WO2012062841A1 - Feuchtigkeitsindikator - Google Patents

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WO2012062841A1
WO2012062841A1 PCT/EP2011/069813 EP2011069813W WO2012062841A1 WO 2012062841 A1 WO2012062841 A1 WO 2012062841A1 EP 2011069813 W EP2011069813 W EP 2011069813W WO 2012062841 A1 WO2012062841 A1 WO 2012062841A1
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WO
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moisture
lyophilisate
pama
drying
indicator
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PCT/EP2011/069813
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English (en)
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Inventor
Andy Wende
Original Assignee
Qiagen Gmbh
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Publication date
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
    • G01N31/222—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators for investigating moisture content
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N19/00—Investigating materials by mechanical methods
    • G01N19/10—Measuring moisture content, e.g. by measuring change in length of hygroscopic filament; Hygrometers
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N25/00—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means
    • G01N25/56—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating moisture content
    • G01N25/62—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating moisture content by psychrometric means, e.g. wet-and-dry bulb thermometers

Definitions

  • the present invention relates to a lyophilisate which has at least one moisture-indicating compound.
  • Another object of the present invention is the use of at least one compound selected from the group consisting of poly (acrylic acid-co-maleic acid), polyacrylic acid and / or a salt thereof, for moisture indication and a method for monitoring the moisture content of a lyophilisate.
  • Freeze-drying also known as lyophilization or sublimation drying, is a process for the gentle production of high-quality products. In freeze-drying, the ice crystals evaporate directly without the transition to the liquid state. The end product of freeze-drying is called lyophilisate Freeze-drying of the stabilization and preservation of liquid reagent formulations, such as pharmaceuticals and enzyme solutions.
  • the handling of lyophilizates is facilitated by the presence of moisture indicators indicating the level of moisture in the lyophilizate.
  • the moisture indicators available on the market are based essentially on a color reaction of dried salts during the rewetting of the lyophilisate.
  • the indicator system can be applied directly to a drying agent or to a carrier material, for example paper. In general, this application is followed by drying of the resulting indicator system so that it is "dry” in a starting color state, and when the indicator system then comes into contact with moisture, the system changes color. In this way, the exact humidity or material moisture content of the carrier materials can be determined.
  • drying agents are silica gels, alumina or Molekularsie- be.
  • 6,655,315 would not be added to any biological reaction because it consists essentially of carrier material and usually divalent salts (Co 2+ , Mg 2+ , Cr 2+, etc.) The latter are often highly inhibitory to enzyme reactions such as PCR.
  • US Pat. No. 6,665,315 does not mention the use of moisture indicators in lyophilizates at all.
  • WO 92/02804 A discloses a moisture indicator comprising cobalt thiocyanate as an inner mold material and a hygroscopic salt.
  • the hygroscopic salt is selected from the group consisting of copper chloride, sodium chloride and potassium chloride. This indicator system is not suitable for use because of the components used in sensitive biological lyophilizates.
  • WO 92/02804 A does not mention that the moisture indicator is suitable at all for use in lyophilisates.
  • the object of the present invention is to provide an indicator system for moisture in lyophilisates, which in particular does not have the disadvantages described above,
  • the present invention has the object to provide a moisture indicator which can be used in combination with lyophilizates of biological samples, but from this point of view is not understood that the biological sample is stored directly together with the moisture indicator, but in particular in that the moisture indicator is stored spatially separate from the biological sample but in the same atmosphere as the biological sample. Should it come in such an arrangement, comprising - spatially separated, but in the same atmosphere - at least one biological sample and at least one moisture indicator to a moisture absorption, this should be displayed by the separately present moisture indicator.
  • the moisture indicator should preferably be easy to produce,
  • a substantial absence of water means a relative humidity of 0%
  • a moisture indicator in combination with a lyophilizate, which has a volume reduction in comparison to the substantial absence of water of at least 30%, more preferably 60%, particularly preferably 90% Presence of a defined relative air humidity of the surrounding air of at least 70%, more preferably 50%, even more preferably 30%, particularly preferably 1 0%,
  • the moisture indicator itself is a lyophilisate. This can considerably simplify the production of arrangements comprising at least one biological sample and at least one moisture indicator since, for example, it is possible to lyophilize the at least one biological sample and the moisture indicator at the same time,
  • the solution of the underlying problem according to the invention does not require the use of a carrier material on which the humidity-indicating system (compound, complex, composite material, etc.) is applied, since it itself is present as an independent lyophilisate.
  • the moisture indicator according to the invention is itself a lyophilisate and thus suitable for monitoring the moisture state of lyophilized samples present, for example, in adjacent cavities.
  • the moisture indicator after taking up a defined amount of at least 60% by weight of water, based on the initial weight of the dry moisture indicator, the moisture indicator completely dissolves.
  • the object underlying the present invention is further solved by the use of a moisture indicator selected from the group consisting of poly (acrylic acid-co-maleic acid), polyacrylic acid and / or a salt thereof in a lyophilizate.
  • the present invention initially relates to a lyophilizate comprising at least one moisture indicator which has a volume reduction compared to the substantial absence of water of at least 30%, more preferably 60%, most preferably 90%, in the presence of a defined relative humidity of ambient air of at least 70%, more preferably 50%, even more preferably 30%, most preferably 10%.
  • a moisture indicator is understood as meaning a single compound, but also a composition of several individual compounds.
  • the present invention relates to a lyophilizate comprising at least one moisture indicator selected from the group consisting of poly (acrylic acid-co-maleic acid), polyacrylic acid and / or a salt thereof.
  • the compound poly (acrylic acid-co-maleic acid) (CAS number 52255-49-9) provided according to the invention is preferably a copolymer having an average molecular weight of about 50,000; Further, the molar ratio of acrylic acid and maleic acid monomers is preferably about 1: 1. In particular, in the context of the present invention, the use of the sodium salt of poly (acrylic acid-co-maleic acid) is suitable.
  • the moisture indicator according to the invention itself preferably represents a lyophilizate
  • the content of moisture-indicating compound, based in each case on the lyophilisate is preferably 30 to 100% by weight, preferably 40 to 100% by weight, particularly preferably 50 to 100% by weight -%.
  • the moisture indicator provided according to the invention is preferably used as lyophilizate in combination with at least one further biologically active constituent, wherein the moisture indicator and the at least one biologically active constituent are spatially separated, but at the same time in the same atmosphere.
  • This further biologically active ingredient may, for example, be selected from the group consisting of blood, its constituents; Proteins, in particular enzymes; viruses; Bacteria; hormones; antibiotics; fatty acids; lipids; Carbohydrates of any chain length; vaccines; Low molecular weight chemical compounds, their salts and organics.
  • the moisture-indicating compound and / or the at least one biologically active constituent may, for example, be incorporated in a cavity on a PCR strip or in a well on a microtiter plate, a (possibly not) standardized reaction vessel, reaction spaces, microfluidic environments or consumables .
