WO2013119058A1 - 골 융합 향상 및 항균 효능을 갖는 항생제와 골형성 촉진 물질 방출형 임플란트 또는 스캐폴드 및 그 제조방법 - Google Patents

골 융합 향상 및 항균 효능을 갖는 항생제와 골형성 촉진 물질 방출형 임플란트 또는 스캐폴드 및 그 제조방법 Download PDF

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scaffold
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titanium
heparin
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송해룡
김학준
박경순
윤영필
김성은
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고려대학교 산학협력단
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    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a functional implant or scaffold capable of preventing bacterial infection occurring after orthopedic or dental implant or scaffold implantation and at the same time promoting induction of bone fusion and bone formation, and a method of manufacturing the same.
  • Implants or scaffolds are implantable medical devices that are embedded in vivo and exert their desired function. Therefore, the implant or scaffold must have mechanical strength to withstand repeated loads and instantaneous pressures, as well as satisfy conditions such as biocompatibility and chemical compatibility.
  • the most commonly used materials of implant or scaffold materials are titanium and some titanium alloys which are highly biocompatible. Titanium has a low specific gravity and is relatively lighter than other metallic materials. However, titanium can be improved in strength by the use of alloys with other metals or by proper treatment. It has a very large corrosion resistance. In addition, since there is an advantage that the bone (osteointegration) occurs when embedded in the bone is currently the most widely used as the material of the implant or scaffold.
  • Tita ⁇ and its alloys having such excellent mechanical properties, chemical stability, biocompatibility, and the like are widely used as implants or scaffolds used in orthopedic and dental fields.
  • a poor bond between the implant or scaffold and bone tissue will loosen the implant or scaffold and eventually lead to the implantation failure of the implant or scaffold.
  • Various methods for surface modification and functionalization have been developed to control bone fusion between the titanium surface and bone tissue by controlling thorax phosphate or hydroxyapatite coatings, biomolecules, proteins and surface topography.
  • a bone morphogenic protein-2 (BMP-2) delivery system using collagen gel, sponge, fibrogen, chitosan, and the like has been developed.
  • BMP-2 bone morphogenic protein-2
  • Typical titanium implants are susceptible to infection with bacteria from the patient's own skin or mucous membranes during insertion. When bacteria grow on the implant surface, the bacterial cells form a thick biofilm, which is a host defense. It acts as a major barrier to the diffusion and penetration of the mechanisms and antibiotics administered. These bacterial infections can cause the failure of the implant and can exacerbate the patient's disease with the additional cost of implant removal.
  • the drug release rate is controlled to release BMP-2 slowly by chemically bonding heparin, a negatively charged linear polysaccharide, to the titanium surface.
  • heparin a negatively charged linear polysaccharide
  • 0068240 discloses a dental implant that can be applied to a recombinant bone formation promoting protein and buried in the jaw bone to allow adult undifferentiated cells around the treatment site to rapidly differentiate into osteocytes, resulting in osteoinductive healing and shortening the healing period.
  • the technique has a problem that can be attached and infected with bacteria on the surface of the implant. In order to solve this problem, actual clinical trials require patients to take antibiotics to prevent bacterial attachment and infection.
  • Wilson Wang group (Biomacromolecules, 2009, 10 (6) 1603—1611; Tissue Eng Part A, 2009, 15 (2), 417-426; Biomaterials, 1008,) to prevent bacterial infections and improve bone fusion efficacy. 29 (10), 1412-1421; J Biomed Mater Res A, 2008, 86 (4), 85-872), the development of titanium implants in which chitosan and its derivatives, dextran, hyaluronic acid, peptides and the like are bonded to the surface Has been.
  • titanium implants significantly increased osteoblastic cell adhesion, proliferation and alkaline phosphatase activity, and at the same time reduced the adhesion of bacteria such as Staphylococcus aureus CSapAWococc s aureus).
  • bacteria such as Staphylococcus aureus CSapAWococc s aureus.
  • the present inventors prevent bacterial attachment and infection that may occur after implantation of an orthopedic or dental implant or scaffold, and do not need to take antibiotics, and at the same time have fusion and bone formation efficacy with bone tissue.
  • the invention led to the development of functional implants or scaffolds that allow both antibiotics and osteogenic compounds to sustained release at the same time. Detailed description of the invention
  • "Crab is used to modify the surface of an implant or scaffold with a polymer to functionalize (activate) the surface of the implant or scaffold and to activate the polymer through a physical bond.
  • Silver mold Immobilizes antibiotics and bone formation promoting substances on the surface of the capfold to make them antibacterial
  • the present invention is an implant or scaffold whose surface is modified by using a complex of a compound containing a polymer-catechol functional group, wherein the implant or scaffold comprises one or two or more selected from antibiotics and osteogenic compounds.
  • An implant or scaffold is provided.
  • the present invention (a) preparing a complex of a compound containing a polymer-catechol functional group
  • step (b) modifying the surface of the implant or scaffold using a complex of a polymer comprising a polymer-catechol functional group prepared in step (a) to activate the surface;
  • step (c) the surface-activated implant or scaffold prepared in step (b) is immersed in a solution containing antibiotics, and then stirred at 20-25 ° C. for 4 to 24 hours, and the antibiotic is implanted or scaffolded Immobilizing the surface;
  • step (d) the implant or scaffold immobilized on the surface of the antibiotic prepared in step (c) is immersed in a solution containing a bone formation promoting substance, and then stirred at 20 to 25 ° C for 4 to 24 hours. And immobilizing the antibiotic / bone formation promoting substance on the implant or scaffold surface.
  • the implant or scaffold of the present invention contains antibiotics and bone formation promoting substances
  • bacterial attachment may occur during the implantation or scaffold or after transplantation because antibiotics are released from the implant or scaffold for a long time.
  • the rate of bacterial or scaffold ear failure by bacteria can be significantly reduced.
  • the substance that promotes bone fusion and bone formation (bone formation promoting substance) is continuously released for a long time, it can improve bone formation by promoting adhesion between implant or scaffold and bone tissue and differentiation of osteoblasts.
  • the duration of treatment after implant or scaffold transplantation can be shortened and the economic burden can be reduced because the success rate of implant or scaffold transplantation can be increased.
  • FIG. 1 illustrates a method of sequentially immobilizing the antibiotic gentamycin and bone growth promoting factor BMP-2 on a titanium metal surface of a heparin-modified implant.
  • Figure 2 is a scanning electron micrograph of the implant titanium surface of Comparative Examples 1 to 4 and Example 1, respectively (a) titanium (Comparative Example 1), (b) heparin-titanium (Comparative Example 2), (c) Genta Heparin-titanium fixed with mycin (Comparative Example 3), (d) Heparin-titanium fixed with BMP-2 (Comparative Example 4), (e) Heparin titanium fixed with gentamicin / BMP-2 (Example 1) The scanning electron micrograph of the surface of is shown.
  • FIG. Example 3 shows titanium (Comparative Example 1) and activated titanium (Heparin-titanium (Comparative Example 2), heparin-titanium (Comparative Example 3) fixed with gentamicin, heparin-titanium fixed with BMP-2 (FIG. Example 4) shows the results of chemical element analysis of the surface using X-ray photoelectron spectroscopy of heparin titanium (Example 1) fixed with gentamicin / BMP-2.
  • FIG. 4 is a graph showing the drug release of gentamicin or BMP-2 from the activated titanium of Comparative Examples 2 to 4 and Example 1 according to Experimental Example 2 of the present invention
  • Figure 4a is fixed with gentamicin Shows the drug release behavior of gentamicin from heparin-titanium (Comparative Example 3, GSHep-Ti) and gentamicin / BMP-2 fixed heparin titanium (Example 1, GS / BMP-2 Hep-Ti)
  • 4B shows heparin-titanium fixed with BMP-2 (Comparative Example 4, ⁇ -2 / Hep-Ti) and heparin titanium fixed with gentamycin / BMP-2 (Example 1, GS / BMP-2 Hep-Ti Drug release behavior of BMP-2 is shown.
  • Example 5 Comparative Example 1 according to Experiment 3 of the present invention (Pristine Ti) and functionalized titanium (gentamicin-fixed heparin-titanium (Comparative Example 3, GSHep-Ti), BMP-2 is fixed heparin-titanium Staphylococcus aureus C3 ⁇ 43 ⁇ 4D / 7y / ococc s of (Comparative Example 4, ⁇ -2 / Hep-Ti) and gentamicin / BMP-2-immobilized heparin titanium (Example 1, GS / BMP-2 Hep-Ti) aureus) shows the results of antimicrobial effects on bacterial cells.
  • Example 6 is Comparative Example 1 (Pristine Ti) according to Experimental Example 4 of the present invention and functionalized titanium (haeparin-titanium (Comparative Example 2, Heparinized Ti), gentamicin-fixed heparin-titanium (Comparative Example 3, GSHep -Ti), heparin-titanium fixed with BMP-2 (Comparative Example 4, BMP-2 / Hep-Ti) and heparin titanium fixed with gentamicin / BMP-2 (Example 1, GS / BMP-2 Hep- Ti)) shows cytotoxicity results on osteoblasts.
  • functionalized titanium haeparin-titanium (Comparative Example 2, Heparinized Ti), gentamicin-fixed heparin-titanium (Comparative Example 3, GSHep -Ti), heparin-titanium fixed with BMP-2 (Comparative Example 4, BMP-2 / Hep-Ti) and heparin titanium fixed with gent
  • Example 7 is Comparative Example 1 (Pristine Ti) according to Experimental Example 5 of the present invention and functionalized titanium (heparin-titanium (Comparative Example 2, Heparnized Ti), gentamicin-immobilized heparin-titanium (Comparative Example 3, GSHep- Ti), heparin-titanium fixed with BMP-2 (Comparative Example 4, BMP-2 / Hep-Ti) and heparin titanium fixed with gentamicin / BMP-2 (Example 1, GS / BMP-2 Hep-Ti Live / Dead analysis of osteoblasts is shown.
  • Example 8 is Comparative Example KPristine Ti according to Experimental Example 6 of the present invention and functionalized titanium (heparin-titanium (Comparative Example 2, Heparnized Ti), gentamicin-immobilized heparin-titanium (Comparative Example 3, GSHep-Ti)).
  • Heparin-titanium fixed with BMP-2 Comparative Example 4, BMP-2 / Hep-Ti
  • heparin titanium fixed with gentamycin / BMP-2 Example 1, GS / BMP-2 Hep—Ti
  • the results of the cell proliferation after culturing osteoblasts for 1 day, 3 days and 7 days are shown.
  • Example 9 is Comparative Example 1 according to Experimental Example 7 of the present invention (Pristine Ti) and functionalized titanium (heparin-titanium (Comparative Example 2, Heparnized Ti), gentamicin-fixed heparin-titanium (Comparative Example 3, GSHep-Ti), heparin-titanium fixed with BMP-2 (Comparative Example 4, BMP-2 / Hep-Ti) and heparin titanium fixed with gentamicin / BMP-2 (Example 1, GS / BMP-2 Hep -Ti)) shows the results of alkaline phosphatase activity after culturing osteoblasts for 7 days, 14 days and 21 days,
  • Example 10 is Comparative Example KPristine Ti according to Experimental Example 7 of the present invention and functionalized titanium (heparin-titanium (Comparative Example 2, Heparnized Ti), gentamicin-immobilized heparin-titanium (Comparative Example 3, GSHep-Ti) ), Heparin-titanium fixed with BMP-2 (Comparative Example 4, BMP-2 / Hep-Ti) and heparin titanium fixed with gentamicin / BMP-2 (Example 1, GS / BMP-2 Hep-Ti) The results for calcium deposition after 21 days of incubation of osteoblasts are shown in Fig. 6).
  • Figure 11 shows (a) PCL / PLGA scaffold surface, (b) BMP-2 loaded heparin PCL / PLGA scaffold surface, and (c) BMP-2 loaded heparin—dopamine PCL / PLGA scaffold surface of Example 1 The results were observed with an electron microscope.
  • FIG. 12 shows the respective scans for evaluating cytotoxicity of osteoblasts of PCL / PLGA scaffolds, BMP-2 loaded heparin-PCL / PLGA scaffolds, BMP-2 loaded heparin-dopamine-PCL / PLGA scaffolds. The result was measured by absorbance at 450 nm after fold the cells in the cell culture medium.
  • FIG. 13 shows PCL / PLGA scaffolds, BMP-2 loaded heparin-PCL / PLGA scaffolds, BMP-2 loaded heparin-dopamine—PCL / PLGA scaffolds to assess cell proliferation on osteoblasts. 10 5 osteoblasts were placed in each scaffold and cultured for 1 day, 3 days, and 7 days, and then absorbance was measured at 450 nm.
  • Fig. 14 shows the result of measuring alkaline phosphatase activity, which is an early differentiation marker of osteoblasts of PCL / PLGA scaffold, BMP-2 loaded heparin-PCL / PLGA scaffold, BMP-2 loaded heparin-dopamine® PCL / PLGA scaffold. .
  • Fig. 15 shows the results of measurement of calcium deposition, a late differentiation marker of osteoblasts, using the PCL / PLGA scaffold, the BMP-2 loaded heparin-PCL / PLGA scaffold, and the BMP-2 loaded heparin-dopamine® PCL / PLGA scaffold.
