WO2011098458A2 - Verfahren zum rekonstruieren eines histologischen volumens und messvorrichtung - Google Patents

Verfahren zum rekonstruieren eines histologischen volumens und messvorrichtung Download PDF

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Jose Gardiazabal-Schilling
Marco Feuerstein
Tim Hauke Heibel
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Technische Universität München
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    • G06T2210/41—Medical

Definitions

  • the present invention relates to a measuring device for the examination of tissue samples, and in particular relates to a device for reconstructing a histological volume from a stack of successive sectional images of a tissue sample. Furthermore, the present invention relates to a histological volume reconstruction method.
  • Microscopes examined. In the so-called morphological diagnosis is based on the appearance and the
  • Histological tissue samples include u.a. Surgical preparations, such as
  • microtome used.
  • Such a microtome can as a
  • Carriage microtome or a rotary microtome are performed.
  • the preparations obtained with the microtome are then examined microscopically.
  • the object of the present invention is an improved reconstruction method and a corresponding measuring device for the reconstruction of a histological
  • the above object is achieved by a camera support for mounting a camera for receiving a reference image with the features of claim 13.
  • the above task is accomplished by a
  • An essential idea of the invention is reference images from a cut surface of the tissue sample
  • Tissue sample on the basis of stored reference images associated with each other, then the associated and
  • the present invention provides a method for reconstructing a histological
  • Volume from a stack of consecutive sectional images a tissue sample having at least one cut surface comprising the steps of: providing the
  • Sectional view of a histological layer and assembling the aligned and aligned slice images to the histological volume.
  • the present invention provides a camera support including a bottom plate and a positioning device attached to the bottom plate, which is designed for the spatial positioning of a camera with respect to the bottom plate, wherein the
  • Attachment of the camera and at least one actuating unit which is designed to set a spatial position of the fastener along at least one axis.
  • the positioning device can also be located on the microtome or on the table on which the microtome is located.
  • FIG. 1 shows a perspective view of a measuring system for the reconstruction of a histological volume, wherein the measuring system comprises a carriage microtome, according to a typical embodiment; a detailed view of that shown in Fig. 1
  • the measuring system comprises a rotary microtome, according to another typical embodiment; another perspective view of the measuring system shown in Figure 3; a detailed view of a deflecting mirror for
  • FIG. 1 Deflection of an optical beam path for recording reference images in the in Figs. 3 and 4 measuring system shown; a perspective view of a camera support, which can be used with a microtome of Figures 1 to 5; another perspective view of the camera support shown in Figure 6; Yet another perspective view of the camera support shown in Figures 6 and 7. Yet another perspective view of the camera support shown in Figures 6 to 8. and a flowchart for illustrating a
  • FIG. 1 is a perspective view of a measurement system for reconstructing a histological volume from a stack of successive sectional images of a tissue sample according to a first embodiment.
  • a cutting device 300 which is designed as a carriage microtome (see also below description with reference to FIG. 2).
  • the carriage microtome has a sample holder 302 in which a tissue sample, for example, embedded in paraffin or similar material, can be introduced.
  • a guide carriage see Fig. 2
  • a tissue sample for example, embedded in paraffin or similar material
  • Microtome blade 301 is mounted, which is moved over the sample holder 302 and a thin histological layer of the
  • Tissue sample (not shown in FIG. 1) by movement of the microtome blade 301 relative to the tissue sample ablates.
  • This histological layer is then removed, placed in a liquid, such as water, and mounted on a substrate, such as a glass support. Subsequently, the histological layer can be examined by, for example, staining it with an HE stain (hematoxylin-eosin stain) and digitizing it with an image digitizing device such that a sectional image of the wounded on the substrate histological layer is obtained.
  • HE stain hematoxylin-eosin stain
  • Brightfield microscopy also fluorescence microscopy, confocal microscopy, multiphoton microscopy, electron microscopy, or any combination thereof can be used for image digitization.
  • the measuring system shown in Fig. 1 further has a
  • Carrier frame 104 includes. On the support frame 104, a camera 102 is mounted, on which a cut surface of the tissue sample can be imaged. The cut surface of the tissue sample is before ablating a respective
  • histological layer taken with the camera and stored as a reference image.
  • a histological volume can be
  • the previously digitized histological sectional images are thus brought into a local, geometric reference relationship to corresponding reference images recorded during the cutting process.
  • the reference images are generated by the camera 102, which is at the
  • Support frame 104 is attached.
  • the camera 102 arranged such that the optical axis of the camera 106 is approximately orthogonal to the cutting direction.
  • the reference image is generated at the exact moment that the sample is not obscured by the blade or other parts of the cutting device 300 (microtome). For example, it is possible to automatically perform cuts by the cutting device 300, such that image acquisition by an algorithm is automatic
  • Tissue sample can thus be determined depending on one
  • Position of the microtome blade in relation to the tissue sample or in dependence on a detected position of the tissue sample are performed automatically. For example, taking the reference image of the cut surface of the tissue sample may be performed in response to the detected position of the microtome blade relative to the tissue sample or in response to a sensed position of the tissue sample after an elapse of a predetermined latency period.
  • the image acquisition during the transition to the next cut is triggered, for example, by a sensor attached to the measuring system (see FIG. 2) or manually.
  • Reconstruction of the histological volume then takes place a spatial orientation of corresponding images or subvolumes of these image stacks.
  • a subvolume for example, a three-dimensional structure becomes
  • Reference image can be an alignment of 2D coordinates or alignment of 3D coordinates of at least one
  • the quality of an alignment can be checked or optimized with iterative methods.
  • the alignment can be done by a (semi-) automatic
  • Image registration algorithm which global (eg perspective, affine, isometric with or without
  • Such coordinate transformations form coordinates of the histological slice stack in coordinates of the
  • a global transformation is a transformation that treats each pixel coordinate in the same way, e.g.
  • a nonrigid transformation is a change of spatial
  • Image registration is the process by which a transformation can be automatically calculated from given images or from information extracted from images, so that the
  • corresponding structures of the images can be superimposed.
  • an optimization can be carried out, the distance of corresponding markers and anatomical landmarks, which for this purpose in a
  • Labeling are introduced, minimized; Further, an optimization can be carried out, the distance of the color ⁇ or intensity values of corresponding image or
  • Volume elements (pixels or voxels) are minimized.
  • the correspondence of the landmarks and landmarks is within the registration algorithm either via a next-point criterion, or by matching
  • Landmarks is determined by a distance standard
  • the Euclid 's standard (L2 standard) or the Ll standard is calculated.
  • the distance of color or intensity values of corresponding image or volume elements is determined by comparative measures (for example, sum of squared values)
  • Cuts are piled to a volume.
  • Providing the tissue sample may include at least one
  • a tissue sample in a paraffin block including the tissue sample in resin, and any combination thereof.
  • Histological sectional images are digitized sections produced in a histological process, which are located on substrates or on the substrate. Digitization is typically done with a scanner by microscope camera and illumination system
  • An image stack is a collection of consecutive images from the same tissue sample.
  • a microtome may be employed which may be embodied as a carriage microtome or a rotary microtome. The tissue sample is added
  • Carrier frame 104 is mounted at an angle of approximately 45 °, which makes it possible to attach the camera facing downward and to record the tissue sample facing the front.
  • Carrier frame 104 both
  • Microtome types may also be provided with a stabilization stage on which the assembly together with the microtome
  • the local resolution of the scanned images which is generally known by a separate calibration of the histological scanner, may be related to the local resolution of the image
  • Camera images may also be determined by a camera calibration algorithm within the image plane that relates to the histological tissue sample.
