WO2012090493A1 - 免疫学的測定方法 - Google Patents

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equivalent
solid phase
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carrier
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有希 古田
晃司 新谷
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東ソー株式会社
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms

Definitions

  • the present invention relates to a substance to be measured in a sample that is immunologically equivalent to the substance to be measured, an equivalent substance that is fixed (bound) to the solid phase during the measurement, and a substance to be measured and an equivalent substance.
  • the present invention relates to an immunoassay method for measuring using a labeled antibody that specifically binds to.
  • Certain substances present in the blood may be associated with specific diseases. For example, if the amount of the substance exceeds a certain range and shows a high value or a low value, it may mean the onset or seriousness of the specific disease, and the measurement of the substance is actively conducted in the field of clinical diagnosis Has been.
  • homocysteine is one of the intermediate substances produced in the process of methionine being metabolized in the body.
  • the generated homocysteine is rapidly metabolized by either the methionine conversion or the cystathionine formation-mediated conversion to cysteine.
  • the high level of homocysteine is suggested to be one of the risk factors for cardiovascular disease, and its measurement is drawing attention.
  • Immunological measurement methods are known as methods for measuring proteins, steroids, vitamins, and other substances in the blood that are immunologically antigenic (substances that can artificially generate antibodies to the substance).
  • a so-called competitive measurement method is known as an immunoassay method for homocysteine (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 An immunoassay method for homocysteine (Patent Document 1).
  • this competitive measurement method using blood as a sample, first, homocysteine bound to blood components is released by SS binding, then adenosine is added by an enzyme, and homocysteine can be immunologically measured. Convert to some S-adenosylhomocysteine.
  • this S-adenosylhomocysteine competes with the labeled anti-S-adenosylhomocysteine antibody with S-adenosylhomocysteine previously prepared and immobilized on a water-insoluble solid phase. Combined.
  • homocysteine is measured by measuring the amount of labeled antibody bound to the solid phase after the so-called B / F (bound / free) separation operation.
  • a water-insoluble solid phase to which S-adenosylhomocysteine is immobilized is used.
  • Immobilization (binding) of S-adenosylhomocysteine to the solid phase usually involves binding S-adenosylhomocysteine to a carrier substance such as bovine serum albumin and fixing the resulting carrier substance in this complex. This is done by physical adsorption to the phase.
  • a carrier substance such as bovine serum albumin
  • the amount of S-adenosylhomocysteine bound to the solid phase is likely to vary.
  • the measurement results may vary and the reproducibility may deteriorate.
  • the process for quality control becomes complicated when preparing the solid phase. There is.
  • the immunological measurement of homocysteine has been described as a specific example.
  • the problem is that the measurement target substance is an equivalent substance fixed on a solid phase that is immunologically equivalent to the measurement target substance, and the measurement target substance.
  • the present invention capable of solving the above-described problems is a method of measuring a substance to be measured in a sample. Measurement is performed using an equivalent substance that is immunologically equivalent to the measurement target substance, immobilized on the solid phase in the execution of the measurement, and a labeled antibody that specifically binds to the measurement target substance and the equivalent substance.
  • An immunological assay that The equivalent substance is bound by the binding of the equivalent substance to the carrier substance that does not bind to the labeled antibody, and the substance that specifically binds to the carrier substance and the carrier substance. It is immobilized on a solid phase.
  • the present invention is an immunological measurement reagent for measuring a substance to be measured in a sample, It includes an equivalent substance that is immunologically equivalent to the substance to be measured, fixed to the solid phase in the execution of the measurement, and a labeled antibody that specifically binds to the substance to be measured and the equivalent substance.
  • the substance is bound to the carrier substance, which is a substance to which the labeled antibody does not bind, and the substance specifically binds to the carrier substance and the carrier substance, and the equivalent substance is fixed by binding to the specific binding substance fixed on the solid phase. It is fixed to a phase.
  • this invention is for measuring the measuring object substance in a sample, An equivalent substance that is immunologically equivalent to the substance to be measured and is fixed to the solid phase in the execution of the measurement; A labeled antibody that specifically binds to the substance to be measured and an equivalent substance, Equivalent substance through binding between the equivalent substance and the carrier substance that is not bound to the labeled antibody, and the substance that specifically binds to the carrier substance and the carrier substance, and the binding to the specific binding substance immobilized on the solid phase.
  • Is a method for producing an immunological measurement reagent immobilized on a solid phase The solid phase on which the specific binding substance is immobilized is frozen in a container, and the combined substance of the equivalent substance and the carrier substance is added to the container in which the solid phase is frozen, and then the frozen substance is further frozen. A mixture of the solid phase, the frozen equivalent substance and the combined substance of the carrier substance is lyophilized.
  • the sample includes a substance to be measured which will be described later, for example, Biological samples typified by bodily fluids such as blood, saliva, urine, etc. containing the substance to be measured, Environmental water such as rivers, lakes, and sewage containing the substances to be measured, Examples include foods containing substances to be measured. Since the measurement method of the present embodiment uses a reaction in a liquid phase system, more specifically, in the present embodiment, a sample is a liquid containing a measurement target substance. If the substance to be measured is contained in a liquid that is not inherently liquid, it is suspended in the liquid, or the substance to be measured is extracted by a known method and dispersed or dissolved in the liquid. Samples can be prepared.
  • the measurement according to the present embodiment is performed.
  • the interference substances that coexist with the measurement target substance are reduced to such an extent that the immune reaction cannot be affected by removing the interference substance or purifying the measurement target substance. It is preferable.
  • the substance to be measured is not particularly limited as long as it has a low molecular weight (preferably a molecular weight of 2000 or less) and can be specifically bound by a labeled antibody described later.
  • substances to be measured include amino acids such as homocysteine, folic acid, vitamins B 12 (cyanocobalamin), vitamins such as vitamin D (cholecalciferol, calcidiol), proteins such as thyroid stimulating hormone receptor (TSHR), Hormones such as triiodothyronine (T3), thyroxine (T4), 3,5-diiodo-L-thyronine (T2), estrone (E1), estradiol (E2), estriol (E3), progesterone, cortisol, Examples thereof include biopolymers such as sugar chains and lipids, viruses, chemical substances having a pharmacological action, and endocrine disrupting substances such as bisphenol A.
  • the substance to be measured includes a concept including the case where homocysteine is measured via a substance converted into a derivative such as S-adenosylhomocysteine when homocysteine is used as the substance to be measured, for example. It is.
  • the equivalent substance used in the measurement method of the present embodiment is a substance that is immunologically equivalent to the substance to be measured and is fixed to a solid phase.
  • “Immunologically equivalent” means that the reactivity with the labeled antibody described later is equivalent to the substance to be measured. More specifically, it refers to a substance to which a labeled antibody binds at substantially the same ratio as the measurement target substance when the measurement target substance and the equivalent substance are present in the same ratio.
  • the substance to be measured is a protein, its partial peptide, its subunit or its derivative can be cited as an example of an equivalent substance.
  • the same type of substance as the substance to be measured which has been prepared in advance by extraction from the same raw material as the sample (hereinafter sometimes referred to as “artificially prepared”), is an equivalent substance. It is particularly preferable to use as For example, when homocysteine is converted into S-adenosyl homocysteine and the measurement method of this embodiment is applied using the S-adenosyl homocysteine as a substance to be measured, S-adenosyl homocysteine prepared artificially is used. It is particularly preferred to use cysteine as an equivalent substance. When the measurement target substance is folic acid, it is particularly preferable to use artificially prepared folic acid as an equivalent substance.
