WO2011158623A1 - 麹菌染色体における大領域重複の作製方法 - Google Patents

麹菌染色体における大領域重複の作製方法 Download PDF

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    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/50—Soya sauce

Definitions

  • strain belonging to the bacterium belonging to the genus Aspergillus used as the parent strain of the transformant of the present invention examples include Aspergillus soja, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus awamori and the like, among which Aspergillus awamori Strains belonging to Soya and Aspergillus oryzae are preferred.
  • the coding region of the transformation marker gene By culturing a transformant having such a structural feature, the coding region of the transformation marker gene incorporated between the corresponding chromosomes and outside the 5 ′ end or 3 ′ end of the target region, respectively. Homologous recombination between the homologous sequence regions present in common in the middle part of the RNA (parts shown by hatching in FIGS. 1, 2 and 10) via the repair mechanism at the time of double-strand break occurred, and the result A strain in which the target region is overlapped is obtained.
  • the “corresponding chromosome”, as shown in the Examples includes many genes encoding homologous chromosomes contained in the polynuclear of the transformant, for example, useful substances (for example, various enzymes) in each bacterium. It means a plurality of chromosomes such as No. 8 and No. 2 included.
  • a homologous sequence region existing in the middle part of the coding region of either or both of the transformation marker genes to be incorporated outside the 5 ′ and 3 ′ ends of the target region on the chromosome for duplication is previously added to the I Appropriate restriction enzyme recognition sites known to those skilled in the art such as -sceI, I-ceuI, PI-pspI and PI-sceI can be introduced.
  • restriction enzyme sites can be introduced by any means known to those skilled in the art, such as homologous recombination.
  • double-strand breaks are suitable between homologous sequence regions that are commonly present in the middle part of the coding region of the transformation marker gene. It utilizes homologous recombination through a repair mechanism that works when it occurs at a frequency.
  • the transformant is once made into a protoplast state by any method known to those skilled in the art, and is maintained under appropriate conditions for a certain period of time (for example, about several tens of minutes to about 1 hour), and then cultured.
  • a certain period of time for example, about several tens of minutes to about 1 hour
  • Chromosome duplication strain was prepared as follows. After adding 20 ⁇ l of PEG solution to a protoplast solution of about 2 ⁇ 10 7/100 ⁇ l, add 50 U or 0 U of I-SceI, hold on ice for 40 minutes, add 70 ⁇ l of PEG solution, and further at room temperature After holding for 20 minutes, they were regenerated on 1.2M sorbitol-CZ media plates. Strains that grew on CZ medium were used as chromosome duplication candidate strains for the subsequent analysis.
  • a vector (pH72-5′ ⁇ ) for integration was constructed. Subsequently, the vector containing H160 amplified using primers H160iU and H160iL was ligated with the phosphorylated 3′ ⁇ pyrG unit after amplification using primers pyrU and pyrL, and the 3′ ⁇ pyrG construct was incorporated into the H160 region. A vector for this purpose (pH 160-3′ ⁇ ) was constructed.
  • A.oryzae ⁇ pyrG strain was transformed with a vector (pB1035C-5′ ⁇ ) for incorporating a 5′ ⁇ pyrG construct into the intermediate region between B1035 and B1036.
  • the resulting transformants were examined by PCR and Southern hybridization. As a result, it was confirmed that the vector was integrated into the target site in one strain.
