WO2012128464A1 - 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 - Google Patents

언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2012128464A1
WO2012128464A1 PCT/KR2012/000697 KR2012000697W WO2012128464A1 WO 2012128464 A1 WO2012128464 A1 WO 2012128464A1 KR 2012000697 W KR2012000697 W KR 2012000697W WO 2012128464 A1 WO2012128464 A1 WO 2012128464A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
undecenoyl
ome
examples
group
melanin
Prior art date
Application number
PCT/KR2012/000697
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이윤섭
최하영
Original Assignee
미원상사주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 미원상사주식회사 filed Critical 미원상사주식회사
Publication of WO2012128464A1 publication Critical patent/WO2012128464A1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06043—Leu-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06156—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Trp-amino acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to an undecenoyl dipeptide derivative and a cosmetic composition for skin whitening comprising the same, and more particularly, acts as an antagonist of MC1R, an alpha melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH) receptor, leading to skin blackening. It binds to its receptor, MC1R, through competitive binding with its alpha melanocyte stimulating hormone, which blocks melanin synthesis pathways and effectively blocks inflammation-related signaling pathways, resulting in undecenoyl depeptides with excellent skin whitening and anti-inflammatory effects. It relates to a derivative and a cosmetic composition for skin whitening comprising the same.
  • Melanin is produced in the melanocytes (Melanosome), which are organelles that exist in cells called melanocytes (Melanocytes) in the basement layer of the skin. The amount is determined. The production of melanin is determined by genetic factors such as congenital factors, female hormones, drugs, pregnancy, ultraviolet rays, stress, etc., which are most influenced by UV rays. Melanin absorbs the light energy of ultraviolet rays and protects cells from damage caused by ultraviolet rays. When abnormally low melanin is produced, skin lesions such as vitiligo are caused, and excessive production causes damage to the skin as well as the formation of blemishes and freckles, and even skin cancer.
  • melanocytes melanocytes
  • UV rays ultraviolet rays
  • the skin of modern man is damaged by exposure to environmental pollution, external stimuli such as ultraviolet rays and stress.
  • external stimuli such as ultraviolet rays and stress.
  • the damaged skin has a slow recovery rate, wrinkles, decreased elasticity and skin pigmentation.
  • the expectation for the whitening effect is very high, and various cosmetics have been developed to reduce the color of melanin already produced or to suppress the production of new melanin.
  • melanocyte stimulating hormone ⁇ -MSH
  • endothelin-1 endothelin-1
  • ⁇ -MSH When the ⁇ -MSH binds to the melanocortin-1 receptor (MC1R), which is an ⁇ -MSH receptor present in the melanocyte membranes, by stimulating melanin forming cells such as ultraviolet rays, hormones, and drugs, the stimulated MC1R Activates an enzyme called adenylate cyclase, which increases cyclic adenosine monophosphate (cAMP) in the cell and causes a series of processes of melanin biosynthesis to occur continuously by increased cAMP. do. cAMP sequentially activates protein kinase A (PKA) and CREB transcription factors to promote expression of MITF (Microphthalmia associated transcription factor), a precursor of ⁇ -MSH.
  • M1R melanocortin-1 receptor
  • MITF causes transcriptional activity of melanin synthesis-related genes such as tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP1) and dopachrome tautomerase (DCT), tyrosine in melanocytes (tyrosine) in the melanocytes (tyrosinase; Important enzyme) is converted into dopa (DOPA; 3,4-dihydroxyphenylalanine) and dopaquinone.
  • TRP1 tyrosinase related protein 1
  • DCT dopachrome tautomerase
  • Endothelin-1 is also increased by stimulation of ultraviolet rays, hormones, drugs, and the like, and binds to endothelin B type receptor (ETbR) present in melanocyte membranes.
  • Phospholipase C (PLC) stimulated by ETbR is used to convert phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP 2 ) present in the cell membrane into diacyl glycerol (DAG) and inositol. Decompose with 1,4,5-trisphosphate (inositol 1,4,5-trisphosphate: IP 3 ).
  • IP 3 binds to the IP 3 receptors of the endoplasmic reticulum, opening up the calcium channel of the endoplasmic reticulum, and increasing the calcium concentration in the cytoplasm is involved in melanin synthesis through several chain reactions in the cell.
  • PKC Protein kinase C
  • Endoderin activates PKA, as well as PKC, through cAMP stimulation. It is known that melanogenesis occurs through the cross-talk of these two kinase enzymes.
  • Endothelin-1 / ETbR signaling is also synergistic with SCF / c-KIT, another pathway involved in melanin synthesis, increasing tyrosinase expression, leading to skin blackening.
  • pheomelanin phemelanin (red melanin) is formed), or through enzymatic reactions such as TRP1, DCT, eumelanin (eumelanin (melanin, black or brown melanin) is formed.
  • the produced melanin is transferred from the melanocytes to the keratinocytes (keratinocytes), which form the epidermis, through the melanosomes, and is deposited on the skin when overproduced according to the amount of melanin produced in this process. It will cause freckles and skin blackening.
  • a substance having a tyrosinase inhibitory activity such as arbutin, ascorbic acid, kojic acid, glutathione, and the like is added to the cosmetic to give a skin whitening effect, It has improved skin hyperpigmentation such as blemishes and freckles.
  • kojic acid effectively inhibits enzymatic activity by adsorbing copper ions present in the active site of tyrosinase, but it is unstable when blended into cosmetics and causes skin troubles.
  • Ascorbic acid and its derivatives have a poor skin penetration. It is difficult, and its efficacy is poor when used as a cosmetic raw material because of the oxidation instability.
  • Hydroquinone causes allergies, high cytotoxicity and irritation and is limited in each country.
  • Arbutin is a derivative in which glucopyranoside is bound to hydroquinone, which has been widely used because it has no side effects of hydroquinone, and has been spotlighted, but it is decomposed by skin enzymes. That is, the existing whitening raw materials are severe skin irritation or toxic, the product stability is not good, the skin penetration is not good, the whitening effect is insignificant, there is a limit in use.
  • ETbR stimulation Another cause of melanin biosynthesis is ETbR stimulation.
  • endodelin-1 When endodelin-1 is secreted by ultraviolet rays, it promotes the secretion of various inflammation-related cytokines (Cytokine) as well as skin blackening caused by ETbR stimulation.
  • the endothelin-1 / ETbR stimulatory signal stimulates the secretion of cytokines such as IL-1a, IL-1b, COX-1, COX-2, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , and PEG2, causing UV-inflammation.
  • N-cadherin (M-Cherin) MMP-1, MMP-2, MMP-9, Integrin (Integrin) to increase the expression of cancer cells to help metastasis.
  • the development of ETbR antagonists will have the function of inhibiting the skin inflammatory response caused by ultraviolet light and protect skin cells from skin cancer.
  • the whitening effect is excellent, as well as stabilizing the damaged skin due to ultraviolet rays, excellent skin permeability or stability, bio-friendly development of a non-toxic raw material has emerged as an important key.
  • the present inventors focused on MC1R, which plays the most important role in skin pigmentation process, and synthesized an antagonist of MC1R, and thus the undecylenoyl dipeptide derivatives according to the present invention was applied to skin blackening caused by MC1R.
  • the inhibitory effect was demonstrated to be very good, the signal transduction process was elucidated, and ETbR blackening stimulation was also demonstrated to be inhibited through MC1R-dependent cross-reaction.
  • ETbR blackening stimulation was also demonstrated to be inhibited through MC1R-dependent cross-reaction.
  • Undecenoyl dipeptide derivatives used in the present invention are arbutin, kojic acid, which is widely used as a whitening test material, and DermaPep TM UL (patent application number PCT / KR2010 / 006387, INCI name: Methyl Undecenoyl)
  • the whitening effect was better than that of Leucinate.
  • the present inventors have developed a functional whitening material with an anti-inflammatory effect and proved its efficacy.
  • an object of the present invention is to provide an undecenoyl dipeptide derivative which is harmless to the human body, has an excellent whitening effect and is accompanied by an anti-inflammatory effect, and has excellent skin permeability and stability, and a cosmetic composition for skin whitening containing the same.
  • the present invention provides an undecenoyl dipeptide derivative.
  • the undecenoyl dipeptide derivative according to the present invention is represented by the following Chemical Formula 1.
  • -C ( 0)-means carbonyl
  • a 1 , A 2 are amino acid residues selected from Leu, Phe, Trp and Gly, respectively, where Leu, Phe and Trp are L- Or a D-form or a mixture thereof
  • R is H, C 1 -C 18 alkyl, phenyl, or benzyl
  • the undecenoyl group is bonded to an amine group of A 1
  • OR is a carbon of A 2 To bind to a carbonyl group.
  • a 1 and A 2 are composed of L- or D-type or a mixed form of leucine, and R is preferably a methyl group, and more preferably, the undecenoyl dipeptide derivative is an undeceno.
  • L means l-type leucine
  • L means d-type leucine.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for skin whitening comprising the above-described undecenoyl dipeptide derivative as an active ingredient.
  • the undecenoyl dipeptide derivative is preferably 0.0001 to 10% by weight based on the total weight of the cosmetic composition for skin whitening.
  • the cosmetic composition for skin whitening may be made of any one formulation selected from the group consisting of lotions, creams, foundations, essences, gels, packs, foam cleansing, and soap.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for preventing inflammatory diseases associated with ultraviolet rays, comprising the above-described undecenoyl dipeptide derivative as an active ingredient.
  • the undecenoyl dipeptide derivative acts as an antagonist of MC1R, effectively inhibits the expression of genes in the lower stage, inhibits the activity of tyrosinase, and inhibits the major enzyme of melanogenesis. It has the effect of inhibiting melanin production by inhibiting expression.
  • the undecenoyl dipeptide derivative is an MC1R antagonist and shows inhibitory effect on ETbR stimulation.
  • the undecenoyl dipeptide derivatives use biocompatible amino acids, resulting in low cytotoxicity and no skin irritation.
  • the undecenoyl dipeptide derivative has a low molecular weight and high skin penetration due to the organic affinity of fatty acids.
  • the present invention provides an undecenoyl dipeptide derivative.
  • the undecenoyl dipeptide derivative according to the present invention is represented by the following Chemical Formula 1.
  • -C ( O)-means carbonyl
  • a 1 , A 2 are amino acid residues selected from Leu, Phe, Trp and Gly, respectively, where Leu, Phe and Trp are L- Or a D-form or a mixture thereof
  • R is H, C 1 -C 18 alkyl, phenyl, or benzyl
  • the undecenoyl group is bonded to an amine group of A 1
  • OR is a carbon of A 2 To bind to a carbonyl group.
  • the undecenoyl dipeptide derivative of the present invention can be used as an active ingredient of a cosmetic composition that inhibits the production of melanin in cells and gives a whitening effect on the skin. Since the undecenoyl dipeptide derivative of the present invention acts as an antagonist of MC1R, a lotion, cream, essence, gel, ointment, pack, stick, powder, and the like, such as skin lotion and milk lotion, are known by a known cosmetic preparation method. Whitening cosmetics can be prepared in the form, and pharmaceutically acceptable carriers, excipients, and diluents can be added to the quasi-drugs and external medicines without any side effects.
  • Undecenoyl dipeptide derivatives according to the present invention can be synthesized through solid phase synthesis or solution synthesis.
  • solid phase synthesis the N-terminus is protected and the reactive side chains are protected.
  • the protecting group for protecting the N-terminus 9-fluorenylmethyloxycarbonyl group (Fmoc) is generally used.
  • solution synthesis conventionally well-known synthesis methods can be used.
  • the undecenoyl dipeptide methyl ester can be synthesized using a synthetic route as in Scheme 1.
  • Undecenoyl chloride (Undecenoyl chloride) and the amino acid (A 1 -OH) in the KOH aqueous solution as shown in Scheme 1 above (1) can be obtained undecenoyl amino acid (Undecenoyl amino acid).
  • the carbonyl group of the undecenoyl chloride reacts with the amine group of the amino acid to bind, and OH of A 1 -OH is OH of the carboxyl group of the amino acid.
  • Coupling Reagents that can be used at this time can be used as a general coupling agent widely used in peptide synthesis, for example, dicyclohexyl carbodiimide (DCC), HBTU (N-[(1H- benzotriazol-1-yl) (dimethylamino) methylene] -N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide) or HATU (N-[(dimethylamino) -1-1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] pyridin- 1-yl-methylene] -N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide may be used, and HOAt (1-Hydroxy-7-Azabenzotriazole) or H
  • DCC dicyclohexyl carbodiimide
  • HBTU N-[(1H- benzotriazol-1-yl) (dimethylamino) methylene
  • the content of the undecenoyl dipeptide derivative contained in the preparation of the composition for skin whitening according to the present invention is preferably 0.0001 to 10% based on the total weight of the composition in consideration of the skin whitening effect and economical efficiency, and more preferably 0.002 1.0 wt%.
  • Examples 1 to 23 are applied in the present inventors DermaPep TM UL (Patent Application No. PCT / KR2010 / 006387), which is one of Leucine, Tryptophan, Phenylalanine, or Glycine. Synthesized in combination. Where L is Leucine, F is Phenylalanine, G is Glycine, and W is tryptophan, and these four amino acids are in vitro in consideration of the structure showing whitening efficacy through prior experiments of the present inventors. It was proved and selected through experimental system. OH at the peptide C-terminus represents a free acid group, OMe represents a methyl ester group, (d) represents a D-form amino acid, and an amino acid without such a designation is l- Type amino acids.
  • Examples 1 to 23 The whitening efficacy of the undecenoyl dipeptide compounds of Examples 1 to 23 was tested. Skin blackening is due to the production of melanin in the skin's melanocytes, which are released into the epidermis. Therefore, if the melanogenesis and the mechanism of melanocytes blocking the production of melanin, melanin is not produced and skin blackening does not appear. In addition, since Examples 1 to 23 will function as antagonists of MC1R, it was predicted that by binding to MC1R instead of ⁇ -MSH, it would inhibit the downstream signaling process of MC1R.