  • the solid phase to which the equivalent substance is immobilized is insoluble in the liquid phase that can be separated from the liquid phase by a B / F (bound / free) separation operation generally performed in immunological measurement.
  • a B / F (bound / free) separation operation generally performed in immunological measurement.
  • it can be prepared with various water-insoluble materials such as natural materials such as agarose and dextran, synthetic polymer materials such as polyethylene and polystyrene, and metal materials.
  • the shape may be a particle shape, a rod shape, or a flat plate (sheet) shape.
  • the inner wall of a container for performing the measurement method of the present embodiment can be used as a solid phase.
  • the size of the solid phase is not particularly limited, but it is small in order to improve the reactivity with the measurement target substance and to shorten the time required for the binding reaction between the measurement target substance and equivalent substance and the labeled antibody. It is preferable to use a phase, and particularly preferable are fine particles having a particle size (particle size at an integrated value of 50% in a particle size distribution determined by a laser diffraction / scattering method) of about 0.3 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the solid phase may contain a magnetic substance for stirring by magnetic force or B / F separation operation.
  • an equivalent substance is bound to a carrier substance, while a specific binding substance that specifically binds to the carrier substance is bound to the solid phase, and the equivalent substance is obtained by binding the carrier substance to the specific binding substance.
  • the carrier substance and the specific binding substance can be referred to as an immobilization substance that is a substance for immobilizing an equivalent substance on a solid phase.
  • the immobilization of an equivalent substance on a solid phase via a carrier substance and a specific binding substance is also referred to as indirect immobilization on a solid phase.
  • the carrier substance is not particularly limited as long as the labeled antibody described later does not bind and can bind to an equivalent substance.
  • examples include bovine serum albumin (BSA), avidin, biotin, receptor protein, fluorescein, or DNA.
  • BSA bovine serum albumin
  • fluorescein and BSA which are easily available and inexpensive, can be exemplified as a suitable carrier substance. It is preferable to use a chemical bond for the bond between the carrier substance and the equivalent substance. This is because the binding site between the carrier substance and the equivalent substance can be artificially controlled.
  • the carrier substance need not be a single and uniform molecule, and may be a mixture of two or more kinds.
  • the specific binding substance is not particularly limited as long as it can specifically bind to the carrier substance, and examples thereof include biotin for avidin and a receptor for hormone.
  • an antigenic substance such as fluorescein or BSA
  • an antibody against the carrier substance it is particularly preferable to use an antibody against the carrier substance that is easy to produce and has sufficient specificity.
  • the specific binding substance need not be a single and uniform molecule, and may be a mixture of two or more kinds.
  • the specific binding substance does not necessarily have to specifically bind to the carrier substance itself.
  • the carrier substance is converted to fluorescein, while the specific binding substance specifically binds to fluorescein (for example, an anti-fluorescein antibody). ) Can also be used.
  • the solid phase and the specific binding substance are bound to each other by a chemical method such as covalent bonding or by adsorption.
  • the equivalent substance can be used by indirectly immobilizing it in advance on the solid phase, but the sample is used for measurement in a state where the carrier substance and the specific binding substance are not bound, and the measurement method of this embodiment is carried out.
  • the equivalent substance may be indirectly fixed to the solid phase. That is, in the process of causing a specific binding by bringing the measurement target substance and equivalent substance into contact with the labeled antibody in a free state, or the specific binding between the measurement target substance and equivalent substance and the labeled antibody occurs. After the reaction, the equivalent substance may be immobilized on the solid phase.
  • the equivalent substance is fixed to the solid phase in the execution of the measurement.
  • a labeled antibody is used in which a labeled substance that generates a detectable signal is bound to an antibody that specifically binds to a substance to be measured and an equivalent substance.
  • the labeled antibody can be easily prepared by using the measurement target substance as an immunogen.
  • the labeled antibody may be a mixture of two or more kinds, or may be a single and uniform antibody, and a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used respectively.
  • a monoclonal antibody capable of obtaining a desired amount of antibody simply by culturing the hybridoma is a surface of uniformity of reactivity. Is also particularly preferable.
  • the labeling substance that generates a signal can be detected by, for example, optical detection or radiation detection, or can act on another substance to enable optical detection, for example.
  • an enzyme, a chemiluminescent substance, a bioluminescent substance, a radioisotope, a color substance, etc. can be illustrated.
  • the bond between the antibody and the labeling substance can be formed, for example, by a chemical method such as a covalent bond, or by a physical bond between affinity substances bound to both.
  • a pre-bonded antibody can be used as a labeled antibody, but both can be bound by binding of affinity substances such as avidin-biotin in the process of the present embodiment. .
  • the measurement target substance, equivalent substance and labeled antibody described above When the measurement target substance, equivalent substance and labeled antibody described above are mixed, the measurement target substance and equivalent substance competitively bind to the labeled antibody, and the amount of the measurement target substance derived from the sample is large, The amount of equivalent substance that binds to the labeled antibody is relatively reduced. Since the equivalent substance is finally indirectly bound to the solid phase, depending on the amount of labeling substance present in the liquid phase, a B / F separation operation is performed after a certain time of immune reaction, or Then, a signal that depends on the amount of the labeling substance that has formed a complex with the solid phase is measured. By measuring the signal, for example, a measurement target substance in a sample can be detected, and the amount and concentration of the measurement target substance can be measured.
  • the measurement target substance, the equivalent substance, and the labeled antibody are brought into contact in a free state (without binding the equivalent substance bound to the carrier substance to the solid phase) to cause an immune reaction
  • the measurement target substance, the equivalent substance and the labeled antibody react rapidly, and as a result, the reproducibility of the measurement value can be improved.
  • the equivalent substance and the labeled antibody are charged into the reaction vessel, and then the solid phase to which the specific binding substance is bound is charged.
  • a reagent prepared by freezing treatment without binding an equivalent substance and a solid phase more preferably a reagent prepared by performing freeze-drying treatment after the freezing treatment
  • An example is a method in which a sample is added and a dry matter is dissolved to simultaneously perform a reaction of a measurement target substance, an equivalent substance and a labeled antibody, and a reaction between the equivalent substance and a solid phase.
  • Reagents prepared by performing freeze-drying after the freezing treatment include, for example, freezing a solid phase in which a specific binding substance is immobilized in a container, and the equivalent substance and carrier in the container in which the solid phase is frozen.
  • It can be produced by adding a binding substance of the substance and further freezing, and then freeze-drying the mixture of the frozen solid phase and the frozen equivalent substance and carrier substance in the container.
  • the amount and ratio of the constituent components contained in the reagent can be appropriately set according to the type of sample to be processed.
  • the present embodiment provides a method, a reagent, and a method for manufacturing the same, which can accurately measure the measurement target substance having a low reproducibility, for example, a low concentration.
  • the carrier substance when the equivalent substance is bound to the solid surface, the carrier substance is not directly bound, but is bound via the specific binding substance, thereby reducing the contact area of the carrier substance to the solid surface. And more equivalent substances can be combined.
  • the equivalent substance can be bound to the solid phase in a state where it can participate in an immune reaction.