  • conidia were collected from this strain, about 1 ⁇ 10 5 was applied onto a CZ medium plate containing 5FOA, and the obtained 5FOA resistant strain was analyzed. As a result, 5' ⁇ pyrG was found in the middle region of B1035 and B1036. It was confirmed to have a construct.
  • a vector (pB1213C-3 ') for incorporating the 3' ⁇ pyrG construct into the intermediate region of B1212 and B1214 (for 499 kb region duplication) with the ⁇ pyrG strain having a 5' ⁇ pyrG construct in the intermediate region of B1035 and B1036 as the parent strain ⁇ ) was transformed.
  • a strain in which the vector was integrated into the intermediate region between B1212 and B1214 was selected using PCR and Southern hybridization, and conidia were collected. As a result, colonies showing resistance on the 5FOA-CZ plate were selected.

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Abstract

本発明の目的は、アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の大領域を広範囲に渡って重複させる技術を提供し、従来は取得不能であった新たな形質を持つアスペルギルス属に属する菌の取得を安定的・計画的に可能にすることであり、本発明は、形質転換マーカー遺伝子の配列を染色体中の任意の領域を挟むように該領域の５'及び３'末端の外側に配し、該遺伝子の内部の相同領域で発生する二重鎖切断の後の相同組換えによって染色体の重複が起きた形質転換体、及び、該形質転換体を培養することによってアスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複させる方法に係る。

Description

麹菌染色体における大領域重複の作製方法
本発明は、アスペルギルス属に属する菌の染色体において、任意の大領域を重複させる技術に関する。
アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae ）及びアスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）等の麹菌は、醤油、酒、味噌などの伝統的な食品の醸造や酵素の生産等のために工業的に広く用いられている、また近年の麹菌（アスペルギルス・オリゼ）の全ゲノム配列の決定やマイクロアレイを用いた網羅的な遺伝子発現解析などの進展に伴い、遺伝子工学的な改変、特に染色体レベルの改変により酵素等の生産性や増殖速度の改良などの効果が期待される糸状菌である。
更に、麹菌が生産する酵素は様々な産業に利用されている。例えば、日本の伝統食品である醤油製造においても、麹菌の生産する多様な酵素が利用されている。醤油製造では、麹菌を原料である大豆と小麦に生育させ、多様な酵素を生産させる。ここで麹菌が生産した多様な酵素は、大豆や小麦のタンパク質、糖質、脂質などを分解し、次工程の乳酸発酵、酵母発酵を促す。この過程で、麹菌が原料分解酵素を多量に生産すると、原料利用率や圧搾性が上がり生産性を大幅に向上させることができる。加えて、乳酸発酵、酵母発酵への基質が十分に供給されるため、発酵が適正に行なわれ、醤油の品質は大きく向上する。
Aspergillus nidulans, niger, fumigatus, awamoriなどのアスペルギルス属菌が単核の世代を持つのに対し、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ等の麹菌は分生子の状態も含めてその生活環において常に多核の状態を保ち、これまでのところ有性世代が確認されておらず、親細胞から娘細胞への核の分配機構についても解明されていない。そのために、菌株間の交配やＲＩＰ（repeat induced mutation）等の手段によって新たな変異株を作成することが出来ず、遺伝学的研究が困難であり、上記のように産業的に極めて有用な菌であるにもかかわらず、遺伝的解析は遅れていた。
これらのことから、多種の酵素の生産性の高い等の有用な麹菌を育種することは産業上極めて重要であり、これを目的とした育種が現在までに精力的に行なわれている。このような麹菌の育種方法には、大きく分けて突然変異法と遺伝子組換え法がある。
突然変異法にはX線、紫外線、重イオンビーム等の各種変異処理が用いられ、そこから有用な性質を指標としたスクリーニングを行うことにより、様々な酵素活性や、醸造特性等の優れた株が作出されてきた。近年、ゲノム情報を利用してこれらの有用な形質を持つ菌株を解析し、得られた知見により染色体の重複が麹菌に好ましい性質を付与するのに重要であることが判明しており、突然変異処理によって９００ｋｂ以上の大規模なゲノム領域の重複をもつ麹菌が得られている（特許文献１）。又、最近の研究により、ガンマ線照射により得られた酵母を解析すると、染色体の重複領域の境界領域に高頻度で繰り返し配列が存在することが報告された（非特許文献１）。
しかしながら、このような染色体の重複のメカニズムは解明されていない。従って、変異処理を用いた従来の方法では、酵素活性等を指標としてスクリーニングを行った際に、たまたまその活性に関係のある染色体上の領域に重複を持つ菌株が得られるだけで、実際には様々な染色体上の部位でランダムに変異が起こるため、麹菌の染色体上の特定の箇所を狙って重複させることは不可能であった。又、このような変異を利用して得られた染色体の重複株の場合には、それらの間の相同配列間の組換えにより復帰変異（すなわち染色体重複の脱落）が高い頻度で生じることも知られている。
一方で、遺伝子組換え法は形質転換を利用して目的のＤＮＡを麹菌に取り込ませることにより育種する方法であり、従来の遺伝子組換え法で取り込ませる遺伝子のサイズは５～６ｋｂが通常である。しかしながら、上記のような酵素生産性の高い等の有用な麹菌を実際に得るには、目的とする遺伝子領域に加えて、該遺伝子のプロモーター領域、ターミネーター領域、場合によってはスクリーニング時のマーカーとなる遺伝子が取り込ませるＤＮＡ領域に含まれている必要があり、これらの領域を併せると通常は１０ｋｂ以上にも及ぶ大きな領域になることが多い。
以上のように、染色体上の任意の位置で比較的大きな領域の重複を起こすことが出来る技術はこれまで存在していない。
特許第４４６９０１４号公報
Argueso et al. (2008) Proc Natl Acad Sci U S A. 105:11845-11850.
本発明は上記の問題点を解決し、麹菌の染色体上の任意の大領域を広範囲に渡って重複させる技術を提供し、従来は取得不能であった新たな形質を持つ麹菌の取得を安定的・計画的に可能にすることを目的とする。
本発明者は、アスペルギルス属に属する菌において、pyrG遺伝子等の形質転換マーカー（選択マーカー）遺伝子の配列を染色体中の任意の領域を挟むように該領域の５’及び３’末端の外側に配する形質転換体を作製することによって、該遺伝子の内部の相同領域で発生した二重鎖切断後の修復機能を介した相同組換えによって染色体の重複が起き、そのような株を該形質転換マーカーに基づき選抜することによって、狙った染色体大領域で重複が起きた株を作製することが出来ることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は以下の各態様に係る。
［態様１］