  • the lyophilisate of the moisture-indicating compound may generally be obtained from at least one aqueous solution of the moisture-indicating compound.
  • the aqueous solution may have a concentration of moisture-fixing compound, in each case based on the aqueous solution, of 0.01 to 20% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight, particularly preferably 0.25 to 2, 5 wt .-%, exhibit.
  • the aqueous solution may further comprise at least one further biologically active ingredient as defined above,
  • the lyophilizate according to the invention can be prepared, for example, according to the following procedure:
  • the water is sublimated, in which the product to be dried is dissolved. This is done at a vacuum that corresponds to the vapor pressure of the water at the temperature at which drying is to be carried out (eg: the product must be at least -40 ° C cold so that it does not change its structure during drying, ie lyophilized during the main drying with 0.1 2 mbar, this is the vapor pressure of the water at -40 ° C, so that the temperature to be dried product will be as long as -40 ° C, as water is still present).
  • the post-drying serves to remove the water molecules which are bound directly to the product to be dried. For this, a high vacuum of, for example, 0.001 mbar must be applied.
  • incubation means the time in which the mixture to be dried is frozen, the length of the incubation at a given glass transition temperature having an influence on the properties of the lyophilisate (especially on the appearance and structure of the freeze-drying cake) and can be suitably adapted by the skilled person.
  • the freezing provided in process step (ii) may be carried out at a temperature of -10 to -200 ° C, preferably -20 to -80 ° C, more preferably -30 to -50 ° C.
  • the duration of freezing may be 0.5 to 24 hours, preferably 0.5 to 8 hours, more preferably 1 to 3 hours,
  • the temperature can be raised to room temperature. Drying preferably takes place at at least 20 ° C. and a vacuum of 0.1 to 0.00001 mbar, more preferably 0.01 to 0.0001 mbar, particularly preferably 0.01 to 0.001 mbar, for a period of preferably 0 to 72 hours, more preferably 1 to 24 hours , more preferably 3 to 10 hours.
  • the lyophilisate according to the invention is preferably provided in a PCR vessel, in particular a PCR tube.
  • hygroscopic substances are added to the indicator solution to be lyophilized.
  • the lyophilisate changes its volume even at lower humidities than would be the case without addition.
  • the present invention relates to the use of a humectant-indicating compound which has a volume reduction compared to the substantial absence of water of at least 30%, more preferably 60%, most preferably 90%, in the presence of a defined relative humidity of the surrounding at least 70%, more preferably 50%, even more preferably 30%, more preferably 10%, of the moisture content,
  • Another object of the present invention is the use of a moisture keitsindigoingden compound selected from the group consisting of poly (acrylic acid-co-maleic acid), polyacrylic acid and / or a Saiz thereof, in a lyophilisate, for moisture indication.
  • the moisture indication is in a lyophilizate.
  • Another object of the present invention is a method for monitoring the moisture content of a lyophilisate, characterized in that (i) a lyophilisate comprising at least one moisture-proofing compound according to the invention is provided; and
  • the volume of the moisture-indicating compound can be monitored visually, and it can further be provided that the monitoring of the volume of the moisture-indicating compound takes place by comparison observation with an equivalent blank.
  • LoC lab-on-a-chip
  • PAMA poly (acrylic acid-co-maleic acid), Na salt
  • PEG polyethylene glycol
  • Lyophilisaten synonym for freeze-drying
  • MTP microtiter plate
  • a freeze-drying PAMA solution forms a dense network of PAMA as a solid. This is to be recognized by the fact that PAMA lyophilisates have a white body, which the person skilled in the art calls "cake". This is not unusual in itself. Surprising, however, was the observation that this cake disappears on exposure to moist air, as follows 50 ⁇ of a 0.5% or 5% PAMA solution was filled into PCR strips and freeze-dried (freezing at -80 ° C., incubation at -50 ° C.
  • the right four tubes contain the corresponding lyophilisates, starting from the 0.5% PAMA solution (1, and 2 nd tube from the left) and twice from the 5% PAMA solution (3 and 4, tubes from the left).
  • tube 2 (from the left) on both images with the inscription "0.5" contains the lyophilisate which was obtained starting from the 0.5% PAMA solution (left) (FIG.
  • FIGS. 2 a and 2 b A comparison of FIGS. 2 a and 2 b (same arrangement of the tubes as in FIGS. 1 a and b) shows, as already mentioned, that the 5% PAMA lyophilisate shows no change in its morphology even after incubation for 1 5 min, Trial 2:
  • FIG. 3 shows a time series of the humidification of PAMA lyophilizates (0 hours to 10 days).
  • MTP wells were described externally with a red permanent marker, resulting in a red area.
  • 2 MTP wells each were filled with 200 ⁇ 0, 1% / 0.5% / 2% / 5% PAMA incl. 2 ⁇ malachite green solution each. Thereafter, the filled MTP was freeze-dried as described in experiment 1,
  • the thus prepared MTP was successively 1 4 d on the laboratory bench (20 ° C, 35% rel, LF), 1 0 d in a desiccator (22 ° C, 45% rel, LF) and 2 d in a desiccator (22 ° C, 75% rel, LF). After 2 days on the bench, there was no further change in the PAMA cake at 35% rel. LF more recognizable ( Figure 5a). After 10 days at 45% rel, LF, the 0.1% and 0.5% PAMA cakes had shrunk (Figure 5b). After 2 days at 75% rel. Finally, all PAMA cakes had shrunken (Figure 5c).
  • FIG. 6 shows the freeze-dried cakes of 0.5% solutions of PAA, PEG8000, PEG35000, PEG3000 in the stated sequence from left to right.
  • Experiment 6 Quantification of the Water Consumption by the PAMA Lyophilisate
  • Table 1 Weight gain of PAMA lyophilisates (prepared according to approach a)) when incubated at different humidities
  • Table 2 Weight gain of PAMA lyophilisates (prepared according to approach b)) when incubated at different humidities
  • 11a and 11b show tubes from left to right with the following CsF & PAMA concentrations: OmM & 0.5%, 20mM & 0.5%, 30mM & 0.5%, 40mM & 0 , 5%, 50mM & 1%, 60mM & 1%, 70m & 1%, 80mM & 1%.
  • CsF & PAMA concentrations OmM & 0.5%, 20mM & 0.5%, 30mM & 0.5%, 40mM & 0 , 5%, 50mM & 1%, 60mM & 1%, 70m & 1%, 80mM & 1%.