  • FIG. 16 shows rat bone tibia for the bone formation ability of PCL / PLGA scaffold, BMP-2 loaded heparin-PCL / PLGA scaffold, BMP-2 loaded heparin-dopamine-PCL / PLGA scaffold.
  • H & E hematoxylin and eosin
  • MT Masson's trichrome
  • FIG. 17 shows the rat tibia in order to determine osteogenic capacity for the PCL / PLGA scaffold, BMP-2 loaded heparin-PCL / PLGA scaffold, BMP-2 loaded heparin-dopamine-PCL / PLGA scaffold.
  • X-ray analysis, CT analysis and histomorphologic analysis of each scaffold implanted in 8 mm bone defects were performed. Best Mode for Carrying Out the Invention Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
  • the present invention is an implant or scaffold whose surface is modified by using a complex of a compound containing a polymer-eucatechol functional group, wherein the implant or scaffold is one or two or more selected from antibiotics and bone promoting compounds
  • An implant or scaffold is provided.
  • the present invention provides an antibiotic and / or bone fusion and bone formation that can modify the surface of the implant or scaffold through strong covalent or non-covalent bonds of the excellent biocompatibility polymer, and inhibit bacterial adhesion and infection
  • the functional implant or scaffold which can release the antibiotic and / or the bone formation promoting substance simultaneously in a sustained release form is provided.
  • the surface of the implant or scaffold may be made of titanium and some titanium alloys excellent in biocompatibility.
  • the surface of the implant or scaffold is polycaprolactone (PCL); Polylactic acids (PLA), polyglycolic acid, or copolymers thereof, PLGA; One or two or more biodegradable plastics selected from the group consisting of polyhydroxybutyrate-co-valerate (PHBV), polyvinyl alcohol (PVA), polybutylene succinate (PBS), and polypropylene glycol acid (PG) It may consist of a composition.
  • the polymer that can be used to modify the surface of the implant or scaffold is a biocompatible polymer, Heparin (Heparin), Heparan sulfate, Hyaluronic acid (Hyaluronic acid), Alginate (Alginate), Polyaspartic acid [Poly ( aspartic acid), polyacrylic acid, polyglutamic acid, carboxymethyl cellulose, gelatin, collagen; chitosan; Chitosan and its derivatives, glycol chitosan, poly-L-lysine, polyethyleneimine, and dendrimers having functional groups of amine groups at their ends. It is preferably one or two or more selected, but is not limited thereto.
  • the dendrimer having a functional group of an amine group at the end is composed of repeating units (generations) radially bonded from the center, and the generation number of the dendrimers is preferably 1 to 5.
  • mussels having mussels attached to the organic and organic substrates of virtually all kinds are used in the present invention.
  • Adhesive properties were used.
  • the strong adhesion properties of mussels are believed to be due to the amino acids of 3,4-dihydroxy- L-phenylalanine (3,4_dihydroxy- L-phenylalanine, D0PA) and lysine amino acids found near the plaque-substrate interface. .
  • the DOPA not only participates in reactions leading to the solidification of the adhesive material, but also forms strong covalent or non-covalent bonds with the substrate.
  • ortho-dihydroxyphenyl called catechol in the DOPA structural formula plays an important role in forming strong covalent or non-covalent bonds with the substrate. Therefore, in the present invention, a compound containing a catechol functional group was used to bind the biocompatible polymer to the implant or scaffold surface.
  • the compound containing the catechol functional group is 3,4-dihydroxyper 1-ylalanine (L-3,4-dihydroxyphenylalanine), dopamine (Dopamine), 3,4-dihydroxy bezylamine (3,4-dihydroxybenzylamine ),
  • Norepinephrine 3,4-dihydroxy benzaldehyde (3,4, -dihydroxybenzaldehyde), 3,4-dihydroxybenzoic acid (3,4_dihydroxybenzoic acid), caffeic acid, 3 It is preferably, but not limited to, one or more compounds selected from the group consisting of, 4-dihydroxy-phenylacetic acid (3,4-Dihydroxyphenylacetic acid).
  • a complex of a compound comprising a polymer-catechol which binds the polymer to the surface of an implant or scaffold using a compound containing a catechol functional group, activates or functionalizes the surface of the implant or scaffold, It can be prepared by using a crosslinker in the compound containing and catechol.
  • the complex of the compound containing the polymer-catechol functional group may be a functional group of an amine group or a carboxy group of the polymer;
  • It is preferably formed by a chemically bondable combination with any one functional group selected from the group consisting of amine groups, carboxy groups or aldehyde functional groups of a compound comprising a catechol functional group, and the polymer- Complexes of compounds containing catechol functionalities can be used to modify the surface of the implant or scaffold.
  • the complex of the compound containing phase 7 polymer- ⁇ techol is prepared by the following combination.
  • heparin, heparan sulfate, hyaluronic acid, alginate, and polyaspartic acid which are polymers having functional groups of the carboxy group ]
  • Poly (acrylic acid), Polyglutamic acid, Carboxymethyl cellulose, Gelatin, Collagen have functional groups of amine group 3,4-dihydroxyphenylalanine, dopamine, 3,4-dihydroxybenzylamine, norepine, which are catechol-containing compounds
  • Compound combinations containing polymer-catechol can be prepared by various combinations with norepinephirine.
  • gelatin, collagen, chitosan and derivatives thereof, glycol chitosan, poly-L-lysine, polymers having functional groups of amine groups, Polyethyleneimine and dendrimer are 3,4—dihydroxybenzaldehyde, 3,4—dihydroxy, which are catechol-containing compounds with carboxyl or aldehyde functional groups.
  • Compound complex containing high molecular weight catechol through various combinations with benzoic acid (3,4-dihydroxybenzoic acid), caffeic acid, and 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid (3,4_Dihydroxyphenylacetic acid) Can manufacture have.
  • Table 1 below provides examples of polymer-catechol-containing complexes that can be obtained through various superpositions of polymers and catechol-containing compounds.
  • the weight average molecular weight of the polymer is preferably 1,800 to 300,000.
  • the composite of the compound containing the polymer ⁇ catechol functional group is preferably coupled to 3 to 25 parts by weight of the compound containing the catechol functional group with respect to 1 part by weight of the polymer, but is not limited thereto.
  • a catechol functional group can easily undergo oxidation reaction.
  • Preferred conditions are preferred, and the pH of the solution is preferably 7-12. It is possible to use a pH buffer such as Tris buffer (Pris), phosphate buffer (PBS) to maintain the pH of the solution as described above.
  • a pH buffer such as Tris buffer (Pris), phosphate buffer (PBS) to maintain the pH of the solution as described above.
  • Antibiotics that can be immobilized or mounted on the surface of a surface-activated or functionalized implant or scaffold using a compound complex containing a polymer-catechol functional group are sisomycin, ribostomycin, and vancomycin. ), Tobramycin, Aztreonam Gentamicin, Cefotiam, Ceftriaxone, Netilmicin, Ciprofloxacin, Cindamycin ) And one or two species selected from the group consisting of Cefazolin, and more preferably carboxylic acid, amine, phosphates and sulfate. Any one or more of the functional groups can be used to have a functional group, but is not limited thereto.
  • the concentration of the antibiotic that can be mounted or immobilized on the surface of the polymer-activated implant or scaffold is preferably in the concentration range of lng / ml to 200 mg / ml, and the polymer-activated implant in the antibiotic concentration range.
  • antibiotics may be mounted or immobilized on the surface of the scaffold, but the implant or Active
  • the capacity that can be mounted and immobilized can be determined. If the concentration of the antibiotic is less than lng / ml will not show the antimicrobial effect, if the treatment exceeds 200mg / ml concentration may affect normal cells.
  • the bone formation promoting material that can be immobilized or mounted on the surface of an implant or scaffold surfaced or functionalized using the compound complex containing the polymer-catechol functional group is a bone formation factor or low molecular weight protein. It is possible to use bone formations, and it is more preferable to be a bone formation growth factor, but not to this.
  • bone morphogenetic agents include BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, which are bone morphogenic proteins.
  • BMP-8a, BMP-8b, BMP-10, BMP-15 Platelet derived growth factor (PDGF), transforming growth factor beta (TGF-beta), basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor; bFGF), insulin-like growth factor-KlnsuUn like growth factor 1; IGF-1) and lactoferin (lactoferin) is preferably one or two or more selected from the group consisting of.
  • bisphosphone a low molecular weight bone morphogenetic compound that can be substituted in place of the osteogenic growth factor used to improve bone fusion and bone formation efficacy on the surface of the surface-activated or functionalized implant or scaffold of the present invention
  • PGE2 Prostaglandin E2
  • the dose at which the osteogenic growth factor may be mounted or immobilized on the surface of the polymer-activated implant or scaffold is preferably in the concentration range of lpg / ml to 3 mg / ml, and the concentration of the osteogenic growth factor is lpg. / ml U If it does not show the effect of bone formation, and if it exceeds 3mg / ml side effects that can dissolve luck can occur.
  • the low molecular weight bone morphogenetic compound capable of promoting fusion and bone formation can be mounted or immobilized on the surface of a polymer-activated implant or scaffold in a concentration range of 1 ng / ml to 500 mg / ml. This is preferable.
  • concentration of the osteogenic growth factor is less than lng / ml does not appear bone formation efficacy, when it exceeds 500 mg / ml can cause side effects to dissolve the bone.
  • weakly acidic conditions under which an electrostatic interaction between the polymers and antibiotics, polymers and bone formation promoting substances can easily occur.
  • Phosphorus pH is preferably in the range of 5 to 6.5, and a solution such as water having the above pH range, MES buffer 2_ (N-morpholino) ethanesulfonic acid], Tris, and phosphate buffer (PBS) is used. It is possible to do
  • the implant or scaffold of the present invention is preferably a dental or orthopedic implant or scaffold, for example, the orthopedic implant or scaffold is a hip joint, knee joint, ankle joint, shoulder joint, elbow joint or Prostheses, such as spinal discs and artificial discs, are used. Fixtures such as metal screws, metal plates, and metal tablets used in fracture therapy.
  • the dental implant or scaffold may include a fixed implant or scaffold, a membrane implant or a scaffold.
  • a functional implant or scaffold capable of sustained release of the antibiotic and bone formation promoting substance of the present invention may occur during implantation of the implant or scaffold because antibiotics are released from the implant or scaffold for a long time. It can prevent bacterial attachment and infection, and there is no need to take additional antibiotics after implant or scaffold transplantation.
  • the substances that promote bone fusion and bone formation are continuously released in the long run, adhesion and bone formation between the implant or scaffold and bone tissue may be promoted, thereby shortening the treatment period of the implant or scaffold. It can greatly contribute to the success of fold transplantation.
  • the present invention relates to a method for manufacturing an implant or scaffold
  • step (b) modifying the surface of the implant or scaffold using a complex of the polymer prepared in step (a) containing a compound containing a catechol functional group to activate the surface;
  • step (c) the surface-activated implant or scaffold prepared in step (b) is immersed in a solution containing antibiotics, and then stirred at 20-25 ° C. for 4 to 24 hours, and the antibiotic is implanted or scaffolded on the surface Immobilizing to;
  • step (d) the implant or scaffold immobilized on the surface of the antibiotic prepared in step (c) is immersed in a solution containing a bone formation promoting substance, and then stirred at 20 to 25 ° C for 4 to ⁇ 24 hours. And, immobilizing the antibiotic crab / bone formation promoting material on the implant or scaffold surface.
  • the complex of the compound containing the polymer-catechol functional group of step (a) may be a functional group of an amine group or a carboxy group of a biocompatible polymer
  • It is preferably formed by bonding with any one functional group selected from the group consisting of amine groups, carboxy groups or aldehyde functional groups of the compound comprising a catechol functional group.
  • the method for producing a composite of the polymer material-compound containing a catechol functional group uses the contents described above.
  • Reaction conditions that can easily occur the electrostatic interaction between the polymer of the step (C) and (d) of the method of manufacturing the implant or scaffold and the antibiotic, the polymer and the bone formation promoting material is pH 5 to 6.5 It is preferable that the conditions of the range of, and the solution that can be used at this time is water having the above pH range,
  • MES buffer 2_ N-morpholino ethanesulfonic acid
  • Tris buffer Pris
  • PBS phosphate buffer
  • the antibiotics use the contents described above.
  • the concentration of the antibiotic solution that can be mounted or immobilized on the surface of the polymer-activated implant or scaffold is preferably in the concentration range of lng / ml to 200 mg / ml, and the polymer-activated implant or Antibiotics may be mounted or immobilized on the scaffold surface, but the capacity to be mounted and immobilized may be determined by the size of the implant or scaffold. If the concentration of the antibiotic is less than lng / ml treatment will not show the antibacterial effect, if the treatment exceeds 200mg / ml concentration may affect normal cells
  • the bone formation promoting substance uses the contents described above.
  • the dose at which the osteogenic growth factor can be mounted or immobilized on the surface of the polymer-activated implant or scaffold is preferably in the range of lpg / ml to 3 mg / ml,
  • the low-molecular-weight bone-forming compound capable of promoting fusion and osteomorphism can be mounted or immobilized on a polymer-activated implant or scaffold surface in a concentration range of l ng / ml to 500 mg / ml. desirable.