重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体上のターゲット領域の５’ 末端又は３’末端のいずれか一方の末端の外側に、コード領域の５’ 末端又は３’末端のいずれかの一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれ、該ターゲット領域の他方の末端の外側に他方の末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれて成り、該ターゲット領域が、夫々、コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子によって挟み込まれ、且つ、組み込まれた形質転換マーカー遺伝子の欠損部分に接する配列が該ターゲット領域とは反対側に位置していることを特徴とする、形質転換体。
［態様２］
コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した２つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が約１００ｂp～約２ｋｂの塩基を有する、態様１記載の形質転換体。
［態様３］
形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、態様１又は２記載の形質転換体。
［態様４］
形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている態様１ないし３のいずれか一項に記載の形質転換体。
［態様５］
制限酵素がI-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceIから成る群から選択される、態様４記載の形質転換体。
［態様６］
制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、態様４又は５に記載の形質転換体。
［態様７］
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである態様１ないし６のいずれかに記載の形質転換体。
［態様８］
アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複させる方法であって、
（１）態様１ないし７のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、
（２）ターゲット領域の５’ 末端及び３’末端の外側に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体の対応する染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複された菌株を得、
（３）上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。
［態様９］
形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、請求項８記載の方法。
［態様１０］
形質転換体をプロトプラストの状態で保持した後、培養することを特徴とする、態様８又は９記載の方法。
［態様１１］
制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、態様８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
［態様１２］
プロトプラストの状態にした形質転換体と制限酵素を融合補助剤の存在下で混合することによって制限酵素を該形質転換体に作用させる、態様１１記載の方法。
［態様１３］
態様８～１２のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複領域を有するアスペルギルス属に属する菌。
［態様１４］
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである態様１３記載の形質転換体。
［態様１５］
重複領域が数十～数百ｋｂである、態様１３又は１４記載のアスペルギルス属に属する菌。
［態様１６］
態様１３ないし１５のいずれか一項に記載のアスペルギルス属に属する菌を用いて製造される醤油。
本発明によって、麹菌の染色体上において数十～数百ｋｂ（例えば、約２００ｋｂ～約５００ｋｂ）に及ぶ任意の大きな領域の重複を起こさせることが可能となった。このような技術は従来存在しなかった。また本発明は宿主に内在性の遺伝子しか使用しておらず、作出した重複株中にも外来遺伝子が残らないセルフクローニング株であることから、醤油の醸造等、食品製造に使用する微生物（例えば、醤油麹）の育種法としても極めて優れた方法である。
更に、発明方法によって製造された染色体領域の重複を有する麹菌株においては、タンデムに並ぶ相同配列間の組換えにより染色体重複が脱落した場合、pyrG等の形質転換マーカー遺伝子が一緒に脱落して特定の栄養要求（例えば、ウリジン要求）性となり、その結果、通常の培地では生育不可能であるため、選択圧がかかり、染色体重複の脱落を回避することが可能である。このように、本発明方法は復帰変異が起こらない染色体重複株の作製方法としても有用で優れた方法である。
本発明方法の概略を示す。 ５’ΔpyrGあるいは３’ΔpyrGユニットの作製を示す。 ８番染色体中の染色体重複のtarget領域を示す。 PCRの結果を示す。 サザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す。 サザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す。 サザンハイブリダイゼーションを行った結果を示す。 定量PCRを用いた８番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数を示す。 ２番染色体中の染色体重複のtarget領域を示す。 PCRの結果を示す。 定量PCRを用いた２番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数を示す。 プロテアーゼ活性測定の結果を示す。 α-アミラーゼ活性測定の結果を示す。
本発明の形質転換体の親株として使用するアスペルギルス属に属する菌に属する菌株としては、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ等の任意の菌株が挙げられるが、そのうちアスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼに属する菌株が好ましい。
このような菌株としては、例えば、アスペルギルス・ソーヤ ２６２（ＦＥＲＭ Ｐ－２１８８）、アスペルギルス・ソーヤ ２１６５（ＦＥＲＭ Ｐ－７２８０）、アスペルギルス・ソーヤ （ＡＴＣＣ４２２５１）、アスペルギルス・オリゼ（ＩＡＭ２６３８）、及びアスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０（ＮＢＲＣ１００９５９）等の公的寄託機関で保存されており当業者には容易に入手可能であるような各菌株等を挙げることができる。
　外来ＤＮＡの染色体への組込みは染色体DNAの二重鎖切断時の修復機構を介して行われることが知られており、このDNA修復機構には相同組換えと非相同組換え（非相同末端結合）の２種類の機構が存在する。相同組換えの場合には外来ＤＮＡと相同性のある領域を介して組込みが起こるが、非相同組換えの場合には外来ＤＮＡの配列には関係なく染色体上のランダムな位置への組込みが起こり、これら２つの組換え機構は平衡して作用していると考えられている（Ristic et al. Nucl. Acids Res. (2003) 31: 5229-5237）。
　相同組換え機構の中心をなす遺伝子はrad52グループと呼ばれる一連の遺伝子でその中にrad50、51、52、54、Mre11、XRS2等が含まれる（Kooistra et al. 2004）。相同組換え機構はバクテリアから真核生物まで多くの生物種で存在が確認され、Aspergillus属の実験室株であり単核分生子を持つAspergillus nidulansにおいてもuvsC遺伝子がクローニングされ研究が進められており(van Heemst et al. Mol. Gen. Genet. (1997)254: 654-64)、発現頻度を一定レベル上昇させることで相同組換頻度が向上することが報告されている（Natsume et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2004) 68: 1649-1656）。