  • the equivalent substance on the solid surface it is difficult to uniformly fix the equivalent substance on the solid surface simply by binding the equivalent substance to the carrier substance, particularly when S-adenosylhomocysteine or folic acid is used as the measurement target substance. It is effective for the case where By applying this embodiment, for example, the amount of S-adenosylhomocysteine (or folic acid) bound to the surface of the solid phase is made uniform, and the measurement results are not fluctuated due to the fluctuations, thereby being reproducible. Can be improved.
  • a fluoresceinated S-adenosylhomocysteine solution A
  • beads immobilized with an anti-fluorescein antibody B
  • an ALP-labeled anti-S-adenosylhomocysteine antibody solution C
  • S-adenosylhomocysteine directly immobilized beads D
  • fluoresceinated folic acid solution E
  • ALP-labeled antifolate antibody solution F
  • folic acid folic acid directly immobilized
  • the converted beads are abbreviated as (G).
  • Example 1 Homocysteine measuring reagent, its production, and measurement using it (1) Preparation of fluoresceinated S-adenosylhomocysteine solution
  • S-adenosylhomocysteine Commercially available S- (5'-adenosyl) -L-homocysteine (manufactured by Sigma-Aldrich) ) (Hereinafter abbreviated as S-adenosylhomocysteine or SAH) and bovine serum albumin (BSA) 0.5 mg (SAH-BSA) 0.5 mg borate buffer (50 mmol / L, pH 9) 0.0).
  • mice are immunized with commercially available S-adenosylhomocysteine as an antigen, and anti-S-adenosylhomocysteine antibody that specifically binds to S-adenosylhomocysteine is prepared. did.
  • the prepared antibody was combined with alkaline phosphatase (ALP), and then diluted with 0.1 mol / L Tris buffer (pH 7.5) containing BSA to prepare an ALP-labeled anti-S-adenosylhomocysteine antibody solution (C). .
  • ALP alkaline phosphatase
  • the results are shown in Table 1.
  • the results in Table 1 are average values obtained by repeating the same operation five times.
  • the sample concentration in the table is a value measured by the HPLC method.
  • Comparative Example 1 (1) Preparation of a solid phase on which an equivalent substance is directly fixed 0.01 ⁇ g of the SAH-BSA and 0.2 ⁇ g of BSA are added to each spherical plastic bead having a diameter of about 2 mm, and incubated at 30 ° C. for 17 hours. Then, S-adenosylhomocysteine was adsorbed on the beads. The washed beads were placed in a 0.1% blocking agent (trade name Block Ace, DS Pharma Biomedical) solution adjusted to 53 ° C. for 3 hours to perform blocking treatment, and S-adenosylhomocysteine was directly added. Immobilized beads (D) were obtained.
  • a 0.1% blocking agent trade name Block Ace, DS Pharma Biomedical
  • the results are shown in Table 1.
  • the results in Table 1 are average values obtained by repeating the same operation five times.
  • the standard solution has a smaller variation coefficient of measurement results than the method of Comparative Example 1, and the reproducibility of repeated measurement is reduced. It turns out that it improves.
  • the samples although there are some samples in which the variation coefficient of the measurement result is larger than that of the method of Comparative Example 1, there was no sample with a variation coefficient exceeding 10%. It can be said that the method has improved reproducibility as a whole. From this, it is considered that the equivalent substance is uniformly immobilized over the entire surface of the solid phase in the method of this embodiment in which the equivalent substance is bound to the solid phase via a specific binding substance such as an antibody.
  • the amount of equivalent substance used for one measurement is about 2/3 compared with the immobilization method without using anti-fluorescein antibody, and an immune reaction can be efficiently performed even with a small amount of equivalent substance. I understand.
  • Example 2 Measuring reagent for lyophilized homocysteine, its production, and measurement using it
  • the results are shown in Table 2.
  • the results in Table 2 are average values obtained by repeating the same operation five times.
  • Example 3 (1) Production of freeze-dried reagent First, the (A) and the (B) were put in a plastic container, and both were combined and then frozen. Subsequently, the above (C) was further added and frozen. The frozen reagent thus obtained was dried to produce a homocysteine measurement reagent (lyophilized product).
  • the results are shown in Table 2.
  • the results in Table 2 are average values obtained by repeating the same operation five times.
  • Example 4 Immunoreactive reagent for folic acid, its production, and measurement using the same (1)
  • fluoresceinated folic acid solution 10 mg of a combined folic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and bovine serum albumin (BSA-FOL) It was dissolved in 4.4 mL of borate buffer (50 mmol / L, pH 9.0). Thereto was added 5 equivalents of 5-SFX dissolved in N, N-dimethylformamide and reacted at 37 ° C. for 3 hours to form fluorescein. The solution was diluted with 0.05 mol / L Tris buffer (pH 7.5) containing BSA to prepare a fluoresceinated folic acid solution (E).
  • a reducing agent is added to a blood sample collected from a healthy person with consent and incubated at 37 ° C for 10 minutes to release folic acid from the folate-binding protein in the sample, and then the immune reaction is performed. I did it.
  • the (E), the sample subjected to the treatment and the (F) were added to the (B), set in the commercially available immunoassay apparatus, and reacted at 37 ° C. for 40 minutes. After the B / F separation operation, 4 MUP was added, and an increase rate of 4 MU (nmol / L / sec) was calculated by measuring the fluorescence intensity.
  • the results are shown in Table 3.
  • the results in Table 3 are average values obtained by repeating the same operation three times.
  • the sample concentrations in the table are values measured by AIA-PACK FOLATE (manufactured by Tosoh Corporation) and the above-mentioned commercially available immunoassay device (AIA-600II, manufactured by Tosoh Corporation).
  • Comparative Example 2 (1) Preparation of a solid phase on which folic acid was directly immobilized 0.03 ⁇ g BSA-FOL and 0.2 ⁇ g BSA were added per spherical plastic bead having a diameter of about 2 mm, and incubated at 30 ° C. for 17 hours. Was adsorbed on beads. The washed beads were placed in a 0.1% blocking agent (trade name Block Ace, DS Pharma Biomedical) solution adjusted to 53 ° C. for 3 hours for blocking treatment, and beads (G) with immobilized folic acid (G) Got.
  • a 0.1% blocking agent trade name Block Ace, DS Pharma Biomedical
  • the results are shown in Table 3.
  • the results in Table 3 are average values obtained by repeating the same operation three times.
  • Example 3 a competitive reaction was established with folic acid in the standard solution and the sample, and a change in the fluorescence intensity increase rate of 4 MU corresponding to the folic acid concentration was observed.
  • the coefficient of variation is also within the allowable range for this measurement system. Therefore, in the method of the present embodiment in which the equivalent substance is bound to the solid phase via the specific binding substance (antibody), the equivalent substance is uniformly fixed over the entire surface of the solid phase and can participate in the immune reaction. Conceivable.
  • Comparative Example 2 in which an equivalent substance was bound to a carrier substance and the carrier substance was directly bound to a solid phase, a competitive reaction was not established and it was not applicable to measurement of folic acid in a sample.