  • Figure 1a shows the batches immediately after lyophilization: first row from above: 2x each 25 ⁇ 0.25%, 0.5%, 1%, 2.5% PAMA; second row from the top: 2x 25 ⁇ each 5% PAMA, 2x each 50 ⁇ 0.25%, 0.5%, 1% PAMA; third row from the top: 2x each 50 ⁇ 2.5%, 5% PAMA; 2x each ⁇ ⁇ 0.25%, 0.5% PAMA; bottom row: 2x each ⁇ ⁇ 1%, 2.5%, 5% PAMA,
  • FIG. 1b shows the same approaches as FIG. however, after the one-day incubation at 45% relative humidity

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Abstract

PAMA nimmt bei Inkubation in feuchter Luft vergleichsweise große Mengen an Wasser auf (% Feststoffgewicht). Damit einher geht eine starke Veränderung des Lyophilisats aus trockenem und vernetztem PAMA. Diese Veränderung manifestiert sich in einem Zusammenschrumpfen des ursprünglichen Lyophilisats. Es kann vermutet werden, dass beide Beobachtungen (Wasseraufnahme und Schrumpfen) ursächlich in Zusammenhang stehen.

Description

FEUCHTIGKEITSINDIKATOR
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lyophilisat, welches mindestens eine feuchtigkeits- indizierende Verbindung aufweist. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Poly(acrylsäure-co-maleinsäure), Polyacrylsäure und/oder einem Salz davon, zur Feuchtigkeitsindikation sowie ein Verfahren zur Überwachung des Feuchtigkeitsgehalts von einem Lyophilisat. Die Gefriertrocknung, auch als Lyophilisation oder Sublimationstrocknung bezeichnet, ist ein Verfahren zur schonenden Herstellung hochwertiger Produkte, Bei der Gefriertrocknung verdampfen die Eiskristalle direkt ohne den Übergang in den flüssigen Zustand, Das Endprodukt der Gefriertrocknung wird als Lyophilisat bezeichnet, In der Biotechnologie und Pharmaindustrie dient die Gefriertrocknung der Stabilisierung und Haltbarmachung von flüssigen Reagenzienformulierungen, wie Pharmaka und Enzymlösungen, Mit dieser Methode ist es beispielsweise möglich, die Aktivität von empfindlichen Enzymen bei Raumtemperatur für lange Zeit aufrecht zu erhalten, Um den Inhalt der getrockneten Probe einzusetzen (als Pharmakum oder für biologische Reakti- onen, wie beispielsweise der PCR (Polymerase Chain Reaction (PCR, Polymerase Kettenreaktion))) wird das Lyophilisat mit einem adäquaten Lösungsmittel, bei welchem es sich in der Regel um Wasser handelt, versetzt. Dies führt zu einer sofortigen Rücklösung der getrockneten Inhaltsstoffe, welche dann in Lösung wieder ihre ursprüngliche Wirkung entfalten.
Die Handhabung von Lyophilisaten wird durch die Gegenwart von Feuchtigkeitsindikatoren erleichtert, welche den Gehalt an Feuchtigkeit in dem Lyophilisat angeben. Die auf dem Markt erhältlichen Feuchtigkeitsindikatoren beruhen im Wesentlichen auf einer Farbreaktion getrockneter Salze beim Rückfeuchten des Lyophilisats. Das Indikatorsys- tem kann dabei direkt auf ein Trocknungsmittel oder auf ein Trägermaterial, beispielsweise Papier, aufgetragen sein. Im Allgemeinen schließt sich an dieses Auftragen eine Trocknung des resultierenden Indikatorsystems an, so dass dieses in einem farblichen Ausgangszustand „trocken" vorliegt. Kommt das Indikatorsystem anschließend mit Feuchtigkeit in Berührung, verändert das System seine Farbe. Durch die Auswahl geeig- neter Systeme ist dadurch die genaue Luftfeuchte bzw, die Materialfeuchte der Trägermaterialien bestimmbar.
Üblicherweise verwendete Trocknungsmittel sind Silikagele, Tonerde oder Molekularsie- be.
Ein Beispiel, nach welchem ein Feuchtigkeitsindikator mit Farbumschlag hergestellt werden kann, offenbart das US-Patent US 6,655,31 5, In diesem US-Patent wird ein Feuchtigkeitsindikator beschrieben, welcher einen mit Kupferchlorid oder mit einem oder mehre- ren, zur Freisetzung von Cu2+-lonen fähigen Salzen gefärbt ist, Zusätzlich umfasst der Feuchtigkeitsindikator ein oder mehrere Metallchloride, Nachteilig an diesem Indikationssystem ist im Wesentlichen, dass es ein Verbundstoff aus mehreren Komponenten ist, die vor der Verwendung des Feuchtigkeitsindikators erst in speziellen Verhältnissen gemischt werden müssen, Darüber hinaus ist es bei einigen biologischen Proben uner- wünscht, wenn farbige Feuchtigkeitsindikatoren verwendet werden, da durch die Farbe des Indikators bzw, den auftretenden Farbumschlag eine optische Beeinträchtigung der Probe auftreten kann. Hinzu kommt noch, dass der in US 6,655,31 5 beschriebene Feuchtigkeitsindikator schon deshalb keiner biologischen Reaktion zugesetzt werden würde, weil er auch im Wesentlichen aus Trägermaterial und meist zweiwertigen Salzen (Co2+, Mg2+, Cr2+ etc.) besteht, Letztere sind oftmals stark inhibitorisch auf Enzymreaktionen, wie eine PCR, Darüber hinaus wird in dem US-Patent US 6,665,31 5 die Verwendung von Feuchtigkeitsindikatoren in Lyophilisaten überhaupt nicht erwähnt,
Die WO 92/02804 A offenbart einen Feuchtigkeitsindikator, der Kobaltthiocyanat als Indl- kaformaterial und ein hygroskopisches Salz umfasst, Das hygroskopische Salz wird ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Kupferchlorid, Natriumchlorid und Kaliumchlorid, Dieses Indikatorsystem eignet sich aufgrund der verwendeten Komponenten nicht zur Verwendung in empfindlichen biologischen Lyophilisaten, Zusätzlich wird in der WO 92/02804 A nicht erwähnt, dass sich der Feuchtigkeitsindikator überhaupt für die An- wendung in Lyophilisaten eignet.