  • image processing techniques are used to improve structural similarities. Such a pre-processing step takes place before the actual registration. To do this
  • Embedding material such as paraffin
  • a method is used to analyze the histological sections
  • Render three-dimensional reconstructed volumes This rendering creates an image on the computer screen, either by "flipping through” the image stack via a user interaction or by computing a new virtual one
  • the volumes reconstructed from the histological sections will eventually allow volumetric measurements to be performed semi-automatically or fully automatically by performing geometric extraction of landmarks or anatomical landmarks. For example, a tumor region can be extracted from the volume, and its volumetric spread can be calculated.
  • the extraction can be manual, semi-automatic or automatic via a software user interface
  • histological layer provided.
  • An overview staining for example a hematoxylin-eosin stain or an azan stain, a connective tissue or supporting tissue depiction, for example a Van Gieson stain, a
  • Lipid representation for example, a Sudan-I I-staining, a carbohydrate representation, for example, a Alcianblau- staining, an amyloid representation, for example a
  • Congo red stain a pigment representation, for example a Berlin blue reaction stain, a microorganism representation, for example a Gram stain, for example by safranin-O, a representation of neurological structures, for example a crescent-fast stain, a
  • Fluorescence staining for example DAPI, cyanide (Cy3, Cy5) or Fitc staining, immunohistochemical staining, staining for electron microscopy, in situ hybridization staining (ISH), fluorescence in situ Hybridization stains (FISH), and any
  • Microtome 301 of the microtome 300 is removed, is typically in a range of 2 pm to 15 pm.
  • FIG. 2 is a detail view of a portion of the microtome 300 shown in FIG. 1, with the microtome blade 301 and the sample holder 302 shown in more detail.
  • the microtome 300 is attached to the bottom plate 101 or to the support frame 104 to which a camera to be described later for capturing reference images can be attached.
  • the attachment of the microtome 300 to the bottom plate 101 or to the support frame 104 can be done by screwing by means of a screw connection. Further, the microtome 300 can be placed without screwing only on the bottom plates 101 or on the support frame 104.
  • the microtome blade 301 is attached to a guide carriage 304 which is used to move the microtome blade 301 along the surface of the sample (not shown) into the sample holder 302 is einbringbar, is suitable. In this way, a histological layer of the tissue sample through the
  • Microtome 301 are removed. Before removing the histological layer, as below
  • a reference image of the cut surface of the tissue sample is taken.
  • the surface of the tissue sample must be optically accessible, i. the microtome blade 301 is in a retracted state as shown in FIG.
  • Imaging process is a sensor unit 303, which detects when the guide carriage 304 of the microtome 300 is retracted, such that the microtome blade 301, the surface of the tissue sample releases.
  • the sensor unit 303 may include a sensor selected from the
  • Group which consists of a limit switch, a button, an ultrasonic sensor, a laser sensor, a
  • Infrared sensor and any combination thereof.
  • Sensor unit 303 thus provides a signal which indicates when the surface of the tissue sample for a recording of a reference image is optically freely accessible. That shown in the typical embodiment of Figs. 1 and 2
  • the microtome is shown as a slide microtome such that removal of the tissue sample from the sample holder 302 is provided by displacement of the guide carriage 304.
  • FIG. 3 is a perspective view of a measuring system according to another typical embodiment.
  • a microtome 300 shown in Fig. 3 is formed as a rotary microtome.
  • the sample holder 302 is such
  • a surface i. a cut surface of the tissue sample is oriented perpendicular to the bottom plate 101.
  • a vertical linkage 204th On the bottom plate 101 is a vertical linkage 204th
  • a camera 102 is mounted, which from above, ie with an optical axis aligned perpendicular to the bottom plate 101st
  • a camera assembly is provided in connection with a cryostat.
  • a cryostat is a cutting device that contains a sample and a blade in an upwardly open, cooled chamber, and with which manual or motorized thin layers can be removed from a sample. The structure of the cryostat is different from the above
  • said carriage microtome and rotary microtome such that typically a substructure identifies the cryostat as a ground-based device that can not be mounted on a table.
  • the structure of the camera is not used together with the camera mount 100, but in
  • an alternative camera carrier can be provided, which is mounted on a surface located above and behind or next to the cutting chamber and in turn deflects the observation beam path of the camera onto the sample by means of a deflection mirror.
  • the alternative camera carrier may have actuators, one
  • a positioning device 200 which includes a first actuator (not shown) and the second and third actuators 202 and 203, serves to adjust the camera in three axes (x, y, z) with respect to the bottom plate 101 so that the intersection of the Tissue sample is imaged on the camera 102.
  • FIG. 4 is another perspective view of the measurement system shown in FIG. 3 for reconstructing a histological volume from a stack of successive slice images of a tissue sample.
  • FIG. The microtome 300 is in turn mounted on the bottom plate 101, with the bottom plate
  • the 101 may have positioning recesses for placing the microtome 300 such that a reproducible positioning of the microtome 300 is provided on the bottom plate 101.
  • a camera carrier 100 for holding the camera 102 includes the bottom plate 101, the positioning unit 201 consisting of the first setting unit 201, the second setting unit 202, and the third setting unit 203, the vertical linkage 204, and the horizontal linkage 205.
  • the camera carrier 100 is described below with reference to FIGS. 6 to 9 explained in more detail.
  • first, second and third actuators 201, 202 and 203 may be formed as a linear stage.
  • Actuator 201 is attached to the bottom plate 101. In a direction shown by a double arrow x, the vertical linkage 204 is moved by the first actuator unit 201 with respect to the bottom plate 101. On the vertical linkage 201, the second actuator 202 is mounted, which a
  • the second actuator 202 is connected to the third actuator 203, which has a
  • a mounting unit 206 is attached to which the camera 102 is attached. In this way it is possible for the camera 102 to be in three
  • FIG. 5 is a perspective detail view of the measuring system shown in FIG. 4, to illustrate the deflection of the optical camera axis 106 in a direction perpendicular to the cut surface of the tissue sample.
  • Deflection mirror 103 attached to a mirror holder 107 at an angle of approximately 45 ° to the bottom plate 101, such that the optical beam path 105 is deflected by approximately 90 °. In this way, the optical camera axis 106 can be perpendicular to the bottom plate 101.
  • the camera 102 includes a lighting ring configured to illuminate the tissue sample.
  • the Fign. Figures 6, 7, 8 and 9 show a camera carrier 100 according to a typical embodiment in different perspective views, respectively.
  • the camera carrier 100 includes the bottom plate 101 and the first, second and third actuators 201, 202 and 203
  • a free surface of the bottom plate 101 which is shown on the left in FIG. 6, serves to receive a microtome.
  • the optical camera axis 106 of the camera 102 is substantially perpendicular to the bottom plate 101
  • the optical camera axis 106 hits the
  • Deflection mirror 103 which is attached to the mirror holder 107 at an angle of approximately 45 ° to the bottom plate 101.
  • first, second and third actuators 201, 202 and 203 may be configured as a phaser having a predetermined stroke, i. have a predetermined adjustment.
  • the first actuator 201 provides a stroke in a range of 2 cm to 6 cm, and even more
  • This stroke corresponds to the adjustment path length x shown in FIG. 4
  • Actuator 203 is designed to set a
  • the second actuator 202 provides a stroke in a range of 30 cm to 50 cm, and more typically a 40 cm stroke. This stroke corresponds to a displacement z in the vertical direction, i. approximately orthogonal to
  • the stroke that the third actuator 203 provides corresponds to an adjustment length z shown in FIG.
  • At least one of the actuators 201, 202, 203 may be electrically operated.
  • FIG. 7 is another perspective view of FIG.
  • Deflection mirror 103 is shown obliquely from behind. Of the
  • Camera carrier 100 may further include vibration damping
  • vibration damping feet on the bottom plate 101 a weight of the bottom plate 101, active damping elements, or any combination thereof.
  • Fig. 8 corresponds to a perspective view of Fig. 4, wherein in Fig. 8, the camera carrier 100 without the
  • Microtome 300 is shown.