  • the undecenoyl dipeptide derivatives of Examples 1 to 23 were pretreated with melanin-producing cells, and treated with ⁇ -MSH, which artificially synthesizes melanin, to determine how much inhibition of skin blackening ability of ⁇ -MSH was detected. It was.
  • the whitening effect was measured by measuring the inhibitory effect on tyrosinase enzymes involved in the main stage of melanin synthesis. In the demonstration of efficacy of whitening raw materials, measuring the inhibition rate of melanin synthesis and tyrosinase enzyme activity in melanocytes is widely used as a basic experiment.
  • Mouse melanoma B16F10 cells were used as melanocytes. Cells were cultured at 37 ° C., 5% CO 2 ⁇ using 90% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, GibcoBRL, USA) medium mixed with 10% fetal bovine serum (FBS; Hyclone, Lagan, UT). Incubated at 95% atmosphere (Incubator; Thermo-scientific, USA). Penicillin G and streptomycin (Phenicilin G sodium, 100 units / L, streptomycin sulfate, 100 mg / L; GibcoBRL, USA) were used as antibiotics.
  • DMEM Dulbecco's modified eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Penicillin G and streptomycin Penicillin G and streptomycin (Phenicilin G sodium, 100 units / L, streptomycin sulfate, 100 mg / L; GibcoBRL, USA) were used as
  • Table 2 is a table showing the results of measuring their cytotoxicity by treating various concentrations of Examples 1 to 23.
  • B16F10 melanin producing cells were placed at 1 ⁇ 10 5 cells / well (Final volume 3 ml), incubated for 24 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator, and then the medium of each well was removed and a new DMEM (10% FBS). Whitening efficacy samples were prepared for each well by concentration and pretreated for 30 minutes.
  • the cells were lysed by vortex at 10 minute intervals for 30 minutes, centrifuged at 4 ° C and 13,000 rpm for 30 minutes to remove supernatant, and cell pellets containing melanin were recovered and 100 ml of Ether / Isopropanol 1: 1 solution. Wash once. The supernatant was removed by centrifugation at 13,000 rpm for 10 minutes, dried at 60 ° C. for about 3 hours, and 150 ml of 2N NaOH added with 10% DMSO was added thereto to dissolve intracellular melanin at 60 ° C. for 1 hour. . 100 ml of the supernatant obtained by dissolving each well of a 96-well plate was measured at 405 nm using an ELISA reader.
  • DMSO a solvent in which the sample was dissolved
  • the positive control did not process the sample, but treated only ⁇ -MSH to maximize melanin production.
  • Melanin synthesis inhibition rate (%) was calculated by the following equation.
  • Table 3 is a chart measuring the melanin synthesis inhibition rate (%) of the samples.
  • Examples 1 to 23 which are undecenoyl dipeptide derivatives, showed a concentration-dependent melanin synthesis inhibitory effect as the prescription concentration was increased from 5 ppm to 30 ppm. It showed much better melanin inhibitory effect than arbutin or kojic acid, which is known as a conventional whitening cosmetic. As a result, it was confirmed that Examples 1 to 23 are excellent candidate materials as whitening raw materials.
  • Example 2 and 3 [dipeptide sequence LL], Examples 4, 5 [dipeptide sequence LF], Examples 8, 9 [dipeptide sequence FL], Examples 12, 13 [dipeptide sequence GL], Examples 18, 19 [dipeptide sequence G (d) L ], Example 20, 21 [dipeptide sequence F (d) L]).
  • melanin synthesis inhibitory effect was the best in the repeat sequence of leucine (Leucine), the whitening effect was excellent in the sample containing the D-form amino acid when comparing the leucine repeat sequences (Example 3, 15, 16, 17).
  • B16F10 melanocytes or HEMn-LP melanocytes
  • HEMn-LP melanocytes were added to 1 ⁇ 10 5 cells / well (Final volume 3 ml), incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours, The medium from each well was removed and replaced with fresh DMEM.
  • Whitening efficacy samples were prepared for each well by concentration and pretreated for 30 minutes.
  • the cells were lysed by vortex at intervals of 10 minutes for 30 minutes, then centrifuged at 4 ° C and 13,000 rpm for 30 minutes to transfer the supernatant to a new 1.5 ml tube.
  • Total protein was quantified using BCA protein assay kit (PIERCE, USA), and 40 ml of each sample was placed in each well of a 96-well plate, followed by phosphate buffer (pH, 6.8). 160 ml of L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) dissolved immediately in After reacting for 20 to 60 minutes at 37 ° C, absorbance was measured at 475 nm using an ELISA reader.
  • L-DOPA L-3,4-dihydroxyphenylalanine
  • DMSO a solvent in which a sample was dissolved instead of a sample
  • the positive control did not process the sample, but only ⁇ -MSH was used to maximize the activity of tyrosinase enzyme.
  • the inhibition rate of tyrosinase enzyme activity (%) was calculated by the following equation.
  • % Tyrosinase activity inhibition [(A-C) / (A-B)] x 100
  • Table 4 is a chart measuring the percent inhibition of tyrosinase activity of the samples.
  • Examples 1 to 23 which are undecenoyl dipeptide derivatives, showed an effect of inhibiting concentration-dependent tyrosinase enzyme activity as the prescription concentration was increased from 5 ppm to 30 ppm. It showed much better inhibitory activity of tyrosinase enzyme activity than arbutin or kojic acid, which is known as a conventional whitening cosmetic. As a result, it was confirmed that Examples 1 to 23 were excellent whitening candidates that inhibited melanin production as well as inhibiting tyrosinase enzyme activity, which is an enzyme essential for melanin production.
  • Example 2 and 3 [Dipeptide Sequence LL ], Examples 4, 5 [dipeptide sequence LF], Examples 8, 9 [dipeptide sequence FL], Examples 12, 13 [dipeptide sequence GL], Examples 18, 19 [dipeptide sequence G (d ) L], Example 20, 21 [dipeptide sequence F (d) L]).
  • tyrosinase enzyme activity was the best inhibitory effect in the leucine repeat sequence, and the whitening effect was excellent in the sample containing D-form amino acids when leucine repeat sequences were compared.
  • Examples 1 to 23 inhibited melanin synthesis through inhibition of tyrosinase enzyme activity. If so, we examined which intracellular signal transduction pathways inhibited tyrosinase enzyme activity and inhibited melanin synthesis in their whitening efficacy.
  • the major signaling mechanism that stimulates melanogenesis is initiated by an increase in the amount of cAMP in the cell through adenylate cyclase. Therefore, it was measured how much the amount of intracellular cAMP is inhibited by Examples 1 to 23.
  • Examples 1 to 23 really act as MC1R-specific antagonists to show whitening efficacy.
  • Examples 16 and 17, which had the highest whitening effect increased tyrosinase activity and melanin production when PKA, cAMP, cGMP, PKC, and ETbR stimuli, which are factors causing skin blackening, were increased in addition to MC1R stimulation, respectively.
  • Experiments were conducted to evaluate which signaling pathways showed whitening efficacy by measuring how much inhibition was performed.
  • the present inventors anticipated that the whitening raw materials of the present invention would be specifically targeted to MC-R-stimulating ⁇ -MSH, and thus, the whitening raw materials of the present invention were ETbR-stimulated, which is known to cross-react in MC1R and cells. In addition, it was predicted to show some inhibitory effect through intracellular mechanism. In addition, since the whitening raw materials of the present invention will bind to the MC1R receptor and block its lower signaling mechanism, when stimulating intracellular proteins (PKA, cAMP, cGMP, PKC) activated by MC1R stimulation, MC1R present in the cell membrane It could be expected that the whitening material bound to the lysate would not be effective.
  • PKA intracellular proteins
  • melanin-related genes such as tyrosinase, TRP1, and TRP2.
  • % Transcription inhibition was measured using RT-PCR.
  • the amount of cAMP released into the cells was measured using a cAMP ELISA kit (Assay Design, USA).
  • the amount of cAMP generated during cell signal transduction of skin blackening was measured by ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) and the results are shown in Table 5.
  • the amount of cAMP in the cells was normalized to the amount of protein for each sample measured using the BCA protein assay.
  • Examples 1 to 23 inhibited the amount of cAMP in the cell, thereby affecting tyrosinase enzyme activity, which is a lower signaling pathway, and inhibited melanin synthesis. Since Examples 1 to 23 are made of MC1R antagonists, it is obvious that adenylate cyclase activity, which is a MC1R subsignal, is inhibited, thereby reducing intracellular cAMP release.
  • the undecenoyl dipeptide derivative used in the present invention was synthesized by modifying DermaPep TM UL. It has already been demonstrated that DermaPep TM UL is an MC1R specific antagonist (Patent Application No. PCT / KR2010 / 006387). Therefore, Examples 16 and 17, which were the most effective among Examples 1 to 23, were selected to determine whether they exhibit whitening efficacy by acting as MC1R-specific antagonists. Different stimulation to stimulate melanin synthesis by stimulating melanocytes, and demonstrated how effectively the blocking of Examples 16, 17 (%) and tyrosinase enzyme activity inhibition (%).
  • ⁇ -MSH M1R stimulation
  • Endothelin (16-21) EbR stimulation
  • Forskolin PKA stimulation
  • 8-Bromo-cAMP cAMP stimulation
  • 8-Bromo-cGMP cGMP stimulation
  • PMA PLC stimulation
  • Inhibition rate (%) of melanin synthesis is shown in Table 6, and tyrosinase enzyme activity inhibition rate (%) is shown in Table 6, and the effect of Examples 16 and 17 on the increased melanin synthesis and tyrosinase enzyme activity by treatment.
  • Reagents used for melanin stimulation were treated at the following concentrations.
  • Examples 16 and 17 were the most excellent inhibition of melanin production and tyrosinase enzyme activity when the melanin production stimulation by MC1R.
  • Forskolin, 8-Bromo-cAMP, 8-Bromo-cGMP, PKA by PMA, Adenylate cyclase, cGMP, PKC stimulation is a sub-step of the signaling mechanism in which MC1R antagonist acts, Examples 16, 17 Skin blackening irritation could not be prevented.
  • the ETbR stimulatory response by Endothelin (16-21) also showed some inhibitory effect. This assumes that ETbR and MC1R share several molecules in the cell and cross-talk. As a result, the MC1R antagonists of the present invention cross-talk with the ETbR signaling system, and proved to bind to MC1R and show a whitening effect.
  • B16F10 melanin producing cells were placed in a 60 mm dish at 5 ⁇ 10 5 cells / well (Final volume 5 ml), incubated for 24 hours in 37 ° C., 5% CO 2 incubator, and then the medium of each well was removed and replaced with fresh DMEM. Whitening efficacy samples were prepared for each well by concentration and pretreated for 30 minutes.
  • PCR primers were prepared beta-actin, tyrosinase, TRP1, TRP2, MITF, POMC of the mouse, and amplified 30 times under conditions of 94 ° C 1 minute, 60 ° C 1 minute, 72 ° C 1 minute.
  • PCR products were loaded on 1% agarose gel and electrophoresed for 20 minutes and identified using EC3 UV illuminator (UVP, USA). MRNA quantified by densitometer was quantified by dividing by beta-actin value. Primer sequences are shown in Table 8.
  • Examples 1 to 23 generally inhibited the mRNAs of Tyrosinase and TRP1 and TRP2.
  • Examples 1 to 23 which are MC1R antagonists, bind to MC1R to inhibit melanin synthesis and tyrosinase enzyme activity. Inhibiting the mRNA of tyrosinase, TRP1, TRP2 genes, it was proved to inhibit the whitening effect through inhibition at the transcription level. Moreover, the inhibitory effect of Examples 16 and 17 was the most excellent among Examples 1-23.
  • Examples 1 to 23 which are MC1R antagonists, act as MC1R-specific antagonists (Tables 6 and 7), reduce the amount of cAMP in cells (Table 5), tyrosinase, Inhibition of transcription of skin blackening-related genes such as TRP1 and TRP2 (Table 9) shows that whitening efficacy is shown by inhibiting tyrosinase enzyme activity and melanin biosynthesis (Tables 3 and 4).
  • Example 16 After treating with Example 16, 17 and ⁇ -MSH and incubating for 48 hours, replacing the medium with fresh medium, Examples 16, 17 were no longer treated, and only ⁇ -MSH was continued to be treated.
  • Table 11 Examples 16, 17% inhibition of tyrosinase activity at recovery, 48 h after treatment division Treatment concentration (ppm) When sample is not collected, continue processing with ⁇ -MSH 48 hours later, only sample recovery ⁇ -MSH Negative Control (Sample-Free) DMSO 0.01% - - DermaPep TM UL 5 4 31 15 32 0 30 70 48
  • Example 16 Undecenoyl L (d) L -OMe 5 11 One 15 76 24 30 82 39
  • Example 17 Undecenoyl (d) L (d) L-OMe 5 3 -3 15 71 35 30 85 42
  • Human keratinocyte HaCaT cells were used as keratinocytes.
  • Cells were prepared at 90 ° Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, GibcoBRL, USA) medium containing 10% fetal bovine serum (FBS; Cyclone, Lagan, UT) at 37 ° C, 5% CO 2 -95% (Incubator; Thermo-scientific, USA).
  • Penicillin G and streptomycin (Phenicilin G sodium, 100 units / L, streptomycin sulfate, 100 mg / L; GibcoBRL, USA) were used as antibiotics.