Demgemäß stellt sich die vorliegende Erfindung die Aufgabe, ein Indikatorsystem für Feuchtigkeit in Lyophilisaten bereitzustellen, welches insbesondere die zuvor beschriebenen Nachteile nicht aufweist, Insbesondere stellt sich die vorliegende Erfindung die Aufgabe, einen Feuchtigkeitsindikator bereitzustellen, der in Kombination mit Lyophilisaten von biologischen Proben verwendet werden kann, Unter diesem Gesichtspunkt wird dabei jedoch nicht verstanden, dass die biologische Probe unmittelbar zusammen mit dem Feuchtigkeitsindikator auf- bewahrt wird, sondern insbesondere, dass der Feuchtigkeitsindikator räumlich getrennt von der biologischen Probe aufbewahrt wird, jedoch sich in der gleichen Atmosphäre wie die biologische Probe befindet. Sollte es in solch einer Anordnung, umfassend - räumlich voneinander getrennt, jedoch in der gleichen Atmosphäre - mindestens eine biologische Probe und mindestens einen Feuchtigkeitsindikator zu einer Feuchtigkeits- aufnähme kommen, soll dieses von dem getrennt vorliegenden Feuchtigkeitsindikator angezeigt werden. Dabei sollte sich der Feuchtigkeitsindikator vorzugsweise leicht herstellen lassen,
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden Untersuchungen an unterschiedlichen Indikatorsystemen zur Anwendung bei Lyophilisaten durchgeführt und es wurde festgestellt, dass sich im Allgemeinen Verbindungen als Indikatorsystem in Lyophilisaten eignen, welche eine Volumenreduktion im Vergleich zur im Wesentlichen Abwesenheit von Wasser von mindestens 30 %, weiter bevorzugt 60 %, besonders bevorzugt 90 %, in Gegenwart einer definierten relativen Luftfeuchte der umgebenden Luft von mindestens 70 %, bevorzugter 50 %, noch bevorzugter 30 %, besonders bevorzugt 1 0 %, aufweisen,
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einer im Wesentlichen Abwesenheit von Wasser eine relative Luftfeuchtigkeit von 0 % verstanden,
Gelöst wird die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe daher zunächst durch die Verwendung von einem Feuchtigkeitsindikator in Kombination mit einem Lyophilisat, welcher eine Volumenreduktion im Vergleich zur im Wesentlichen Abwesenheit von Wasser von mindestens 30 %, weiter bevorzugt 60 %, besonders bevorzugt 90 %, in Gegenwart einer definierten relativen Luftfeuchte der umgebenden Luft von mindestens 70 %, bevorzugter 50 %, noch bevorzugter 30 %, besonders bevorzugt 1 0 %, aufweist,
Dabei ist es insbesondere bevorzugt, wenn der Feuchtigkeitsindikator selbst ein Lyophilisat ist, Dadurch kann die Herstellung von Anordnungen, umfassend mindestens eine biologische Probe und mindestens einen Feuchtigkeitsindikator, erheblich vereinfacht werden, da es beispielsweise möglich ist, die mindestens eine biologische Probe und den Feuchtigkeitsindikator zeitgleich zu lyophilisieren,
Darüber hinaus benötigt die erfindungsgemäße Lösung des zugrundeliegenden Prob- lems nicht die Verwendung von einem Trägermaterial, auf welchem das die Feuchtigkeit indizierende System (Verbindung, Komplex, Verbundmaterial etc.) aufgebracht ist, da es selbst als eigenständiges Lyophilisat vorliegt.
Der erfindungsgemäße Feuchtigkeitsindikator ist also selbst ein Lyophilisat und damit inherent dazu geeignet, den Feuchtigkeitszustand von lyophilisierten Proben, die beispielsweise in benachbarten Kavitäten vorliegen, zu überwachen,
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung löst sich der Feuchtigkeitsindikator nach Aufnahme einer definierten Menge von mindestens 60 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Ausgangsgewicht des trockenen Feuchtigkeitsindikators, vollständig auf.
Gelöst wird die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ferner durch die Verwendung von einem Feuchtigkeitsindikator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Poly(acrylsäure-co-maleinsäure), Polyacrylsäure und/oder einem Salz davon, in einem Lyophilisat.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung zunächst ein Lyophilisat, umfassend mindestens einen Feuchtigkeitsindikator, welcher eine Volumenreduktion im Vergleich zur im Wesentlichen Abwesenheit von Wasser von mindestens 30 %, weiter bevorzugt 60 %, besonders bevorzugt 90 %, in Gegenwart einer definierten relativen Luftfeuchte der umgebenden Luft von nnindestens 70 %, bevorzugter 50 %, noch bevorzugter 30 %, besonders bevorzugt 1 0 %, aufweist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einem Feuchtigkeitsindikator eine einzelne Verbindung, jedoch auch eine Zusammensetzung mehrerer einzelner Verbindungen verstanden, Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Lyophilisat, umfassend mindestens einen Feuchtigkeitsindikator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Po- ly(acrylsäure-co-maleinsäure), Polyacrylsäure und/oder einem Salz davon. Bei der erfindungsgemäß vorgesehenen Verbindung Poly(acrylsäure-co-maleinsäure) (CAS-Nummer 52255-49-9) handelt es sich vorzugsweise um ein Copolymer mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von ungefähr 50000; ferner ist das molare Verhältnis von Acrylsäure- und Maleinsäure-Monomeren vorzugsweise ungefähr 1 : 1 . Insbesondere eignet sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Verwendung des Natriumsalzes der Poly(acrylsäure-co-maleinsäure).
Da der erfindungsgemäße Feuchtigkeitsindikator selbst vorzugsweise ein Lyophilisat darstellt, beträgt der Gehalt an feuchtigkeitsindizierender Verbindung, jeweils bezogen auf das Lyophilisat, vorzugsweise 30 bis 1 00 Gew,-%, bevorzugt 40 bis 1 00 Gew.-%, besonders bevorzugt 50 bis 1 00 Gew,-%.
Der erfindungsgemäß vorgesehene Feuchtigkeitsindikator wird vorzugsweise als Lyophilisat in Kombination mit zusätzlich mindestens einem weiteren biologisch aktiven Be- standteil verwendet, wobei der Feuchtigkeitsindikator und der mindestens eine biologisch aktive Bestandteil räumlich voneinander getrennt vorliegen, jedoch gleichzeitig sich in der gleichen Atmosphäre befinden.
Dieser weitere biologisch aktive Bestandteil kann beispielsweise ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Blut, dessen Bestandteile; Proteine, insbesondere Enzyme; Viren; Bakterien; Hormone; Antibiotika; Fettsäuren; Lipide; Kohlenhydrate mit beliebiger Kettenlänge; Impfstoffe; niedermolekulare chemische Verbindungen, deren Salze und Organika. Die feuchtigkeitsindizierende Verbindung und/oder der mindestens eine biologisch aktive Bestandteil kann beispielsweise in einer Kavität auf einem PCR-Streifen eingebracht sein oder in einer Kavität auf einer Mikrotiterplatte, einem (ggf. nicht) standardisierten Reagiergefäß, in Reaktionsräumen, in mikrofluidischen Umgebungen oder Verbrauchsmaterialien vorliegen, Das Lyophilisat der feuchtigkeitsindizierenden Verbindung kann im Allgemeinen ausgehend von zumindest einer wässrigen Lösung der feuchtigkeitsindizierenden Verbindung erhalten werden. Die wässrige Lösung kann dabei eine Konzentration an feuchtigkeitsin- dizierender Verbindung, jeweils bezogen auf die wässrige Lösung, von 0,01 bis 20 Gew,- %, bevorzugt 0,1 bis 5 Gew,-%, besonders bevorzugt 0,25 bis 2,5 Gew.-%, aufweisen. Die wässrige Lösung kann ferner zumindest einen weiteren biologisch aktiven Bestandteil gemäß der oben stehenden Definition umfassen,
Das erfindungsgemäße Lyophilisat kann beispielsweise gemäß folgender Verfahrens- weise hergestellt werden:
Herstellen einer wässrigen Lösung, umfassend mindestens eine erfindungsgemäße feuchtigkeitsindizierende Verbindung;
Einbringen bzw. Aufbringen der hergestellten Mischung in eine Kavität bzw. sonstige Oberfläche;
Einfrieren und Inkubieren der aus Verfahrensschritt (ii) resultierenden Mischung; und
Trocknen der aus Verfahrensschritt (iii) resultierenden Mischung in einem geeigneten Vakuum, wobei die Trocknungsphase eine Haupttrocknung und eine Nachtrocknung bei geeigneten Unterdrücken umfassen kann.
