WO2012091023A1 - 培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法 - Google Patents

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medium
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快朗 若松
康文 今本
純 石橋
高橋　研
田中　久也
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協和発酵キリン株式会社
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    • C12N2511/00—Cells for large scale production

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing an aqueous solution containing a medium and a chelating agent, an aqueous solution prepared by the preparation method, a method for culturing cells using the aqueous solution prepared by the preparation method, and a method for producing a physiologically active substance using the culture method ,
  • a physiologically active substance produced using the production method a method for membrane filtration of an aqueous solution prepared by the method for preparing the aqueous solution, a method for improving the membrane filterability of an aqueous solution, or an aqueous solution prepared, and the aqueous solution as a membrane
  • the present invention relates to a method for producing a physiologically active substance by culturing cells using the aqueous solution after filtration.
  • Non-patent Document 1 Physiologically active substances, especially glycoproteins or antibodies, have recently been approved as various biopharmaceuticals, and more candidate substances are under development (Non-patent Document 1). For this reason, production of physiologically active substances such as glycoproteins and antibodies using cells is expected to become increasingly popular.
  • Non-Patent Document 2 In preparation of an aqueous solution for cell culture that is indispensable for producing these physiologically active substances using cells, it is necessary to ensure the sterility of the medium for the safety of the product and the process. So far, 0.2 ⁇ m membrane filtration process for removing microorganisms has been widely used in the preparation of aqueous solution for cell culture, but it is recommended to use 0.1 ⁇ m membrane filtration process for the purpose of removing mycoplasma for several years. (Non-Patent Document 2). Therefore, good membrane permeability of an aqueous solution for cell culture is becoming more and more useful in industrialization, and is one problem.
  • Non-patent Document 3 it is a problem in the pharmaceutical industry that biopharmaceuticals have higher production costs than low molecular weight drugs.
  • Non-patent Document 3 efforts have been made to reduce costs by reinforcing productivity by adding some components, adding new components, or increasing the concentration of aqueous solutions for cell culture. Good membrane filtration is becoming more difficult.
  • a highly versatile aqueous solution for cell culture that performs membrane filtration in an increasingly stable and short time.
  • Patent Document 1 Non-Patent Document 4, and Non-Patent Document 5
  • the improvement of membrane filterability of an aqueous solution for cell culture by increasing the membrane area is not industrially suitable due to cost and equipment limitations.
  • the improvement of dissolution conditions has not led to a dramatic improvement in the filterability of aqueous solutions for cell culture.
  • Chelating agents such as citric acid, malic acid or ethylenediaminetetraacetic acid are widely known as one of the components contained in an aqueous solution for cell culture (Patent Document 2 and Patent Document 3).
  • Sialic acid is also known as a substance having a chelating action (Non-Patent Document 6).
  • Non-Patent Document 6 there is no known method for improving the membrane filterability of an aqueous solution for cell culture using a chelating agent.
  • the present invention provides a method for preparing an aqueous solution that achieves dramatic improvement in filterability, an aqueous solution prepared by the preparation method, a method for culturing cells using an aqueous solution prepared by the preparation method, A method for producing a physiologically active substance using a culture method, a physiologically active substance produced using the production method, a method for membrane filtration of an aqueous solution prepared by the method for preparing the aqueous solution, a method for improving the membrane filterability of an aqueous solution, Alternatively, a method for producing a physiologically active substance by preparing an aqueous solution, subjecting the aqueous solution to membrane filtration, and culturing cells using the aqueous solution is provided.
  • the present invention is as follows. 1. A method for preparing an aqueous solution containing a medium and a chelating agent, comprising adding the chelating agent to the aqueous solution prior to final pH adjustment of the aqueous solution. 2. The preparation of the aqueous solution according to item 1 above, wherein the chelating agent is at least one selected from citric acid, malic acid, ethylenediaminetetraacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid iron (III) sodium salt and sialic acid, and salts or hydrates thereof. Method. 3. 3. The preparation method according to item 1 or 2, wherein the medium is a powder medium, a liquid medium, or a slurry medium. 4). 4.
  • the preparation method according to item 3 wherein the powder medium is a medium further containing at least one selected from metal salts, sugars and vitamins. 5. 5. The preparation method according to any one of items 1 to 4, wherein the medium is a cell culture medium. 6). 6. The preparation method according to item 5 above, wherein the medium is a medium for animal cell culture. 7. 7. The preparation method according to item 6 above, wherein the medium is a medium for CHO cell culture derived from Chinese hamster ovary tissue. 8). 8. An aqueous solution prepared by the method according to any one of 1 to 7 above. 9. 8. A cell culture method using the aqueous solution prepared by the method according to any one of 1 to 7 above. 10. 10. The method for culturing cells according to item 9, wherein the cells are animal cells. 11.
  • the method for culturing cells according to item 10 above, wherein the cells are CHO cells derived from Chinese hamster ovary tissue.
  • 12 A method for producing a physiologically active substance, which uses the cell culture method according to any one of 9 to 11 above.
  • the physiologically active substance is a peptide or protein.
  • 14 The production method according to item 13 above, wherein the protein is a glycoprotein or an antibody. 15.
  • a method for membrane filtration of an aqueous solution containing a medium and a chelating agent wherein the aqueous solution is an aqueous solution prepared by adding a chelating agent prior to final pH adjustment of the aqueous solution.
  • the chelating agent is at least one selected from citric acid, malic acid, ethylenediaminetetraacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid iron (III) sodium salt and sialic acid, and salts or hydrates thereof.
  • Method. 18 18.
  • the powder medium is a powder further containing at least one selected from metal salts, sugars and vitamins.
  • 20. The method for membrane filtration as described in 18 or 19 above, wherein the medium is a cell culture medium. 21. 21. The method of membrane filtration as described in 20 above, wherein the medium is a medium for animal cell culture. 22. 22. The method for membrane filtration according to 21 above, wherein the medium is a medium for CHO cell culture derived from Chinese hamster ovary tissue. 23. 23.
  • a method for improving the membrane filterability of an aqueous solution comprising adding a chelating agent to an aqueous solution to prepare an aqueous solution containing the chelating agent and subjecting the aqueous solution to membrane filtration. 25. 25. A method for improving the membrane filterability of an aqueous solution as described in 24 above, further comprising adding an aqueous medium to the aqueous solution to prepare an aqueous solution containing the medium and a chelating agent, and subjecting the aqueous solution to membrane filtration. 26. 26.
  • the present inventors have found for the first time that the membrane filterability of the aqueous solution is greatly improved by adding a chelating agent in the aqueous solution preparation method. Further, the present inventors have found that the membrane filterability is improved depending on the addition concentration of the chelating agent in the aqueous solution preparation method.
  • the present inventors have found that the membrane filterability of the aqueous solution is greatly improved by adding the chelating agent prior to the final pH adjustment of the aqueous solution in the aqueous solution preparation method.
  • the present inventors have found that a physiologically active substance can be produced by culturing cells using an aqueous solution prepared by adding a chelating agent prior to final pH adjustment of the aqueous solution.
  • a method for preparing an aqueous solution containing a medium and a chelating agent can be provided. Further, using an aqueous solution prepared by the method, a cell culturing method using the aqueous solution prepared by the method, a method for producing a physiologically active substance using the cell culturing method, and a method for producing the physiologically active substance It has been shown that the bioactive substances produced can be provided.
  • a method for membrane filtration of an aqueous solution prepared by the method for preparing the aqueous solution and a method for improving membrane filtration properties characterized by preparing an aqueous solution using a chelating agent can be provided. It was also shown that a method for producing a physiologically active substance can be provided by subjecting an aqueous solution prepared by the preparation method to membrane filtration and then culturing cells using the obtained aqueous solution.
  • FIG. 1 shows that the filterability of an aqueous solution is improved by adding a chelating agent.
  • the vertical axis indicates the maximum throughput [Vmax (L / m 2 )] per unit membrane area.
  • the horizontal axis shows the chelating agent used.
  • FIG. 2 shows that the filterability of the aqueous solution is significantly improved by adding the chelating agent prior to the final pH adjustment of the aqueous solution.
  • the vertical axis indicates the maximum throughput [Vmax (L / m 2 )] per unit membrane area.
  • the horizontal axis indicates the time when the chelating agent is added.
  • FIG. 3 shows that the filterability is improved depending on the concentration of the chelating agent.
  • the vertical axis indicates the maximum throughput [Vmax (L / m 2 )] per unit membrane area.
  • the horizontal axis represents the chelating agent concentration (g / L).
  • FIG. 4 shows that the filterability improving effect by the chelating agent does not depend on the membrane material and the membrane structure.
  • the vertical axis indicates the maximum throughput [Vmax (L / m 2 )] per unit membrane area.
  • the horizontal axis indicates the material of the filtration membrane.
  • FIG. 5 shows that the filterability of the aqueous solution is significantly improved by adding sialic acid as a chelating agent.
  • the vertical axis indicates the maximum throughput [Vmax (L / m 2 )] per unit membrane area.
  • the horizontal axis indicates the type of solution.
  • the present invention relates to a method for preparing an aqueous solution containing a medium and a chelating agent, wherein the chelating agent is added to the aqueous solution prior to final pH adjustment of the aqueous solution.
  • the aqueous solution is not particularly limited, but preferably includes an aqueous solution capable of culturing cells and the like (also referred to as an aqueous solution for cell culture).
  • Examples of the medium include a powder medium, a liquid medium, and a slurry medium. These media can be appropriately selected from commercially available media, and two or more types of media may be mixed. Furthermore, known media described in literatures can be selected.
  • the medium examples include a medium for bacterial cell culture, a medium for yeast cell culture, a medium for plant cell culture, a medium for animal cell culture, and the like. Among these, a medium for animal cell culture is preferable.
  • the medium is not particularly limited, and examples thereof include an expansion culture medium, a basic (initial) medium, and a feed medium.
  • the medium may be any of a synthetic medium, a semi-synthetic medium, or a natural medium.
  • examples thereof include a basal medium, a serum-containing medium, a serum-free medium, a medium not containing animal-derived components, or a protein-free medium.
  • a serum-free medium, a protein-free medium, or a completely synthetic medium is preferable.
  • a medium for cell culture a medium for animal cell culture is preferable, and a medium for CHO cell culture derived from Chinese hamster ovary tissue is more preferable.
  • basal medium for example, RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM (DMEM) medium [DMEM] medium [DMEM] medium, for example. , 8, 396 (1959)], 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medical, 73, 1 (1950)], F12 medium (manufactured by LTI) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288 (1965)], Iskov modified Dulbecco medium (IMDM medium) [J.
  • EX-CELL registered trademark
  • EX-CELL registered trademark
  • EX-CELL registered trademark
  • 325 manufactured by SAFC Bioscience
  • CHO-S-SFMII manufactured by Invitrogen
  • RPMI1640 medium DMEM medium
  • F12 medium IMDM
  • EX-CELL registered trademark
  • hybridoma SFM medium Invitrogen
  • the serum-containing medium examples include a basal medium, mammalian serum such as cow or horse, avian animal serum such as chicken, fish animal serum such as yellowtail, or one or more kinds of serum from the above serum fractions. Or what added the serum fraction is mentioned.
  • serum-free medium examples include a basal medium supplemented with nutrient factors or physiologically active substances that are serum substitutes.
  • substances that are added instead of animal-derived components may be added.
  • the substance include physiologically active substances produced by genetic recombination methods, hydrolysates, and lipids that do not contain animal-derived materials.
  • the protein-free medium includes, for example, an ADPF medium (Animal derived protein free medium, manufactured by High Clone), CD-Hybridoma medium (manufactured by Invitrogen), CD-CHO medium (manufactured by Invitrogen), IS-CD-CHO medium ( Irvine Scientific) or EX-CELL (registered trademark) CD-CHO medium (SAFC Bioscience).
  • ADPF medium Animal derived protein free medium, manufactured by High Clone
  • CD-Hybridoma medium manufactured by Invitrogen
  • CD-CHO medium manufactured by Invitrogen
  • IS-CD-CHO medium Irvine Scientific
  • EX-CELL registered trademark
  • the production method of the powder medium is not particularly limited, but preferably, a production method by a mixing process such as a disk mill, a ball mill or a pin mill of a dry component, or a production method by freeze-drying an aqueous solution prepared in advance, etc. It is done.
  • the powder medium includes a medium that exists in the form of granules.
  • the finely divided component may further include a step of spraying and drying a solution in which at least one material selected from the group consisting of natural glues, synthetic glues, sugars, and fats and oils is dissolved. Good.
  • the desired nutrient factor can be appropriately selected and added to the medium.
  • you may comprise a culture medium with the component which selected the desired trophic factor suitably.
  • the nutrition factor include a carbon source such as a saccharide or a nitrogen source such as an amino acid.
  • Specific examples include amino acids, metals, vitamins, sugars, salts, lipids, nucleic acids, physiologically active substances, fatty acids, organic acids, proteins, hydrolysates, and the like.
  • these compounds may form salts such as hydrochloride, sodium salt, potassium salt, ammonium salt, and / or solvates such as hydrates.
  • the amino acid is not particularly limited.
  • L-alanine (Ala), L-arginine (Arg), L-asparagine (Asn), L-aspartic acid (Asp), L-cysteine (Cys), L-cystine L-glutamic acid (Glu), L-glutamine (Gln), glycine (Gly), L-histidine (His), L-isoleucine (Ile), L-leucine (Leu), L-lysine (Lys), L-methionine (Met), L-phenylalanine (Phe), L-proline (Pro), L-serine (Ser), L-threonine (Thr), L-tryptophan (Trp), L-valine (Val), etc.
  • salts such as hydrochlorides and sodium salts and / or solvates such as hydrates may be used. It may be added as a peptide, and examples thereof include L-alanyl-L-glutamine or L-alanyl-L-cysteine.
  • physiologically active substance examples include insulin, transferrin, serum albumin or a serum fraction containing a growth factor.
  • lipids examples include cholesterol, linoleic acid, and linolenic acid.
  • salts such as hydrochlorides and sodium salts and / or solvates such as hydrates may be used.
  • metal For example, iron, manganese, zinc, molybdenum, vanadium, copper, cadmium, rubidium, cobalt, zirconium, germanium, nickel, tin, chromium, silicon etc. are mentioned, 1 type or 2 types or more Used in combination. These metals may form, for example, salts such as hydrochloride, sulfate, sodium salt, potassium salt and ammonium salt, and / or solvates such as hydrate.
  • the saccharide may be any of monosaccharide, oligosaccharide and polysaccharide, and is not particularly limited.
  • sugar derivatives such as deoxy sugar, uronic acid, amino sugar or sugar alcohol are also included.
  • glucose, mannose, galactose, fructose, ribose, arabinose, ribulose, erythrose, erythrulose, glyceraldehyde, dihydroxyacetone, sedoheptulose, maltose, lactose or sucrose can be used, and one or more can be used in combination.
  • salts such as hydrochlorides and sodium salts and / or solvates such as hydrates may be used.
  • the vitamin is not particularly limited, and examples thereof include d-biotin, D-pantothenic acid, choline, folic acid, myo-inositol, niacinamide, pyridoxal, riboflavin, thiamine, cyanocobalamin, and DL- ⁇ -tocopherol. Or two or more types are used in combination. Further, salts such as hydrochlorides and sodium salts and / or solvates such as hydrates may be used.
  • hydrolyzate examples include hydrolysates such as soybean, wheat, rice, peas, cottonseed, fish or yeast extract, or extracts.
  • hydrolysates such as soybean, wheat, rice, peas, cottonseed, fish or yeast extract, or extracts.
  • SOY HYDROLYSATE UF manufactured by SAFC Bioscience, catalog number: 91052-1K3986, or 91052-5K3986
  • the chelating agent is not particularly limited as long as it is suitable for the purpose of use of the aqueous solution prepared by adding the chelating agent.
  • the chelating agent of the present invention one type or a plurality of types of chelating agents may be used.
  • a water-soluble chelating agent is particularly preferable, and examples thereof include aminocarboxylic acid type, oxycarboxylic acid type, lower dibasic carboxylic acid type, polyhydric alcohol, and inorganic compound type.
  • the chelating agent of the present invention may form a salt or the like as long as the chelating effect is maintained, for example, a salt such as hydrochloride, sodium salt, potassium salt, ammonium salt, and / or hydration A solvate such as a product may be formed.
  • aminocarboxylic acid-based chelating agents include nitrilotriacetic acid (NTA), N-hydroxyethyliminodiacetic acid (NIMDA), ethylenediaminediacetic acid (EDDA), ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and ethylenediamine.
  • Tetraacetic acid iron (III) sodium salt (EDTA iron (III) sodium salt), N-hydroxyethylethylenediaminetetraacetic acid (HEDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), 1,2-cyclohexanediaminetetraacetic acid (CyDTA), trimethylene Diamine tetraacetic acid (TMTA), ethylene glycol diethyl ether diamine tetraacetic acid (GEDTA), ethylenediaminetetrapropionic acid (EDTP), glutamic acid-N, N-diacetic acid, aspartic acid-N, N- Acid, glycine, alanine, solvate, etc. These salts and / or hydrates thereof.
  • oxycarboxylic acid-based chelating agents include, for example, lactic acid, glycolic acid, citric acid, malic acid, tartaric acid, gluconic acid, mandelic acid, solvates of these salts and / or hydrates, and the like. Is mentioned.
  • the lower dibasic carboxylic acid-based chelating agent include oxalic acid, malonic acid, solvates of these salts and / or hydrates, and the like.
  • polyhydric alcohol examples include glycols such as ethylene glycol, diethylene glycol and triethylene glycol, and sugar alcohols. Specific examples include inositol and the like such as glycerin, erythrite, arabit, xylit, sorbit, mannitol or galactite.
  • the inorganic compound-based chelating agent examples include pyrophosphoric acid, triphosphoric acid, condensed phosphoric acid, solvates of these salts and / or hydrates, and the like. Particularly preferred as a chelating agent is trisodium citrate dihydrate, L-malic acid or ethylenediaminetetraacetic acid iron (III) sodium salt.
  • sialic acid can be used as a chelating agent.
  • Sialic acid means 2-keto-3 deoxynonic acid having a carboxyl group consisting of nine carbon skeletons, and is also called neuraminic acid.
  • Sialic acid includes N-acetylneuraminic acid, N-glycolylneuraminic acid, O-acetylneuraminic acid, or deaminoneuraminic acid, or salts, hydrates and / or derivatives thereof, etc. It is.
  • sialic acid includes those having 5-N-acetyl or 5-N-glycolylneuraminic acid as a skeleton, wherein some of the hydroxyl groups are O-acetylated.
  • the sialic acid of the present invention is particularly preferably N-acetylneuraminic acid dihydrate.
  • the chelating agent can be produced by a known chemical synthesis method.
  • the chelating agent is added during preparation of the aqueous solution, and it is particularly preferable to add the chelating agent to the aqueous solution prior to final pH adjustment.
  • the order in which the chelating agents are added to the aqueous solution can be appropriately selected depending on the composition of the medium to be added, the type of the chelating agent, etc., as long as it is prior to the final pH adjustment of the aqueous solution. .
  • the membrane filterability of the prepared aqueous solution can be improved.
  • the chelating agent can be added to the aqueous solution simultaneously with or before any medium, and is preferably added to the aqueous solution before or simultaneously with the medium. Further, the chelating agent can be added to the medium in advance. By adding the chelating agent to the aqueous solution prior to or simultaneously with the medium, the membrane filterability of the prepared aqueous solution can be further improved.
  • the final pH adjustment in the present invention refers to a step of adjusting the pH of the aqueous solution to a predetermined pH.
  • the final pH is adjusted according to the intended use of the aqueous solution.
