JP6081245B2 - 麹菌染色体における任意領域の重複転座の作製方法 - Google Patents
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Description
[態様1]
アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の5’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の5’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の3’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の5’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
[態様2]
アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の3’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の3’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の5’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子がその3’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
[態様3]
コード領域の5’又は3’末端の一部が欠損した2つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が約100bp〜約2kbの塩基を有する、態様1又は2に記載の形質転換体。
[態様4]
形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、態様1ないし3のいずれか一項に形質転換体。
[態様5]
形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている、態様1ないし4のいずれか一項に記載の形質転換体。
[態様6]
制限酵素がI-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceIから成る群から選択される、態様5記載の形質転換体。
[態様7]
制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、態様5又は6に記載の形質転換体。
[態様8]
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様1ないし7のいずれかに記載の形質転換体。
[態様9]
アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複転座させる方法であって、
(1)態様1ないし8のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、
(2)2つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における2つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を得、
(3)上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。
[態様10]
形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、態様9記載の方法。
[態様11]
形質転換体に紫外線照射することによって、2つの異なる染色体の間での相同組換えを促進させることを特徴とする、態様9又は10記載の方法。
[態様12]
制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、態様9ないし11のいずれか一項に記載の方法。
[態様13]
態様9〜12のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複転座領域を有するアスペルギルス属に属する菌。
[態様14]
アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、態様13記載の形質転換体。
[態様15]
重複転座領域が千kb以上である、態様13又は14記載のアスペルギルス属に属する菌。
[態様16]
態様14ないし15のいずれか一項に記載のアスペルギルス属に属する菌を用いて製造される醤油。
染色体の重複は染色体中に生じた二重鎖切断を修復する過程で生じると考えられているが、その詳しいメカニズムは判っていない。しかしながら2倍体酵母においてガンマ線照射により取得された変異株の染色体を解析すると染色体の重複あるいは転座が起きた領域の境界付近に繰り返し配列が存在することが報告されている(非特許文献1)。
即ち、第1例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる領域が共に夫々の染色体の長腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の5’ 末端の外側にコード領域の5’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が5’側を上流にして組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の5’末端の外側にコード領域の3’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が5’側を上流にして組み込まれている。