  • the titanium implant Before modifying the titanium surface of the implant, the titanium implant was immersed in ethane and sonicated for 1 hour and then dried at 50 degrees for about 24 hours. Thereafter, the titanium implant was placed in 10 mM Tris buffer (pH 8.0) in which the heparin-dopamine complex prepared in Preparation Example 1 was dissolved at a concentration of 5 mg / ml, blocked the light, and then stirred overnight.
  • a titanium implant (heparin-titanium implant) whose surface was modified with a heparin-dopamine complex was washed 3-4 times with distilled water, and then dried by pouring nitrogen gas to prepare a titanium implant whose surface was modified with a heparin-dopamine complex. .
  • the gentamicin was dissolved at 50 mg / ml in a titanium implant surface modified with the heparin-dopamine complex. Heparin-fixed in 0.1 M MES buffer (pH 5.6), stirred at 80 ° C at 25 ° C for 15 ⁇ 24 hours, washed 3-4 times with distilled water, and dried at 50 ° C. Titanium implants (gentamicin-heparin-titanium implants) were prepared.
  • a heparin-titanium implant with gentamycin immobilized in ⁇ M MES buffer (pH 5.6) containing BMP-2 at a concentration of 50 ng / ⁇ was stirred overnight. After washing with distilled water 3-4 times, it was dried to obtain a heparin-titanium implant fixed with gentamicin / BMP-2.
  • the titanium implant Prior to modifying the titanium surface of the implant, the titanium implant was immersed in ethanol solution for 1 hour ultrasonic cleaning and then dried at 50 degrees for about 24 hours. After that, the titanium implant was placed in 10 mM Tris buffer (pH 8.0) in which the heparin-dopamine complex prepared in Preparation Example 1 was dissolved at a concentration of 5 mg / ml, and then stirred overnight after blocking light.
  • a titanium implant (heparin-titanium implant) whose surface was modified with a heparin-dopamine complex was washed 3-4 times with distilled water and dried by flowing nitrogen gas to prepare a titanium implant whose surface was modified with a heparin-dopamine complex.
  • Heparin-titanium implants (gentamimycin ⁇ heparin-titanium) in which gentamicin is immobilized in the same manner as in Example 1, except that BMP-2 is immobilized on a titanium implant whose surface is modified with a heparin-dopamine complex. Implants).
  • a heparin-titanium implant (gentamycin ⁇ heparin-titanium implant) with BMP-2 immobilized in the same manner as in Example 1, except that only imgentamicin was immobilized on a titanium implant whose surface was modified with a heparin-dopamine complex. Prepared.
  • each functionalized titanium implant was placed in 1 ml of PBS buffer (pH 7.4) and stirred at 100 rpm at 37 degrees. Each time was measured 1, 3, 5, 10 hours and 1, 3, 5, 7, 14, 21, 28 days intervals. I exchanged it with a new buffer.
  • Emitted gentamicin was analyzed by absorbance at 257 nm using an infrared and visible light spectrometer (DU-530, Beckman Coulter TM, USA), and the released BMP-2 was analyzed by ELISA kit (Human BMP-2 Mini ELISA). Development Kit (900-M255), Peprotech, USA) was used to measure the absorbance at 450 nm and analyzed. The results are shown in FIG.
  • gentamicin As shown in Figure 4, heparin-titanium fixed with gentamicin (Comparative Example 3), heparin-titanium fixed with BMP-2 (Comparative Example 4), heparin-titanium fixed with gentamicin / BMP-2 (Example From 1) gentamicin or BMP-2 was released slightly earlier during the first day but continued to be released for 4 weeks thereafter.
  • each titanium was placed in a bacterial culture broth TSB (Tryptic Soy Broth), followed by 1 x 10 6 Staphylococcus aureus (5 /? 2y / o ci / s). aureus) bacterial cells were added and stirring was continued at 37 degrees.
  • TSB Traptic Soy Broth
  • Liver for osteoblasts of titanium and functionalized titanium heparin-titanium, hepatin-titanium fixed with gentamicin, heparin-titanium fixed with BMP-2, heparin-titanium fixed with gentamicin / BMP-2
  • each titanium was placed in a 48 well-plate and 5 x 10 4 osteoblasts were carefully placed on each titanium surface and incubated for 48 hours.
  • titanium, heparin-titanium, gentamicin-fixed heparin ⁇ titanium was similar in alkaline phosphatase activity to osteoblasts, did not show any difference.
  • heparin-titanium fixed with BMP-2 and heparin-titanium fixed with gentamicin / BMP-2 had similar alkaline phosphatase activities.
  • heparin-titanium (Comparative Example 4) immobilized with BMP-2 and heparin-titanium (Comparative Example 1) with gentamicin / BMP-2 immobilized were made from titanium (Comparative Example 1), heparin-titanium (Comparative Example 2) and Gentamicin showed significantly higher alkaline phosphatase activity compared to immobilized heparin-titanium (Comparative Example 3).
  • Example 1 and Comparative Examples 1-4 Osteofusion efficacy of Example 1 and Comparative Examples 1-4 titanium was evaluated by measuring and analyzing calcium deposition, a late differentiation marker of osteoblasts. 1 X 10 5 osteoblasts are carefully placed on each titanium and incubated for 21 days. After incubation, the cells are washed with PBS buffer and carefully scraped from each titanium surface. The scraped cells were centrifuged at 13,500 rpm for 1 minute, and then 0.1% Triton X-100 solution was added to the cells. In order to break up the cell membranes, ultrasonic waves are applied at 0 degrees for about 1 minute, followed by centrifugation.
  • heparin-titanium with immobilized BMP-2 and gentamicin / heparin-titanium with immobilized BMP-2 has significantly higher calcium deposition compared to heparin-titanium with immobilized titanium, heparin-titanium, and gentamicin. Indicated.
  • the heparin-titanium implant of Example 1 which is a functional implant in which the titanium surface of the implant is modified to immobilize antibiotics and bone formation promoters, is fixed in the comparative example. Compared to prevent bacterial infection, it has been shown to have an excellent effect on bone fusion and bone formation efficacy.
  • the scaffold Before modifying the surface of the PCL / PLGA scaffold, the scaffold was placed in an ethanol solution, sonicated for about 1 hour, and dried at 50 degrees for about 24 hours. Subsequently, the PCL / PLGA scaffold was placed in 10 mM Tris buffer (pH 8.0) in which the heparin-dopamine complex prepared in Preparation Example 1 was dissolved at a concentration of 5 mg / ml. After stirring, the PCL / PLGA scaffold (heparin-dopamine-PCL / PLGA scaffold) whose surface was modified with the heparin-dopamine complex was 3-4 times with distilled water.
  • Tris buffer pH 8.0
  • the heparin-dopamine PCL / PLGA scaffold to which BMP-2 was immobilized which is a functional scaffold that modified the surface of the PCL / PLGA scaffold and immobilized the bone formation promoter, was subjected to bone fusion. And it has been shown to have an excellent effect on bone formation efficacy.

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Abstract

본 발명은 정형외과 또는 치과용 임플란트 또는 스캐폴드의 이식 후에 발생될 수 있는 박테리아 감염을 방지하고, 골융합 및 골형성 효능을 동시에 갖는 항생제와 골형성 촉진 물질 방출형 임플란트 또는 스캐폴드 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

명세서
발명의 명칭
ᅳ 골 융합 향상 및 항균 효능을 갖는 항생제와 골형성 촉진 물질 방출형 임플란트 또는 스캐폴드 및 그 제조방법 기술분야
본 발명은 정형외과용 또는 치과용 임플란트 또는 스캐폴드 이식 후 발생하는 박테리아 감염을 방지하고 동시에 골융합 및 골형성을 유도 촉진할 수 있는 기능성 임플란트 또는 스캐폴드 및 그 제조방법에 관한 것이다. 배경기술ᅳ
임플란트 (implant) 또는 스캐폴드 (scaffold)는 생체 내에 매식되어 소기의 기능을 발휘하는 생체 매식용 의료기구이다. 따라서 임플란트 또는 스캐폴드는 반복되는 하중 및 순간적인 압력에도 견딜 수 있는 기계적 강도를 지니고 있어야 함은 물론, 생체 친화성 (biocompatibility), 화학적 적합성 (chemical compatibility) 등의 조건을 만족해야 한다.
따라서 임플란트 또는 스캐폴드 재료 중 현재 가장 많이 사용되고 있는 재료는 생체적합성이 뛰어난 티타늄과 일부의 티타늄 합금 등이다. 티타늄은 비중이 낮아서 다른 금속재료에 비해 상대적으로 가볍지만 다른 금속과의 합금으로 제조되거나 적절한 처리과정을 거치면 강도가 향상될 수 있고 또한 공기 중이나 수중에서 매우 치밀하고 재형성 능력이 뛰어난 부동태 산화 피막을 형성하여 매우 큰 부식저항성을 갖는다. 또한， 골 내에 매식되었 때 골과의 유착 (osteointegration)이 일어나는 장점이 있으므로 현재 임플란트 또는 스캐폴드의 소재로서 가장 널리 사용되고 있다.
이러한 뛰어난 기계적 특성， 화학적 안정성， 생체적합성 등의 특성을 갖는 티타 ^ 및 그의 합금은 정형외과 및 치과영역에서 사용되는 임플란트 또는 스캐폴드로 널리 사용이 되고 있다. 하지만, 임플란트 또는 스캐폴드와 골 조직 간 ^ 불층분한 결합이 임플란트 또는 스캐폴드를 느슨하게 하고 결국에는 임플란트 또는 스캐폴드의 이식 실패에 이르게 된다. 티타늄 표면과 골 조직사이의 골 융합을 향상시키기 위해 칼슴 포스페이트 또는 히드록시아파타이트 코팅， 생체분자， 단백질, 표면 지형의 제어를 통한 표면 개질과 기능화에 대한 다양한 방법들이 개발이 되어져 왔다. 최근에， 조골세포의 기능을 향상시키기 위해， 콜라젠 젤， 스폰지， 피브노젠， 키토산 등을 이용한 골형성 성장인자 BMP-2 (Bone morphogenic protein-2) 전달시스템이 개발되어 왔다. 하지만， 이러한 약물전달체 중에 몇몇은 BMP-2 가 단기간에 빠른 약물 방출과 초기에 갑작스런 방출되는 문제점을 나타내었다.
정형외과 또는 치과 영역의 임플란트 또는 스캐폴드의 이식 실패에 대한 또 다른 주요 원인은 금속표면에 대한 박테리아의 감염과 관련이 되어 있다. 일반적인 티타늄 임플란트는 삽입하는 동안 환자 자신의 피부 또는 점막으로부터 유래하는 박테리아에 감염이 되기 쉽다. 임플란트 표면에 박테리아가 부착되어 성장을 하면， 박테리아 세포는 두꺼운 생체필름을 형성하게 되고， 이는 숙주방어 메커니즘과 투여된 항생제의 확산 /침투를 막는 주요 장애물 역할을 한다. 이러한 박테리아 감염은 임플란트의 실패의 원인이 되며, 임플란트 제거에 따른 추가 비용과 함께 환자의 질병을 악화시킬 수 있다.
이러한 문제점 중， 단기간 내에 빠른 약물방출과 초기 갑작스런 방출의 문제점을 해결하기 위해， 음전하를 띄는 선형 다당류인 헤파린을 화학적으로 티타늄 표면에 결합함으로써, BMP-2 가 천천히 방출될 수 있도록 약물방출속도를 제어할 수 있었다 (Sung Eun Kim et al., Biomaterials, 2011, 32(2), 366-373). 그러나， 이는 박테리아 세포의 부착 및 감염 억제 효과는 낮을 것으로 사료된다.
또한 골융합 효능을 향상시키기 위하여 대한민국 공개특허 제 200그
0068240 호에는 재조합 골형성 촉진 단백질을 도포하여 턱뼈에 매식하면 시술부위 주변의 성체 미분화세포가 빠르게 골세포로 분화되어 골유도성 치유가 일어나도록 하여 치유기간을 단축시킬 수 있는 치과용 임플란트가 개시되어 있으나， 상기 기술은 임플란트 표면에 박테리아의 부착 및 감염될 수 있는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하고자 실제 임상에서는 박테리아 부착 및 감염 방지를 위하여 환자에게 항생제를 추가적으로 복용해야한다.
또한， 박테리아 감염을 방지하고 골융합 효능을 향상시키기 위해， Wilson Wang 그룹 (Biomacromolecules, 2009, 10(6) 1603—1611; Tissue Eng Part A, 2009, 15(2), 417-426； Biomaterials, 1008, 29(10)， 1412-1421； J Biomed Mater Res A, 2008, 86(4)， 85-872)에서는 키토산 및 그의 유도체， 덱스트란， 히알루론산， 펩타이드 등이 표면에 결합된 티타늄 임플란트가 개발이 되어 왔다. 이러한 티타늄 임플란트는 조골세포의 부착， 증식 및 알칼리성 포스파타제 활성도를 현저히 증가시켰으며， 동시에 황색포도알균 CSapAWococc s aureus)^ 표피포도알균 C ap/2_K/ococciAs epidermidis)^ 같은 박테리아의 부착을 감소시켰다. 그러나， 이러한 고분자 또는 펩타이드만으로 결합된 티타늄 임플란트의 경우， 임플란트 표면에 박테이라의 부착 및 감염을 최소화 또는 방지하기 위해서 의사의 처방을 받은 항생제를 추가적으로 복용을 해야만 하는 번거로움이 있다.