　一方で、非相同組換え機構は相同組換えとは全く異なる非相同末端結合（Non-Homologous End Joining）によることがに明らかとなっており、この機構の中心になる遺伝子としてはKu70、Ku80、Xrcc4、LIG4、DNAPKcsなどが知られている。Ku70およびKu80はヘテロダイマーとして機能し、ヌクレオチドキナーゼ(XRCC4)およびDNA LigaseVIとともに複合体を形成して、ＤＮＡ二重鎖切断（DSB）時にその修復のためにDNA末端に結合してNon-Homologous End Joiningを促進することが知られている。（Walker et al. Nature (2001) 412: 607-614）。このKuを介した非相同組換え機構に関しては真核生物でのみ存在が確認されている。
本発明の形質転換体を使用して、アスペルギルス属に属する菌の染色体上において数十～数百kbに及ぶ任意の大きな領域を重複させることが可能である。即ち、本発明の形質転換体は、重複を目的とする麹菌染色体上のターゲット領域の５’ 末端又は３’末端のいずれか一方の末端の外側に、コード領域の５’ 末端又は３’末端のいずれか一方の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれ、該ターゲット領域の他方の末端の外側に他方の末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれて成り、該ターゲット領域が、夫々、コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した２つの形質転換マーカー遺伝子によって挟み込まれ、且つ、組み込まれた形質転換マーカー遺伝子の欠損部分に接する配列（欠損部分を有する各末端領域配列）が該ターゲット領域とは反対側に位置していることを特徴とする。
即ち、重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体上のターゲット領域の５’末端の外側にコード領域の５’末端の一部（適当な長さの塩基配列から成る５’末端領域）が欠損した形質転換マーカー遺伝子を組み込み、一方、ターゲット領域の３’末端の一部（適当な長さの塩基配列から成る３’末端領域）の外側にコード領域の３’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子を組み込むことが出来る。或いは、重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体上のターゲット領域の５’末端の外側にコード領域の３’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子を組み込み、一方、ターゲット領域の３’末端の外側にコード領域の５’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子を組み込んでもよい。
いずれの場合でも、重複の対象となるターゲット領域を挟み込んでいる、夫々、コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した２つの形質転換マーカー遺伝子において、欠損した部分に接する配列が該ターゲット領域とは反対側に位置していることが必要である。
　このような構造上の特徴を有する形質転換体を培養することによって、対応する染色体の間で、夫々、ターゲット領域の５’ 末端又は３’末端の外側に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域（図１，図２及び図１０中で斜線で示した部分）間における二重鎖切断時の修復機構を介する相同組換えが生起し、その結果、該ターゲット領域が重複された菌株が得られる。ここで、「対応する染色体」とは、実施例で示されるように、形質転換体の多核に含まれる相同染色体、例えば、各菌において有用物質（例えば、各種酵素類）をコードする遺伝子が多数含まれている、複数の８番及び第２番等の染色体を意味する。
従って、本発明で使用するアスペルギルス属に属する菌としては、上記のような非相同組換え機構に関与する各種遺伝子が抑制又は欠失している形質転換菌（特開２００６－１５８２６９号公報）を使用することもできる。
　　又、該形質転換体における該ターゲット領域の５’及び３’末端の外側に組み込まれる形質転換マーカー遺伝子は、相同組換えを効率よく生起するのに十分な長さ、例えば、数百ｂｐ以上、数百ｂｐ～数ｋｂ程度（例えば、約１００ｂp～約２ｋｂ）の塩基配列がコード領域の中間部分に残るように、そのコード領域の５’末端又は３’末端の一部が欠損していることが好ましい。即ち、重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体のターゲット領域の５’及び３’末端の外側に組み込まれた、コード領域の５’末端又は３’末端の一部が欠損している２つの形質転換マーカー遺伝子のいずれにおいても、元の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に存在する上記の長さの塩基配列が共通して残っていることが好ましい。従って、形質転換マーカー遺伝子のコード領域において欠損させる５’末端又は３’末端領域の塩基配列の長さは、使用する形質転換マーカー遺伝子の種類及び全長等に応じて、当業者が適宜決めることが出来る。例えば、pyrG遺伝子を使用する場合には、通常、例えば、約０．４ｋｂ～約１．４ｋｂ）である。又、欠損させる５’末端又は３’末端領域の塩基配列の長さは同じである必要はない。
本発明の形質転換体を培養した場合に、上記の相同組換えによって該ターゲット領域が重複された菌株においては同時に形質転換マーカー遺伝子コード領域の完全長が構築される結果、形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を該ターゲット領域が重複されていない（即ち、形質転換マーカー遺伝子コード領域の完全長が構築されていない）菌株から選択すること出来る。
本発明で使用するこのような形質転換マーカーに特に制限はないが、ポジティブ選択可能なマーカー遺伝子の代表例として、pyrG、sC及びniaD等を挙げることが出来、これらマーカー遺伝子を使用した際には、夫々の栄養要求性（ウリジン要求、イオウ資化、及び、硝酸資化）を補償する形質によって該ターゲット領域が重複された菌株を選択することが可能となる。　
尚、これらのマーカー遺伝子は、選択用の薬剤を含む培地で培養することによって、該マーカー遺伝子を含有する菌はそこに含まれている該マーカー遺伝子の発現産物によって選択用の薬剤が細胞毒性物質に変換され細胞死に至らしめることによって、ネガティブ選択にも使用することが出来る。
更に、重複を目的とする染色体上のターゲット領域の５’及び３’末端の外側に組み込む形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め、I-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceI等の当業者に公知の適当な制限酵素認識部位を導入しておくことが出来る。このような制限酵素部位は、相同組換え等の当業者に公知の任意の手段によって導入することが出来る。
従って、本発明は、上記の形質転換体を使用してアスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複させる方法にも係る。この方法の概略は図１に示したとおりである。即ち、本発明方法は、
（１）上記の特徴を有する本発明の形質転換体を培養し、
（２）ターゲット領域の５’ 末端及び３’末端の外側に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体の対応する染色体の間での相同組換えによって該ターゲット領域が重複された菌株を得、
（３）上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る。