  • UV-B 100mJ / cm 2
  • serum-free DMEM medium serum-free DMEM medium
  • the culture medium was removed, washed with 1 ml of PBS, and RNA was extracted using an easy-spin TM (DNA free) Total RNA extraction kit (Intron, Korea).
  • PCR Primer was prepared in human gapdh, Interleukin-1a (IL-1a), Interleukin-1b (IL-1b), Interleukin 6 (IL-6), Interleukin 8 (IL-8), 94 ° C 1 minute, After 5 times amplification at 52 ° C. 1 min, 72 ° C.
  • Examples 1 to 21 are different in degree, but overall, IL-1a, IL-1b, IL-6, and IL-8, which are inflammation-related cytokines (Cytokine) increased by UV-B. Was effectively suppressed.
  • the amount of protein was measured by ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method.
  • UV-B 100mJ / cm 2
  • serum-free DMEM medium serum-free DMEM medium
  • the culture medium was removed, washed with 1 ml of PBS, 1 ml of PBS was added, each well was scraped with a cell scraper to separate cells, and then transferred to each 1.5 ml tube. Subsequently, the supernatant was removed by centrifugation at 4 ° C.
  • Strip for ELISA was inserted into an ELISA plate, coated for 30 minutes (0.1% Glutaraldehyde in PBS), washed three times (0.1% Tween20 in PBS), 100ml each sample was added and reacted at 37 ° C for 3 hours. After the washing was repeated three times, the blocking buffer was added 100ml each reaction for 1 hour at 37 ° C.
  • the primary antibodies IL-1 ⁇ and IL-6 (antibody titer 1: 1000, Santacruz, USA) diluted in blocking buffer were added to each well 100ml each reaction at 37 ° C for 3 hours, washed three times After that, the secondary antibody (anti-rabbit, titer 1: 2000, Santacruz, USA) was added 100ml each reaction was performed at 37 ° C for 1 hour. After washing the secondary antibody three times or more, 100ml each of the TMB solution (Sigma, USA) was added and reacted at room temperature for 10-30 minutes, 1N H 2 SO 4 by 50ml each to terminate the reaction. Absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader (TECAN, USA). Protein expression inhibition rate (%) was calculated by the following equation (4).
  • Examples 1 to 23 can act as an MC1R antagonist to show whitening efficacy, and at the same time inhibit the inflammation-related signaling processes below the ETbR (Table 13, 14), it can be seen that it has anti-inflammatory efficacy.
  • the cosmetic composition for skin whitening of the present invention not only provides an excellent whitening effect even in a small amount, but also shows a superior whitening effect even when compared to DermaPep TM UL, which is a conventional whitening raw material.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 관한 것이다. 본 발명의 언데세노일 디펩타이드 유도체들은 알파 멜라노사이트 자극 호르몬 (a-MSH) 수용체인 MC1R의 길항제로 작용하여 세포내의 멜라닌 생성을 억제하며, 기존 MC1R 길항제가 미백효과와 더불어 갖는 염증반응을 일으키지 않고, UV에 의한 염증반응을 억제하는 효과까지 입증되었다. 또한 엔도델린에 의한 자극에 대해서도 억제작용을 하였는데, 이는 MC1R과 엔도델린 B타입 수용체의 하위 신호전달 과정에서 교차반응을 하기 때문이었다. 이 언데세노일 디펩타이드 유도체들은 인체에 무해하고, 피부 침투성과 안정성이 뛰어나므로, 항염 효과를 수반하는 피부 미백용 화장료로 매우 효과적으로 사용 될 수 있다. [화학식 1] CH2=CH(CH2)8-C(=O)-A1-A2-OR 상기 화학식에서, -C(=O)-는 카보닐을 의미하고, A1, A2는 아미노산 잔기로서, 각각 Leu, Phe, Trp 및 Gly중에서 선택되는 것이고, 이때 Leu, Phe 및 Trp는 L- 또는 D-형(form) 또는 그것들의 혼합형이며, R은 H, C1~C18 알킬, 페닐, 또는 벤질이며, 언데세노일 그룹은 A1의 아민기와 결합하는 것이고, OR은 A2의 카르보닐 그룹에 결합하는 것임.

Description

언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물
본 발명은 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알파 멜라노사이트 자극 호르몬 (α-MSH) 수용체인 MC1R의 길항제로 작용하여, 피부 흑화를 일으키는 주된 요인인 알파 멜라노사이트 자극 호르몬과 경쟁적 결합을 통하여 그 수용체인 MC1R에 결합함으로써 멜라닌 합성 경로를 차단하고, 염증 관련 신호 전달 경로를 효과적으로 차단하여, 탁월한 피부 미백 효과와 항염 효능을 갖는 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 포함하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
멜라닌(melanin)은 피부 기저층에 존재하는 멜라노사이트(Melanocyte, 멜라닌 형성세포)라는 세포에 존재하는 소기관인 멜라노좀(Melanosome)에서 생성되는데, 이 세포의 활성여부에 따라 피부와 머리카락 등에서 생성되는 멜라닌의 양이 결정된다. 이러한 멜라닌의 생성은 선천적 요인으로는 유전적 영향, 후천적으로는 여성호르몬, 약물, 임신, 자외선, 스트레스 등의 요인에 의해 결정되는데, 후천적 요인으로서 가장 영향을 끼치는 것이 바로 자외선에 의한 것이다. 멜라닌은 자외선의 빛 에너지를 흡수하여 자외선에 의한 손상으로부터 세포들을 보호하는 역할을 한다. 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부 병변이 유발되고, 과도하게 생산되면 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라, 기미와 주근깨를 형성하고, 더 나아가서는 피부암 등의 원인이 되기도 한다. 현대인의 피부는 환경오염, 자외선 등의 외부자극 및 스트레스에 노출되어 손상 받고 있으며, 이렇게 해서 손상된 피부는 회복속도가 느려지고, 주름형성, 탄력저하 및 피부색소 침착 등의 현상을 나타내게 된다. 이 중에서도 특히 동양여성에 있어서 미백효과에 거는 기대는 매우 높으며, 이미 생성된 멜라닌의 색을 엷게 하거나, 멜라닌이 새롭게 생성되는 것을 억제하는 다양한 화장료들이 개발되고 있다.
멜라닌 생합성에 있어서 중요한 메커니즘은 크게 멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH)에 의한 것과 엔도델린-1(Endothelin-1)에 의한 것이 있다.
자외선, 호르몬, 약물 등의 멜라닌 형성세포 자극에 의해 멜라노사이트의 세포막에 존재하는 α-MSH 수용체인 멜라노코르틴-1 수용체(melanocortin-1 receptor, MC1R)에 α-MSH가 결합하면, 자극된 MC1R에 의해 아데닐레이트 사이클레이즈(adenylate cyclase)라는 효소가 활성화되어, 세포 내의 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)가 증가하고, 증가된 cAMP에 의해 멜라닌 생합성의 일련의 과정이 연속적으로 일어나게 된다. cAMP는 단백질 인산화효소 A(protein kinase A: PKA), CREB 전사인자를 순차적으로 활성화하여 α-MSH의 전구체인 MITF(Microphthalmia associated transcription factor)의 발현을 촉진한다. MITF가 티로시나제(tyrosinase), TRP1(tyrosinase related protein 1), DCT(dopachrome tautomerase) 등 멜라닌합성 관련 유전자의 전사 활성을 일으키면, 멜라노사이트 내에 존재하는 티로신(tyrosine)이 티로시나제(tyrosinase; 멜라닌 합성반응의 가장 중요한 효소)라는 효소에 의하여 도파(DOPA; 3,4-다이하이드록시페닐알라닌)와 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환된다.
엔도델린-1(Endothelin-1) 또한 자외선, 호르몬, 약물 등의 자극에 의해 증가하여, 멜라노사이트 세포막에 존재하는 엔도델린 B타입 수용체(ETbR)에 결합한다. ETbR의 자극을 받은 포스포리파아제(phospholipase C: PLC)는 세포막에 존재하는 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate: PIP2)를 디아실 글리세롤(diacyl glycerol: DAG)과 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트(inositol 1,4,5-trisphosphate: IP3)로 분해시킨다. IP3는 소포체의 IP3 수용체에 결합하여 소포체의 칼슘채널을 열고, 세포질내의 칼슘농도 증가는 세포내의 여러 연쇄반응을 통해 멜라닌 합성반응에 관여하고, DAG는 증가된 칼슘이온과 함께 단백질 인산화효소 C(Protein kinase C: PKC)를 활성화시킨다. 엔도델린은 PKC 뿐만 아니라, cAMP 자극을 통해 PKA도 활성화시키는데, 이 두 인산화 효소의 크로스토크(cross-talk)를 통하여 멜라닌 생성반응이 일어난다고 알려져 있다. 엔도델린-1/ETbR 신호전달과정은 멜라닌 합성에 관여하는 또 다른 경로인 SCF/c-KIT과도 시너지 효과를 내어 티로시나제 발현을 증가시켜 피부 흑화를 일으킨다는 보고도 있다.
이러한 순차적이고 복합적인 반응을 통하여 페오멜라닌(pheomelanin, 붉은 색을 나타내는 멜라닌)이 형성되거나, TRP1, DCT 등의 효소 반응을 거쳐 유멜라닌(eumelanin, 검정이나 갈색을 나타내는 멜라닌)이 형성된다. 생성된 멜라닌은 멜라노좀을 통해 멜라노사이트로부터 표피를 구성하는 세포인 케라티노사이트(keratinocyte, 각질형성세포)로 전이되어 이 과정에서 생성된 멜라닌의 양에 따라, 과잉 생산될 경우 피부에 침착 되어 기미나 주근깨, 피부 흑화 등을 유발하게 된다.
종래에는, 피부 미백원료로서 알부틴(arbutin), 아스코르빈산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid), 글루타치온(glutathione)과 같은 티로시나제 저해 활성을 갖는 물질을 화장료에 배합하여 피부 미백효과를 주거나, 기미, 주근깨와 같은 피부 과색소 침착증을 개선하여 왔다. 그러나, 예를 들면 코지산은 티로시나제의 활성부위에 존재하는 구리이온을 흡착시켜 효소활성을 효과적으로 저해하지만, 화장품에 배합 시 불안정하며 피부 트러블을 일으키는 문제가 있고, 아스코르빈산 및 그 유도체는 피부 침투가 어렵고, 산화가 잘되는 불안정성 때문에 화장품 원료로 사용 시 그 효능이 좋지 않다. 하이드로퀴논은 알러지를 일으키고, 세포독성 및 자극성이 높아 각 나라별로 사용이 제한되고 있다. 알부틴은 하이드로퀴논에 글루코피라노사이드(Glucopyranoside)가 결합된 유도체로 하이드로퀴논의 부작용이 나타나지 않는 장점이 있어 널리 사용되며 각광받았으나, 피부 효소에 의해 분해되는 단점이 있다. 즉, 기존의 미백원료들은 피부 자극성이 심하거나 독성이 있으며, 제품 안정성이 좋지 못하고, 피부침투가 잘 되지 않아 미백효과가 미미하여 사용에 있어서 한계가 있다.
또 다른 멜라닌 생합성의 원인으로 ETbR자극이 있다. 엔도델린-1이 자외선에 의해 분비되었을 경우에는, ETbR 자극에 의한 피부 흑화 뿐만 아니라, 각종 염증관련 사이토카인(Cytokine)의 분비도 촉진시킨다. 엔도델린-1/ETbR 자극 신호는 IL-1a, IL-1b, COX-1, COX-2, TNF-α, IFN-γ, PEG2 등의 사이토카인의 분비를 촉진시킴으로써 자외선에 의한 염증반응을 일으키고, N-카데린(N-cadherin), MMP-1, MMP-2, MMP-9, 인테그린(Integrin) 등의 발현을 증가시켜 암세포의 전이를 돕는다. 즉, ETbR 길항제의 개발은 자외선에 의한 피부 염증반응을 억제하고, 피부암으로부터 피부세포를 보호하는 기능을 가질 것이라는 사실은 자명하다.
따라서, 새로운 미백제의 개발에 있어 미백효능이 우수하며, 더불어 자외선으로 인해 손상된 피부를 안정시키고, 피부투과성이나 안정성이 뛰어나며, 생체친화적이어서 독성을 나타내지 않는 원료의 개발이 중요한 관건으로 떠오르고 있다.
<선행기술문헌>
<비특허문헌>
[문헌 1] Imokawa G, Yada Y, Kimura M., Biochem. J. 314 (1996) 305.
[문헌 2] Sriwiriyanont P, Ohuchi A, Hachiya A, Visscher MO, Boissy RE., Lab Invest. 86 (2006) 1115
[문헌 3] Hachiya A, Kobayashi A, Ohuchi A, Takema Y, Imokawa G., J Invest Dermatol 116 (2001) 578
[문헌 4] Scott MC, Suzuki I, Abodel-Malek ZA., Pigment Cell Res 15(2002) 433
[문헌 5] HearingVJ. Tsukamoto K., FASEB J, 5(1991)2902.
[문헌 6] Halaban R, Cheng E, Svedin S, Aron R, Hebert DN., J Biol Chem. 276 (2001) 11933.
[문헌 7] Imokawa G, Kobayashi T, Miyagishi M, Higashi K, Yada Y., Pigment Cell Res 10 (1997) 218.
[문헌 8] Hara M, Yaar M, Gilchrest BA., J Invest Dermatol 105 (1995) 744.
[문헌 9] Imokawa G, Miyagishi M, Yada Y., J Invest Dermatol. 105 (1995) 32.
[문헌 10] Metz M, Lammel V, Gibbs BF, Maurer M., Am J Pathol 169 (2006) 815.
[문헌 11] Spinella F, Rosanu L, Di Castro V, Decandia S, Nicotra MR, Natali PG, Bagnato A., Cancer Res 67 (2007) 1725.