即ち、第1例として、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域及び該ターゲット領域と置き換えられる領域が共に夫々の染色体の長腕に位置するような場合には、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域の5’ 末端の外側にコード領域の3’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が3’を上流にして逆向きで組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域の5’末端の外側にコード領域の5’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が3’ 側を上流にして逆向きで組み込まれている。
(1)上記の本発明に係る形質転換体を培養し、
(2)2つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における2つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を得、
(3)上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る。
使用菌株
Aspergillus oryzae RP-1株(ΔpyrG)。Aspergillus oryzae RP-1株はRIB40(=ATCC42149) 由来のpyrG deletion株(Takahashi et al. (2006) Biosci Biotechnol Biochem. 70:135-143)。
ポリペプトンデキストリン(PD)培地(polypepton 1%, dextrin 2%, KH2PO4 0.5%, NaNO3 0.1%, MgSO4 0.05%, casamino acid 0.1%, pH 6.0)、CzapekDox (CZ) 最小培地、再生培地として1.2M ソルビトール CZを使用した。1.5 mg/ml 5fluoroortic acid(5FOA) (シグマ社) および20mM ウリジンを含むCZ培地プレートをpyrG-(ウリジン要求)株のポジティブセレクション用の培地として使用した。
150ml容三角フラスコ中の20mM Uridineを含むポリペプトンデキストリン液体培地50mlに分生子を接種し、30℃で約20時間振とう培養を行い、菌体を回収した。回収した菌体を0.7 M KCl bufferで洗浄し、1% Lysing enzyme(シグマ社)を含む0.7M KCl buffer中で30℃、3時間緩やかに振とうし、プロトプラストを調製した。得られたプロトプラストを1.2 Mソルビトール bufferで洗浄した後、プロトプラストPEG法により形質転換を行った。形質転換体の再生は0.5%agarを含む1.2Mソルビトール-CZ培地上で行った。
染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。約2X107/100μl量のプロトプラスト溶液に対し、20μlのPEG溶液を加えた後、50Uまたは0UのI-SceIを加え、氷中に40分保持した後、70μlのPEG溶液を加え、さらに室温で20分保持した後、1.2Mソルビトール-CZ培地プレート上で再生させた。CZ培地上で生育の見られた株を染色体重複転座候補株として以後の解析に使用した。
麹菌の酵素活性評価は定法に従って行なった。すなわち、80%散水した小麦ふすま5gを150ml容三角フラスコに入れ、121℃、50分滅菌した後、麹菌を2白金耳程度接種し30℃、4日間培養する。培養後、滅菌水100mlを入れ、ゴム栓をして十分に振とうし、4時間室温にて静置した後、No.2の濾紙(アドバンテック社製)で濾過して得られた抽出液を酵素サンプルとした。
得られた酵素サンプルを適宜希釈し、「しょうゆ試験法」(財団法人 日本醤油研究所 昭和60年、287ページ)に記載の方法に従って測定した。プロテアーゼ活性は、ふすま麹1g当り1分間に1μモルのチロシンを生成する活性を1U(ユニットまたは単位)として示した。
得られた酵素サンプルを適宜希釈し、α-アミラーゼ測定キット(キッコーマン醸造分析キット、コード60213)を用い、キットのプロトコルに従って測定を行なった。α-アミラーゼ活性は、ふすま麹1g当り1分間に1μモルの2-クロロ-4-ニトロフェノールを遊離する力価を1U(ユニットまたは単位)として示した。
定量PCRはMx3005P(アジレント・テクノロジー社)を用いて行った。rad52をノーマライザーとして相対定量法により、2番染色体上のAlp (B1036)、amyR、prtT(B1212)、D1258、B1440、B1555および4番染色体上のD0024、D0123および8番染色体上のH19の各遺伝子のコピー数を親株(RIB40)と染色体重複株(UV4-C株及びBN1-1株)比較した。PCRの条件は95℃で10分保持した後、95℃20秒−58℃30秒−72℃30秒を40サイクル繰り返した。rad52、Alp、prtT、H19、D1258、B1440、B1555、D0024、D0123の各遺伝子の増幅には、r52UR-r52LR、AlpU-AlpL、prtTU-prtTL、H19U-H19L、1258D U-1258D L、B1440U-B1440L、B1555U-B1555L、D0024U-D0024L、D0123U-D0123Lの各プライマーを使用した(表1)。
[形質転換体の作製]