本発明方法は、本発明の形質転換体を通常の条件で培養することによって、形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間において二重鎖の切断が適当な頻度で生じた時に働く修復機構を介した相同組換えを利用するものである。本発明方法において、形質転換体を当業者に公知の任意の方法で一度プロトプラストの状態にして適当な条件下で一定時間（例えば、数十分間～１時間程度）保持し、その後、培養することによって相同組換えの効率を高めることが出来る。尚、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼ等の麹菌は分生子の状態も含めてその生活環において常に多核の状態を保っているので、対応する染色体の間で上記の相同組換えが容易に起こると考えられる。一方、アスペルギルス属のその他の菌、例えば、Aspergillus nidulans, niger, fumigatus, awamori等は単核の世代を持つが、それらの菌であっても菌糸からであれば多核状態のプロトプラストを容易に得ることができる。
更に、コード領域の中間部分に存在する相同配列領域に、予め、I-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceI等の当業者に公知の適当な制限酵素認識部位が導入された形質転換マーカー遺伝子を使用する場合には、該制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させることが出来る。具体的には、例えば、プロトプラストの状態にした形質転換体と制限酵素を融合補助剤（例えば、PEG等）の存在下で混合すること（プロトプラストPEG法）によって、制限酵素を該形質転換体に効率よく作用させることが可能である。
尚、本発明の形質転換体は、本願明細書の実施例に記載されているような当業者の公知の手段を用いて作製することが出来る。又、形質転換体の培養は当業者に公知の適当な条件で実施することが出来る。
更に、本発明は、以上の方法で得られた、染色体上に、例えば、数十～数百ｋｂ（例えば、約２００ｋｂ～約５００ｋｂ）の重複領域を有する麹菌にも係るものである。重複の対象となるターゲット領域は任意に選択することができるので、有用な酵素類をコードする公知の各種領域をターゲット領域とすることによって、醤油の醸造等、食品製造に有用な麹菌（例えば、醤油麹）を得ることが出来る。従って、本発明は、このような該麹菌を用いて製造される醤油等の食品にも係るものである。
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
 [実験方法]
使用菌株
Aspergillus oryzae RP-1株（ΔpyrG）。Aspergillus oryzae RP-1株はRIB40(=ATCC42149) 由来のpyrG deletion株（Takahashi et al. (2006) Biosci Biotechnol Biochem. 70:135-143）。
使用培地
ポリペプトンデキストリン（ＰＤ）培地（polypepton 1%, dextrin 2%, KH2PO4 0.5%, NaNO3 0.1%, MgSO4 0.05%, casamino acid 0.1%, pH 6.0）、CzapekDox (CZ) 最小培地、再生培地として1.2M ソルビトール CZを使用した。1.5 mg/ml 5fluoroortic acid（5FOA） (シグマ社) および20mM ウリジンを含むCZ培地プレートをpyrG-（ウリジン要求）株のポジティブセレクション用の培地として使用した。
形質転換
150ｍｌ容三角フラスコ中の20ｍＭ Uridineを含むポリペプトンデキストリン液体培地50ｍｌに分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行い、菌体を回収した。回収した菌体を0.7M KCl bufferで洗浄し、1％Lysing enzyme(シグマ社)を含む0.7M KCl buffer中で30℃、3時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラストを1.2Ｍソルビトール bufferで洗浄した後、プロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行った。形質転換体の再生は0.5％agarを含む1.2Ｍソルビトール-ＣＺ培地上で行った。
サザンハイブリダイゼーション
サザンハイブリダイゼーションはHybond-N+のメンブレンフィルター（アマシャムファルマシア社）を使用し、一般的な方法により行った。検出にはDIG Luminescent Detection Kit（ロシュ社）を使用し、メーカーの推奨する方法で行った。H160、TD-AおよびTD-Bの各プローブの作製はそれぞれH160-iUとH160-iL、TD-AUとTD-ALおよびTD-BUとTD-BLのプライマーを用い（表１）、PCR DIG Probe Synthesis Kit（ロシュ社）によって行った。
I-SceIを用いた染色体重複株の作製
　染色体重複株の作製は、以下の通りに行った。約2X107/100μl量のプロトプラスト溶液に対し、20μlのPEG溶液を加えた後、50Uまたは0UのI-SceIを加え、氷中に40分保持した後、70μlのPEG溶液を加え、さらに室温で20分保持した後、1.2Ｍソルビトール-ＣＺ培地プレート上で再生させた。CZ培地上で生育の見られた株を染色体重複候補株として以後の解析に使用した。
定量PCR（リアルタイムPCR）を用いた染色体中の遺伝子コピー数の比較
定量PCRはMx3000P（ストラタジーン社）を用いて行った。他の染色体に位置するrad52をノーマライザーとして相対定量法により、H19、H74、H99、H158の各遺伝子のコピー数を親株であるF5株と染色体重複株との間で比較した。PCRの条件は95℃で10分保持した後、95℃20秒－58℃30秒－72℃30秒を45サイクル繰り返した。PCRにはRad52、H19、H74、H99、H158の各遺伝子の増幅にはそれぞれr52U-r52L、H19U-H19L、H74U-H74L、H99U-H99L、H158U-H158Lの各プライマーを使用した（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
形質転換体の作製
染色体の重複は染色体の二重鎖切断修復の過程で生じると考えられているが、そのメカニズムは判っていない。しかし酵母においてガンマ線照射によって取得された変異株の染色体を解析すると染色体の重複が起きた領域の境界付近に繰り返し配列が存在することが報告された（非特許文献１）ことから、相同領域を持つ５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGで重複ターゲット領域を挟んだコンストラクトを作製し、相同配列内部で二重鎖切断を引き起こすことにより、染色体の重複を作製出来るのではないかと考えられる（図１）。そこで、まず、５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGを作製するために、図２に示すような基本ユニットを作製した。
５’ΔpyrGあるいは３’ΔpyrGユニットの作製は PCRとライゲーションを用いて行った。pyrGユニットの作製は、当業者に公知の方法を用いて、pyrG全長の転写開始点付近(5’ΔpyrGの場合)あるいはコード領域の3’側付近(3’ΔpyrGの場合)に図２中で斜線で示す相同配列（適当な制限酵素認識部位を含んでいても良い）を組込むことにより行った。各ベクターが染色体上に組込まれた後５FOA耐性株を選択（ネガティブ選択）することにより、それぞれ相同領域での組換えにより内部が切り出された５’ΔpyrGあるいは３’ΔpyrG株が得られた。
次に５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGそれぞれのユニットを染色体上のターゲットとする領域に組込むためのベクターを構築した。標的とする領域はA.oryzaeの８番染色体中のSC103領域のAO090103000072～AO090103000160の各遺伝子の領域に対応する部分を含む210 kbの領域である（図３）。本明細書内では以後簡略化のため、各遺伝子名のAO090103000部分を省略し、Hで表現する（例：AO090103000160 → H160）。SC１０３領域と対応する各遺伝子の配列は独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）のゲノム解析データベースであるDOGAN（Database Of the Genomes Analyzed at NITE）に基づいている。（http://www.bio.nite.go.jp/dogan/GeneMap?GENOME_ID=ao__G2）。
