RU2796929C2 - Способы получения происходящих из мышц клеток - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к способу получения популяции клеток, происходящих из скелетных мышц (SMDCs), и к популяции SMDCs, полученной таким способом. Для осуществления указанного способа сначала охлаждают образец, полученный из ткани скелетных мышц, в буфере. Затем обрабатывают последующим охлаждением образца, причём охлаждение выполняют при температуре от 1 до 16°C в течение периода времени от 2 часов до 48 часов. Далее образец ресуспендируют среде с сывороткой, содержащей по меньшей мере один фермент, и нагревания до 25 - 38°С в течение 1-20 часов, осаждают образец центрифугированием. После чего осадок образца ресуспендируют для получения суспензии одиночных клеток из образца с получением таким образом популяции SMDCs. Полученная клеточная популяция SMDCs обладает миогенной активностью и компетентностью к слиянию, а также содержит по меньшей мере 90% CD56-позитивных, 90% A2B5-позитивных, 90% CD105-позитивных и 90% десмин-позитивных клеток. Настоящее изобретение позволяет расширить арсенал способов получения SMDCs популяций, которые могут быть применены для предупреждения или лечения нейромиопатий или миопатий, в частности недержания мочи или анального недержания, недержание кала. 2 н. и 16 з.п. ф-лы, 10 ил., 12 пр.

Description

Настоящее изобретение относится к способам получения происходящих из скелетных мышц клеток (SMDC), к применению SMDC в способе улучшения нейро-мышечного соединения и для применения в лечения мышечной дисфункции, где мышечная дисфункция представляет собой недержание, в частности недержание мочи и/или анальное недержание.

Способность контролировать функцию мочевого пузыря и кишечника имеет важное значение для нашего благополучия как социальных существ. Потеря анального контроля приводит к физическим, физиологическим и социальным ограничениям. Обычно полагают, что анальным недержанием страдают в основном пожилые люди и люди с ограниченными возможностями, однако эти симптомы могут возникать у людей любого возраста. Спектр анального недержания, то есть потери контроля за содержимым кишечника, варьируется от незначительных следов фекалий на нижнем белье до выделения газов из кишечника, вплоть до эпизодов массивных неконтролируемых дефекаций мягких или твердых фекалий. Причины этого могут быть многоуровневыми и сложными. Независимо от чрезвычайно ухудшенного качества жизни для пострадавшего индивидуума, нарушенный анальный контроль приводит к высокому фактору затрат системы здравоохранения, который не следует недооценивать. Кроме того, анальное недержание представляет собой вторую наиболее частую причину госпитализации в домах престарелых (более частую, чем слабоумие). Треть пожилых людей в домах престарелых или больницах имеют недержание кала.

Две скелетные мышцы важны для произвольного контроля за органами удерживания: Musculus sphincter ani externus и Musculus puborectalis как часть Musculus levator ani. Скорее всего, оставшаяся мышца Diaphragma pelvis (M. pubococcygeus, M. ischiococcygeus, M. iliococcygeus) играет более или менее вспомогательную роль. Внешний анальный сфинктер поддерживается N. pudendus. Обе мышцы, Musculus sphincter ani externus и Musculus puborectalis, могут поддерживать постоянный тонус, прямо пропорциональный объему/количеству заполнения прямой кишки, который уменьшается с началом процесса дефекации. Постоянный исходный тонус М. puborectalis приводит к "изгибу" аноректального перехода в сторону симфиза с образованием угла 90° между анальным каналом и прямой кишкой. Этот аноректальный угол также способствует поддержанию анального удержания. Дополнительная функция М. puborectalis заключается в удержании по меньшей мере частично сформированных фекалий при повреждении внешнего анального сфинктера.

Контроль за выделением газов или жидких фекалий с помощью М. puborectalis невозможен. Анальное удержание этих типов фекалий обеспечивается посредством взаимодействия внутреннего и внешнего анального сфинктера. Геморроидальные подушки обеспечивают герметичную преграду. В состоянии покоя анальный канал перекрыт посредством постоянной тонической активности наружных анальных сфинктеров и базовым давлением покоя внутреннего анального сфинктера. Внутренний анальный сфинктер, являющийся продолжением и расширением кругового гладкомышечного слоя толстой кишки, обеспечивает примерно 75-85% исходного давления закрытого анального канала. Активность этого компонента гладкой мышцы полностью ингибируется растяжением прямой кишки, так называемым ректальным анальным ингибирующим рефлексом. Это расслабление сопровождается рефлекторным сокращением внешнего анального сфинктера и М. puborectalis для предупреждения дефекации.

Как указано выше, современные способы лечения главным образом направлены на хирургическую коррекцию разрыва сфинктера. Это приводит к кратковременному улучшению симптомов, как указано выше.

Легкие формы анального недержания можно лечить консервативными методами лечения, что может привести к улучшению симптомов. Однако в более серьезных случаях соответствующее хирургическое вмешательство часто приводит к кратковременному улучшению с небольшим шансом на успех.

Консервативные способы лечения включают изменение питания в дополнение к повышенному потреблению волокон, а также, в случаях с нарушенной анальной чувствительностью, использование анальных тампонов и ректальной клизмы. Прием лоперамида, при необходимости также в сочетании с веществами, связывающими желчные кислоты, снижает моторику кишечника и повышает давление анальной сфинктерной мышцы. Новая форма терапии использует локально применяемый местный эстроген для женщин после менопаузы, однако рандомизированные исследования отсутствуют.

Однако определенному числу пациентов требуется хирургическое вмешательство: чаще всего реконструкция сфинктера (апроксимальная или перекрывающаяся) применяется для неотложного лечения травм после родов, но также вторично после травм анального сфинктера, вызванных другими обстоятельствами. При этом краткосрочные перспективы хорошие, а долгосрочные результаты плохие.

Для недержания мочи при напряжении было предложено вводить клетки мышечного происхождения в поврежденный участок для исправления недержания мочи при напряжении. Однако недержание мочи при напряжении несопоставимо с анальным недержанием, поскольку причины этих двух разных заболеваний совершенно разные. Кроме того, эти две системы (мочевыводящая и анальная) также выполняют разные функции. Моче вы водящие пути должны обеспечивать достаточный контроль только за жидкостями. Прямая кишка способна контролировать твердое, жидкое, а также газообразное содержимое. Для этого требуются совсем другие сенсорные условия. Следовательно, анатомия мочеполовых путей и прямой кишки совершенно разная. Например, в то время как существует внешняя анальная сфинктерная мышца, окружающая прямую кишку, не существует эквивалента, полностью окружающего уретру. Кроме того, на задней части уретры у взрослого мужчины едва ли может быть обнаружена поперечнополосатая мышца, в то время как наружный анальный сфинктер прямой кишки является поперечнополосатой мышцей, которая является полностью круглой.

Миобласты, предшественники мышечных волокон, представляют собой одноядерные мышечные клетки, которые во многом отличаются от других типов клеток. Миобласты естественным образом сливаются с образованием постмитотических многоядерных мышечных трубочек, что приводит к продолжительной экспрессии и доставке биологически активных белков. Миобласты используются для доставки генов к мышцам в случае мышечных заболеваний, таких как мышечная дистрофия Дюшенна, а также при не связанных с мышцами заболеваниях, например при доставке генов аденозиндезаминазы человека при синдроме дефицита аденозиндезаминазы; при переносе гена проинсулина человека при сахарном диабете; при переносе гена для экспрессии тирозингидроксилазы при болезни Паркинсона; при переносе и экспрессии фактора IX при гемофилии В, для доставки гормона роста человека при задержке роста.

Применение миобластов для лечения дегенерации мышц, для восстановления повреждения тканей или лечения заболевания описано в патентах США 5130141 и 5538722. Также была использована трансплантация миобластов для восстановления дисфункции миокарда Robinson et al., 1995; Murry et al., 1996; Gojo et al., 1996; Zibaitis et al., 1994.

Миобласты также можно использовать для заживления мышечных травм, вовлеченных в поддержание удерживания, в частности в недержание мочи и анальное недержание. Клетки, происходящие из скелетных мышц, содержащие миобласты, известны как клетки-предшественники скелетных мышц, которые могут подвергаться дифференцировке для заживления мышечных травм у взрослых.

В предшествующем уровне техники описано несколько способов выделения клеток, происходящих из скелетных мышц. Отдельный способ выделения клеток, происходящих из скелетных мышц, включает метод предварительного культивирования. При этом клетки получают из мышечной ткани и суспензию одиночных клеток переносят последовательно в разные контейнеры для клеточных культур, что известно, как предварительное культивирование, для удаления немиогенных клеток, таких как фибробласты, и обогащения миогенных клеток, таких как миобласты. Например, в Rando и Blau, 1994 описана такая очистка миобластов в клеточной культуре (Т.A. Rando and Н.М. Blau, "Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy" J. Cell Biol, vol. 125, no. 6, pp. 1275-1287, Jun. 1994). Использование нескольких стадий предварительного культивирования по сравнению с однократным предварительным культивированием повышает чистоту и выживаемость миобластов, что необходимо для лечебного эффекта при терапии посредством переноса миобластов (Z. Qu, L. Balkir, J.С.Т. van Deutekom, P.D. Robbins, R. Pruchnic, and J. Huard, "Development of Approaches to Improve Cell Survival in Myoblast Transfer Therapy," J. Cell Biol, vol. 142, no. 5, pp. 1257-1267, Sep. 1998).