이에 본 발명자들은 정형외과 또는 치과에서 사용되는 임플란트 또는 스캐폴드의 이식 후에 발생될 수 있는 박테리아 부착 및 감염을 방지하고， 추가적으로 항생제 복용이 필요가 없으며， 동시에 골 조직과의 융합 및 골형성 효능을 갖고 있는， 항생제와 골형성 촉진 물질이 동시에 지속적으로 서방형 방출이 가능한 기능성 임플란트 또는 스캐폴드를 발명하게 되었다. 발명의 상세한설명
기술적 과제
본 발명의 목적은 정형외과 또는 치과용 임폴란트 또는 스캐폴드의 이식 후에 발생될 수 있는 박테리아 감염을 방지하고, 골융합 및 골형성 효능을 동시에 갖는 임플란트 또는 스캐폴드를 제공하는 것은로， 보다 상세^ "게는 임풀란트 또는 스캐폴드의표면을 고분자로 개질하여 임풀란트 또는 스캐폴드의 표면을 기능화 (활성화)하고， 물리적 결합을 통하여 고분자로 활성화된 임플란트 또고골것
는형이형 ：캐폴드의 표면에 항생제와 골형성 촉진 물질을 고정화하여， 항생제와 성성다
촉진 물질을 동시 에 지속적으로 서방형으로 방출할 수 있는， 항생제와 촉진 물질 방출형 임플란트 또는 스캐폴드 및 그 제조방법을 제공하는 기술적 해결방법
본 발명은 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체를 이용하여 표면을 개질한 임플란트 또는 스캐폴드로서， 상기 임플란트 또는 스캐폴드는 항생제 및 골형성 촉진물질 중에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 포함하는 임플란트 또는 스캐폴드를 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체를 제조하는 단계 ;
(b) 상기 (a)단계에서 제조된 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체를 이용하여 임플란트 또는 스캐폴드 표면을 개질시 켜， 표면을 활성화시키는 단계 ;
(c) 상기 (b)단계에서 제조된 표면 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드를 항생제가 포함된 용액에 침지 한 후， 20 ~ 25 °C에서 4 내지 24 시 간 동안 교반하여， 항생제를 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 고정화시 키는 단계 ;
ᅳ (d) 상기 (c) 단계에서 제조된 항생제가 표면에 고정화된 임플란트 또는 스캐폴드를 골 형성 촉진 물질이 포함된 용액에 침지 한 후， 20 ~ 25°C에서 4 내지 24 시 간 동안 교반하여， 항생제 /골 형성 촉진 물질을 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 고정화시 키는 단계를 포함하는 임플란트 또는 스캐폴드의 제조방법을 제공한다. 유리한 효과
본 발명의 임플란트 또는 스캐폴드는 항생제 및 골형성 촉진 물질을 포함할 경우， 임 란트 또는 스캐폴드로부터 장기간 지속적으로 항생제가 방출이 되기 때문에 임플란트 또는 스캐폴드를 이식하는 과정 또는 이식 후에 발생할 수 있는 박테리아 부착， 성장 및 감염을 방지 하여， 박테리아에 의 한 임플란트 또는 스캐플드 이삭 실패율을 현저히 감소시 킬 수 있다. 또한， 임플란트 또는 스캐폴드 이식 후에도 추가적으로 항생제를 복용해야하는 번거로움이 없다. 게다가， 골융합 및 골형성을 촉진하는 물질 (골 형성 촉진 물질)이 장기간 지속적으로 방출이 되기 때문에 임플란트 또는 스캐플드와 골조직 사이 의 부착， 조골세포의 분화를 촉진하여 골형성을 향상시 킬 수 있기 때문에 임플란트 또는 스캐폴드 이식 후 치료기간이 단축이 될 수가 있으며， 임플란트 또는 스캐폴드 이식 성공률을 높일 수 있기 때문에 경 제적 부담감을 줄일 수 있다. 도면의 간단한 설명
도 1 은 헤파린 처 리하여 개질된 임플란트의 티타늄 금속표면에 항생제인 젠타마이신과 골형성 촉진 성 장인자 BMP-2 를 순차적으로 고정 화시 키는 방법을 도시하고 있다. 도 2 는 비교예 1 내지 4 및 실시예 1 의 임플란트 티타늄 표면의 주사전자현미경 사진으로， 각각 (a) 티타늄 (비교예 1), (b) 헤파린-티타늄 (비교예 2)， (c) 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 3)， (d) BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4)， (e) 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시예 1)의 표면에 대한 주사전자현미경 사진을 도시하고 있다.
도 3 은 임플란트의 티타늄 (비교예 1) 및 활성화된 티타늄 (헤파린- 티타늄 (비교예 2)， 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 3)， BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4)， 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시예 1))들의 X-선 광전자 분광기를 이용한 표면의 화학적 원소분석 결과를 도시하고 있다.
도 4 는 본 발명의 실험예 2 에 따른 비교예 2 내지 4 및 실시예 1 의 활성화된 티타늄으로부터 젠타마이신 또는 BMP-2 의 약물 방출을 보여주는 결과를 나타낸 그래프로， 도 4a는 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 3， GSHep-Ti) 및 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시예 1， GS/BMP-2 Hep-Ti)으로부터 젠타마이신의 약물 방출 거동을 도시하고 있으며， 도 4b 는 BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4, ΒΜΡ-2/Hep-Ti) 및 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시예 1， GS/BMP-2 Hep- Ti)으로부터 BMP-2의 약물 방출 거동 결과를 도시하고 있다.
도 5 는 본 발명의 실험예 3 에 따른 비교예 1 (Pristine Ti) 및 기능화된 티타늄 (젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 3， GSHep-Ti), BMP-2 가 고정된 헤파린—티타늄 (비교예 4， ΒΜΡ-2/Hep-Ti) 및 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시예 1, GS/BMP-2 Hep-Ti))들의 황색포도알균 C¾¾D/7y/ococc s aureus) 박테리아 세포에 대한 항균 효과에 대한 결과를 도시하고 있다.
도 6 은 본 발명의 실험예 4 에 따른 비교예 1 (Pristine Ti) 및 기능화된 티타늄 (해파린-티타늄 (비교예 2, Heparinized Ti), 젠타마이신이 고정된 헤파린- 티타늄 (비교예 3, GSHep-Ti), BMP— 2가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4， BMP— 2/Hep-Ti) 및 젠타마이신 /BMP— 2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시예 1， GS/BMP- 2 Hep-Ti))들의 조골세포에 대한 세포독성 결과를 도시하고 있다.
도 7 은 본 발명의 실험예 5 에 따른 비교예 1 (Pristine Ti) 및 기능화된 티타늄 (헤파린—티타늄 (비교예 2, Heparnized Ti), 젠타마이신이 고정된 헤파린- 티타늄 (비교예 3, GSHep-Ti), BMP-2가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4， BMP- 2/Hep-Ti) 및 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시예 1， GS/BMP- 2 Hep-Ti))들의 조골세포에 대한 Live/Dead 분석 결과를 도시하고 있다.
도 8 은 본 발명의 실험예 6 에 따른 비교예 KPristine Ti) 및 기능화된 티타늄 (헤파린—티타늄 (비교예 2, Heparnized Ti), 젠타마이신이 고정된 헤파린— 티타늄 (비교예 3， GSHep-Ti), BMP-2가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4， BMP- 2/Hep-Ti) 및 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시예 1， GS/BMP- 2 Hep— Ti))에 조골세포를 1 일, 3 일， 7 일 배양 후의 세포증식에 대한 결과를 도시하고 있다. 도 9 는 본 발명 의 실험 예 7 에 따른 비교예 1 (Pristine Ti) 및 기능화된 티타늄 (헤파린—티타늄 (비교예 2， Heparnized Ti), 젠타마이신이 고정 된 헤과린- 티 타늄 (비교예 3， GSHep-Ti), BMP— 2 가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4， BMP- 2/Hep-Ti) 및 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 (실시 예 1， GS/BMP- 2 Hep-Ti))에 조골세포를 7 일， 14 일， 21 일 배양 후의 알칼리성 포스파타제 활성도에 대한 결과를 도시하고 있으며，
도 10 은 본 발명 의 실험 예 7 에 따른 비교예 KPristine Ti) 및 기능화된 티 타늄 (헤파린—티타늄 (비교예 2， Heparnized Ti), 젠타마이신이 고정된 헤파린- 티타늄 (비교예 3, GSHep-Ti), BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4， BMP— 2/Hep-Ti) 및 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티 타늄 (실시 예 1， GS/BMP- 2 Hep-Ti))에 조골세포를 21 일 동안 배양 후의 칼슘 침 착에 대한 결과를 도시하고 있다.
도 11 은 실시 예 1 의 (a) PCL/PLGA 스캐폴드 표면， (b) BMP-2 탑재 헤파린 PCL/PLGA 스캐폴드 표면， (c) BMP-2 탑재 헤파린—도파민 PCL/PLGA 스캐폴드 표면을 주사전자현미 경으로 관찰한 결과이다.
도 12 는 PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 혜파린 -PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 헤파린-도파민- PCL/PLGA 스캐폴드의 조골세포에 대한 세포독성을 평가하기 위해， 각각의 스캐폴드를 세포배양액에 넣고 배양한 후 450 nm 에서 흡광도를 측정 한 결과이다.
도 13 은 PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 헤파린 -PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 해파린-도파민— PCL/PLGA 스캐폴드의 조골세포에 대한 세포증식을 평가하기 위 해 , 1 X 105 개의 조골세포를 각각의 스캐폴드에 넣고 1 일， 3 일， 7 일을 배양한 후， 450 nm 에서 흡광도를 측정 한 결과이다.
도 14 는 PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 헤파린 -PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 헤파린-도파민ᅳ PCL/PLGA 스캐폴드의 조골세포의 초기분화 마커 인 알칼리성 포스파타제 활성도를 측정 한 결과이다.
도 15 는 PCL/PLGA 스캐폴드, BMP-2 탑재 헤파린 -PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 헤파린-도파민ᅳ PCL/PLGA 스캐폴드를 조골세포의 후기분화 마커 인 칼슘침착을 측정 한 결과이다.
도 16 은 PCL/PLGA 스캐폴드， BMP— 2 탑재 헤파린 -PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 헤파린-도파민- PCL/PLGA 스캐폴드에 대한 골형성능을 알아보기 위해， 쥐 경골 (tibia)에 8 mm 골결손 (bone defect) 부분에 이식 된 각각의 스캐플드를각각 hematoxylin and eosin (H&E) 과 Masson's trichrome (MT) 염 색을 한 후， 조직 학적 분석을 한 결과이다.
도 17 은 PCL/PLGA 스캐폴드， BMP-2 탑재 헤파린 -PCL/PLGA 스캐폴드， BMP- 2 탑재 헤파린-도파민- PCL/PLGA 스캐폴드에 대한 골형성 능을 알아보기 위해， 쥐 경골 (tibia)에 8 mm 골결손 (bone defect) 부분에 이식 된 각각의 스캐폴드에 대하여 X-ray 분석， CT 분석 및 조직 형 태학적 분석을 한 결과이다. 발명의 실시를 위한 최선의 형태 이하， 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 고분자 -ᅳ카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체를 이용하여 표면을 개질한 임플란트 또는 스캐폴드로서， 상기 임플란트 또는 스캐폴드는 항생제 및 골형성 촉진물질 중에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 포함하는 임플란트 또는 스캐폴드를 제공한다.
보다 상세하게， 본 발명은 생체적합성이 뛰어난 고분자를 강력한 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 임플란트 또는 스캐폴드의 표면을 개질하고， 박테리아 부착 및 감염을 억제할 수 있는 항생제 및 /또는 골 융합 및 골 형성을 증가시킬 수 있는 골형성 촉진 물질을 고분자로 표면이 개질된 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 고정화를 함으로써， 항생제 및 /또는 골형성 촉진 물질이 서방형으로 동시에 방출이 가능한 기능성 임플란트 또는 스캐폴드를 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서， 상기 임플란트 또는 스캐폴드의 표면은 생체적합성이 뛰어난 티타늄과 일부의 티타늄 합금으로 이루어질 수 있다.
ᅳ 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 임플란트 또는 스캐폴드의 표면은 폴리카프로락톤 (PCL); 폴리유산 (polylactic acids, PLA), 폴리글리콜산 (polyglycolic acid) 또는 이들의 공중합체인 PLGA; 폴리리드록시부티레이트-코 -발레레이트 (PHBV), 폴리비닐알콜 (PVA), 폴리부틸렌 숙시네이트 (PBS) 및 폴리필렌 글리콜산 (PG)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 또는 2종 이상의 생분해성 플라스틱 조성물로 이루어질 수 있다.