[문헌 12] Lan CC, Wu CS, Cheng CM, Yu CL, Chen GS, Yu HS., Exp Dermatol 14 (2005) 528.
[문헌 13] Lahav R, Heffner G, Patterson PH., Proc Natl Acad Sci USA 96 (1999) 11496.
[문헌 14] Kadono S, Manaka I, Kawashima M, Kobayashi T, Imokawa G., J Invest Dermatol 116 (2001) 571.
[문헌 15] Udono-Fujimori R, Totsune K, Murakami O, Arihara Z, Kikuchi K, Tamai M, Shibahara S, Takahashi K., J Cardiovasc Pharmacol. 44 (2004) S471-3.
[문헌 16] Hachiya A, Kobayashi T, Takema Y, Imokawa G. J Biol Chem 277 (2002) 5395.
[문헌 17] Channa K. JayawickremeS, J. Mark Quillan§, Gerard F. Graminski, and Michael R. Lerner., J Biol Chem 269 (1994) 29846.
[문헌 18] Jose´ C. Garcı´a-Borro´ n, Berta L, Sa´nchez-Laorden, Celia Jime´nez-Cervantes., Pigment Cell Res 18 (2005) 393.
[문헌 19] Scotti MC, Suzuki I, Zalafa A.A-M., Pigment Cell Res 15 (2002) 433.
[문헌 20] Solano F, Briganti S, Picardo M, Ghanem G., Pigment Cell Res. 19 (2006) 550.
[문헌 21] Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry; Synthesis of Prptides and Peptidomimetics, Workbench edition vol E22a, Georg Thieme Verlag (2004)
본 발명자들은 피부 색소침착 과정에서 가장 중요한 역할을 하는 MC1R에 초점을 맞추고, MC1R의 길항제를 합성하여, 본 발명에 따른 언데세노일 디펩타이드 유도체 {Undecylenoyl dipeptide derivatives}가 MC1R에 의해 일어나는 피부 흑화에 대한 억제 효과가 매우 우수함을 입증하였고, 그 신호 전달 과정을 규명하였으며, ETbR 흑화 자극에 대하여도 MC1R-의존적 교차반응을 통하여 억제함을 증명하였다. 또한 UV에 의한 염증 반응까지 억제하는 것을 in vitro 실험계를 확립하여 증명하였다.
본 발명에 사용한 언데세노일 디펩타이드 유도체는 미백 고시원료로 널리 사용되고 있는 알부틴, 코지산과 기존에 본 발명자들이 개발한 미백물질인 DermaPep™ UL(특허 출원번호 PCT/KR2010/006387, INCI name: Methyl Undecenoyl Leucinate) 보다 미백 효과가 우수하였다. 이로써, 본 발명자들은 항염 효과를 수반하는 기능성 미백원료를 개발하고 그 효능을 증명하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은 인체에 무해하며 우수한 미백효과를 지님과 동시에 항염효과를 수반하며, 피부침투성과 안정성이 뛰어난 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 언데세노일 디펩타이드 유도체를 제공한다. 본 발명에 따른 언데세노일 디펩타이드 유도체는 아래 화학식 1과 같이 표시된다.
[화학식 1]
CH2=CH(CH2)8-C(=O)-A1-A2-OR
상기 화학식에서, -C(=O)-는 카보닐을 의미하고, A1, A2는 아미노산 잔기로서, 각각 Leu, Phe, Trp 및 Gly중에서 선택되는 것이고, 이때 Leu, Phe 및 Trp는 L- 또는 D-형(form) 또는 그것들의 혼합형이며, R은 H, C1~C18 알킬, 페닐, 또는 벤질이고, 언데세노일 그룹은 A1의 아민기와 결합하는 것이며, OR은 A2의 카르보닐 그룹에 결합하는 것임.
특히, 상기 화학식 1에서 A1과 A2는 L- 또는 D-형 또는 그것들의 혼합형의 류신으로 구성되며 R은 메틸기인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는, 상기 언데세노일 디펩타이드 유도체는 언데세노일-L-(d)L-OMe, 언데세노일-(d)L-L-OMe 그리고 언데세노일-(d)L(d)L-OMe이다. 여기에서 L은 l-형 류신을 의미하고, (d)L은 d-형 류신을 의미한다.
본 발명은 또한 상기한 언데세노일 디펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물을 제공한다.
이러한 조성물에서, 상기 언데세노일 디펩타이드 유도체는 상기 피부미백용 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.0001 내지 10 중량%인 것이 바람직하다. 또한 상기 피부미백용 화장료 조성물은 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌징, 및 비누로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 상기한 언데세노일 디펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는, 자외선과 관련된 염증 질환을 예방하는 화장료 조성물을 제공한다.
첫째, 본 발명에 의하면 본 언데세노일 디펩타이드 유도체는 MC1R의 길항제(antagonist)로 작용하여, 그 하위단계의 유전자의 발현을 효과적으로 억제하며, 티로시나제의 활성을 억제하고, 멜라닌 생성반응의 주요효소의 발현을 억제하여 멜라닌 생성을 저해하는 효능을 갖는다.
둘째, 우수한 미백효능과 더불어, 자외선에 의한 염증을 억제한다.
셋째, 언데세노일 디펩타이드 유도체는 MC1R 길항제로써, ETbR 자극에 대해서도 억제 효능을 보인다.
넷째, 언데세노일 디펩타이드 유도체는 생체친화적인 아미노산을 사용하여, 세포독성이 적고 피부자극이 없다.
다섯째, 언데세노일 디펩타드 유도체는 분자량이 작고, 지방산의 유기친화적인 특성으로 인해 피부 침투도가 높다.
본 발명은 언데세노일 디펩타이드 유도체를 제공한다. 본 발명에 따른 언데세노일 디펩타이드 유도체는 아래 화학식 1과 같이 표시된다.
[화학식 1]
CH2=CH(CH2)8-C(=O)-A1-A2-OR
상기 화학식에서, -C(=O)-는 카보닐을 의미하고, A1, A2는 아미노산 잔기로서, 각각 Leu, Phe, Trp 및 Gly중에서 선택되는 것이고, 이때 Leu, Phe 및 Trp는 L- 또는 D-형(form) 또는 그것들의 혼합형이며, R은 H, C1~C18 알킬, 페닐, 또는 벤질이고, 언데세노일 그룹은 A1의 아민기와 결합하는 것이며, OR은 A2의 카르보닐 그룹에 결합하는 것임.
본 발명의 언데세노일 디펩타이드 유도체는 세포 내에서 멜라닌이 생성되는 것을 억제하여 피부에 미백효과를 주는 화장료 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 이와 같은 본 발명의 언데세노일 디펩타이드 유도체는 MC1R의 길항제로 작용하므로, 이미 알려진 화장료 제조방법에 의해 스킨로션 및 밀크로션과 같은 로션, 크림, 에센스, 젤, 연고, 팩, 스틱, 파우더 등의 형태로 미백용 화장료를 제조할 수 있고, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 첨가하여, 의약부외품, 외용 의약품에도 별다른 부작용 없이 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 언데세노일 디펩타이드 유도체는 고체상 합성법 또는 용액(Solution) 합성법을 통해 합성될 수 있다. 고체상 합성법의 경우 N-말단이 보호된 형태 그리고 반응성 측쇄가 보호된 형태로 사용된다. N-말단을 보호하는 보호기로는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기(Fmoc)가 일반적으로 사용된다. 용액 합성법의 경우 기존에 통상적으로 널리 알려진 합성법을 사용할 수 있다. 예를 들어 언데세노일 디펩타이드 메틸에스테르의 경우 반응식 1과 같은 합성 경로를 사용하여 합성할 수 있다.
[반응식 1]
위의 반응식 1의 (1)에서와 같이 언데세노일 클로라이드 (Undecenoyl chloride)와 아미노산(A1-OH)을 KOH수용액에서 반응시키면 언데세노일 아미노산 (Undecenoyl amino acid)를 얻을 수 있다. 여기에서 언데세노일 클로라이드의 카보닐기는 아미노산의 아민기와 반응하여 결합하며, A1-OH의 OH는 아미노산의 카르복실기의 OH이다.
한편으로 (2)와 같이 두 번째 아미노산(A2-OH)을 메탄올 용액하에서 티오닐 클로라이드 (Thionyl chloride, SOCl2)와 반응시키면 아미노산 메틸에스테르를 높은 수율로 얻을 수 있다. 마찬가지로, A2-OH의 OH는 아미노산의 카르복실기의 OH이다.
(1)과 (2)에서 얻은 두 가지 물질을 커플링제(Coupling Reagent)를 이용하여 반응시키면 (3)과 같이 원하는 언데세노일 디펩타이드 메틸에스테르를 얻을 수 있다. 이 때 사용될 수 있는 커플링제(Coupling Reagent)로는 펩타이드 합성에 널리 사용되는 일반적인 커플링제를 사용할 수 있으며, 예를 들어 디싸이클로헥실카보디이미드 (Dicyclohexyl carbodiimide, DCC), HBTU (N-[(1H-benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide) 혹은 HATU (N-[(dimethylamino)-1-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-yl-methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)등을 사용할 수 있으며, 첨가 보조제로서 HOAt (1-Hydroxy-7-Azabenzotriazole) 혹은 HOBt (1-Hydroxybenzotriazole)등이 함께 사용될 수 있다. 보다 자세한 합성방법은 실시예 1에 기술하였다.
본 발명에 따른 피부 미백용 조성물 제조시에 함유되는 언데세노일 디펩타이드 유도체의 함량은 피부 미백 효과와 경제성을 고려할 때 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001~10%인 것이 바람직하며, 더욱 바람직한 함량은 0.002~1.0 중량%이다.
이하, 본 발명의 구체적인 설명을 위하여 실시예 및 실험예를 들어 설명하기로 한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 및 실험예들은 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
<실험예 1> 시료의 준비
(1) 언데세노일 아미노산의 합성
2L 반응기에 0.28mol 아미노산을 0.74mol의 KOH를 700g의 물에 녹인 수용액에 투입한 후 아이스-솔트 배스(Ice-salt bath)를 이용하여 냉각시킨다. 이어서 0.19mol의 언데세노일 클로라이드(Undecenoyl chloride)를 적하조를 통해 약 2시간에 걸쳐 적하시킨 후 아이스-솔트 배스(Ice-Salt Bath)에서 6시간 숙성반응을 시킨 후 12% 염산 수용액을 이용하여 pH=3이 될 때까지 중화시킨다. 300ml의 에틸아세테이트(Ethyl acetate)를 이용하여 추출한 후 에틸아세테이트 층을 100ml의 소금물(Brine)을 이용하여 세척해준 후 MgSO4를 이용하여 수분을 제거하고 에틸아세테이트를 증류하여 언데세노일 아미노산(Undecenoyl amino acid)을 얻는다. 수율은 아미노산에 따라 약간의 차이가 있지만 대략 70-90%의 수율을 얻었다.
(2) 아미노산 메틸 에스테르 염산의 합성
500mL 반응기에 0.38mol의 아미노산과 150ml의 메탄올을 투입한 후 아이스-솔트 배스(Ice-Salt Bath)를 이용하여 0 ℃까지 냉각시킨다. 이어서 0.50mol의 티오닐 클로라이드(thionyl chloride)를 적하조를 통해 3시간에 걸쳐 적하시킨다. 적하가 완료되면 반응온도를 60 ℃로 승온하여 2시간 숙성하여 반응을 종료시킨 후 회전 증발기(Rotary Evaporator)를 이용하여 메탄올과 미반응 티오닐 클로라이드를 증류해 낸다. 흰색 조(Crude)제품을 최소량의 메탄올에 녹인 후 디에틸 에테르(Diethyl ether)를 투입하여 석출시킨다. 석출된 고체를 여과한 후 디에틸 에테르로 세척하고 건조시킴으로 아미노산 메틸 에스테르 염산(Amino acid Methyl ester hydrochloride)를 얻는다. 수율은 아미노산에 따라 약간의 차이가 있지만 대략 80-90%의 수율을 얻었다.
(3) 언데세노일 디펩타이드 메틸 에스테르의 합성
500mL의 반응기에 0.030mol의 아미노산 메틸 에스테르 염산, 0.027mol의 언데세노일 아미노산, 0.027mol의 HOBt, 0.057mol의 디이소프로필에틸 아민(diisopropylethyl amine)과 100ml의 테트라하이드로퓨란(Tetrahydrofuran: THF)을 투입한 후 아이스-솔트 배스(Ice-Salt Bath)를 이용하여 0 ℃로 냉각한다. 이어서 0.03mol의 디사이클로헥실카보디이미드(Dicyclohexylcarbodiimide: DCC)를 10ml의 THF에 녹인 용액을 적하조를 통해 약 40분에 걸쳐 투입한다. 반응액을 상온으로 승온한 후 5시간 숙성반응 시킨 후 여과하고 여액을 회전 증발기를 이용하여 농축시킨다. 200mL의 에틸 아세테이트를 투입하여 녹인 후 분액깔대기를 이용하여 차례대로 50mL의 1N 염산수용액으로 두 번, 50mL의 물로 두 번, 50mL의 5% 중탄산나트륨 수용액으로 두 번 그리고 마지막으로 50mL의 물로 세 번 세척한 후 MgSO4를 이용하여 수분을 제거한 후 용매를 회전 증발기를 이용하여 제거하여 언데세노일 디펩타이드 메틸 에스테르(Undecenoyl dipeptide Methyl ester)를 얻는다. 수율은 펩타이드의 종류에 따라 다르지만 대략적으로 70-80%의 수율을 얻었다.