  • the pH value may be any value as long as cells can be cultured.
  • pH adjustment is unnecessary, the final addition of the substance contained in the aqueous solution to the aqueous solution is regarded as the final pH adjustment.
  • the final pH adjustment can be performed using any acid or alkali. Specifically, for example, sodium bicarbonate, hydrochloric acid, sodium hydroxide and the like can be used.
  • Na 2 CO 3 or 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine ethersulfonic acid (which adjusts the pH in the medium) HEPES), 3- (N-Morpholino) propanesulphonic acid (MOPS), etc. may already be contained.
  • the amount of the chelating agent added is not particularly limited, but after the aqueous solution is prepared, the concentration of the added chelate in the aqueous solution is preferably 0.001 mmol / L or more, more preferably 0.01 mmol / L or more, and still more preferably 0. It is preferable to add an amount such that it is 1 mmol / L or more, particularly preferably 0.34 mmol / L or more.
  • the amount of the chelating agent added to the aqueous solution is within the range of 0.001 to 1000 mmol / L, 0.01 to 100 mmol / L, 0.1 to 100 mmol / L, 0.1 to 50 mmol / L, and the like. However, it is preferable to add an amount such that it is 0.34 to 89 mmol / L, more preferably 0.34 to 15 mmol / L, and particularly preferably 0.34 to 6.8 mmol / L. You can also.
  • the concentration of the chelating agent in the prepared aqueous solution may be higher due to the metal such as iron and the chelate complex added as a source of metal such as iron in the medium.
  • hydrolyzate, metal salt, saccharide, vitamin, amino acid, pH adjuster, organic acid, fatty acid, peptide, physiologically active substance, lipid or nucleic acid, etc. are separately or partially mixed in a medium. It can also be added. Metal salts, sugars or vitamins can also be added to the culture medium.
  • the cells may be eukaryotic cells or prokaryotic cells, for example, cells derived from mammals, birds, reptiles, amphibians, fish, insects or plants, microorganisms such as bacteria, Escherichia coli or Bacillus subtilis, bacteria, Escherichia coli or Examples include cells derived from microorganisms such as Bacillus subtilis, yeasts, or cells derived from yeasts.
  • animal cells belonging to mammals are preferred, animal cells derived from primates such as humans or monkeys or animal cells derived from rodents such as mice, rats or hamsters, more preferably derived from Chinese hamster ovary tissue. CHO cells are most preferred.
  • CHO cells derived from Chinese hamster ovary tissue in the present invention include any cells established from ovarian tissue of Chinese hamster (Crichetulus griseus).
  • CHO-K1 strain ATCC No. CCL-61
  • DUXB11 strain ATCC CRL-9096
  • Pro-5 strain ATCC CRL-1781 registered in ATCC (The American Type Culture Collection)
  • CHO / dhfr- ATCC No. CRL-9096
  • commercially available CHO-S strain Lifetechnologies Cat # 11619
  • CHO / DG44 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)] or sub-strains obtained by acclimating these strains to various media.
  • Examples of cells belonging to mammals include myeloma cells, ovarian cells, kidney cells, blood cells, uterine cell connective tissue cells, mammary gland cells or embryonic retinoblasts, or cells derived from these cells.
  • myeloma cells cells derived from myeloma cells, ovary cells, or cells derived from ovarian cells are preferable.
  • human cell lines HL-60 ATCC No. CCL-240
  • HT-1080 ATCC No. CCL-121
  • HeLa ATCC No. CCL-2
  • 293 ECACC No. 85120602
  • Namalwa ATCC CRL-1432
  • Namalwa KJM-1 Chinese Cell ACC2605, International Publication No. 2005/017130
  • PER. C6 ECACC No. 96022940, US Pat. No. 6,855,544
  • VERO ATCC No. CCL-1651
  • COS-7 ATCC No. CRL-1651
  • monkey cell lines ATCC No. C127I (mouse cell line) ATCC No.
  • CRL-1616 Sp2 / 0-Ag14 (ATCC No. CRL-1581), NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), NS0 (ATCC No. CRL-1827), rat cell line Y3 Ag1.
  • 2.3. ATCC No. CRL-1631
  • YO ECACC No. 85110501
  • YB2 / 0 ATCC No. CRL-1662
  • Examples of cells belonging to birds include the chicken cell line SL-29 (ATCC No. CRL-29).
  • Examples of cells belonging to fish include zebrafish cell line ZF4 (ATCC No. CRL-2050).
  • Examples of cells belonging to insects include the Spodoptera frugiperda cell line Sf9 (ATCC No. CRL-1711).
  • Examples of primary cultured cells used for vaccine production include primary monkey kidney cells, primary rabbit kidney cells, primary chicken embryo cells, or primary quail embryo cells.
  • myeloma cells or cells derived from myeloma cells include Sp2 / 0-Ag14, NS0, Y3, Ag1.2.3. , YO, YB2 / 0, and the like.
  • ovary cells or cells derived from ovarian cells include the above-described CHO cells derived from Chinese hamster ovary tissue.
  • kidney cells include 293, VERO, COS-7, BHK21, and MDCK.
  • Examples of blood cells include HL-60, Namalwa, Namalwa KJM-1, or NM-F9.
  • Examples of uterine cells include HeLa.
  • Examples of connective tissue cells include HT-1080 and NIH3T3.
  • Examples of mammary gland cells include C1271I.
  • Examples of embryonic retinoblast cells include PER. C6 etc. are mentioned, respectively.
  • the presence or absence of the ability to produce a substance is not particularly limited as a cell.
  • iPS cells obtained by introducing several types of genes into somatic cells, sperm and egg cells collected from mammalian donors including humans Examples thereof include cells that produce a substance or fused cells that have produced a substance.
  • cells that produce substances, or fused cells that have produced substances are preferable, such as animal cells that produce substances, or fusion cells derived from animals that have produced substances. More preferred.
  • the desired substance is an antibody
  • a hybridoma that is a fusion cell of an antibody-producing cell such as a B cell and a myeloma cell can be used.
  • Animal cells that have been subjected to mutation treatment to produce substances, or animal cells that have been subjected to mutation treatment to increase the expression level of substances are also included in animal cells.
  • animal cells that have been subjected to mutation treatment to produce substances include cells in which mutations have been introduced into protein modifying enzymes, etc. in order to be able to produce desired substances.
  • the desired substance is a glycoprotein
  • cells in which mutations are introduced into various sugar chain modifying enzymes in order to change the structure of the sugar chain can be mentioned.
  • any animal cell may be used as the animal cell that produces the substance as long as the desired substance can be produced.
  • an animal cell transformed with a recombinant vector containing a gene involved in the production of the substance are also included.
  • the transformed cell can be obtained by introducing a DNA involved in the production of a substance and a recombinant vector containing a promoter into the cells belonging to the mammal.
  • DNA encoding a substance such as a peptide DNA encoding an enzyme or protein involved in the biosynthesis of the substance, and the like can be used.
  • Any promoter can be used as long as it functions in the animal cells used in the present invention.
  • a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter for example, a cytomegalovirus (CMV) immediate early (IE) gene promoter, an SV40 early promoter, a retrovirus Promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter, SR ⁇ promoter and the like.
  • an enhancer of IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • Recombinant vectors can be prepared using desired vectors. Any vector can be used as the vector used for preparing the recombinant vector as long as it functions in the animal cells used in the present invention.
  • Any vector can be used as the vector used for preparing the recombinant vector as long as it functions in the animal cells used in the present invention.
  • pcDNAI, pcDM8 manufactured by Funakoshi
  • pAGE107 [Japan KOKAI Publication No. 3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAS3-3 Japanese Unexamined Patent Publication No. 227075
  • pcDM8 [Nature, 329, 840 (1987)]
  • pcDNAI / Amp Invitrogen
  • pREP4 Invitrogen
  • pAGE103 [J. Biochem. , 101, 1307 (1987)]
  • pAGE210 and the like.
  • any method for introducing a recombinant vector into a host cell any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the cell.
  • electroporation [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • calcium phosphate Method Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987), Virology, 52, 456 (1973)] and the like.
  • transformed cells include transformed cells 7-9-51 (FERM BP-6691) that produce anti-GD3 human chimeric antibodies and transformed cells KM2760 (FERM) that produce anti-CCR4 chimeric antibodies.
  • BP-7054 transformed cells KM8759 (FERM BP-8129) and KM8760 (FERM BP-8130), 709LCA-500D (FERM BP-8239), anti-IL-5 receptor ⁇ chain producing anti-CCR4 humanized antibody Transformed cells producing chimeric antibodies KM7399 (FERM BP-5649), transformed cells producing anti-IL-5 receptor ⁇ chain human CDR-grafted antibodies KM8399 (FERM BP-5648) and KM9399 (FERM BP-5647) Anti-GM2 human CDR-grafted antibody Transformed cells to be produced KM8966 (FERM BP-5105), KM8967 (FERM BP-5106), KM8969 (FERM BP-5527), KM8970 (FERM BP-5528), transformed
  • the present invention relates to an aqueous solution prepared by a method for preparing an aqueous solution containing a medium and a chelating agent, wherein the chelating agent is added prior to final pH adjustment of the aqueous solution.
  • the present invention also relates to a method for culturing cells using an aqueous solution prepared by a method for preparing an aqueous solution containing a medium and a chelating agent, wherein the chelating agent is added prior to the final pH adjustment of the aqueous solution. .
  • Examples of the method for culturing cells include batch culture, repeat batch culture, fed-batch culture, and perfusion culture.
  • the method for culturing the cells may be any method suitable for the cells used, but fed-batch culture is preferred.
  • the culture is usually performed under conditions of pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., for example, for 3 to 20 days for fed batch culture and for 3 to 60 days for perfusion culture.
  • antibiotics such as streptomycin or penicillin
  • the method for storing the aqueous solution is not particularly limited as long as the aqueous solution is maintained in a sterile state, and examples thereof include a method using a stainless tank or a disposable bag.
  • the culture method can be used for culturing jars or the like using a very small amount of culture, usually 0.1 mL to 10 mL using a cell culture plate, or a small amount of culture usually 10 to 1000 mL using an Erlenmeyer flask or the like.
  • a large amount of culture that can be used for commercial production of usually 1 to 20000 L using a tank or the like may be used.
  • the present invention also relates to a method for producing a physiologically active substance, comprising culturing cells using an aqueous solution containing a medium and a chelating agent prepared by adding a chelating agent prior to final pH adjustment of the aqueous solution.
  • physiologically active substance produced by the method for producing a physiologically active substance of the present invention is a peptide or protein
  • a direct expression method for producing the peptide or protein in the host cell, or a method for secreting and producing the peptide or protein outside the host cell Molecular Cloning 2nd Edition or the like can be used.
  • Peptide or protein is prepared by the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem. , 264, 17619 (1989)], the method of Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop. , 4, 1288 (1990)], or Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-336963, International Publication No. 94/23021, and the like, can be actively secreted outside the host cell. . That is, a desired peptide or protein can be actively secreted out of the host cell by expressing the signal peptide bound to the N-terminus of the desired peptide or protein using a genetic recombination technique. I can do it.
  • the production amount of a desired peptide or protein can be increased.
  • the desired peptide or protein produced by the method of the present invention can be isolated and purified using, for example, a normal peptide or protein isolation and purification method.
  • the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer or Cells are disrupted with dynomill or the like to obtain a cell-free extract.
  • a normal peptide or protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent ,
  • Anion exchange chromatography using a resin such as diethylaminoethyl-sepharose, DIAION HPA-75 (manufactured by Mitsubishi Kasei), and a cation exchange chromatography using a resin such as S-sepharose FF (manufactured by Pharmacia)
  • Hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography using resins containing protein A or protein G, chromatofocusing, or isoelectric
  • There is a single electrophoresis method such as point electrophoresis. Is by using a combination, it is possible to obtain
  • the peptide or protein can be recovered in the culture supernatant. That is, a culture supernatant is obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a crudely purified sample is obtained from the culture supernatant by using the same isolation and purification method as described above. Alternatively, a purified sample can be obtained.
  • the physiologically active substance may be any substance that can produce cells, preferably animal cells, but is preferably a substance that can produce animal cells belonging to mammals.
  • Such substances include, for example, biocatalytic molecules such as amino acids, peptides, proteins or ribozymes, formation / retention molecules such as keratin, collagen, elastin, resilin or fibroin, pressure ulcer vaccine, polio vaccine, measles vaccine, rubella vaccine, Mumps vaccine, rabies vaccine, varicella vaccine, bovine epidemic fever vaccine, Ibaraki disease vaccine or bovine infectious tracheitis vaccine, or a virus such as adenovirus or baculovirus.
  • the peptide is preferably a eukaryotic cell-derived peptide, more preferably an animal cell-derived peptide, for example, a mammalian cell-derived peptide.
  • the peptide includes a desired peptide and may have any shape as long as it has activity, for example, an artificially modified peptide such as a fusion peptide fused with another peptide. Alternatively, it may be a peptide consisting of a partial fragment.
  • peptides examples include peptides that maintain the activity of the glycoprotein among the partial fragments of the glycoprotein.
  • a peptide that regulates the activity of the enzyme or a peptide that retains the structure of the enzyme is also included.
  • Specific examples of peptides that regulate enzyme activity include peptides that function as glycoprotein agonists or antagonists.
  • the agonist may be any peptide as long as it has an activity to enhance the activity of glycoprotein.
  • somatostatin derivative for example, somatrobin, atrial natriuretic peptide, glucagon, insulin, insulin-like growth factor or Examples include gonadotropins.
  • the antagonist may be any peptide as long as it has an activity of suppressing glycoprotein activity, and specifically includes, for example, pegvisomaton.
  • the protein is preferably a protein derived from a eukaryotic cell, more preferably a protein derived from an animal cell, and examples thereof include a protein derived from a mammalian cell.
  • the protein may be any structure as long as it contains the desired protein and has activity, for example, an artificially modified protein such as a fusion protein fused with another protein. It may be a protein consisting of partial fragments.
  • proteins include glycoproteins and antibodies.
  • glycoproteins include erythropoietin (EPO) [J. Biol. Chem. , 252, 5558 (1977)], thrombopoietin (TPO) [Nature, 369 533 (1994)], tissue type plasminogen activator, prourokinase, thrombomodulin, antithrombin III, protein C, protein S, blood coagulation factor VII, blood clotting factor VIII, blood clotting factor IX, blood clotting factor X, blood clotting factor XI, blood clotting factor XII, prothrombin complex, fibrinogen, albumin, gonadotropin, thyroid stimulating hormone, epidermal growth factor (EGF), Hepatocyte growth factor (HGF), keratinocyte growth factor, activin, osteogenic factor, stem cell factor (SCF), granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) [J.
  • EPO erythropoietin
  • TPO thrombopoietin
  • Macrophage colony-stimulating factor [J. Exp. Med. , 173, 269 (1992)] granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) [J. Biol. Chem. , 252, 1998 (1977)], interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , interleukin-2 (IL-2) [Science, 193, 1007 (1976)], interleukin 6, interleukin 10, interleukin 11, Interleukin-12 (IL-12) [J. Leuc. Biol.
  • the antibody may be any antibody having antigen-binding properties, such as an antibody recognizing a tumor-related antigen or an antibody fragment thereof, an antibody recognizing an antigen associated with allergy or inflammation, or an antibody fragment thereof, and a circulatory organ.
  • An antibody that recognizes an antigen related to a disease or an antibody fragment thereof, an antibody that recognizes an antigen related to an autoimmune disease or an antibody fragment thereof, an antibody that recognizes an antigen related to a virus or bacterial infection, or an antibody fragment thereof It is done.
  • tumor-associated antigens examples include CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD9, CD10, CD13, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD28, CD30, CD32, CD33, CD38, CD40, CD40Ligand (CD40L), CD44, CD45, CD46, CD47, CD52, CD54, CD55, CD56, CD59, CD63, CD64, CD66b, CD69, CD70, CD74, CD80, CD89, CD95, CD98, CD105, CD134, CD137, CD138 , CD147, CD158, CD160, CD162, CD164, CD200, CD227, adrenomedullin, angiopoietin related pro ein 4 (ARP4), aurora, B7-H1, B7-DC, integlin, bone marlow stromal antigen 2 (BST2), CA125, CA19.9, carbonic anhydrase 9 (CA9), cadherincecre
  • G-CSF receptor ganglioside (eg GD2, GD3, GM2 or GM3, etc.), globo H, gp75, gp88, GPR-9-6, heparanase I, hepatocyte growth factor (HGF), HGF, HG -DR etc.), HM1.24, human milk fatglobule (HMFG), hRS7, heat shock protein 90 (hsp90), idiotype epitope factor, insulin-like growth factor (IGF), inter (ILR), ce, etc.
  • ganglioside eg GD2, GD3, GM2 or GM3, etc.
  • globo H gp75, gp88, GPR-9-6
  • heparanase I hepatocyte growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • HG -DR etc. HG -DR etc.
  • HM1.24 human milk fatglobule
  • hRS7 heat shock protein 90
  • IL-6R or IL-15R integrin
  • integrin immunoreceptor translocation associated-4
  • IRTA-4 immunoreceptor translocation associated-4
  • kallikrein 1 KDR
  • KIR2DL1 KIR2DL2 / 3, KS1 / 4
  • lamp-1 laminin -5
  • Lewis y sia ylLewis x
  • lymphotoxin-beta receptor LUNX
  • MCSP melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan
  • MICA mesothelin
  • MICA Mullerian inhibitingsubstance type II receptor
  • MIIR melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan
  • mucin neural cell adhesionmolecule
  • NCAM neural cell adhesionmolecule
  • Necl-5 Notch1
  • Osteopontin platelet-derived growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • PF-4 platelet factor-4
  • TRAIL apoptosis-inducingLigand
  • TRAIL receptor e.g., such as DR4 or DR5
  • ASCT2 system ASC amino acid transporter 2
  • trkC trkC
  • TROP-2 TWEAK receptor Fn14
  • type IV collagenase urokinase receptor
  • VEGF vascular endothelialgrowth factor
  • VEGF receptor for example, VEGFR1, VEGFR2, or VEGFR3
  • vimentin VLA-4, or the like.
  • the antibody may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Examples of the antibody class include immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA), immunoglobulin E (IgE), and immunoglobulin M (IgM), with IgG being preferred.
  • IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 is mentioned as a subclass of IgG.
  • the antibody includes a fragment containing a part of the antibody.
  • Fab Frament of antigen binding
  • Fab ′ fragment of antigen binding
  • F (ab ′) 2 single chain antibody
  • scFv single chain Fv
  • disulfide examples thereof include a stabilized antibody (disulphide stabilized Fv, dsFv), a fusion protein containing the Fc region of the antibody, and the like.
  • an antibody for example, an antibody produced by gene recombination technology, that is, an antibody expression vector into which an antibody gene is inserted, in addition to an antibody secreted by a hybridoma cell produced from a spleen cell of an animal immunized with an antigen And the like, and the like obtained by introducing into a host cell.
  • an antibody for example, an antibody produced by gene recombination technology, that is, an antibody expression vector into which an antibody gene is inserted, in addition to an antibody secreted by a hybridoma cell produced from a spleen cell of an animal immunized with an antigen And the like, and the like obtained by introducing into a host cell.
  • Specific examples include antibodies produced by hybridomas, human-type chimerized antibodies, humanized antibodies or human antibodies.
  • the human chimeric antibody is a non-human animal antibody heavy chain variable region (hereinafter, the heavy chain is also referred to as H chain, and the variable region is also referred to as HV or VH) and an antibody light chain variable region (hereinafter, light chain).