重複転座の標的とする領域は図3に示すように、A.oryzaeの2番染色体中のSC003領域のAO090003001035〜AO090003001556の各ORFの領域に対応する部分を含む1380 kbの領域(図3、斜線部)である。この領域を4番染色体SC166領域のAO090166000009とAO090166000010の境界領域(166 locus)からテロメア側に重複転座させる。そのために、B locusに5’ΔpyrGを組込み、166 locusに3’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。本明細書内では以後簡略化のため、各遺伝子名のAO090003000部分を省略し、Bで表現する(例:AO090003000160 → B0160)。またAO090166000部分を省略し、Dで表現する(例:AO090166000010 → D0010)。SC003領域と対応する各遺伝子の配列は独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)のゲノム解析データベースであるDOGAN(Database Of the Genomes Analyzed at NITE)に基づいている。
(http://www.bio.nite.go.jp/dogan/GeneMap?GENOME_ID=ao__G2)。
4番染色体において予定通りの重複転座が起こり、2番染色体中のtarget領域(図3)が4番染色体へと重複転座した場合、図4のような染色体構造を持った株を得ることが出来る。
まず、5’ΔpyrGおよび3’ΔpyrGを作製するために、図2に示すような基本ユニットを作製した。5’ΔpyrGあるいは3’ΔpyrGユニットの作製は PCRとライゲーションを用いて行った。pyrGユニットの作製は、当業者に公知の方法を用いて、pyrG全長の転写開始点付近(5’ΔpyrGの場合)あるいはコード領域の3’側付近(3’ΔpyrGの場合)に、図2中で斜線で示す相同配列(適当な制限酵素認識部位を含んでいても良い)を組込むことにより行った。各ベクターが染色体上に組込まれた後5FOA耐性株を選択(ネガティブ選択)することにより、それぞれ相同領域での組換えにより内部が切り出された5’ΔpyrGあるいは3’ΔpyrG株が得られた。
次に5’ΔpyrGおよび3’ΔpyrGそれぞれのユニットを染色体上のターゲットとする領域に組込むためのベクターを構築した。
まず、B-locusへ5’ ΔpyrGを組込むためのベクターは以下のようにして作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer B-UおよびB-Lを用いてPCRを行い、B-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit(invitrogen社)を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマーB-iUとB-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。5’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit(Takara社)を用いて処理し、ベクターpB-d5pyrGを得た。
続いて166-locusへ3’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer 166-Uおよび166-Lを用いてPCRを行い、166-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit(invitrogen社)を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマー166-iUと166-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。3’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit(Takara社)を用いて処理し、ベクターp166-d3pyrGを得た。
続いてこれらのベクターをA.oryzae染色体上のB-locusおよび166-locusへ組込み、染色体の重複転座用の親株を作製した。まず、A.oryzae RIB40のpyrG欠失株であるA.oryzae RP-1株に対し、pB-d5pyrGをプライマーB-UおよびB-Lを用いて増幅した断片で形質転換を行った。再生培地上で得られた形質転換体に対し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてスクリーニングを行い、B-locusにベクターが組込まれた株を得た。この株より分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、30℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株からDNAを抽出し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの5’側の欠失を確認するとともに最小培地で生育しないことを確認し、B-locusに5’pyrGが組込まれた株(AO-B-d5pyrG株)を得た。続いて、得られた株の4番染色体の166-locusに3’ΔpyrGの組込むことを試みた。3’pyrG組込み用のベクターp166d3pyrGをプライマー166Uおよび166Lを用いて増幅し、得られた断片を用いてAO-B-d5pyrG株に対し、形質転換を行った。最小培地上で再生した形質転換体からゲノムDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行い、166-locusにベクターが組込まれた株を得た。得られた株から分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、30℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株を得た。得られた耐性株からDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの3’側の欠失を確認した。最小培地で生育しないことを確認し、最終的に2番染色体B-locusに5’pyrGが組込まれ、4番染色体166-locusに3’pyrGが組込まれた、本発明の形質転換体である、重複転座用の親株(AO-D-2株)を得た。