染色体上のH72の領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pH72-5’Δ）とH160の領域に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pH160-3’Δ）の構築を、以下の通り行った。
H72およびH160の領域は、上述のとおりA.oryzaeの８番染色体中のAO090103000072およびAO090103000160のORF領域に対応している。まずプライマーH72UとH72LおよびH160UとH160 Lを用いてA.oryzaeのゲノムDNAよりPCRによりH72およびH160それぞれを含む約３kbの領域を増幅し、ベクターにクローニングした。プライマーH72iUおよびH72iLを用いて増幅したH72を含むベクターを、プライマーpyrUおよびpyrLを用いて増幅後、リン酸化処理した５’ΔpyrGユニットとライゲーションし、染色体上のH72の領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pH72-5’Δ）を構築した。続いてプライマーH160iUおよびH160iLを用いて増幅したH160を含むベクターを、プライマーpyrUおよびpyrLを用いて増幅後、リン酸化処理した３’ΔpyrGユニットとライゲーションし、H160の領域に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pH160-3’Δ）を構築した。
まずH72の領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pH72-5’Δ）を用いてA.oryzaeのΔpyrG株に対して形質転換を行った。得られた形質転換体11株をPCRおよびサザンハイブリダイゼーションにより調べた。結果、１株で目的部位にベクターが組込まれていることが確認された。次にこの株から分生子を採取し、約1×10５を5FOAを含むCZ培地プレート上へ塗布し、得られた5FOA耐性株を解析したところ、H72部位に5’ΔpyrGのコンストラクトを持つことが確認された。このH72部位に5’ΔpyrGのコンストラクトを持つΔpyrG株（ku70+株）を親株として、H160部位（210 kb領域重複用）に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pH160-3’Δ）で形質転換を行った。H160部位にベクターが組込まれた株をPCRおよびサザンハイブリダイゼーションを用いて選抜して分生子を回収し、5FOA－CZプレート上で耐性を示すコロニーを選択した結果、重複ターゲット領域中（210kb領域）の最もセントロメア側であるH72部位に5’ΔpyrGが組込まれ、最もテロメア側であるH160部位に3’ΔpyrGが組込まれた株（F5株）の構築が確認された。こうして８番染色体中の210kbの領域を重複させるための基本的なコンストラクトを持った株（F5株）の構築に成功した。尚、形質転換体の第８番染色体に組み込まれた一部欠損した２つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分は約５００ｂｐであった。
 [染色体重複株の作製]
次に、この株（F5株）を用いて染色体の重複実験を行った。実験はI-SceI使用量0Uおよび50Uの条件で行った。その結果、各プレートからそれぞれ１個づつのpyrG+のコロニーが得られた。続いて、得られたpyrG+の２株（0C株、50B株）から染色体DNAを抽出し、PCRおよびサザンハイブリダイゼーションおよび定量PCR（リアルタイムPCR）により、染色体が重複しているかどうかの確認を試みた。
まず、PCRの結果を図４に示す。重複領域の両端であるH72あるいはH160を増やすためのプライマー（H72UとH72Lあるいは H160UとH160L）を用いた場合には、コントロール、重複株ともに4.8 kbおよび3.9 kbのバンドが増幅するのに対し、H160U-H72Lの組合わせでPCRを行った場合にはコントロールや親株では全くバンドの増幅が見られないが、染色体重複株（0C株、50B株）では、はっきりと4.4kbのバンドの増幅が見られた。これは染色体の領域が重複している場合にのみ得られるバンドであると考えられるため、染色体重複株（0C株、50B株）では８番染色体上のこの領域（H72～H160の210 kb）が重複していることが示唆された。
次に、サザンハイブリダイゼーションを行った結果を図５～７に示す。まず重複領域の末端に位置するH160をプローブとし、BglIIで消化したゲノムDNAを使用して実験を行った。
図５の上部は親株および染色体重複株中での８番染色体上の重複ターゲット領域の制限酵素地図およびプローブの位置を示している。H160プローブを用いた場合、親株では5.6kbと1.6kbの２つのバンドのみが出るのに対し、８番染色体上での染色体の重複が狙った通りに起こった場合、完全型のpyrGを含む13.8kbの新しいバンドが出現すると考えられる。図５によれば、コントロールおよび親株（レーン１～３）では２つのバンドのみであるのに対し、染色体重複の２株（レーン４、５）では新たに13.8kbの位置にバンドが出現していることが判る。このことから染色体重複株では狙った通りに染色体の重複が起きているものと考えられる。
続いて、同一のメンブレンを用いてやはり重複領域の末端であるH72付近に位置するTD-Bをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った（図６）。コントロールおよび親株（レーン１～３）では6.6kbのバンドのみが見られるのに対し、染色体重複の２株（レーン４、５）では新たに13.8kbのバンドが出現していることからやはり染色体の重複がおきていることを示すデータが得られた。
それに対し、重複領域外に位置するTD-Aをプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行った場合（図７）、コントロール、親株、染色体重複株のいずれにおいても6.6kbのバンドのみが見られ、変化はなかった。
続いて定量PCRを用いて８番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株および染色体重複株で比較した（図８）。実験では他の染色体に存在し、コピー数が１であるrad52をノーマライザーとして使用し、重複領域内のセントロメア側の端に位置するH74遺伝子（タンナーゼ）とそこから60kb離れた位置に存在するH99遺伝子およびテロメア側の端に位置するH158遺伝子、そして重複領域外に位置するH19遺伝子をターゲットとして、SYBR Greenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。その結果、コントロール株（F5株およびCT株）では、H19遺伝子、H74遺伝子、H99遺伝子、H158遺伝子ともに１倍程度の値を示していることから、それぞれコピー数が１であると考えられるのに対し、染色体重複株（0C株および50B株）では重複領域外に位置するH19の値は１程度であるが、重複領域内に位置するH74遺伝子、H99遺伝子、H158遺伝子はいずれも２倍以上の値を示しており、コピー数が２に増幅していることが確認された。
以上、PCR、サザンハイブリダイゼーション、定量PCRの結果から、上記の染色体重複株（0C株、50B株）では確かに狙った領域である８番染色体の210kbの領域が重複していることが確認された。
次に、麹菌２番染色体重複株の作製を行った。尚、以下の実験方法に記載されていない事項（使用菌株、使用培地、形質転換、染色体重複株の作製、等）に関しては、実施例１と同様に実施した。
[実験方法]
定量PCR（リアルタイムPCR）を用いた染色体中の遺伝子コピー数の比較
定量PCRはMx3005P（アジレント・テクノロジー社）を用いて行った。他の染色体に位置するrad52をノーマライザーとして相対定量法により、２番染色体上のAlp、amyR、prtT、1258Dの各遺伝子のコピー数を親株と染色体重複株との間で比較した。PCRの条件は95℃で10分保持した後、95℃20秒－58℃30秒－72℃30秒を45サイクル繰り返した。PCRにはRad52、Alp、amyR、prtT、1258Dの各遺伝子の増幅にはそれぞれr52U-r52L、amyRU-amyRL、AlpU-AlpL、prtTU-prtTL、1258DU-1258DLの各プライマーを使用した（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