  • LV or VL an L chain
  • CH a heavy chain constant region of a human antibody
  • CL a light chain constant region of a human antibody
  • animals other than humans any animals such as mice, rats, hamsters, rabbits and the like can be used as long as hybridomas can be produced.
  • a human chimeric antibody is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL from a hybridoma producing a monoclonal antibody, and inserting them into expression vectors for host cells having genes encoding human antibody CH and human antibody CL, respectively.
  • Type chimeric antibody expression vectors can be constructed and expressed by introducing them into host cells.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as hIg), but is preferably of the hIgG class, and further subclasses of hIgG1, hIgG2, hIgG3 or hIgG4 belonging to the hIgG class. Any of these can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • a humanized antibody for example, the amino acid sequence of the VH and VL human type homology determining regions (hereinafter referred to as CDRs) of an antibody of a non-human animal is placed at an appropriate position of the VH and VL of the human antibody.
  • CDRs include CDR-grafted antibodies produced by transplantation.
  • the CDR-grafted antibody constructs a cDNA encoding the V region in which the CDR sequences of the VH and VL of the non-human animal antibody are grafted onto the CDR sequences of any human antibody, and the human antibody CH and human antibody
  • a CDR-grafted antibody expression vector is constructed by inserting each into a host cell expression vector having a gene encoding CL, and the CDR-grafted antibody can be expressed and produced by introducing the expression vector into the host cell. .
  • the CH of the CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hIg, but is preferably of the hIgG class, and any subclass such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, or hIgG4 belonging to the hIgG class can be used.
  • the CL of the CDR-grafted antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human antibody is, for example, that human lymphocytes can be cultured by isolating and immortalizing and cloning human peripheral blood lymphocytes, and purifying the antibody from the culture. I can do it.
  • Human antibodies can be prepared from a human antibody phage library.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab or scFv are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, phages expressing antibody fragments having antigen-binding activity can be recovered using the binding activity to the immobilized antigen as an index.
  • the antibody fragment can be converted into a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains.
  • cDNAs encoding VL and VH are obtained from human antibody-producing hybridomas, and one or more amino acid residues of wild type (hereinafter referred to as WT) are appropriately substituted with Cys residues by the above-described method or the like. It can also be produced by inserting it into an expression vector for animal cells having DNA encoding the CL and CH of the human antibody and introducing it into animal cells.
  • a human antibody-producing hybridoma can be obtained from a human antibody-producing transgenic animal by a conventional hybridoma production method performed in mammals other than humans.
  • a human antibody-producing transgenic animal refers to an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, and transplanting the ES cell into an early embryo of the mouse, followed by generation [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 722 (2000)].
  • cDNAs encoding VL and VH are obtained from human antibody-producing hybridomas, and inserted into expression vectors for animal cells having DNAs encoding CL and CH of human antibodies, respectively, and the above-described method as appropriate. It is also possible to construct a human antibody expression vector by substituting one or more amino acid residues of WT with a Cys residue, etc., and introducing the human antibody expression vector into an animal cell for expression.
  • WT CH used for human antibodies may be any as long as it belongs to hIg, but is preferably hIgG class, and any of subclasses such as hIgG1, hIgG2, hIgG3, and hIgG4 belonging to hIgG class can be used.
  • the CL of the human antibody may be any as long as it belongs to hIg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • antibody produced by the method of the present invention include the following antibodies, but are not particularly limited thereto.
  • antibodies that recognize tumor-associated antigens include, for example, anti-GD2 antibody [Anticancer Res. , 13, 331 (1993)], anti-GD3 antibody [Cancer Immunol. Immunother. , 36, 260 (1993)], anti-GM2 antibody [Cancer Res. , 54, 1511 (1994)], anti-HER2 antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992), US5725856], anti-CD52 antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285 (1992)], anti-MAGE antibody [British J. et al. Cancer, 83, 493 (2000)], anti-HM1.24 antibody [Molecular Immunol.
  • anti-parathyroid hormone related protein (PTHrP) antibody [Cancer, 88, 2909 (2000)], anti-bFGF antibody, anti-FGF-8 antibody [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911 (1989)], anti-bFGFR antibody, anti-FGF-8R antibody [J. Biol. Chem. , 265, 16455 (1990)], anti-IGF antibodies [J. Neurosci. Res. , 40, 647 (1995)], anti-IGF-IR antibody [J. Neurosci. Res. , 40, 647 (1995)], anti-PSMA antibody [J. Urology, 160, 2396 (1998)], anti-VEGF antibody [Cancer Res.
  • PTHrP anti-parathyroid hormone related protein
  • anti-VEGFR antibody [Oncogene, 19, 2138 (2000), WO 96/30046], anti-CD20 antibody [Curr. Opin. Oncol. , 10, 548 (1998), US Pat. No. 5,736,137], anti-CD10 antibody, anti-EGFR antibody (WO96 / 402010), anti-Apo-2R antibody (WO98 / 51793), anti ASCT2 antibody (International Publication No. 2010/008075), anti-CEA antibody [Cancer Res. 55 (23 suppl): 5935 s-5945 s, (1995)], anti-CD38 antibody, anti-CD33 antibody, anti-CD22 antibody, anti-EpCAM antibody or anti-A33 antibody.
  • antibodies that recognize antigens associated with allergy or inflammation include, for example, anti-interleukin 6 antibody [Immunol. Rev. , 127, 5 (1992)], anti-interleukin 6 receptor antibody [Molecular Immunol. , 31, 371 (1994)], anti-interleukin-5 antibody [Immunol. Rev. , 127, 5 (1992)], anti-interleukin 5 receptor antibody, anti-interleukin 4 antibody [Cytokine, 3,562 (1991)], anti-interleukin 4 receptor antibody [J. Immunol.
  • antibodies that recognize antigens related to cardiovascular diseases include anti-GPIIb / IIIa antibodies [J. Immunol. , 152, 2968 (1994)], anti-platelet-derived growth factor antibody [Science, 253, 1129 (1991)], anti-platelet-derived growth factor receptor antibody [J. Biol. Chem. 272, 17400 (1997)], anticoagulant factor antibody [Circulation, 101, 1158 (2000)], anti-IgE antibody, anti- ⁇ V ⁇ 3 antibody or ⁇ 4 ⁇ 7 antibody.
  • antibodies that recognize antigens associated with virus or bacterial infection include anti-gp120 antibody [Structure, 8, 385 (2000)], anti-CD4 antibody [J. Rheumatology, 25, 2065 (1998)], anti-CCR5 antibody or anti-verotoxin antibody [J. Clin. Microbiol. , 37, 396 (1999)].
  • the present invention also provides a culture medium characterized by adding a chelating agent prior to the final pH adjustment of the aqueous solution and an aqueous solution prepared by the method for preparing an aqueous solution containing the chelating agent. It relates to the bioactive substance produced.
  • the present invention also relates to a method for membrane filtration of an aqueous solution containing a culture medium and a chelating agent, using the aqueous solution prepared by adding a chelating agent prior to final pH adjustment of the aqueous solution.
  • the method for membrane filtration is not particularly limited as long as it is a method that allows the treatment aqueous solution to pass through the porous membrane by pressure and removes components, particles, contaminants, etc. in the solution, but is not limited thereto.
  • Dialysis, electrodialysis or reverse osmosis is preferred, microfiltration, ultrafiltration or dialysis is more preferred, and microfiltration is particularly preferred.
  • the filtration membrane used for membrane filtration is not particularly limited, but is preferably a microfiltration membrane, ultrafiltration membrane, dialysis membrane, electrodialysis membrane or reverse osmosis membrane, more preferably a microfiltration membrane, ultrafiltration membrane or dialysis membrane.
  • a microfiltration membrane is particularly preferred.
  • the material of the filtration membrane is not particularly limited.
  • polyether sulfone or polyvinylidene fluoride is preferable.
  • filtration membranes using polyethersulfone or derivatives thereof include, for example, Millipore Express (registered trademark) PLUS Membrane Filters (pore size: 0.22 or 0.45 ⁇ m) (Millipore), Millipore Express SHC cartridge filter (Millipore), Millipore Express SHR cartridge filter (Millipore), Super EBV (Pall), Super EKV (Pall, catalog number: AB3EKV7PH4 PH4) Zaltopore 2 (membrane structure: two-layer membrane, pore size: 0.2 + 0.1, 0.45 + 0.2, or 0.
  • a filtration membrane using polyvinylidene fluoride or a derivative thereof specifically, for example, Durapre (registered trademark) Membrane Filters (pore diameter: 0.10, 0.22, 0.45, 0.65, Or 5.0 ⁇ m) (Millipore Inc.), Durapore II Hydrophilic Filter CartridgegV (Millipore Inc.), Durapore II Hydrofiltrate Filter Cartridge VV (registered by Millipore Inc. LP) -DBLP (Pall), Fluorodine II-DJLP (Pall), Ultipore VF-DV20 (Pall) or Ulchi A VF-DV50 (manufactured by Pall Corporation), and the like.
  • Durapre registered trademark
  • Membrane Filters pore diameter: 0.10, 0.22, 0.45, 0.65, Or 5.0 ⁇ m
  • Durapore II Hydrophilic Filter CartridgegV Millipore Inc.
  • Durapore II Hydrofiltrate Filter Cartridge VV registered by Millipore
  • a filtration membrane combining polyethersulfone or a derivative thereof and polyvinylidene fluoride or a derivative thereof, specifically, for example, Fluorodyne (registered trademark) EXgrade EDF Membrane Filter Cartridge (manufactured by Pall, catalog number: AB3UEDF7PH4) Etc.
  • Fluorodyne registered trademark
  • EXgrade EDF Membrane Filter Cartridge manufactured by Pall, catalog number: AB3UEDF7PH4
  • a filtration membrane using a membrane material other than polyether sulfone or polyvinylidene fluoride specifically, for example, Omnipore (registered trademark) Membrane Filters (pore diameter: 0.1, 0.2, 0.45).
  • the pore size of the filtration membrane is not particularly limited, but is preferably 1 nm to 100 ⁇ m, more preferably 5 nm to 10 ⁇ m, still more preferably 10 nm to 1 ⁇ m, and particularly preferably 0.1 ⁇ m to 0.5 ⁇ m.
  • Specific examples of the membrane pore diameter include the pore diameters of the filtration membrane examples described above.
  • a filtration membrane structure consisting of a single sheet, such as a Millex filter unit (manufactured by Millipore, catalog number: SLGV033RS) may be used.
  • 2 ⁇ m Express SHC Disk W / Type (made by Millipore, catalog number: HGEP02550) may be attached to one or more pre-filters to form a structure of two or more layers.
  • Vmax (L / m 2 ) is the maximum throughput per unit membrane area obtained after infinite time from the start of filtration, and can be measured by the method described in BioPharm, 46, September (1995).
  • the present invention also relates to a method for improving the membrane filterability of an aqueous solution, in which a chelating agent is added to an aqueous solution to prepare an aqueous solution containing the chelating agent, and the aqueous solution is subjected to membrane filtration. Furthermore, the present invention also includes a method for improving the membrane filterability of an aqueous solution, in which an aqueous solution containing a chelating agent and a medium is prepared by adding the chelating agent and the medium to the aqueous solution, and the aqueous solution is subjected to membrane filtration.
  • the present invention also provides a medium and an aqueous solution containing the chelating agent by adding a chelating agent to the aqueous solution prior to final pH adjustment of the aqueous solution, and membrane-filtering the aqueous solution, and then using the obtained aqueous solution.
  • the present invention relates to a method for producing a physiologically active substance by culturing cells.
  • Example 1 Filterability improvement effect by chelating agent The influence on the filterability of the aqueous solution when various chelating agents were added during preparation of the aqueous solution containing the powder medium was examined. Vmax (maximum throughput per unit membrane area) It was clarified that the value of improved.
  • the aqueous solution was prepared according to the following procedure. First, in 900 mL of pure water (hereinafter referred to as PW), trisodium citrate dihydrate (manufactured by Kosuge Pharmaceutical Co., Ltd.), L-malic acid (manufactured by Wako, catalog number: 138-07512) as a chelating agent, or Ethylenediaminetetraacetic acid iron (III) sodium salt (hereinafter referred to as EDTA iron (III) sodium salt) (manufactured by Sigma-Aldrich, catalog number: EDFS-100G) was added and stirred. The pH after the chelating agent was completely dissolved was 8.41 for the trisodium citrate dihydrate addition solution, 2.57 for the L-malic acid addition solution, and 5. for the EDTA iron (III) sodium salt addition solution. 11.
  • PW pure water
  • trisodium citrate dihydrate manufactured by Kosuge Pharmaceutical Co., Ltd.
  • L-malic acid manufactured
  • SOY HYDROLYSATE UF SAFC Bioscience, catalog number: 91052-1K3986
  • improved powder medium EX-CELL 302 SAFC manufactured by Bioscience 22.6 g containing 1 amino acid, metal salt, vitamin and the like and 1 mmol / L methorexate dissolved using PBS (manufactured by Invitrogen, catalog number: 14190-250).
  • 0.5 mL of a solution manufactured by Sigma-Aldrich, catalog number: M8407-500MG was added and stirred for about 30 minutes.
  • the concentration of each of the added chelating agents described above after preparation of the aqueous solution was 6.8 mmol / L for trisodium citrate dihydrate, 15 mmol / L for L-malic acid, and 5. for EDTA iron (III) sodium salt. 4 mmol / L.
  • Vmax test of the prepared aqueous solution was performed according to the following procedure.
  • 1 L of the test aqueous solution was placed in a pressurized tank (Millipore).
  • Millex (registered trademark) GV Filter Unit manufactured by Millipore, catalog number: SLGV033RS
  • the filter was connected to a tank and a pressure of 100 kPa was applied with compressed air.
  • the tank valve was slightly opened and the filter was moistened with an aqueous solution. After the filter was wetted, the valve was fully opened to start the test. The time when the valve was fully opened was set to 0, and the elapsed time required to increase the filtration throughput by 5 g was measured. The density of the aqueous solution was set to 1 g / mL, and the amount of filtration (V) was calculated from the measured weight. The measurement was performed for 3 minutes or more. A graph was created with the measured value as time (t) on the horizontal axis and t / V on the vertical axis, and Vmax was calculated from the reciprocal of the slope of the obtained straight line.
  • Vmax (L / m 2 ) was 452 in the aqueous solution to which no chelating agent was added, whereas 1931, L-apple in the aqueous solution to which trisodium citrate dihydrate was added as the chelating agent. It increased to 2483 in the aqueous solution to which the acid was added and 1834 in the aqueous solution to which the EDTA iron (III) sodium salt was added.
  • Vmax value of the aqueous solution is improved by adding a chelating agent during preparation of the aqueous solution.
  • Example 2 Trisodium citrate dihydrate addition time and filterability improvement effect The effect of trisodium citrate dihydrate addition time and filterability on the preparation of an aqueous solution containing a powder medium was examined. It is clear that Vmax (maximum throughput per unit membrane area) is greatly increased by adding trisodium citrate dihydrate at the same time or before the powder medium containing amino acids, metal salts, vitamins, etc. I made it. Furthermore, it has been clarified that Vmax (maximum throughput per unit membrane area) is increased by adding trisodium citrate dihydrate before the final pH adjustment step.
  • the aqueous solution was prepared according to the following procedure except for the addition of trisodium citrate dihydrate.
  • 6.7 g of SOY HYDROLYSATE UF manufactured by SAFC Bioscience, catalog number: 91052-5K3986 was added to 900 mL of pure water (hereinafter referred to as PW) and stirred for about 15 minutes.
  • trisodium citrate dihydrate manufactured by Kominato Pharmaceutical Co., Ltd. was added at the time of conditions A to H below to prepare an aqueous solution.
  • concentration of trisodium citrate dihydrate added as described above after preparation of the aqueous solution is 0.1 g / L (0.34 mmol / L).
  • Condition A No addition Condition B: 10 minutes before the addition of SOY HYDROLYSATE UF Condition C: 1 minute before the addition of SOY HYDROLYSATE UF Condition D: Simultaneous with the addition of SOY HYDROLYSATE UF Condition E: 10 minutes before the addition of improved EX-CELL 302 F: Simultaneous with addition of improved EX-CELL 302 Condition G: 15 minutes before sodium bicarbonate addition Condition H: Immediately after preparation to 1 L with PW
  • the Vmax test of the prepared aqueous solution was performed according to the following procedure.
  • 1 L of the test aqueous solution was placed in a pressurized tank (Millipore).
  • Millex (registered trademark) GV Filter Unit manufactured by Millipore, catalog number: SLGV033RS
  • the filter was connected to a tank and a pressure of 100 kPa was applied with compressed air.
  • the valve of the tank was slightly opened and the filter was moistened with an aqueous solution. After the filter was wetted, the valve was fully opened to start the test.
  • the time when the valve was fully opened was set to 0, and the elapsed time taken to increase the filtration processing amount by 5 g was measured.
  • the density of the aqueous solution was set to 1 g / mL, and the amount of filtration (V) was calculated from the measured weight. The measurement was performed for 3 minutes or more.
  • a graph was created with the measured value as time (t) on the horizontal axis and t / V on the vertical axis, and Vmax was calculated from the reciprocal of the slope of the obtained straight line.
  • Vmax (L / m 2 ) was 1163 in condition A, but 3199 in condition B, 3652 in condition C, 3783 in condition D, 3060 in condition E, and 3581 in condition F.
  • the filterability of the aqueous solution was greatly improved by adding trisodium citrate dihydrate simultaneously with or before the addition of CELL 302.
  • Vmax (L / m 2 ) under condition G is 2502, and the filterability of the aqueous solution can be improved by adding trisodium citrate dihydrate prior to the addition of sodium bicarbonate, which is the pH adjustment step. Improved.
  • condition H in which trisodium citrate dihydrate was added after pH adjustment it was 1441, and the improvement of the filterability of the aqueous solution was the same as or slightly increased as A.
  • Vmax maximum throughput per unit membrane area
  • the Vmax of the aqueous solution increases by adding trisodium citrate dihydrate before the final pH adjustment step. Furthermore, in particular, it was clarified that the Vmax of the aqueous solution is increased by adding trisodium citrate dihydrate to the aqueous solution simultaneously with or before the powder medium containing amino acids, metal salts, vitamins and the like.
  • Example 3 Correlation between trisodium citrate dihydrate addition concentration and improvement of aqueous solution filterability Correlation between concentration of trisodium citrate dihydrate added during aqueous solution preparation and filterability was examined, and concentration dependence In particular, it has been clarified that Vmax (maximum throughput per unit film area) is improved.
  • the aqueous solution was prepared according to the following procedure. First, 0 g (no addition), 0.1 g, or 1.0 g of trisodium citrate dihydrate (manufactured by Kominato Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to 900 mL of pure water (hereinafter referred to as PW) and stirred. After trisodium citrate dihydrate was completely dissolved, 6.7 g of SOY HYDROLYSATE UF (manufactured by SAFC Bioscience, catalog number: 91052-1K3986) was added and stirred for about 15 minutes.
  • PW pure water
  • the concentration of trisodium citrate dihydrate described above after preparation of the aqueous solution is 0 g / L (no addition), 0.1 g / L (0.34 mmol / L), or 1.0 g / L ( 3.4 mmol / L).
  • Vmax test of the prepared aqueous solution was performed according to the following procedure.
  • 1 L of the test aqueous solution was placed in a pressurized tank (Millipore).
  • Millex (registered trademark) GV Filter Unit manufactured by Millipore, catalog number: SLGV033RS
  • the filter was connected to a tank and a pressure of 100 kPa was applied with compressed air.