(4) 언데세노일 디펩타이드의 합성
1L의 반응기에 0.021mol의 언데세노일 아미노산 메틸 에스테르를 300ml의 메탄올에 녹인다. 이어서 420ml의 1N NaOH수용액을 투입한 후 25 ℃에서 1시간 숙성 반응시킨다. 회전 증발기를 이용하여 반응액을 농축한 후 200mL의 물을 투입하여 녹인다. 10% 시트르산(Citric acid) 수용액을 이용하여 pH=3이 될 때까지 중화시키면 제품이 석출되기 시작하며 200mL의 에틸 아세테이트를 투입하여 제품을 추출해 낸 후 50mL의 소금물(Brine)을 이용하여 세척한다. 에틸 아세테이트 층을 MgSO4를 이용하여 수분을 제거한 후 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하면 언데세노일 디펩타이드(Undecenoyl dipeptide)를 얻을 수 있다. 수율은 펩타이드에 따라 다르지만 대략적으로 70-90%의 수율을 얻었다.
위와 같은 합성법을 이용하여, 하기 실시예 1~23의 언데세노일 디펩타이드 화합물을 합성하였다(표 1). 실시예 1~23은 본 발명자들의 기존 발명물질인 DermaPep™ UL(특허출원번호 PCT/KR2010/006387)에서 응용하여, 루신(Leucine), 트립토판(Tryptophan), 페닐알라닌(Phenylalanine) 또는 글라이신(Glycine) 중 조합하여 합성하였다. 여기서 L은 루신(Leucine), F는 페닐알라닌(Phenylalanine), G는 글라이신(Glycine), 그리고 W는 트립토판을 나타내며, 이 네가지 아미노산은 본 발명자의 사전 실험을 통하여 미백효능을 나타내는 구조를 고려하여 in vitro 실험계를 통해 증명, 선별하였다. 펩타이드 C-말단의 OH는 자유로운 산기(Free acid)를, OMe는 메틸 에스테르(Methyl ester)기를 나타내고, (d)는 D-형(D-form) 아미노산을 나타내고, 그러한 표시가 없는 아미노산은 l-형 아미노산을 나타낸다.
표 1
실시예 1 Undecenoyl F-OMe
실시예 2 Undecenoyl LL-OH
실시예 3 Undecenoyl LL-OMe
실시예 4 Undecenoyl LF-OH
실시예 5 Undecenoyl LF-OMe
실시예 6 Undecenoyl LW-OH
실시예 7 Undecenoyl FF-OH
실시예 8 Undecenoyl FL-OH
실시예 9 Undecenoyl FL-OMe
실시예 10 Undecenoyl FG-OH
실시예 11 Undecenoyl FW-OH
실시예 12 Undecenoyl GL-OH
실시예 13 Undecenoyl GL-OMe
실시예 14 Undecenoyl (d)L-OMe
실시예 15 Undecenoyl (d)L L -OMe
실시예 16 Undecenoyl L(d) L -OMe
실시예 17 Undecenoyl (d)L(d) L -OMe
실시예 18 Undecenoyl G(d)L-OH
실시예 19 Undecenoyl G(d)L-OMe
실시예 20 Undecenoyl F(d)L-OH
실시예 21 Undecenoyl F(d)L-OMe
실시예 22 Undecenoyl (d)FL-OMe
실시예 23 Undecenoyl (d)LF-OMe
<실험예 2> 미백효능 확인 실험 : 멜라닌 함량 및 티로시나제 효소활성 억제능 측정
상기 실시예 1~23의 언데세노일 디펩타이드 화합물들의 미백효능을 실험하였다. 피부가 흑화를 일으키는 것은 피부의 멜라닌 생성세포에서 멜라닌을 만들어 표피로 내보내기 때문이다. 따라서, 멜라닌 생성세포의 멜라닌 생성과 그 기전을 차단시킨다면, 멜라닌이 만들어 지지 않으므로 피부 흑화는 나타나지 않는다. 또한 실시예 1~23은 MC1R 의 길항제로서 기능을 할 것이므로, α-MSH 대신 MC1R에 결합하여, MC1R의 하위 신호전달 과정을 억제할 것이라고 예측하였다.
실시예 1~23의 언데세노일 디펩타이드 유도체들을 멜라닌 생성 세포에 전처리 하고, 인위적으로 멜라닌을 합성시키는 α-MSH을 처리하여, α-MSH의 피부 흑화능을 얼마나 저해하는지, 멜라닌 합성 억제율을 측정하였다. 또한 멜라닌 합성의 주요단계에 관여하는 티로시나제 효소에 대한 저해력을 측정하여 미백효능을 측정하였다. 미백원료의 효능입증에 있어서, 멜라닌형성세포 내 멜라닌 합성 억제율과 티로시나제 효소 활성 억제율을 측정하는 것은 기본 실험으로 널리 이용되고 있다.
(1) 세포배양
멜라노사이트(Melanocyte)로서 마우스 멜라노마(mouse melanoma) B16F10 세포를 사용하였다. 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)(FBS;Hyclone, Lagan, UT)이 혼합된 90% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, GibcoBRL, USA) 배지를 이용하여, 37 ℃, 5% CO2-95% 대기상태로 배양하였다 (Incubator; Thermo-scientific, USA). 항생제로는 페니실린G 및 스트렙토마이신 (Phenicilin G sodium, 100 units/L, streptomycin sulfate, 100 mg/L; GibcoBRL, USA) 을 사용하였다.
(2) MTT 분석
96-웰 플레이트의 각 웰에 세포를 2.5x103 cell/웰 (final volume 100ml)로 넣고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고, 새로운 DMEM(Phenol red-free) 배지로 갈아주었다. 각각의 웰에 미백효능 시료 및 기존 미백원료를 농도 별로 처리하였고, 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 3시간 전 10 ml의 MTT 용액 (5mg/ml in PBS)을 각 웰에 넣었다. 배양이 끝나면 각 웰의 배양액을 제거하고, 100 ml의 DMSO 용액을 넣어 생성된 Formazin을 녹였다. ELISA 리더(TECAN)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료 대신 DMSO를 처리한 음성대조군을 기준으로 세포생존율(%)을 다음 수학식 1에 의하여 환산하였다.
[수학식 1]
세포생존률(%) = [(ODsample)/ODcontrol] x 100
표 2는 여러 농도의 실시예 1~23을 처리하여 이들의 세포독성을 측정한 결과를 나타낸 표이다.
표 2 실시예 1~23의 세포생존율 (%)
농도(ppm)시료명 1 5 10 20 100 250 500
실시예1: Undecenoyl F-OMe 100 100 100 93 82 72 54
실시예2: Undecenoyl LL-OH 100 100 100 95 91 65 61
실시예3: Undecenoyl LL-OMe 100 100 101 100 88 77 65
실시예4: Undecenoyl LF-OH 100 101 99 92 82 76 52
실시예5: Undecenoyl LF-OMe 100 100 98 96 83 69 51
실시예6: Undecenoyl LW-OH 100 99 99 85 79 65 49
실시예7: Undecenoyl FF-OH 100 100 99 92 80 71 47
실시예8: Undecenoyl FL-OH 100 102 100 99 73 70 55
실시예9: Undecenoyl FL-OMe 100 100 99 101 78 65 32
실시예10: Undecenoyl FG-OH 100 100 100 98 79 57 48
실시예11: Undecenoyl FW-OH 100 98 100 95 82 68 56
실시예12: Undecenoyl GL-OH 100 100 101 98 80 64 25
실시예13: Undecenoyl GL-OMe 100 102 100 100 79 64 29
실시예14: Undecenoyl (d)L-OMe 100 102 100 97 90 81 67
실시예15: Undecenoyl (d)L L -OMe 100 100 101 99 89 76 59
실시예16: Undecenoyl L(d) L -OMe 100 100 100 97 88 70 61
실시예17: Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 100 99 99 98 85 72 57
실시예18: Undecenoyl G(d)L-OH 100 100 97 101 75 61 48
실시예19: Undecenoyl G(d)L-OMe 100 100 100 99 73 62 49
실시예20: Undecenoyl F(d)L-OH 100 97 99 98 79 59 51
실시예21: Undecenoyl F(d)L-OMe 100 100 102 99 75 55 32
실시예22: Undecenoyl (d)FL-OMe 100 100 105 102 69 56 41
실시예23: Undecenoyl (d)LF-OMe 100 100 97 92 72 69 44
DermaPep™ UL 100 100 99 93 80 64 51
각 실시예 1~23의 미백효능을 시험하기에 앞서, 세포독성을 측정한 결과, 실험에 사용한 시료들이 유효 농도 (5~30ppm)에서 세포 성장에 영향을 주지 않고, 세포 독성을 나타내지 않는 것으로 판단하고, 이후에는 적정 농도로 실험하였다.
(3) 멜라닌 합성 억제 효과 측정
6-웰 플레이트의 각 웰에 B16F10 멜라닌 생성세포를 1x105cell/웰 (Final volume 3ml)로 넣고, 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM (10% FBS)으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도 별로 만들어 30분간 전처리 하였다.
이후 α-MSH 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 PBS를 1ml씩 넣어 세포스크래퍼(Corning, USA)로 각 웰을 긁어 세포를 떼어낸 뒤, 각각을 새 1.5ml 튜브로 옮겼다. 이어서 4 ℃, 13,000rpm에서 3분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 세포펠렛을 회수하여 200ml의 라이시스 버퍼 (1% Triton X-100, 1mM PMSF, 50mM Tris-HCl (pH7.0), 2mM EDTA(pH8.0), 150mM NaCl, 4℃)를 넣었다. 30분 동안 10분 간격으로 vortex하여 세포를 용해시킨 뒤, 4°C, 13,000rpm에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고 멜라닌이 포함된 세포 펠렛을 회수하여 Ether/Isopropanol 1:1 용액 100ml 로 1회 세척하였다. 13,000rpm에서 10분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 60°C에서 약 3시간 건조시킨 뒤, 10% DMSO가 첨가된 2N NaOH를 150ml씩 넣어 60°C에서 1시간 동안 세포 내 멜라닌을 용해시켰다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 용해시켜 얻은 상층액을 100ml씩 넣어 ELISA 리더를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로 시료대신 시료를 녹인 용매인 DMSO를 시료 처리량과 같은 양 넣어 주었고, 양성 대조군으로는 시료는 처리하지 않고, α-MSH만 처리하여 멜라닌 생성을 극대화시켰다. 멜라닌 합성 억제율(%)은 다음 수학식 2에 의하여 구하였다.
[수학식 2]
멜라닌 합성 억제율(%) = [(A-C)/(A-B)] x 100
A. 양성대조군의 멜라닌의 양
B. 음성대조군의 멜라닌의 양
C. 시험물질의 멜라닌의 양
표 3은 시료들의 멜라닌 합성 억제율(%)을 측정한 도표이다.
표 3 실시예 1~23의 멜라닌 합성 억제율(%)
구분 처리 농도(ppm) 멜라닌 합성억제율(%)
양성대조군 (시료무처리, α-MSH 1ppm) DMSO 0.01% -
Arbutin 30 37
Kojic acid 200 29
DermaPep™ UL 5 8
15 37
30 74
SepiWhite™ MSH 5 11
15 8
30 63
실시예1:Undecenoyl F-OMe 5 -8
15 23
30 38
실시예2: Undecenoyl LL-OH 5 -2
15 21
30 48
실시예3: Undecenoyl LL-OMe 5 2
15 47
30 67
실시예4: Undecenoyl LF-OH 5 -7
15 -41
30 36
실시예5: Undecenoyl LF-OMe 5 -3
15 29
30 50
실시예6: Undecenoyl LW-OH 5 13
15 11
30 21
실시예7: Undecenoyl FF-OH 5 1.8
15 11
30 23
실시예8: Undecenoyl FL-OH 5 7
15 35
30 57
실시예9: Undecenoyl FL-OMe 5 1
15 36
30 69
실시예10: Undecenoyl FG-OH 5 11
15 23
30 52
실시예11: Undecenoyl FW-OH 5 1
15 28
30 41
실시예12: Undecenoyl GL-OH 5 -2
15 24
30 36
실시예13: Undecenoyl GL-OMe 5 5
15 35
30 51
실시예14: Undecenoyl (d)L-OMe 5 15
15 44
30 69
실시예15: Undecenoyl (d)L L -OMe 5 14
15 42
30 74
실시예16: Undecenoyl L(d) L -OMe 5 13
15 84
30 89
실시예17: Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 5 24
15 75
30 93
실시예18: Undecenoyl G(d)L-OH 5 4
15 25
30 54
실시예19: Undecenoyl G(d)L-OMe 5 11
15 33
30 65
실시예20: Undecenoyl F(d)L-OH 5 9
15 15
30 49
실시예21: Undecenoyl F(d)L-OMe 5 14
15 24
30 61
실시예22: Undecenoyl (d)FL-OMe 5 -2
15 5
30 42
실시예23: Undecenoyl (d)LF-OMe 5 1
15 15
30 41
상기 실험 결과, 언데세노일 디펩타이드 유도체인 실시예 1~23은 5ppm에서 30ppm으로 처방 농도를 높일수록 모두 농도 의존적 멜라닌 합성 억제 효능을 보였다. 기존의 미백 화장료로 알려진 알부틴이나 코지산보다 훨씬 우수한 멜라닌 억제 효과를 보였다. 이로써, 실시예 1~23이 미백 원료로 우수한 후보 물질임을 확인하였다.
실시예 1~23의 결과를 분석하였을 때, 동일한 디펩타이드일 때에는 말단이 -OH기 보다는 메틸 에스테르로 치환된 시료에서 더욱 우수한 멜라닌 억제 효능을 보였다(실시예 2, 3 [디펩타이드 서열 LL], 실시예 4, 5 [디펩타이드 서열 LF], 실시예 8, 9 [디펩타이드 서열 FL], 실시예 12, 13 [디펩타이드 서열 GL], 실시예 18, 19 [디펩타이드 서열 G(d)L], 실시예 20, 21 [디펩타이드 서열 F(d)L]).