Недостатком методов, основанных на методике предварительного культивировании, является то, что выполнение нескольких стадий предварительного культивирования занимает много времени. Хотя клетки проходили несколько стадий предварительного культивирования, дополнительное повторное культивирование необходимо для получения необходимого количества клеток эффективной чистоты (В. Gharaibeh et al., "Isolation of a slowly adhering cell fraction containing stem cells from murine skeletal muscle by the preplate technique," Nat. Protoc., vol. 3, no. 9, p. 1501, Aug. 2008; A. Lu et al., "Isolation of myogenic progenitor populations from Pax7-deficient skeletal muscle based on adhesion characteristics," Gene Ther., vol. 15, no. 15, pp. 1116-1125, May 2008). Таким образом, увеличение времени культивирования и увеличение количества удвоений клеток миобластов во время предварительного и повторного культивирования могут привести к старению, сопровождающемуся остановкой роста и даже неспособностью достичь необходимого количества клеток для переноса миобластов. (W.Е. Wright and J.W. Shay, "Historical claims and current interpretations of replicative aging," Nat. Biotechnol, vol. 20, no. 7, pp. 682-688, Jul. 2002). Кроме того, отсутствие чувствительности предварительного культивирования может привести к общему уменьшению количества миобластов, даже несмотря на то, что может быть достигнута повышенная чистота. (В.С. Syverud, J.D. Lee, K.W. VanDusen, and L.M. Larkin, "Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering" J. Regen. Med., vol. 3, no. 2, 2014).

Другие способы выделения миобластов, такие как сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS) или активируемая магнитным полем сортировка клеток (MACS) кажутся многообещающими, но из-за возможного повреждения клеток при применении высоковольтной интенсивности лазерного излучения при FACS, а также из-за повреждения при удержании магнитных антител при MACS, эти методы не являются лучшим выбором для выделения миобластов.

Ввиду этих недостатков способов, известных из уровня техники, необходимы новые способы получения клеток, происходящих из скелетных мышц (SMDC).

Эта задача решается с помощью объекта, определенного в формуле изобретения.

Следующие ниже фигуры составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Изобретение можно лучше понять с помощью одного или более из этих графических материалов в сочетании с подробным описанием конкретных воплощений, представленных здесь.

На Фиг. 1 показано изображение фазово-контрастной микроскопии (100х увеличение) SMDC, прикрепленных к стандартной культуральной колбе.

На Фиг. 2 показан анализ FACS, демонстрирующий чистоту и жизнеспособность SMDC. Гистограмма А представляет собой анализ CD56 и показывает, что 99,3% клеток являются CD56-позитивными. Гистограмма В представляет собой анализ жизнеспособности 7AAD и показывает, что 98,77% клеток являются живыми.

На Фиг. 3 представлено микроскопическое изображение (с 100х увеличением) чистоты SMDC, показанное посредством иммуноокрашивания миогенного маркера десмина. Позитивные клетки имеют более темное окрашивание, в то время как негативные клетки не окрашены.

На Фиг. 4 показано микроскопическое изображение SMDC, в которых индуцирована дифференцировка в многоядерные миотрубочки. Миотрубочки экспрессируют миогенный белок десмин, как показано темным окрашиванием.

На Фиг. 5 представлен FACS-анализ А2В5-окрашивания SMDC. Окрашивание изотипического контроля показано на гистограмме А по сравнению с окрашиванием антителами А2В5, представленным на гистограмме В. На гистограмме В показано, что 96% клеток являются А2В5-позитивным.

На Фиг. 6 показана генная экспрессия ферментов, синтезирующих А2В5-реактивный антиген. Средние показатели для аннотации генов ST3GAL1, ST3GAL2 и ST3GAL3 предполагают более высокую экспрессию этих мРНК в SMDC, полученную посредством настоящего изобретения (ST3GAL1: 17,72; ST3GAL2: 20,91; ST3GAL3: 205,89) по сравнению с имеющимися в продаже SMDC (ST3GAL1: 5,97; ST3GAL2: 9,59; ST3GAL3: 97,81).

На Фиг. 7 показано сравнение% CD56-позитивных клеток в клетках, полученных либо посредством примера 1, со стадией охлаждения, либо посредством примера 9, без стадии охлаждения. Показано, что клетки, полученные в Примере 1, содержат значительно (р<0,05 (t-критерий Стьюдента); *) более высокий% CD56-позитивных клеток (среднее ± SD (стандартное отклонение): 93,28±8,37) по сравнению с клетками, полученными в Примере 9 (среднее ± SD: 77,11±8,37). Данные представлены, как среднее ± SD клеток, полученных из мышечных биопсий трех отдельных человеческих доноров, которые разделили пополам для выполнения процедур в соответствии с Примерами 1 и 9 на клетках от тех же доноров.

На Фиг. 8 показан анализ FACS, демонстрирующий экспрессию мезенхимного маркера CD105 на SMDC. Гистограмма В представляет собой анализ CD105 и показывает, что 98,69% SMDC являются позитивными по CD105. Гистограмма А показывает точную установку порога позитивности путем демонстрации позитивности изотипического контроля только в 0,31% SMDC.

На Фиг. 9 показана нервно-мышечная регенеративная способность SMDC по настоящему изобретению посредством сравнения активности AChE (mU_rel на грамм белка) между CD56+ SMDC (содержащими примерно 100% CD56-экспрессирующих клеток) и CD56- SMDC (содержащими примерно 30% CD56-позитивных клеток). Измерение активности AChE выполняли, как описано в Примере 11. CD56+ SMDC демонстрируют значительно (р<0,05 (t-критерий Стьюдента); *) более высокую активность AChE по сравнению с CD56- SMDC. Данные представлены, как среднее ± SEM клеток, полученных из мышечных биопсий трех отдельных человеческих доноров.

На Фиг. 10 показана нервно-мышечная регенеративная способность SMDC по изобретению посредством сравнения способности к слиянию (%-ный индекс слияния) между CD56+ SMDC (содержащими примерно 100% CD56-экспрессирующих клеток) и CD56- SMDC (содержащими примерно 30% CD56-позитивных клеток). Количественную оценку способности к слиянию проводили, как описано в Примере 12. CD56+ SMDC демонстрируют значительно (р<0,05 (t-критерий Стьюдента); *) более высокий % индекса слияния по сравнению с CD56- SMDC. Данные представлены, как среднее ± SEM клеток, полученных из мышечных биопсий трех отдельных человеческих доноров.

Применение слова "а" или "an" при использовании вместе с термином "содержащий" в формуле изобретения и/или в описании может означать "один", но это также соответствует значению "один или более", "по меньшей мере один", и "один или более чем один".

Термин "примерно" означает, что предполагается указанное значение плюс или минус 5% от указанного значения или стандартная погрешность для измерений данного значения.

При использовании здесь термин "анальное недержание" относится к любой нежелательной потере содержимого кишечника через анус, подобной выделению газов, жидких или твердых фекалий. Термин включает все три степени тяжести: степень 1 = только газы, степень 2 = жидкие и мягкие фекалии, степень 3 = твердые, сформированные фекалии.

При использовании здесь термин "анальный сфинктер" или "аппарат анального сфинктера" относится, в частности, к Musculus sphincter ani externus и Musculus puborectalis как части Musculus levator ani. Однако он также включает М. pubococcygeus, М. ischiococcygeus, М. iliococcygeus и N. pudendus.

Термин "клетка, происходящая из скелетных мышц" или "SMDC" относятся к многоядерным слитым компетентным клеткам, таким как, например, миобласты, которые могут быть первичными клетками и/или in vitro культивируемыми клетками и альтернативных другим клеткам с миогенным потенциалом (например из ткани от липосакции или других тканей, содержащих стволовые клетки, таких как костный мозг). Термин также включает клетки, происходящие из жировой ткани, которые могут быть выделены и использованы для культивирования клеток скелетных мышц. Термин "клетка, происходящая из скелетных мышц" или "SMDC" также относятся к популяции клеток, выделенной из мышечной ткани. Как правило, такая клеточная популяция содержит дополнительные клетки, не имеющие миогенного потенциала. Такие клетки называются здесь "немиогенными клетками" или "немиогенными клетками, полученными из скелетных мышц" и предпочтительно являются CD56-негативными и/или десмин-негативными. Таким образом, используемый здесь термин "клетка, происходящая из скелетных мышц" или "SMDC" предпочтительно относится к популяции клеток, содержащей по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 100% многоядерных слитых компетентных клеток.

При использовании здесь термин "проникновение" относится к способу введения инъекционного устройства, например иглы, в ткань тела без влияния на процесс инъекции.

При использовании здесь термин "инъекция" относится к вытеснению раствора для инъекций, содержащего вышеупомянутые клетки, из устройства для инъекций в конкретный участок организма человека, в частности в мышечную ткань или рядом с мышечной тканью, обеспечивающей анальное удержание. Процесс инъекции может быть статическим, то есть устройство для инъекции остается в достигнутом положении, но не ограничивается этим. Альтернативно, процесс инъекции является динамическим. Например, в некоторых воплощениях настоящего изобретения инъекция происходит одновременно с отводом устройства для инъекции от места инъекции.

При использовании здесь термин "место инъекции" относится к месту в человеческом организме, такому как близко расположенное к мышечной ткани, обеспечивающей анальное удержание, или являющееся такой тканью, в котором инициируют процесс инъекции. Место инъекции не обязательно должно совпадать с местом, где заканчивается процесс инъекции.

При использовании здесь термин "устройство для инъекции" относится к любому устройству, подходящему для проникновения в ткань человека для того, чтобы достичь интересующего места для инъекции, и способного доставлять растворы, в частности растворы, содержащие клетки, происходящие из мышц, в интересующие места для инъекции.

При использовании здесь термин "недержание фекалий" относится только к нежелательной потере жидких или сформированных фекалий через анус.

При использовании здесь термин "пассивное недержание" относится к отсутствию сенсорного распознавания потери фекалий. Это включает низкие исходные анальные значения давления и отсутствие сенсорной способности анальной и ректальной слизистой оболочки.

При использовании здесь "императивная дефекация" или "императивное мочеиспускание" относится к отсутствию способности субъекта задерживать дефекации на более чем пять минут. Такой пациент вынужден немедленно идти в туалет.

При использовании здесь термин "CD56+" или "CD56-позитивный" относится к клетке, экспрессирующий клеточный маркер CD56. Термины "CD56+" или "CD56-позитивные" могут также использоваться для клеточной популяции, содержащей разные типы клеток, если, предпочтительно, по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов клеточной популяции экспрессируют клеточный маркер CD56.

При использовании здесь термин "CD56-" или "CD56-негативная" относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD56. Термины "CD56-" или "CD56-негативные" могут также использоваться для клеточной популяции, содержащей разные типы клеток, если, предпочтительно, не более чем 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов клеточной популяции экспрессирует клеточный маркер CD56.