  • the tank valve was slightly opened and the filter was moistened with an aqueous solution. After the filter was wetted, the valve was fully opened to start the test. The time when the valve was fully opened was set to 0, and the elapsed time required to increase the filtration throughput by 5 g was measured. The density of the aqueous solution was set to 1 g / mL, and the amount of filtration (V) was calculated from the measured weight. The measurement was performed for 3 minutes or more. A graph was created by taking the measured value as time (t) on the horizontal axis and (t / V) on the vertical axis, and Vmax was calculated from the reciprocal of the slope of the obtained straight line.
  • Vmax (L / m 2 ) was 452 in the aqueous solution to which no chelating agent was added, whereas 1706 and 1 in the aqueous solution to which 0.1 g / L of trisodium citrate dihydrate was added.
  • the aqueous solution to which 0.0 g / L trisodium citrate dihydrate was added increased to 2588.
  • Example 4 Membrane material and membrane structure independence of filterability improvement effect by chelating agent
  • the aqueous filterability improvement effect by the chelating agent during preparation of an aqueous solution containing a powder medium was examined using a plurality of filtration membranes.
  • a PES having a pore size of 0.2 ⁇ m in which a polyvinylidene fluoride (hereinafter referred to as PVDF) membrane having a pore size of 0.22 ⁇ m or a polyethersulfone (hereinafter referred to as PES) membrane having a pore size of 0.5 ⁇ m as a prefilter is combined.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • PES polyethersulfone
  • the aqueous solution was prepared according to the following procedure. First, 0 g (no addition) or 0.1 g of trisodium citrate dihydrate (manufactured by Kominato Pharmaceutical) was added to 900 mL of pure water (hereinafter referred to as PW) and stirred. After the trisodium citrate dihydrate was completely dissolved, 6.7 g of SOY HYDROLYSATE UF (manufactured by SAFC Bioscience, catalog number: 91052-1K3986 or 91052-5K3986) was added and stirred for about 15 minutes.
  • PW pure water
  • improved powder medium EX-CELL 302 (SAFC manufactured by Bioscience) 22.6 g containing 1 amino acid, metal salt, vitamin and the like and 1 mmol / L methorexate dissolved using PBS (manufactured by Invitrogen, catalog number: 14190-250). 0.5 mL of a solution (manufactured by Sigma-Aldrich, catalog number: M8407-500MG) was added and stirred for about 30 minutes. Further, 1.6 g of sodium hydrogen carbonate (manufactured by Kanto Chemical Co., catalog number: 37116-00) was added as a final pH adjustment, and the mixture was stirred for about 5 minutes, then PW was added to 1 L, and the mixture was further stirred for about 10 minutes. The concentration of trisodium citrate dihydrate described above after the aqueous solution preparation is 0 g / L (no addition) or 0.1 g / L (0.34 mmol / L).
  • Millex (registered trademark) GV Filter Unit manufactured by Millipore, catalog number: SLGV033RS
  • a PVDF membrane having a pore diameter of 0.22 ⁇ m was used as a test filter
  • Vmax test of the prepared aqueous solution was performed according to the following procedure. It was. 1 L of the test aqueous solution was placed in a pressurized tank (Millipore). The filter was connected to a tank and a pressure of 100 kPa was applied with compressed air.
  • the tank valve was slightly opened and the filter was moistened with an aqueous solution. After the filter was wetted, the valve was fully opened to start the test. The time when the valve was fully opened was set to 0, and the elapsed time required to increase the filtration throughput by 5 g was measured. The density of the aqueous solution was set to 1 g / mL, and the amount of filtration (V) was calculated from the measured weight. The measurement was performed for 3 minutes or more. A graph was created with the measured value as time (t) on the horizontal axis and t / V on the vertical axis, and Vmax was calculated from the reciprocal of the slope of the obtained straight line.
  • a test filter sufficiently wetted with PW was attached to a folder (Millipore), and the folder was connected to a pressurized tank.
  • the valve attached to the folder was opened, and air was fully pushed out from the air vent. After applying a pressure of 120 kPa to the pressurized tank with compressed air, the valve was fully opened to start the test.
  • the time when the valve was fully opened was set to 0, and the elapsed time taken to increase the filtration processing amount by 5 g was measured.
  • the density of the aqueous solution was set to 1 g / mL, and the amount of filtration (V) was calculated from the measured weight. The measurement was performed for 3 minutes or more.
  • a graph was created with the measured value as time (t) on the horizontal axis and t / V on the vertical axis, and Vmax was calculated from the reciprocal of the slope of the obtained straight line.
  • the filterability of the aqueous solution is improved by adding a chelating agent to the aqueous solution before adjusting the final pH of the aqueous solution even when the material of the filtration membrane to be used is PVDF or PES. Furthermore, even if the structure of the filtration membrane used is a single layer or multiple layers combined with a prefilter, the aqueous solution can be filtered by adding a chelating agent before adjusting the final pH of the aqueous solution. It was clarified that sex improved.
  • Example 5 Cultivation of animal cells and production of physiologically active substance using aqueous solution prepared by adding a chelating agent prior to final pH adjustment Trisodium citrate dihydrate prior to final pH adjustment Animal cells were cultured using the prepared aqueous solution. As a result, it was clarified that even in an aqueous solution to which trisodium citrate dihydrate was added, cell growth and titer equivalent to or higher than that of the aqueous solution not added were obtained.
  • an improved powder medium EX-CELL 302 (SAFC manufactured by Bioscience) 22.6 g containing amino acids, metal salts, vitamins and the like and 1 mmol / L dissolved using PBS (manufactured by Invitrogen, catalog number: 14190-250) were used. 0.5 mL of a Methotrexate solution (manufactured by Sigma-Aldrich, catalog number: M8407-500MG) was added and stirred for about 30 minutes.
  • CHO cells expressing a monoclonal antibody were fed batch cultured in a 3 L reactor for 14 days.
  • the seeding density at the initial stage of the culture was about 3.0 ⁇ 10 6 cells / mL, and the temperature of the aqueous solution for culture was controlled to 35 ° C. and the pH to 7.10 during the culture period.
  • the aqueous solution for feed includes amino acids [L-alanine, L-arginine monohydrochloride, L-asparagine monohydrate, L-cystine dihydrochloride, L-glutamic acid, L-histidine monohydrochloride dihydrate, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine monohydrochloride, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine disodium dihydrate, L-valine (Sigma-Aldrich) L-aspartic acid, glycine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), L-alanyl-L-glutamine (manufactured by Kyowa Hakko Bio), and L-methionine (manufactured by Junsei Kagaku)], vitamin [D- Biotin, calcium D-pantothenate, choline chloride,
  • the maximum viable cell density was 5.4 ⁇ 10 6 cells / mL
  • the titer of the monoclonal antibody at the end of the culture was 1.
  • the maximum cell density reached was 5.8 ⁇ 10 6 cells / mL
  • the titer of the monoclonal antibody at the end of the culture was 1.9 g / L.
  • Example 6 Filterability improvement effect by addition of N-acetylneuraminic acid dihydrate
  • N-acetylneuraminic acid dihydrate was added as a chelating agent when preparing an aqueous solution containing a powder medium, the aqueous solution The influence on the filterability was examined, and it was revealed that the Vmax (maximum throughput per unit membrane area) value of the aqueous solution was improved.
  • the aqueous solution was prepared according to the following procedure. First, in 160 mL of pure water (hereinafter abbreviated as PW), 4.0 g of sodium hydroxide (manufactured by Junsei Co., Ltd., catalog number: 39155-0301), L-Tyrosine disodium salt (manufactured by SIGMA, catalog number: T1145-100G) ) 4.5 g, 6.16 g of L-(-)-Cystein Dihydrochlorid (manufactured by Wako Pure Chemicals, catalog number: 034-05322), stirred for about 30 minutes, and then PW was added to make 200 mL of an aqueous solution (hereinafter referred to as the following). (Abbreviated as Cys-Tyr solution).
  • powder medium containing amino acids, metal salts, vitamins, etc. in 800 mL of PW, Effective Feed A (Life Technologies, catalog number: A12870SB), 32.6 g, liquid additive, polyamine solution (Life Technologies, catalog number) : A12872SA) 0.5 mL, powder media containing amino acids, metal salts, vitamins, etc.
  • Effective Feed B (Life Technologies, catalog number: A11498SA) 27.1 g, L-(+)-glutamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Catalog number: 078-00525) 5.0 g, Peptone SE50MAF-UF (manufactured by Wako Pure Chemicals, catalog number: P42474) 30.0 g, D (+)-g 70.0 g of a course (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, catalog number: 041-00595) was added, and 30.9 g of N-acetylneuraminic acid dihydrate (manufactured by Kyowa Hakko Bio) was added as a chelating agent. Stir for about 30 minutes.
  • the pH after stirring was 4.05. Thereafter, 50 mL of Cys-Tyr solution was added and stirred for about 20 minutes. The pH after adding the Cys-Tyr solution was 4.37. Then, as final pH adjustment, 17 mL of 5 mol / l sodium hydroxide solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Catalog No. 196-05375) was added and stirred for about 20 minutes, and then PW was added to 1 L to obtain Solution A. The final pH of solution A was 8.1. The concentration of the above-described added N-acetylneuraminic acid dihydrate after preparation of the aqueous solution is 30.9 g / L (89 mmol / L).
  • Vmax test of the prepared aqueous solution was performed according to the following procedure. 1 L of the test aqueous solution was placed in a pressurized tank (Millipore). As a test filter, Millex (registered trademark) GV Filter Unit (manufactured by Millipore, catalog number: SLGV033RS) having a pore diameter of 0.22 ⁇ m was used.
  • Millex registered trademark
  • GV Filter Unit manufactured by Millipore, catalog number: SLGV033RS
  • the filter was connected to the tank and a pressure of 100 kPa was applied with compressed air. Before starting the test, the valve of the tank was slightly opened and the filter was moistened with an aqueous solution. After the filter was wetted, the valve was fully opened to start the test.
  • the time when the valve was fully opened was set to 0, and the elapsed time taken to increase the filtration processing amount by 5 g was measured.
  • the density of the aqueous solution was set to 1 g / mL, and the amount of filtration (V) was calculated from the measured weight. The measurement was performed for 3 minutes or more.
  • a graph was created with the measured value as time (t) on the horizontal axis and t / V on the vertical axis, and Vmax was calculated from the reciprocal of the slope of the obtained straight line.
  • Vmax (L / m 2 ) was 190 in solution B to which no chelating agent was added, whereas it was 2025 in solution A to which N-acetylneuraminic acid dihydrate was added as a chelating agent. Increased.
  • Vmax of the aqueous solution is improved by adding N-acetylneuraminic acid dihydrate as a chelating agent when preparing an aqueous solution containing a powder medium.
  • an aqueous solution preparation method that realizes a dramatic improvement in filterability.
  • a highly versatile aqueous solution for cell culture that stably performs membrane filtration in a short time was provided.
  • an aqueous solution prepared by the preparation method that achieves dramatic improvement in filterability, a cell culture method using the aqueous solution prepared by the preparation method, a method for producing a physiologically active substance using the culture method, A method for improving the membrane filterability of an aqueous solution, characterized in that a physiologically active substance produced using the production method, a method for membrane filtration of an aqueous solution prepared by the preparation method, and an aqueous solution prepared by adding a chelating agent
  • a method for producing a physiologically active substance by preparing an aqueous solution, filtering the membrane, and culturing cells using the aqueous solution was provided.

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Abstract

　安定的に短時間で膜ろ過を遂行する汎用性の高い膜ろ過性を向上した水溶液の調製方法、該調製方法により調製された水溶液、該調製方法により調製された水溶液を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該水溶液の製造方法を用いて製造される生理活性物質、該水溶液の調製方法により調製された水溶液を膜ろ過する方法、水溶液の膜ろ過性を向上する方法および、水溶液を調製し、膜ろ過し、および該水溶液を用いて細胞を培養し、生理活性物質を製造する方法を提供する。本発明は、キレート剤を添加することを特徴とする水溶液の調製方法に関する。

Description

培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法
　本発明は培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法、該調製方法により調製された水溶液、該調製方法により調製された水溶液を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該製造方法を用いて製造される生理活性物質、該水溶液の調製方法により調製された水溶液を膜ろ過する方法、水溶液の膜ろ過性の向上方法、又は、水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後該水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法に関する。
　生理活性物質、中でも糖蛋白質あるいは抗体は、近年、種々のバイオ医薬品として認可され、さらに多くの候補物質が開発中である（非特許文献１）。この為、細胞を用いた糖蛋白質、抗体等の生理活性物質の生産がますます盛んになることが期待される。
　細胞を用いてこれらの生理活性物質を製造する上で欠かせない細胞培養用水溶液の調製においては、製品、工程の安全のために培地の無菌性を担保する必要がある。これまで細胞培養用水溶液の調製においては、微生物除去を目的とした０．２μｍ膜ろ過工程が広く用いられてきたが、ここ数年マイコプラズマ除去を目的とした０．１μｍ膜ろ過工程の利用が推奨されるようになってきている（非特許文献２）。従って、細胞培養用水溶液の良好な膜透過性は工業化において益々有用になっており、一つの課題である。
　また、バイオ医薬品は低分子医薬と比較して製造コストが高いことが医薬産業における課題である（非特許文献３）。これまでに細胞培養用水溶液の一部成分の補強、新規成分の追加又は高濃度化により生産性向上を達成することでコスト削減を図る取り組みがなされてきているが、その一方で、その水溶液の良好な膜ろ過は難しさを増している。また、市場ニーズを満たすための製造設備の大型化と設備上の制約から、ますます安定的に短時間で膜ろ過を遂行する汎用性の高い細胞培養用水溶液が求められている。
　これまで、ろ過設備の改造、ろ過膜の増設やろ過膜素材の変更、あるいは、細胞培養用水溶液調製時の温度など溶解条件の改善による該水溶液の膜ろ過量又は膜ろ過性向上の取り組みが行われてきた（特許文献１、非特許文献４および非特許文献５）。しかし、膜面積の増加による細胞培養用水溶液の膜ろ過性向上は、コスト、設備上の制約から工業的には適さない。また、溶解条件の改善では細胞培養用水溶液ろ過性の飛躍的向上には到っていない。
　クエン酸、リンゴ酸またはエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤は、細胞培養用水溶液中に含まれる成分の１つとして広く知られている（特許文献２および特許文献３）。またシアル酸もキレート作用を有する物質として知られている（非特許文献６）。しかし、キレート剤による細胞培養用水溶液の膜ろ過性を向上する方法は知られていない。
日本国特表平０７－５０６４９２号公報 日本国特開２００３－２５０５３３号公報 日本国特開２０００－２１７４５５号公報
Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００４年５月、Ｖｏｌ．３，ｐ．３８３ Ｎａｔｕｒｅ，１９８９年６月、Ｖｏｌ．３３９，ｐ．４８７－４８８ Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２００６年１１月、Ｖｏｌ．３３，ｐ．２１２４－２１３１ Ｐａｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、"Ｆｉｌｔｅｒ　Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓａｍｐｌｅｓ（１－１００ｍＬ）ｉｎ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）Ｓｙｒｉｎｇｅ　Ｆｉｌｔｅｒｓ．５．３"、［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成２２年１１月１５日検索］、　インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｌｌ．ｃｏｍ／ｖａｒｉａｎｔｓ／ｐｄｆ／ｐｄｆ／ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＿４９５３３．ｐｄｆ＞ Ｔｈｅ　２３ｒｄ　Ａｎｎｕａｌ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　要旨集，２０１０年９月、ｐ．１２７ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄｅｎｔａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、　１９６７年５月、Ｖｏｌ．４６、Ｎｏ．３、ｐ．５１４－５２１
　そこで、上記の課題に鑑み、本発明はろ過性の飛躍的向上を実現した水溶液の調製方法、該調製方法により調製された水溶液、該調製方法により調製された水溶液を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該製造方法を用いて製造される生理活性物質、該水溶液の調製方法により調製された水溶液を膜ろ過する方法、水溶液の膜ろ過性の向上方法、又は、水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後該水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法を提供する。
　即ち、本発明は、以下のとおりである。
１．培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法であって、該水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加することを特徴とする、培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法。