디펩타이드의 서열을 비교하였을 때, 루신(Leucine)의 반복 서열에서 멜라닌 합성 억제효능이 가장 우수하였고, 루신 반복 서열끼리 비교 하였을 때에는 D-form 아미노산을 포함하는 시료에서 미백효능이 뛰어났다(실시예 3, 15, 16, 17).
기존 발명 물질인 DermaPep™ UL과 비교 하였을 때에도, 말단이 메틸 에스테르기로 치환되어 있으며, 루신 반복 서열을 같고, 이중 D-form 루신을 포함하는 실시예 14, 15, 16, 17이 특히 우수한 효과를 나타내었다. 더욱 주목할 만한 것은 DermaPep™ UL의 최고 효능 농도인 30ppm에서 나타낸 최대 멜라닌 억제율을 실시예 16, 17의 경우에는 그 절반인 15ppm만 사용해도 DermaPep™ UL 30ppm처방 효과보다 우수한 점이다. 즉, 실시예 16, 17은 더 낮은 유효농도로 더 높은 미백효과를 나타내었다.
본 실험은 모두 한번에 3번씩 진행되었고, 표 3은 5 세트 이상의 실험 결과를 분석하여 나타낸 수치이다.
(4) 티로시나제 효소 활성 억제를 통한 미백효과 증명 실험
6-웰 플레이트의 각 웰에 B16F10 멜라닌 생성세포 (또는 HEMn-LP 멜라닌 세포)를 1x105cell/웰 (Final volume 3 ml)로 넣고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도 별로 만들어 30분간 전처리 하였다.
이어서 α-MSH 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 PBS를 1ml씩 넣어 세포스크래퍼로 각 웰을 긁어 세포를 떼어낸 뒤, 각각의 1.5ml 튜브로 옮겼다. 이어서 4°C, 13,000rpm에서 3분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 세포펠렛을 회수하여 200ml의 라이시스 버퍼 (1% Triton X-100, 1mM PMSF이 함유된 100mM sodium phosphate buffer (pH6.8))를 넣었다. 30분 동안 10분 간격으로 vortex하여 세포를 용해시킨 뒤, 4°C, 13,000rpm에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. BCA protein assay kit (PIERCE, USA)를 이용하여 총 단백질 정량을 하였고, 같은 양으로 정량 된 시료를 96-웰 플레이트의 각 웰에 40ml씩 넣고, 이어서 2mg/ml로 실험 전 phosphate buffer (pH,6.8)에 바로 녹인 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)를 160ml씩 넣었다. 37°C에서 20분~60분간 반응시킨 뒤, ELISA 리더를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로 시료 대신 시료를 녹인 용매인 DMSO를 시료 처리량과 같은 양 넣어 주었고, 양성 대조군으로는 시료는 처리하지 않고, α-MSH만 처리하여 티로시나제 효소의 활성도를 극대화시켰다. 티로시나제 효소 활성 억제율(%)은 다음 수학식 3에 의하여 구하였다.
[수학식 3]
티로시나제 활성 억제율(%) = [(A-C)/(A-B)] x 100
A. 양성대조군의 티로시나제 효소 활성율
B. 음성대조군의 티로시나제 효소 활성율
C. 시험물질의 티로시나제 효소 활성율
표 4는 시료들의 티로시나제 활성 억제율(%)을 측정한 도표이다.
표 4 실시예 1~23의 티로시나제 활성 억제율(%)
구분 처리 농도(ppm) 티로시나제 활성억제율(%)
양성대조군 (시료무처리, α-MSH 1ppm) DMSO 0.01% -
Arbutin 30 47
Kojic acid 200 46
DermaPep™ UL 5 23
15 53
30 86
SepiWhite™ MSH 5 3
15 31
30 61
실시예1:Undecenoyl F-OMe 5 0
15 21
30 41
실시예2: Undecenoyl LL-OH 5 0
15 24
30 51
실시예3: Undecenoyl LL-OMe 5 1
15 33
30 71
실시예4: Undecenoyl LF-OH 5 -2
15 11
30 24
실시예5: Undecenoyl LF-OMe 5 -7
15 22
30 33
실시예6: Undecenoyl LW-OH 5 3
15 13
30 15
실시예7: Undecenoyl FF-OH 5 -4
15 -3
30 37
실시예8: Undecenoyl FL-OH 5 4
15 42
30 67
실시예9: Undecenoyl FL-OMe 5 13
15 31
30 72
실시예10: Undecenoyl FG-OH 5 -3
15 0
30 42
실시예11: Undecenoyl FW-OH 5 -5
15 -9
30 21
실시예12: Undecenoyl GL-OH 5 0
15 3
30 52
실시예13: Undecenoyl GL-OMe 5 7
15 49
30 61
실시예14: Undecenoyl (d)L-OMe 5 52
15 67
30 89
실시예15: Undecenoyl (d)L L -OMe 5 9
15 86
10 82
실시예16: Undecenoyl L(d) L -OMe 5 5
15 96
30 107
실시예17: Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 5 4
15 97
30 107
실시예18: Undecenoyl G(d)L-OH 5 6
15 42
30 70
실시예19: Undecenoyl G(d)L-OMe 5 16
15 23
30 75
실시예20: Undecenoyl F(d)L-OH 5 -1
15 12
30 39
실시예21: Undecenoyl F(d)L-OMe 5 2
15 10
30 71
실시예22: Undecenoyl (d)FL-OMe 5 0
15 2
30 62
실시예23: Undecenoyl (d)LF-OMe 5 -1
15 41
30 71
상기 실험 결과, 언데세노일 디펩타이드 유도체인 실시예 1~23은 5ppm에서 30ppm으로 처방 농도를 높일수록 모두 농도 의존적 티로시나제 효소 활성 억제 효능을 보였다. 기존의 미백 화장료로 알려진 알부틴이나 코지산보다 훨씬 우수한 티로시나제 효소 활성 억제 효과를 보였다. 이로써, 실시예 1~23이 미백 원료로서 멜라닌 생성 억제와 더불어 멜라닌 생성에 필수적인 효소인 티로시나제 효소 활성 또한 억제하는 우수한 미백 후보 물질임을 확인하였다.
실시예 1~23의 결과를 분석하였을 때, 동일한 디펩타이드일 때에는 말단이 -OH기 보다는 메틸 에스테르로 치환된 시료에서 더욱 우수한 티로시나제 효소 활성 억제 효능을 보였다(실시예 2, 3 [디펩타이드 서열 LL], 실시예 4, 5 [디펩타이드 서열 LF], 실시예 8, 9 [디펩타이드 서열 FL], 실시예 12, 13 [디펩타이드 서열 GL], 실시예 18, 19 [디펩타이드 서열 G(d)L], 실시예 20, 21 [디펩타이드 서열 F(d)L]).
디펩타이드의 서열을 비교하였을 때, 루신(Leucine)의 반복 서열에서 티로시나제 효소 활성 억제효능이 가장 우수하였고, 루신 반복 서열끼리 비교 하였을 때에는 D-form 아미노산을 포함하는 시료에서 미백효능이 뛰어났다(실시예 3, 15, 16, 17).
기존 발명 물질인 DermaPep™ UL과 비교 하였을 때에도, 말단이 메틸 에스테르기로 치환되어 있으며, 루신 반복 서열을 같고, 이중 D-form 루신을 포함하는 실시예 14, 15, 16, 17이 특히 우수한 효과를 나타내었다. 더욱 주목할 만한 것은 DermaPep™ UL의 최고 효능 농도인 30ppm에서 나타낸 최대 티로시나제 효소 활성 억제율을 실시예 16, 17의 경우에는 그 절반인 15ppm만 사용해도 DermaPep™ UL 30ppm처방 효과보다 우수한 점이다. 즉, 실시예 16, 17은 더 낮은 유효농도로 더 높은 미백효과를 나타내었다.
본 실험은 모두 한번에 3번씩 진행되었고, 표 4는 5 세트 이상의 실험 결과를 분석하여 나타낸 수치이다.
<실험예 3> 멜라닌 생성 유전자 발현 억제능 측정
실험예 2를 통하여, 실시예 1~23이 티로시나제 효소 활성 억제를 통하여, 멜라닌 합성을 억제함을 알았다. 그렇다면, 이들이 미백 효능을 보임에 있어서, 어떠한 세포 내 신호 전달 경로를 통하여 티로시나제 효소 활성을 억제하고 멜라닌 합성을 저해하는 것인지 알아 보았다.
멜라닌 생성을 자극하는 주요 신호전달 기전은 아데닐레이트 사이클레이즈(adenylate cyclase)를 통하여 세포 내 cAMP양이 증가하면서 개시된다. 따라서 실시예 1~23 에 의해 세포 내 cAMP양이 얼마나 억제되는지 측정하였다.
또한 실시예 1~23 이 정말로 MC1R 특이적인 길항제로 작용하여 미백효능을 나타내는 것인지 알아보기 위한 실험을 하였다. 실시예 1~23 중 가장 미백효과가 뛰어났던 실시예 16, 17이 MC1R 자극 외에도, 피부 흑화를 일으키는 인자인 PKA, cAMP, cGMP, PKC, ETbR 자극을 각각 주었을 때 증가하는 티로시나제 활성과 멜라닌 생성을 얼마나 억제하는지 측정하여 어느 신호전달 경로를 통하여 미백효능을 나타내는지 평가하는 실험을 하였다. 본 발명자는 본 발명의 미백 원료들은 MC1R을 타겟으로 만들어졌으므로, MC1R을 자극시키는 α-MSH에 대하여만 특이적으로 미백효능을 보일 것을 예상하였으며, MC1R과 세포 내에서 교차반응을 한다고 알려져 있는 ETbR 자극에 대해서도 세포 내 기전을 통해 어느 정도의 억제효능을 보일 것으로 예측하였다. 또한 본 발명의 미백 원료들을 MC1R 수용체에 결합하여 그 하위 신호전달 기전을 막을 것이므로, MC1R 자극에 의해 활성화 되는 세포 내 단백들(PKA, cAMP, cGMP, PKC)을 자극할 때에는, 세포막에 존재하는 MC1R에 결합한 미백원료가 효능을 미치지 못할 것으로 예상할 수 있었다.
다음으로는, 멜라노사이트가 피부 흑화 자극을 받으면, 그 하위 신호전달체계가 활성화되어, tyrosinase, TRP1, TRP2 등의 멜라닌 생성 관련 유전자의 전사가 촉진되는데, 실시예 1~23의 피부 흑화 관련 유전자의 전사 억제율(%)을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다.
(1) 실시예 1~23의 cAMP 억제효과
cAMP ELISA kit (Assay Design, USA)을 이용하여 세포 내에 방출된 cAMP양을 측정하였다. 피부 흑화의 세포 신호 전달 시 발생되는 cAMP의 양을 얼마나 억제하는지 그 양을 ELISA (효소결합 면역 흡착법; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)법을 통해 측정하여 그 결과를 표 5에 기재하였다. 세포 내 cAMP양은 BCA 단백질 정량법을 이용해 측정한 각 시료 별 단백량으로 표준화하였다.
표 5 실시예 1~23의 세포 내 cAMP 억제율(%)
구분 처리 농도(ppm) cAMP 억제율(%)
양성대조군 (시료무처리, α-MSH 1ppm) DMSO 0.01% -
DermaPep™ UL 30 39
SepiWhite™ MSH 30 36
실시예1:Undecenoyl F-OMe 30 41
실시예2: Undecenoyl LL-OH 30 44
실시예3: Undecenoyl LL-OMe 30 42
실시예4: Undecenoyl LF-OH 30 38
실시예5: Undecenoyl LF-OMe 30 41
실시예6: Undecenoyl LW-OH 30 27
실시예7: Undecenoyl FF-OH 30 28
실시예8: Undecenoyl FL-OH 30 15
실시예9: Undecenoyl FL-OMe 30 22
실시예10: Undecenoyl FG-OH 30 19
실시예11: Undecenoyl FW-OH 30 14
실시예12: Undecenoyl GL-OH 30 21
실시예13: Undecenoyl GL-OMe 30 31
실시예14: Undecenoyl (d)L-OMe 30 52
실시예15: Undecenoyl (d)L L -OMe 30 55
실시예16: Undecenoyl L(d) L -OMe 30 50
실시예17: Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 30 49
실시예18: Undecenoyl G(d)L-OH 30 44
실시예19: Undecenoyl G(d)L-OMe 30 34
실시예20: Undecenoyl F(d)L-OH 30 37
실시예21: Undecenoyl F(d)L-OMe 30 31
실시예22: Undecenoyl (d)FL-OMe 30 33
실시예23: Undecenoyl (d)LF-OMe 30 26
상기 실험결과를 통하여, 실시예 1~23은 세포 내 cAMP 양을 억제하여 그 하위 신호전달 경로인 티로시나제 효소 활성에 영향을 주고, 멜라닌 합성을 억제한 것임을 알 수 있다. 실시예 1~23은 MC1R 길항제로 만들어 졌으므로, MC1R 하위 시그널인 아데닐레이트 사이클레이즈(adenylate cyclase) 활성이 억제되어 세포 내 cAMP 방출이 줄어든 것은 자명한 결과이다.
본 실험은 모두 한번에 2번씩 진행되었고, 표 5는 2 세트 이상의 실험 결과를 분석하여 나타낸 수치이다.