UV照射による染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。約2X106/100μl量の分生子懸濁液を塗布したマルツプレートを6枚用意し、それぞれのプレートに対し、クリーンベンチ中で蓋を開けた状態でUVランプを0分、1分、2分、3分、4分、5分間、照射した後、30℃で1週間、培養しプレート全面に分生子を形成させた。各プレートの分生子に0.01% tween液を加え、スプレッダーでかき取ることにより回収した後、一枚あたり約2X106個の分生子をカゼインプレート上に塗布し、30℃で約4日間培養し、分生子の生育状況、およびハロの形成状態を調べた。カゼインプレート上ではウリジン要求株は生育できないため、ここで生育できる株は、栄養要求が解除された株である。各UV照射で得られた再生分生子数(コロニー数)を図5に示す。UV照射0分、1分、2分のものから再生した分生子は得られなかったが、UV照射3分および5分からは各1個、4分のものからは5個の再生分生子が得られた。UV照射4分の分生子を塗布したカゼインプレートを図5に示す。5個のコロニー(UV4-A、UV4-B、UV4-C、UV4-D、UV4-E)のうち1個(UV4-C)で大きなハロの形成が確認された(図5)。
続いて、得られた重複転座候補株に対し、PCRを用いて染色体上の狙った位置で重複転座が起きているかどうかを確認した。使用したプライマーの配列を表2に示す。図6に示すように、2番染色体上の転座境界領域および4番染色体上の転座境界領域の両隣接領域にプライマーを組合せ、PCR産物が増幅されるか否かにより、重複転座の有無を確認できる。転座が起きる前の状態では2番染色体上の5‘ΔpyrG の両サイドに配置したプライマーB-U&B-Lの組合せ(1)、および4番染色体上の3’ΔpyrGの両サイドに配置したプライマーct166-U&ct166-Lの組合せ(2)、それぞれで、約5-kbのバンドの増幅が見られる。これに対し、相互転座が起きた場合には、プライマーB-U&ct166-Lの組合せ(3)、およびプライマーct166-U&B-Lの組合せ(4)でバンドが増幅する。一方、重複転座が起きた場合にはプライマーB-U&B-Lの組合せ(1)、およびプライマーct166-U&B-Lの組合せ(4)でバンドが増幅されると考えられる。そこで転座が起きる前の親株および今回得られた重複転座の候補株であるUV4-C株およびUV4-D株よりゲノムDNAを調製し、PCRを行った。親株およびUV4-D株ではプライマーの組合せがB-U&B-L(1)の時、およびct166-U&ct166-L(2)の時(2)にのみバンドの増幅が見られ、転座が起きていないことが示された。一方、UV4-C株ではプライマーB-U&B-Lの組合せ(1)、に加えてプライマーct166-U&B-Lの組合せ(4)でもバンドが増幅されたため、狙った領域で重複転座が起きていることが示唆された(図6、電気泳動図)。
続いてリアルタイムPCR(定量PCR)を用いて2番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株(Wt:RIB40株)および染色体重複転座株(UV4-C株)で比較した(図7および図8)。実験では他の染色体に存在し、コピー数が1であるrad52をノーマライザーとして使用し、重複転座領域内のセントロメア側の端に位置するB1036遺伝子(Alp)とそこから490 kb離れた位置に存在するB1208(amyR)遺伝子、B1212(prtT)遺伝子、B1258(1258D)遺伝子、B1440遺伝子およびテロメア側の端に位置するB1555遺伝子、そして重複領域外である8番染色体に位置するH19遺伝子および転座した先の4番染色体上の領域に位置するD0024遺伝子とD0123遺伝子(図3参照)をターゲットとして、SYBR Greenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。図7および図8にはコントロール株(Wt:RIB40株)でのコピー数に対する相対値を示す。
2番染色体の重複株については、特許文献1(特許第4469014号「大規模ゲノム重複を保持する麹菌」)で、麹菌の2番染色体上のSC003のAO090003001003〜AO090003001259に対応するゲノム領域の重複株で、プロテアーゼ活性およびアミラーゼ活性の顕著な上昇が見られることが報告されている。そこで本実験で2番染色体を重複転座させた重複株について、同様の活性上昇が見られるかどうかを調べるために、酵素活性の測定を行なった。
前述の方法によって、ふすま麹より得られた酵素抽出液を用いて全プロテアーゼ活性の測定を行い、染色体重複を持たないコントロール株(Ct株)と重複株とで比較を行なった。その結果を表3に示す。プロテアーゼ活性については、コントロール株(Ct株)の活性に対し、染色体重複転座株(UV4-C株)では約2.6倍程度に活性値が上昇していた。
続いてα‐アミラーゼ活性についても同一の酵素液を用いて測定を行なった。その結果を表4に示す。その結果、コントロール株(Ct株)の活性値に対し、染色体重複転座株(UV4-C株)での活性値は約1.8倍程度に上昇していることが明らかとなった。
実施例1と同様に、形質転換体の作成、5’ΔpyrGおよび3’ΔpyrGの作製、2番染色体B-locusへ5’ΔpyrGのユニットを組み込むためのベクターの作製を行った。