상기 임플란트 또는 스캐폴드의 표면 개질에 사용될 수 있는 고분자는 생체적합성 고분자로， 헤파린 (Heparin), 헤파란설페이트 (Heparan sulfate), 히알루론산 (Hyaluronic acid), 알지네이트 (Alginate), 폴리아스파틱산 [Poly(aspartic acid)], 폴리아크릴산 [Poly(acrylic acid)], 폴리글루타믹산 [Poly(glutamic acid)], 카르복시메틸셀를로오스 (Carboxymethyl cellulose), 젤라틴 (Gelatin), 콜라젠 (Collagen)；， 키토산 (Chitosan) 및 그의 유도체, 글라이콜키토산 (Glycol chitosan), 폴리 -L-라이신 (Poly— L-lysine), 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine), 말단에 아민 그룹의 작용기를 갖는 덴드리머 (Dendrimer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상인 것이 바람직하나， 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 말단에 아민 그룹의 작용기를 갖는 덴드리머 (Dendrimer)는 중심에서부터 방사상으로 결합된 반복단위 (세대)로 구성되는 것으로， 상기 덴드리머의 세대 (generation) 수는 1 내지 5인 것이 바람직하다.
상기 고분자가 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 강력한 공유결합 또는 비공유결합을 형성할 수 있도록 하기 위하여， 본 발명에서는 실질적으로 모든 종류의 무기 및 유기 기판에 접착할 수 있는 부착유기물을 갖는 홍합 (Mussel)의 접착 특성을 이용하였다. 홍합의 강력한 접착 특성은 플라크 -기판 접면 근처에서 발견되는 3，4—다이하이드록시— L—페닐알라닌 (3,4_dihydroxy— L-phenylalanine, D0PA) 및 라이신 아미노산이 풍부한 단백질의 아미노산에서 기인하는 것으로 보여진다. 상기 DOPA 는 접착물질의 고화를 초래하는 반웅에 관여할 뿐만 아니라， 기판과 강력한 공유결합 또는 비공유결합을 형성한다. 특히， DOPA 구조식 중에 카테콜 (catechol)이라 불리는 오르소-다이하이드록시페닐 (ortho- dihydroxyphenyl)의 작용기가 기판과 강력 한 공유결합 또는 비공유결합을 형성하는데 중요한 역할을 한다. 따라서 본 발명에서는 상기 생체적합성 고분자를 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 결합을 하기 위해서， 카테콜 작용기를 함유하는 화합물을 이용하였다. 상기 카테콜 작용기를 함유하는 화합물은 3，4- 다이하이드록시퍼 1닐알라닌 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine), 도파민 (Dopamine), 3，4-다이하이드록시 벨질아민 (3,4-dihydroxybenzylamine),
노르에피 네피 린 (norepinephrine);， 3，4-다이하이드록시 벤즈알데히드 (3，4，- dihydroxybenzaldehyde), 3,4—다이하이드록시 벤조익산 (3,4_dihydroxybenzoic acid), 카페익산 (Caffeic acid), 3，4-다이하이드록시 -페닐아세틱산 (3，4- Dihydroxyphenylacetic acid)으로 이루어진 군에서 선택되는 1 종 이상의 화합물인 것이 바람직하나， 이에 한정하는 것은 아니 다.
상기 고분자를 카테콜 작용기를 포함하는 화합물을 이용하여 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 결합시 켜， 임플란트 또는 스캐폴드의 표면을 활성화 또는 기능화시 키 는 고분자-카테콜을 함유한 화합물의 복합체는， 고분자와 카테콜을 함유하는 화합물에 가교제 (crosslinker)를 사용함으로써 제조할 수 있다. 상기 고분자-카테콜 작용기를 함유한 화합물의 복합체는 상기 고분자의 아민그룹 또는 카르복시그룹의 작용기 ; 및
카테콜 작용기를 포함하는 화합물의 아민그룹， 카르복시 그룹 또는 알데히드 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 작용기와의 화학적으로 결합할 수 있는 조합에 의하여 형성되는 것 이 바람직하며， 이에 따라 제조된 고분자-카테콜 작용기를 함유한 화합물의 복합체를 이용하여 임플란트 또는 스캐폴드의 표면을 개질할 수 있다.
상 7 고분자-^테콜을 함유한 화합물의 복합체는 다음과 같은 조합에 의하여 제조되 는 것 이 보다 바람직하다. 예를 들면, 카르복시 그룹의 작용기를 가지고 있는 고분자인 헤파린 (Heparin), 헤파란설페 이트 (Heparan sulfate), 히 알루론산 (Hyaluronic acid), 알지 네이트 (Alginate), 폴리아스파틱산 [Poly(aspartic acid) ] , 폴리 아크릴산 [Poly(acrylic acid) ] , 폴리글루타믹산 [Poly(glutamic acid) ] , 카르복시 메틸셀를로오스 (Carboxymethyl cellulose), 젤라틴 (Gelatin), 콜라젠 (Collagen)은 아민그룹의 작용기를 갖는 카테콜을 함유하는 화합물인 3，4-다이하이드록시 페닐알라닌 (L-3,4- dihydroxyphenylalanine), 도파민 (Dopamine), 3，4-다이하이드록시 벤질아민 (3,4- dihydroxybenzylamine)， 노르에피네피 린 (norepinephirine)과 다양한 조합을 통하여 고분자-카테콜을 함유하는 화합물 복합체를 제조할 수 있다. 또한， 아민 그룹의 작용기를 갖는 고분자인 젤라틴 (Gelatin), 콜라젠 (Collagen), 키토산 (Chitosan) 및 그의 유도체， 글라이콜키토산 (Glycol chitosan), 폴리 -L- 라이신 (Poly-L-lysine), 폴리 에 틸렌이 민 (Polyethyleneimine), 덴드리머 (Dendrimer)는 카르복시 작용기 또는 알데히드 작용기를 갖는 카테콜 함유 화합물인 3,4—다이하이드록시 벤즈알데히드 (3,4,-dihydroxybenzaldehyde), 3，4—다이하이드록시 벤조익산 (3,4-dihydroxybenzoic acid), 카페 익산 (Caffeic acid), 3，4—다이하이드톡시 -페닐아세틱산 (3,4_Dihydroxyphenylacetic acid)와 다양한 조합을 통하여 고분자ᅳ카테콜을 함유하는 화합물 복합체를 제조할 수 있다. 하기 표 1 은， 고분자와 카테콜 함유하는 화합물의 다양한 초합을 통하여 얻어 질 수 있는 고분자-카테콜을 함유하는 복합체의 예를 제공하고 있다.
【표 1】
고분자-카테콜 함유한 화합물 복합체
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상기 고분자의 중량평균분자량은 1,800 내지 300,000 인 것 이 바람직하다. 또한 상기고분자 ᅳ 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체는 상기 고분자 1 중량부에 대하여 상기 카테콜 작용기를 함유하는 화합물 3 내지 25 중량부로 결합되는 것 이 바람하나， 이에 한정 되는 것은 아니다.
ᅳ 상기 고분자-카테콜 작 기를 함유한 화합물 복합체를 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 결합시켜 임플란트 또는 스캐폴드 표면의 활성화 및 기능화를 하기 위해선， 카테콜 작용기가 산화중합반웅이 용이하게 일어 날 수 있는 염 기조건이 바람직하며， 용액의 pH 는 7 내지 12 인 것 이 바람직하다. 용액의 pH 를 상기와 같은 조건으로 유지하기 위하여 트리스버퍼 (Tris), 인산버퍼 (PBS)와 같은 pH 버퍼를 사용하는 것이 가능하다.
상기 고분자—카테콜 작용기를 함유한 화합물 복합체를 사용하여 표면활성화 또는 기능화된 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 고정화 또는 탑재될 수 있는 항생제는 시소마이신 (Sisomicin), 리보스타마이신 (Ribostamycin), 반코마이신 (Vancomycin), 토브라마이신 (Tobramycin), 아즈트레오남 (Aztreonam) 젠타마이신 (Gentamicin), 세포티 암 (Cefotiam), 세프트리 악손 (Ceftriaxone), 네틸마이신 (Netilmicin), 시프로플록사신 (Ciprofloxacin), 신다마이신 (Cindamycin) 및 세포졸린 (Cefazolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종이상인 것 이 바람직하며 , 보다 바람직하게는 카르복실산 (carboxylic acid), 아민 (amine), 인산염 (phosphates) 및 황산염 (sulfate)의 작용기 중 어느 하나 이상의 작용기를 가지고 있는 것을 사용할 수 있으나， 이 에 한정되는 것은 아니다. 상기 고분자로 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 탑재 또는 고정화될 수 있는 항생제의 농도는 lng/ml 내지 200 mg/ml 의 농도 범위 인 것 이 바람직하며， 상기의 항생제 농도 범위 에서 고분자로 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 항생제를 탑재 또는 고정화할 수 있으나, 임플란트 또는 활화한있
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스캐폴드의 크기에 따라 탑재 및 고정화될 수 있는 용량이 결정 될 수 있다. 상기 항생제의 농도가 lng/ml 미 만의 농도로 처 리할 경우에는 향균효과가 나타나지 않을 것 이며， 200mg/ml 농도를 초과하여 처 리할 경우에는 정상세포에 영 향을 미 칠 수 있다.
상기 고분자-카테콜 작용기를 함^힌" 화합물 복합체를 사용하여 표면 화 또는 기능화된 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 고정화 또는 탑재될 수 골 형성 촉진 물질로는 단백질인 골형성 성 장인자 또는 저분자량의 골형성 물을 사용할 수 있으며， 골 형성 성 장인자인 것 이 보다 바람직하나， 이 에 하는 것은 아니다.
상기 골 형성 촉진 물질 중 골 형성 성 장인자로는， 골형성 단백질 (bone morphogenic protein)인 BMP- l, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8a, BMP-8b, BMP- 10, BMP- 15 혈소판유래증식 인자 (Platelet derived growth factor; PDGF), 형 질전환성 장인자베타 (Transforming growth factor beta; TGF-beta), 염기성 섬유모세포생장인자 (basic fibroblast growth factor; bFGF), 인슐린유사성장인자 - KlnsuUn like growth factor 1； IGF- 1) 및 락토페린 (lactoferin)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 또는 2 종 이상인 것 이 바람직하다.
또한， 본 발명의 표면활성화 또는 기능화된 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 골융합 및 골형성 효능을 향상시 키 기 위하여 사용되는 골형성 성 장인자 대신에 대체가 가능한 저분자량의 골형성 화합물인 비스포스포네 이트 약물계열인 알렌드로네이드 (alendronate), 리 제드로네이트 (risedronate), 졸레드로네이트 (zoledronate), 에티드로네 이트 (Etidronate), 클로드로네 이트 (Clodronate), 틸루드로네이트 (Tiludronate), 파미드로네 이트 (Pamidronate), 올파드로네이트 (Olpadronate), 이 바드로네이트 (Ibadronate); 스태틴 약물 계열인 아트로바스타틴 (Atrovastatin), 플루바스타틴 (Fluvastatin), 로바스타틴 (Lovastatin), 피타바스타틴 (pitavastatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 로수바스타틴 (rosuvastatin), 심바스타틴 (simastatin); 프로스타글란틴 E2 (Prostaglandin E2, PGE2), 신바로메 틴 (shinbarometin), 파이로포스페이트 (pyrophosphate), 메드로네이트 (medronate), 옥시드로네이트 (oxidronate) 및 옥시스테를 (Oxysterol)로 이루어진 군으로 선택되는 1 종 또는 2 종이상의 약물이 탑재 또는 고정화될 수 있다.
상기 골형성 성장인자가 고분자로 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 탑재 또는 고정화될 수 있는 용량은 lpg/ml 내지 3 mg/ml 의 농도범위 인 것이 바람직하며， 상기 골형성 성장인자의 농도가 lpg/ml 미 만일 경우에는 골형성 효능이 나타나지 않으며， 3mg/ml 를 초과할 경우에는 뻐를 녹이 게 하는 부작용 발생이 가능하다.
골융합 및 골형성을 촉진할 수 있는 상기 저분자량의 골형성 화합물이 고분자로 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 탑재 또는 고정화될 수 있는 용량은 1 ng/ml 내지 500 mg/ml 의 농도 범위 인 것 이 바람직하다. 상기 골형성 성장인자의 농도가 lng/ml 미만일 경우에는 골형성 효능이 나타나지 않으며， 500 mg/ml 를 초과할 경우에는 뼈를 녹이 게 하는 부작용 발생할 수 있다. 상기 고분자로 표면이 활성화 또는 기능화된 임플란트 또는 스캐폴드에 항생제， 골 형성 촉진 물질을 탑재 또는 고정화하기 위해선， 고분자와 항생제, 고분자와 골형성 촉진 물질간의 정전기적 상호작용이 용이하게 일어날 수 있는 약산성 조건인 pH 5 내지 6.5 범위가 바람직하며， 용액으로는 상기의 pH 범위를 갖는 물， MES 버페 2_(N-morpholino)ethanesulfonic acid], 트리스 ^퍼 (Tris), 인산버퍼 (PBS)와 같은 용액을사용하는 것이 가능하다.
본 발명의 임플란트 또는 스캐폴드는 치과용 또는 정형외과용인 임플란트 또는ᅳ스캐폴드인 것이 바람직하며， 예를 들어, 상기 정형외과용 임플란트 또는 스캐폴드는 고관절, 슬관절， 족관절， 견관절， 주관절의 인공관절이나， 척추영역 인공디스크 등의 인공삽입물이 사용되며， 골절치료에 사용되는 금속나사， 금속판， 금속정 등의 고정물 : 포함한다. 또한ᅳ상기 치과용 임플란트 또는 스캐폴드는 고정 (Fixture)형 임플란트 또는 스캐폴드， 멤브레인 (Membrane) 형 임플란트 또는 스캐폴드 등을 포함한다.
