 마커로서의 사용 가능성을 암시한다. 또한, 2개 HCC 환자군 코호트에서 유전자 발현정보를 제공하는 매칭되는 세트(GSE39791 및 GSE77314)에서의 TCIRG1 발현은 비종양 조직과 비교하여 간세포암 조직(HCC)에서 유의적으로 과발현되는 것으로 나타났다(도 2j 참조). TCIRG1 유전자 발현은 높은 등급의 HCC 환자군에서 유의하게 과발현되었다(G3-G4, 도 2a 참조). 일관되게 TCIRG1 발현은 정상 간 조직 (정상, n = 13) 또는 초기 HCC (eHCC, n = 25) 조직(도 2k 참조) 보다 명백한 HCC 환자군(ovHCC, n = 26)에서 유의적으로 과발현되었다. 또한 동일한 환자군(GSE89337)에서의 비재발 또는 재발에 따른 차별적인 유전자 발현분석은 전체 간 절제술 후 재발한 간세포 암 환자에서 TCIRG1이 유의하게 과발현되는 것으로 나타났다(도 1k, 오른쪽 참조).

HCC 환자에서 TCIRG1의 과발현 확인을 위해, 인접한 비 암성 간 조직과 짝을 이루는 무작위로 선택된 35개의 간세포 암종에서 TCIRG1의 발현수준을 qRT-PCR로 분석하였다. 분석 결과, 35개의 HCC 조직 중에서 24개(68.6 %)는 TCIRG1의 과발현을 보였다(도 2d 참조).

다음으로, HCC 조직에서 TCIRG1 단백질의 과발현 여부를 확인하기 위해, TCIRG1 특이적인 항체를 이용하여 면역염색을 수행하였다. 그 결과, HCC 조직에서 TCIRG1에 대한 항체 양성율은 24.4 % (133/546)였고, 비 종양 그룹에서 TCIRG1에 대한 양성율은 1.0 % (1/100)인 것으로 나타났다(도 2e 참조). TCIRG1 단백질의 발현 증가는 무작위로 선택된 14개의 인간 간암 조직과 비- 암성 간 조직을 대상으로 웨스턴 블랏 (Western blot) 분석을 통해 재확인한 결과, 비암성 조직에 비해 간암 조직에서 발현이 증가되어 있었다(도 2f 참조).

또한, TCIRG1을 포함한 간 전이와 관련된 다양한 임상 변수에 대한 다변량 로지스틱 회귀 분석을 수행한 결과, TCIRG1의 과발현은 6개의 다른 전이 특징 중에서 가장 강한 연관성을 보였다(Odds ratio 1.768, p <0.001)(표 2 참조).

[표 2]

로지스틱 회귀 분석

또한, TCIRG1 양성 환자의 무병생존율(DFS rate)는 546명의 간 이식을 하지 않은 HCC 환자군과 285명의 간이식을 수행한 HCC 환자군의 코호트에서 TCIRG1에 대한 음성 발현을 보이는 환자에 비해 수치가 유의하게 낮았다(도 2g 및 2h 참조). 즉 암의 진행은 2개 코호트 모두에서 TCIRG1 양성 환자군이 유의하게 더 많은 것으로 나타났고(하기 표 3 참조), 이러한 결과는 TCIRG1이 간 절제술 후 간세포암의 재발 가능성을 예측할 수 있는 유의한 마커임을 시사한다.

[표 3]

간 이식을 수행한 간세포암 환자의 두 가지 코호트에 대한 임상 병리학적 특징

< 실시예 3>

간암 세포주에서 TCIRG1 결함에 따른 종양 억제효과 분석

나아가 본 발명자들은 간 종양 형성에서 TCIRG1이 미치는 기능을 더 확인하기 위해, RNA 간섭을 통해 TCIRG1을 녹다운시킨 상태에서 세포생존율, 세포증식, BrdU 염색 및 콜로니 형성에 대한 실험을 수행하였다. TCIRG1이 과발현되는 간암 세포주의 선택을 위해 세포에 내재된 TCIRG1의 발현수준을 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿을 통해 14개의 다른 간 세포주를 대상으로 분석하였는데, 상기 간 세포주에는 MIHA 및 THLE3이 불멸화된 정상 간 세포주도 포함하도록 하였다.