Während der Haupttrocknung wird das Wasser sublimiert, in dem das zu trocknende Produkt gelöst ist. Dies geschieht bei einem Vakuum, das dem Dampfdruck des Wassers bei der Temperatur entspricht, bei der die Trocknung durchführen möchte (Bsp.: das Produkt muss mindestens -40 °C kalt sein, damit es seine Struktur während der Trocknung nicht verändert, also lyophilisiert man während der Haupttrocknung mit 0.1 2 mbar, Dies ist der Dampfdruck des Wassers bei -40 °C, Dadurch wird die Temperatur zu trocknende Produkts solange bei -40 °C liegen, wie noch Wasser vorhanden ist). Die Nachtrocknung dient dazu, die Wassermoleküle zu entfernen, die direkt an das zu trocknende Produkt gebunden sind, Dazu muss ein Hochvakuum von bsp, 0.001 mbar angelegt werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter einer Inkubation die Zeit verstanden, in der die zu trocknende Mischung eingefroren wird, wobei die Länge der Inkubation bei einer gegebenen Einfriertemperatur einen Einfluss auf die Eigenschaften des Lyophilisats (speziell auf Aussehen und Struktur des Gefriertrocknungskuchens) aufweist und von dem Fachmann geeignet angepasst werden kann.
Das im Verfahrensschritt (ii) vorgesehene Einfrieren kann bei einer Temperatur von -10 bis -200 °C, bevorzugt -20 bis -80 °C, besonders bevorzugt -30 bis -50 °C, erfolgen. Die Dauer des Einfrierens kann 0,5 bis 24 Stunden, bevorzugt 0,5 bis 8 Stunden, besonders bevorzugt 1 bis 3 Stunden, betragen,
Während dieses Trocknungsschritts kann die Temperatur bis auf Raumtemperatur erhöht werden. Ein Nachtrocknen erfolgt vorzugsweise bei mindestens 20°C und einem Vakuum von 0.1 bis 0.00001 mbar, weiter bevorzugt 0,01 bis 0.0001 mbar, besonders bevorzugt 0.01 bis 0.001 mbar, für einen Zeitraum von vorzugsweise 0 bis 72 Stunden, weiter bevorzugt 1 bis 24 Stunden, besonders bevorzugt 3 bis 1 0 Stunden. Das erfindungsgemäße Lyophilisat wird vorzugsweise in einem PCR-Gefäß, insbesondere einem PCR-Röhrchen, bereitgestellt.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der zu lyophilisieren- den Indikatorlösung hygroskopische Substanzen zugesetzt. Dies führt dazu, dass das Lyophilisat sein Volumen bereits bei geringeren Luftfeuchten verändert ,als dies ohne Zusatz der Fall wäre.
Für die Wasseraufnahme und damit Gewichtszunahme ist im Wesentlichen die absolute Menge an feuchtigkeitsindizierender Verbindung in dem Lyophilisat entscheidend. Für die Volumenreduktion ist jedoch insbesondere die Prozentualst an feuchtigkeitsindizierender Verbindung in der Ursprungslösung (d.h. vor dem Lyophilisieren) von entscheidender Bedeutung: Das heißt, je höher die Ausgangskonzentration in der Lösung vor dem Trocknen, desto höher muss die Luftfeuchte sein, damit das Lyophilisat seine Gestalt verändert.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von einer feuchfig- keitsindizierenden Verbindung, welche eine Volumenreduktion im Vergleich zur im Wesentlichen Abwesenheit von Wasser von mindestens 30 %, weiter bevorzugt 60 %, besonders bevorzugt 90 %, in Gegenwart einer definierten relativen Luftfeuchte der um- gebenden Luft von mindestens 70 %, bevorzugter 50 %, noch bevorzugter 30 %, besonders bevorzugt 1 0 % autweist, zur Feuchtigkeitsindikation,
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von einer feuchtig- keitsindizierenden Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Po- ly(acrylsäure-co-maleinsäure), Polyacrylsäure und/oder einem Saiz davon, in einem Lyophilisat, zur Feuchtigkeitsindikation.
Gemäß den vorstehenden Erläuterungen erfolgt die Feuchtigkeitsindikation in einem Lyophilisat.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Überwachung des Feuchtigkeitsgehalts von einem Lyophilisat, dadurch gekennzeichnet, dass (i) ein Lyophilisat, umfassend mindestens eine erfindungsgemäße feuchtig- keifsindizierende Verbindung bereitgestellt wird; und
(ii) das Volumen der feuchtigkeitsindizierenden Verbindung beobachtet wird,
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Volumen der feuchtigkeitsindizieren- den Verbindung visuell überwacht werden, wobei es des Weiteren vorgesehen sein kann, dass das Beobachten des Volumens der feuchtigkeitsindizierenden Verbindung durch Vergleichsbeobachtung mit einer äquivalenten Blindprobe erfolgt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele näher erläutert,
Begriffe und Abkürzungen, die im Folgenden benutzt werden:
LoC = Lab-on-a-Chip
PAMA = Poly(acrylsäure-co-maleinsäure), Na Salz
PEG = Polyethylenglykol
Lyophilisaten = Synonym für Gefriertrocknung
MTP = Mikrotiterplatte
rel. LF = relative Luftfeuchte Versuch 1 : Veränderung der Gestalt von gefriergetrocknetem PAMA durch Feuchteeinwirkung