При использовании здесь термин "А2В5+" или "А2В5-позитивный" относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер А2В5. Термины "А2В5+" или "А2В5-позитивные" могут также использоваться для клеточной популяции, содержащей разные типы клеток, если, предпочтительно, по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов клеточной популяции экспрессирует клеточный маркер А2В5.

При использовании здесь термин "А2В5-" или "А2В5-негативный" относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер А2В5. Термины "А2В5-" или "А2В5-негативные" могут также использоваться для клеточной популяции, содержащей разные типы клеток, если, предпочтительно, не более чем 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов клеточной популяции экспрессирует клеточный маркер А2В5.

При использовании здесь термин "десмин-позитивная" относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер десмин. Термин "десмин-позитивная" может также использоваться для клеточной популяции, содержащей разные типы клеток, если, предпочтительно, по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов клеточной популяции экспрессирует клеточный маркер десмин.

При использовании здесь термин "десмин-негативная" относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер десмин. Термин "десмин-негативная" может также использоваться для клеточной популяции, содержащей разные типы клеток, если, предпочтительно, не более чем 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов клеточной популяции экспрессирует клеточный маркер десмин.

При использовании здесь термин "CD105+" или "CD105-позитивная" относится к клетке, экспрессирующей клеточный маркер CD105. Термины "CD105+" или "CD105-позитивная" могут также использоваться для клеточной популяции, содержащей разные типы клеток, если, предпочтительно, по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 или 99 процентов клеточной популяции экспрессирует клеточный маркер CD105.

При использовании здесь термин "CD105-" или "CD105-негативная" относится к клетке, не экспрессирующей клеточный маркер CD105. Термины "CD105-" или "CD105-негативная" могут также использоваться для клеточной популяции, содержащей разные типы клеток, если, предпочтительно, не более чем 49, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 1 или 0 процентов клеточной популяции экспрессирует клеточный маркер CD105.

При использовании здесь термин "среда для дифференцировки" относится к среде для культивирования клеток, которая индуцирует слияние в многоядерных слитых компетентных клетках или в миогенных клетках, таких как, например, миобласты. Однако указанный термин также относится к среде для культивирования клеток, не содержащей каких-либо веществ, необходимых для индукции слияния, в случае, когда многоядерные компетентные к слиянию клетки или миогенные клетки способны сливаться без соответствующей индукции.

При использовании здесь термин "среда для роста клеток" относится к любой среде, подходящей для инкубации клеток млекопитающих, таких как SMDC, которая обеспечивает возможность прикрепления указанных клеток млекопитающего к поверхности инкубационного контейнера.

В соответствии с настоящим изобретением предложены способы получения клеток, происходящих из скелетных мышщ (SMDC).

Первый объект настоящего изобретения направлен на способ получения клеток, происходящих из скелетных мышц (SMDC), включающий стадии: (а) охлаждения образца, полученного из ткани скелетных мышц, в буфере; (б) обработки и охлаждения образца; (в) ресуспендирования образца со стадии (б) в среде с сывороткой, содержащей по меньшей мере один фермент, и нагревание до 38°С в течение 1-20 часов; осаждение образца центрифугированием и (г) ресуспендирование осадка, полученного на стадии (в) для получения одноклеточной суспензии из образца со стадии (в) с получением, таким образом, SMDC.

Авторы изобретения обнаружили, что проведение способа по настоящему изобретению преимущественно позволяет получать и обогащать SMDC, проявляющие высокую миогенную способность, без необходимости проведения стадий предварительного культивирования. Эти обогащенные SMDC являются высокочистыми по миогенным маркерам, таким как CD56 и десмин, указывая на повышенный миогенный потенциал, как определено, например, с помощью подходящего анализа активности. Кроме того, обогащение клеток SMDC перед исходным посевом является предпочтительным, так как клетки должны меньше подвергаться субкультивированию, что, таким образом, приводит к меньшему количеству старых клеток и более высокой жизнеспособности благодаря настоящему изобретению. Кроме того, в настоящем изобретении образуются клетки, не только экспрессирующие миогенные маркеры, такие как CD56 и десмин, но также маркеры нейронных клеток-предшественников, такие как А2В5, что позволяет предположить также возможную нейромышечную поддержку. Действительно, SMDC, полученные по настоящему изобретению, отличаются от клеток известных из уровня техники своей генной экспрессией ферментов ST3GAL1, ST3GAL2 и ST3GAL3 синтезирующих А2В5-реактивный антиген, необходимых для нейромышечной поддержки А2В5-реактивных антигенов. Подводя итоги, можно сказать, что обогащенные SMDC, полученные согласно настоящему изобретению, демонстрируют высокую чистоту и жизнеспособность, что, таки образом, позволяет предположить высокую клиническую эффективность в поддержании нейромышечного соединения, а также в регенерации мышечной слабости, особенно в случае недержания мочи и/или недержания кала.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения стадия (а) включает проведение мышечной биопсии.

Такая мышечная биопсия, служащая источником клеток мышечного происхождения, может быть получена из мышцы в месте повреждения или из другой области, которая может быть более легкодоступна для клинического хирурга. Место биопсии не ограничено отдельной скелетной мышцей и может быть, например, плечом. Размер биопсии может составлять примерно 1 см × 1 см × 1 см или больше.

Для использования миобластов в лечении мышечных травм, например, для лечения недержания, указанные миобласты предпочтительно выделяют из биопсии скелетной мышцы субъекта, подвергаемого лечению.

В другом предпочтительном воплощении стадию (а) выполняют при температуре ниже 16°С, предпочтительно при температуре в диапазоне от 1 до 16°С, предпочтительно от 4 до 10°С, в частности, предпочтительно при 7°С; и в течение времени вплоть до 96 часов.

Соответственно, предпочтительно, чтобы стадию (а) способа по изобретению выполняли в интервале температур от 1 до 16°С или при любой температуре в этом интервале, например при 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15°С или при любой промежуточной температуре в этом интервале. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения интервал температуры варьирует от 6 до 8°С. В другом предпочтительном воплощении интервал температуры ниже 4°С, предпочтительно в интервале от 1 до 3°С.

Кроме того, предпочтительно, чтобы стадию (а) способа по настоящему изобретению выполняли в интервале времени вплоть до 96 часов или в течение любого времени в этом интервале, например от 12 до 96 часов, от 12 до 72 часов, от 12 до 48 часов, от 24 до 96 часов, от 24 до 72 часов, от 24 до 48 часов или в любом другом промежуточном интервале.

Предпочтительно, стадия (б) включает применение ножниц, скальпеля, пинцета, фильтра или шаровой дробилки и центрифуги. Однако для специалиста в данной области очевидно, что любые другие средства, которые позволяют измельчать или дробить ткань скелетных мышц, охвачены и находятся в соответствии с настоящим изобретением.

В другом предпочтительном воплощении стадию (б) выполняют при температуре в интервале от 1 до 16°С или при любой температуре в этом интервале, например при 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15°С или при любой промежуточной температуре в этом интервале. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения стадию (б) выполняют при температуре в интервале от 4 до 8°С, особенно предпочтительно при 4°С. В другом предпочтительном воплощении интервал температуры находится ниже 4°С, предпочтительно в интервале от 1 до 3°С.

Кроме того, предпочтительно стадию (б) по настоящему изобретению выполняют в течение определенного интервала времени, например от 2 до 48 часов или в течение времени в пределах этого интервала, например от 2 до 36 часов, от 2 до 24 часов или в течение любого другого промежуточного интервала.

Соответственно, предполагается, что стадию (б) способа по настоящему изобретению выполняют посредством обработки ткани скелетной мышцы и охлаждения в течение определенного периода времени обработанной ткани скелетной мышцы. В предпочтительном воплощении изобретения, предполагается, что охлаждение образца проводят после стадии обработки. Авторы изобретения обнаружили, что охлаждение обработанного образца является полезным, поскольку это приводит к существенному уменьшению немиогенных клеток, таких как фибробласты, что достигается благодаря тому, что немиогенные клетки, такие как фибробласты, являются термочувствительными из-за более высокой метаболической активности, чем неподвижные миогенные клетки. Из-за этого свойства немиогенные клетки, такие как фибробласты, умирают из-за холодных температурных условий. Как следствие этого, охлаждение на стадии (б) способа по настоящему изобретению обеспечивает обогащение миогенных клеток. Это обогащение достигается без необходимости проведения каких-либо стадий предварительного культивирования. Следовательно, способ по настоящему изобретению обеспечивает хорошее обогащение и очистку миогенных клеток без необходимости проведения долговременных и дорогостоящих стадий.

Важность стадии охлаждения, в частности, демонстрируется в виде сравнительных данных, показанных в примерах ниже. Там показано, что количество CD56-позитивных клеток значительно увеличивается. CD56-позитивные клетки представляют собой маркер, который демонстрирует чистоту полученных SMDC. Следовательно, способ по настоящему изобретению представляет собой способ, который позволяет получать SMDC в большем количестве, а также с более высоким качеством по сравнению со способами из уровня техники, в которых не проводят стадию охлаждения, как это предусмотрено в способе по настоящему изобретению.

CD56, также известный как молекула адгезии нейронных клеток (NCAM), представляет собой миогенный коммитированный маркер, экспрессируемый в миобластах скелетных мышц in vitro (Belles-Isles et al., 1993) и в гладкомышечной ткани in vivo (Romanska et al., 1996). CD56 присутствует в слитых компетентных десмин + SMDC. В частности, было продемонстрировано, что CD56 маркирует популяцию SMDC, которая способна образовывать многоядерные миотрубочки и проявлять более высокую ферментативную активность ацетилхолинэстеразы (AChE), чем CD56-негативные SMDC (Thurner et al., 2018). Высокая AChE активность SMDC, используемых для лечения больных с недержанием кала фактически связана с высоким успехом лечения с точки зрения снижения симптомов недержания кала (Thurner et al., 2018). Таким образом, SMDC высокочистые по CD56 и, таким образом, имеющие высокую активностью AChE, являются желательными для успешного лечения пациентов с нейромиопатиями и/или миопатиями, такими как недержание кала. В настоящем изобретении предложен способ выделения SMDC, высокочистых по CD56 и с высокой активностью AChE.