분석 결과, 인간 간암 세포주인 Hep3B, HepG2, Huh7, PLC/PRF/5, SK-Hep1, SNU354, SNU368, SNU387, SNU398, SNU423, SNU449 및 SNU475에서는 TCIRG1의 발현이 MIHA 세포와 비교하여 과발현되는 것으로 나타났다(도 3a 및 3b 참조).

한편, RNA 간섭을 통해 TCIRG1이 넉다운된 SNU475 및 Huh7 간암 세포주의 경우, 세포 성장 및 증식이 모두 억제되는 것으로 나타났다(도 3c 내지 3f 참조). 간암 세포의 성장 억제는 부분적으로 TCIRG1을 표적화에 따른 세포주기 정지, 세포노화 또는 세포사멸과 같은 세포 성장 조절의 파괴로 유발되는 것일 수 있으며, 본 발명자들은 먼저 TCIRG1의 넉다운에 따른 세포주기 영향을 분석하고자 유세포분석기를 이용하여 분석하였고, 또한 세포 사멸 분석을 위해 TCIRG1 표적 siRNA (siTCIRG1)로 세포주를 형질 감염시킨 후, 아넥신 V-FITC와 PI를 사용하여 분석하였다.

그 결과, TCIRG1이 넉다운된 SNU475 및 Huh7 간암 세포주에서 S 기와 G2 / M 기의 세포수는 감소한 것으로 나타났고 G1 기의 세포 수가 현저히 증가한 것으로 나타났고(도 3g 참조), FACS 분석 결과 TCIRG1 siRNA로 형질감염된 SNU475 세포에서는 음성 대조군 siRNA (N.C)으로 형질감염된 세포와 비교하여 세포 사멸이 현저하게 유도되는 것으로 나타났다(도 3h 참조). 또한, TCIRG1 siRNA로 형질감염된 Huh7 세포에서 자가포식에 의한 세포 사멸(왼쪽 상단 부분의 점으로 표시된 플롯)이 유도되는 것으로 나타났다. 또한, 동일한 세포에 대해 자가포식의 특이적 억제제인 3- 메틸 아데닌을 처리한 경우, 자가포식(autophagic)으로 인한 세포 사멸이 억제되는 것으로 나타났다(도 3i 참조). 이러한 결과는 TCIRG1의 과발현이 간암 발생 과정에서 자가포식에 의한 세포사멸 억제를 촉진함으로써 간암 발병과 관련되어 있음을 의미한다.

또한, 재발과 연관된 분자 시그널을 가진 GSEA는 LIAO_METASTASIS 유전자가 재발 신호를 유의적으로 많이 내포하고 있다는 것을 보여준다(도 1g 참조). 이에 간암 세포의 악성 종양에서 TCIRG1의 작용을 규명하기 위해 in vitro에서 세포 이동성 및 침윤 분석을 수행하였다.

분석 결과, 변형된 Boyden 챔버 분석은 TCIRG1이 넉다운된 SNU475와 Huh7 세포주 모두 화학유인물질(2 % FBS)에 의한 세포 이동 및 침습이 유의하게 억제됨을 확인할 수 있었다(도4a 및 4b 참조). 또한, 스크래치 치유 분석 결과, TCIRG1이 넉다운 된 세포군이 대조군에 비해 화학유인물질에 의한 간암 세포의 상처 치유 효과가 감소되는 것으로 나타났다(도 4c 참조). TCIRG1의 전이 잠재성을 확인하기 위해 Boyden 챔버 어세이 분석을 ras로 형질전환 된 NIH-3T3 세포를 이용하여 수행하였다. 그 결과, TCIRG1의 넉다운은 ras로 형질전환된 NIH-3T3 세포의 화학유인물질로 인한 세포 이동 및 침윤이 유의하게 억제되는 것으로 나타났다(도 4d 및 4e 참조).