続いて166-locusへ3’ΔpyrGを組込むためのベクターを作製した。A.oryzae RIB40株のゲノムDNAを鋳型とし、primer 166-Uおよび166-Lを用いてPCRを行い、166-locus近傍を含む3 kbのDNA断片を得た。得られた断片を精製し、TOPO-TA cloning kit(invitrogen社)を用いてクローニングした。得られたプラスミドを鋳型とし、プライマー166-iUと166-iLを用いて増幅し、約6 kbのDNA断片を得た。コード領域中にI-SceI切断部位を持つ3’ ΔpyrGを作製するための基本ユニットをプライマーP-UおよびP-Lを用いて増幅し、約3 kbのDNA断片を得た。これらの断片を精製した後、In-fusion cloning kit(Takara社)を用いて処理し、ベクターp166-d3pyrG-Iを得た。
続いてこれらのベクターをA.oryzae染色体上のB-locusおよび166-locusへ組込み、染色体の重複転座用の親株を作製した。まず、A.oryzae RIB40のpyrG欠失株であるA.oryzae RP-1株に対し、pB-d5pyrGをプライマーB-UおよびB-Lを用いて増幅した断片で形質転換を行った。再生培地上で得られた形質転換体に対し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてスクリーニングを行い、B-locusにベクターが組込まれた株を得た。この株より分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、30℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株からDNAを抽出し、プライマーB-OUおよびB-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの5’側の欠失を確認するとともに最小培地で生育しないことを確認し、B-locusに5’ΔpyrGが組込まれた株(AO-B-d5pyrG株)を得た。続いて、得られた株の4番染色体の166-locusに3’ΔpyrGの組込むことを試みた。3’ΔpyrG組込み用のベクターp166d3pyrGをプライマー166Uおよび166Lを用いて増幅し、得られた断片を用いてAO-B-d5pyrG株に対し、形質転換を行った。最小培地上で再生した形質転換体からゲノムDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行い、166-locusにベクターが組込まれた株を得た。得られた株から分生子を回収し、5FOA-CZプレートに塗布した後、30℃で一週間程度培養し、十分に分生子を着生した耐性株を得た。得られた耐性株からDNAを抽出し、プライマー166-OUおよび166-OLを用いてPCRを行うことにより、pyrGの3’側の欠失を確認し、なおかつこの部分に新たにI-SceIによる切断認識部位が組込まれていることを確認した。最小培地で生育しないことを確認し、最終的に2番染色体B-locusに5’ΔpyrGが組込まれ、4番染色体166-locusに3’ΔpyrGが組込まれ、重複転座用の親株(AO-BN43株)を得た。
部位特異的切断による染色体重複転座株の作製は、以下の通りに行った。重複転座用の親株の分生子をポリペプトンデキストリン液体培地に接種し30℃で14時間培養した。形質転換と同様の方法でプロトプラストを調製し、I-SceIで処理後(方法の項参照)、1.2 MソルビトールCZプレート上に重層し、30℃で約一週間静置培養した。その結果、再生株として1株(BN1-1株)が得られた。重複転座用の親株はウリジン要求性であるため、そのままでは生育出来ないが、I-SceIにより切断された4番染色体の3’ΔpyrGが2番染色体の5’ΔpyrGによって修復されることにより、完全型pyrGとして相補されることが期待される。
続いて、得られた重複転座候補株に対し、PCRを用いて染色体上の狙った位置で重複転座が起きているかどうかを確認した。使用したプライマーの配列を表2に示す。図9に示すように、2番染色体上の転座境界領域および4番染色体上の転座境界領域の両隣接領域にプライマーを組合せ、PCR産物が増幅されるか否かにより、重複転座の有無を確認できる。転座が起きる前の状態では2番染色体上の5‘ΔpyrG の両サイドに配置したプライマーB-U&B-Lの組合せ(1)、および4番染色体上の3’ΔpyrGの両サイドに配置したプライマーct166-U&ct166-Lの組合せ(2)、それぞれで、約5-kbのバンドの増幅が見られる。これに対し、相互転座が起きた場合には、プライマーB-U&ct166-Lの組合せ(3)、およびプライマーct166-U&B-Lの組合せ(4)でバンドが増幅する。一方、重複転座が起きた場合にはプライマーB-U&B-Lの組合せ(1)、およびプライマーct166-U&B-Lの組合せ(4)でバンドが増幅されると考えられる。そこで今回得られた重複転座の候補株であるBN1-1株よりゲノムDNAを調製し、PCRを行った。その結果、BN1-1株ではプライマーB-U&B-Lの組合せ(1)、およびプライマーct166-U&B-Lの組合せ(4)でバンドが増幅され、プライマーct166-U&ct166-Lの組合せ(2)およびプライマーB-U&ct166-Lの組合せ(3)ではバンドが検出されなかった。このことから、BN1-1株では、染色体上の狙った領域で重複転座が起きていることが示された(図9左下、電気泳動図)。