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Abstract

【課題】　いわゆる競合的免疫測定方法であって、固相に抗原と等価な物質をより均一に固定することが可能な方法を提供する。 【解決手段】　サンプル中の測定対象物質を、測定対象物質と免疫学的に等価である、測定の実行において固相に固定される等価物質、及び測定対象物質と等価物質に対して特異的に結合する標識された標識抗体、を用いて測定する免疫学的測定法であって、等価物質と前記標識抗体が結合しない物質であるキャリアー物質との結合、及びキャリアー物質とキャリアー物質に特異的に結合する物質であり、固相に固定された特異結合物質との結合により、等価物質を固相に固定化することを特徴とする、前記測定法。

Description

免疫学的測定方法
　本発明は、サンプル中の測定対象物質を、測定対象物質と免疫学的に等価である、測定の実行中に固相に固定される（結合される）等価物質、及び測定対象物質と等価物質に対して特異的に結合する標識された抗体を用いて測定する免疫学的測定法に関するものである。
　血液中に存在する特定の物質が特定の疾患と関連していることがある。例えば当該物質の量が一定の範囲を超えて高値又は低値を示す場合、当該特定の疾患の発症や重篤化を意味する場合があり、臨床診断の分野で当該物質の測定が盛んに実施されている。
　例えば血液中のホモシステインの測定が挙げられる。ホモシステインは、メチオニンが体内で代謝される過程で生成する中間物質のひとつである。生成したホモシステインは、メチオニンへの変換、又はシスタチオニンの形成を経たシステインへの変換のどちらかの経路により急速に代謝される。ホモシステイン量が高値となっている状態は心臓血管疾患の危険因子のひとつであることが示唆され、その測定が注目されている。
　血液中の蛋白質、ステロイド、ビタミンその他、免疫学的に抗原性を示す物質（人為的に当該物質に対する抗体を生成し得る物質）の測定法として、免疫学的測定法が知られている。ホモシステインの免疫学的測定法（特許文献１）としては、いわゆる競合測定法が知られている。当該競合測定法では、血液をサンプルとして、まずＳＳ結合により血中成分と結合しているホモシステインを遊離させ、次に酵素によってアデノシンを付加してホモシステインを免疫学的に測定可能な誘導体であるＳ－アデノシルホモシステインに変換する。引き続き、このＳ－アデノシルホモシステインを、標識された抗Ｓ－アデノシルホモシステイン抗体に対して、予め調製され且つ水不溶性の固相に固定されたＳ－アデノシルホモシステインとの間で競合的に結合させる。次に、いわゆるＢ／Ｆ（バウンド／フリー）分離操作の後に固相に結合した標識抗体量を測定することで、ホモシステインを測定する。
特許第２８７０７０４号公報
　特許文献１に記載されたホモシステインの免疫学的測定法では、Ｓ－アデノシルホモシステインが固定された水不溶性の固相を使用する。固相へのＳ－アデノシルホモシステインの固定化（結合）は、通常、ウシ血清アルブミン等のキャリアー物質にＳ－アデノシルホモシステインを結合させ、得られたこの複合体中のキャリアー物質を固相に物理的に吸着させることにより行なわれる。しかしながら、このような固定化ではＳ－アデノシルホモシステインを固相へ均一に固定（結合）することが困難である。よって、固相へのＳ－アデノシルホモシステインの結合量が変動しやすい。この固相へのＳ－アデノシルホモシステインの結合量の変動に伴って測定結果が変動し、再現性が悪化することがある。再現性の悪化を回避するために固相へのＳ－アデノシルホモシステインの結合量を制御しようとすると、固相を調製する際、その品質管理のための工程が煩雑になってしまうという課題がある。
　また更に、キャリアー物質との結合によってＳ－アデノシルホモシステインの一部分は抗体と免疫反応し得ない状態（例えばキャリアー物質に内包される等）となってしまい、抗Ｓ－アデノシルホモシステイン標識抗体との効率的な免疫反応が妨げられる問題もある。そして、当該問題の結果、再現性が悪化することがある。これを回避しようとすると、抗Ｓ－アデノシルホモシステイン標識抗体として、Ｓ－アデノシルホモシステインとキャリアー物質との結合により免疫反応が妨げられることのないモノクローナル抗体等を使用せざるを得ないという課題もある。
　以上、ホモシステインの免疫学的測定を具体例として説明したが、前記課題は、測定対象物質を、測定対象物質と免疫学的に等価である固相に固定された等価物質、及び測定対象物質と等価物質に対して特異的に結合する標識された抗体を用いて測定する免疫学的測定法、特に、当該固相に固定するためのキャリアー物質に等価物質を結合させたうえで固相にキャリアー物質を物理的に吸着させた状態で等価物質を使用する方法においては、共通の課題である。
　本発明者らは、従来の技術に見いだされる前記課題を解決すべく鋭意検討を行ない、本発明を完成するに至った。
　上記課題を解決し得る本発明は、サンプル中の測定対象物質を、
　測定対象物質と免疫学的に等価である、測定の実行において固相に固定される等価物質、及び
　測定対象物質と等価物質に対して特異的に結合する標識された標識抗体、を用いて測定する免疫学的測定法であって、
　等価物質と標識抗体が結合しない物質であるキャリアー物質との結合、及びキャリアー物質とキャリアー物質に特異的に結合する物質であり、固相に固定された特異結合物質との結合により、等価物質を固相に固定化することを特徴とする。
　また本発明は、サンプル中の測定対象物質を測定するための免疫学的測定試薬であって、
　測定対象物質と免疫学的に等価である、測定の実行において固相に固定される等価物質、及び
測定対象物質と等価物質に対して特異的に結合する標識された標識抗体とを含み、等価物質と標識抗体が結合しない物質であるキャリアー物質との結合、及びキャリアー物質とキャリアー物質に特異的に結合する物質であり、固相に固定された特異結合物質との結合により、等価物質が固相に固定化されることを特徴とする。
　そして本発明は、サンプル中の測定対象物質を測定するための、
　測定対象物質と免疫学的に等価である、測定の実行において固相に固定される等価物質と、
　測定対象物質と等価物質に対して特異的に結合する標識された標識抗体とを含み、
　等価物質と標識抗体が結合しない物質であるキャリアー物質との結合、及びキャリアー物質とキャリアー物質に特異的に結合する物質であり、固相に固定された特異結合物質との結合を介し、等価物質が固相に固定化される免疫学的測定試薬の製造方法であって、
　特異結合物質が固定された固相を容器中で凍結し、固相を凍結させた容器中に等価物質とキャリアー物質の結合物を加えて更に凍結し、その後に当該容器中の、凍結した前記固相と凍結した前記等価物質と前記キャリアー物質の結合物との混合物を凍結乾燥することを特徴とする。
　本発明によれば、測定対象物質の測定における再現性を高めることができる。
発明の実施の形態
　以下、本実施形態の免疫学的測定法について詳細に説明する。
　本実施形態においてサンプルとは、後述する測定対象物質を含むものであり、例えば、
測定対象物質を含む血液、唾液、尿等の体液に代表される生体試料、
測定対象物質を含む河川、湖沼、下水等の環境水、
測定対象物質を含む食品、等があげられる。本実施形態の測定方法は液相系での反応を利用するものであることから、より具体的には、本実施形態においてサンプルとは、測定対象物質を含む液体である。測定対象物質が本来液体ではないものに含まれているような場合については液体に懸濁等することにより、又は、公知の手法により測定対象物質を抽出して液体に分散または溶解等させることにより、サンプルを調製することができる。なお、サンプル中に測定対象物質及び等価物質と標識抗体との結合反応（以下、本明細書において免疫反応とも称す）を妨害する妨害物質の存在が予見される場合には、本実施形態の測定方法の実施に先立ち、妨害物質を除去することにより、又は、測定対象物質について精製操作を行なうことにより、免疫反応に影響し得ない程度にまで測定対象物質と共存する妨害物質を低減しておくことが好ましい。