Eine PAMA-Lösung bildet beim Gefriertrocknen ein dichtes Netzwerk an PAMA als Fest- stoff. Dies ist zu daran zu erkennen, dass PAMA-Lyophilisate einen weißen Körper besitzen, den der Fachmann als„Kuchen" bezeichnet, Dies ist an sich nichts Ungewöhnliches, Überraschend hingegen war die Beobachtung, dass dieser Kuchen bei Einwirkung von feuchter Luft verschwindet, wie folgender Versuch zeigt, 50 μΙ einer 0,5%- bzw, 5%-PAMA-Lösung wurde in PCR-Streifen gefüllt und gefriergetrocknet (Einfrieren bei -80 °C, 2 h Inkubation bei -50 °C, Trocknung im Vakuum (0,2 mbar) bei steigenden Temperaturen (-40 °C bis 20 °C), Nachtrocknung bei 20 °C und 0,002 mbar). In den Deckel der Lyophilisat-bestückten PCR-Tubes wurden 1 0 μΙ Wasser pipettiert und das Tube mit dem passenden Deckel verschlossen, Im Falle des 0,5%- PAMA-Lyophilisats begann der Kuchen nach 2 - 4 min„dahinzuschmelzen". Er verringerte sein Volumen und die Oberfläche sah zunehmend glasig aus (Figur 1 ), Das 5%- PAMA-Lyophilisat hingegen zeigte auch nach 1 5 min Inkubation keine Veränderung seiner Morphologie (Figur 2). Die Ergebnisse des Versuches 1 sind in den Figuren 1 a und 1 b dargestellt. Dabei umfassen die rechten vier Tubes die entsprechenden Lyophilisate, zweimal ausgehend von der 0,5 % PAMA-Lösung (1 , und 2. Tube von links) und zweimal ausgehend von der 5 % PAMA-Lösung (3 und 4, Tubes von links), In den Figuren l a und 1 b enthält Tube 2 (von links) auf beiden Bildern mit der Aufschrift„0,5" das Lyophilisat, welches ausgehend von der 0, 5%-PAMA-Lösung erhalten wurde (Links (Figur l a): vor Feuchte-Inkubation, Rechts (Figur 1 b): Feucht-Inkubation für 1 5 min), Man erkennt, dass sich das Lyophilisat in Tube 2 (von links) nach der Feucht-Inkubation aufgelöst hat, während das Lyophilisat, welches ausgehend von der 5%-PAMA-Lösung erhalten wurde, sich nach der gleichen Feucht- Inkubation noch nicht aufgelöst hat (auf dem rechten Bild (Figur 1 b) befinden sich die Lyophilisate im Deckel der Tubes 3 und 4),
Ein Vergleich der Figuren 2a und 2b (gleiche Anordnung der Tubes wie in Figuren 1 a und b) zeigt, wie bereits erwähnt, dass das 5%-PAMA-Lyophilisat auch nach 1 5 min Inkubation keine Veränderung seiner Morphologie zeigt, Versuch 2:
Im Folgenden ist ein Experiment gezeigt, bei dem 0,5% / 1 % / 5% / 1 0%-PAMA- Lösungen gefriergetrocknet und anschließend relativen Lufffeuchten von 43 - 59 % ausgesetzt wurden. Die verschiedenen PAMA-Kuchen wurden wie oben beschrieben in PCR-Tubes hergestellt. Dann wurden die PCR-Tubes in einem Exsikkator in Gegenwart einer CaCl2-Lösung inkubiert (offen, ohne Deckel) und in Intervallen fotodokumentiert, Die relative Luftfeuchte in dem Exsikkator betrug dadurch 43 % (zu Beginn) bis 59 % (am Ende des Experiments). Abbildung 3 zeigt, dass der 0,5%-PAMA-Kuchen nach weniger als 2 h bereits stark geschrumpft ist. Für den gleichen Effekt brauchte der 1 %-Ansatz ca. 3 h, der 5%-Ansatz mehr als 5 h. Der 1 0%-Ansatz zeigte erst bei der finalen Fotodokumentation nach 1 0 Tagen ein vollständig geschrumpftes Lyophilisat. Allgemein war die finale Größe des feuchtgewordenen PAMA-Kuchens proportional zur vorhandenen PAMA-Menge,
Die Ergebnisse sind in der Figur 3 dargestellt, welche eine Zeitreihe des Feuchtwerdens von PAMA-Lyophilisaten (0 Stunden bis 1 0 Tage) zeigt.
Versuch 3:
Die folgenden beiden Experimente zeigen mit einfachsten Mitteln, wie man den Effekt des„Zusammenschmelzens" von PAMA für einen Feuchtigkeitsindikator nutzen kann.
Ein Parafilm wurde von unten mit dem englischen Wort„humid" beschrieben. Danach wurde auf die Oberseite des Parafilms eine 0,5%-PAMA-Lösung aufgebracht und wie im Versuch 1 beschrieben gefriergetrocknet,
Der so vorbereitete PAMA-Kuchen auf Parafilm wurde in ein halboffenes Plastikkästchen gelegt, in dem sich 4 ml Wasser befanden, Die Veränderungen des PAMA-Kuchens wurden über die nächsten 1 ,5 h fotografisch dokumentiert (Abb. 4). Man sieht deutlich, wie der PAMA-Kuchen quasi unsichtbar wird und den darunterliegenden Schriftzug„humid" also„feucht" erkennen lässt. Figur 4α zeigt links den gefriergetrockneten PAMA-Kuchen vor dem Feuchtwerden, Figur 4b zeigt den PAMA-Kuchen nach 45min an feuchter Luft und Figur 4c zeigt den PAMA- Kuchen nach 1 h 45min an feuchter Luft. Versuch 4:
Die MTP-Vertiefungen wurden von außen mit rotem Permanentmarker beschrieben, sodass sich eine rote Fläche ergab. Je 2 MTP-Vertiefungen wurden mit je 200 μΙ 0, 1 % / 0,5% / 2% / 5% PAMA inkl. je 2 μΙ Malachitgrünlösung befüllt. Danach wurde die befüllte MTP wie im Versuch 1 beschrieben gefriergetrocknet,
Die so präparierte MTP wurde nacheinander 1 4 d auf der Laborbank (20 °C, 35 % rel, LF), 1 0 d im Exsikkator (22 °C, 45 % rel, LF) sowie 2 d im Exsikkator (22 °C, 75 % rel, LF) gelagert, Nach 2 Tagen auf der Laborbank war keine weitere Veränderung der PAMA- Kuchen bei 35 % rel. LF mehr zu erkennen (Figur 5a). Nach 10 Tagen bei 45 % rel, LF waren die 0,1 %- und 0,5%-PAMA-Kuchen geschrumpft (Figur 5b). Nach 2 Tagen bei 75 % rel. LF waren schließlich alle PAMA-Kuchen zusammengeschrumpft (Figur 5c).
Versuch 5:
Dieses Experiment zeigt, dass nicht jede Polymersubstanz eine Volumenreduktion bei Feuchtwerden zeigt. Verglichen wurden Polyacrylsäure (PAA, Molekulargewicht 250.000), PEG3000, PEG8000 sowie PEG35000 (PEG = Polyethylenglykol). Je 1 00 μΙ dieser Substanzen wurden, wie bereits mehrfach beschrieben, in PCR-Tubes gefüllt und gefrierge- trocknet, Danach wurden die Lyophilisate steigenden Lufffeuchten ausgesetzt, Figur 6 zeigt, wie sich die Lyophilisat-Kuchen der einzelnen Chemikalien nach 8 Tagen Inkubation bei 75% rel, LF verändert haben, Man sieht deutlich, dass sich das Volumen des Kuchens aus Polyacrylsäure stark reduziert hat, Die PAA verhält sich folglich vergleichbar wie PAMA, Die drei PEG-Kuchen hingegen zeigen keinerlei Veränderung und sind folg- lieh nicht als Substanzgrundlage für einen Feuchtigkeitsindikator im Sinne der vorliegenden Erfindung geeignet.