２．キレート剤がクエン酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸　鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩およびシアル酸、並びにそれらの塩または水和物から選ばれる少なくとも１である、前項１に記載の水溶液の調製方法。
３．培地が粉末培地、液体培地またはスラリー状の培地である、前項１または前項２に記載の調製方法。
４．粉末培地がさらに金属塩、糖類およびビタミンから選ばれる少なくとも１を含む培地である、前項３に記載の調製方法。
５．培地が細胞培養用の培地である、前項１～４のいずれか１に記載の調製方法。
６．培地が動物細胞培養用の培地である、前項５に記載の調製方法。
７．培地がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地である、前項６に記載の調製方法。
８．前項１～７のいずれか１に記載の方法により調製された、水溶液。
９．前項１～７のいずれか１に記載の方法で調製した水溶液を用いる、細胞の培養方法。
１０．細胞が動物細胞である、前項９に記載の細胞の培養方法。
１１．細胞がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞である、前項１０に記載の細胞の培養方法。
１２．前項９～１１のいずれか１に記載の細胞の培養方法を用いる、生理活性物質の製造方法。
１３．生理活性物質がペプチドまたは蛋白質である、前項１２に記載の製造方法。
１４．蛋白質が糖蛋白質または抗体である、前項１３に記載の製造方法。
１５．前項１２～１４のいずれか１に記載の製造方法を用いて製造される、生理活性物質。
１６．培地およびキレート剤を含む水溶液を膜ろ過する方法であって、該水溶液が、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加して調製した水溶液である、膜ろ過する方法。
１７．キレート剤がクエン酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸　鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩およびシアル酸、並びにそれらの塩または水和物から選ばれる少なくとも１である、前項１６に記載の膜ろ過する方法。
１８．培地が粉末培地、液体培地又はスラリー状の培地である、前項１６または前項１７に記載の膜ろ過する方法。
１９．粉末培地がさらに金属塩、糖類およびビタミンから選ばれる少なくとも１を含む粉末である、前項１８に記載の膜ろ過する方法。
２０．培地が細胞培養用の培地である、前項１８または１９に記載の膜ろ過する方法。
２１．培地が動物細胞培養用の培地である、前項２０に記載の膜ろ過する方法。
２２．培地がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地である、前項２１に記載の膜ろ過する方法。
２３．膜ろ過に用いるろ過膜の孔径が１ｎｍから１００μｍである、前項１６～２２のいずれか１に記載の膜ろ過する方法。　
２４．キレート剤を水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
２５．さらに培地を水溶液に添加して培地およびキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、前項２４に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
２６．キレート剤を水溶液の最終ｐＨ調整よりも先に水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製することを特徴とする、前項２４または２５に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
２７．キレート剤を、培地よりも先または同時に水溶液に添加することを特徴とする、前項２４～２６のいずれか１に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
２８．最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加して培地および該キレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後、得られた水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法。
　驚くべきことに本発明者らは、水溶液調製方法において、キレート剤を添加することにより該水溶液の膜ろ過性が大幅に向上することを初めて見出した。また、本発明者らは、水溶液調製方法において、キレート剤の添加濃度に依存して膜ろ過性が向上することを見出した。
　さらに、本発明者らは、水溶液調製方法において、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することにより、該水溶液の膜ろ過性が大幅に向上することを見出した。また、本発明者らは、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することにより調製した水溶液を用いて細胞を培養し、生理活性物質を製造することができることを見出した。
　このような知見に基づいて培地及びキレート剤を含む水溶液の調製方法を提供できることが示された。また、該方法により調製された水溶液、該方法で調製した水溶液を用いた細胞の培養方法、該細胞の培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、及び該生理活性物質の製造方法を用いて製造される生理活性物質を提供できることが示された。
　さらに、該水溶液の調製方法によって調製された水溶液を膜ろ過する方法、およびキレート剤を用いて水溶液を調製することを特徴とする膜ろ過性を向上する方法も提供できることが示された。該調製方法によって調製された水溶液を膜ろ過した後、得られた水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法を提供できることも示された。
図１はキレート剤を添加することにより水溶液のろ過性が向上することを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸は使用したキレート剤を示す。 図２は水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することにより水溶液のろ過性が顕著に向上することを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸はキレート剤を添加した時点を示す。 図３はキレート剤の濃度依存的にろ過性が向上することを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸はキレート剤の濃度（ｇ／Ｌ）を示す。 図４はキレート剤によるろ過性向上効果が膜材質及び膜構造に依存しないことを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸はろ過膜の材質を示す。 図５はキレート剤としてシアル酸を添加することにより水溶液のろ過性が顕著に向上することを示す。縦軸は単位膜面積あたりの最大処理量［Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）］を示す。横軸は溶液の種類を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法であって、該水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加する水溶液の調製方法に関する。
　前記水溶液とは、特に限定されるものではないが、好ましくは細胞等を培養することができる水溶液（細胞培養用水溶液ともいう）が挙げられる。
　培地としては、例えば、粉末培地、液体培地またはスラリー状の培地が挙げられる。これらの培地は市場で入手可能な培地から適宜選択でき、また、２種類以上の培地を混合してもかまわない。さらに文献に記載された公知の培地等も選択できる。
　また、培地としては、例えば、細菌細胞培養用の培地、酵母細胞培養用の培地、植物細胞培養用の培地、または動物細胞培養用の培地等が挙げられる。これらの中でも、動物細胞培養用の培地が好ましい。また、培地としては、特に制限はないが、例えば、拡大培養培地、基本（初発）培地、またはフィード培地等が挙げられる。
　また、培地は、合成培地、半合成培地、または天然培地のいずれでもよい。例えば、基礎培地、血清含有培地、無血清培地、動物由来成分を含まない培地または無蛋白質培地等が挙げられる。これらの中でも、無血清培地、無蛋白質培地または完全合成培地が好ましい。
　細胞培養用の培地としては、動物細胞培養用の培地が好ましく、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地がより好ましい。
　基礎培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］、Ｆ１２培地（ＬＴＩ社製）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，５３，２８８（１９６５）］、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ培地）［Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４７，９２３（１９７８）］、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３２５培地、（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）、若しくはＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭＩＩ培地（インビトロジェン社製）など各社の市販培地、またはこれらの改変培地あるいは混合培地等が挙げらる。これらの中でも、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ及びＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）３０２培地、またはハイブリドーマＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）が好ましい。
　血清含有培地としては、例えば、基礎培地に、ウシ若しくはウマ等の哺乳類動物血清、ニワトリ等の鳥類動物血清、ブリ等の魚類動物血清、または上記血清の分画物の内、１種以上の血清若しくは血清分画物を添加したものが挙げられる。
　無血清培地としては、例えば、基礎培地に、血清の代替物である栄養因子または生理活性物質等を添加させたものが挙げられる。
　動物由来成分を含まない培地においては、動物由来成分の代わりに添加される物質を添加してもよい。該物質としては、例えば、遺伝子組換え法で製造された生理活性物質、または加水分解物若しくは動物由来原料を含まない脂質等が挙げられる。
　無蛋白培地とは、例えば、ＡＤＰＦ培地（Ａｎｉｍａｌ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｅｅ　ｍｅｄｉｕｍ、ハイクローン社製）、ＣＤ－Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ培地（インビトロジェン社製）、ＣＤ－ＣＨＯ培地（インビトロジェン社製）、ＩＳ－ＣＤ－ＣＨＯ培地（アーバイン・サイエンティフィック社製）、またはＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）ＣＤ－ＣＨＯ培地（ＳＡＦＣバイオサイエンス社製）等が挙げられる。
　粉末培地の製造方法は特に限定はないが、好ましくは、乾燥成分のディスクミル、ボールミル若しくはピンミル等のような混合プロセスによる製造方法、または事前に作られた水溶液の凍結乾燥による製造方法等が挙げられる。
　粉末培地には、顆粒形態で存在する培地が含まれる。
　顆粒形態で存在する粉末培地の製造方法は特に限定されないが、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）等が挙げられる。また、細粒化した成分に、更に天然糊料、合成糊料、糖類、及び油脂類からなる群から選択される少なくとも１種類の素材を溶解した溶液を噴霧し乾燥させる工程が含まれてもよい。
　前記培地に所望の栄養因子を適宜選択して添加することもできる。さらに、所望の栄養因子を適宜選択した成分で培地を構成してもよい。栄養因子としては、例えば、糖類などの炭素源、またはアミノ酸などの窒素源が挙げられる。具体的には、例えば、アミノ酸、金属、ビタミン、糖類、塩、脂質、核酸、生理活性物質、脂肪酸、有機酸、蛋白質、加水分解物等が挙げられる。また、これらの化合物は、塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩、及び／または、例えば水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
　アミノ酸としては特に限定されないが、例えば、Ｌ－アラニン（Ａｌａ）、Ｌ－アルギニン（Ａｒｇ）、Ｌ－アスパラギン（Ａｓｎ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｌ－システイン（Ｃｙｓ）、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、Ｌ－グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈｉｓ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉｌｅ）、Ｌ－ロイシン（Ｌｅｕ）、Ｌ－リジン（Ｌｙｓ）、Ｌ－メチオニン（Ｍｅｔ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｌ－プロリン（Ｐｒｏ）、Ｌ－セリン（Ｓｅｒ）、Ｌ－スレオニン（Ｔｈｒ）、Ｌ－トリプトファン（Ｔｒｐ）またはＬ－バリン（Ｖａｌ）等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。ペプチドとして添加してもよく、例えば、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミンまたはＬ－アラニル－Ｌ－システインなどが挙げられる。
　生理活性物質としては、例えば、インシュリン、トランスフェリン、血清アルブミンまたは増殖因子を含む血清分画物等が挙げられる。
　脂質としては、例えば、コレステロール、リノール酸またはリノレイン酸等が挙げられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
　金属としては特に限定されないが、例えば、鉄、マンガン、亜鉛、モリブデン、バナジウム、銅、カドミウム、ルビジウム、コバルト、ジルコニウム、ゲルマニウム、ニッケル、スズ、クロムまたはケイ素等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。これらの金属は、例えば、塩酸塩、硫酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩、及び／または、例えば水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
　糖類としては、単糖、オリゴ糖または多糖のいずれでもよく、特に限定されない。さらにデオキシ糖、ウロン酸、アミノ糖または糖アルコール等の糖誘導体も含まれる。例えば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、リボース、アラビノース、リブロース、エリトロース、エリトルロース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、セドヘプツロース、マルトース、ラクトースまたはスクロース等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
　ビタミンとしては特に限定されないが、例えば、ｄ－ビオチン、Ｄ－パントテン酸、コリン、葉酸、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール、リボフラビン、チアミン、シアノコバラミンまたはＤＬ－α－トコフェロール等が挙げられ、１種または２種以上組み合わせて用いられる。また、これらの塩酸塩、ナトリウム塩等の塩及び／または水和物等の溶媒和物を用いてもよい。
　加水分解物としては、例えば、大豆、小麦、米、えんどう豆、綿実、魚若しくは酵母抽出物等の加水分解物、または抽出物等が挙げられる。具体的には、例えば、ＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２－１Ｋ３９８６、または９１０５２－５Ｋ３９８６）が挙げられる。　
　キレート剤としては、キレート剤を添加し調製される水溶液の使用目的に適っていれば、特に限定されない。また、本発明のキレート剤としては、１種類若しくは複数の種類のキレート剤を用いてもよい。
　キレート剤としては、特に水溶性のキレート剤が好ましく、例えば、アミノカルボン酸系、オキシカルボン酸系、低級二塩基性カルボン酸系、多価アルコール、または無機化合物系等が挙げられる。また、本発明のキレート剤は、キレート効果を維持していれば塩等を形成していてもよく、例えば、塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等の塩、及び／または、水和物等の溶媒和物を形成していてもよい。
　アミノカルボン酸系のキレート剤としては、具体的には、例えば、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、Ｎ－ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＮＩＭＤＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸　鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩（ＥＤＴＡ　ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ）、Ｎ－ヒドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、トリメチレンジアミン四酢酸（ＴＭＴＡ）、エチレングリコールジエチルエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四プロピオン酸（ＥＤＴＰ）、グルタミン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸や、アスパラギン酸－Ｎ，Ｎ－二酢酸、グリシン、アラニン、これらの塩及び／または水和物の溶媒和物等が挙げられる。
　オキシカルボン酸系のキレート剤としては、具体的には、例えば、乳酸、グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、マンデル酸、これらの塩及び／または水和物の溶媒和物等が挙げられる。低級二塩基性カルボン酸系のキレート剤としては、例えば、シュウ酸、マロン酸、これらの塩及び／または水和物の溶媒和物等が挙げられる。
　多価アルコールとしては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール若しくはトリエチレングリコール等のグリコール類、または糖アルコール類が挙げられる。具体的には、例えば、グリセリン、エリトリット、アラビット、キシリット、ソルビット、マンニットまたはガラクチット等の他イノシトール等が挙げられる。
　無機化合物系のキレート剤としては、例えば、ピロリン酸、トリリン酸、縮合リン酸、これらの塩及び／または水和物の溶媒和物等が挙げられる。キレート剤として特に好ましいのは、クエン酸３ナトリウム２水和物、Ｌ－リンゴ酸又はエチレンジアミン四酢酸　鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩である。
　さらにキレート剤としては、シアル酸を用いることができる。シアル酸とは、９つの炭素骨格からなるカルボキシル基を持つ２－ケト－３デオキシノン酸を意味し、ノイラミン酸ともいう。
　シアル酸には、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－グライコリルノイラミン酸、Ｏ－アセチルノイラミン酸、またはデアミノノイラミン酸、または、これらの塩、水和物及び／または誘導体等が含まれる。
　またシアル酸には、骨格として５－Ｎ－アセチル、または５－Ｎ－グリコリルノイラミン酸を持つものであって、水酸基の幾つかがＯ－アセチル化されたものを含む。本発明のシアル酸として、特に好ましくは、Ｎ－アセチルノイラミン酸二水和物である。
　キレート剤は公知の化学合成法により製造することが出来る。
　キレート剤は水溶液の調製時に添加し、特に最終ｐＨ調整よりも先に水溶液に添加することが好ましい。本発明の水溶液の調製方法において、キレート剤を水溶液に添加する順番（添加時期）は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先であれば、添加する培地の組成、キレート剤の種類等により適宜選択できる。水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加することにより、調製された水溶液の膜ろ過性を向上することができる。
　本発明の水溶液の調製方法において、キレート剤はいずれの培地と同時にまたはその前後に水溶液に添加することができ、培地よりも先または同時に水溶液に添加することが好ましい。さらに、キレート剤は培地中に先に添加しておくこともできる。キレート剤を培地よりも先または同時に水溶液に添加することにより、調製された水溶液の膜ろ過性を更に向上することができる。
　本発明における最終ｐＨ調整とは、水溶液のｐＨを所定のｐＨに調整する工程のことをいう。最終ｐＨは水溶液の使用目的に応じて調整される。水溶液が細胞培養用水溶液の場合、該ｐＨの値は細胞を培養できるものであればいずれの値であってもよい。ｐＨ調整が不要な場合は、水溶液に含有される物質の水溶液への最終の添加を最終ｐＨ調整とみなす。
　最終ｐＨ調整はいずれの酸またはアルカリを用いて行うことが出来る。具体的には、例えば、炭酸水素ナトリウム、塩酸、水酸化ナトリウム等を用いることができる。
　水溶液に含有される物質の水溶液への最終の添加を最終ｐＨ調整とみなす場合の例としては、培地中にｐＨを調整するＮａ２ＣＯ３または４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、３－（Ｎ－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）などの緩衝剤が既に含有されている場合などがある。
　キレート剤の添加量は特に限定はないが、水溶液調製後、添加した該キレートの該水溶液中の濃度が好ましくは０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、特に好ましくは０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ以上であるような量を添加することが好ましい。
　また、水溶液へのキレート剤の添加量としては、０．００１～１０００ｍｍｏｌ／Ｌ、０．０１～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、０．１～５０ｍｍｏｌ／Ｌ等の範囲で当業者であれば適宜選択できるが、好ましくは０．３４～８９ｍｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．３４～１５ｍｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．３４～６．８ｍｍｏｌ／Ｌであるような量を添加することもできる。調製された水溶液中のキレート剤の濃度は、培地中に鉄等の金属の供給源として加えられている鉄等金属とキレート複合体により、さらに高くてもよい。
　本発明における水溶液の調製時に、加水分解物、金属塩、糖類、ビタミン、アミノ酸、ｐＨ調整剤、有機酸、脂肪酸、ペプチド、生理活性物質、脂質または核酸等をそれぞれ別に、あるいは一部培地に混合して添加することもできる。金属塩、糖類またはビタミンを培地に混合して添加することもできる。
　細胞としては、真核細胞、原核細胞のいずれでもよく、例えば、哺乳類、鳥類、は虫類、両生類、魚類、昆虫類若しくは植物等由来の細胞、細菌、大腸菌若しくは枯草菌等の微生物、細菌、大腸菌若しくは枯草菌等微生物由来の細胞、または、酵母等若しくは酵母等由来の細胞が挙げられる。
　これらの中でも、哺乳類に属する動物細胞が好ましく、ヒト若しくはサル等の霊長類に由来する動物細胞またはマウス、ラット若しくはハムスター等のげっ歯類に由来する動物細胞がより好ましく、チャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞が最も好ましい。
　本発明におけるチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞とは、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ；Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓ）の卵巣組織から樹立された株化細胞であればいかなる細胞も包含される。
　具体的には、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１０８，９４５（１９５８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０，１２７５（１９６８）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５５，５１３（１９６８）、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ，４１，１２９（１９７３）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８，１１５（１９９６）、Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４８，２６０（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６０，１２７５（１９６８）、Ｃｅｌｌ，６，１２１（１９７５）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　Ｉ，ＩＩ，８８３－９００等の文献に記載されているＣＨＯ細胞を挙げることができる。
　また、例えば、ＡＴＣＣ（Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録されているＣＨＯ－Ｋ１株（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－６１）、ＤＵＸＢ１１株（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５株（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１７８１）、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ－（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－９０９６）、市販のＣＨＯ－Ｓ株（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社　Ｃａｔ＃１１６１９）若しくはＣＨＯ／ＤＧ４４［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］またはこれら株を様々な培地に馴化させた亜株なども挙げることができる。
　哺乳類に属する細胞としては、例えば、骨髄腫細胞、卵巣細胞、腎臓細胞、血球細胞、子宮細胞結合組織細胞、乳腺細胞若しくは胚性網膜芽細胞またはこれらの細胞に由来する細胞等が挙げられる。これらの中でも、骨髄腫細胞、骨髄腫細胞に由来する細胞、卵巣細胞、または卵巣細胞に由来する細胞から選ばれる細胞が好ましい。
　例えば、ヒト細胞株であるＨＬ－６０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－２４０）、ＨＴ－１０８０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－１２１）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－２）、２９３（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．８５１２０６０２）、Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ－１４３２）、Ｎａｍａｌｗａ　ＫＪＭ－１［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，１５１（１９８８）］、ＮＭ－Ｆ９（ＤＳＭ　ＡＣＣ２６０５、国際公開第２００５／０１７１３０号）及びＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．９６０２２９４０、米国特許第６８５５５４４号明細書）、サル細胞株であるＶＥＲＯ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－１６５１）及びＣＯＳ－７（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５１）、マウス細胞株であるＣ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６１６）、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１５８１）、ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６５８）、ＮＳ０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１８２７）、ラット細胞株であるＹ３　Ａｇ１．２．３．（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６３１）、ＹＯ（ＥＣＡＣＣ　Ｎｏ．８５１１０５０１）及びＹＢ２／０（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１６６２）、ハムスター細胞株である上記記載のチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞及びＢＨＫ２１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１０）またはイヌ細胞であるＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ－３４）等が挙げられる。
　鳥類に属する細胞としては、例えば、ニワトリ細胞株ＳＬ－２９（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－２９）等が挙げられる。魚類に属する細胞としては、例えば、ゼブラフィッシュ細胞株ＺＦ４（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－２０５０）等が挙げられる。
　昆虫類に属する細胞としては、例えば、蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞株Ｓｆ９（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ－１７１１）等が挙げられる。また、ワクチン製造に使用される初代培養細胞としては、例えば、初代サル腎細胞、初代ウサギ腎細胞、初代ニワトリ胎児細胞、または初代ウズラ胎児細胞等が挙げられる。
　骨髄腫細胞または骨髄腫細胞に由来する細胞としては、例えば、Ｓｐ２／０－Ａｇ１４、ＮＳ０、Ｙ３　Ａｇ１．２．３．、ＹＯまたはＹＢ２／０等が挙げられる。卵巣細胞または卵巣細胞に由来する細胞としては、例えば、上記記載のチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞等が挙げられる。また、腎臓細胞としては、例えば、２９３、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ２１またはＭＤＣＫ等が挙げられる。
　血球細胞としては、例えば、ＨＬ－６０、Ｎａｍａｌｗａ、Ｎａｍａｌｗａ　ＫＪＭ－１またはＮＭ－Ｆ９等が挙げられる。子宮細胞としては、例えば、ＨｅＬａ等が挙げられる。結合組織細胞としては、例えば、ＨＴ－１０８０またはＮＩＨ３Ｔ３等が挙げられる。乳腺細胞としては、例えば、Ｃ１２７１Ｉ等が挙げられる。胚性網膜芽細胞としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６等がそれぞれ挙げられる。
　細胞としては、物質を生産する能力の有無は、特に限定されず、例えば、体細胞へ数種類の遺伝子を導入することにより得られたｉＰＳ細胞、ヒトを含む哺乳動物ドナーから採取した***、卵子細胞、物質を産生する細胞または物質を産生するようになった融合細胞等が挙げられる。
　これらの中でも、物質を産生する細胞、または、物質を産生するようになった融合細胞等が好ましく、物質を産生する動物細胞、または、物質を産生するようになった動物由来の融合細胞等がより好ましい。例えば、所望の物質が抗体である場合には、Ｂ細胞等の抗体産生細胞と骨髄腫細胞との融合細胞であるハイブリドーマ等が挙げられる。また、変異処理を施して物質を産生するようになった動物細胞、または物質の発現量を上昇させるような変異処理を施した動物細胞等も動物細胞に包含される。
　変異処理を施して物質を産生するようになった動物細胞としては、例えば、所望の物質を生産出来るようにする為に、蛋白質の修飾酵素等に変異が導入された細胞等が挙げられる。例えば、所望の物質が糖蛋白質である場合には、糖鎖の構造を変化させるために、種々の糖鎖修飾酵素に変異が導入された細胞等が挙げられる。
　さらに、物質を産生する動物細胞としては、所望の物質が産生出来ればいずれの動物細胞を用いてもよく、例えば、物質の生産に関与する遺伝子を含む組換え体ベクターで形質転換された動物細胞も包含される。該形質転換細胞は、物質の生産に関与するＤＮＡとプロモーターを含む組換え体ベクターとを、上記の哺乳類に属する細胞に導入することによって得ることが出来る。
　物質の生産に関与する遺伝子としては、例えば、ペプチド等の物質をコードするＤＮＡ、物質の生合成に関わる酵素または蛋白質をコードするＤＮＡ等のいずれも用いることができる。
　プロモーターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のイミディエイトアーリー（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターまたはＳＲαプロモーター等が挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサー等をプロモーターと共に用いてもよい。　