  • Deflection mirror 103 is shown obliquely from behind.
  • FIG. 10 is a flow chart illustrating a method of reconstructing a histological volume from a stack of successive slice images of a tissue sample, wherein the tissue sample includes at least one of a tissue sample
  • the camera carrier as a modular unit. As a result, this may e.g. to existing ones
  • the camera carrier is not firmly connected to the cutting device.
  • the measuring device according to embodiments of the invention may be used together with a cryostat because the camera carrier is modular. According to others typical embodiments described with here
  • the camera is a macroscopic camera, so for example, is not connected to a microscope or has no magnifying optics analogous to that of a microscope or an enlargement of less than 10.
  • Block 401 the procedure starts.
  • Block 402 serves to provide the tissue sample whose histological volume is to be reconstructed from the stack of successive slice images of the tissue sample.
  • a reference image of the cut surface of the tissue sample is taken. This cut surface is a cut surface, which arises after a removal of a
  • the recorded reference image is displayed in a block 404
  • a histological layer is removed from the cut surface of the tissue sample with the aid of the microtome, as described above with reference to FIGS. 1 to 3.
  • the histological layer is mounted on a substrate. Such a process step is necessary to be able to digitize the typically very thin tissue sample. After putting up the
  • step 406 a sectional image of the histological layer grown on the substrate is taken in step 407.
  • Such recording of the sectional image can in one
  • Image digitizing device take place. This will not be described in detail here, since it is not required for understanding the invention.
  • the recorded slice image can now be aligned geometrically with the stored reference image.
  • Such geometric alignment can be performed by a transformation model.
  • the transformation can be considered a global transformation
  • Transformation corresponds to a local orientation of the recorded slice image with the stored
  • stored reference image is a pair of images
  • the aligned slice image is assigned to at least one further recorded slice image of the histological slice.
  • the histological volume is reconstructed from a stack of successive sectional images of the tissue sample.
  • the procedure ends in a block 411.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Messsystem und ein Verfahren zum Rekonstruieren eines histologischen Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe bereit. Nach einem Bereitstellen der Gewebeprobe wird ein Referenzbild der Schnittfläche der Gewebeprobe aufgenommen und abgespeichert. Eine histologische Schicht wird von der Schnittfläche der Gewebeprobe mittels eines Mikrotoms abgetragen und auf ein Substrat aufgezogen. Anschließend wird ein Schnittbild der auf dem Substrat aufgezogenen histologischen Schicht aufgenommen. Ein geometrisches Ausrichten des aufgenommenen Schnittbilds mit dem abgespeicherten Referenzbild und ein Zuordnen des ausgerichteten Schnittbildes zu mindestens einem weiteren aufgenommenen Schnittbild einer histologischen Schicht wird durchgeführt, um einander zugeordnete und ausgerichtete Schnittbilder zu dem histologischen Volumen zu kombinieren.

Description

VERFAHREN ZUM REKONSTRUIEREN EINES HISTOLOGISCHEN VOLUMENS
UND MESSVORRICHTUNG
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Messvorrichtung zur Untersuchung von Gewebeproben, und betrifft insbesondere eine Vorrichtung zum Rekonstruieren eines histologischen Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Rekonstruktionsverfahren für ein histologisches Volumen.
STAND DER TECHNIK
Bei der histologischen Untersuchung von Gewebeproben werden mikrometerdünne, teilweise gefärbte Gewebeschnitte
hergestellt und optisch, beispielsweise mittels eines
Mikroskops, untersucht. Bei der so genannten morphologischen Diagnostik wird anhand des Erscheinungsbilds und des
färberischen Verhaltens der Gewebestrukturen ein
entsprechender diagnostischer Befund erstellt. Histologische Gewebeproben schließen u.a. Operationspräparate, wie
beispielsweise Magen, Darm, Niere, Probenexzisionen, wie beispielsweise Muttermal, Sehnen, Zysten und Biopsien, wie beispielsweise Magen-, Darm-, Brustgewebebiopsien ein. Durch histologische Verfahren ist es möglich, schon an winzigen Gewebestücken mikroinvasiv Diagnostik zu betreiben.
Zur Herstellung von Gewebeschnitten werden
Schnittvorrichtungen, die als Mikrotom bezeichnet werden, eingesetzt. Ein derartiges Mikrotom kann als ein
Schlittenmikrotom oder ein Rotationsmikrotom ausgeführt werden. Die mit dem Mikrotom gewonnenen Präparate werden anschließend mikroskopisch untersucht. Um ein histologisches Volumen zu rekonstruieren, müssen einzelne Gewebeschnitte einander eindeutig zugeordnet werden.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein verbessertes Rekonstruktionsverfahren und eine entsprechende Messvorrichtung zur Rekonstruktion eines histologischen
Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe bereit zustellen .
Diese Aufgabe wird durch ein in dem Patentanspruch 1
angegebenes Verfahren zum Rekonstruieren eines histologischen Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe gelöst. Ferner wird die obige Aufgabe durch einen Kameraträger zur Halterung einer Kamera zur Aufnahme eines Referenzbildes mit den Merkmalen des Patentanspruchs 13 gelöst. Darüber hinaus wird die obige Aufgabe durch ein
Messsystem zur Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe mit den Merkmalen des Anspruchs 21 gelöst.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen .
Ein wesentlicher Gedanke der Erfindung besteht darin, von einer Schnittfläche der Gewebeprobe Referenzbilder
aufzunehmen und aufeinander folgende Schnittbilder der
Gewebeprobe anhand abgespeicherter Referenzbilder einander zuzuordnen, um anschließend die zugeordneten und
ausgerichteten Schnittbilder zu einem histologischen Volumen zusammenzuset zen .
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Rekonstruieren eines histologischen
Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe, welche mindestens eine Schnittfläche aufweist, bereit, mit den Schritten: Bereitstellen der
Gewebeprobe; Aufnehmen eines Referenzbilds der Schnittfläche der Gewebeprobe; Abspeichern des aufgenommenen
Referenzbilds; Abtragen einer histologischen Schicht von der Schnittfläche der Gewebeprobe; Aufziehen der histologischen Schicht auf ein Substrat; Aufnehmen eines Schnittbilds der auf dem Substrat aufgezogenen histologischen Schicht;
Ausrichten des aufgenommenen Schnittbilds mit dem
abgespeicherten Referenzbild; Zuordnen des ausgerichteten Schnittbilds zu mindestens einem weiteren aufgenommenem
Schnittbild einer histologischen Schicht; und Zusammensetzen der einander zugeordneten und ausgerichteten Schnittbilder zu dem histologischen Volumen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Kameraträger bereit, welcher eine Bodenplatte und eine an der Bodenplatte angebrachte Positioniereinrichtung einschließt, die ausgelegt ist zur räumlichen Positionierung einer Kamera in Bezug auf die Bodenplatte, wobei die
Positioniereinrichtung ein Befestigungselement zur
Befestigung der Kamera und mindestens eine Stelleinheit aufweist, die ausgelegt ist zur Einstellung einer räumlichen Position des Befestigungselements entlang mindestens einer Achse. Alternativ kann die Positioniereinrichtung auch am Mikrotom bzw. am Tisch, auf dem das Mikrotom steht,
angebracht werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert .
In den Zeichnungen zeigen: eine perspektivische Ansicht eines Messsystems zur Rekonstruktion eines histologischen Volumens, wobei das Messsystem ein Schlittenmikrotom aufweist, gemäß einem typischen Ausführungsbeispiel; eine Detailansicht des in Fig. 1 dargestellten
Schlittenmikrotoms mit einer detaillierten Ansicht einer Mikrotomklinge; ein Messsystem zur Rekonstruktion eines
histologischen Volumens, wobei das Messsystem ein Rotationsmikrotom aufweist, gemäß einem weiteren typischen Ausführungsbeispiel; eine weitere perspektivische Ansicht des in Fig. 3 gezeigten Messsystems; eine Detailansicht eines Umlenkspiegels zur
Umlenkung eines optischen Strahlengangs zur Aufnahme von Referenzbildern in dem in den Fign. 3 und 4 gezeigten Messsystem; eine perspektivische Ansicht eines Kameraträgers, der mit einem Mikrotom der Fig. 1 bis 5 verwendet werden kann; eine weitere perspektivische Ansicht des in Fig. 6 dargestellten Kameraträgers; noch eine weitere perspektivische Ansicht des in den Fig. 6 und 7 dargestellten Kameraträgers; noch eine weitere perspektivische Ansicht des in den Fig. 6 bis 8 dargestellten Kameraträgers; und ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines
Verfahrens zum Rekonstruieren eines histologischen Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe.
In den Zeichnungen bezeichnen gleiche Bezugszeichen gleiche oder funktionsgleiche Komponenten oder Schritte.
WEGE ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG Im Folgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung detaillierter beschrieben.
Fig. 1 ist eine perspektivische Ansicht eines Messsystems zur Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe gemäß einem ersten Ausführungsbeispiel. Zur Erzeugung
histologischer Schichten ist eine Schnittvorrichtung 300 bereitgestellt, welches als ein Schlittenmikrotom (siehe auch untenstehende Beschreibung in Bezug auf Fig. 2) ausgebildet ist. Das Schlittenmikrotom weist einen Probenhalter 302 auf, in welchen eine Gewebeprobe, beispielsweise eingebettet in Paraffin oder ähnlichem Material, eingebracht werden kann. Auf einem Führungsschlitten (siehe Fig. 2) ist eine
Mikrotomklinge 301 angebracht, die über den Probenhalter 302 bewegt wird und eine dünne histologische Schicht der
Gewebeprobe (in Fig. 1 nicht gezeigt) durch eine Bewegung der Mikrotomklinge 301 in Bezug zur Gewebeprobe abträgt.
Diese histologische Schicht wird anschließend entnommen, in eine Flüssigkeit, wie beispielsweise Wasser eingebracht und auf ein Substrat, wie beispielsweise einen Glas-Ob ektträger, aufgezogen. Anschließend kann die histologische Schicht untersucht werden, indem sie beispielsweise durch eine HE- Färbung (Hämatoxylin-Eosin-Färbung) eingefärbt und mit einem Bilddigitalisierungsgerät digitalisiert wird, derart, dass ein Schnittbild der auf dem Substrat aufgezogenen histologischen Schicht erhalten wird.
Weiterhin sei darauf hingewiesen, dass neben der
Hellfeldmikroskopie auch Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Mikroskopie, Multiphoton-Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, oder jedwede Kombination davon zur Bilddigitalisierung eingesetzt werden kann.
Das in Fig. 1 gezeigte Messsystem weist ferner einen
Kameraträger auf, der eine Bodenplatte 101 und einen
Trägerrahmen 104 einschließt. An dem Trägerrahmen 104 ist eine Kamera 102 angebracht, auf welche eine Schnittfläche der Gewebeprobe abgebildet werden kann. Die Schnittfläche der Gewebeprobe wird vor einem Abtragen einer jeweiligen
histologischen Schicht mit der Kamera aufgenommen und als ein Referenzbild abgespeichert. Durch die Zuordnung des
Referenzbildes zu dem Schnittbild ist es möglich, das digitalisierte Schnittbild anschließend mit dem
abgespeicherten Referenzbild auszurichten und das
ausgerichtete Schnittbild mindestens einem zuvor
aufgenommenen Schnittbild einer histologischen Schicht zuzuordnen. Ein histologisches Volumen lässt sich
anschließend anhand der zugeordneten und ausgerichteten
Schnittbilder zusammensetzen.
Um einen Stapel aufeinander folgender, gegebenenfalls gefärbter histologischer Schnittbilder einer Gewebeprobe zu rekonstruieren, werden somit die zuvor digitalisierten histologischen Schnittbilder zu während des Schneidevorgangs aufgenommenen, korrespondierenden Referenzbildern in eine örtliche, geometrische Beziehung gebracht. Die Referenzbilder werden durch die Kamera 102 erzeugt, welche an dem
Trägerrahmen 104 befestigt ist. Hierbei ist die Kamera 102 derart angeordnet, dass die optische Achse der Kamera 106 annähernd orthogonal zur Schnittrichtung verläuft.
Vor einem einzelnen Schnitt der Gewebeprobe wird dann
automatisch ein Bild (Referenzbild) des noch ungeschnittenen Blocks der Gewebeprobe erzeugt. Das Referenzbild wird genau in dem Augenblick erzeugt, in dem die Probe nicht durch die Klinge oder andere Teile des Schneidegeräts 300 (Mikrotom) verdeckt ist. Beispielsweise ist es möglich, Schnitte durch das Schneidegerät 300 automatisch durchzuführen, derart, dass eine Bildaufnahme durch einen Algorithmus automatisch
ausgelöst wird.
Das Aufnehmen des Referenzbilds der Schnittfläche der
Gewebeprobe kann somit in Abhängigkeit von einer erfassten
Position der Mikrotomklinge in Bezug zur Gewebeprobe oder in Abhängigkeit von einer erfassten Position der Gewebeprobe automatisch durchgeführt werden. Beispielsweise kann das Aufnehmen des Referenzbilds der Schnittfläche der Gewebeprobe in Abhängigkeit von der erfassten Position der Mikrotomklinge in Bezug zur Gewebeprobe oder in Abhängigkeit von einer erfassten Position der Gewebeprobe nach einem Verstreichen einer vorgebbaren Latenzzeit durchgeführt werden. Im Fall einer manuellen Betätigung der Schneidevorrichtung wird die Bildaufnahme während des Übergangs zum nächsten Schnitt beispielsweise durch einen an dem Messsystem angebrachten Sensor (siehe Fig. 2) oder manuell ausgelöst.
Nach einer Digitalisierung der histologischen Schnitte, welche mit oder ohne vorheriger Färbung erfolgen kann, stehen dann zwei Stapel aufeinander folgender Bilder zur Verfügung: (i) ein erster Stapel potenziell gefärbter histologischer Schnittbilder und (ii) ein weiterer Stapel von optischen Referenzbildern, die während des Schnittvorgangs von der Schnittfläche erstellt wurden. Eine dreidimensionale
Rekonstruktion des histologischen Volumens erfolgt dann durch eine räumliche Ausrichtung korrespondierender Bilder oder Subvolumina dieser Bildstapel. Als ein Subvolumen wird beispielsweise eine dreidimensionale Struktur aus
Bildelementen (Voxel) bezeichnet. Die Ausrichtung des aufgenommenen Schnittbilds mit dem abgespeicherten
Referenzbild kann eine Ausrichtung von 2D-Koordinaten oder eine Ausrichtung von 3D-Koordinaten mindestens eines
Subvolumens einschließen. Gemäß typischen Ausführungsformen, kann die Qualität einer Ausrichtung mit iterativen Verfahren überprüft bzw. optimiert werden.
Die Ausrichtung kann durch einen (semi-) automatischen
Bildregistrierungsalgorithmus erfolgen, welcher globale (z. B. perspektivische, affine, isometrische mit oder ohne
Skalierung (rigide, isometrische) oder lokale (nicht-rigide, nicht-lineare) Koordinatentransformationen durchführt.
Derartige Koordinatentransformationen bilden Koordinaten des histologischen SchnittStapels in Koordinaten des
entsprechenden digitalen Bildstapels ab.
Eine globale Transformation ist eine Transformation, die jede Pixelkoordinate in gleicher Weise behandelt, z.B.
hinsichtlich einer Änderung der räumlichen Ausrichtung, die durch eine Isometrie beschrieben werden kann. Eine nichtrigide Transformation ist eine Änderung der räumlichen
Ausrichtung, die nur durch nicht-lineare mathematische
Abbildungen beschrieben werden kann.