In der Figur 6 sind die gefriergetrockneten Kuchen aus je 0,5%-Lösungen von PAA, PEG8000, PEG35000, PEG3000 in der angegebenen Reihenfolge von links nach rechts dargestellt. Versuch 6: Quantifizierung der Wasserauf nähme durch das PAMA-Lyophilisat
Um das Phänomen der extremen Volumenreduktion des PAMA-Kuchens bei Feuchtwerden besser zu verstehen, wurde bestimmt, bei welchen Luftfeuchtegraden die Ände- rung der Morphologie stattfindet und wie viel Wasser dabei aufgenommen wird.
Es wurden Lösungen mit verschiedenen PAMA-Konzentrationen (1 - 8 % w/v) sowie verschiedene Volumen einer 1 0%-PAMA-Lösung in PCR-Streifen pipettiert und wie im ersten Experiment beschrieben gefriergetrocknet. Die PCR-Tube-Streifen wurden zerschnitten und die einzelnen Tubes mit den Lyophilisaten gewogen, Diese wurden dann für 4 Tage einer relativen Luftfeuchte von ca, 60 % bei ca, 20 °C ausgesetzt, Nach Ablauf dieser Inkubationszeit wurden die PCR-Tubes erneut gewogen und die Gewichtsdifferenz bestimmt, Trägt man die aufgenommene Menge an Wasser (abzulesen an der Gewichtsdifferenz zwischen trockenem und feuchten Zustand) gegen die Ausgangsmenge an PAMA auf, sieht man eine ganz klare Proportionalität zwischen aufgenommener Wassermenge und ursprünglich eingetrocknetem PAMA-Lösungsvolumen (Figur 7a) bzw, der PAMA-Konzentration der eingetrockneten PAMA-Lösung (Figur 7b). Beide Beobachtungen legen nahe, dass die Menge des aufgenommen Wassers zwar von der initialen PAMA-Menge abhängig ist, nicht jedoch von der ursprünglichen PAMA-Konzentration.
Versuch 7:
Mit diesem Experiment lässt sich klar belegen, dass tatsächlich lediglich die absolut vorhandene PAMA-Menge und nicht die Konzentration der Ursprungslösung bestimmt, wie viel Wasser von einem PAMA-Gefriertrocknungskuchen aufgenommen wird.
Dazu wurden a) 20 - 1 00 μΙ 1 0% PAMA-Lösungen und b) je 80 μΙ 1 - 8 %-PAMA-Lösungen in PCR-Tubestrips gefüllt (als Triplikat) und wie eingangs beschrieben gefriergetrocknet, Die Gewichte der trockenen PAMA-Kuchen wurden mit einer Feinwaage bestimmt. An- schließend wurden die offenen Tubes steigenden Luftfeuchten (9%, 33%, 45%, 75%) ausgesetzt, wobei jeweils ca. 1 Woche bei einer bestimmten Luftfeuchte inkubiert wurde. Vor jedem Wechsel zur nächsthöheren LF wurde das Gewicht der PAMA-Kuchen erneut bestimmt.
Aus den Figuren 8a und 8b sowie Tabellen .1 und 2 geht hervor, dass beide Ansätze, sowohl a) als auch b), die gleiche Gewichtszunahme pro Milligramm PA- MA-Ausgangsgewicht aufweisen,
Tabelle 1 : Gewichtszunahme von PAMA-Lyophilisaten (hergestellt nach Ansatz a)) bei Inkubation an verschiedenen Luftfeuchten
Figure imgf000014_0001
Mittlere Gewichtszunahme [Gew.-%]: 22 28 67
Tabelle 2: Gewichtszunahme von PAMA-Lyophilisaten (hergestellt nach Ansatz b)) bei Inkubation an verschiedenen Luftfeuchten
Figure imgf000014_0002
Mittlere Gewichtszunahme [Gew,-%]:
Versuch 8: In diesem Experiment wurde bestimmt, wie viel Wasser PEG-Lyophilisate (PEG = Poly- ethylenglykol) im Vergleich zu PAMA-Lyophilisaten aufnehmen, Dazu wurden abermals je 4x Ι ΟΟμΙ 5% PAMA- bzw, PEG8000-Lösungen in PC -Tubes gefriergetrocknet (Figur 9a: 4 Tubes links mit PAMA und 4 Tubes rechts mit PEG8000), Die Gewichte der trockenen Substanzen wurden bestimmt, Anschließend wurden die Lyophilisate für 4 Tage einer relativen Luftfeuchte von 75% ausgesetzt und erneut gewogen. Figuren 9a und 9b zeigen Fotos der Ansätze vor und nach dem Feuchtwerden. Es ist deutlich zu erkennen, dass die PEG8000-Lyophilisate (4 Tubes von rechts) keine Volumenreduktion aufwiesen, während die PAMA-Lyophilisate (4 Tubes von links) sehr stark zusammenschrumpften (Figur 8b), Die Gewichtsbestimmung ergab, dass die PAMA-Ansätze bei gleichem Feststoffgewicht mit 3,35 mg ca, dreimal mehr Wasser aufgenommen hatten als die PEG8000-Ansätze (1 ,05 mg). PAMA nimmt somit etwa 67% seines Eigenfeststoffgewichts an Wasser auf (Messwert durch mehrere Versuche bestätigt), während es bei PEG8000 nur 21 % sind. Vermutlich ist diese hohe Wasseraufnahmekapazität der Grund für die Lyophilisatveränderungen bei PAMA.