　組換え体ベクターは所望のベクターを用いて調製できる。前記組換えベクターを調製するために用いられるベクターとしては、本発明で用いる動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることが出来、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３－２２９７９号公報、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０等が挙げられる。
　宿主細胞への組換え体ベクターの導入方法としては、当該細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが出来、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（日本国特開平２－２２７０７５号公報）またはリポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）］等が挙げられる。
　形質転換細胞としては、具体的には、例えば、抗ＧＤ３ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換細胞７－９－５１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６９１）、抗ＣＣＲ４キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ２７６０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７０５４）、抗ＣＣＲ４ヒト化抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８７５９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－８１２９）及びＫＭ８７６０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－８１３０）、７０９ＬＣＡ－５００Ｄ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－８２３９）、抗ＩＬ－５受容体α鎖キメラ抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ７３９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５６４９）、抗ＩＬ－５受容体α鎖ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８３９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５６４８）及びＫＭ９３９９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５６４７）、抗ＧＭ２ヒト型ＣＤＲ移植抗体を生産する形質転換細胞ＫＭ８９６６（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５１０５）、ＫＭ８９６７（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５１０６）、ＫＭ８９６９（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５５２７）、ＫＭ８９７０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５５２８）、抗ＣＤ２０抗体を生産する形質転換株Ｍｓ７０４－ＣＤ２０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１００９２）及びアンチトロンビンＩＩＩを生産する形質転換細胞Ｍｓ７０５－ｐＫＡＮ－ＡＴＩＩＩ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－８４７２）等が挙げられる。
　本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することを特徴とする、培地とキレート剤を含む水溶液の調製方法により調製された水溶液に関する。
　また、本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することを特徴とする、培地とキレート剤を含む水溶液の調製方法により調製された水溶液を用いた、細胞の培養方法に関する。
　細胞を培養する方法としては、例えば、バッチ培養、リピートバッチ培養、フェドバッチ培養またはパーフュージョン培養等が挙げられる。細胞を培養する方法は、用いる細胞に適した方法であればいずれでもよいが、フェドバッチ培養が好ましい。
　具体的には、例えば、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃等の条件下で、例えば、フェドバッチ培養では３～２０日間、パーフュージョン培養では３～６０日間、培養を行う。また、培養中必要に応じて、ストレプトマイシンまたはペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。なお、溶存酸素濃度制御、ｐＨ制御、温度制御または攪拌等は通常の細胞の培養に用いられる方法を用いることが出来る。
　水溶液の保存方法としては、水溶液が無菌状態を保持する方法であれば特に制限されないが、例えば、ステンレスタンクまたはディスポーサブルバッグ等を用いる方法等が挙げられる。
　培養方法の培養量としては、細胞培養用プレートを用いた通常０．１ｍＬ～１０ｍＬのごく微量な培養量でも、三角フラスコ等を用いた通常１０～１０００ｍＬの少量の培養量でも、ジャー等の培養槽等を用いた通常１～２００００Ｌの商用生産に用いることが出来る大量の培養量でも、いかなる培養量でもよい。
　また、本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加し調製された、培地およびキレート剤を含む水溶液を用いて細胞を培養することを含む、生理活性物質の製造方法に関する。
　本発明の生理活性物質の製造方法で製造される生理活性物質がペプチドまたは蛋白質である場合、宿主細胞内にペプチドまたは蛋白質を生産させる直接発現方法、宿主細胞外にペプチドまたは蛋白質を分泌生産させる方法（モレキュラー・クローニング第２版）等を用いることができる。
　ペプチドまたは蛋白質は、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または日本国特開平５－３３６９６３号公報、国際公報第９４／２３０２１号等に記載の方法を利用することにより、宿主細胞外へ積極的に分泌させることが出来る。即ち、遺伝子組換えの手法を用いて、所望のペプチドまたは蛋白質のＮ末端にシグナルペプチドを結合させた形で発現させることにより、所望のペプチドまたは蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることが出来る。
　また、日本国特開平２－２２７０７５号公報に記載されている、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用することにより、所望のペプチドまたは蛋白質の生産量を上昇させることも出来る。
　本発明の方法により製造される所望のペプチドまたは蛋白質は、例えば、通常のペプチドまたは蛋白質の単離精製法等を用いて単離精製することが出来る。
　所望のペプチドまたは蛋白質が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザーまたはダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
　前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常のペプチドまたは蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－セファロースＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、プロテインＡ若しくはプロテインＧ等を含むレジンを用いたアフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、または等電点電気泳動等の電気泳動法等を、単独あるいは組み合わせて用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることが出来る。
　所望のペプチドまたは蛋白質が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ペプチドまたは蛋白質を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、粗精製標品または精製標品を得ることができる。
　生理活性物質としては、細胞、好ましくは動物細胞が生産出来る物質であればいかなるものでもよいが、哺乳類に属する動物細胞が生産できる物質が好ましい。該物質としては、例えば、アミノ酸、ペプチド、蛋白質若しくはリボザイム等の生体触媒分子、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、レシリン若しくはフィブロイン等の構造の形成／保持分子、痘瘡ワクチン、ポリオワクチン、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、狂犬病ワクチン、水痘ワクチン、ウシ流行熱ワクチン、イバラキ病ワクチン若しくはウシ伝染性気管炎ワクチン等のワクチン、またはアデノウィルス若しくはバキュロウィルス等のウイルス等が挙げられる。
　ペプチドとしては、真核細胞由来のペプチドが好ましく、より好ましくは動物細胞由来のペプチド、例えば、哺乳動物細胞由来のペプチドが挙げられる。また、前記ペプチドとしては、所望のペプチドが含まれており、活性を有していればいかなる形状でもよく、例えば、他のペプチドと融合させた融合ペプチド等の人工的に改変されたペプチドであってもよいし、部分断片からなるペプチドであってもよい。
　ペプチドとしては、例えば、糖蛋白質の部分断片のうち、該糖蛋白質の活性を維持しているペプチド等が挙げられる。また、糖蛋白質が酵素である場合には、酵素の活性を調節するペプチドまたは酵素の構造を保持するペプチド等も包含される。酵素の活性を調節するペプチドとしては、具体的には、例えば、糖蛋白質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するペプチド等が挙げられる。
　アゴニストとしては、糖蛋白質の活性を亢進する活性を有するペプチドであればいかなるものでもよく、具体的には、例えば、ソマトスタチン誘導体、ソマトロビン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、グルカゴン、インスリン、インスリン様成長因子または性腺刺激ホルモン等が挙げられる。
　アンタゴニストとしては、糖蛋白質の活性を抑制する活性を有するペプチドであればいかなるものでもよく、具体的には、例えば、ペグビソマトン等が挙げられる。
　蛋白質としては、真核細胞由来の蛋白質が好ましく、動物細胞由来の蛋白質がより好ましく、例えば、哺乳動物細胞由来の蛋白質が挙げられる。また、蛋白質は、所望の蛋白質が含まれており、活性を有していればいかなる構造でもよく、例えば、他の蛋白質と融合させた融合蛋白質等の人工的に改変された蛋白質であってもよいし、部分断片からなる蛋白質であってもよい。
　蛋白質としては、具体的には、例えば、糖蛋白質または抗体等が挙げられる。
　糖蛋白質とは、具体的には、例えば、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，５５５８（１９７７）］、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）［Ｎａｔｕｒｅ，３６９　５３３（１９９４）］、組織型プラスミノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼ、トロンボモジュリン、アンチトロンビンＩＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、血液凝固因子ＶＩＩ、血液凝固因子ＶＩＩＩ、血液凝固因子ＩＸ、血液凝固因子Ｘ、血液凝固因子ＸＩ、血液凝固因子ＸＩＩ、プロトロンビン複合体、フィブリノゲン、アルブミン、性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子、アクチビン、骨形成因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）、顆粒球コロニ－刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，９０１７（１９８３）］マクロファ－ジコロニ－刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，２６９（１９９２）］、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，１９９８（１９７７）］、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９３，１００７（１９７６）］、インターロイキン６、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）［Ｊ．Ｌｅｕｃ．Ｂｉｏｌ．，５５，２８０（１９９４）］、可溶性インターロイキン４受容体、腫瘍壊死因子α、ＤＮａｓｅＩ、ガラクトシダーゼ、αグルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘモグロビン若しくはトランスフェリン、またはこれらの誘導体、及びこれらの糖蛋白質の部分断片等が挙げられる。
　抗体としては、抗原結合性を有する抗体であればいかなるものでもよく、例えば、腫瘍関連抗原を認識する抗体またはその抗体断片、アレルギー若しくは炎症に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片、あるいはウイルス若しくは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体またはその抗体断片等が挙げられる。
　腫瘍関連抗原としては、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌｉｇａｎｄ（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８９、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５８、ＣＤ１６０、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ２００、ＣＤ２２７、ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４（ＡＲＰ４）、ａｕｒｏｒａ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－ＤＣ、ｉｎｔｅｇｌｉｎ、ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　ｓｔｒｏｍａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　２（ＢＳＴ２）、ＣＡ１２５、ＣＡ１９．９、ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　９（ＣＡ９）、ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｃｃ－ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＣＲ）４、ＣＣＲ７、ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１（ＣＦＲ－１）、ｃ－Ｍｅｔ、ｃ－Ｍｙｃ、ｃｏｌｌａｇｅｎ、ＣＴＡ、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　ｔｉｓｓｕｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＣＴＧＦ）、ＣＴＬＡ－４、ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ－１８、ＤＦ３、Ｅ－ｃａｔｈｅｒｉｎ、ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｅｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＦＲ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲ３（ＨＥＲ３）、ＥＧＦＲ４（ＨＥＲ４）、ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥｐＣＡＭ）、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＰＣＲ）、ｅｐｈｒｉｎ、ｅｐｈｒｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｅｐｈ）、ＥｐｈＡ２、ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ－２（ＥＴ２）、ＦＡＭ３Ｄ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）、Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｈｏｍｏｌｏｇ１（ＦｃＲＨ１）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ８（ＦＧＦ８）、ＦＧＦ８　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、ｂＦＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＦＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＧＦＲ）３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ｆｏｌａｔｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　１０（ＦＺＤ１０）、ｆｒｉｚｚｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　４（ＦＺＤ－４）、Ｇ２５０、Ｇ－ＣＳＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（例えば、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２またはＧＭ３等）、ｇｌｏｂｏ　Ｈ、ｇｐ７５、ｇｐ８８、ＧＰＲ－９－６、ｈｅｐａｒａｎａｓｅ　Ｉ、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ＨＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＨＬＡ　ａｎｔｉｇｅｎ（例えば、ＨＬＡ－ＤＲ等）、ＨＭ１．２４、ｈｕｍａｎ　ｍｉｌｋ　ｆａｔｇｌｏｂｕｌｅ（ＨＭＦＧ）、ｈＲＳ７、ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　９０（ｈｓｐ９０）、ｉｄｉｏｔｙｐｅ　ｅｐｉｔｏｐｅ、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ＩＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦＲ）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（例えば、ＩＬ－６またはＩＬ－１５等）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＩＬ－６ＲまたはＩＬ－１５Ｒ等）、ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ－４（ＩＲＴＡ－４）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ　１、ＫＤＲ、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／３、ＫＳ１／４、ｌａｍｐ－１、ｌａｍｐ－２、ｌａｍｉｎｉｎ－５、Ｌｅｗｉｓ　ｙ、ｓｉａｌｙｌＬｅｗｉｓ　ｘ、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－ｂｅｔａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＴＢＲ）、ＬＵＮＸ、ｍｅｌａｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　ｓｕｌｆａｔｅ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ（ＭＣＳＰ）、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＩＣＡ、Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｓｕｂｓｔａｎｃｅ　ｔｙｐｅ　ＩＩ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＭＩＳＩＩＲ）、ｍｕｃｉｎ、ｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＮＣＡＭ）、Ｎｅｃｌ－５、Ｎｏｔｃｈ１、ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｐｌａｔｅｌｅｔ　ｆａｃｔｏｒ－４（ＰＦ－４）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）、ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）、Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ　ｈｏｒｍｏｎｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｐｅｐｔｉｄｅ（ＰＴＨｒＰ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－ｋａｐｐａＢＬｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆｏｒ　ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ（ＲＨＡＭＭ）、ＲＯＢＯ１、ＳＡＲＴ３、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ　４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）、ｓｅｃｒｅｔｏｒｙＬｅｕｋｏｃｙｔｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＳＬＰＩ）、ＳＭ５－１、ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ－７２（ＴＡＧ－７２）、ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）、ＴＧＦ－ｂｅｔａ、Ｔｈｙ－１、Ｔｉｅ－１、Ｔｉｅ２　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｔ　ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ｍｕｃｉｎ　ｄｏｍａｉｎ　１（ＴＩＭ－１）、ｈｕｍａｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ（ｈＴＦ）、Ｔｎ　ａｎｔｉｇｅｎ、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）、Ｔｈｏｍｓｅｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＴＦ　ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＮＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｔｕｍｏｒ　ｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇＬｉｇａｎｄ（ＴＲＡＩＬ）、ＴＲＡＩＬ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＤＲ４またはＤＲ５等）、ｓｙｓｔｅｍ　ＡＳＣ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　２（ＡＳＣＴ２）、ｔｒｋＣ、ＴＲＯＰ－２、ＴＷＥＡＫ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｆｎ１４、ｔｙｐｅ　ＩＶ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ、ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ３等）またはｖｉｍｅｎｔｉｎ、ＶＬＡ－４等が挙げられる。
　抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。抗体のクラスとしては、例えば、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、イムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）、及びイムノグロブリンＭ（ＩｇＭ）が挙げられるが、好ましくはＩｇＧである。更にＩｇＧのサブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４が挙げられる。
　また、抗体には、抗体の一部分を含む断片等が包含され、例えば、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ、ｓｃＦｖ）及びジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　Ｆｖ、ｄｓＦｖ）、または抗体のＦｃ領域を含む融合蛋白質等が挙げられる。
　抗体としては、例えば、動物に抗原を免疫し、免疫動物の脾臓細胞より作製したハイブリドーマ細胞が分泌する抗体の他、遺伝子組換え技術により作製された抗体、即ち、抗体遺伝子を挿入した抗体発現ベクターを、宿主細胞へ導入することにより取得された抗体等が挙げられる。具体的には、ハイブリドーマが生産する抗体、ヒト型キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体等が挙げられる。
　ヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域（以下、重鎖はＨ鎖として、可変領域はＶ領域としてＨＶまたはＶＨとも称す）及び抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬとも称す）と、ヒト抗体の重鎖定常領域（以下、定常領域はＣ領域としてＣＨとも称す）及びヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることが出来る。
　ヒト型キメラ抗体は、モノクロ－ナル抗体を生産するハイブリドーマよりＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することが出来る。
　ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと称す）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
　ヒト化抗体としては、例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのヒト型相同性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと称す）のアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬの適切な位置に移植して作製されたＣＤＲ移植抗体等が挙げられる。
　ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列を任意のヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲ配列に移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨ及びヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することが出来る。
　ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３またはｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
　ヒト抗体とは、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルス等を感染させ不死化、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物より該抗体を精製することが出来る。
　ヒト抗体はヒト抗体ファージライブラリーから調製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーとは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂまたはｓｃＦｖ等の抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、固相化した抗原に対する結合活性を指標にして、抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することが出来る。該抗体断片より、２本の完全なＨ鎖及び二本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へ変換することが出来る。
　ヒト抗体は、ヒト抗体産生ハイブリドーマより、ＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、適宜上述の方法等により野生型（以下、ＷＴと記載する）の１以上のアミノ酸残基をＣｙｓ残基に置換させたヒト抗体のＣＬ及びＣＨをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し、動物細胞へ導入することにより発現させて製造することも出来る。
　ヒト抗体産生ハイブリドーマは、ヒト抗体産生トランスジェニック動物から、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法により取得出来る。ヒト抗体産生トランスジェニック動物とは、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することが出来る［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，７２２（２０００）］。
　あるいは、ヒト抗体は、ヒト抗体産生ハイブリドーマより、ＶＬ及びＶＨをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＬ及びＣＨをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入し、さらに適宜上述の方法等によりＷＴの１以上のアミノ酸残基をＣｙｓ残基に置換してヒト抗体発現ベクターを構築し、該ヒト抗体発現ベクターを動物細胞へ導入し、発現させて製造することも出来る。
　ヒト抗体に用いるＷＴのＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好ましく、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることが出来る。また、ヒト抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスまたはλクラスのものを用いることが出来る。
　本発明の方法により製造される抗体としては、具体的には以下の抗体が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＤ２抗体［Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，１３，３３１（１９９３）］、抗ＧＤ３抗体［Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，２６０（１９９３）］、抗ＧＭ２抗体［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５４，１５１１（１９９４）］、抗ＨＥＲ２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）、ＵＳ５７２５８５６］、抗ＣＤ５２抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，４２８５（１９９２）］、抗ＭＡＧＥ抗体［Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３，４９３（２０００）］、抗ＨＭ１．２４抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６，３８７（１９９９）］、抗副甲状腺ホルモン関連蛋白（ＰＴＨｒＰ）抗体［Ｃａｎｃｅｒ，８８，２９０９（２０００）］、抗ｂＦＧＦ抗体、抗ＦＧＦ－８抗体［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，９９１１（１９８９）］、抗ｂＦＧＦＲ抗体、抗ＦＧＦ－８Ｒ抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１６４５５（１９９０）］、抗ＩＧＦ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＩＧＦ－ＩＲ抗体［Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，４０，６４７（１９９５）］、抗ＰＳＭＡ抗体［Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６０，２３９６（１９９８）］、抗ＶＥＧＦ抗体［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５７，４５９３（１９９７）］、抗ＶＥＧＦＲ抗体［Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９，２１３８（２０００）、国際公開第９６／３００４６号］、抗ＣＤ２０抗体［Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１０，５４８（１９９８）、米国特許第５７３６１３７号明細書］、抗ＣＤ１０抗体、抗ＥＧＦＲ抗体（国際公開第９６／４０２０１０号）、抗Ａｐｏ－２Ｒ抗体（国際公開第９８／５１７９３号）、抗ＡＳＣＴ２抗体（国際公開第２０１０／００８０７５号）、抗ＣＥＡ抗体［Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５５（２３　ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ－５９４５ｓ，（１９９５）］、抗ＣＤ３８抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＥｐＣＡＭ抗体または抗Ａ３３抗体等が挙げられる。