Das Ausrichten des aufgenommenen Schnittbilds mit dem
zugehörigen abgespeicherten Referenzbild schließt eine
Bildregistrierung ein, die mittels geometrischer Marker, einer Merkmalsextraktion, Landmarken, anatomischen
Orientierungspunkten, Texturen, Intensitäts- oder Farbvergleichen, von der Intensität oder einem Farbwert abgeleiteten Merkmalen und jedweder Kombination davon
durchgeführt werden kann. Als Bildregistrierung wird der Vorgang bezeichnet, mit dem aus gegebenen Bildern bzw. aus von Bildern extrahierten Informationen eine Transformation automatisch berechnet werden kann, so dass die
korrespondierenden Strukturen der Bilder überlagert werden können . Hierfür kann eine Optimierung durchgeführt werden, die den Abstand korrespondierender Markierungen und anatomischer Orientierungspunkte, welche zu diesem Zweck in einem
vorherigen Schnitt durch Segmentierung oder manuelle
Kennzeichnung einbringbar sind, minimiert; ferner kann eine Optimierung durchgeführt werden, die den Abstand der Farb¬ oder Intensitätswerte von korrespondierenden Bild- oder
Volumenelementen (Pixel oder Voxel) minimiert.
Die Korrespondenz der Landmarken und Orientierungspunkte wird innerhalb des Registrierungsalgorithmus entweder über ein Nächster-Punkt-Kriterium, oder durch Abgleichen von
Merkmalsdeskriptoren hergestellt .
Der Abstand zwischen korrespondierenden Landmarken oder
Orientierungspunkten wird durch eine Abstandsnorm,
beispielsweise die Euklid 'sehe Norm (L2-Norm) oder die Ll- Norm errechnet. Der Abstand von Färb- oder Intensitätswerten korrespondierender Bild- oder Volumenelemente wird durch Vergleichsmaße (beispielsweise Summe der quadrierten
Differenzen, Kreuzkorrelation, "Mutual Information"), die sich direkt aus Färb- bzw. Intensitätswerten ableiten lassen, hergestellt . Nachdem der Registrierungsschritt abgeschlossen ist, wird das histologische Volumen erstellt, indem die berechneten
Transformationen auf die entsprechenden histologischen
Schnitte angewandt und nachfolgend die transformierten
Schnitte zu einem Volumen aufgeschichtet werden.
Ein Bereitstellen der Gewebeprobe kann mindestens einen
Schritt aus der Gruppe einschließen, die besteht aus einem Fixieren der Gewebeprobe, einem Verfestigen der Gewebeprobe, einem Einfrieren der Gewebeprobe, einem Einbetten der
Gewebeprobe in einem Paraffinblock, einem Einschließen der Gewebeprobe in Kunstharz, und jedweder Kombination davon.
Als histologische Schnittbilder werden digitalisierte, in einem histologischen Prozess erstellte Schnitte bezeichnet, die sich auf Substraten bzw. Ob ektträgern befinden. Eine Digitalisierung erfolgt in typischer Weise mit einem Scanner, der durch Mikroskopkamera und Beleuchtungssystem
hochauflösende Aufnahmen von Schnitten erlaubt. Weiterhin ist es möglich, neben der Hellfeldmikroskopie auch
Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Mikroskopie, Multiphoton- Mikroskopie, Elektronenmikroskopie, oder jedwede Kombination davon zur Bilddigitalisierung einzusetzen. Als ein Bildstapel wird eine Ansammlung von konsekutiven Bildern von ein und derselben Gewebeprobe bezeichnet.
Als das Schneidgerät 300 kann ein Mikrotom eingesetzt werden, welches als ein Schlittenmikrotom oder ein Rotationsmikrotom ausgeführt sein kann. Die Gewebeprobe wird beim
Schlittenmikrotom so eingespannt, dass sie von oben her sichtbar ist, beim Rotationsmikrotom so, dass sie von vorne sichtbar ist. Da sich der Benutzer typischerweise vor dem Mikrotom aufhält, ist ein Rahmenaufbau für Rotationsmikrotome durch eine Zusatzkomponente erweitert, die eine bessere
Handhabung erlaubt. Um das Arbeitsfeld des Benutzers
möglichst wenig einzuschränken, wird ein Umlenkspiegel (siehe Fig. 5 und untenstehende zugehörige Beschreibung) im
Trägerrahmen 104 in einem Winkel von ungefähr 45° angebracht, wodurch es ermöglicht wird, die Kamera mit Blickrichtung nach unten anzubringen, und die Gewebeprobe mit Blickrichtung nach vorne aufzunehmen. Für den Trägerrahmen 104 beider
Mikrotomtypen kann ferner ein Stabilisierungstisch vorgesehen werden, auf dem der Aufbau zusammen mit dem Mikrotom
angeordnet wird.
Zur räumlichen Ausrichtung der histologischen Schnittbilder zu optischen Referenzbildern ist es notwendig oder kann es notwendig sein, die örtliche Auflösung beider Bildstapel zu kennen. Zu ihrer Bestimmung wird eine Kalibrierplatte
benutzt, welche durch beide Geräte visualisiert werden kann, sowohl den histologischen Scanner, welcher histologische Schnitte digitalisiert, als auch durch die Kamera 102 des Messsystems. Nach einer Visualisierung kann die örtliche Auflösung der gescannten Bilder, die im Allgemeinen durch eine separate Kalibrierung des histologischen Scanners bekannt ist, in Bezug zu der örtlichen Auflösung der
Kamerabilder gesetzt werden. Die örtliche Auflösung der
Kamerabilder kann ferner durch einen Kamera- Kalibrierungsalgorithmus innerhalb der Bildebene, die sich auf die histologische Gewebeprobe bezieht, bestimmt werden.
Zur räumlichen Ausrichtung der optischen Referenzbilder mit den histologischen Bildern werden Bildverarbeitungstechniken zur Verbesserung von strukturellen Ähnlichkeiten verwendet. Ein derartiger Vorverarbeitungsschritt erfolgt vor der eigentlichen Registrierung. Hierzu werden
Bildverarbeitungsoperationen auf Farbkanälen oder Grauwerten genutzt, um die Ähnlichkeit der Erscheinungsbilder
korrespondierender anatomischer Strukturen zwischen den
Bildstapeln zu maximieren und hervorzuheben. Um den Kontrast zwischen Einbettungsmaterial und der histologischen Probe in den optischen Referenzbildern zu maximieren, kann das
Einbettungsmaterial, wie beispielsweise Paraffin, vor dem Schneiden entsprechend eingefärbt werden. Zur Visualisierung des Endergebnisses wird ein Verfahren verwendet, um die histologischen Schnitte bzw. das
dreidimensional rekonstruierte Volumen zu rendern. Dieses Rendering erzeugt ein Bild auf dem Computerschirm, entweder durch "Durchblättern" des Bildstapels über eine Benutzer- Interaktion oder durch Berechnung eines neuen virtuellen
Volumenschnitts durch Interpolation oder durch die Berechnung eines Pro ektionsbilds.
Die aus den histologischen Schnitten rekonstruierten Volumina erlauben schließlich volumetrische Messungen, die semiautomatisch oder vollautomatisch durchgeführt werden können, indem eine geometrische Extraktion von Landmarken oder anatomischen Orientierungspunkten durchgeführt wird. So kann beispielsweise eine Tumorregion aus dem Volumen extrahiert werden, und ihre volumetrische Ausbreitung kann berechnet werden. Die Extraktion kann manuell, semi-automatisch oder automatisch über eine Software-Benutzerschnittstelle
gesteuert werden. Auf die Weise ist es möglich, anatomisch relevante Strukturen computergestützt zu markieren und zu selektieren.