Предпочтительно, предполагается, что стадия (в) включает проведение ферментативной обработки раствором, содержащим один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из трипсина, папаина, эластазы, гиалуронидазы, коллагеназы, дезоксирибонуклеазы и ДНКазы. В предпочтительном воплощении стадия (в) предполагает использование коллагеназы.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтительно предполагается, что ресуспендирование на стадии (в) включает центрифугирование образца со стадии (б), удаление супернатанта и ресуспендирование клеточного осадка в среде с сывороткой, содержащей по меньшей мере один фермент. Кроме того, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения также предпочтительно, чтобы одну или более стадий промывки выполняли с клетками на стадии (в), включая интенсивное перемешивание клеток в подходящем растворе, например в буфере. Согласно изобретению, ресуспендированный образец со стадии (б) в среде с сывороткой, содержащей по меньшей мере один фермент, центрифугируют после окончания времени инкубации для осаждения клеток образца и отбрасывают супернатант, содержащий фермент.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения фермент на стадии (в) представляет собой трипсин.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения стадию (в) выполняют при температуре в интервале от 25 до 38°С, предпочтительно от 36 до 38°С, особенно предпочтительно при 37°С.

Предпочтительно, стадия (г) включает способ, выбранный по меньшей мере из одного из сортировки FACS, центрифугирования, электрокинетической сортировки, сортировки посредством акустофореза, сортировки клеток с помощью микросфер и оптической сортировки.

Способы получения одноклеточной суспензии хорошо известны в данной области. Один пример подходящего способа обогащения представляет собой активируемую магнитным полем сортировку клеток (MACS®). Способ MACS позволяет клеткам разделяться посредством инкубации клеток с частицами (http://en.wikipedia.org/wiki/Magnetic_nanoparticles), покрытыми антителами к конкретному поверхностному антигену. Затем инкубированные клетки переносят на колонку, помещенную в магнитное поле. На этой стадии клетки, которые экспрессируют антиген и, следовательно, прикреплены к наночастицам, остаются на колонке, в то время как другие клетки, не экспрессирующие антиген, проходят через колонку. Этим способом клетки могут быть разделены на позитивные и/или негативные по отношению к конкретному антигену(ам). Другой пример подходящего способа обогащения представляет собой сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS®) как описано, например, в Webster et al. (Exp Cell Res. 1988 Jan; 174(1):252-65).

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения, после стадии (г) выполняют дополнительную возможную стадию (д), включающую инкубацию одноклеточной суспензии, полученной на стадии (г), где инкубацию на стадии (д) предпочтительно выполняют при температуре в интервале от 25 до 38°С, предпочтительно от 36 до 38°С, особенно предпочтительно при 37°С, таким образом, получая прикрепленные SMDC.

Эта дополнительная возможная стадия инкубации позволяет клеткам расти с достижением большего количества SMDC. Специалист в данной области скорректирует условия культивирования, такие как среда и температура, соответственно, для получения максимального количества SMDC.

Также предпочтительно предполагается, что после стадии (д) можно выполнять дополнительную стадию (е), включающую удаление неприкрепленных клеток со стадии (д), где стадию (е) предпочтительно выполняют через промежуток времени от по меньшей мере 6 часов до 4 суток.

В соответствии с настоящим изобретением эта возможная стадия предпочтительно обеспечивает возможность удаление немиогенных клеток или клеток, которые плавают в культуральном контейнере, таких как мертвые клетки. Тем самым, необходимые прикрепленные клетки дополнительно обогащаются. Специалист в данной области техники проводит возможную стадию (е) в подходящее время в течение предпочтительного интервала от 6 часов до 3 суток в зависимости от фактической необходимости выполнения такой стадии. Действительно ли необходима такая возможная стадия (е), можно определить, например, при наблюдении за клетками под микроскопом и определении количества неприкрепленных клеток в клеточной культуре.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения после стадии (е) в некоторых случаях выполняют дополнительную стадию (ж) размножения прикрепленных клеток со стадии (д), при этом стадия размножения (з) включает культивирование прикрепленных клеток в течение от 1 до 5 пассажей до 70-80% конфлюентности.

В соответствии с настоящим изобретением, специалист в данной области может определить необходимую продолжительность и количество пассажей для достижения необходимой 70-80% конфлюентности.

Второй объект настоящего изобретения направлен на SMDC, где SMDC содержат по меньшей мере 60% CD56-позитивных и 60% А2В5-позитивных клеток.

В другом предпочтительном воплощении изобретения SMDC представляют собой CD105-позитивные клетки, что означает, что SMDC экспрессируют CD105 на своей клеточной поверхности.

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток или любой промежуточный интервал количества клеток между указанными значениями SMDC являются CD105-позитивными, что означает, что SMDC экспрессируют CD105 на своей клеточной поверхности.

CD105 также известен, как Эндоглин. Он представляет собой интегральный мембранный гомодимерный белок типа I с субъединицами 90 кД, обнаруженный на сосудистых эндотелиальных клетках и синцитиотрофобластах плаценты. CD105 слабо экспрессируется на стромальных фибробластах. Он также экспрессируется на активированных моноцитах и тканевых макрофагах. Экспрессия CD105 повышена на активированном эндотелии в тканях, подвергающихся ангиогенезу, таких как опухоли, или в случаях заживления ран или кожного воспаления. CD105 является компонентом системы рецепторов TGF-β в эндотелиальных клетках пупочной вены человека и связывается с TGF-β1 и β 3 с высокой аффинностью, но не связывается с TGF-β2. Было показано, что TGF-β рецепторы требуются для дифференцировки скелетных мышц. Действительно, было показано, что рецептор TGFβ необходим для увеличения миогенина, фактора дифференцировки скелетных мышц, и способности миобластов к слиянию. Таким образом, CD105-позитивные клетки могут быть предпочтительными для SMDC и SMDC, полученных способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В другом предпочтительном воплощении изобретения SMDC являются десмин-позитивными, что означает, что SMDC экспрессирует десмин на своей клеточной поверхности.

В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% клеток или любой промежуточный интервал количества клеток между указанными значениями SMDC, являются десмин-позитивными, что означает, что SMDC экспрессируют десмин на своей клеточной поверхности.

В другом предпочтительном воплощении изобретения SMDC являются Рах7-позитивными, что означает, что SMDC экспрессируют Рах7 на своей клеточной поверхности.

В другом предпочтительном воплощении изобретения SMDC являются Myf5-позитивными, что означает, что SMDC экспрессируют Myf5 на своей клеточной поверхности.

А2В5-реактивные антигены принадлежат к семейству ганглиозидов с-серии, семейству гликолипидов, наиболее распространенных в нервной системе, где они проявляют такие функции, как межклеточная адгезия и распознавание, а также трансдукция сигнала. Потеря ганглиозидов приводит к тяжелым неврологическим дефектам, таким как регенеративные дефекты двигательных нейронов у мышей с дефицитом ганглиозидов с-серии (R. K. Yu, Y.-T. Tsai, Т. Ariga, and М. Yanagisawa, "Structures, biosynthesis, and functions of gangliosides-An overview," J. Oleo Sci., vol. 60, no. 10, pp. 537-544, 2011). Также в нейромышечном соединении (NMJ) было обнаружено большое количество ганглиозидов. Обработка NMJ анти-ганглиозидными антителами приводила к тяжелому дефекту NMJ, таким образом, подтверждая идею, что ганглиозиды необходимы для NMJ (J.J. Plomp and Н.J. Willison, "Pathophysiological actions of neuropathy-related anti-ganglioside antibodies at the neuromuscular junction," J. Physiol., vol. 587, no. Pt 16, pp. 3979-3999, Aug. 2009). Кроме того, ганглиозиды особенно маркируют стволовые клетки, которые считаются имеющими регенеративный потенциал (R. K. Yu, Y.-T. Tsai, Т. Ariga, and M. Yanagisawa, "Structures, biosynthesis, and functions of gangliosides-An overview," J. Oleo Sci., vol. 60, no. 10, pp. 537-544, 2011). A2B5-реактивные ганглиозиды синтезируются сиалтрансферазами. Среди них обладающими наивысшей гликосфинголипидной акцепторной активностью in vitro, высокоэкспрессируемыми в мозге, являются ST3GAL1 и ST3GAL2 (Е. R. Sturgill et al., "Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b," Glycobiology, vol. 22, no. 10, pp. 1289-1301, Oct. 2012). мРНК и ST3GAL1, и ST3GAL2 экспрессируется в SMDC, полученных посредством настоящего изобретения и экспрессируется в большем количестве по сравнению с имеющимися в продаже SMDC. Взятые вместе SMDC с миогенной регенеративной способностью, также экспрессирующие А2В5-реактивные антигены, могут не только регенерировать скелетную мышцу, но также обеспечивать нейромышечную поддержку, особенно в новообразованном нервно-мышечном соединении во время регенерации мышц.

SMDC, которые могут быть использованы для лечения мышечной дисфункции, в частности для лечения недержания, такого как недержание мочи и/или анальное недержание, предпочтительно демонстрируют характерный профиль экспрессии. Предпочтительно, более чем примерно 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% указанных SMDC экспрессируют CD56 и А2В5. Предпочтительно, указанные SMDC не экспрессируют CD34, Sca-1 и MyoD. Таким образом, термин "не экспрессируют" означает, что предпочтительно менее 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или 2% SMDC экспрессируют указанные маркеры. Профиль экспрессии SMDC, как описано выше, можно использовать для определения индекса миогенности клеточной культуры без требования дифференцировки. Таким образом, указанный профиль экспрессии SMDC можно использоваться для установления, можно ли использовать клетки, происходящие из скелетных мышц, для лечения мышечной дисфункции, в частности для лечения недержания, такого как недержание мочи и/или анальное недержание.