ふすま麹の作製法
麹菌の酵素活性評価は定法に従って行なった。すなわち、80％散水した小麦ふすま５ｇを150ｍｌ容三角フラスコに入れ、121℃、50分滅菌した後、麹菌を２白金耳程度接種し30℃、4日間培養する。培養後、滅菌水100mlを入れ、ゴム栓をして十分に振とうし、4時間室温にて静置した後、No.2の濾紙（アドバンテック社製）で濾過して得られた抽出液を酵素サンプルとした。
プロテアーゼ活性の測定法
得られた酵素サンプルを適宜希釈し、「しょうゆ試験法」（財団法人　日本醤油研究所　昭和60年、287ページ）に記載の方法に従って測定した。プロテアーゼ活性は、ふすま麹１ｇ当り1分間に1μモルのチロシンを生成する活性を１U（ユニットまたは単位）として示した。
α-アミラーゼ活性の測定法
得られた酵素サンプルを適宜希釈し、α-アミラーゼ測定キット（キッコーマン醸造分析キット、コード60213）を用い、キットのプロトコルに従って測定を行なった。α-アミラーゼ活性は、ふすま麹１ｇ当り1分間に1μモルの2-クロロ-4-ニトロフェノールを遊離する力価を１U（ユニットまたは単位）として示した。
形質転換体の作製
次に５’ΔpyrGおよび３’ΔpyrGそれぞれのユニットを染色体上のターゲットとする領域に組込むためのベクターを構築した。標的とする領域はA.oryzaeの２番染色体中のSC003領域のAO090003001036～AO090003001212の各遺伝子の領域に対応する部分を含む499 kbの領域である（図９、斜線部）。本明細書内では以後簡略化のため、各遺伝子名のAO090003000部分を省略し、Bで表現する（例：AO090003000160 → B160）。SC003領域と対応する各遺伝子の配列は独立行政法人製品評価技術基盤機構（NITE）のゲノム解析データベースであるDOGAN（Database Of the Genomes Analyzed at NITE）に基づいている。（http://www.bio.nite.go.jp/dogan/GeneMap?GENOME_ID=ao__G2）。
染色体上のB1035およびB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pB1035C-5’Δ）とB1212およびB1214の中間領域に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pB1213C-3’Δ）の構築を、以下の通り行った。
B1035、B1036 、B1212およびB1214の領域は、上述のとおりA.oryzaeの２番染色体中のAO090003001035、AO090003001036、AO090003001212、およびAO090003001214のORF領域に対応している。まずプライマーB1035CUとB1035CLおよびB1213CUとB1213CLを用いてA.oryzaeのゲノムDNAよりPCRによりB1035とB1036の中間領域およびB1212とB1214の中間領域を含む約３kbの領域を増幅し、ベクターにクローニングした。
プライマーB1035iUおよびB1035iLを用いて増幅したB1035とB1036の中間領域を含むベクターを、プライマーpyrUおよびpyrLを用いて増幅後、リン酸化処理した５’ΔpyrGユニットとライゲーションし、染色体上のB1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pB1035C-5’Δ）を構築した。続いてプライマーB1213iUおよびB1213iLを用いて増幅したB1212とB1214の中間領域を含むベクターを、プライマーpyrUおよびpyrLを用いて増幅後、リン酸化処理した３’ΔpyrGユニットとライゲーションし、B1212とB1214の中間領域に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pB1213C-3’Δ）を構築した。
まずB1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pB1035C-5’Δ）を用いてA.oryzaeのΔpyrG株に対して形質転換を行った。得られた形質転換体をPCRおよびサザンハイブリダイゼーションにより調べた。結果、1株で目的部位にベクターが組込まれていることが確認された。次にこの株から分生子を採取し、約1×10５を5FOAを含むCZ培地プレート上へ塗布し、得られた5FOA耐性株を解析したところ、B1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを持つことが確認された。このB1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGのコンストラクトを持つΔpyrG株を親株として、B1212とB1214の中間領域（499 kb領域重複用）に3’ΔpyrGのコンストラクトを組込むためのベクター（pB1213C-3’Δ）で形質転換を行った。B1212とB1214の中間領域にベクターが組込まれた株をPCRおよびサザンハイブリダイゼーションを用いて選抜して分生子を回収し、5FOA－CZプレート上で耐性を示すコロニーを選択した結果、重複ターゲット領域中（499 kb領域）の最もセントロメア側であるB1035とB1036の中間領域に5’ΔpyrGが組込まれ、最もテロメア側であるB1212とB1214の中間領域に3’ΔpyrGが組込まれた株の構築が確認された。こうして2番染色体中の499 kbの領域を重複させるための基本的なコンストラクトを持った株(C-4-hap株)の構築に成功した（図９）。重複株の作製に使用したプライマーを表３に示す。尚、形質転換体の第２番染色体に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分は約５００ｂｐであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 [染色体重複株の作製]
次に、このC-4-hap株を親株として、前述の方法により、染色体重複株の取得実験を行った。その結果、再生プレートから１個のpyrG+のコロニーが得られたので、これをC-4-499k株とした。続いて、得られたpyrG+株（C-4-499k株）から染色体DNAを抽出し、PCRおよび定量PCR（リアルタイムPCR）により、染色体が重複しているかどうかの確認を試みた。
PCRによる染色体重複の確認
まず、PCRにより狙った染色体上の領域の重複が起きているかどうかの確認を行なった。その結果を図１０に示す。重複領域のセントロメア側の端に位置し、ベクター（pB1035C-5’Δ）が組込まれているB1035とB1036の中間領域を増やすためのプライマー（B1035CUとB1035CL）を用いた場合（図１０上）には、コントロール株（親株：C-4-hap株）、重複株（C-4-499k株）ともに4.4 kbのバンドの増幅が見られた（図１０下、レーン１および２）。また重複領域のテロメア側の端に位置し、ベクター（pB1213C-3’Δ）が組込まれているB1212とB1214の中間領域を増やすためのプライマー（B1213CUとB1213CL）を用いた場合（図１０上）には、コントロール、重複株ともに3.9 kbのバンドの増幅が見られた（図１０下、レーン５および６）。一方、B1213CU-B1035CLの組合わせでPCRを行った場合（図１０中）にはコントロールでは全くバンドの増幅が見られないのに対し、染色体重複株では、はっきりと4.8 kbのバンドの増幅が見られた（図１０下、レーン３および４）。染色体重複株でのみ見られた4.8kbのバンドは、染色体上の狙った領域が重複し、図１０中に示すような構造が染色体上に存在する場合にのみ得られるバンドであると考えられる。このことから、染色体重複株499ｋ株では2番染色体上のこの領域（B1035～B1212の499 kb）が重複していることが示唆された。
リアルタイムPCRによるコピー数の確認