(2) 실시예 16, 17의 MC1R-특이적 길항제로서 작용여부 확인
본 발명에서 사용한 언데세노일 디펩타이드 유도체는 DermaPep™ UL을 변형하여 합성하였다. DermaPep™ UL이 MC1R 특이적 길항제임은 이미 증명되어있다(특허출원번호 PCT/KR2010/006387). 따라서 실시예 1~23중 가장 효과가 우수했던 실시예 16, 17을 선정하여, MC1R-특이적인 길항제로서 작용하여 미백효능을 나타내는 것인지 알아보았다. 멜라노사이트를 자극하여 멜라닌 합성을 촉진시키는 서로 다른 자극을 주고, 이것을 실시예 16, 17이 얼마나 효과적으로 차단시키는지 멜라닌 생성 억제율(%)과 티로시나제 효소활성 억제율(%)을 통하여 증명하였다.
α-MSH (MC1R 자극), Endothelin (16-21) (ETbR 자극), Forskolin (PKA 자극), 8-Bromo-cAMP (cAMP 자극), 8-Bromo-cGMP (cGMP 자극), PMA (PKC 자극)를 처리하여 증가되는 멜라닌 합성 및 티로시나제 효소활성에 실시예 16, 17이 어떠한 효과를 나타내는지를 멜라닌 합성 억제율(%)은 표 6에, 티로시나제 효소활성 억제율(%)은 표 7에 기재하였다.
멜라닌 자극에 사용한 시약은 아래와 같은 농도로 처리하였다.
α-MSH : 1ppm (Synthesis)
Endothelin(16-21) : 10ppm (Synthesis)
Forskolin : 20ppm (Sigma, USA)
8-Bromo-cAMP : 10ppm (Sigma, USA)
8-Bromo-cGMP : 10ppm (Sigma, USA)
PMA : 20ppm (Sigma, USA)
표 6 각종 멜라닌 생성 자극에 따른 실시예 16, 17의 멜라닌 합성 억제율(%)
구분 처리 농도(ppm) α-MSH Endothelin (16-21) Forskolin 8-Br-cAMP 8-Br-cGMP PMA
음성대조군(시료무처리) DMSO 0.01% - - - - - -
DermaPep™ UL 15 38 23 0 2 0 -22
30 65 39 -11 3 -8 -25
실시예 16:Undecenoyl L(d) L -OMe 15 61 44 -13 0 -3 -21
30 73 53 -21 0 -2 -10
실시예 17:Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 15 72 39 -9 -5 -5 2
30 81 55 -14 -12 -9 -18
표 7 각종 멜라닌 생성 자극에 따른 실시예 16, 17의 티로시나제 효소활성 억제율(%)
구분 처리 농도(ppm) a-MSH Endothelin (16-21) Forskolin 8-Br-cAMP 8-Br-cGMP PMA
음성대조군(시료무처리) DMSO 0.01% - - - - - -
DermaPep™ UL 15 39 22 -1 -22 -1 -2
30 75 42 1 -5 0 0
실시예 16:Undecenoyl L(d) L -OMe 15 82 54 0 -2 4 -2
30 92 61 -24 -14 3 -5
실시예 17:Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 15 85 42 2 0 -3 -21
30 99 59 -13 0 -6 -12
상기 표 6, 7의 결과로 알 수 있듯이, 실시예 16, 17은 MC1R에 의한 멜라닌 생성 자극을 받았을 때, 멜라닌 생성억제와 티로시나제 효소활성 억제율이 가장 우수했다. Forskolin, 8-Bromo-cAMP, 8-Bromo-cGMP, PMA에 의한 PKA, Adenylate cyclase, cGMP, PKC자극은 MC1R 길항제가 작용하는 신호전달 메커니즘의 하위단계에 있어서, 실시예 16, 17은 이들에 의한 피부 흑화 자극을 막을 수 없었다. 특이한 점은, Endothelin (16-21)에 의한 ETbR 자극 반응도 어느 정도의 억제효과를 보인 점이다. 이것은 ETbR과 MC1R이 세포 내에서는 여러 분자들을 공유하며 cross-talk을 하기 때문이라고 가정하였다. 이로써, 본 발명의 MC1R 길항제들은 ETbR 신호전달 체계와 cross-talk을 하며, MC1R 에 결합, 미백효능을 보임을 증명하였다.
(3) 실시예 1~23의 피부 흑화 관련 유전자의 mRNA 억제효능
60mm 접시에 B16F10 멜라닌 생성 세포를 5x105 cell/웰 (Final volume 5ml)로 넣고, 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도 별로 만들어 30분간 전처리 하였다.
이후 α-MSH 1ppm을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 PBS 1ml로 세척한 뒤, easy-spin™ (DNA free) Total RNA extraction kit (Intron, Korea)을 이용하여 RNA를 추출하였다. PCR Primer는 mouse의 beta-actin, tyrosinase, TRP1, TRP2, MITF, POMC를 제작하였고, 94°C 1분, 60°C 1분, 72°C 1분의 조건으로 30회 증폭하였다. PCR product는 1% agarose gel에 로딩하여 20분간 전기영동하고 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다. Densitometer로 수치화한 mRNA량은 beta-actin수치로 나누어 정량 하였다. 프라이머 서열은 표 8과 같다.
표 8 피부 흑화 관련 유전자의 PCR 프라이머 서열
유전자 이름 Forward primer (5' → 3') Reverse primer (5' → 3')
Tyrosinase GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT TGG TGC TTC ATG GGC AAA ATC
TRP1 GCT GCA GGA GCC TTC TTT CTC AAG ACG CTG CAC TGC TGG TCT
TRP2 GGA TGA CCG TGA GCA ATG GCC CGG TTG TGA CCA ATG GGT GCC
Beta-actin TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G
표 8에서 언급된 유전자의 억제효능을 측정한 결과는 하기 표 9에 기재하였다.
표 9 RT-PCR 분석법을 통한 실시예 1~23의 피부 흑화 관련 유전자 mRNA 억제율(%) 실험 결과
구분 최대효능농도(ppm) Tyrosinase mRNA억제율 (%) TRP1 mRNA억제율 (%) TRP2 mRNA억제율 (%)
음성대조군(시료무처리) DMSO 0.01% - - -
Arbutin 20 74 49 52
Kojic acid 200 72 71 72
DermaPep™ UL 30 140 69 125
실시예 1 30 121 110 109
실시예 2 30 74 71 102
실시예 3 30 76 44 65
실시예 4 30 83 38 57
실시예 5 30 92 46 69
실시예 6 30 96 63 88
실시예 7 30 97 112 113
실시예 8 30 45 33 -21
실시예 9 30 78 60 72
실시예 10 30 63 64 57
실시예 11 30 68 71 -31
실시예 12 30 -15 -21 2
실시예 13 30 53 76 -2
실시예 14 30 98 144 108
실시예 15 30 99 156 99
실시예 16 30 111 162 69
실시예 17 30 115 179 73
실시예 18 30 19 49 -
실시예 19 30 91 104 -
실시예 20 30 33 -6 -
실시예 21 30 50 -28 -
실시예 22 30 56 -15 -
실시예 23 30 105 17 108
상기 표 9에서 보는 바와 같이 실시예 1~23은 Tyrosinase 및 TRP1, TRP2의 mRNA를 대체적으로 억제시켰고, 이로써, MC1R 길항제인 실시예 1~23이 MC1R에 결합하여 멜라닌 합성과 티로시나제 효소활성을 억제함에 있어서 tyrosinase, TRP1, TRP2 유전자의 mRNA를 억제하여, 전사 레벨에서의 억제를 통해 미백 효능을 억제함을 증명하였다. 또한 실시예 1~23 중 실시예 16, 17의 억제 효능이 가장 우수했다.
본 실험은 3회 이상의 재현성 확인 결과를 종합하여, 평균치로 나타내었다.
이로써, <실험예 2, 3>를 통하여, MC1R 길항제인 실시예 1~23은 MC1R-특이적인 길항제로 작용하며(표 6, 7), 세포 내 cAMP 양을 감소시키고(표 5), tyrosinase, TRP1, TRP2와 같은 피부 흑화 관련 유전자의 전사를 억제하여(표 9), 티로시나제 효소 활성과 멜라닌 생합성을 억제함으로써(표 3, 4) 미백효능을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
<실험예 4>
상기 실시예 1~23이 나타내는 α-MSH-induced melanogenesis 억제 반응이 미백 시료를 회수하고 α-MSH만 다시 처리하였을 때, 가역적으로 다시 멜라닌 합성을 증가시키는지, 아니면 비가역적으로 한번 감소한 멜라닌에 대하여 세포내 멜라닌 합성 기구의 영구적 손상을 일으켜 미백 시료를 회수하고, 다시 α-MSH로 멜라닌 합성 자극을 주어도 다시는 멜라닌 합성을 증가시키지 않는지를 확인하고자 실험으로 증명하였다. 본 실험은 실시예 1~23중 실시예 16, 17을 선정하여 실험하였다.
이미 기존 실험을 통해 DermaPep™ UL의 미백 효과는 시료를 회수하면, 다시 가역적으로 정상적인 멜라노사이트의 멜라닌 합성 기능을 회복시킴을 확인하였다.
실시예 16, 17과 α-MSH를 처리하고 48시간 동안 배양한 후, 배지를 새 배지로 교체하면서, 실시예 16, 17은 더 이상 처리하지 않고, α-MSH만 계속 처리하였다.
멜라닌 합성 억제율(%)과 티로시나제 효소 활성 억제율(%)은 다음 표 10 및 11과 같다.
표 10 실시예 16, 17 처리 48시간 후, 회수 시 멜라닌 합성 억제율(%)
구분 처리 농도(ppm) 시료를 회수 하지 않았을 때,α-MSH와 시료 계속 처리시 48시간 뒤, 시료 회수α-MSH만 계속 처리시
음성대조군(시료무처리) DMSO 0.01% - -
DermaPep™ UL 5 3.7 5
15 31 -27
30 79 44
실시예 16:Undecenoyl L(d) L -OMe 5 23 -1
15 89 24
30 88 31
실시예 17:Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 5 6 2
15 77 33
30 92 42
표 11 실시예 16, 17 처리 48시간 후, 회수 시 티로시나제 활성 억제율(%)
구분 처리 농도(ppm) 시료를 회수하지 않았을 때,α-MSH와 시료 계속 처리시 48시간 뒤, 시료 회수α-MSH만 계속 처리시
음성대조군(시료무처리) DMSO 0.01% - -
DermaPep™ UL 5 4 31
15 32 0
30 70 48
실시예 16:Undecenoyl L(d) L -OMe 5 11 1
15 76 24
30 82 39
실시예 17:Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 5 3 -3
15 71 35
30 85 42
상기 실험 결과에서 알 수 있듯이, DermaPep™ UL, 실시예 16, 17을 회수 하지 않고 계속 처리하면, 농도 의존적으로 멜라닌 합성과 티로시나제 효소활성이 억제되었으나, 미백 효능이 충분이 나타나는 시간인 48시간 뒤, DermaPep™ UL, 실시예 16, 17을 회수하고 α-MSH만 처리하자, 다시 멜라닌 함량과 티로시나제 효소 활성이 증가하였다. 이 결과를 통해, DermaPep™ UL을 비롯, 실시예 16, 17의 미백효과는 세포 내 멜라닌 합성 관련 기전을 파괴하는 것이 아닌, MC1R 수용체 레벨에서의 가역적 반응임을 알 수 있다.
<실험예 5>
α-MSH는 피부 흑화를 일으키지만, 각종 염증자극에 대하여 억제효과를 갖는 것은 잘 알려져 있다. 그렇기 때문에 MC1R 길항제로서 미백효능을 갖는 미백 원료들은 염증반응을 일으킬 수 있다는 문제점이 지적되어 왔다. 본 실험예 5에서는 실시예 1~21의 항염 효능을 시험하였다. 기존 발명물인 DermaPep™ UL이 자외선에 대한 염증반응을 억제하는 것을 확인하였고(특허 출원번호 : PCT/KR2010/006387), 실험예 3을 통하여 실시예 16, 17이 MC1R 길항제이면서, ETbR에 대하여도 억제효능을 보임을 확인하였으므로, ETbR 길항제가 갖는 항염 효능을 기대해 볼 수 있었다. 실시예 1~23의 항염 효능은 UVB로 증가된 각종 염증 관련 사이토카인을 얼마나 감소시키는지 mRNA 유전자억제율과 ELISA (효소결합 면역 흡착법; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)법을 이용한 단백량 측정을 통해 확인하였다.
(1) 세포 배양
Keratinocyte로서 Human keratinocyte HaCaT 세포를 사용하였다. 세포는 10% fetal bovine serum(FBS;Hyclone, Lagan, UT)이 혼합된 90% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM, GibcoBRL, USA) 배지를 이용하여, 37˚C, 5% CO2-95% 대기상태로 배양하였다 (Incubator; Thermo-scientific, USA). 항생제로는 페니실린G 및 스트렙토마이신 (Phenicilin G sodium, 100 units/L, streptomycin sulfate, 100 mg/L; GibcoBRL, USA) 을 사용하였다.
(2) 실시예 1~23의 피부 염증 관련 유전자의 mRNA 억제효능
60mm 접시에 HaCaT 각질 형성 세포를 6x105 cell/웰 (Final volume 5ml)로 넣고, 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 serum-free DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도 별로 만들어 4시간 전처리 하였다.
이후 PBS 버퍼 상태에서 UV-B(100mJ/cm2)을 처리하고 다시 serum-free DMEM 배지로 교체하여 다시 시료를 처리한 뒤, 8시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 PBS 1ml로 워싱한 뒤, easy-spin™ (DNA free) Total RNA extraction kit (Intron, Korea)을 이용하여 RNA를 추출하였다. PCR Primer는 human 의 gapdh, Interleukin-1a(IL-1a), Interleukin-1b(IL-1b), Interleukin 6(IL-6), Interleukin 8(IL-8)을 제작하였고, 94°C 1분, 52°C 1분, 72°C 1분의 조건으로 5회 증폭 후, 56°C 1분, 72°C 1분의 조건으로 30회 증폭 하였다. PCR product는 1% agarose gel에 로딩하여 20분간 전기영동하고 EC3 UV illuminator (UVP, USA)를 이용하여 확인하였다. Densitometer로 수치화한 mRNA량은 gapdh수치로 나누어 정량 하였다. 그 Primer 서열은 표 12와 같다.