Gemäß einem typischen Ausführungsbeispiel, das mit anderen hierin beschriebenen Ausführungsbeispielen kombiniert werden kann, sind unterschiedliche Einfärbeverfahren für die
histologische Schicht bereitgestellt. Eine Übersichtsfärbung, beispielsweise eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung oder eine Azan- Färbung, eine Bindegewebe- oder Stützgewebedarstellung, beispielsweise eine Van-Gieson-Färbung, eine
Lipiddarstellung, beispielsweise eine Sudan-I I I-Färbung, eine Kohlenhydrat-Darstellung, beispielsweise eine Alcianblau- Färbung, eine Amyloid-Darstellung, beispielsweise eine
Kongorotfärbung, eine Pigment-Darstellung, beispielsweise eine Berliner-Blau-Reaktionsfärbung, eine Mikroorganismen- Darstellung, beispielsweise eine Gram-Färbung, beispielsweise durch Safranin-O, eine Darstellung neurologischer Strukturen, beispielsweise eine Kresylechtfärbung, eine
Fluoreszenzfärbung, beispielsweise eine DAPI-, Cyanid- (Cy3-, Cy5-) oder Fitc-Färbung, eine immunohistochemischen Färbung bzw. Markierung, eine Färbung für die Elektronenmikroskopie, eine in-situ-Hybridisierungsfärbung (ISH), eine Fluoreszenz- in-situ-Hybridisierungsfärbungen (FISH) , und jedwede
Kombination davon sind Verfahren in der Histologie, mit welchen die verschiedenen Strukturen eines feingeweblichen Schnitts angefärbt bzw. dargestellt werden können. Sie dienen der Unterscheidung verschiedener Gewebestrukturen im
mikroskopischen Bild anhand von unterschiedlichen
Einzelfärbungen und sind insbesondere für morphologische
Untersuchungen geeignet. In der Pathologie können mit Hilfe derartiger Färbeverfahren krankhafte Veränderungen in
Biopsien und Operationspräparaten untersucht werden. Die Dicke der histologischen Schicht, die durch die
Mikrotomklinge 301 des Mikrotoms 300 abgetragen wird, liegt typischerweise in einem Bereich von 2 pm bis 15 pm.
Fig. 2 ist eine Detailansicht eines Ausschnitts des in Fig. 1 gezeigten Mikrotoms 300, wobei die Mikrotomklinge 301 und der Probenhalter 302 detaillierter dargestellt sind. Das Mikrotom 300 ist an der Bodenplatte 101 oder an dem Trägerrahmen 104 angebracht, an welchem eine später zu beschreibende Kamera zur Aufnahme von Referenzbildern befestigt werden kann. Das Anbringen des Mikrotoms 300 an der Bodenplatte 101 oder an dem Trägerrahmen 104 kann durch ein Anschrauben mittels einer Schraubverbindung erfolgen. Ferner kann das Mikrotom 300 ohne ein Anschrauben lediglich auf die Bodenplatten 101 oder auf den Trägerrahmen 104 aufgesetzt werden. Die Mikrotomklinge 301 ist an einem Führungsschlitten 304 angebracht, welcher zur Bewegung der Mikrotomklinge 301 entlang der Oberfläche der Probe (nicht gezeigt), die in den Probenhalter 302 einbringbar ist, geeignet ist. Auf diese Weise kann eine histologische Schicht der Gewebeprobe durch die
Mikrotomklinge 301 abgetragen werden. Vor einem Abtragen der histologischen Schicht wird, wie unten stehend unter
Bezugnahme auf die Fig. 3 bis 5 erläutert werden wird, ein Referenzbild der Schnittfläche der Gewebeprobe aufgenommen. Zu diesem Zweck muss die Oberfläche der Gewebeprobe optisch zugänglich sein, d.h. die Mikrotomklinge 301 ist dabei in einem wie in Fig. 2 dargestellten zurückgezogenen Zustand.
Zur teilweisen oder vollständigen Automatisierung des
Bildaufnahmeprozesses dient eine Sensoreinheit 303, welche detektiert, wann der Führungsschlitten 304 des Mikrotoms 300 zurückgezogen ist, derart, dass die Mikrotom-Klinge 301 die Oberfläche der Gewebeprobe freigibt. Die Sensoreinheit 303 kann einen Sensor einschließen, der gewählt ist aus der
Gruppe, die besteht aus einem Endlagenschalter, einem Taster, einem Ultraschallsensor, einem Lasersensor, einem
Infrarotsensor und jedweder Kombination davon. Die
Sensoreinheit 303 liefert somit ein Signal, welches anzeigt, wann die Oberfläche der Gewebeprobe für eine Aufnahme eines Referenzbildes optisch frei zugänglich ist. Das in dem typischen Ausführungsbeispiel der Fig. 1 und 2 gezeigte
Mikrotom ist als ein Schlittenmikrotom dargestellt, derart, dass ein Abtragen der Gewebeprobe von dem Probenhalter 302 durch Verschiebung des Führungsschlittens 304 bereitgestellt wird .
Fig. 3 ist eine perspektivische Ansicht eines Messsystems gemäß einem weiteren typischen Ausführungsbeispiel. Ein in Fig. 3 gezeigtes Mikrotom 300 ist als ein Rotationsmikrotom ausgebildet. Hierbei ist der Probenhalter 302 derart
angeordnet, dass eine Oberfläche, d.h. eine Schnittfläche der Gewebeprobe, senkrecht zu der Bodenplatte 101 orientiert ist. An der Bodenplatte 101 ist ein Vertikalgestänge 204
angebracht, welches über eine zweite Stelleinheit 202 und eine dritte Stelleinheit 203 mit einem Horizontalgestänge 205 verbunden ist. An dem Horizontalgestänge 205 ist eine Kamera 102 angebracht, welche von oben, d.h. mit einer optischen Achse senkrecht ausgerichtet zu der Bodenplatte 101
angeordnet ist. Da die aufzunehmende Schnittfläche der
Gewebeprobe senkrecht zu der Bodenplatte 101 orientiert ist, wird ein Beobachtungsstrahlengang 105 um ungefähr 90° in Richtung der optischen Achse 106 der Kamera 102 mittels eines Umlenkspiegels 103 umgelenkt. Gemäß einem weiteren typischen Ausführungsbeispiel, das mit anderen hierin beschriebenen Ausführungsbeispielen kombiniert werden kann, ist ein Kameraaufbau in Verbindung mit einem Kryostat bereitgestellt. Ein Kryostat ist ein Schneidegerät, das in einer nach oben offenen, gekühlten Kammer Probe und Klinge enthält, und mit welchem manuell bzw. motorisiert dünne Schichten von einer Probe abgetragen werden können. Der Aufbau des Kryostats ist unterschiedlich zu dem oben
genannten Schlittenmikrotom und Rotationsmikrotom derart, dass typischerweise ein Unterbau das Kryostat als ein auf dem Boden stehendes Gerät ausweist, das nicht auf einem Tisch angebracht werden kann. Der Aufbau der Kamera wird nicht zusammen mit dem Kameraträger 100 verwendet, sondern in
Verbindung mit einem Stativ, das vor das Kryostat gestellt wird und an dem die Kamera allein oder einschließlich der Sensoreinheit angebracht wird. Ferner kann ein alternativer Kameraträger bereitgestellt werden, der auf einer über und hinter oder neben der Schnittkammer befindlichen Fläche angebracht ist und wiederum mittels eines Umlenkspiegels den Beobachtungsstrahlengang der Kamera auf die Probe umlenkt. Der alternative Kameraträger kann Stelleinheiten, eine
Sensoreinheit und eine Bodenplatte zur Stabilisierung
einschließen .