따라서， 본 발명의 상기 항생제와 골형성 촉진 물질이 서방형으로 방출 가능한 기능성 임플란트 또는 스캐폴드를 이용할 경우， 임플란트 또는 스캐폴드로부터 장기간 지속적으로 항생제가 방출이 되기 때문에 임플란트 또는 스캐폴드를 이식하는 동안 발생할 수 있는 박테리아 부착 및 감염을 방지할 수 있으며， 임플란트 또는 스캐폴드 이식 후에도 추가적으로 항생제를 복용해야하는 번거로움이 없다. 또한， 골융합 및 골형성을 촉진하는 물질이 장가간 지속적으로 방출이 되기 때문에 임플란트 또는 스캐폴드와 골조직 사이의 부착 및 골형성이 촉진되어 임플란트 또는 스캐폴드의 치료기간이 단축될 수가 있으며， 임플란트 또는 스캐폴드의 이식 성공에 크게 기여를 할 수 있다.
또한 본 발명은 임플란트 또는 스캐폴드의 제조방법에 관한 것으로，
(a) 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 제조된 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체를 이용하여 임플란트 또는 스캐폴드의 표면을 개질시켜， 표면을 활성화시키는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 제조된 표면 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드를 항생제가 포함된 용액에 침지한 후， 20 ~ 25°C에서 4 내지 24 시간 동안 교반하여， 항생제를 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 고정화시키는 단계;
ᅳ (d) 상기 (c) 단계에서 제조된 항생제가 표면에 고정화된 임플란트 또는 스캐폴드를 골 형성 촉진 물질이 포함된 용액에 침지한 후， 20 ~ 25°C에서 4 내지ᅳ 24 시간 동안 교반하여， 항생게 /골 형성 촉진 물질을 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 고정화시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 (a)단계의 상기 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체는 생체적합성 고분자의 아민그룹 또는 카르복시그룹의 작용기; 및
카테콜 작용기를 포함하는 화합물의 아민그룹， 카르복시그룹 또는 알데히드 작용기로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 작용기와의 결합에 의하여 형성되는 것이 바람직하다. 상기 고분자 물질- 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체의 제조 방법은 상기에 7|ᅳ재한 내용을 원용한다.
상기 임플란트 또는 스캐폴드의 제조 방법의 (C)단계 및 (d)단계의 고분자와 항생제， 고분자와 골형성 촉진 물질간의 정전기적 상호작용이 용이하게 일어날 수 있는 반웅 조건은 약산성 조건인 pH 5 내지 6.5 의 범위의 조건인 것이 바람직하며， 이때 이용할 수 있는 용액으로는 상기의 pH 범위를 갖는 물，
MES 버페 2_(N-morpholino)ethanesulfonic acid], 트리스버퍼 (Tris), 인산버퍼 (PBS)와 같은 용액을 사용하는 것이 가능하다.
또한， 상기 (b), (c) 및 (d)단계 이후， 각각 증류수로 3-4 회 세척한 후， 50도에서 건조시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 항생제는 상기 기재한 내용을 원용한다.
상기 고분자로 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 탑재 또는 고정화될 수 있는 항생제 용액의 농도는 lng/ml 내지 200 mg/ml의 농도 범위인 것이 바람직하며， 상기의 항생제 농도 범위에서 고분자로 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 항생제를 탑재 또는 고정화할 수 있으나， 임플란트 또는 스캐폴드의 크기에 따라 탑재 및 고정화될 수 있는 용량이 결정될 수 있다. 상기 항생제의 농도가 lng/ml 미만의 농도로 처리할 경우에는 향균효과가 나타나지 않을 것이며， 200mg/ml 농도를 초과하여 처리할 경우에는 정상세포에 영향을 미칠 수 있다
상기 골형성 촉진 물질은 상기 기재한 내용을 원용한다.
상기 골형성 성장인자가 고분자로 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 탑재 또는 고정화될 수 있는 용량은 lpg/ml 내지 3 mg/ml 의 농도 범위인 것이 바람직하며，
골융합 및 골형ᅳ성을 촉진할 수 있는 상기 저분자량의 골형성 화합물이 고분자로 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 탑재 또는 고정화될 수 있는 용량은 l ng/ml 내지 500 mg/ml의 농도 범위인 것이 바람직하다. 발명의 실시를위한형태
이하， 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만， 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시로서， 본 발명의 권리범위가 이에 의하여 한정되지 않는다. 제조예 1.헤파린-도파민 복합체 제조
헤파린 (heparin) 400 mg, 1-에틸 -3— (3—디메틸- 아미노프로필)카보디이미드 (l-ethyl-3_(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide; EDC) 190.6 mg, N—하이드로숙시니미드 (N— hydrosuccinimide; NHS) 115 mg 을 10 ml 의 MES buffer(pH 4.5)에 녹여 10 분간 반응시킨 후， 102.2 mg 의 도파민을 넣어 25°C에서 약 24 시간 동안 반웅시킨다. 반웅 후， 증류수에서 투석하여 미반웅 물질을 제거한 후, 동결건조하여 헤파린-도파민 복합체 (Hep-DOPAm)를 제조하였다. 상기의 반웅은 하기 반응식 1 에 나타난 바와 같다.
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상기 제조된 헤파린-도파민 복합체를 자외선 및 가시광선 분광분석 법을 통하여 280 nm 파장에서 분석 한 결과, 헤파린 한 개의 분자 당 약 4.6 士 0.8 개의 도파민 분자가 결합되어 있음을 확인하였다.
실시예 1. 티타늄 임플란트 표면에 헤파린， 젠타마이신 설페이트 (gentamicin sulfate)와 BMP-2 의 고정화
임플란트의 티타늄 표면을 개질하기 전에 , 티타늄 임플란트를 에 탄을 용액에 넣어 1 시간 정도 초음파 세척을 한 후， 약 24 시간 동안 50 도에서 건조시 켰다. 그 후， 티타늄 임플란트를 상기 제조예 1 에서 제조한 헤파린-도파민 복합체가 5 mg/ml 의 농도로 용해되어 있는 10 mM Tris 버퍼 (pH 8.0)에 넣고， 빛을 차단한 후 밤새도록 교반한 뒤에 , 헤파린-도파민 복합체로 표면이 개질된 티타늄 임플란트 (헤파린-티타늄 임플란트)를 증류수로 3-4 회 세척 한 후 질소가스를 홀려주면서 건조시 켜 헤파린-도파민 복합체로 표면이 개질된 티 타늄 임플란트를 제조하였다. 항생제 인 젠타마이신을 상기 헤파린-도파민 복합체로 표면이 개질된 티타늄 임ᅳ플란트에 탑재시키 기 위해， 해파린-도파민 복합체로 표면이 개질된 티타늄 임플란트를 50 mg/ml 농도로 젠타마이신이 녹여져 있는 0.1 M MES 버퍼 (pH 5.6)에 넣고 25 도에서 80 rpm 으로 15ᅳ 24 시 간 정도 교반한 후, 증류수로 3-4 회 세척 한 후， 50 도에서 건조시 켜 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 임플란트 (젠타마이신-헤파린-티타늄 임플란트)를 제조하였다. 골형성 성장인자인 BMP-2 를 추가적으로 탑재하기위해， 50 ng/ιηΓ농도의 BMP- 2 가 포함된 αΐ M MES 버퍼 (pH 5.6)에 젠타마이신이 고정 된 헤파린—티타늄 임플란트를 넣고， 밤새도록 교반한 후， 3-4 회 증류수로 세척 한 후， 건조하여， 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린-티 타늄 임플란트를 얻었다.
비교예 1. 티타늄 임플란트 표면처 리 되지 않은 티타늄 임플란트.
비교예 2. 헤파린-티타늄 임플란트 제조
임플란트의 티타늄 표면을 개질하기 전에， 티타늄 임플란트를 에 탄올 용액에 넣어 1 시간 정도 초음파 세척을 한 후, 약 24 시간 동안 50 도에서 건조시 켰다. 그 후， 티타늄 임플란트를 상기 제조예 1 에서 제조한 헤파린-도파민 복합체가 5 mg/ml 의 농도로 용해되어 있는 10 mM Tris 버퍼 (pH 8.0)에 넣고， 빛을 차단한 후 밤새도록 교반한 뒤에， 헤파린-도파민 복합체로 표면이 개질된 티타늄 임플란트 (헤파린-티타늄 임플란트)를 증류수로 3-4 회 세척 한 후 질소가스를 흘려주면서 건조시켜 헤파린ᅳ도파민 복합체로 표면이 개질된 티타늄 임플란트를 제조하였다.
비교예 3· 젠타마이신이 고정화된 헤파린-티타늄 임플란트 제조
헤파린—도파민 복합체로 표면이 개질된 티타늄 임플란트에 BMP-2 를 고정화시 키는 단계를 제외 한 것 이외 에는 실시 예 1 과 동일한 방법으로 젠타마이신이 고정 된 헤파린-티타늄 임플란트 (젠타마이신ᅳ헤파린-티타늄 임플란트)를 제조하였다.
비교예 4. BMP-2 가 고정화된 헤파린-티타늄 임플란트 제조
헤파린-도파민 복합체로 표면이 개질된 티타늄 임플란트에 젠타마이신만을 고정화시 킨 것을 제외 한 것 이외에는 실시 예 1 과 동일한 방법으로 BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 임플란트 (젠타마이신ᅳ헤파린-티타늄 임플란트)를 제조하였다.
실험예 1.
상기 제조된 실시 예 1 의 임플란트의 활성화된 티타늄 표면에 헤파린， 젠타마이신 및 BMP-2 를 탑재한 기능화된 티타늄 임플란트와 비교예 1 내지 4 의 티타늄 임플란트들의 표면을 주사전자현미경으로 관찰한 결과， 도 2 에서 보여주듯이 모두 비슷한 표면 형상이 나타났다. 비교예 1 의 티 타늄 임플란트와 기능화된 티타늄 임플란트 (실시 예 1 및 비 교예 2 내지 3)를 X-선 광전자 분광기를 이용해 표면 원소 분석을 한 ^과, 도 3 에 나타내었다. 도 3 에서 보여주듯이， 개질되지 않은 티타늄 임플란트 (비교예 1)와 비교하여 헤파린- 티타늄 임플란트에서 3.63%의 질소 성분의 증가와 20.49%의 산소 성분의 감소를 확인함으로써 헤파린이 티타늄 임플란트 표면에 성공적으로 개질이 되 었음을 확인하였다. 또한， 헤파린-티 ^늄 임플란트 (비교예 2)와 비교하여， 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 임플란트 (비교예 3), BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 임플란트 (비교예 4)， 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린 티타늄 임플란트 (실시 예 1)는 탄소 성분 감소와 질소 성 분이 증가된 것으로 젠타마이신과 BMP-2 가 성공적으로 탑재가 되었음을 확인하였다. 하기의 표 2 는 티타늄과 기능화된 티타늄의 표면 원소 분석 결과를 보여주고 있다.
【표 2】
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
GS: Gentamicin sulfate
Hep: heparin 실험예 2. 기능화된 티타늄에서 젠타마이신 또는 BMP-2 의 약물 방출 거동
ᅳ 기능화된 티타늄 임플란트인, 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 임플란트 (비교예 3)， BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 임플란트 (비교예 4)， 젠타마이신 /BMP—2 가 고정된 헤파린—티타늄 임플란트 (실시예 1)로부터 젠타마이신 또는 BMP-2 의 방출 거동을 분석하기 위해， 각 기능화된 티타늄 임플란트를 1 ml 의 PBS 버퍼 (pH 7.4)에 넣고 37도에서 100 rpm으로 교반을 하였다. 각 정해진 시간인 1， 3, 5, 10 시간과 1， 3， 5， 7， 14, 21, 28일 간격으로 측정하였다. 새로운 버퍼로 교환을 해 주었다. 방출된 젠타마이신은 적외선 및 가시광선 분광분석기 (DU-530, Beckman Coulter™, 미국)를 이용하여 257 nm 에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며， 방출된 BMP-2 는 ELISA 키트 (Human BMP-2 Mini ELISA Development Kit(900-M255), Peprotech, 미국) 를 이용하여 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며ᅳ 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4 에서 보여주듯이， 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 3)， BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4)， 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린—티타늄 (실시예 1)으로부터 젠타마이신 또는 BMP— 2 는 초반 1 일 동안에 약간 빠르게 방출되기는 하였으나, 그 이후로 4 주 동안 지속적으로 방출이 되는 것으로 나타났다.
실험예 3. 기능화된 티타늄의 항균효능
티타늄 (비교예 1)과 기능화된 티타늄인 젠타마이신이 고정된 헤파린- 티타늄 (비교예 3)， BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4)， 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (실시예 1)의 항균효과를 검증하기위해， 각각의 티타늄을 박테리아 배양액인 TSB (Tryptic Soy Broth)에 넣은 후， 1 x 106개의 황색포도알균 (5 /? 2y/o ci/s aureus) 박테리아 세포를 넣고 37 도에서 지속적으로 교반하였다. 배양 후 6 시간， 12 시간， 24 시간 후에 각각 배양액의 흡광도를 600 nm 에서 측정하여 각 티타늄의 항균효능을 분석하였으며， 그 결과를 도 5 에 나타내었다. 도 5 에서 보여주듯이， 티타늄 (비교예 1)과 BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 4)은 황색포도알균 C a/?/?^ococc s aureus)^ 성장을 억제하지 못하였으나， 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 3)과 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (실시예 1)은 박테리아의 성장을 매우 효과적으로 억제하였다.