　アレルギーまたは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗インターロイキン６抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン６受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３１，３７１（１９９４）］、抗インターロイキン５抗体［Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，１２７，５（１９９２）］、抗インターロイキン５受容体抗体、抗インターロイキン４抗体［Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，３，５６２（１９９１）］、抗インターロイキン４受容体抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１７，４１（１９９８）］、抗腫瘍壊死因子抗体［Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１３，１８３（１９９４）］、抗腫瘍壊死因子受容体抗体［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５８，２３７（２０００）］、抗ＣＣＲ４抗体［Ｎａｔｕｒｅ，４００，７７６，（１９９９）］、抗ケモカイン抗体（Ｐｅｒｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１７４，２４９，１９９４）または抗ケモカイン受容体抗体［Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６，１３７３（１９９７）］等が挙げられる。
　循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２，２９６８（１９９４）］、抗血小板由来増殖因子抗体［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，１１２９（１９９１）］、抗血小板由来増殖因子受容体抗体［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１７４００（１９９７）］、抗血液凝固因子抗体［Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０１，１１５８（２０００）］、抗ＩｇＥ抗体、抗αＶβ３抗体またはα４β７抗体等が挙げられる。
　ウイルスまたは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、例えば、抗ｇｐ１２０抗体［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８，３８５（２０００）］、抗ＣＤ４抗体［Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，２５，２０６５（１９９８）］、抗ＣＣＲ５抗体または抗ベロ毒素抗体［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３７，３９６（１９９９）］等が挙げられる。
　また、本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加することを特徴とする培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法により調製された水溶液を用いて細胞の培養をすることにより製造された、生理活性物質に関する。
　また、本発明は、培地およびキレート剤を含む水溶液を膜ろ過する方法であって、該水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加して調製した水溶液を用いる該膜ろ過する方法に関する。
　膜ろ過する方法としては、処理水溶液を圧力により多孔質膜を透過させ、溶液中の成分、粒子、夾雑物等を除去する方法であれば、特に限定されないが、精密ろ過法、限外ろ過法、透析法、電気透析法または逆浸透法が好ましく、精密ろ過法、限外ろ過法または透析法がより好ましく、精密ろ過法が特に好ましい。
　膜ろ過に用いるろ過膜としては、特に限定されないが、精密ろ過膜、限外ろ過膜、透析膜、電気透析膜または逆浸透膜が好ましく、精密ろ過膜、限外ろ過膜または透析膜がより好ましく、精密ろ過膜が特に好ましい。
　ろ過膜の材質としては、特に限定されないが、例えば、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニル－ポリアクリロニトリル共重合体、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン（ＰＥＳ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、セラミックス、ポリビニルアルコール、ポリビニルデンジフルオライド、セルロースの酢酸－硝酸混合エステル、ポリテトラフルオロエチレン、アルミナ、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体若しくはテフロン（登録商標）等、またはそれらの誘導体等が挙げられる。これらの中でも、ポリエーテルスルフォンまたはポリフッ化ビニリデン等が好ましい。
　ポリエーテルスルフォンまたは、その誘導体を用いたろ過膜としては、具体的には、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）ＰＬＵＳ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．２２、または０．４５μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ＳＨＣ　カートリッジ　フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ＳＨＲ　カートリッジ　フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、スーポア　ＥＢＶ（Ｐａｌｌ社製）、スーポア　ＥＫＶ（Ｐａｌｌ社製、カタログ番号：ＡＢ３ＥＫＶ７ＰＨ４）、スーポアライフ２００（Ｐａｌｌ社製）、ザルトポア（登録商標）２（膜構造：２層膜、孔径：０．２＋０．１、０．４５＋０．２、または０．８＋０．４５μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ｓｔｅｄｉｍ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア（登録商標）２　ＸＬＧ（膜構造：２層膜、孔径：０．８＋０．２μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ｓｔｅｄｉｍ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア（登録商標）２　ＸＬＩ（膜構造：２層膜、孔径：０．３５＋０．２μｍ）（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ｓｔｅｄｉｍ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、ザルトポア２　ハイフロー（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ｓｔｅｄｉｍ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）またはＰＥＳメンブレンカートリッジフィルター　ＴＣＳ（孔径：０．２０、または０．４５μｍ）（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）等が挙げられる。
　または、ポリフッ化ビニリデンまたは、その誘導体を用いたろ過膜としては、具体的には、例えば、Ｄｕｒａｐｒｅ（登録商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．１０、０．２２、０．４５、０．６５、または５．０μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｄｕｒａｐｏｒｅ　ＩＩ　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｆｉｌｔｅｒ　ＣａｒｔｒｉｄｇｅｇＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｄｕｒａｐｏｒｅ　ＩＩ　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ　ＶＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、フロロダイン（登録商標）ＩＩ－ＤＦＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、フロロダインＩＩ－ＤＢＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、フロロダインＩＩ－ＤＪＬＰ（Ｐａｌｌ社製）、ウルチポアＶＦ－ＤＶ２０（Ｐａｌｌ社製）またはウルチポアＶＦ－ＤＶ５０（Ｐａｌｌ社製）等が挙げられる。
　また、ポリエーテルスルフォンまたはその誘導体とポリフッ化ビニリデンまたはその誘導体を組み合わせたろ過膜としては、具体的には、例えば、Ｆｌｕｏｒｏｄｙｎｅ（登録商標）ＥＸｇｒａｄｅ　ＥＤＦ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｐａｌｌ社製、カタログ番号：ＡＢ３ＵＥＤＦ７ＰＨ４）等が挙げられる。
　また、ポリエーテルスルフォンまたは、ポリフッ化ビニリデン以外の膜材質を用いたろ過膜としては、具体的には、例えば、Ｏｍｎｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．１、０．２、０．４５、１．０、５．０、または１０μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ＭＦ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．０２５、０．０５、０．１、０．２２、０．３、０．４５、０．６５、０．８、１．２、３、５、または８μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、Ｎｙｌｏｎ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｆｉｌｔｅｒｓ（孔径：０．２０、または５．０μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）、ウルチポアＮ６６（孔径：０．２、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、ポジダイン（登録商標）（孔径：０．１０、０．２０、０．３、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファイン　ＶＦＳＰ（孔径：０．２、または０．４５μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファイン　ＶＦＳＥ（孔径：０．０２、０．１、または０．２μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、バラファイン　ＶＦＳＧ（孔径：０．０２、０．１、または０．２μｍ）（Ｐａｌｌ社製）、ザルトロン（ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　ｓｔｅｄｉｍ　ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、アセテートメンブレンカートリッジフィルター　ＴＣＲ（孔径：０．２０、０．４５、または８．０μｍ）（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）、ユミクロンカートリッジフィルター（孔径：０．２、０．４、０．６、０．９、または２．５μｍ）（ユアサメンブレンシステム社製）等が挙げられる。
　ろ過膜の孔径としては、特に限定されないが、１ｎｍから１００μｍが好ましく、５ｎｍから１０μｍがより好ましく、より好ましくは１０ｎｍから１μｍが更に好ましく、０．１μｍから０．５μｍが特に好ましい。膜孔径の具体例としては、上記に記載したろ過膜具体例の孔径が挙げられる。
　ろ過膜の構造としては、例えば、マイレクス（Ｍｉｌｌｅｘ）フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）の様に、一枚からなるろ過膜構造を取ってもよく、また、０．５／０．２　μｍ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ＳＨＣ　Ｄｉｓｋ　Ｗ／Ｔｙｐａｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＨＧＥＰ０２５５０）の様に１枚以上のプレフィルターが付属されることにより、２層以上の構造となっていてもよい。
　水溶液のろ過性評価方法としては、特に限定されないが、例えば、Ｖｍａｘ試験等が挙げられる。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）とは、ろ過開始から無限時間後に得られる単位膜面積あたりの最大処理量であり、ＢｉｏＰｈａｒｍ，４６，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ（１９９５）記載の方法により測定することが出来る。
　また、本発明は、キレート剤を水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、水溶液の膜ろ過性を向上する方法に関する。さらに本発明はキレート剤および培地を水溶液に添加してキレート剤および培地を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、水溶液の膜ろ過性を向上する方法も含む。
　また、本発明は、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加することによって培地および該キレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後、得られた水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法に関する。
　以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示に過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
［実施例１］キレート剤によるろ過性向上効果
　粉末培地を含む水溶液調製時に各種キレート剤を添加したときの該水溶液のろ過性への影響を検討し、Ｖｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）の値が向上することを明らかにした。
　水溶液の調製は以下の手順により行った。まず９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、キレート剤としてクエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）、Ｌ－リンゴ酸（Ｗａｋｏ社製、カタログ番号：１３８－０７５１２）、またはエチレンジアミン四酢酸　鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩（以下、ＥＤＴＡ　ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔと称す）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：ＥＤＦＳ－１００Ｇ）をそれぞれ２．０ｇ添加し攪拌した。キレート剤が完全に溶解した後のｐＨは、クエン酸３ナトリウム２水和物添加液で８．４１、Ｌ－リンゴ酸添加液で２．５７、ＥＤＴＡ　ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ添加液で５．１１であった。
　次に、６．７ｇのＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２－１Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。さらにアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良粉末培地ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０－２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７－５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。
　さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６－００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、さらに約１０分間攪拌した。
　水溶液調製後の上記記載の添加した各キレート剤の濃度は、クエン酸３ナトリウム２水和物が６．８ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ－リンゴ酸が１５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＥＤＴＡ　ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔが５．４ｍｍｏｌ／Ｌとなる。
　次に、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。試験用フィルターには、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いた。フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。
　試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。
　結果を図１に示す。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、キレート剤を添加しなかった水溶液では４５２であったのに対し、キレート剤として、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液では１９３１、Ｌ－リンゴ酸を添加した水溶液では２４８３、ＥＤＴＡ　ｉｒｏｎ（ＩＩＩ）ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔを添加した水溶液では１８３４と増大した。
　以上から、水溶液の調製時にキレート剤を添加することで水溶液のＶｍａｘの値が向上することを明らかにした。
［実施例２］クエン酸３ナトリウム２水和物の添加時期とろ過性向上効果
　粉末培地を含む水溶液調製時における、クエン酸３ナトリウム２水和物の添加時期とろ過性への影響を検討し、クエン酸３ナトリウム２水和物をアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地と同時または前に添加することにより、Ｖｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）が大幅に増加することを明らかにした。さらに、クエン酸３ナトリウム２水和物を最終ｐＨ調整工程より前に添加することにより、Ｖｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）が増加することを明らかにした。
　水溶液の調製は、クエン酸３ナトリウム２水和物の添加を除き、以下の手順により行った。まず９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、６．７ｇのＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２－５Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。
　さらにアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０－２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７－５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。
　さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６－００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、さらに約１０分間攪拌した。
　上記の水溶液調製手順のうち以下条件Ａ～Ｈの時点でクエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）を添加し、水溶液を調製した。上記記載の添加したクエン酸３ナトリウム２水和物の水溶液調製後の濃度は０．１ｇ／Ｌ（０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。
　条件Ａ：添加なし
　条件Ｂ：ＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ添加の１０分前
　条件Ｃ：ＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ添加の１分前
　条件Ｄ：ＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ添加と同時
　条件Ｅ：改良ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２添加の１０分前
　条件Ｆ：改良ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２添加と同時
　条件Ｇ：炭酸水素ナトリウム添加の１５分前
　条件Ｈ：ＰＷで１Ｌに調製した直後
　次に、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。試験用フィルターには、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いた。フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。
　バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。
　結果を図２に示す。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、条件Ａでは１１６３であったのに対し、条件Ｂでは３１９９、条件Ｃでは３６５２、条件Ｄでは３７８３、条件Ｅでは３０６０、条件Ｆでは３５８１となり、改良ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２添加と同時または前にクエン酸３ナトリウム２水和物を添加することにより水溶液のろ過性が大幅に向上した。
　さらに、条件ＧでのＶｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は２５０２となり、ｐＨ調整工程である炭酸水素ナトリウムの添加前に、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加することにより水溶液のろ過性が向上した。一方、ｐＨ調整後にクエン酸３ナトリウム２水和物を添加する条件Ｈでは１４４１となり、水溶液のろ過性の向上はＡと同等あるいは微増に留まった。
　以上から、クエン酸３ナトリウム２水和物を最終ｐＨ調整工程より前に添加することにより、水溶液のＶｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）が増加することを明らかにした。さらに、特に、クエン酸３ナトリウム２水和物をアミノ酸、金属塩またはビタミン等を含む粉末培地と同時または前に水溶液に添加することにより、水溶液のＶｍａｘが増加することを明らかにした。
［実施例３］クエン酸３ナトリウム２水和物添加濃度と水溶液ろ過性の向上の相関
　水溶液調製時に添加するクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度とろ過性への相関を検討し、濃度依存的にＶｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）が向上することを明らかにした。
　水溶液の調製は以下の手順により行った。まず９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、クエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）を０ｇ（添加なし）、０．１ｇまたは１．０ｇ添加し攪拌した。クエン酸３ナトリウム２水和物が完全に溶解した後、６．７ｇのＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２－１Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。
　さらに、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０－２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７－５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。
　さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６－００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、さらに約１０分間攪拌した。水溶液調製後の上記記載の添加したクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度は、０ｇ／Ｌ（添加せず）、０．１ｇ／Ｌ（０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ）、または１．０ｇ／Ｌ（３．４ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。
　次に、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。試験用フィルターには、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いた。フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。
　試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸に（ｔ／Ｖ）をとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。
　結果を図３に示す。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、キレート剤を添加しなかった水溶液は４５２であったのに対し、０．１ｇ／Ｌのクエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液は１７０６、１．０ｇ／Ｌのクエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液は２５８８と増大した。
　以上から、水溶液の最終ｐＨ調整前にキレート剤としてクエン酸３ナトリウム２水和物を添加することでクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度依存的に水溶液のＶｍａｘの値が向上することを明らかにした。
［実施例４］キレート剤によるろ過性向上効果の膜材質・膜構造非依存性
　粉末培地を含む水溶液調製時におけるキレート剤による水溶液ろ過性向上効果を、複数のろ過膜を用いて検討した。その結果、孔径０．２２μｍのポリフッ化ビニリデン（以下、ＰＶＤＦと称す）膜、または、プレフィルターとして孔径０．５μｍのポリエーテルスルフォン（以下、ＰＥＳと称す）膜を組み合わせた孔径０．２μｍのＰＥＳ膜（以下、孔径０．５／０．２μｍのＰＥＳ膜と称す）において、Ｖｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）の値が向上することを明らかにした。
　水溶液の調製は以下の手順により行った。まず９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、クエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）を０ｇ（添加なし）または、０．１ｇ添加し攪拌した。クエン酸３ナトリウム２水和物が完全に溶解した後、６．７ｇのＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２－１Ｋ３９８６、または９１０５２－５Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。
　さらにアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良粉末培地ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０－２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７－５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６－００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、さらに約１０分間攪拌した。水溶液調製後の上記記載の添加したクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度は、０ｇ／Ｌ（添加なし）または、０．１ｇ／Ｌ（０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。
　次に、試験用フィルターとして、孔径０．２２μｍのＰＶＤＦ膜であるＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用い、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。
　試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。
　さらに、試験用フィルターとして、孔径０．５／０．２μｍのＰＥＳ膜である０．５／０．２μｍ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ＳＨＣ　Ｄｉｓｋ　Ｗ／Ｔｙｐａｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＨＧＥＰ０２５５０）を用い、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。
　ＰＷにより充分に湿潤させた試験用フィルターをフォルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に装着し、フォルダーを加圧タンクに接続した。フォルダー付属のバルブを開け、エアーベントから十分にエアーを押し出した。加圧タンクに圧縮空気により１２０ｋＰａの圧力をかけた後、バルブを全開して試験を開始した。
　バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。
　結果を図４に示す。孔径０．２２μｍのＰＶＤＦ膜を用いたろ過において、Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加しなかった水溶液では９５７であったのに対し、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液では３１９９と増大した。さらに、孔径０．５／０．２μｍのＰＥＳ膜を用いたろ過において、Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加しなかった水溶液では１５１１であったのに対し、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液では３９２２と増大した。
　以上から、使用するろ過膜の材質がＰＶＤＦまたはＰＥＳの場合であっても、水溶液の最終ｐＨ調整前にキレート剤を水溶液に添加することで、水溶液のろ過性が向上することを明らかにした。さらに、使用するろ過膜の構造が単一の層であっても、プレフィルターと組み合わせた複数の層であっても、水溶液の最終ｐＨ調整前にキレート剤を添加することで、その水溶液のろ過性が向上することを明らかにした。
［実施例５］最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加し調製された水溶液を用いた動物細胞の培養と生理活性物質の生産
　最終ｐＨ調整よりも先にクエン酸３ナトリウム２水和物を添加し調製された水溶液を用いて、動物細胞の培養を行った。その結果、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液においても、添加しなかった水溶液と同等以上の細胞増殖、力価が得られることを明らかにした。
　生産水溶液１Ｌ当りの調製手順を以下に示す。
　最初に約９００ｍＬの純水（以下、ＰＷと称す）に、クエン酸３ナトリウム２水和物（小堺製薬社製）を０ｇ（添加せず）、または０．１ｇ添加し攪拌した。クエン酸３ナトリウム２水和物が完全に溶解した後、６．７ｇのＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、カタログ番号：９１０５２－１Ｋ３９８６、または９１０５２－５Ｋ３９８６）を添加し、約１５分間攪拌した。
　次にアミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む改良粉末培地ＥＸ－ＣＥＬＬ　３０２（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）２２．６ｇとＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１４１９０－２５０）を用いて溶解した１ｍｍｏｌ／ＬのＭｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、カタログ番号：Ｍ８４０７－５００ＭＧ）０．５ｍＬを加えて、約３０分間攪拌した。