Durch die in Fig. 3 gezeigte Anordnung der Kamera 102
oberhalb des Mikrotoms 300 ist es möglich, platzsparend die senkrecht zu der Bodenplatte 101 angeordnete Schnittfläche der Gewebeprobe zu beobachten. Eine Positioniereinrichtung 200, welche eine erste Stelleinheit (nicht gezeigt) und die zweiten und dritten Stelleinheiten 202 und 203 enthält, dient dazu, die Kamera in drei Achsen (x, y, z) in Bezug auf die Bodenplatte 101 derart zu justieren, dass die Schnittfläche der Gewebeprobe auf die Kamera 102 abgebildet wird.
Fig. 4 ist eine weitere perspektivische Ansicht des in Fig. 3 gezeigten Messsystems zur Rekonstruktion eines histologischen Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe. Das Mikrotom 300 ist wiederum auf der Bodenplatte 101 angebracht, wobei die Bodenplatte
101Justiermulden zum Aufsetzen des Mikrotoms 300 aufweisen kann, derart, dass eine reproduzierbare Positionierung des Mikrotoms 300 auf der Bodenplatte 101 bereitgestellt ist.
Ein Kameraträger 100 zum Halten der Kamera 102 schließt die Bodenplatte 101, die aus der ersten Stelleinheit 201, der zweiten Stelleinheit 202 und der dritten Stelleinheit 203 bestehende Positioniereinrichtung 200, das Vertikalgestänge 204 und das Horizontalgestänge 205 ein. Der Kameraträger 100 ist untenstehend unter Bezugnahme auf die Fign. 6 bis 9 näher erläutert .
Es sei hier darauf hingewiesen, dass zumindest eine der ersten, zweiten und dritten Stelleinheiten 201, 202 und 203 als ein Lineartisch ausgebildet sein kann. Die erste
Stelleinheit 201 ist an der Bodenplatte 101 befestigt. In einer durch einen Doppelpfeil x gezeigten Richtung wird das Vertikalgestänge 204 durch die erste Stelleinheit 201 in Bezug zur Bodenplatte 101 bewegt. An dem Vertikalgestänge 201 ist die zweite Stelleinheit 202 angebracht, welche eine
Verschiebung in z-Richtung (Doppelpfeil z) entlang des
Vertikalgestänges 204 in einer im Wesentlichen horizontalen Richtung gestattet. Die zweite Stelleinheit 202 ist mit der dritten Stelleinheit 203 verbunden, welche eine
Horizontalbewegung, d.h. eine Bewegung in y-Richtung
(Doppelpfeil y) des Horizontalgestänges 205 erlaubt. An einem Ende des Horizontalgestänges 205 ist eine Befestigungseinheit 206 angebracht, an welcher die Kamera 102 befestigt ist. Auf diese Weise ist es möglich, die Kamera 102 in drei
Raumrichtungen, d.h. in x-, y- und z-Richtung zu justieren. Auf diese Weise wird eine Abbildung der senkrecht auf der Bodenplatte 101 stehenden Schnittfläche der Gewebeprobe auf die Kamera 102 über den Umlenkspiegel 103 ermöglicht.
Fig. 5 ist eine perspektivische Detailansicht des in Fig. 4 dargestellten Messsystems, zur Verdeutlichung der Umlenkung der optischen Kameraachse 106 in eine Richtung senkrecht zur Schnittfläche der Gewebeprobe. Um die Gewebeprobe, die in dem Probenhalter 302 angeordnet ist, in einer
Beobachtungsrichtung senkrecht zu der Bodenplatte 101 (in Fig. 5 nicht gezeigt) beobachten zu können, ist der
Umlenkspiegel 103 an einem Spiegelhalter 107 in einem Winkel von etwa 45° zur Bodenplatte 101 angebracht, derart, dass der optische Strahlengang 105 um ungefähr 90° umgelenkt wird. Auf diese Weise kann die optische Kameraachse 106 senkrecht auf der Bodenplatte 101 stehen.
Gemäß einer typischen Ausführungsform, welche mit anderen hierin beschriebenen Ausführungsformen kombiniert werden kann, schließt die Kamera 102 einen Beleuchtungsring ein, der ausgelegt ist zur Beleuchtung der Gewebeprobe. Auf diese
Weise lässt sich eine homogene Ausleuchtung der Gewebeprobe zur Aufnahme eines Referenzbilds der Schnittfläche der
Gewebeprobe erreichen. Die Fign. 6, 7, 8 und 9 zeigen einen Kameraträger 100 gemäß einer typischen Ausführungsform in jeweils unterschiedlichen perspektivischen Ansichten. Der Kameraträger 100 schließt die Bodenplatte 101 und die aus den ersten, zweiten und dritten Stelleinheiten 201, 202 und 203 bestehende
Positioniereinrichtung ein. Eine freie Fläche der Bodenplatte 101, die in Fig. 6 links gezeigt ist, dient zur Aufnahme eines Mikrotoms. Die optische Kameraachse 106 der Kamera 102 ist im Wesentlichen senkrecht zu der Bodenplatte 101
angeordnet. Die optische Kameraachse 106 trifft auf den
Umlenkspiegel 103, der in einem Winkel von ungefähr 45° zu der Bodenplatte 101 an dem Spiegelhalter 107 angebracht ist.
Die ersten, zweiten und dritten Stelleinheiten 201, 202 und 203 können beispielsweise als Linearversteller ausgebildet sein, welche einen vorgegebenen Hub, d.h. eine vorgegebene Verstellstrecke aufweisen.
In typischer Weise stellt die erste Stelleinheit 201 einen Hub in einem Bereich von 2 cm bis 6 cm, und in noch
typischerer Weise einen Hub von 4 cm bereit. Dieser Hub entspricht der in Fig. 4 gezeigten Verstellweglänge x
ungefähr parallel zur Bodenplatte 101. Die dritte
Stelleinheit 203 ist ausgelegt zur Einstellung einer
räumlichen Position des Befestigungselements 206 entlang einer ungefähr parallel zur Bodenplatte 101 und orthogonal zur x-Achse verlaufenden y-Achse mit einem Hub in einem
Bereich von 20 cm bis 40 cm, und in typischer Weise von ungefähr 30 cm.
Ferner stellt die zweite Stelleinheit 202 einen Hub in einem Bereich von 30 cm bis 50 cm, und in typischerer Weise einen Hub von 40 cm bereit. Dieser Hub entspricht einem Verstellweg z in vertikaler Richtung, d.h. ungefähr orthogonal zur
Bodenplatte 101, wie dies in Fig. 4 gezeigt ist. Der Hub, den die dritte Stelleinheit 203 bereitstellt, entspricht einer in Fig. 4 gezeigten Verstellweglänge z. Auf diese Weise ist es möglich, die Kamera 102 in drei Raumachsen, d.h. in den drei Achsen x, y und z in Bezug zu der Bodenplatte 101, auf der ein Mikrotom 300 fest anbringbar ist, zu verstellen. Somit ist es möglich, die Schnittfläche der Gewebeprobe, die von dem Probenhalter 302 des Mikrotoms 300 (siehe Fig. 3)
aufgenommen ist, optisch exakt auf die Kamera 102 abzubilden. Es sei hier darauf hingewiesen, dass mindestens eine der Stelleinheiten 201, 202, 203 elektrisch betrieben sein kann.
Fig. 7 ist eine weitere perspektivische Ansicht des
Kameraträgers 100, wobei der Spiegelhalter 107 für den
Umlenkspiegel 103 schräg von hinten gezeigt ist. Der
Kameraträger 100 kann ferner eine Vibrationsdämpfung
einschließen, die bereitgestellt ist durch
vibrationsdämpfende Füße an der Bodenplatte 101, ein Gewicht der Bodenplatte 101, aktive Dämpfungselemente, oder jedwede Kombination davon.