실험예 4. 티타늄과 기능화된 티타늄의 세포독성 평가 티타늄 (비교예 1)과 기능화된 티타늄인 헤파린-티타늄 (비교예 2)， 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄 (비교예 3)， BMP-2 가 고정된 헤파린- 티타늄 (비교예 4)， 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (실시 예 1)의 조골세포에 대한 세포독성을 평가하기위해， 각각의 티타늄을 세포배양액에 넣고 37 도에서 24 시 간 배양하여 추출배양액을 얻었다. 한편， 조골세포인 MG63 세포 1 104 개를 96—well 플레이트에 넣고 37 도에서 24 시간 배양하였다. 배양된 조골세포의 배양액을 제거하고 PBS 버퍼로 세척 한 후， 추출배양액을 첨가한 후 조골세포를 24 시간， 48 시간 배양한 후， 추출배양액을 제거하였다. 세포독성은 CCK-8 증식 키트 시 약을 첨가하여 37 도에서 1 시 간을 더 배양한 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 도 6 에 나타난 바와 같이， 티타늄 및 기능화된 티 타늄들은 모두 48 시간 배양후에도 95%이상의 세포생존율을 보여주었으며 , 이 결과는 티타늄 및 기능화된 티타늄 모두 조골세포에 대한 세포독성 이 없음을 의미 한다.
실험예 5. 티타늄과 기능화된 티타늄의 Live/Dead 분석
티타늄과 기능화된 티 타늄인 헤파린-티 타늄， 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄， BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄， 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린ᅳ티타늄의 조골세포에 대 한 Live/dead 분석 평가를 위 해， 각 티타늄을 48 well-플레이트에 넣고 5 X 104 개의 조골세포를 조심스럽 게 각각 티타늄 표면에 넣은 후 48 시간을 배양하였다. 48 시 간 배양 후， PBS 버퍼로 3-4 회 세척 한 후 live/dead 염 색약 (Calcein, Ethidium homodimer- 1 시 약， L3224(Live/DEAD Viability/ Cytotoxicity Kit for mammalian cells), Molecular ProbesTM, 미국)을 넣고 30 분간 배양한 후， 공초점 레이져 주사 현미경으로 분석 하였다. 티타늄 및 기능화된 티타늄의 모든 그룹에서 조골세포가 매우 건강하게 티타늄 표면에 부착되 어서 잘 자라고 있음을 확인하였다 (도 7).
실험예 6. 티타늄과 기능화된 티타늄의 세포증식
티타늄과 기능화된 티 타늄인 헤파린-티타늄， 젠타마이신이 고정된 헤파린-티타늄， BMP— 2 가 고정 된 헤파린—티타늄， 젠타마이신 /BMP-2 가 고정 된 헤파린-티타늄의 조골세포에 대한 세포증식을 평가하기위해， 1 X 105 개의 조골세포를 각각의 티타늄에 조심스럽 게 넣고 1 일， 3 일， 7 일을 배양한 후， 세포를 PBS 버퍼로 세척하였다. 세척 후, CCK-8 증식 키트 시 약 (Tetrazolium salt 시 약， Cell Counting kit-8, Dojindo, 미국)을 넣고 1 시간 배양한 후에， 배양액을 96 well 플레이트에 조심스럽 게 옮긴 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 티 타늄 및 기능화된 티타늄 표면 위에서 배양된 조골세포는 1 일， 3 일， 7 일 후에 점차적으로 세포가 활발하게 증식 이 되 었으며 (도 8)， 각 그룹간의 세포증식에 대한 차이는 없는 것으로 확인되 었다. 실험예 7. 티타늄과 기능화된 티타늄의 알칼리성 포스파타제 활성도 조골세포의 초기분화 마커 인 알칼리성 포스파타제 활성도를 측정 분석 함으로서 티 타늄과 기능화된 티타늄들의 골융합 효능을 평가하였다. 1 X 105 개의 조골세포를 각각의 티타늄 위에 조심스럽 게 넣고 7 일 , 14 일, 21 일을 배양한다. 배양 후, 세포를 PBS 버 퍼로 세척 한 뒤， 1XRIPA 버 퍼를 세포에 넣어 0°C에서 110 와트로 1 분동안 초음파를 가한다. 용해된 세포를 4 도에서 3 분 동안 13，500 rpm 으로 원심분리 하였다. 원심분리 후， 상층액을 p- 니트로페닐포스파테이트 용액과 37 도에서 30 분 동안 배양한 후， 500 ^의 1 N NaOH 로 반웅을 종결시 킨 후, 405 nm 에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 도 9 에 나타내었다. 도 9 에서 보듯이， 티 타늄， 헤파린-티타늄， 젠타마이신이 고정 된 헤파린ᅳ티타늄은 조골세포에 대한 알칼리성 포스파타제 활성도가 비슷하였으며， 전혀 차이를 보이지 않았다. 또한， BMP-2 가 고정된 헤파린-티 타늄과 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄도 서로 알칼리성 포스파타제 활성도가 비슷하였다. 그러나 BMP-2 가 고정 된 헤파린-티타늄 (비교예 4)과 젠타마이신 /BMP-2 가 고정 된 헤파린-티타늄 (실시 예 1)은 티타늄 (비교예 1)， 헤파린ᅳ티타늄 (비교예 2) 및 젠타마이신이 고정 된 헤파린-티 타늄 (비교예 3)과 비교하여 현저하게 높은 알칼리성 포스파타제 활성도를 나타내었다.
실험예 8. 티타늄과 기능화된 티타늄의 칼슘 침착
조골세포의 후기 분화 마커 인 칼슘침 착을 측정 분석 함으로서 실시 예 1 및 비교예 1 내지 4 티 타늄의 골융합 효능을 평가하였다. 1 X 105 개의 조골세포를 각각의 티타늄 위에 조심스럽 게 넣고 21 일 동안 배양한다. 배양 후， 세포를 PBS 버퍼로 세척 한 뒤 각각의 티타늄 표면으로부터 세포를 조심스럽 게 긁어 낸다. 긁어 낸 세포를 1 분간 13，500 rpm 으로 원심분리 한 뒤， 0.1% 트리톤 X-100 용액을 세포에 넣었다. 세포의 막을 분쇄시 키 기 위해 0 도에서 약 1 분 동안 초음파를 가한 후， 원심분리를 한다. 상층액을 분리하여 QuantiChrom™ Calcium Assay 키트를 이용하여 612 nm 에서 흡광도를 측정 비교하여 칼슘 침 착 정도를 분석하였다. 도 10 에서 보여주듯이， 티타늄 (비교예 1), 헤파린-티타늄 (비교예 2)， 젠타마이신이 고정된 헤파린-티 타늄 (비교예 3)의 칼슴침 착 정도가 비슷하였으며 통계학적으로도 큰 차이를 보이지 않았다. 또한， BMP-2 가 고정된 헤파린- 티타늄 (비교예 4)과 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 (실시 예 1)도 서로 칼슘침착 정도가 비슷하였다. 그러 나， BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄과 젠타마이신 /BMP-2 가 고정 된 헤파린-티타늄은 티타늄, 헤파린-티타늄, 젠타마이신이 고정된 헤파린 -티타늄들과 비교하여 현저하게 높은 칼슘 침착 정도를 나타내었다.
따라서 상기 실험 예에 나타난 바와 같이 임플란트의 티타늄 표면을 개질하여 항생제 및 골형성 촉진물질을 고정화시 킨 기능성 임플란트인， 실시 예 1 의 젠타마이신 /BMP-2 가 고정된 헤파린-티타늄 임플란트가 비교예에 비하여 박테리아 감염을 방지할 뿐만 아니 라 골융합 및 골형성 효능에도 우수한 효과를 가지는 것으로 나타났다.
실시예 2. PCL/PLGA 스캐폴드 표면에 BMP-2 의 고정화
PCL/PLGA 스캐폴드의 표면을 개질하기 전에， 스캐폴드를 에탄올 용액에 넣어 1 시간 정도 초음파 세척을 한 후， 약 24 시 간 동안 50 도에서 건조시 켰다. 그 후， PCL/PLGA 스캐폴드를 상기 제조예 1 에서 제조한 해파린-도파민 복합체가 5 mg/ml 의 농도로 용해되어 있는 10 mM Tris 버퍼 (pH 8.0)에 넣고， 빛을 차단한 후 밤새도록 교반한 뒤에， 헤파린 -도파민 복합체로 표면이 개질된 PCL/PLGA 스캐폴드 (헤파린-도파민 -PCL/PLGA 스캐폴드)를 증류수로 3-4 회 세척 한 후 질소가스를 흘려주면서 ^ 건조시 켜 헤파린-도파민 복합체로 표면이 개질된 PCL/PLGA 스캐폴드를 제조하였다. 골형성 성 장인자인 BMP-2 를 탑재하기 위해， 50 ng/ml 농도의 BMP-2 가 포함된 0.1 M MES 버퍼 (pH 5.6)에 헤파린ᅳ도파민 복합체로 표면이 개질된 PCL/PLGA 스캐폴드를 넣고， 밤새도록 교반한 후， 3-4 회 증류수로 세척 한 후, 건조하여， BMP— 2 가 고정된 헤파린- 도파민 -PCL/PLGA 스캐폴드를 얻었다.
실험예 9, PCL/PLGA와 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드의 표면 관찰 상기 제조된 실시 예 1 의 스캐 ^드의 활성화된 PCL/PLGA 스캐폴드 표면에 헤파린 및 헤파린-도파민 스캐폴드에 BMP-2 를 탑재한 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드를 주사전자현미 경으로 관찰한 결과， 도 11 에서 보여주듯이 헤파린 처 리 BMP-2 탑재 PCL/PLGA 스캐폴드는 표면이 거 칠고 헤파린-도파민 BMP-2 탑재 PCL/PLGA 스캐폴드는 표면이 매끄러운 형상이 나타났다. 이는 헤파린ᅳ도파민 복합체 스캐폴드가 BMP-2 탑재에 적합함을 나타낸다.
실험예 10. PCL/PLGA와 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드의 세포독성 평가 PCL/PLGA 와 BMP-2 고정된 헤파린 -PCL/PLGA, BMP-2 고정된 헤파린ᅳ도파민 -PCL/PLGA 스캐폴드의 조골세포에 대한 세포독성을 평가하기 위해， 각각의 스캐폴드를 세포배양액에 넣고 37 도에서 24 시 간 배양하여 ^출배양액을 얻었다. 한편, 조골세포인 MG63 세포 1 X 104 개를 96-well 플레이트에 넣고 37 도에서 24 시간 배양하였다. 배양된 조골세포의 배양액을 제거하고 PBS 버 퍼로 세척 한 후， 추출배양액을 첨 가한 후 조골세포를 24 시 간, 48 시 간 배양한 후， 추출배양액을 제거 하였다. 세포독성은 CCK— 8 증식 키트 시 약을 첨가하여 37 도에서 1 시간을 더 배양한 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 도 12 에 나타난 바와 같이 , PCL/PLGA 및 기 능화된 PCL/PLGA 스캐폴드들은 모두 48 시 간 배양 후에도 90%이상의 세포생존율을 보여주었으며， 이 결과는 PCL/PLGA 및 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드 모두 조골세포에 대한 세포독성 이 없음을 의 미 한다.
실험예 11. PCL/PLGA와 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드의 세포증식
PCL/PLGA 와 BMP-2 담지 PCL/PLGA 인 헤파린 -PCL/PLGA, BMP— 2 가 고정된 헤파린-도파민— PCL/PLGA 스캐폴드의 조골세포에 대한 세포증식을 평가하기 위해， 1 X 105 개의 조골세포를 각각의 스캐폴드에 조심스럽 게 넣고 1 일 , 3 일， 7 일을 배양한 후， 세포를 PBS 버퍼로 세척 하였다. 세척 후, CCK-8 증식 키트 시 약 (Tetrazolium salt 시 약， Cell Counting kitᅳ 8, Dojindo, 미국)을 넣고 1 시간 배양한 후에， 배양액을 96 well 플레이트에 조심스럽 게 옮긴 후 450 nm 에서 흡광도를 측정하였다. PCL/PLGA 및 기능화된 PCL/PLGA 위에서 배양된 조골세포는 1 일 3 일， 7 일 후에 점차적으로 세포가 활발하게 증식 이 되 었으며 (도 13)， 각 그룹간의 세포증식에 대한 차이는 7 일에 BMP-2 가 고정된 헤파린-도파민 -PCL/PLGA 스캐폴드가 유효성 있게 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 12. PCL/PLGA 과 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드의 알칼리성 포스파타제 활성도 조골세포의 초기분화 마커 인 알칼리성 포스파타제 활성도를 측정 분석함으로서 PCL/PLGA 와 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드들의 골융합 효능을 평가하였다. 1 X 105 개의 조골세포를 각각의 PCL/PLGA 위에 조심스럽 게 넣고 3 일， 10 일， 14 일을 배양한다. 배양 후， 세포를 PBS 버퍼로 세척 한 뒤， 1XRIPA 버퍼를 세포에 넣어 0°C에서 110 와트로 1 분 동안 초음파를 가하였다. 용해된 세포를 4 도에서 3 분 동안 13,500 rpm 으로 원심분리하였다. 원심분리 후， 상층액을 P-니트로페닐포스파테이트 용액과 37 도에서 30 분 동안 배양한 후， 500 ^의 1 N NaOH 로 반웅을 종결시 킨 후， 405 nm 에서 흡광도를 측정하였으며 그 결과를 도 14 에 나타내었다. 도 14 에서 보듯이， PCL/PLGA, BMP-2 담지 헤파린ᅳ PCL/PLGA 스캐폴드는 조골세포에 대한 알칼리성 포스파타제 활성도가 비슷하였으며， 전혀 차이를 보이지 않았다. 그러나 BMP- 2 가 고정된 헤파린-도파민 -PCL/PLGA 스캐폴드는 PCL/PLGA 스캐폴드와 비교하여 현저하게 높은 알칼리성 포스파타제 활성도를 나타내었다.