Еще один объект настоящего изобретения относится к SMDC, полученной в соответствии со способом по настоящему изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением SMDC, полученные способом по настоящему изобретению, можно легко отличить от клеток из предшествующего уровня техники, принимая во внимание отличительную экспрессию маркера А2В5 и/или ферментов, синтезирующих А2В5-реактивный антиген. Поскольку А2В5-реактивные ганглиозиды синтезируются сиалилтрансферазами, эти сиалилтрансферазы могут, таким образом, служить косвенным маркером экспрессии А2В5. Среди трех важных сиалилтрансфераз ST3GAL1, ST3GAL2 и ST3GAL3, ферментами с наивысшей in vitro гликосфинголипидной акцепторной активностью, высокоэкспрессируемыми в головном мозге, являются ST3GAL1 и ST3GAL2 (Е.R. Sturgill et al., "Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b," Glycobiology, vol. 22, no. 10, pp. 1289-1301, октябрь 2012). Определение экспрессии ST3GAL1 и ST3GAL2 представляет косвенное доказательство экспрессии А2В5. Следовательно, новый способ по настоящему изобретению позволяет получить SMDC, которые отличаются от SMDC, полученных известными в данной области способами.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения SMDC и SMDC, полученные способом по настоящему изобретению, характеризуются экспрессией разных маркеров. В соответствии с настоящим изобретением предполагается, что SMDC характеризуются позитивной экспрессией одного, двух, трех, четырех или пяти маркеров CD56, А2В5, CD105, десмин, Myf5 и Рах7. Кроме того, предпочтительно, чтобы SMDC и SMDC, полученные способом по настоящему изобретению, характеризовались экспрессией комбинациями разных маркеров, выбранной из позитивной экспрессии одного или более маркеров, выбранных из CD56, А2В5, CD105, Myf5 и Рах7, и негативной экспрессии по меньшей мере одного маркера, выбранного из CD34 и MyoD. Предпочтительно, по меньшей мере 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% или количество в любом промежуточным интервале между указанными значениями SMDC являются позитивными в отношении любого одного или более из CD56, А2В5, CD105, Myf5 и Рах7, что означает, что SMDC экспрессируют CD56, А2В5, CD105, Myf5 и/или Рах7 на своей клеточной поверхности. Также предпочтительно, чтобы не более 59%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0% клеточной популяции экспрессировали любой из CD34 и/или MyoD.

В особенно предпочтительном воплощении изобретения SMDC и SMDC, полученные способом по настоящему изобретению, характеризуются позитивной экспрессией CD56, А2В5, CD105, Myf5, Рах7 и негативной экспрессией CD34 и MyoD.

Другой объект настоящего изобретения относится к SMDC, полученным в соответствии со способом по настоящему изобретению, для применения в качестве фармацевтической композиции.

В соответствии с настоящим изобретением SMDC, полученные в соответствии со способом по настоящему изобретению, можно использовать в качестве активного ингредиента в фармацевтической композиции.

Другой объект настоящего изобретения относится к SMDC, полученным в соответствии со способом по настоящему изобретению, для использования в способе улучшения нейро-мышечного соединения.

Предпочтительно, SMDC по настоящему изобретению предназначены для использования в способе улучшения предупреждения и/или лечения нейромиопатий и/или миопатий. Предпочтительно, SMDC предназначены для использования в способе предупреждения и/или лечения нейромиопатий и/или миопатий, таких как недержание кала и/или недержание мочи.

В соответствии с настоящим изобретением SMDC можно использовать в способе, который предпочтительно предполагает инъекцию SMDC субъекту, страдающему от недержания. В общем случае, инъекция SMDC в данную ткань или участок повреждения содержит терапевтически эффективное количество клеток в растворе или суспензии, предпочтительно от примерно 1×10⁵ до примерно 6×10⁶ клеток на 100 мкл раствора для инъекций. Раствор для инъекций представляет собой физиологически приемлемую среду с аутологичной сывороткой или без нее. Физиологически приемлемая среда может представлять собой, в качестве неограничивающего примера, физиологический раствор или фосфатный буферный раствор.

Наконец, еще один объект настоящего изобретения относится к SMDC, полученным в соответствии со способом по настоящему изобретению, для применения в способе лечения мышечной дисфункции, где мышечная дисфункция представляет собой недержание, в частности недержание мочи и/или анальное недержание.

В принципе, любой тип анального недержания можно лечить, так как укрепление анальных мышечных систем обеспечивает лучший контроль ректального наполнения. Однако лечат и анальное недержание, которое является результатом разрыва промежности, особенно если повреждена и травмирована систему анального сфинктера и/или М. puborectalis. Такой разрыв промежности может быть вызван широким рядом причин, как описано выше. Однако причина такого разрыва промежности не ограничивается применением способов и SMDC по настоящему изобретению. Пациентов можно лечить способами и SMDC по настоящему изобретению, если они страдают от разрыва промежности третьей или четвертой степени. Это относится, в частности, к женщинам, которые страдают от такого разрыва промежности после родов с помощью пинцета, рожают впервые, рожают ребенка весом свыше 4 кг или страдают от последствий из-за аномального положения ребенка перед рождением. Способы и SMDC по настоящему изобретению также можно применять после травмы системы анального сфинктера и/или М. puborectalis из-за хирургических процедур. Кроме того, способы и SMDC по настоящему изобретению могут также применяться в случае только временного недержания. Такое лечение предотвращает развитие полного анального недержания. Кроме того, заболеваниями анального недержания для лечения способами и SMDC по настоящему изобретению, являются пассивное недержание, недержание кала и императивная дефекация.

Следует понимать, что способы и SMDC по настоящему изобретению могут использоваться не только для лечения пациентов, уже страдающих анальным недержанием, то есть проявляющих симптомы анального недержания, но могут быть применены к субъектам, еще не страдающим анальным недержанием, но с повышенным риском этого состояния, например в случаях, когда ректальная мускулатура пострадала от хирургического вмешательства, родов, несчастных случаев и т.д. Другим примером могут служить случаи, когда ректальная мускулатура становится тоньше, чем у здорового субъекта, или когда она подвергается дегенерации по другим причинам. Способы по настоящему изобретению могут обеспечить подходящую профилактику для предупреждения возникновения анального недержания.

SMDC для применения в лечении или профилактике недержания предпочтительно являются гомологичными реципиенту.

В более предпочтительном воплощении указанные SMDC являются аутологичными или гетерологичными реципиенту. Указанные SMDC могут быть получены, например, посредством биопсии из бицепсов реципиента. Аутологичные SMDC снижают или минимизируют риск аллергических реакций после введения SMDC реципиенту. Предпочтительно, SMDC представляют собой многоядерные компетентные к слиянию клетки или миогенные клетки, такие как миобласты. Более предпочтительно, указанные SMDC представляют собой человеческие клетки.

Следовательно, настоящее изобретение также обеспечивает простой профилактический подход или способ лечения женщин и мужчин с недержанием мочи и/или анальным недержанием или с риском развития недержания мочи и/или анального недержания с использованием аутологичных клеток, происходящих из скелетных мышц, для укрепления их моче вы водящих и/или анальных сфинктеров. Такая терапия с помощью клеток, происходящих из мышц, позволяет восстановить и улучшить поврежденный мочевыводящий и анальный сфинктер. В соответствии с настоящим изобретением лечение включает аспирацию иглой с получением мышечных клеток, например, и быструю последующую обработку для введения культивированных и приготовленных клеток пациенту. Также, согласно настоящему изобретению, аутологичные клетки, происходящие из скелетных мышц (SMDC), собранные от и культивированные для конкретного пациента с недержанием мочи и/или анальным недержанием, можно использовать в качестве неаллергенного агента для увеличения мышечной массы стенки мочевыделительной системы и/или прямой кишки, тем самым увеличивая коаптацию и улучшая мышцы сфинктера мочевыделительной системы и/или прямой кишки. В этом аспекте изобретения выполняют простую трансплантацию аутологичных мышечных клеток, как описано выше.

В соответствии с настоящим изобретением аутологичные клетки, происходящие из скелетных мышц и введенные непосредственно в мочевой сфинктер и/или анальный сфинктер, демонстрируют продолжительное выживание. Таким образом, инъекция аутологичных миобластов приводит к безопасной и неиммуногенной продолжительной выживаемости мышечного волокна в мочевом и/или анальном сфинктере.

В конкретном воплощении изобретения, от примерно 50 до примерно 200 мкл суспензии клеток, происходящих из скелетных мышц (с концентрацией от примерно 1×10⁵ до примерно 6×10⁶ клеток на 100 мкл раствора инъекции) инъецируют в мочевой сфинктер. Инъекционное устройство может быть соединено с контейнером, содержащим суспензию клеток, которую необходимо ввести. Для лечения анального недержания предпочтительно от примерно 50 мкл до примерно 1 мл, более предпочтительно примерно 0,5 мл суспензии клеток, происходящих из скелетных мышц (с концентрацией от примерно 1×10⁵ до примерно 6×10⁶ клеток на 100 мкл), инъецируют в наружный анальный сфинктер. Инъекционное устройство может быть соединено с контейнером, содержащим суспензию клеток, подлежащую инъекции.

В другом воплощении стадия инъекции может включать несколько отдельных инъекций, например от примерно 20 до примерно 40 инъекций суспензии клеток, происходящих из скелетных мышц, где в каждой инъекции инъецируют от примерно 50 до примерно 500 мкл суспензии клеток, происходящих из скелетных мышц, и при этом каждую инъекцию вводят в другую область анального сфинктера. Однако эти параметры следует рассматривать только в качестве примера, и специалист легко сможет адаптировать эти процедуры к требованиям лечения для каждого отдельного пациента.

В другом воплощении настоящего изобретения, движение инъекционного устройства в сторону мочевого и/или анального сфинктера контролируется посредством сонографии и/или EMG (электромиографии). В конкретном воплощении вводят трансректальный зонд и положение трансректального зонда оптимально регулируют для лечения мочевого и/или анального сфинктера с помощью способов по изобретению. В другом конкретном воплощении клетки, происходящие из скелетных мышц, имплантируют в область, окружающую дефект мочевого и/или анального сфинктера, и/или особенно в область дефекта мочевого и/или анального сфинктере. Пациент может начать следующий день после инъекции клеток с физических упражнений для дополнительно лечения мочевого и/или анального недержания в соответствии с изобретением.