나아가 본 발명자들은 EMT에 대한 TCIRG1의 조절 효과를 확인하기 위해, 간암 세포를 대상으로 EMT 조절 단백질들의 발현 현상을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 그 결과, E-cadherin은 TCIRG1이 넉다운된 SNU475 및 Huh7 세포주에서 현저하게 증가하는 것으로 나타난 반면, N-cadherin, Fibronectin, Vimentin, Snail 및 Slug는 동일한 세포에서 감소한 것으로 나타났다(도 4f 참조).

또한, 2개의 큰 HCC 환자 코호트에서의 TCIRG1 발현 분석은 매칭되는 세트(GSE39791 및 GSE77314)의 유전자 발현양상을 보였고, E- cadherin(CDH1)의 발현은 비 종양 조직에 비해 간세포 암종에서 유의하게 감소하였고, TCIRG1과 E- cadherin은 동일한 데이터 세트에서 역관계성을 보이는 것으로 나타났다(도 4g 참조).

마지막으로, 생체 외 실험 전이 분석은 micro-CT 영상 분석과 폐결핵 계수 분석 모두에 의해, TCIRG1 넉다운은 ras로 형질 전환된 NIH-3T3 세포의 전이 잠재력을 지연 또는 감소시킨다는 것을 알 수 있었다(도 5a 및 5b 참조).

이상의 실험결과를 통해, 본 발명자들은 TCIRG1을 간세포암의 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커로서의 사용 가능성을 확인하였고, 나아가 간세포암의 수술 후 재발 또는 전이 여부를 예측할 수 있는 마커로도 사용 가능함을 알 수 있었으며, TCIRG1이 과발현된 군에서는 수술 후 무병 생존율이 현저하게 낮다는 것으로 통해, 간세포암의 재발 및 전이를 예방 또는 억제할 수 있는 치료제로서 TCIRG1의 억제제를 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

간암의 발병, 진행 및 재발을 예측할 수 있는 TCIRG1 발현수준에 대한 컷오프 값 제시

나아가 본 발명자들은 상기와 같은 실험결과를 통해, TCIRG1의 간세포암 발병시 발현수준이 증가하고, 간 절제 수술 후 간암이 재발된 환자의 조직에서도 TCIRG1의 발현이 증가되어 있음을 확인함으로써 TCIRG1을 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었고, 나아가 간암의 진행, 예후 및 재발 가능성을 예측하는 마커로 사용할 수 있음을 알았다. 이에 TCIRG1의 발현수준을 정량화하여 간암에 대한 상태 정보를 제공할 수 있는 컷오프(cut off) 값을 도출하였다.

<4-1> 간암 발병 여부를 예측할 수 있는 TCIRG1의 컷오프 값

앞서 실험에서 수행한 2개의 대규모 간암 환자의 코호트에서 간세포암 환자군과 비간암 환자군에 대한 ROC 분석결과를 확인하였다(도 2c 참조). 또한, TCGA_LIHC 에서는 환자의 비종양조직 (Non tumor, n=50)과 진행성 간세포암 (G2,G3,G4, n=301)에 대하여 평가하였을 때, AUC 값이 0.74로 분석되었다. 이에 본 발명자들은 이들 도출 값을 토대로 진행성 간암에 대한 TCIRG1 cut-off 값을 도출하였다. 보다 구체적으로, 바이오마커로써 효능을 평가하기 위하여, 리시버 오퍼레이터 특성(Receiver Operator Characteric, ROC) 커브 및 스캐터 플롯을 분석하였다. ROC는 민감도와 특이도가 서로 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것인데, ROC 아래의 면적에 해당하는 AUC(Area Uder Curve) 값이 클수록 우수한 진단 방법이라고 할 수 있다. 모든 통계 분석 및 생성된 모든 스캐터 플롯 및 ROC는 Medcalc(MedCalc, Mariakerke, Belgium, version 12.2.1)를 이용하였다.