　測定対象物質は、低分子量（好ましくは分子量２０００以下）であって、後述する標識抗体によって特異的に結合されるものであれば特別の制限はない。測定対象物質の一例として、ホモシステインのようなアミノ酸、葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、ビタミンＤ（コレカルシフェロール、カルシジオール）のようなビタミン、甲状腺刺激ホルモンレセプター（ＴＳＨＲ）のような蛋白質、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、チロキシン（Ｔ４）、３，５－ジヨード－Ｌ－チロニン（Ｔ２）、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）、プロゲステロン、コルチゾールのようなホルモン、糖鎖や脂質等の生体高分子、ウイルス、薬理作用を有する化学物質、又はビスフェノールＡのような内分泌かく乱物質、があげられる。
　なお、本明細書において、測定対象物質は、例えばホモシステインを測定対象物質とする場合に、Ｓ－アデノシルホモシステインのような誘導体に変換した物質を介してホモシステインを測定する場合も含む概念である。
　本実施形態の測定方法で使用する等価物質は、測定対象物質と免疫学的に等価な物質であり、固相に固定されたものである。免疫学的に等価とは、後述する標識抗体との反応性において測定対象物質と同等であることを意味する。より具体的には、測定対象物質と等価物質とが同じ比率で存在している場合に、測定対象物質と実質的に同じ割合で標識抗体が結合する物質をいう。例えば測定対象物質が蛋白質である場合は、その部分ペプチド、そのサブユニット又はその誘導体等が等価物質の例としてあげられる。このうち、例えばサンプルと同様の原料から予め抽出されるなどにより予め調製された（以下、「人為的に調製された」と表現することがある）、測定対象物質と同一種類の物質を等価物質として使用することが特に好ましい。例えば、ホモシステインをＳ－アデノシルホモシステインに変換し、当該Ｓ－アデノシルホモシステインを測定対象物質として本実施形態の測定方法を適用する場合には、人為的に調製したＳ－アデノシルホモシステインを等価物質として使用することが特に好ましい。また測定対象物質が葉酸の場合は、人為的に調製した葉酸を等価物質として使用することが特に好ましい。
　等価物質が固定される固相は、免疫学的測定において一般に実施されるＢ／Ｆ（バウンド／フリー）分離操作によって液相からの分離が可能である液相に対して不溶性のものであれば何ら制限はない。例えばアガロースやデキストランといった天然の材料、ポリエチレンやポリスチレンといった合成ポリマー材料、金属材料等、さまざまな水不溶性材料で調製することができる。その形状としては粒子状、棒状、または平板（シート）状とすることができる。また、例えば本実施形態の測定方法を実施するための容器の内壁を固相として利用することもできる。中でも、比較的大きい表面積を提供し得る球状のものが、後述する特異結合物質を多量に結合できる点で好ましい。固相の大きさとしては特に制限はないが、測定対象物質との反応性を向上し、測定対象物質及び等価物質と標識抗体との結合反応に要する時間を短時間化するためには小さい固相を使用することが好ましく、特に好ましくは粒径（レーザー回折・散乱法などによって求めた粒度分布における積算値５０％での粒径）が０．３μｍから１０μｍ程度の微粒子である。なお固相は、磁力による撹拌やＢ／Ｆ分離操作のために、磁性物質を内包するなどしていても良い。
　本実施形態は、前記した等価物質を固相に固定化するに当たり、化学結合や物理的吸着を利用して両者を直接結合させるのではない。具体的には、等価物質をキャリアー物質と結合し、一方で固相にはキャリアー物質と特異的に結合する特異結合物質を結合しておき、キャリアー物質と特異結合物質との結合により、等価物質を間接的に固相に結合する。キャリアー物質および特異結合物質は、等価物質を固相に固定するための物質である固定化物質ということができる。また、本明細書においては、キャリアー物質および特異結合物質を介した等価物質の固相への固定化を、間接的な固相への固定化とも称す。
　キャリアー物質は、後述する標識抗体が結合せず、かつ、等価物質と結合することができるものであれば特に制限はない。例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、アビジン、ビオチン、レセプタータンパク質、フルオレセイン、またはＤＮＡがあげられる。中でもフルオレセインや入手が容易で単価の安いＢＳＡを好適なキャリアー物質として例示できる。キャリアー物質と等価物質との結合には、化学的結合を利用することが好ましい。キャリアー物質と等価物質との結合場所を人為的に制御し得るからである。なおキャリアー物質は単一かつ均一な分子である必要はなく、二種類以上の混合物であっても良い。
　特異結合物質は、キャリアー物質に特異的に結合し得るものであれば何ら制限はなく、アビジンに対するビオチン、ホルモンに対するレセプター等を例示することができる。中でも、フルオレセインやＢＳＡ等の抗原性を有する物質をキャリアー物質として使用する場合には、製造が容易で、しかも十分な特異性を有する、前記キャリアー物質に対する抗体を使用することが特に好ましい。なお特異結合物質は単一かつ均一な分子である必要はなく、二種類以上の混合物であっても良い。なお、特異結合物質は、必ずしもキャリアー物質そのものと特異的に結合するものである必要はなく、例えばキャリアー物質をフルオレセイン化し、一方で特異結合物質としてフルオレセインと特異的に結合する物質（例えば抗フルオレセイン抗体）を用いることもできる。固相と特異結合物質とは、例えば共有結合等の化学的な方法により、又は吸着により、相互に結合する。
　等価物質は、予め間接的に固相に固定化して使用することもできるが、キャリアー物質と特異結合物質とが結合していない状態でサンプルを測定に供し、本実施形態の測定方法の実施の過程で等価物質を間接的に固相に固定させるようにしてもよい。すなわち、測定対象物質及び等価物質と標識抗体とを遊離状態で接触させて特異的結合を生じさせる反応を行なっている過程において、又は測定対象物質及び等価物質と標識抗体との特異的結合を生じさせる反応後に、等価物質を固相に固定化するようにしてもよい。
　本明細書において、等価物質が測定の実行において固相に固定される、とは、測定の実行前に等価物質が固相に固定される場合、測定対象物質及び等価物質と標識抗体とを遊離状態で接触させて特異的結合を生じさせる反応を行なっている過程において等価物質が固相に固定される場合、および測定対象物質及び等価物質と標識抗体との特異的結合を生じさせる反応後に等価物質が固相に固定される場合を含む概念である。
　本実施形態では、測定対象物質と等価物質に対して特異的に結合する抗体に検出可能なシグナルを生成する標識物質を結合した標識抗体を使用する。前記したとおり、等価物質として測定対象物質そのものを使用する場合、標識抗体は、測定対象物質を免疫源として使用すること等により容易に調製することが可能である。また標識抗体は、二種類以上の混合物であっても単一かつ均一な抗体であっても良く、それぞれポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。中でも製造方法自体が既に確立され、しかもひとたび抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立すれば、当該ハイブリドーマを培養するのみで所望量の抗体を得ることができるモノクローナル抗体が、反応性の均一さ等の面からも特に好ましい。