　さらに、最終ｐＨ調整として１．６ｇの炭酸水素ナトリウム（関東化学社製、カタログ番号：３７１１６－００）を加えて、約５分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、その後、約１０分間攪拌し、生産水溶液とした。水溶液調製後の上記記載の添加したクエン酸３ナトリウム２水和物の濃度は、０ｇ／Ｌ（添加なし）、または０．１ｇ／Ｌ（０．３４ｍｍｏｌ／Ｌ）なる。
　上記手順で調製された生産水溶液を用いて、モノクローナル抗体を発現するＣＨＯ細胞を３Ｌリアクターにて、１４日間フェドバッチ培養した。培養初期の播種密度は、約３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、培養期間中、培養用水溶液の温度は３５℃、ｐＨは７．１０に制御した。
　フィード用水溶液には、アミノ酸［Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン一塩酸、Ｌ－アスパラギン一水和物、Ｌ－シスチン二塩酸、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－ヒスチジン一塩酸二水和物、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン一塩酸、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン二ナトリウム二水和物、Ｌ－バリン（以上、シグマ－アルドリッチ社製）、Ｌ－アスパラギン酸、グリシン（以上、和光純薬工業社製）、Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（協和発酵バイオ製）、及びＬ－メチオニン（純正化学社製）］、ビタミン［Ｄ－ビオチン、Ｄ－パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｍｙｏ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサール塩酸、リボフラビン、チアミン塩酸、シアノコバラミン（以上、シグマ－アルドリッチ社製）］、リコンビナントヒトインスリン（ジェーアールエイチバイオサイエンス社製）、エタノールアミン（シグマ－アルドリッチ社製）、ＳＯＹ　ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ　ＵＦ（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、コレステロール脂質濃縮溶液（２５０×水溶液、インビトロジェン社製）、エチレンジアミン四酢酸第二鉄ナトリウム塩（シグマ－アルドリッチ社製）及びグルコース（和光純薬工業社製）からなる水溶液を用いた。上記フィード用水溶液を培養３、６、９及び１２日目にそれぞれ初発生産水溶液量の約６．３％添加した。
　その結果、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加しなかった水溶液を用いた培養においては、最高到達生細胞密度が５．４×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養終了時のモノクローナル抗体の力価が１．８ｇ／Ｌであったのに対して、０．１ｇ／Ｌのクエン酸３ナトリウム２水和物を添加した水溶液を用いた培養においては、最高到達生細胞密度が５．８×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、培養終了時のモノクローナル抗体の力価が１．９ｇ／Ｌであった。
　以上から、最終ｐＨ調整よりも先にクエン酸３ナトリウム２水和物を添加し調製された水溶液においても、クエン酸３ナトリウム２水和物を添加しなかった水溶液と同等以上の細胞増殖、力価が得られることを明らかにした。
［実施例６］Ｎ－アセチルノイラミン酸二水和物添加によるろ過性向上効果
　粉末培地を含む水溶液調製時にキレート剤として、Ｎ－アセチルノイラミン酸二水和物を添加したときの該水溶液のろ過性への影響を検討し、水溶液のＶｍａｘ（単位膜面積あたりの最大処理量）値が向上することを明らかにした。
　水溶液の調製は以下の手順により行った。まず、１６０ｍＬの純水（以下ＰＷと略す）に、水酸化ナトリウム（純正化学社製、カタログ番号：３９１５５－０３０１）４．０ｇ、Ｌ－Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｔ１１４５－１００Ｇ）４．５ｇ、Ｌ－（－）－Ｃｙｓｔｉｎｅ　Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄ（和光純薬社製、カタログ番号：０３４－０５３２２）６．１６ｇを添加し、約３０分間攪拌後、ＰＷを加え２００ｍＬとした水溶液（以下、Ｃｙｓ－Ｔｙｒ溶液と略す）を調製した。
　つぎに、８００ｍＬのＰＷに、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｆｅｅｄ　Ａ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１２８７０ＳＢ）３２．６ｇ、液体添加物　ｐｏｌｙａｍｉｎｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１２８７２ＳＡ）０．５ｍＬ、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｆｅｅｄ　Ｂ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１１４９８ＳＡ）２７．１ｇ、Ｌ－（＋）－グルタミン（和光純薬社製、カタログ番号：０７８－００５２５）５．０ｇ、ペプトン　ＳＥ５０ＭＡＦ－ＵＦ（和光純薬社製、カタログ番号：Ｐ４２４７４）３０．０ｇ、Ｄ（＋）－グルコース（和光純薬社製、カタログ番号：０４１－００５９５）７０．０ｇを添加し、キレート剤として、Ｎ－アセチルノイラミン酸二水和物（協和発酵バイオ社製）３０．９ｇを添加し、約３０分間攪拌した。
　攪拌後のｐＨは、４．０５であった。その後、Ｃｙｓ－Ｔｙｒ溶液を５０ｍＬ添加し、約２０分間攪拌した。Ｃｙｓ－Ｔｙｒ溶液添加後のｐＨは、４．３７であった。その後、最終ｐＨ調整として５ｍｏｌ／ｌ　水酸化ナトリウム溶液（和光純薬社製、カタログ番号：１９６－０５３７５）１７ｍＬを加え約２０分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、溶液Ａとした。溶液Ａの最終ｐＨは８．１であった。水溶液調製後の上記記載の添加したＮ－アセチルノイラミン酸二水和物の濃度は、３０．９ｇ／Ｌ（８９ｍｍｏｌ／Ｌ）となる。
　一方、８００ｍＬのＰＷに、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｆｅｅｄ　Ａ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１２８７０ＳＢ）３２．６ｇ、液体添加物　ｐｏｌｙａｍｉｎｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１２８７２ＳＡ）０．５ｍＬ、アミノ酸、金属塩、ビタミン等を含む粉末培地Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｆｅｅｄ　Ｂ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、カタログ番号：Ａ１１４９８ＳＡ）２７．１ｇ、Ｌ－（＋）－グルタミン（和光純薬社製、カタログ番号：０７８－００５２５）５．０ｇ、ペプトン　ＳＥ５０ＭＡＦ－ＵＦ（和光純薬社製、カタログ番号：Ｐ４２４７４）３０．０ｇ、Ｄ（＋）－グルコース（和光純薬社製、カタログ番号：０４１－００５９５）７０．０ｇを添加し、キレート剤ではない酸として　５ｍｏｌ／ｌ　塩酸（和光純薬社製、カタログ番号：０８１－０５４３５）２８ｍＬを添加し、約３０分間攪拌した。攪拌後のｐＨは、３．０９であった。その後、Ｃｙｓ－Ｔｙｒ溶液を５０ｍＬ添加し、約２０分間攪拌した。Ｃｙｓ－Ｔｙｒ溶液添加後のｐＨは、３．３９であった。
　その後、最終ｐＨ調整として５ｍｏｌ／ｌ　水酸化ナトリウム溶液（和光純薬社製、カタログ番号：１９６－０５３７５）２８ｍＬを加え約２０分間攪拌した後、ＰＷを加え１Ｌとし、溶液Ｂとした。溶液Ｂの最終的なｐＨは８．１であった。
　次に、調製した水溶液のＶｍａｘ試験を以下の手順で行った。加圧タンク（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に試験水溶液を１Ｌ入れた。試験用フィルターには、孔径０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）ＧＶ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、カタログ番号：ＳＬＧＶ０３３ＲＳ）を用いた。
　フィルターをタンクへ接続し、圧縮空気により１００ｋＰａの圧力をかけた。試験開始前にタンクのバルブを若干開け、水溶液を用いてフィルターを湿潤した。フィルターを湿潤した後、バルブを全開して試験を開始した。
　バルブ全開時の時間を０とし、ろ過処理量５ｇ増加するのにかかる経過時間を測定した。水溶液の密度を１ｇ／ｍＬとして、測定重量よりろ過量（Ｖ）を算出した。計測は３分以上行った。計測値を横軸に時間（ｔ）、縦軸にｔ／Ｖにとってグラフを作成し、得られた直線の傾きの逆数からＶｍａｘを算出した。
　結果を図５に示す。Ｖｍａｘ（Ｌ／ｍ２）の値は、キレート剤を添加しなかった溶液Ｂでは１９０であったのに対し、キレート剤としてＮ－アセチルノイラミン酸二水和物を添加した溶液Ａでは２０２５と増大した。
　以上から、粉末培地を含む水溶液の調製時にキレート剤として、Ｎ－アセチルノイラミン酸二水和物を添加することで、水溶液のＶｍａｘの値が向上することを明らかにした。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１０年１２月２７日付けで出願された日本出願（特願２０１０－２９０４４４）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　本発明により、ろ過性の飛躍的向上を実現した水溶液調製方法が提供された。該調製方法を用いることで、安定的に短時間で膜ろ過を遂行する汎用性の高い細胞培養用水溶液が提供された。また、ろ過性の飛躍的向上を実現した、該調製方法により調製された水溶液、該調製方法により調製された水溶液を用いる細胞の培養方法、該培養方法を用いた生理活性物質の製造方法、該製造方法を用いて製造される生理活性物質、該調製方法により調製された水溶液を膜ろ過する方法、キレート剤を添加して水溶液を調製することを特徴とする水溶液の膜ろ過性を向上する方法又は、水溶液を調製し、膜ろ過し、および該水溶液を用いて細胞を培養し、生理活性物質を製造する方法が提供された。

Claims (28)

  1. 　培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法であって、該水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加することを特徴とする、培地およびキレート剤を含む水溶液の調製方法。
  2. 　キレート剤がクエン酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸　鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩およびシアル酸、並びにそれらの塩または水和物から選ばれる少なくとも１である、請求項１に記載の水溶液の調製方法。
  3. 　培地が粉末培地、液体培地またはスラリー状の培地である、請求項１または請求項２に記載の調製方法。
  4. 　粉末培地がさらに金属塩、糖類およびビタミンから選ばれる少なくとも１を含む培地である、請求項３に記載の調製方法。
  5. 　培地が細胞培養用の培地である、請求項１～４のいずれか１項に記載の調製方法。
  6. 　培地が動物細胞培養用の培地である、請求項５に記載の調製方法。
  7. 　培地がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地である、請求項６に記載の調製方法。
  8. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の方法により調製された、水溶液。
  9. 　請求項１～７のいずれか１項に記載の方法で調製した水溶液を用いる、細胞の培養方法。
  10. 　細胞が動物細胞である、請求項９に記載の細胞の培養方法。
  11. 　細胞がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞である、請求項１０に記載の細胞の培養方法。
  12. 　請求項９～１１のいずれか１項に記載の細胞の培養方法を用いる、生理活性物質の製造方法。
  13. 　生理活性物質がペプチドまたは蛋白質である、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　蛋白質が糖蛋白質または抗体である、請求項１３に記載の製造方法。
  15. 　請求項１２～１４のいずれか１項に記載の製造方法を用いて製造される、生理活性物質。
  16. 　培地およびキレート剤を含む水溶液を膜ろ過する方法であって、該水溶液が、水溶液の最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を添加して調製した水溶液である、膜ろ過する方法。
  17. 　キレート剤がクエン酸、リンゴ酸、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸　鉄（ＩＩＩ）ナトリウム塩およびシアル酸、並びにそれらの塩または水和物から選ばれる少なくとも１である、請求項１６に記載の膜ろ過する方法。
  18. 　培地が粉末培地、液体培地又はスラリー状の培地である、請求項１６または請求項１７に記載の膜ろ過する方法。
  19. 　粉末培地がさらに金属塩、糖類およびビタミンから選ばれる少なくとも１を含む粉末である、請求項１８に記載の膜ろ過する方法。
  20. 　培地が細胞培養用の培地である、請求項１８または１９に記載の膜ろ過する方法。
  21. 　培地が動物細胞培養用の培地である、請求項２０に記載の膜ろ過する方法。
  22. 　培地がチャイニーズハムスター卵巣組織由来のＣＨＯ細胞培養用の培地である、請求項２１に記載の膜ろ過する方法。
  23. 　膜ろ過に用いるろ過膜の孔径が１ｎｍから１００μｍである、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の膜ろ過する方法。　
  24. 　キレート剤を水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
  25. 　さらに培地を水溶液に添加して培地およびキレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過する、請求項２４に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
  26. 　キレート剤を水溶液の最終ｐＨ調整よりも先に水溶液に添加してキレート剤を含む水溶液を調製することを特徴とする、請求項２４または２５に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
  27. 　キレート剤を、培地よりも先または同時に水溶液に添加することを特徴とする、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の水溶液の膜ろ過性を向上する方法。
  28. 　最終ｐＨ調整よりも先にキレート剤を水溶液に添加して培地および該キレート剤を含む水溶液を調製し、該水溶液を膜ろ過した後、得られた水溶液を用いて細胞を培養することによって、生理活性物質を製造する方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020091041A1 (ja) * 2018-11-02 2020-05-07 協和キリン株式会社 液体培地の調製方法
JPWO2019088143A1 (ja) * 2017-11-01 2020-11-12 中外製薬株式会社 生物活性が低下した抗体バリアントおよびアイソフォーム

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190292514A1 (en) * 2016-07-14 2019-09-26 Basf Se Fermentation medium comprising chelating agent

Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02227075A (ja) 1988-09-29 1990-09-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ポリペプチド
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
JPH05336963A (ja) 1991-12-17 1993-12-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
WO1994023021A1 (en) 1993-03-29 1994-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,3-FUCOSYLTRANSFERASE
JPH07506492A (ja) 1992-05-09 1995-07-20 ヴエストフアリア　ゼパラトール　アクチエンゲゼルシヤフト 無菌培地の連続調合法
WO1996030046A1 (en) 1995-03-30 1996-10-03 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
WO1996040210A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US5725856A (en) 1988-01-12 1998-03-10 Genentech, Inc. Monoclonal antibodies directed to the HER2 receptor
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO1998051793A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Genentech, Inc. Apo-2 RECEPTOR
JP2000217455A (ja) 1999-01-28 2000-08-08 Kubota Corp イチゴ用液体培地組成物
JP2003250533A (ja) 2002-03-05 2003-09-09 F Hoffmann La Roche Ag 哺乳類細胞をインビトロで増殖させる改善法
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
WO2005017130A2 (en) 2003-08-18 2005-02-24 Glycotope Gmbh Tumour cell lines nm-f9 (dsm acc2606) and nm-d4 (dsm acc2605), uses thereof
JP2006500931A (ja) * 2002-09-30 2006-01-12 ファイザー・プロダクツ・インク 高レベルのヒト配列抗体を産生するハイブリドーマ
WO2010008075A1 (ja) 2008-07-17 2010-01-21 協和発酵キリン株式会社 抗システムascアミノ酸トランスポーター2(asct2)抗体
WO2010036774A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 Medimmune, Llc Methods for purification of viruses
WO2010036760A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 Medimmune, Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4466889A (en) * 1981-08-20 1984-08-21 Pfizer Inc. Polyvalent metal ion chelating agents for xanthan solutions
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) * 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
US5580348A (en) * 1994-05-10 1996-12-03 Kimberly-Clark Corporation Absorbent structure comprising a microbial polysaccharide and a process of making the same
JP2000517188A (ja) * 1996-08-30 2000-12-26 ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド 無血清哺乳動物細胞培養培地およびその使用
AU4751697A (en) * 1996-10-10 1998-05-05 Douglas Danner Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients
WO2006050050A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
DE102005046225B4 (de) * 2005-09-28 2012-01-05 Cellca Gmbh Verbessertes Zellkulturmedium
US20090298976A1 (en) * 2005-10-26 2009-12-03 Hiroyuki Yano Fiber-Reinforced Composition Resin Composition, Adhesive and Sealant

Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5725856A (en) 1988-01-12 1998-03-10 Genentech, Inc. Monoclonal antibodies directed to the HER2 receptor
JPH02227075A (ja) 1988-09-29 1990-09-10 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規ポリペプチド
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
JPH05336963A (ja) 1991-12-17 1993-12-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
JPH07506492A (ja) 1992-05-09 1995-07-20 ヴエストフアリア　ゼパラトール　アクチエンゲゼルシヤフト 無菌培地の連続調合法
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO1994023021A1 (en) 1993-03-29 1994-10-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,3-FUCOSYLTRANSFERASE
WO1996030046A1 (en) 1995-03-30 1996-10-03 Genentech, Inc. Vascular endothelial cell growth factor antagonists
WO1996040210A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
WO1998051793A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Genentech, Inc. Apo-2 RECEPTOR
JP2000217455A (ja) 1999-01-28 2000-08-08 Kubota Corp イチゴ用液体培地組成物
US6855544B1 (en) 1999-04-15 2005-02-15 Crucell Holland B.V. Recombinant protein production in a human cell
JP2003250533A (ja) 2002-03-05 2003-09-09 F Hoffmann La Roche Ag 哺乳類細胞をインビトロで増殖させる改善法
JP2006500931A (ja) * 2002-09-30 2006-01-12 ファイザー・プロダクツ・インク 高レベルのヒト配列抗体を産生するハイブリドーマ
WO2005017130A2 (en) 2003-08-18 2005-02-24 Glycotope Gmbh Tumour cell lines nm-f9 (dsm acc2606) and nm-d4 (dsm acc2605), uses thereof
WO2010008075A1 (ja) 2008-07-17 2010-01-21 協和発酵キリン株式会社 抗システムascアミノ酸トランスポーター2(asct2)抗体
WO2010036774A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 Medimmune, Llc Methods for purification of viruses
WO2010036760A1 (en) * 2008-09-24 2010-04-01 Medimmune, Llc Methods for cultivating cells, propagating and purifying viruses

Non-Patent Citations (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Book of Abstracts of The 23rd Annual and International Meeting of the Japanese Association for Animal Cell Technology", September 2010, pages: 127
"Filter Sterilization of Samples (1- 100 mL) in Sterile Acrodisc (Registered trademark) Syringe Filters.5.3", 15 November 2010, PALL CORPORATION
ANTICANCER RES., vol. 13, 1993, pages 331
BIOPHARM, vol. 46, September 2006 (2006-09-01)
BRITISH J. CANCER, vol. 83, 2000, pages 493
CANCER IMMUNOL. IMMUNOTHER., vol. 36, 1993, pages 260
CANCER RES., vol. 54, 1994, pages 1511
CANCER RES., vol. 55, no. 23, 1995, pages 5935S - 5945S
CANCER RES., vol. 57, 1997, pages 4593
CANCER, vol. 88, 2000, pages 2909
CELL, vol. 6, 1975, pages 121
CHROMOSOMA, vol. 41, 1973, pages 129
CIRCULATION, vol. 101, 2000, pages 1158
CURR. OPIN. ONCOL., vol. 10, 1998, pages 548
CYTOKINE, vol. 3, 1991, pages 562
CYTOTECHNOLOGY, vol. 3, 1990, pages 133
GENES DEVELOP., vol. 4, 1990, pages 1288
GENETICS, vol. 55, 1968, pages 513
HYBRIDOMA, vol. 13, 1994, pages 183
IMMUNOL. REV., vol. 127, 1992, pages 5
J. BIOCHEM., vol. 101, 1987, pages 1307
J. BIOL. CHEM., vol. 252, 1977, pages 1998
J. BIOL. CHEM., vol. 252, 1977, pages 5558
J. BIOL. CHEM., vol. 258, 1983, pages 9017
J. BIOL. CHEM., vol. 265, 1990, pages 16455
J. BIOL. CHEM., vol. 272, 1997, pages 17400
J. CLIN. MICROBIOL., vol. 37, 1999, pages 396
J. EXP. MED., vol. 173, 1992, pages 269
J. EXP. MED., vol. 186, 1997, pages 1373
J. EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 147, 1978, pages 923
J. IMMUNOL. METHODS, vol. 217, 1998, pages 41
J. IMMUNOL., vol. 152, 1994, pages 2968
J. LEUC. BIOL., vol. 55, 1994, pages 280
J. NEUROSCI. RES., vol. 40, 1995, pages 647
J. RHEUMATOLOGY, vol. 25, 1998, pages 2065
J. UROLOGY, vol. 160, 1998, pages 2396
JOURNAL OF DENTAL RESEARCH, vol. 46, no. 3, May 1967 (1967-05-01), pages 514 - 521
JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 108, 1958, pages 945
LOWE ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 86, 1989, pages 8227
METHODS IN CELL SCIENCE, vol. 18, 1996, pages 115
MOLECULAR CELLGENETICS, APPENDIX I, II, pages 883 - 900
MOLECULAR IMMUNOL., vol. 31, 1994, pages 371
MOLECULAR IMMUNOL., vol. 36, 1999, pages 387
MOLECULAR PHARMACOL., vol. 58, 2000, pages 237
NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY, vol. 3, May 2004 (2004-05-01), pages 383
NATURE, vol. 329, 1987, pages 840
NATURE, vol. 339, 1989, pages 487 - 488
NATURE, vol. 369, 1994, pages 533
NATURE, vol. 400, 1999, pages 776
ONCOGENE, vol. 19, 2000, pages 2138
PAULSON ET AL., JBIOL.CHEM., vol. 264, 1989, pages 17619
PERI ET AL., J. IMMUNOL. METH., vol. 174, 1994, pages 249
PROC. NATL. ACAD. SCI, USA, vol. 77, 1980, pages 4216
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 53, 1965, pages 288
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 60, 1968, pages 1275
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 77, 1980, pages 4216
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 84, 1987, pages 7413
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 86, 1989, pages 9911
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 89, 1992, pages 4285
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 97, 2000, pages 722
PROC. NATL. ACAD. SCI., vol. 60, 1968, pages 1275
PROCEEDING OF THE SOCIETY FOR THE BIOLOGICAL MEDICINE, vol. 73, 1950, pages 1
RADIATION RESEARCH, vol. 148, 1997, pages 260
SCIENCE, vol. 122, 1952, pages 501
SCIENCE, vol. 193, 1976, pages 1007
SCIENCE, vol. 253, 1991, pages 1129
See also references of EP2660315A4
STRUCTURE, vol. 8, 2000, pages 385
THE JOURNAL OF RHEUMATOLOGY, vol. 33, November 2006 (2006-11-01), pages 2124 - 2131
THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION, vol. 199, 1967, pages 519
VIROLOGY, vol. 52, 1973, pages 456
VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2019088143A1 (ja) * 2017-11-01 2020-11-12 中外製薬株式会社 生物活性が低下した抗体バリアントおよびアイソフォーム
WO2020091041A1 (ja) * 2018-11-02 2020-05-07 協和キリン株式会社 液体培地の調製方法
JPWO2020091041A1 (ja) * 2018-11-02 2021-09-30 協和キリン株式会社 液体培地の調製方法
JP7453151B2 (ja) 2018-11-02 2024-03-19 協和キリン株式会社 液体培地の調製方法

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