분석결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 진행성 간암에 대한 TCIRG1 cut-off 값은 11.0112인 것으로 나타났다(컷오프 값:11.0112, log2 RSEM). 따라서 TCIRG1의 발현수준에 대한 정량분석을 통해 컷오프 값이 11.0112인 경우, 진행성 간암으로 판단할 수 있으며, 간암이 전이될 가능성이 높은 것으로 판단할 수 있다.

<4-2> 간암 재발 여부를 예측할 수 있는 TCIRG1의 컷오프 값

상기 실험에서, GSE39791에서는 간 절제술을 받은 동일 환자의 비종양조직 (Non tumor, n=72)과 재발성 간세포암 (Tumor, n=72)에 대하여 평가하였을 때, 대부분의 환자에서 TCIRG1의 발현이 비조양조직에 비해 간세포암 조직에서 더 높은 것을 확인할 수 있었고, ROC 분석 결과 AUC=0.64의 값으로 나타났다. 이에 상기 값을 토대로 cut-off 값을 도출한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, TCIRG1의 cut-off 값은 8.25인 것으로 나타났다(8.25, log2 expression).

따라서 TCIRG1 발현수준에 대한 컷오프 값이 8.25인 경우, 간 절제 후에도 간세포암이 재발될 수 있을 것으로 판단할 수 있다.

<4-3> 간세포암의 진행 단계별 TCIRG1의 컷오프 값

간세포암 단계별(G1, G2, G3, G4) 환자의 암 조직을 입수하여, TCIRG1 발현수준을 정량분석 하였고, 컷 오프 값을 도출하였다.

참고로, 앞서 수행한 실험을 통해 TCGA_LIHC 코호트에서 간암의 병기가 높음에 따라 TCIRG1의 발현이 높은 것을 확인하였다. 각 간세포암 진행 단계별 TCIRG1에 대한 컷오프 값을 분석한 결과, G3(3기 간암) 및 G4(4기 간암)에서의 TCIRG1 발현량의 cut-off값은 11.3794 (log2 RSEM)인 것으로 나타났다(도 6c 참조).

따라서 진행성 간암에서 TCIRG1 발현양에 대한 컷오프 값이 11.3794 인 경우, 말기 간암, 즉, 4기 간암인 것으로 판단할 수 있다.

또한, 간 세포암 진행 단계에 대해 정상-> 조기간암(eHCC) -> 중기간암(avHCC)에 따른 컷 오프 값 분석 결과, 정상과 조기간암(eHCC)에서의 cut-off 값은 6.2821인 것으로 나타났고, 조기간암(eHCC)와 중기간암(avHCC)에서는 cut-off 값이 6.4371인 것으로 나타났다(도 6d 참조).

따라서 이러한 결과를 통해 TCIRG1 발현양에 대한 컷오프 값이 6.2821인 경우에는 조기 간암으로 판단할 수 있고, 6.4371인 경우에는 중기간암으로 판단할 수 있다.

<4-4> 간 절제술 후, 예후 진단을 위한 TCIRG1의 컷오프 값

마지막으로 TCIRG1의 발현수준 분석을 통해, 간 절제술 후의 환자에 대한 예후를 예측할 수 있는지 확인하기 위해 간 절제술 후 간세포암이 재발된 종양조직 및 재발되지 않은 조직에서의 TCIRG1의 발현수준을 측정하였고, 컷오프 값을 도출하였다.

그 결과, 도 6e에 나타낸 바와 같이, 간절제술 후 간암이 재발된 암 조직에서의 TCIRG1 발현수준은 간암이 재발되지 않은 조직에 비해 유의하게 증가되어 있는 것으로 확인되었고, 재발된 조직과 재발되지 않은 조직의 TCIRG1 발현양 컷오프 값은 2.5687인 것으로 나타났다.