В другом воплощении лечение повторяют. Лечение можно повторять, например, в течение одного года после последнего лечения, через 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 месяц(ев) после последнего лечения или в пределах 1-8 недель, предпочтительно 2-3 недель или 10-20 суток после последнего лечения. В частности, лечение можно повторять в пределах 2-3 недель после последнего лечения клетками из той же самой клеточной культуры, что была использована в предыдущем лечении. Такой подход позволяет уменьшить объем введения на инъекцию и дает клеткам больше времени на адаптацию, интеграцию и наращивание мышцы. В еще более конкретном воплощении инъекции повторяют с интервалом 2-3 недель, вплоть до достижения улучшения мочевой и/или анальной регуляции.

Как упоминалось выше, конкретный путь проникновения осуществляется через кожу пациента параллельно направлению прямой кишки. Однако также предполагается, что проникновение может происходить непосредственно из прямой кишки вблизи поврежденной мышцы. В частности, процесс проникновения и инъекции контролируют с помощью средств ультразвуковой визуализации. Кроме того, для женщин рассматривается альтернативный путь проникновения, т.е. трансвагинальная инъекция. В этом случае инъекционное устройство проникает в стенку влагалища и перемещается вперед до тех пор, пока не достигнет необходимого места инъекции. В частности, процесс проникновения и инъекции также контролируют с помощью сонографических и/или EMG (электромиографических) средств визуализации в этом случае.

В другом воплощении инъекция включает инъекцию клеток, происходящих из скелетных мышц, в виде "инъекционной дорожки". При использовании здесь "инъекционная дорожка" относится к расположению клеток вдоль длины или части длины инъекционного трека, т.е. вдоль канала, образованного введением иглы в мышечную ткань. Другими словами, после инъекции иглу извлекают и при этом, в то же самое время, клетки выталкивают из шприца непрерывным или прерывистым образом, при этом инъекционная игла перемещают, в частности извлекают вдоль инъекционного трека. Такое равномерное распределение клеток обеспечивает непрерывную доставку инъекционного раствора, содержащего клетки, вдоль инъекционного канала, который образуется, когда инъекционное устройство/игла входит в целевую мышечную ткань. В конкретном воплощении, инъекционная дорожка или канал должны иметь диаметр не более чем примерно 0,8 мм, поскольку в противном случае это может привести к некрозу клеток, происходящих из скелетных мышц, в центре такого инъекционного канала и, следовательно, привести к неблагоприятному воспалению и другим процессам.

Инъекционным устройством для применения со способами по настоящему изобретению может быть любое устройство, способное проникать в ткань человека и способное доставлять растворы, в частности растворы, содержащие клетки, происходящие из скелетных мышц, в необходимое место в организме субъекта, в частности человека. Инъекционное устройство может содержать, например, полую иглу. Инъекционное устройство может также представлять собой любой тип шприца, пригодный для инъекции клеток, происходящих из скелетных мышц. В более сложных воплощениях инъекционное устройство может, например, представлять собой шприц-пистолет, впрыскивающим суспензию посредством приложения давления воздуха. В частности, инъекционное устройство подходит для применений с минимальным вмешательством и хирургии с минимальным вмешательством, соответственно.

Путем выбора инъекционной иглы, имеющей конкретный диаметр, объем инъекции на мм³ может быть точно предопределен. Диаметр инъекционной иглы обычно не превышает 5 мм, так как это может привести к повреждению мышечных структур.

Ультразвуковая визуализация для контроля за положением и действием инъекционного устройства может быть достигнута с помощью любого стандартного ультразвукового устройства формирования изображения, известного в данной области техники. В дополнение к моно- или двухплоскостным стандартным ультразвуковым зондам также можно использовать новые ультразвуковые технологии, такие как, например, 3D-сонография или цветная допплеровская сонография и т.д. В конкретном воплощении, как описано выше, инъекционное устройство содержит средства ультразвуковой визуализации.

Предполагается, что любой способ или композиция, описанные здесь, могут быть реализованы в отношении любого другого способа или композиции, описанных здесь.

Следующие примеры поясняют настоящее изобретение, но не рассматриваются как ограничивающие.

Пример 1 - Получение SMDC

Для получения SMDC, биопсию скелетной мышцы брали из М. pectoralis major или М. biceps brachii у пациента, страдающего недержанием. Чтобы получить биопсию, сначала кожу вскрывали с помощью разреза длиной примерно 1 см выше мышцы, пока не была достигнута фасция М. pectoralis major. После открытия фасции отбирали 1 см³ мышечной ткани (биопсия). Биопсию непосредственно переносили в среду для транспортировки биопсии, предварительно охлажденную до примерно 4°С и содержащую базальную среду Хэма F10 с добавлением гентамицина (конечная концентрация 1-5 мкг/мл). Биопсию хранили в течение примерно 26 часов при 1-11°С в среде для транспортировки биопсии. Затем биопсию переносили в чашку Петри, заполненную 1х PBS. Мышечную ткань отделяли от соединительной ткани, используя стерильные щипцы и скальпель. Затем мышечную ткань переносили в другую чашку Петри, заполненную 1х PBS, и рассекали на кусочки размером 2-3 мм², используя скальпель. После дополнительной стадии переноса, как описано выше, кусочки ткани дополнительно разрезали на кусочки размером 1 мм. Эти кусочки, наконец, переносили в центрифужную пробирку, заполненную 1x PBS, и центрифугировали в течение 10 минут при 1300 об/мин. После центрифугирования супернатант удаляли и мышечную ткань ресуспендировали в 1x PBS с добавлением 8 мкг/мл гентамицина. Затем суспензию мышечной ткани охлаждали до 2-8°С в течение 48 часов. После охлаждения суспензию мышечной ткани центрифугировали в течение 10 минут при 1300 об/мин, супернатант затем удаляли и добавляли 2,5 мл дигестирующего раствора, содержащего 1-5 мг/мл коллагеназы, 2-4% об./об. буфера Hepes, 0,1-10% об./об. фетальной телячьей сыворотки и 5-10 мкг/мл гентамицина в среде Хэма F10. Затем суспензию мышечных клеток инкубировали в течение 6-20 часов при 37°С, 5% CO₂. Затем суспензию центрифугировали при 1300 об/мин в течение 10 минут, супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в среде, содержащей 10-20% об./об. FCS, 1-3 нг/мл bFGF и 3-10 мкг/мл гентамицина в среде Хэма F10 и высевали в колбы для клеточной культуры. SMDC, прикрепившиеся ко дну колбы для клеточной культуры, дополнительно поддерживали путем смены среды каждые 3-4 суток и субкультивирования после отделения клеток после достижения конфлюентности. Субкультивирование выполняли вплоть до достижения 1×10⁷ - 5×10⁷ SMDC.

Подсчет клеток проводили в соответствии с руководством к Chemometec Nucleocounter™. В этом методе используют окрашивание ядер пропидия иодидом и вычисляет количество клеток в 0,2 мл. Перед автоматическим подсчетом 100 мкл клеточной суспензии смешивали с 200 мкл буфера Reagent A-Lysis (для пермеабилизации клеточной мембраны) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем добавляли 200 мкл буфера Reagent B-Stabilizing. Суспензию смешивали, собирали с помощью nucleocasette™ и наконец проводили измерения.

На Фиг. 1 показана морфология SMDC в стандартных колбах для клеточной культуры, полученных посредством настоящего изобретения, с визуализацией с помощью фазово-контрастной микроскопии.

Пример 2 - Проточная цитометрия

Проточно-цитометрический анализ выполняли на проточном цитометре Guava easyCyte 6НТ 2L (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). В кратком изложении, клетки собирали с помощью трипсина при 37°С в течение 5 мин, центрифугировали при 400 rcf (относительная центробежная сила) и ресуспендировали в 1x PBS с добавлением 1% FCS. Клетки в концентрации 40000/реакционную смесь инкубировали с 5 мкл анти-CD56-РЕ (Beckman Coulter Inc., France), изотипом IgG1-PE (Beckman Coulter), изотипом Alexa488 (Sigma), анти-CD105-РЕ (Beckman Coulter Inc., France) или антителом А2В5-А1еха488 (Millipore) в течение 15 минут в 1,5 мл пробирке Eppendorf® при 4°С в темноте. Клетки промывали 1 мл PBS, центрифугировали при 400 rcf и ресуспендировали в 200 мкл 1x PBS для анализа FACS в 96-луночном круглодонном планшете. После промывания и ресуспендирования в каждую реакционную смесь добавляли 5 мкл красителя 7- амино-актиномицина D (Beckman Coulter Inc., France) для определения жизнеспособности клеток и планшет инкубировали в течение 10 минут при 4°С. Клеточные события определяли с помощью программного обеспечения Guava InCyte™ v.2.3. Гистограммы и точечные графики получали с минимальным количеством 3000 событий со скоростью потока образца 1,8 мкл/мл. Позитивное окрашивание получали путем сравнения изотипического контроля, установленного как по меньшей мере 99% негативный.

Пример 3 - Иммуноцитохимия

Сначала удаляли супернатант с чашек клеточных культур и клетки три раза промывали PBS. Пермеабилизацию и фиксацию осуществляли путем покрытия клеток 4% раствором формальдегида (об./об.; разбавленным в PBS) в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем клетки промывали PBS три раза после каждой проведенной стадии инкубации. После этого клетки покрывали 500 мкл hydrogenperoxid-block (Thermo Fisher Scientific) (блокирующий раствор на основе перекиси водорода) и инкубировали в течение пяти минут при комнатной температуре. На клетки с помощью пипетки наносили покрывали первичные антитела (десмин) в конечной концентрации 40 мкг/мл (масс/об.) и инкубировали в течение по меньшей мере 90 минут (37°С, 5% СО₂). Затем клетки покрывали 500 мкл биотин-конъюгированных вторичных антител (козы против кролика, поликлональные, Thermo Fisher Scientific) и инкубировали в тех же условиях, что и для первичных антител, но в течение по меньшей мере 60 минут. Для визуализации связывания антител, нужно было добавить 500 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (Vectorlabs) в конечной концентрации 2-5 мкг/мл (разбавленный в PBS) и инкубацию проводили при 37°С, 5% CO₂ в течение 20 минут с последующим нанесением на клетки 500 мкл однокомпонентного раствора с хромогеном, который удаляли через 5-15 минут. Конечную стадию промывания с помощью PBS проводили перед тем, как можно было наблюдать результаты. Клетки, окрашенные посредством иммуноцитохимии как десмин-позитивные, имели темно-красный цвет.