표 12 피부 염증 관련 유전자의 PCR primer 서열
유전자 이름 Forward primer (5' → 3') Reverse primer (5' → 3')
IL-1a CTC TCT GAA TCA GAA ATC CTT CTA TC CTA GTC AAA TTT CAC TGC TTC ATC C
IL-1b TGG AGA ACA CCA CTT GTT GCT CCA AAA CAG ATG AAG TGC TCC TTC CAG G
IL-6 GCC TTC GGT CCA GTT GCC TT GCA GAA TGA GAT GAG TTG TC
IL-8 ATG ACT TCC AAG CTG GC GTG GCT TCT CAG CCC TCT TCA AAA ACT TCT C
GAPDH CAA AAG GGT CAT CAT CTC TG CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG
표 12에서 언급된 유전자의 억제효능을 측정한 결과는 다음 표 13에 기재하였다.
표 13 RT-PCR 분석법을 통한 실시예 1~21의 피부 염증 관련 유전자 mRNA 억제율(%) 실험 결과
구분 최대효능농도(ppm) IL-1α mRNA억제율 (%) IL-1β mRNA억제율 (%) IL-6 mRNA억제율 (%) IL-8 mRNA억제율 (%)
음성대조군(시료무처리) DMSO 0.01% - - -
DermaPep™ UL 30 69 51 38 68
SepiWhite™ MSH 30 66 41 41 64
α-MSH 1 102 26 71 77
실시예 1 30 -39 10 31 51
실시예 2 30 38 41 20 8
실시예 3 30 81 30 33 33
실시예 4 30 40 33 25 6
실시예 5 30 116 15 42 52
실시예 6 30 11 40 65 59
실시예 7 30 12 21 -12 -134
실시예 8 30 -9 22 -7 15
실시예 9 30 62 24 -14 33
실시예 10 30 97 16 -8 -12
실시예 11 30 96 33 23 2
실시예 12 30 12 34 -1 48
실시예 13 30 45 14 29 69
실시예 14 30 81 29 57 76
실시예 15 30 66 43 71 75
실시예 16 30 79 42 50 69
실시예 17 30 66 48 61 65
실시예 18 30 25 6 39 -43
실시예 19 30 13 29 29 33
실시예 20 30 8 26 -8 73
실시예 21 30 39 0 44 -72
상기 표 13에서 보는 바와 같이 실시예 1~21은 정도의 차이는 있으나 전반적으로 UV-B에 의해 증가된 염증관련 사이토카인(Cytokine)인 IL-1a, IL-1b, IL-6, IL-8을 효과적으로 억제하였다.
(3) ELISA (효소결합 면역 흡착법; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)법
ELISA (효소결합 면역 흡착법; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)법을 하여 단백량을 측정하였다.
60mm 접시에 HaCaT 각질 형성 세포를 6x105 cell/웰 (Final volume 5ml)로 넣고, 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 각 웰의 배지를 제거하고 새로운 serum-free DMEM으로 교체하였다. 각각의 웰에 미백효능 시료를 농도 별로 만들어 4시간 전처리 하였다.
이후 PBS 버퍼 상태에서 UV-B(100mJ/cm2)을 처리하고 다시 serum-free DMEM 배지로 교체하여 다시 시료를 처리한 뒤, 24시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 PBS 1ml로 세척한 뒤, PBS 1ml을 넣어 세포스크래퍼로 각 웰을 긁어 세포를 떼어낸 뒤, 각각의 1.5ml 튜브로 옮겼다. 이어서 4°C, 13,000rpm에서 3분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 회수하여 200ml의 0.15M RIPA buffer(50mM TRIS, 150mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% Sodium deoxycholate, 1% Triton X-100, 1% NP-40, 100mM PMSF)를 넣었다. 30분 동안 10분 간격으로 vortex하여 세포를 용해시킨 뒤, 4°C, 13,000rpm에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮겼다. BCA protein assay kit (PIERCE, USA)를 이용하여 총 단백질 정량을 하였고, 같은 양으로 정량 된 시료를 준비하였다. ELISA용 strip은 ELISA 플레이트에 끼워, coating 30분(0.1% Glutaraldehyde in PBS), 세척 3회(0.1% Tween20 in PBS)한 뒤, 시료를 100ml씩 넣어 37°C에서 3시간 반응시켰다. 이후 세척을 3회 반복한 뒤, blocking buffer를 100ml씩 넣어 37°C에서 1시간 반응하였다. 세척 3회 후, blocking buffer에 희석한 1차 항체 IL-1β와 IL-6(antibody titer 1:1000, Santacruz, USA)를 각 웰에 100ml씩 넣어 37°C에서 3시간 반응하고, 세척 3회 후, 2차 항체 (anti-rabbit, titer 1:2000, Santacruz, USA)를 100ml씩 넣어 37°C에서 1시간 반응시켰다. 2차 항체를 3회 이상 세척 후, TMB 용액(Sigma, USA)를 100ml씩 넣어 상온에서 10~30분간 반응시킨 뒤, 1N H2SO4를 50ml씩 넣어 반응을 종결시킨다. 흡광도는 ELISA 리더(TECAN, USA)를 이용하여 450nm에서 측정하였다. 단백량 발현 억제율(%)은 다음 수학식 4에 의하여 구하였다.
[수학식 4]
단백량 발현 억제율(%) = [(A-C)/(A-B)] x 100
A. UV-B(100mJ/cm2) 처리군의 흡광도
B. 음성대조군의 흡광도
C. 시험물질의 흡광도
본 실험은 실시예 16, 17을 지정하여 실험하였고, UVB에 의해 증가한 IL-1β와 IL-6 단백질 발현 억제율은 하기 표 14에 나타내었다.
표 14 실시예 16, 17의 IL-1β와 IL-6 단백질 발현 억제율(%)
구분 처리 농도(ppm) IL-1β 단백 발현 억제율 (%) IL-6 단백 발현 억제율 (%)
음성대조군(시료무처리) DMSO 0.01% - -
DermaPep™ UL 15 24 15
30 33 24
실시예 16:Undecenoyl L(d) L -OMe 15 21 18
30 17 19
실시예 17:Undecenoyl (d)L(d) L -OMe 15 32 22
30 21 15
상기 표 14에서는 대표로 실시예 16, 17만 지정하여 단백질량을 측정하였으나, 표 13을 종합하여 해석하면, 나머지 실시예들도 유전자 레벨 뿐만 아니라, 단백질량 또한 줄일 것임을 추측할 수 있다.
이로써, 실시예 1~23은 MC1R 길항제로 작용하여 미백효능을 나타냄과 동시에, ETbR 하위의 염증 관련 신호전달 과정을 억제함(표 13, 14)으로써 항염 효능을 가짐을 알 수 있다.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 소량으로도 탁월한 미백효과를 제공할 뿐 아니라, 기존의 미백 원료인 DermaPepTM UL과 비교하였을 때에도, 더욱 월등한 미백 효과를 보인다. 상기에서 본 발명은 기제된 실험예를 중심으로 상세히 설명되었지만, 본 발명의 범주 및 기술 사상 범위 내에서 다양한 변형 과 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백하며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허 청구범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (7)

  1. 하기 [화학식 1]로 표시되는 언데세노일 디펩타이드 유도체.
    [화학식 1]
    CH2=CH(CH2)8-C(=O)-A1-A2-OR
    상기 화학식에서, -C(=O)-는 카보닐을 의미하고, A1, A2는 아미노산 잔기로서, 각각 Leu, Phe, Trp 및 Gly중에서 선택되는 것이고, 이때 Leu, Phe 및 Trp는 L- 또는 D-형(form) 또는 그것들의 혼합형이며, R은 H, C1~C18 알킬, 페닐, 또는 벤질이며, 언데세노일 그룹은 A1의 아민기와 결합하는 것이고, OR은 A2의 카르보닐 그룹에 결합하는 것임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서 A1과 A2는 L- 또는 D-형 또는 그것들의 혼합형의 류신으로 구성되며 R은 메틸기임을 특징으로 하는 언데세노일 디펩타이드 유도체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 언데세노일 디펩타이드 유도체는 언데세노일-L-(d)L-OMe, 언데세노일-(d)L-L-OMe 그리고 언데세노일-(d)L(d)L-OMe이고, 여기에서 L은 l-형 류신을 의미하고, (d)L은 d-형 류신을 의미하는 것을 특징으로 하는 언데세노일 디펩타이드 유도체.
  4. 제1항에서 제3항까지의 항 들 중 어느 한 항에 따른 언데세노일 디펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 언데세노일 디펩타이드 유도체는 상기 피부미백용 화장료 조성물 전체 중량에 대하여, 0.0001 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 피부미백용 화장료 조성물은 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌징, 및 비누로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형으로 이루어진 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
  7. 제1항에서 제3항까지의 항 들 중 어느 한 항에 따른 언데세노일 디펩타이드 유도체를 유효성분으로 포함하는, 자외선과 관련된 염증 질환을 예방하는 화장료 조성물.
PCT/KR2012/000697 2011-03-18 2012-01-30 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물 WO2012128464A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020110024148A KR101250812B1 (ko) 2011-03-18 2011-03-18 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물
KR10-2011-0024148 2011-03-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012128464A1 true WO2012128464A1 (ko) 2012-09-27

Family

ID=46879566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2012/000697 WO2012128464A1 (ko) 2011-03-18 2012-01-30 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101250812B1 (ko)
WO (1) WO2012128464A1 (ko)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5401773A (en) * 1990-02-22 1995-03-28 Roussel-Uclaf Lactic acid acylates
JPH0853332A (ja) * 1994-08-11 1996-02-27 Kao Corp 美白化粧料
JPH107540A (ja) * 1996-06-17 1998-01-13 Kao Corp 美白化粧料
US6242644B1 (en) * 1998-12-14 2001-06-05 Hoffmann-La Roche Inc. N-(4-carbamimidoyl-phenyl)-glycine derivatives
US20070232698A1 (en) * 2004-05-31 2007-10-04 Akira Shibuya Slimming Skin External Preparation and Cosmetic Containing the Same
US20080234224A1 (en) * 2004-03-31 2008-09-25 Motoaki Kamachi External Preparation For Skin

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101109737B1 (ko) * 2009-10-09 2012-02-15 미원상사주식회사 지방산 아미노에스테르 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5401773A (en) * 1990-02-22 1995-03-28 Roussel-Uclaf Lactic acid acylates
JPH0853332A (ja) * 1994-08-11 1996-02-27 Kao Corp 美白化粧料
JPH107540A (ja) * 1996-06-17 1998-01-13 Kao Corp 美白化粧料
US6242644B1 (en) * 1998-12-14 2001-06-05 Hoffmann-La Roche Inc. N-(4-carbamimidoyl-phenyl)-glycine derivatives
US20080234224A1 (en) * 2004-03-31 2008-09-25 Motoaki Kamachi External Preparation For Skin
US20070232698A1 (en) * 2004-05-31 2007-10-04 Akira Shibuya Slimming Skin External Preparation and Cosmetic Containing the Same

Also Published As

Publication number Publication date
KR101250812B1 (ko) 2013-04-04
KR20120106198A (ko) 2012-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013129801A1 (ko) 트리펩타이드 및 이를 함유하는 노화방지, 주름개선, 미백 및 항염효능의 화장료 조성물
AU2020377805A1 (en) Melanocortin-4 receptor agonists
WO2013137505A1 (ko) 신규한 ｔｒｐｖ１ 억제 펩티드 및 이를 함유하는 피부노화 방지 또는 주름 개선용 조성물
WO2017142305A1 (ko) 발모 촉진 활성 및/또는 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도
WO2021010723A1 (en) Melanophilin antisense oligonucleotides
WO2015037778A1 (ko) 리그난 화합물을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
WO2016080796A2 (ko) 세스퀴테르펜 화합물을 포함하는, stat3 매개 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도
WO2014003232A1 (ko) 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 조성물
WO2019088402A1 (ko) 뷔베리신 또는 뷔베리신 유도체를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물
WO2019059634A1 (ko) D-타이로신 또는 이를 포함하는 펩타이드를 포함하는 피부 미백용 조성물
WO2020180059A1 (ko) 플라즈마 활성 배양액을 포함하는 멜라닌 생산용 조성물 및 이의 용도
WO2020055129A1 (ko) 베르베논 유도체를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물
WO2012128464A1 (ko) 언데세노일 디펩타이드 유도체 및 이를 함유하는 피부미백용 화장료 조성물
WO2015102390A1 (ko) 신규한 아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2017099531A1 (ko) 신규 페놀산류 유도체 화합물, 및 이의 용도
WO2021251790A1 (ko) 항비만 활성을 가지는 디옥시콜산-펩타이드 결합체 및 이의 용도
WO2023106897A1 (ko) 신규 아디포넥틴 유래 펩타이드 유도체 및 이의 용도
WO2023106896A1 (ko) 신규 아디포넥틴 유래 펩토이드 유도체 및 이의 용도
WO2019231175A1 (ko) 멜라닌 생성 억제 활성을 갖는 카르복시 말단이 아미드화된 펩타이드와 이를 포함하는 조성물
WO2019231262A1 (ko) 신규 바이페닐 유도체 화합물 및 이의 용도
WO2014185561A1 (ko) 신규한 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 ｕｃｈ－ｌ１ 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019132610A1 (ko) Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도
WO2019009645A1 (ko) 피부 미백용 조성물
WO2019009627A1 (ko) 피부 미백용 조성물
WO2024106821A1 (ko) 피부 미백 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12761442

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12761442

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1