　シグナルを生成する標識物質としては、それ自体が例えば光学的な検出や放射線の検出により検出し得るか、又は他の物質に作用して例えば光学的な検出を可能とする物質である。具体的には酵素、化学発光物質、生物発光物質、放射性同位元素、または呈色物質等を例示することができる。抗体と標識物質との結合は、例えば共有結合等の化学的な方法により、又は両者に結合した親和性物質同士の物理的な結合により、形成することができる。本実施形態においては、予め両者を結合したものを標識抗体として使用することもできるが、本実施形態の実施の過程で両者をアビジン－ビオチン等の親和性物質同士の結合によって結合することもできる。
　以上に説明した測定対象物質、等価物質及び標識抗体を混合すると、標識抗体に対して測定対象物質及び等価物質が競合的に結合し、サンプルに由来する測定対象物質の量が多量であれば、標識抗体と結合する等価物質の量は相対的に減少する。等価物質は最終的に間接的に固相に結合されることから、一定時間の免疫反応の後にＢ／Ｆ分離操作を実施して、液相中に存在する標識物質の量に依存する、又は、固相と複合体を形成した標識物質の量に依存するシグナルを測定する。当該シグナルの測定により、例えば、サンプル中の測定対象物質を検出したり、測定対象物質の量や濃度などを測定することができる。本実施形態では、測定対象物質、前記等価物質及び前記標識抗体を遊離状態（キャリアー物質と結合した等価物質を固相に結合させることなく）で接触させて免疫反応を生じさせ、その過程で、又は、それらの免疫反応を生じさせた後に、等価物質に結合したキャリアー物質と固相に結合した特異結合物質を結合し、等価物質を固相に固定化することが好ましい。このようにすることで、測定対象物質、等価物質及び標識抗体が迅速に反応し、結果的に測定値の再現性を向上させることが可能となるからである。なおこのような測定を実施するためには、例えばまず測定対象物質、等価物質及び標識抗体のみを反応容器に投入し、後に特異結合物を結合した固相を投入することが例示できる。
　また測定試薬として、等価物質と固相を結合することなく凍結処理を行なうことにより調製した試薬、更に好ましくは当該凍結処理の後に凍結乾燥処理を行なうことにより調製した試薬を用い、測定対象物質を含むサンプルを投入して乾燥物を溶解することにより、測定対象物質、等価物質及び標識抗体の反応と、等価物質と固相の反応を同時に行ない測定する方法が例示できる。
　当該凍結処理の後に凍結乾燥処理を行なうことにより調製した試薬は、例えば、特異結合物質が固定されている固相を、容器中において凍結し、固相を凍結させた容器中に等価物質とキャリアー物質の結合物を加えて更に凍結し、その後に当該容器中の、凍結した固相と、凍結した等価物質とキャリアー物質の結合物との混合物を凍結乾燥することにより、製造することができる。
　試薬中に含まれる構成成分の量や比率などは、対象となるサンプルの種類などに応じて適宜設定することができる。
　本実施形態によれば、サンプル中の測定対象物質を再現性よく測定することが可能となる。このように本実施形態は、再現性を良好にした、例えば低濃度である測定対象物質の測定を精度良く測定可能な方法、試薬及びその製造方法を提供するものである。
　本実施形態はまた、固相表面への等価物質の結合に際し、キャリアー物質を直接結合せず、特異結合物質を介して結合するようにした結果、キャリアー物質の固相表面への接触面積を減少し、より多くの等価物質の結合を可能とする。またそのような等価物質の結合を可能とすることにより、免疫反応に関与し得る状態で等価物質を固相に結合することを可能とする。これらを通じ、本実施形態によれば、前記再現性についての効果を達成し、更に測定に要求される等価物質の量を削減することも可能になる。
　本実施形態は、特にＳ－アデノシルホモシステインや葉酸を測定対象物質とする場合のような、単にキャリアー物質に等価物質を結合しただけでは等価物質を固相表面に均一に固定することが困難であった場合に対して効果的である。本実施形態を適用することによって、例えば、固相表面へのＳ－アデノシルホモシステイン（又は葉酸）の結合量を均一化し、その変動に伴って測定結果が変動することを回避して再現性を良好にすることが可能になる。従来は、この課題を回避するため、固相表面へのＳ－アデノシルホモシステイン（又は葉酸）の結合量を制御するために必要以上のＳ－アデノシルホモシステイン（又は葉酸）を消費し、しかも固相調製の際に品質管理のための煩雑な工程を要していたが、それを省略することが可能になる。
　以下、アミノ酸の一例であるホモシステイン及びビタミンの一例である葉酸での実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以下の説明においては、フルオレセイン化Ｓ－アデノシルホモシステイン溶液を（Ａ）と、抗フルオレセイン抗体を固定化したビーズを（Ｂ）と、ＡＬＰ標識抗Ｓ－アデノシルホモシステイン抗体溶液を（Ｃ）と、Ｓ－アデノシルホモシステインを直接に固定化したビーズを（Ｄ）と、フルオレセイン化葉酸溶液を（Ｅ）と、ＡＬＰ標識抗葉酸抗体溶液を（Ｆ）と、葉酸を直接に固定化したビーズを（Ｇ）と略して記載することもある。
　実施例１　ホモシステイン測定試薬、その製造、それを用いた測定
　（１）フルオレセイン化Ｓ－アデノシルホモシステイン溶液の調製
　市販のＳ－（５’－アデノシル）－Ｌ－ホモシステイン（シグマアルドリッチ社製）（以下、Ｓ－アデノシルホモシステイン又はＳＡＨと略記する）とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）との結合物（ＳＡＨ－ＢＳＡ）０．５ｍｇを０．２５ｍＬのホウ酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．０）に溶解した。そこにＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解した６－（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ（５－ＳＦＸ）を５等量添加し、３７℃で３時間反応させ、フルオレセイン化した。ＢＳＡを含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈して、フルオレセイン化Ｓ－アデノシルホモシステイン（Ａ）の溶液を作製した。なお（Ａ）中のＳ－アデノシルホモシステインは後に調製した（Ｃ）と特異的に反応し、その反応性は血液サンプルを処理して得たＳ－アデノシルホモシステインと同等であった。また（Ａ）中のＢＳＡは、後に調製した（Ｃ）と結合しなかった。
　（２）抗フルオレセイン抗体が固定された固相の調製
　固相として、直径約２ｍｍの球状のプラスチックビーズを使用した。プラスチックビーズ１個あたり、フルオレセインに対して特異的に結合する抗フルオレセイン抗体０．１μｇを加え、３０℃で１７時間インキュベートして抗体をビーズに吸着させた。洗浄したビーズを５３℃に温調した１％のＢＳＡ溶液に３時間置いてブロッキング処理を行ない、抗フルオレセイン抗体を固定化したビーズ（Ｂ）を得た。
　（３）検出用標識抗体溶液の調製
　市販のＳ－アデノシルホモシステインを抗原としてマウスを免疫し、Ｓ－アデノシルホモシステインに対して特異的に結合する抗Ｓ－アデノシルホモシステイン抗体を調製した。調製した抗体とアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）を結合後、ＢＳＡを含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈してＡＬＰ標識抗Ｓ－アデノシルホモシステイン抗体溶液（Ｃ）を作製した。
　（４）標準液の測定