続いてリアルタイムPCR（定量PCR）を用いて2番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株（親株：C-4-hap株）および染色体重複株（C-4-499k株）で比較した（図１１）。実験では他の染色体に存在し、コピー数が１であるrad52をノーマライザーとして使用し、重複領域内のセントロメア側の端に位置するB1036遺伝子（Alp）とそこから490 kb離れた位置に存在するB1208(amyR)遺伝子およびテロメア側の端に位置するB1212(prtT)遺伝子、そして重複領域外に位置するB1258D遺伝子をターゲットとして、SYBR Greenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。図１１にはコントロール株（C-4-hap株）でのコピー数に対する相対値を示す。その結果、染色体重複株であるC-4-499k株では、染色体重複領域外に位置するB1258Dの相対値は約１程度であったが、重複領域の内部に位置するB1036遺伝子、B1208遺伝子、B1212遺伝子についてはいずれもコントロール株でのコピー数に対して２倍程度の値を示した。これらの結果から染色体重複株（C-4-499k株）においては、重複領域内に位置する遺伝子のコピー数が２に増幅していることが確認された。
これらのPCRおよびリアルタイムPCR（定量PCR）の結果から、染色体重複株（C-4-499k株）では２番染色体上の狙った領域である499 kbの領域が確かに重複していることが確認された。
活性の測定
２番染色体の重複株については、特許文献１で、麹菌の２番染色体上のSC003のAO090003001003～AO090003001259に対応するゲノム領域の重複株で、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の顕著な上昇が見られることが報告されている。本実験で２番染色体を重複させた重複株について、同様の活性上昇が見られるかどうかを調べるために、酵素活性の測定を行なった。酵素活性の比較対照とするために、本実験での方法を用いて２番染色体上のAO090003001003～AO090003001258（B1003～B1258）に対応する695kbの領域を重複させたD-2-695k株を用いた。
プロテアーゼ活性測定の結果
前述の方法にてふすま麹より得られた酵素抽出液を用いて全プロテアーゼ活性の測定を行い、染色体重複を持たない親株と重複株とで比較を行なった。その結果を図１２に示す。プロテアーゼ活性については、親株の活性に対し、染色体重複株（C-4-499k株）では約３倍に活性値が上昇していた。また、この値は695 kbの領域の染色体重複株（D-2-695k株）で得られた活性値であるとほぼ同等であった。このことから本発明で作製した499 kbの領域の染色体重複株（C-4-499k株）では、ふすま培養において、695 kbの領域の染色体株重複（D-2-695k株）と同様のプロテアーゼ活性の上昇が見られることが判明した。
α‐アミラーゼ活性測定の結果
続いてα‐アミラーゼ活性についても同一の酵素液を用いて測定を行なった。その結果を図１３に示す。その結果、親株の活性値に対し、染色体重複株（C-4-499k株）では約1.6倍程度に上昇していることが明らかとなった。この値は695 kbの領域の染色体重複株（D2-695k株）において得られた値とほぼ同じであった。このことから本発明で作製した499 kbの領域の染色体重複株（C-4-499k株）では、ふすま培養において、695 kbの領域の染色体株重複（D-2-695k株）と同様のアミラーゼ活性の上昇が見られることが判明した。
以上の結果より、本実施例で作製したC-4-499k株においては、２番染色体のB1036～1212の499 kbの領域が確かに重複しており、ふすま培養において、695 kbの領域の染色体重複株と同様に、染色体重複のない親株に比較して、顕著なプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の上昇が見られることが判った。このことから、2番染色体の重複によるプロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の上昇にはより短い領域であるB1036～1212を含む499 kb領域の重複で十分であることが示された。
本発明による製造方法を使用することにより、育種の対象である菌株のゲノム情報を利用して実用上有用であると考えられる染色体の領域を特定し、その染色体領域を狙って重複させた菌株を作製することが可能となり、効率的に分子育種が進められると考えられる。更に、従来知られていなかった全く新たな有用な形質が強化された麹菌が得られるものと期待される。

Claims (16)

  1. 重複を目的とするアスペルギルス属に属する菌の染色体上のターゲット領域の５’ 末端又は３’末端のいずれか一方の末端の外側に、コード領域の５’ 末端又は３’末端のいずれかの一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれ、該ターゲット領域の他方の末端の外側に他方の末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が組み込まれて成り、該ターゲット領域が、夫々、コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子によって挟み込まれ、且つ、組み込まれた形質転換マーカー遺伝子の欠損部分に接する配列が該ターゲット領域とは反対側に位置していることを特徴とする、形質転換体。
  2. コード領域の５’又は３’末端の一部が欠損した２つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が約１００ｂp～約２ｋｂの塩基を有する、請求項１記載の形質転換体。
  3. 形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、請求項１又は２記載の形質転換体。
  4. 形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている請求項１ないし３のいずれか一項に記載の形質転換体。
  5. 制限酵素がI-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceIから成る群から選択される、請求項４記載の形質転換体。
  6. 制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、請求項４又は５に記載の形質転換体。
  7. アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである請求項１ないし６のいずれかに記載の形質転換体。
  8. アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複させる方法であって、
    （１）請求項１ないし７のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、
    （２）ターゲット領域の５’ 末端及び３’末端の外側に組み込まれた形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体の対応する染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複された菌株を得、
    （３）上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。
  9. 形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、請求項８記載の方法。
  10. 形質転換体をプロトプラストの状態で保持した後、培養することを特徴とする、請求項８又は９記載の方法。
  11. 制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、請求項８ないし１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. プロトプラストの状態にした形質転換体と制限酵素を融合補助剤の存在下で混合することによって制限酵素を該形質転換体に作用させる、請求項１１記載の方法。
  13. 請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複領域を有するアスペルギルス属に属する菌。
  14. アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである請求項１３記載の形質転換体。
  15. 重複領域が数十～数百ｋｂである、請求項１３又は１４記載のアスペルギルス属に属する菌。
  16. 請求項１３ないし１５のいずれか一項に記載のアスペルギルス属に属する菌を用いて製造される醤油。
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