실험예 13. PCL/PLGA과 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드의 칼슘 침착 조골세포의 후기 분화 마커 인 칼슘침착을 측정 분석함으로서 PCL/PLGA 및 BMP-2 가 고정된 헤파린ᅳ도파민 -PCL/PLGA 스캐폴드의 골융합 효능을 평가하였다. 1 X 105 개의 조골세포를 각각의 스캐폴드 위 에 조심스럽 게 넣고 21 일 동안 배양하였다. 배양 후， 세포를 PBS 버퍼로 세척 한 뒤 Tris-EDTA 용액으로 각각의 스캐폴드로부터 세포를 조심스럽 게 떼어내었다. 떼어 낸 세포를 1 분간 13,500 rpm 으로 원심 분리 한 뒤 ᅳ 0.1% 트리톤 X-100 용액을 세포에 넣었다. 세포의 막을 분쇄시 키 기 위 해 0 도에서 약 1 분 동안 초음파를 가한 후， 원심분리를 하였다. 상층액을 분리하여 QuantiChrom TM Calcium Assay 키트를 이용하여 612nm 에서 흡광도를 측정 비 교하여 칼슘 침 착 정도를 분석하였다. 도 15 에서 보여주듯이， PCL/PLGA, BMP-2 담지 헤파린 -PCL/PLGA 스캐폴드의 칼슘침착 정도가 비슷하였으며 통계학적으로도 큰 차이를 보이지 않았다. 그러나， BMP-2 가 고정된 헤파린-도파민 -PCL/PLGA 스캐폴드는 PCL/PLGA 스캐폴드와 비교하여 현저하게 높은 칼슘 침착 정도를 나타내었다.
실험예 14. 조직학 및 조직형태학적 분석
쥐 경골 (tibia)에 8 mm 골결손 (bone defect) 부분에 이식된 각각의 스캐폴드를 X-ray 촬영 후, 각 시료의 절반을 조직 학 및 조직 형 태학적 분석을 위해 처 리하였다. 각 조직은 10% buffered formaldehyde 에 고정 하였으며 , 10% formic acid 로 탈회하였다. 시상봉합에 직각으로 골결손부의 적도를 포함하여 양부위를 trimming 한 후 파라핀에 포매하였다. 블록을 6 ym 두께로 절단한 후 hematoxylin and eosin (H&E) 과 Masson's trichrome (MT) 염 색을 하였다. 조직학적 소견상 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드 군의 경우， 이물반응과 염증이 적으며 8 주로 갈수록 골형성 이 빨리 진행되 었고， 수술후 회복과 골재생이 잘되는 양상이 관찰되 었다. PCL/PLGA 스캐폴드의 경우， 초기에 이물반웅과 염증반웅이 심하며， 8 주로 갈수록 줄어드는 양상을 보였고， 아직 스캐폴드가 잔존함이 관찰되 ^다 (도 16). 조직 형 태학적 분석에서 8 주차에는 기능화된 PCL/PLGA 스캐폴드이 PCL/PLGA 스캐폴드에 비해 유의 하게 높았다 (Ρ<α001). 골형성 양이 8 주차에서 BMP— 2 가 탑재된 헤파린-도파민 PCL-PLGA 스캐폴드 군이 다른 군보다 80% 이상의 높은 수치를 보였다 (도 17).
따라서 상기 실험 예에 나타난 바와 같이 PCL/PLGA 스캐폴드 표면을 개질하여 골형성 촉진물질을 고정화시 킨 기능성 스캐폴드인， 실시 예 2 의 BMP- 2 가 고정된 헤파린-도파민 PCL/PLGA 스캐폴드가 골융합 및 골형성 효능에도 우수한 효과를 가지는 것으로 나타났다.

Claims

청구의 범위
【청구항 1】
고 자 - 카테콜 작 기를 함유하는 화합물의 복합체를 이용하여 표면을 개질한 임플란트 또는 스캐폴드로서 ,
상기 임플란트 또는 스캐폴드는 항생제 및 골형성 촉진물질 중에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상을 포함하는 것을 특징 으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 2】
청구항 1 에 있어서， 상기 고분자는 생체적합성 고분자로， 헤파린 (Heparin), 헤파란설페이트 (Heparan sulfate), 히 알루론산 (Hyaluronic acid), 알지 네이트 (Alginate), 폴리아스파틱산 [Poly(aspartic acid)] , 폴리아크릴산 [Poly(acrylic acid)] , 폴리글루타믹산 [Poly(glutamic acid)] , 카르복시 메틸셀를로오스 (Carboxymethyl cellulose), 젤라틴 (Gelatin), 콜라젠 (Collagen), 키토산 (Chitosan) 및 그의 유도체， 글라이콜키토산 (Glycol chitosan), 플리 -L-라이신 (P이 y—Lᅳ lysine), 폴리 에틸렌이민 (Polyethyleneimine), 세대 수 1 내지 5 의 말단에 아민 그룹의 작용기를 갖는 덴드리 머 (Dendrimer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 또는 2 종 이상인 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 3】
청구항 1 에 있어서， 상기 카테콜 작용기를 함유하는 화합물은 3，4- 다이하이드록시페닐알라닌 (L-3,4ᅳ dihydroxyphenylalanine), 도파민 (Dopamine), 3，4-다이하이드톡시 벨질아민 (3,4-dihydroxybenzylamine),
노르에피 네피 린 (norepinephirine)， 3 , 4 -다이하이드록시 벤즈알데히드 (3 , 4， - dihydroxybenzaldehyde), 3,4一다이하이드록시 벤조익산 (3,4—dihydroxybenzoic acid), 카페익산 (Caffeic acid), 3,4ᅳ다이하이드록시 ᅳ페닐아세틱산 (3,4— Dihydroxyphenylacetic acid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 4】
청구항 1 에 있어서， 상기 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체는 생체적합성 고분자의 아민그룹 또는 카르복시그룹의 작용기 ; 및
카테콜 작용기를 포함하는 화합물의 아민그룹， 카르복시그룹 또는 알데히드 작용기에서 선택된 작용기와의 결합에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 5]
청구항 1 에 있어서， 상기 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체는 상기 고분자 1 중량부에 대하여 상기 카테콜 작용기를 함유하는 화합물 3 내지 25 중량부로 결합되는 것을 특징 으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 6】
청구항 1 에 있어서， 상기 항생제는 lng/ml 내지 200 mg/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 7】 청구항 1 에 있어서， 상기 항생제는 시소마이신 (Sisomicin), 리보스타마이신 (Ribostamycin)， 반코마이신 (Vancomycin) , 토브라마이신 (Tobramycin), 아즈트레오남 (Aztreonam), 젠타마이신 (Gentamicin), 세포티 암 (Cefotiam), 세프트리 악손 (Ceftriaxone), 네틸마이신 (Netilmicin), 시프로플록사신 (Ciprofloxacin), 신다마이신 (Cindamycin) 및 세포졸린 (Cefazolin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종이상인 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 8】
청구항 1 에 있어서， 상기 골 형성 촉진 물질은 단백질인 골 형성 성 장인자로，
골 형성 단백질 (bone morphogenic protein)인 BMP- l, BMPᅳ 2， BMPᅳ 3， BMP— 4, BMP-5, BMP-6, BMPᅳ 7, BMP-8a, BMP-8b, BMP- 10, BMP- 15 와 혈소판유래증식 인자 (Platelet derived growth factor; PDGF), 형 질전환성장인자베타 (Transforming growth factor beta; TGF-beta), 염 기성 섬유모세포생장인자 (basic fibroblast growth factor; bFGF), 인슐린유사성장인자 -Klnsulin like growth factor 1； IGF- 1), 락토페 린 (lactoferiri)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 또는 2 종이상인 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 9】
청구항 8 에 있어서， 상기 골 형성 성장인자는 1 pg/ml 내지 3 mg/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 10】
청구항 1 에 있어서 , 상기 골 형성 촉진 물질은 저분자량의 골형성 화합물로서 , 비스포스포네이트 약물계열인 알렌드로네이드 (alendronate), 리제드로네이트 (risedronate), 졸레드로네이트 (zoledronate), 에티드로네이트 (Etidronate), 클로드로네이트 (Clodronate), 틸루드로네이트 (Tiludronate), 파미드로네이트 (Pamidronate), 을파드로네 이트 (Olpadronate), 이바드로네 이트 (Ibadronate); 스태틴 약물 계열인 아트로바스타틴 (Atrovastatin), 플루바스타틴 (Fluvastatin), 로바스타틴 (Lovastatin), 피타바스타틴 (pitavastatin), 프라바스타틴 (pravastatin), 로수바스타틴 (rosuvastatin), 심바스타틴 (simastatin); 프로스타글란틴 E2 (Prostaglandin E2, PGE2), 신바로메틴 (shinbarometin), 파이로포스페이트 (pyrophosphate), 메드로네 이트 (medronate), 옥시드로네이트 (oxidronate) 및 옥시스테롤 (Oxysterol)로 이루어진 군으로 선택되는 1 종 또는 2 종이상인 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 11】
청구항 10 에 있어서， 상기 저분자량의 골형성 화합물은 1 므 g/ml 내지 500 mg/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 12】
청구항 1 에 있어서， 상기 임플란트 또는 스캐폴드의 표면은 타늄 또는 티타늄 합금으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐플드.
【청구항 13]
ᅳ 청구항 1 에 있어서， 상기 임플란트 또는 스캐폴드의 표면은 폴리카프로락톤 (PCL); 폴리유산 (polylactic acids, PLA), 폴리글리콜산 (polyglycolic acid) 또는 이들의 공중합체인 PLGA; 폴리리드록시부티 레이트-코 -발레 레이트 (PHBV), 폴리비 닐알콜 (PVA), 폴리부틸렌 숙시 네 이트 (PBS) 및 폴리필렌 글리콜산 (PG)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 또는 2 종 이상으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 14]
청구항 1 에 있어서， 상기 임플란트 또는 스캐폴드는 치 과용 또는 정 형외과용인 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 15】
청구항 14 ᅳ에 있어서 , 상기 ᅳ 치과용 임플란트 또는 스캐폴드는 고정 (Fixture)형 임플란트 또는 스캐폴드， 또는 멤브레인 (Membrane) 형 임플란트 또는 스캐폴드인 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐플드.
【청구항 16】
청구항 14 에 있어서， 상기 정 형의과용 임플란트 또는 스캐폴드는 고관절, 슬관절， 족관절， 견관절 또는 주관절을 포함하는 인공관절이나， 척추영 역 인공디스크를 포함하는 인공삽입물; 및
골절치료에 사용되는 금속나사， 금속판 또는 금속정을 포함하는 고정물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드.
【청구항 17】
(a) 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체를 -제조하는 단계 ;
(b) 상기 (a)단계에서 제조된 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체를 이용하여 임플란트 또는 스캐폴드의 표면을 개질시 켜， 표면을 활성화시 키는 단계 ;
(c) 상기 (b)단계에서 제조된 표면 활성화된 임플란트 또는 스캐폴드를 항생제가 포함된 용액에 침지 한 후， 20 ~ 25 °C에서 4 내지 24 시 간 동안 교반하여， 항생제를 임플란트 또는 스캐폴드의 표면에 고정화시 키는 단계 ; 및
(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 항생제가 표면에 고정화된 임플란트 또는 스캐폴드를 골 형성 촉진 물질이 포함된 용액에 침지 한 후， 20 ~ 25 °C에서 4 내지 24 시 간 동안 교반하여 , 항생제 /골 형성 촉진 물질을 임플란트 또는 스캐폴드 표면에 고정화시 키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드의 제조방법 .
【청구항 181
청구항 17 에 있어서， 상기 (a)단계의 고분자 - 카테콜 작용기를 함유하는 화합물의 복합체는 생체적합성 고분자의 아민그룹 또는 카르복시그룹의 작용기 ; 카테콜 작용기를 포함하는 화합물의 아민그룹， 카르복시그룹 또는 알데히드 작용기 에서 선택된 작용기와의 결합에 의하여 형성되는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드의 제조방법 . 【청구항 19]
청구항 17 에 있어서， 상기 임플란트 또는 스캐폴드의 제조 방법의 (C)단계 및 (d)단계는 pH 5 내지 6.5 의 범위의 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 임플란트 또는 스캐폴드의 제조방법 .
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