　市販のＳ－アデノシルホモシステインを０．１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、表１に示した濃度のホモシステイン測定用標準液を調製した。なお、Ｓ－アデノシルホモシステインを含まない前記緩衝液を、ゼロ濃度の標準液とした。前記（Ｂ）に、前記（Ａ）、標準液及び前記（Ｃ）を加え、市販の免疫測定装置（商品名ＡＩＡ－６００ＩＩ、東ソー株式会社製）にセットし、３７℃で１０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、ＡＬＰの基質である４－メチルウンベリフェリルリン酸（４ＭＵＰ）を加え、ＡＬＰによって４ＭＵＰが分解されて生成する４－メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。なお、１回の反応に使用した(Ａ)は約０．０８μｇであった。
　結果を表１に示す。なお表１の結果は、各濃度の標準液に対して同様の操作を５回繰り返した平均値である。
　（５）血液サンプルの測定
　同意を得た健常人から採取した血液サンプルに還元剤、アデノシンを付加する酵素及びアデノシンを加えて３７℃で１０分間インキュベーションし、サンプル中のホモシステインをＳ－アデノシルホモシステインに変換後、免疫測定を行なった。前記（Ｂ）に対して前記（Ａ）、前記処理を行なったサンプル及び前記（Ｃ）を加え、前記市販の免疫測定装置にセットし、３７℃で１０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、４ＭＵＰを加え、４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。
　結果を表１に示す。なお表１の結果は、同様の操作を５回繰り返した平均値である。また表中のサンプル濃度は、ＨＰＬＣ法によって測定した値である。
　比較例１
　（１）等価物質が直接に固定された固相の調製
　直径約２ｍｍの球状のプラスチックビーズ１個あたり、０．０１μｇの前記ＳＡＨ－ＢＳＡと０．２μｇのＢＳＡを加え、３０℃で１７時間インキュベートしてＳ－アデノシルホモシステインをビーズに吸着させた。洗浄したビーズを５３℃に調温した０．１％のブロッキング薬（商品名ブロックエース、ＤＳファーマバイオメディカル社製）溶液に３時間置いてブロッキング処理を行ない、Ｓ－アデノシルホモシステインを直接に固定化したビーズ（Ｄ）を得た。
　（２）標準液の測定
　前記（Ｄ）に、実施例１と同じ標準液及び前記（Ｃ）を加え、前記市販の免疫測定装置にセットし、３７℃で１０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、４ＭＵＰを加え、４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。なお、１回の反応に使用したＳＡＨ－ＢＳＡは約０．１２μｇであった。
　結果を表１に示す。なお表１の結果は、各濃度の標準液に対して同様の操作を５回繰り返した平均値である。
　（３）血液サンプルの測定
　前記（Ｄ）に対して、実施例１（５）に記載の処理を行なったサンプル及び前記（Ｃ）を加え、前記市販の免疫測定装置にセットし、３７℃で１０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、４ＭＵＰを加え、４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。
　結果を表１に示す。なお表１の結果は、同様の操作を５回繰り返した平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１によれば、実施例１、即ち本実施形態の測定方法を行なった場合、標準液については比較例１の方法と比較して測定結果の変動係数が小さくなり、繰り返し測定の再現性が向上することが分かる。サンプルについては、比較例１の方法と比較して測定結果の変動係数が大きくなったサンプルが一部あるものの、変動係数が１０％を超えるサンプルは存在しなかったことから、本実施形態の測定方法のほうが全体としては再現性が向上したといえる。このことから、抗体などの特異結合物質を介して等価物質を固相に結合する本実施形態の方法では、固相表面全面にわたり等価物質が均一に固定化されているものと考えられる。また、１回の測定に使用する等価物質の使用量は、抗フルオレセイン抗体を用いない固定化法と比較して約２／３となり、少ない等価物質量でも効率良く免疫反応ができていることも分かる。
　実施例２　凍結乾燥したホモシステインの測定試薬、その製造、それを用いた測定
　（１）凍結乾燥試薬の製造
　プラスチック製容器に、まず前記（Ｂ）と前記（Ｃ）を入れ、凍結した。続いて前記（Ａ）を更に加えて凍結した。このようにして得た凍結試薬を乾燥させることで、ホモシステイン測定用の試薬（凍結乾燥物）を製造した。
　（２）測定
　上記のようにして製造した凍結乾燥試薬に、前記ゼロ濃度標準液を加え、実施例１と同様に市販の免疫測定装置を使用してＡＬＰによって４ＭＵＰが分解されて生成する４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。
　結果を表２に示す。なお表２の結果は、同様の操作を５回繰り返した平均値である。
　実施例３
　（１）凍結乾燥試薬の製造
　プラスチック製容器に、まず前記（Ａ）と前記（Ｂ）を入れて両者を結合させた後、凍結した。続いて前記（Ｃ）を更に加えて凍結した。このようにして得た凍結試薬を乾燥させることで、ホモシステイン測定用の試薬（凍結乾燥物）を製造した。
　（２）測定
　上記のようにして製造した凍結乾燥試薬に、前記ゼロ濃度標準液を加え、前記と同様に市販の免疫測定装置を使用してＡＬＰによって４ＭＵＰが分解されて生成する４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。
　結果を表２に示す。なお表２の結果は、同様の操作を５回繰り返した平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２によれば、実施例２のような試薬の製造段階で固相に等価物質を固定化しない製造方法によって試薬を製造し、測定の実行中に固相に等価物質に固定する場合、実施例３の固相に等価物質を予め結合させた後に凍結乾燥する方法と比較して、測定結果の変動係数が小さくなり、繰り返し測定の再現性が向上することが分かる。このことから、凍結乾燥試薬にサンプル（実施例２及び実施例３においてはゼロ濃度標準液）が添加され、免疫反応が開始される時点では、等価物質を固相に固定化せず、遊離状態にしておくほうが、標識抗体と測定対象物質の反応及び標識抗体と等価物質の反応が促進されると推察される。
　実施例４　葉酸の免疫反応試薬、その製造、それを用いた測定
　（１）フルオレセイン化葉酸溶液の調製
　市販の葉酸（和光純薬製）とウシ血清アルブミンとの結合物（ＢＳＡ－ＦＯＬ）１０ｍｇを４．４ｍＬのホウ酸緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ９．０）に溶解させた。そこにＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解した５－ＳＦＸを５等量添加し、３７℃で３時間反応させ、フルオレセイン化した。ＢＳＡを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、フルオレセイン化葉酸溶液（Ｅ）を作製した。
　（２）検出用標識抗体溶液の調製
　市販の葉酸を抗原としてマウスを免疫し、葉酸に対して特異的に結合する抗葉酸抗体を調製した。調製した抗体とＡＬＰを結合後、ＢＳＡを含む０．０５ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、ＡＬＰ標識抗葉酸抗体溶液（Ｆ）を作製した。
　（３）標準液の測定