Пример 4 - Чистота SMDC

В SMDC, полученных посредством способа, описанного в Примере 1, определяли их чистоту по миогенным маркерам CD56 (NCAM) и десмина. Процент CD56-позитивных клеток определяли посредством проточной цитометрии, описанной в Примере 2. SMDC, полученные по настоящему изобретению, как указано в Примере 1, содержат 99,3% CD56-позитивных клеток (Фиг. 2А) и 98,77% жизнеспособных клеток (Фиг. 2В). Кроме того, экспрессию десмина в одной репрезентативной партии SMDC, полученной способом, описанным в Примере 1, анализировали с помощью иммуноцитохимии, как описано в Примере 3. На Фиг. 4 показана высокая чистота SMDC, полученных в Примере 1, так как большинство клеток является позитивными в отношении окрашивания десмина (Фиг. 3).

Пример 5 - Дифференцировка клеток

Дифференцировка человеческих миобластов в синцитиальные миотрубочки происходит, когда ростовую среду заменяют на бессывороточную среду для дифференцировки. К среде для дифференцировки скелетных мышечных клеток Skeletal Muscle Cell Differentiation Medium (Promo Cell) добавляли Skeletal Muscle Cell Differentiation Medium Supplement Pack (как описано в протоколе компании, у которой среда была приобретена) и 250 мкл гентамицина. Для начала дифференцировки клетки (в ростовой среде) высевали в 4-луночные или 24-луночные планшеты (60000-480000 клеток), предварительно подсчитанные, как описано в Примере 1. После прикрепления клеток к лунке (в течение ночи), среду для роста сливали, клетки промывали один раз средой для дифференцировки и покрывали средой для дифференцировки объемом 500 мкл.

Пример 6 - Миогенная активность SMDC

Клетки SMDC, которые относятся к миогенной линии, способны сливаться и образовывать синцитиальный миотрубочки in vitro, которые характерны для волокон скелетных мышц in vivo. Таким образом, миогенную активность SMDC тестировали с помощью дифференцировки in vitro. В полученных клетках, описанных в Примере 1, индуцировали дифференцировку, как описано в Примере 5, чтобы определить миогенную активность. SMDC образовали огромные миотрубочки, которые были десмин-позитивными (окрашенными, как описано в Примере 3), как видно из репрезентивной партии SMDC на Фиг. 4. Результаты подтвердили миогенную активность SMDC, которая необходима для функциональной регенерации ткани скелетных мышц.

Пример 7 - Анализ генной экспрессии

Клетки SMDC, полученные в примере 1, высевали, с последующим подсчетом клеток также описанным в примере 1, с плотностью 500000 клеток в лунку в 6-луночные планшеты (NUNC Thermo Scientific) до 70% конфлюентности, затем общую РНК выделяли с использованием набора для выделения RNeasy RNA (QIAGEN) в соответствии с инструкцией производителей. Концентрацию и чистоту РНК оценивали с помощью микрофлюидного анализа с использованием электрофореза в денатурирующем геле и биоанализатора 2100 Agilent. Приготовление образца для микроматричной гибридизации проводили, как описано в руководствах NuGEN Ovation PicoSL WTA System V2 и NUGEN Encore Biotin Module manuals (NuGEN Technologies, Inc, San Carlos, CA, USA). В кратком изложении, 7,5 нг общей РНК обратно транскрибировали в двухцепочечную кДНК в двухстадийном процессе, вводя последовательность метки SPIA. Очищенную от шариков кДНК амплифицировали при помощи реакции амплификации SPIA с последующей дополнительной очисткой с помощью микросфер. 4,5 мкг кДНК SPIA фрагментировали, терминально метили биотином и гибридизовали с панелями Affymetrix Prime View Human Gene Expression arrays в течение 16 ч при 45°С в гибридизационной камере GeneChip Hybridization Oven 640. Гибридизированные панели промывали и окрашивали в Affymetrix Fluidics Station FS450, и флуоресцентные сигналы измеряли с помощью Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G. Функции струйного элемента и сканирования контролировали с помощью программного обеспечения Affymetrix GeneChip Command Console v4.1.3. Обработку образца проводили на Affymetrix Service Provider и Core Facility, "KFB - Center of Excellence for Fluorescent Bioanalytics" (Regensburg, Germany; www.kfb-regensburg.de). Суммарные сигналы набора зондов в шкале log2 вычисляли с использованием алгоритма RMA (1) с помощью программного обеспечения Affymetrix GeneChip Expression Console v1.4. Для сравнения результатов экспрессии генов SMDC, полученных в Примере 1, с генами SMDC, полученных известными из уровня техники способами, данные по экспрессии генов имеющихся в продаже SMDC (Lonza), опубликованные в Abujarour et al., 2014 (R. Abujarour et al., "Myogenic differentiation of muscular dystrophy-specific induced pluripotent stem cells for use in drug discovery," Stem Cells Transl. Med., vol. 3, no. 2, pp. 149-160, Feb. 2014) были загружены из базы данных, присоединенных к публикации (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/geo/DATA/supplementary/series/GSE46633/GSE46633_RAW.ta r; last accession 21.07.2017). Сравнение экспрессии генов SMDC, полученных в Примере 1, с генами SMDC, проанализированными Abujarour et al., 2014, выполняли путем сравнения средних считываний на аннотацию разных генов с использованием программного обеспечения Partek Flow согласно предоставившей его компании (Partek Inc.). Более высокие средние показания на аннотацию, таким образом, представляют более высокое количество аннотированной мРНК, соответствующее более высокой экспрессии гена.

Пример 8 - Характеристика нейромышечной поддержки SMDC

Характеристику нейромышечной поддержки SMDC, полученными с использованием Примера 1, определяли по позитивному связыванию антитела А2В5 с клеточной поверхностью SMDC, выполненному с помощью проточной цитометрии (описанной в Примере 2). Как показано на Фиг. 5, 96,16% SMDC, полученных в Примере 1, являются позитивными в отношении А2В5-реактивного антитела, демонстрируя, что помимо их миогенной активности (экспрессии десмина, CD56), SMDC также проявляют нейрональные характеристики. Для сравнения характеристики нервно-мышечной поддержки SMDC, полученными согласно настоящему изобретению, с миобластами, выделенными способами, известными из уровня техники, экспрессию генов ферментов, необходимых для образования А2В5-реактивных ганглиозидов, проявляющих наиболее высокую активность гликосфинголипидного акцептора in vitro ST3GAL1 и ST3GAL2 SMDC, анализировали, как указано в Примере 7,. Экспрессия мРНК и ST3GAL1 и ST3GAL2 была выше в SMDC, полученных по настоящему изобретению, по сравнению с имеющимися в продаже SMDC, как показано на Фиг. 5. Кроме того, экспрессия ST3GAL3 также была выше в SMDC, полученных в Примере 1.

Пример 9 - Получение клеток без охлаждения после рассечения ткани

В качестве сравнительного примера способ по настоящему изобретению осуществляли при исключении стадии охлаждения. Для получения SMDC биопсию скелетных мышц брали из М. pectoralis major или М. biceps brachii пациента, страдающего недержанием. Чтобы получить биопсию, сначала кожу вскрывали при помощи разреза длиной примерно 1 см над мышцей, пока не была достигнута фасция М. pectoralis major. После вскрытия фасции отбирали 1 см³ мышечной ткани (биопсию). Биопсию непосредственно переносили в среду для транспортировки биопсии, предварительно охлажденную примерно до 4°С и содержащую базальную среду Хэма F10 с добавлением гентамицина (конечная концентрация 1-5 мкг/мл). Биопсию хранили в течение примерно 26 часов при 1-11°С в среде для транспортировки биопсии. Затем биопсию переносили в чашку Петри, заполненную 1x PBS. Мышечную ткань отделяли от соединительной ткани, используя стерильные щипцы и скальпель. Затем мышечную ткань переносили в другую чашку Петри, заполненную 1x PBS, и рассекали на кусочки размером 2-3 мм², используя скальпель. После дополнительной стадии переноса, как описано выше, кусочки ткани дополнительно разрезали на 1 мм² кусочки. Эти кусочки наконец переносили в центрифужную пробирку, заполненную 1x PBS, и центрифугировали в течение 10 минут при 1300 об/мин. После центрифугирования супернатант удаляли и мышечную ткань ресуспендировали в 1x PBS с добавлением 8 мкг/мл гентамицина. Суспензию мышечной ткани центрифугировали в течение 10 минут при 1300 об/мин, затем удаляли супернатант и добавляли 2,5 мл дигестирующего раствора, содержащего 1-5 мг/мл коллагеназы, 2-4% об./об. буфера Hepes, 0,1-10% об./об. фетальной телячьей сыворотки и 5-10 мкг/мл гентамицина в среде Хэма F10. Затем суспензию мышечной ткани инкубировали в течение от 6 до 20 часов при 37°С, 5% CO₂. Затем суспензию центрифугировали при 1300 об/мин в течение 10 минут, супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в среде, содержащей 10-20% об./об. FCS, 1-3 нг/мл bFGF и 3-10 мкг/мл гентамицина в среде Хэма F10, и помещали в колбы для клеточной культуры. SMDC, прикрепленные ко дну культуральной колбы, поддерживали сменой среды каждые 3-4 суток и субкультивировали с последующим отделением после достижения конфлюентности. Субкультивирование выполняли вплоть до достижения 1×10⁷ - 5×10⁷ клеток SMDC.