따라서, 간 절제 수술 후, 환자로부터 수득한 조직에 대한 TCIRG1의 컷오프 값이 2.5687인 경우에는 간암 재발 가능성이 높고 예후가 좋지 못할 것으로 판단할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> TCIRG1 biomarker for diagnosing recurrent and prognosis of liver cancer and use thereof <130> PN1706-208 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2727 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCIRG1 cDNA sequence <400> 1 cgcctgcccg gaaaggagtg agcggcgcct agtcccgggc tggcgggagt gcagttctga 60 gtcccgcccg gcgtgcgcgg agcggggcag ccagcagcgg aggcgcggcg cgcagcacac 120 ccggggacca tgggctccat gttccggagc gaggaggtgg ccctggtcca gctctttctg 180 cccacagcgg ctgcctacac ctgcgtgagt cggctgggcg agctgggcct cgtggagttc 240 agagacctca acgcctcggt gagcgccttc cagagacgct ttgtggttga tgttcggcgc 300 tgtgaggagc tggagaagac cttcaccttc ctgcaggagg aggtgcggcg ggctgggctg 360 gtcctgcccc cgccaaaggg gaggctgccg gcacccccac cccgggacct gctgcgcatc 420 caggaggaga cggagcgcct ggcccaggag ctgcgggatg tgcggggcaa ccagcaggcc 480 ctgcgggccc agctgcacca gctgcagctc cacgccgccg tgctacgcca gggccatgaa 540 cctcagctgg cagccgccca cacagatggg gcctcagaga ggacgcccct 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tcccctccga ggtgctcatg caccaggcca 2040 tccacaccat cgagttctgc ctgggctgcg tctccaacac cgcctcctac ctgcgcctgt 2100 gggccctgag cctggcccac gcccagctgt ccgaggttct gtgggccatg gtgatgcgca 2160 taggcctggg cctgggccgg gaggtgggcg tggcggctgt ggtgctggtc cccatctttg 2220 ccgcctttgc cgtgatgacc gtggctatcc tgctggtgat ggagggactc tcagccttcc 2280 tgcacgccct gcggctgcac tgggtggaat tccagaacaa gttctactca ggcacgggct 2340 acaagctgag tcccttcacc ttcgctgcca cagatgacta gggcccactg caggtcctgc 2400 cagacctcct tcctgacctc tgaggcagga gaggaataaa gacggtccgc cctggcagtg 2460 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2486 <210> 3 <211> 830 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TCIRG1 amino acid <400> 3 Met Gly Ser Met Phe Arg Ser Glu Glu Val Ala Leu Val Gln Leu Phe 1 5 10 15 Leu Pro Thr Ala Ala Ala Tyr Thr Cys Val Ser Arg Leu Gly Glu Leu 20 25 30 Gly Leu Val Glu Phe Arg Asp Leu Asn Ala Ser Val Ser Ala Phe Gln 35 40 45 Arg Arg Phe Val Val Asp Val Arg Arg Cys Glu Glu Leu Glu Lys Thr 50 55 60 Phe Thr Phe Leu Gln Glu Glu Val Arg Arg Ala Gly Leu Val Leu Pro 65 70 75 80 Pro Pro Lys Gly Arg Leu Pro Ala Pro Pro Pro Arg Asp Leu Leu Arg 85 90 95 Ile Gln Glu Glu Thr Glu Arg Leu Ala Gln Glu Leu Arg Asp Val Arg 100 105 110 Gly Asn Gln Gln Ala Leu Arg Ala Gln Leu His Gln Leu Gln Leu His 115 120 125 Ala Ala Val Leu Arg Gln Gly His Glu Pro Gln Leu Ala Ala Ala His 130 135 140 Thr Asp Gly Ala Ser Glu Arg Thr Pro Leu Leu Gln Ala Pro Gly Gly 145 150 155 160 Pro His Gln Asp Leu Arg Val Asn Phe Val Ala Gly Ala Val Glu Pro 165 170 175 His Lys Ala Pro Ala Leu Glu Arg Leu Leu Trp Arg Ala Cys Arg Gly 180 185 190 Phe Leu Ile Ala Ser Phe Arg Glu Leu Glu Gln Pro Leu Glu His Pro 195 200 205 Val Thr Gly Glu Pro Ala Thr Trp Met Thr Phe Leu Ile Ser Tyr Trp 210 215 220 Gly Glu Gln Ile Gly Gln Lys Ile Arg Lys Ile Thr Asp Cys Phe His 225 230 235 240 Cys His Val Phe Pro Phe Leu Gln Gln Glu Glu