　市販の葉酸（和光純薬製）を０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、表３に示した濃度の葉酸測定用標準液とした。なお、葉酸を含まない前記緩衝液をゼロ濃度の標準液とした。前記（Ｂ）に、前記（Ｅ）、標準液及び前記（Ｆ）を加え、前記市販の免疫測定装置にセットし、３７℃で４０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、４ＭＵＰを加え、４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。結果を表３に示す。なお表３の結果は、各濃度の標準液に対して同様の操作を３回繰り返した平均値である。
　（４）血液サンプルの測定
　同意を得て健常人から採取した血液サンプルに還元剤を加えて、３７℃で１０分間インキュベーションし、サンプル中の葉酸結合タンパク質から葉酸を遊離させた後、免疫反応を行なった。前記（Ｂ）に対して前記（Ｅ）、前記処理を行なったサンプル及び前記（Ｆ）を加え、前記市販の免疫測定装置にセットし、３７℃で４０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、４ＭＵＰを加え、４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を蛍光強度を測定して算出した。
　結果を表３に示す。なお表３の結果は、同様の操作を３回繰り返した平均値である。また表中のサンプル濃度は、ＡＩＡ－ＰＡＣＫ　ＦＯＬＡＴＥ（東ソー株式会社製）と前記市販の免疫測定装置（ＡＩＡ－６００ＩＩ、東ソー株式会社製）によって測定した値である。
　比較例２
　（１）葉酸を直接に固定した固相の調製
　直径約２ｍｍの球状のプラスチックビーズ１個あたり、０．０３μｇのＢＳＡ－ＦＯＬと０．２μｇのＢＳＡを加え、３０℃で１７時間インキュベートして葉酸をビーズに吸着させた。洗浄したビーズを５３℃に調温した０．１％のブロッキング薬（商品名ブロックエース、ＤＳファーマバイオメディカル社製）溶液に３時間置いてブロッキング処理を行ない、葉酸を固定化したビーズ（Ｇ）を得た。
　（２）標準液の測定
　前記（Ｇ）に、実施例３と同じ標準液及び前記（Ｆ）を加え、前記市販の免疫測定装置にセットし、３７℃で４０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、４ＭＵＰを加え、ＡＬＰによって４ＭＵＰが分解されて生成する４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。
　結果を表３に示す。なお表３の結果は、各濃度の標準液に対して同様の操作を３回繰り返した平均値である。
　（３）血液サンプルの測定
　前記（Ｇ）に対して、実施例３（４）に記載の処理を行なったサンプル及び前記（Ｆ）を加え、前記市販の免疫測定装置にセットし、３７℃で４０分間反応させた。Ｂ／Ｆ分離操作の後、４ＭＵＰを加え、４ＭＵの増加速度（ｎｍｏｌ／Ｌ／秒）を、４ＭＵからの蛍光強度を測定して算出した。
　結果を表３に示す。なお表３の結果は、同様の操作を３回繰り返した平均値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　表３によれば、実施例３では標準液およびサンプル中の葉酸による競合反応が成立し、葉酸濃度に対応した４ＭＵの蛍光強度増加速度の変化が見られる。また変動係数も本測定系での許容範囲内に収まっている。このことから、特異結合物質（抗体）を介して等価物質を固相に結合する本実施形態の方法では、固相表面全面にわたり等価物質が均一に固定され、免疫反応に関与できているものと考えられる。一方、等価物質をキャリアー物質と結合させ、当該キャリアー物質を固相に直接結合させる比較例２では、競合反応が成立しておらず、サンプル中の葉酸測定には適用できないことが分かった。
 
 

Claims (10)

  1. 　サンプル中の測定対象物質を、
    　前記測定対象物質と免疫学的に等価である、測定の実行において固相に固定される等価物質、及び
    　前記測定対象物質と前記等価物質に対して特異的に結合する標識された標識抗体、
    を用いて測定する免疫学的測定法であって、
    　前記等価物質と前記標識抗体が結合しない物質であるキャリアー物質との結合、及び前記キャリアー物質と前記キャリアー物質に特異的に結合する物質であり、前記固相に固定された特異結合物質との結合により、前記等価物質を前記固相に固定化することを特徴とする、前記測定法。
  2. 　前記測定対象物質が血液成分に由来するＳ－アデノシルホモシステインであり、前記等価物質が人為的に調製されたＳ－アデノシルホモシステインであり、前記キャリアー物質がフルオレセイン又は牛血清アルブミンであることを特徴とする、請求項１に記載の測定法。
  3. 　前記測定対象物質が血液成分に由来する葉酸であり、前記等価物質が人為的に調製された葉酸であり、前記キャリアー物質がフルオレセイン又は牛血清アルブミンであることを特徴とする、請求項１に記載の測定法。
  4. 　前記測定対象物質及び前記等価物質と前記標識抗体とを遊離状態で接触させて結合を生じさせる過程において、又は、前記測定対象物質又は前記等価物質と前記標識抗体との結合を生じさせた後に、前記等価物質を前記固相に固定化することを特徴とする、請求項１から３のいずれか１つに記載の測定法。
  5. 　サンプル中の測定対象物質を測定するための免疫学的測定試薬であって、
    　前記測定対象物質と免疫学的に等価である、測定の実行において固相に固定される等価物質、及び
    　前記測定対象物質と前記等価物質に対して特異的に結合する標識された標識抗体とを含み、
    　前記等価物質と前記標識抗体が結合しない物質であるキャリアー物質との結合、及び前記キャリアー物質と前記キャリアー物質に特異的に結合する物質であり、前記固相に固定された特異結合物質との結合により、前記等価物質が前記固相に固定化されることを特徴とする、前記測定試薬。
  6. 　前記測定対象物質が血液成分に由来するＳ－アデノシルホモシステインであり、前記等価物質が人為的に調製されたＳ－アデノシルホモシステインであり、前記キャリアー物質がフルオレセイン又は牛血清アルブミンであることを特徴とする、請求項５に記載の測定試薬。
  7. 　前記測定対象物質が血液成分に由来する葉酸であり、前記等価物質が人為的に調製された葉酸であり、前記キャリアー物質がフルオレセイン又は牛血清アルブミンであることを特徴とする、請求項５に記載の測定試薬。
  8. 　サンプル中の測定対象物質を測定するための、
    　前記測定対象物質と免疫学的に等価である、測定の実行において固相に固定されている等価物質と、
    　前記測定対象物質と前記等価物質に対して特異的に結合する標識された標識抗体とを含み、
    　前記等価物質と前記標識抗体が結合しない物質であるキャリアー物質との結合、及び前記キャリアー物質と前記キャリアー物質に特異的に結合する物質であり、前記固相に固定された特異結合物質との結合を介して前記等価物質が前記固相に固定化される免疫学的測定試薬の製造方法であって、
    　前記特異結合物質が固定された前記固相を容器中で凍結し、
    　前記固相を凍結させた容器中に前記等価物質と前記キャリアー物質の結合物を加えて更に凍結し、
    その後に当該容器中の、凍結した前記固相と凍結した前記等価物質と前記キャリアー物質の結合物との混合物を凍結乾燥することを特徴とする、前記製造方法。
  9. 　前記測定対象物質が血液成分に由来するＳ－アデノシルホモシステインであり、前記等価物質が人為的に調製されたＳ－アデノシルホモシステインであり、前記キャリアー物質がフルオレセイン又は牛血清アルブミンであることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記測定対象物質が血液成分に由来する葉酸であり、前記等価物質が人為的に調製された葉酸であり、前記キャリアー物質がフルオレセイン又は牛血清アルブミンであることを特徴とする、請求項８に記載の製造方法。
     
     
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