Пример 10 - Экспрессия мезенхимного клеточного маркера SMDC

Экспрессию мезенхимного маркера SMDC, полученных с использованием Примера 1, определяли посредством связывания анти-CD105 антитела, анти-CD105-РЕ (Beckman Coulter Inc., France), с клеточной поверхностью SMDC, измеренным посредством метода проточной цитометрии (описанного в Примере 2). Как показано на Фиг. 8, 98,69% SMDC, полученных в Примере 1, определяют как позитивные в отношении CD105-реактивного антитела, когда порог позитивности был установлен по изотопическому контролю (0,31% позитивным), указывая на то, что SMDC являются мезенхимными клетками и/или имеют мезенхимное происхождение.

Пример 11 - Измерение ацетилхолинэстеразной активности SMDC

Для измерения ацетилхолинэстеразной активности (AChE) 200000 клеток SMDC сеяли в покрытую желатином лунку 24-луночного планшета и индуцировали дифференцировку, как описано в Примере 5. Через шесть суток после начала дифференцировки среду для дифференцировки тщательно удаляли из 24-луночного планшета с немедленным добавлением 300 мкл 0,5 мМ раствора 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (DTNB) (приготовленного в фосфатном буфере, рН 7,2, с 0,1% тритоном Х-100). Через 2 минуты инкубации при комнатной температуре в темноте добавляли 50 мкл 5,76 мМ ацетилтиохолина йодида (ATI) (приготовленного в дистиллированной воде). Содержимое реакционной смеси инкубировали в течение 60 минут при 30°С в темноте с последующим измерением оптической плотности (OD) при 412 нм (OD412 нм) на микропланшетном ридере Anthos Zenyth 340rt (Biochrom Ltd., Cambridge, UK). Также была включена контрольная реакция, которая состояла из всех реагентов за исключением клеток. Скорректированные значения OD412 нм получали путем вычитания среднего измерения для контроля из среднего значения OD412 нм. Активность AChE в относительных мЕ (AChE mUrel) рассчитывали в соответствии с уравнением прямой для стандартной кривой. Стандартная кривая была получена посредством измерения 4-500 мЕ/мл разведений готового к употреблению маточного раствора 50 Е/мл AChE (из электрического угря, ААТ Bioquest® Inc., Sunnyvale, СА, USA). Стандартные разведения готовили в фосфатном буфере (рН 7,2 с 0,1% тритоном Х-100) и немедленно использовали. Для анализа стандартного фермента AChE 200 мкл каждого разведения смешивали с 300 мкл 0,5 мМ DTNB и 50 мкл 5,76 мМ ATI, соответственно, и OD412 нм измеряли через 60 минут в 24-луночном планшете. Для нормализации в отношении концентраций белка, для клеточного типа, активность AChE измеренного количества клеток делили на общее содержание белка в этих клетках, что приводило к активности mUrel AChE на г белка (AChE mUrel/г белка). Для анализа общего количества белка в клеточной популяции, аликвоту прикрепленных клеток, дифференцированных в соответствии с Примером 5, сначала дважды промывали PBS, затем покрывали PBST (0,1% Х-100 Triton) и затем инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем лизат ресуспендировали и переносили в пробирку Eppendorf®, быстро встряхивали и затем центрифугировали в течение 4 минут при 1200*g. Наконец, прозрачный супернатант переносили в свежую пробирку Eppendorf® и концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белка Pierce ВСА (Thermo Scientific, MA, USA) в соответствии с инструкциями производителя путем измерения OD при 540 нм с помощью микропланшетного ридера Anthos Zenyth 340rt (Biochrom Ltd., Cambridge, UK).

Пример 12 - Количественная оценка компетентности SMDC к слиянию

Компетентность SMDC к слиянию основана на их способности образовывать многоядерные миотрубочки и представляет их миогенную активность. Компетентность к слиянию определяется как индекс слияния, который представляет собой количество ядер, расположенных в многоядерных миотрубочках, определенный как клетки, содержащие по меньшей мере 3 ядра, деленные на общее количество ядер в видимом поле микроскопа. Для определения индекса слияния SMDC, 2* 105 клеток высевали на покрытые желатином лунки 24-луночных планшетов и индуцировали дифференцировку, заменяя ростовую среду средой для дифференцировки скелетных мышц через 24 часа после посева. Через 6 суток дифференцировки клетки дважды промывали PBS и фиксировали 4% PFA в течение 10 минут. Затем клетки трижды промывали PBS и окрашивали 2 мкг/мл раствором Hoechst33342 в течение 20 минут. Для каждого образца фиксировали по меньшей мере три поля во время иммунофлуоресцентной визуализации и накладывали на фазово-контрастные изображения, что позволило легко обнаруживать ядра и границы клеток. Индекс слияния рассчитывали для каждого зафиксированного поля зрения посредством деления количества ядер в пределах трубочек на общее количество ядер на поле с последующим вычислением среднего для всех проанализированных полей. В качестве миотрубочек рассматривали только клетки, имеющие по меньшей мере 3 ядра. Для статистического анализа для каждой группы клеток анализировали по меньшей мере 3 популяции, полученные от разных пациентов.

Claims (22)

1. Способ получения популяции клеток, происходящих из скелетных мышц (SMDCs), обладающих миогенной активностью и компетентностью к слиянию, где популяция содержит по меньшей мере 90% CD56-позитивных, 90% A2B5-позитивных, 90% CD105-позитивных и 90% десмин-позитивных клеток, включающий стадии:

(а) охлаждения образца, полученного из ткани скелетных мышц, в буфере;

(б) обработки с последующим охлаждением образца; где охлаждение выполняют при температуре от 1 до 16°C в течение периода времени от 2 часов до 48 часов;

(в) ресуспендирования образца со стадии (б) в среде с сывороткой, содержащей коллагеназу, и нагревания до 25 - 38°С в течение 1-20 часов; осаждения образца центрифугированием; и

(г) ресуспендирования осадка образца со стадии (в) для получения суспензии одиночных клеток из образца со стадии (в) с получением таким образом популяции SMDCs.

2. Способ по п. 1, где стадию (а) выполняют при температуре ниже 16°C, предпочтительно в интервале температур от 1 до 16°C, предпочтительно от 4 до 10°C, особенно предпочтительно при 7°C; и в течение периода времени вплоть до 96 часов.

3. Способ по п. 1 или 2, где стадия (б) включает использование ножниц, скальпеля, пинцета, фильтра или шаровой мельницы.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где охлаждение на стадии (б) выполняют при температуре в интервале от 4 до 8°C, особенно предпочтительно при 4°C и в течение периода времени от 2 часов до 48 часов.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где стадия (в) включает проведение ферментативной обработки раствором, содержащим один или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из трипсина, папаина, эластазы, гиалуронидазы, дезоксирибонуклеазы и ДНКазы.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где стадию (в) выполняют при температуре в интервале от 36 до 38°C, особенно предпочтительно при 37°C.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где стадия (г) предпочтительно включает метод, выбранный из по меньшей мере одного из сортировки FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток), центрифугирования, электрокинетической сортировки, сортировки посредством акустофореза, сортировки клеток с помощью микросфер и оптической сортировки.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где после стадии (г) выполняют дополнительную стадию (д), включающую инкубацию одноклеточной суспензии, полученной на стадии (г), где инкубацию на стадии (д) предпочтительно выполняют при температуре в интервале от 25 до 38°C, предпочтительно от 36 до 38°C, особенно предпочтительно при 37°C, получая таким образом прикрепленные SMDCs.

9. Способ по п. 8, где после стадии (д) выполняют дополнительную стадию (е), включающую удаление клеток, неприкрепленных на стадии (д), где стадию (е) предпочтительно выполняют через промежуток времени от по меньшей мере 6 часов до 4 суток.

10. Способ по п. 9, где после стадии (е) выполняют дополнительную стадию (ж) размножения клеток, прикрепленных на стадии (д), при этом размножение на стадии (з) включает культивирование прикрепленных клеток в течение 1-5 пассажей до 70-80% конфлюентности.

11. Клеточная популяция SMDCs (клетки, происходящие из скелетных мышц), обладающая миогенной активностью и компетентностью к слиянию, где популяция содержит по меньшей мере 90% CD56-позитивных, 90% A2B5-позитивных, 90% CD105-позитивных и 90% десмин-позитивных клеток.

12. Клеточная популяция SMDCs по п. 11, где более 95% или 98% указанных SMDCs экспрессируют CD56, A2B5, CD105 и десмин.

13. Клеточная популяция SMDCs по п. 11 или 12, полученная способом по любому из пп. 1-10.

14. Клеточная популяция SMDCs по любому из пп. 11-13 для использования в качестве фармацевтической композиции.

15. Клеточная популяция SMDCs по любому из пп. 11-13 для использования в способе предупреждения или лечения нейромиопатий и/или миопатий; предпочтительно для использования в способе предупреждения или лечения нейромиопатий и/или миопатий, в частности недержания кала и/или недержания мочи.

16. Клеточная популяция SMDCs по любому из пп. 11-13 для использования в способе лечения мышечной дисфункции, где мышечная дисфункция представляет собой недержание, в частности недержание мочи и/или анальное недержание или недержание кала.

17. Клеточная популяция SMDCs для использования по п. 15 или 16, где клеточная популяция по любому из пп. 11-13 предназначена для использования в способе лечения недержания мочи и клеточная популяция SMDCs представлена в 50-200 мкл клеточного суспензионного инъекционного раствора с концентрацией от 1x105 до 6x106 клеток на 100 мкл инъекционного раствора для инъекции в мочевой сфинктер.

18. Клеточная популяция SMDCs для использования по п. 15 или 16, где клеточная популяция по любому из пп. 11-13 предназначена для использования в способе лечения анального недержания и клеточная популяция SMDCs представлена в 50 мкл - 1 мл клеточного суспензионного инъекционного раствора с концентрацией от 1x105 до 6x106 клеток на 100 мкл инъекционного раствора для инъекции в наружный анальный сфинктер, и, в частности, где способ лечения анального недержания включает от 20 до 40 инъекций суспензии клеток, происходящих из скелетных мышц, где в каждой инъекции инъецируют от 50 до 500 мкл суспензии клеток, происходящих из скелетных мышц, и где каждую инъекцию вводят в другую область анального сфинктера.

Images