続いてリアルタイムPCR(定量PCR)を用いて2番染色体の重複領域における各遺伝子のコピー数をコントロール株(Wt:RIB40株)および染色体重複転座株(BN1-1株)で比較した(図10および図11)。実験では他の染色体に存在し、コピー数が1であるrad52をノーマライザーとして使用し、2番染色体の重複転座領域内のセントロメア側の端に位置するB1036遺伝子(Alp)とそこからテロメア側に490 kb離れた位置に存在するB1212(prtT)遺伝子およびさらにテロメア側に位置するB1440遺伝子とB1555遺伝子、および転座した先の4番染色体上の領域に位置するD0024遺伝子およびD0123遺伝子(図3参照)、さらに重複転座領域全く別の染色体である8番染色体に位置するH19遺伝子をターゲットとして、SYBR Greenを用いた相対的定量法により、親株におけるコピー数との比較を行った。図10および図11に各遺伝子のコピー数のコントロール株(Wt:RIB40株)に対する相対値を示す。その結果、2番染色体の重複転座領域内に位置するB1036(Alp)遺伝子、B1212(prtT)遺伝子、B1440遺伝子、B1555遺伝子のコピー数はいずれも染色体重複転座株(BN1-1株)ではコントロール株に比較して約2倍の値に増幅していた。一方、重複転座した先の4番染色体に上に位置するD0024遺伝子およびD0123遺伝子は染色体重複株(BN1-1株)では消失していることが判明した(図10および図11)。また重複転座領域とは別の8番染色体に位置するH19遺伝子のコピー数は1で変化がなかった。
実施例1と同様に、染色体重複を持たないコントロール株(Ct株)と重複株とで比較を行なった。その結果を表5に示す。プロテアーゼ活性については、コントロール株(Ct株)の活性に対し、染色体重複転座株(BN1-1株)では約2.5倍程度に活性値が上昇していた。
続いてα‐アミラーゼ活性についても同一の酵素液を用いて測定を行なった。その結果を表6に示す。その結果、コントロール株(Ct株)の活性値に対し、染色体重複転座株(BN1-1株)での活性値は約1.5倍程度に上昇していることが明らかとなった。
Claims (15)
- アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の5’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の5’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の3’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の5’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
- アスペルギルス属に属する菌において、或る染色体上の重複転座の対象となるターゲット領域のセントロメア側の外側にコード領域の3’ 末端の一部が欠損した形質転換マーカー遺伝子が該遺伝子の3’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれ、該ターゲット領域と置き換えられる別の染色体上の領域のセントロメア側の外側にコード領域の5’ 末端の一部が欠損した該形質転換マーカー遺伝子がその3’末端がセントロメア側に位置するように組み込まれていることを特徴とする、形質転換体。
- コード領域の5’又は3’末端の一部が欠損した2つの形質転換マーカー遺伝子に共通して存在する該遺伝子のコード領域の中間部分が100bp〜2kbの塩基を有する、請求項1又は2に記載の形質転換体。
- 形質転換マーカー遺伝子が、pyrG、sC及びniaDから成る群から選択される、請求項1ないし3のいずれか一項に形質転換体。
- 形質転換マーカー遺伝子のいずれか一方又はその両方のコード領域の中間部分に存在する相同配列領域に予め制限酵素認識部位が導入されている、請求項1ないし4のいずれか一項に記載の形質転換体。
- 制限酵素がI-sceI、I-ceuI、PI-pspI及びPI-sceIから成る群から選択される、請求項5記載の形質転換体。
- 制限酵素認識部位が相同組換えによって導入されたものである、請求項5又は6に記載の形質転換体。
- アスペルギルス属に属する菌がアスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項1ないし7のいずれかに記載の形質転換体。
- アスペルギルス属に属する菌の染色体上の任意の領域を重複転座させる方法であって、
(1)請求項1ないし8のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、
(2)2つの異なる染色体に組み込まれた夫々の形質転換マーカー遺伝子のコード領域の中間部分に共通して存在する相同配列領域間における二重鎖切断時の修復機構を介した、該形質転換体における2つの異なる染色体の間での相同組換えによって、該ターゲット領域が重複転座された菌株を得、
(3)上記の相同組換えによってコード領域の完全長が構築された該形質転換マーカー遺伝子に基づく形質によって、該ターゲット領域が重複された菌株を選択することから成る、前記方法。 - 形質転換体が多核の状態にあることを特徴とする、請求項9記載の方法。
- 形質転換体に紫外線照射することによって、2つの異なる染色体の間での相同組換えを促進させることを特徴とする、請求項9又は10記載の方法。
- 制限酵素の作用下に形質転換体を培養して相同組換えを生起させる、請求項9ないし11のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法で得られた、染色体上に重複転座領域を有するアスペルギルス属に属する菌。
- アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである、請求項13記載のアスペルギルス属に属する菌。
- 重複転座領域が千kb以上である、請求項13又は14記載のアスペルギルス属に属する菌。
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