Ala Arg Leu Gly Ala 245 250 255 Leu Gln Gln Leu Gln Gln Gln Ser Gln Glu Leu Gln Glu Val Leu Gly 260 265 270 Glu Thr Glu Arg Phe Leu Ser Gln Val Leu Gly Arg Val Leu Gln Leu 275 280 285 Leu Pro Pro Gly Gln Val Gln Val His Lys Met Lys Ala Val Tyr Leu 290 295 300 Ala Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Thr Thr His Lys Cys Leu Ile Ala 305 310 315 320 Glu Ala Trp Cys Ser Val Arg Asp Leu Pro Ala Leu Gln Glu Ala Leu 325 330 335 Arg Asp Ser Ser Met Glu Glu Gly Val Ser Ala Val Ala His Arg Ile 340 345 350 Pro Cys Arg Asp Met Pro Pro Thr Leu Ile Arg Thr Asn Arg Phe Thr 355 360 365 Ala Ser Phe Gln Gly Ile Val Asp Ala Tyr Gly Val Gly Arg Tyr Gln 370 375 380 Glu Val Asn Pro Ala Pro Tyr Thr Ile Ile Thr Phe Pro Phe Leu Phe 385 390 395 400 Ala Val Met Phe Gly Asp Val Gly His Gly Leu Leu Met Phe Leu Phe 405 410 415 Ala Leu Ala Met Val Leu Ala Glu Asn Arg Pro Ala Val Lys Ala Ala 420 425 430 Gln Asn Glu Ile Trp Gln Thr Phe Phe Arg Gly Arg Tyr Leu Leu Leu 435 440 445 Leu Met Gly Leu Phe Ser Ile Tyr Thr Gly Phe Ile Tyr Asn Glu Cys 450 455 460 Phe Ser Arg Ala Thr Ser Ile Phe Pro Ser Gly Trp Ser Val Ala Ala 465 470 475 480 Met Ala Asn Gln Ser Gly Trp Ser Asp Ala Phe Leu Ala Gln His Thr 485 490 495 Met Leu Thr Leu Asp Pro Asn Val Thr Gly Val Phe Leu Gly Pro Tyr 500 505 510 Pro Phe Gly Ile Asp Pro Ile Trp Ser Leu Ala Ala Asn His Leu Ser 515 520 525 Phe Leu Asn Ser Phe Lys Met Lys Met Ser Val Ile Leu Gly Val Val 530 535 540 His Met Ala Phe Gly Val Val Leu Gly Val Phe Asn His Val His Phe 545 550 555 560 Gly Gln Arg His Arg Leu Leu Leu Glu Thr Leu Pro Glu Leu Thr Phe 565 570 575 Leu Leu Gly Leu Phe Gly Tyr Leu Val Phe Leu Val Ile Tyr Lys Trp 580 585 590 Leu Cys Val Trp Ala Ala Arg Ala Ala Ser Ala Pro Ser Ile Leu Ile 595 600 605 His Phe Ile Asn Met Phe Leu Phe Ser His Ser Pro Ser Asn Arg Leu 610 615 620 Leu Tyr Pro Arg Gln Glu Val Val Gln Ala Thr Leu Val Val Leu Ala 625 630 635 640 Leu Ala Met Val Pro Ile Leu Leu Leu Gly Thr Pro Leu His Leu Leu 645 650 655 His Arg His Arg Arg Arg Leu Arg Arg Arg Pro Ala Asp Arg Gln Glu 660 665 670 Glu Asn Lys Ala Gly Leu Leu Asp Leu Pro Asp Ala Ser Val Asn Gly 675 680 685 Trp Ser Ser Asp Glu Glu Lys Ala Gly Gly Leu Asp Asp Glu Glu Glu 690 695 700 Ala Glu Leu Val Pro Ser Glu Val Leu Met His Gln Ala Ile His Thr 705 710 715 720 Ile Glu Phe Cys Leu Gly Cys Val Ser Asn Thr Ala Ser Tyr Leu Arg 725 730 735 Leu Trp Ala Leu Ser Leu Ala His Ala Gln Leu Ser Glu Val Leu Trp 740 745 750 Ala Met Val Met Arg Ile Gly Leu Gly Leu Gly Arg Glu Val Gly Val 755 760 765 Ala Ala Val Val Leu Val Pro Ile Phe Ala Ala Phe Ala Val Met Thr 770 775 780 Val Ala Ile Leu Leu Val Met Glu Gly Leu Ser Ala Phe Leu His Ala 785 790 795 800 Leu Arg Leu His Trp Val Glu Phe Gln Asn Lys Phe Tyr Ser Gly Thr 805 810 815 Gly Tyr Lys Leu Ser Pro Phe Thr Phe Ala Ala Thr Asp Asp 820 825 830 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TCIRG1 siRNA <400> 4 caccuucgcu gccacagau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA <400> 5 ccuacgccac caauuucgu 19