Versuch 9:
Es wurden Lösungen mit verschiedenen PAMA-Konzentrationen (0,01 - 1 % w/v) in Dupli- katen in PCR-Streifen pipettiert und wie im ersten Experiment beschrieben gefriergetrocknet. Das Ergebnis ist in Abbildung 1 0 zu sehen. Das Experiment zeigte, dass man mindestens 0,25% PAMA in Lösung haben muss, damit die Gefriertrocknung einen Kuchen von guter Qualität erzeugt, Figur 1 0 zeigt Gefriertrocknungskuchen von Lösungen mit steigenden PAMA- Konzentrationen (von links oben nach rechts unten: (je 2x) 0,01 % / 0,025% / 0,05% / 0, 1 % / 0,25% / 0,5% / 1 %),
Versuch 1 0:
Es wurden Lösungen mit verschiedenen PAMA- (0,5 bzw, 1 % w/v) und Cäsiumfluorid- Konzentrationen (0/20/30/40mM bzw, 50/60/70/80 mM CsF) in PCR-Streifen pipettiert und wie im ersten Experiment beschrieben gefriergetrocknet (Figur 1 l a). Anschließend wurden die offenen Tubes nacheinander steigenden Luftfeuchten ausgesetzt (7 Tage 9%, 14 Tage 24%, 1 Tag 34%), Nach 1 Tag bei 34% rel, LF schrumpften die meisten Ansätze stark zusammen (Figur I I b), Man kann deutlich erkennen, dass das Ausmaß der Schrumpfung mit der Konzentration an CsF im Ansatz korreliert, Die Figuren 1 1 α und 1 1 b zeigen von links nach rechts Tubes mit folgenden CsF- & PA- MA-Konzentrationen: OmM & 0,5%, 20mM & 0,5%, 30mM & 0,5%, 40mM & 0,5%, 50mM & 1 %, 60mM & 1 %, 70m & 1 %, 80mM & 1 %. Versuch 1 1 :
Es wurden Lösungen mit verschiedenen Volumina (25 - 100 μΙ) von verschiedenen PA- A-Konzentrationen (0,25 - 5% w/v) wie im ersten Experiment beschrieben gefriergetrocknet, Figur 1 2a zeigt die Ansätze unmittelbar nach der Gefriertrocknung: erste Reihe von oben: je 2x je 25 μΙ 0,25%, 0,5%, 1 %, 2,5% PAMA; zweite Reihe von oben: 2x je 25 μΙ 5% PAMA, je 2x je 50 μΙ 0,25%, 0,5%, 1 % PAMA; dritte Reihe von oben: je 2x je 50μΙ 2,5%, 5% PAMA; je 2x je Ι ΟΟμΙ 0,25%, 0,5% PAMA; unterste Reihe: je 2x je Ι ΟΟμΙ 1 %, 2,5%, 5% PAMA,
Anschließend wurden die offenen Tubes einer relativen Luftfeuchte von 45% ausgesetzt, Bereits nach 3h schrumpften alle Lyophilisate mit 0,25% PAMA unabhängig vom eingetrockneten Ausgangsvolumen zusammen, Nach 1 Tag schließlich zeigten alle Ansätze mit kleiner gleich 1 % PAMA unabhängig vom Ausgangsvolumen eine starke Schrumpfung, Alle 2,5% PAMA-Ansätze schrumpften - unabhängig vom Ausgangsvolumen - nur sehr wenig, Nur die 5% PAMA-Ansätze zeigten - wiederum unabhängig vom Ausgangs- volumen - keinerlei Schrumpfung, Figur 1 2b zeigt die selben Ansätze wie Figur 1 2a, jedoch nach der eintägigen Inkubation bei 45% relativer Luftfeuchte,

Claims

Patentansprüche
1 . Lyophilisat, umfassend mindestens einen Feuchtigkeitsindikator, welcher eine Volumenreduktion im Vergleich zur im Wesentlichen Abwesenheit von Wasser von mindestens 30 % in Gegenwart einer definierten relativen Luftfeuchte der umgebenden Luft von mindestens 1 0 % aufweist.
Lyophilisat, umfassend mindestens einen Feuchtigkeitsindikator, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Poly(acrylsäure-co-maleinsäure), Polyacrylsäure und/oder einem Salz davon.
Lyophilisat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Lyophilisat das Natriumsalz der Poly(acrylsäure-co-maleinsäure) umfasst.
Lyophilisat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an Feuchtigkeitsindikator, jeweils bezogen auf das Lyophilisat, 30 bis 1 00 Gew.-%, bevorzugt 40 bis 1 00 Gew.-%, besonders bevorzugt 50 bis 1 00 Gew.-%, beträgt.
Lyophilisat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Lyophilisat gemäß folgender Verfahrensweise hergestellt wird:
(i) Herstellen einer wässrigen Lösung, umfassend mindestens eine feuchtig- keitsindizierende Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2;
(ii) Einbringen bzw, Aufbringen der hergestellten Mischung in eine Kavität bzw. sonstige Oberfläche;
(iii) Einfrieren und Inkubieren der aus Verfahrensschritt (ii) resultierenden Mischung; und
(iv) Trocknen der aus Verfahrensschritt (iii) resultierenden Mischung in einem geeigneten Vakuum, wobei die Trocknungsphase eine Haupttrocknung und eine Nachtrocknung bei geeigneten Unterdrücken umfassen kann.
6. Lyophilisat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Lyophilisat in einem PC -Gefäß, Insbesondere einem PCR-Röhrchen, bereitgestellt wird. , Anordnung, umfassend mindestens ein Lyophilisat nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und zusätzlich mindestens einen biologisch aktiven Bestandteil, dadurch gekennzeichnet, dass das Lyophilisat und der mindestens eine biologisch aktive Bestandteil räumlich voneinander getrennt vorliegen, jedoch in Kontakt mit der glei- chen Atmosphäre stehen, , Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine biologisch aktive Bestandteil ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Blut, dessen Bestandteile; Proteine, insbesondere Enzyme; Viren; Bakterien; Hormone; Antibiotika; Fettsäuren; Lipide; Kohlenhydrate mit beliebiger Kettenlänge; Impfstoffe; niedermolekulare chemische Verbindungen, deren Salze und Organika, , Anordnung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Feuchtigkeitsindikator und/oder der mindestens eine biologisch aktive Bestandteil jeweils getrennt voneinander in einer Kavität auf einem PCR-Streifen eingebracht ist oder in einer Kavität auf einer Mikrotiterplatte, einem gegebenenfalls nicht standardisierten Reagiergefäß, in Reaktionsräumen, in mikrofluidischen Umgebungen oder Verbrauchsmaterialien vorliegt, 10, Verwendung von mindestens einer feuchtigkeitsindizierenden Verbindung, welche eine Volumenreduktion von mindestens 30 % in Gegenwart einer definierten relativen Luftfeuchte der umgebenden Luft von mindestens 1 0 % aufweist,
1 1 , Verwendung von mindestens einer Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe be- stehend aus Poly(acrylsäure-co-maleinsäure), Polyacrylsäure und/oder einem Salz davon, zur Feuchtigkeitsindikation,
1 2, Verwendung nach Anspruch 1 0 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Feuchtigkeitsindikation in einem Lyophilisat erfolgt,
1 3, Verfahren zur Überwachung des Feuchtigkeitsgehalts von einem Lyophilisat, dadurch gekennzeichnet, dass
(i) ein Lyophilisat, umfassend mindestens eine feuchtigkeitsindizierende Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bereitgestellt wird; und (ii) das Volumen der feuchtigkeitsindizierenden Verbindung beobachtet wird, 1 4. Verfahren nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet dass das Volumen der feuchtigkeitsindizierenden Verbindung visuell überwacht wird. 1 5. Verfahren nach Anspruch 1 3 oder 1 4, dadurch gekennzeichnet dass das Beobachten des Volumens der feuchtigkeitsindizierenden Verbindung durch Vergleichsbeobachtung mit einer äquivalenten Blindprobe erfolgt,
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