Claims (16)

1. TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 TCIRG1 유전자는 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 것이고, TCIRG1 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 제제는 TCIRG1에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머 또는 항체인 것을 특징으로 하는, 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 측정은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소 연쇄반응, 실시간 중합효소 연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 이용법, 노던 블랏, 웨스턴 블랏, ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), 방사선 면역분석법, 면역 확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석법(Mass spectrometry) 및 단백질 마이크로어레이 이용법 중에서 선택되는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 간암 진단 또는 예후 예측은 간암의 진행, 재발, 전이 및 예후 평가를 포함하는 것을 특징으로 하는, 간암 진단 또는 예후 예측용 조성물.
6. 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 간암 진단 또는 예후 진단용 키트.
7. 제6항에 있어서,
   상기 키트는 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 간암 진단 또는 예후 진단용 키트.
8. 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자의 mRNA 또는 TCIRG1 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및
   상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계를 포함하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 시료는 조직, 전혈, 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 측정된 TCIRG1의 발현수준을 대조군 시료의 해당 유전자의 발현수준과 비교하는 단계는 표준 또는 컷오프(cut-off) 값에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법.
11. 제8항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 TCIRG1의 발현수준이 대조군 시료에서의 발현수준 보다 증가한 경우, 간암의 재발, 종양성장 또는 전이 가능성이 높아 예후가 좋지 않을 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법.
12. 제8항에 있어서,
    상기 제공방법은 간암의 전이 가능성 판단에 대한 컷오프 값이 11.0112인 것을 특징으로 하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법.
13. 제8항에 있어서,
    상기 제공 방법은 조기 간암 판단에 대한 컷 오프 값이 6.2821이고, 중기 간암 판단에 대한 컷 오프 값이 6.4371이며, 말기 간암 판단에 대한 컷 오프 값이 11.3794인 것을 특징으로 하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법.
14. 제8항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 간암 재발 가능성 판단에 대한 컷 오프 값은 2.5687인 것을 특징으로 하는, 간암 진단을 위한 정보 제공방법.
15. TCIRG1(T-Cell Immune Regulator 1) 유전자에 상보적으로 결합하는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 siRNA를 유효성분으로 포함하는, 간암의 전이 및 재발 억제용 약학적 조성물.
    
16. 삭제

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