Fig. 8 entspricht einer perspektivischen Darstellung der Fig. 4, wobei in Fig. 8 der Kameraträger 100 ohne das
Mikrotom 300 dargestellt ist.
Fig. 9 ist eine weitere perspektivische Ansicht des
Kameraträgers 100, wobei der Spiegelhalter 107 für den
Umlenkspiegel 103 schräg von hinten gezeigt ist.
Fig. 10 ist ein Flussdiagramm zur Veranschaulichung eines Verfahrens zum Rekonstruieren eines histologischen Volumens aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder einer Gewebeprobe, wobei die Gewebeprobe mindestens eine
Schnittfläche aufweist.
Für die oben beschriebenen Ausführungsformen ist es somit möglich, den Kameraträger als modulare Einheit zur Verfügung zu stellen. Hierdurch kann dieser z.B. an existierende
Schneidevorrichtungen als Zusatzaufbau angebracht oder zum Nachrüsten zur Verfügung gestellt werden. Gemäß typischen Ausführungsformen, die mit anderen Ausführungsformen
kombiniert werden können, ist der Kameraträger nicht fest mit dem Schneidegerät verbunden. Insbesondere kann, wie oben beschrieben, die Messvorrichtung gemäß Ausführungsformen der Erfindung zusammen mit einem Kryostat verwendet werden, da der Kameraträger modular bzw. beweglich ist. Gemäß weiteren typischen Ausführungsformen, die mit hier beschriebenen
Ausführungsformen kombiniert werden können, ist die Kamera eine makroskopische Kamera, ist also zum Beispiel nicht mit einem Mikroskop verbunden bzw. hat keine vergrößernde Optik analog zu der eines Mikroskops bzw. eine Vergrößerung von weniger als 10.
In einem Block 401 startet die Prozedur. Der Block 402 dient dem Bereitstellen der Gewebeprobe, deren histologisches Volumen aus dem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder der Gewebeprobe zu rekonstruieren ist. In einem darauf folgenden Block 403 wird ein Referenzbild der Schnittfläche der Gewebeprobe aufgenommen. Diese Schnittfläche ist eine Schnittfläche, die entsteht nach einem Abtragen einer
histologischen Schicht oder unmittelbar nach einem Einsetzen der Gewebeprobe in den Probenhalter 302 (siehe Fig. 3) .
Nach einem Aufnehmen des Referenzbildes in dem Block 403 wird in einem Block 404 das aufgenommene Referenzbild
abgespeichert, damit es für eine anschließende
Weiterverarbeitung zur Verfügung steht. In einem Block 405 wird mit Hilfe des Mikrotoms eine histologische Schicht von der Schnittfläche der Gewebeprobe abgetragen, wie oben stehend unter Bezugnahme auf Fig. 1 bis 3 beschrieben.
Schließlich wird in einem Block 406 die histologische Schicht auf ein Substrat aufgezogen. Ein derartiger Prozessschritt ist nötig, um die typischerweise sehr dünne Gewebeprobe digitalisieren zu können. Nach einem Aufziehen der
histologischen Schicht auf das Substrat in dem Schritt 406 wird in dem Schritt 407 ein Schnittbild der auf dem Substrat aufgezogenen histologischen Schicht aufgenommen. Ein
derartiges Aufnehmen des Schnittbildes kann in einer
separaten Einrichtung, wie beispielsweise einer
Bilddigitalisierungseinrichtung erfolgen. Diese wird hier nicht näher beschrieben, da sie zum Verständnis der Erfindung nicht erforderlich ist. In einem nachfolgenden Schritt 408 kann nun das aufgenommene Schnittbild mit dem abgespeicherten Referenzbild geometrisch ausgerichtet werden. Ein derartiges geometrisches Ausrichten kann durch ein Transformationsmodell durchgeführt werden. Die Transformation kann als eine globale Transformation
bereitgestellt werden, bei der sämtliche Bewegungen über die Bildfläche gleich sind, oder als eine lokale, d.h. nicht¬ rigide, nicht-lineare oder deformierbare Transformation, welche Verzerrungen ausgleichen kann. Die lokale
Transformation entspricht einer lokalen Ausrichtung des aufgenommenen Schnittbildes mit dem abgespeicherten
Referenzbild unter Ausgleich von Verzerrungen.
Nach dem geometrischen Ausrichten des aufgenommenen
Schnittbildes der Gewebeprobe mit dem zugehörigen
abgespeicherten Referenzbild wird ein Bildpaar aus
aufgenommenem Schnittbild und Referenzbild erhalten. In einem Block 409 wird das ausgerichtete Schnittbild zumindest einem weiteren aufgenommenen Schnittbild der histologischen Schicht zugeordnet .
Nach einem Zuordnen von Schnittbildern ist es schließlich einem Block 410 möglich, einander zugeordnete und
ausgerichtete Schnittbilder zu dem histologischen Volumen zusammenzusetzen bzw. zu kombinieren. Auf diese Weise wird aus einem Stapel aufeinander folgender Schnittbilder der Gewebeprobe das histologische Volumen rekonstruiert. Die Prozedur endet in einem Block 411.
Obwohl die vorliegende Erfindung vorstehend anhand
bevorzugter Ausführungsbeispiele beschrieben wurde, ist sie darauf nicht beschränkt, sondern auf vielfältige Weise modifi z ierbar .
Auch ist die Erfindung nicht auf die genannten
Anwendungsmöglichkeiten beschränkt . BE ZUGS ZE ICHENLI STE
No. Part/step
100 Kameraträger
101 Bodenplatte
102 Kamera
03 Umlenkspiegel
104 Trägerrahmen
105 Strahlengang
106 optische Kameraachse
107 Spiegelhalter
200 Positioniereinrichtung
201 erste Stelleinheit
202 zweite Stelleinheit
203 dritte Stelleinheit
204 Vertikalgestänge
205 Horizontalgestänge
300 Mikrotom
301 Mikrotomklinge
302 Probenhalter
303 Sensoreinheit
304 Führungsschlitten

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zum Rekonstruieren eines histologischen
Volumens aus einem Stapel aufeinanderfolgender
Schnittbilder einer Gewebeprobe, welche mindestens eine Schnittfläche aufweist, umfassend:
Bereitstellen der Gewebeprobe;
Aufnehmen eines Referenzbilds der Schnittfläche der Gewebeprobe ;
Abspeichern des aufgenommenen Referenzbilds;
Abtragen einer histologischen Schicht von der
Schnittfläche der Gewebeprobe;
Aufziehen der histologischen Schicht auf ein Substrat;
Aufnehmen eines Schnittbilds der auf dem Substrat aufgezogenen histologischen Schicht;
Ausrichten des aufgenommenen Schnittbilds mit dem abgespeicherten Referenzbild;
Zuordnen des ausgerichteten Schnittbilds zu mindestens einem weiteren aufgenommenem Schnittbild einer
histologischen Schicht; und
Zusammensetzen der einander zugeordneten und
ausgerichteten Schnittbilder zu dem histologischen Volumen .
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Ausrichten des aufgenommenen Schnittbilds mit dem abgespeicherten Referenzbild eine Bildregistrierung umfasst, die mittels geometrischer Marker, einer Merkmalsextraktion,
Landmarken, anatomischen Orientierungspunkten, Texturen, Intensitäts- oder Farbvergleichen, von der Intensität oder einem Farbwert abgeleiteten Merkmalen, oder
jedweder Kombination davon durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Ausrichten des aufgenommenen Schnittbilds mit dem abgespeicherten Referenzbild mittels einer globalen Transformation durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Ausrichten des aufgenommenen Schnittbilds mit dem abgespeicherten Referenzbild mittels einer lokalen oder nicht-rigiden Transformation durchgeführt wird.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden
Ansprüche, wobei das Ausrichten des aufgenommenen
Schnittbilds mit dem abgespeicherten Referenzbild ein Ausrichten von 2D-Koordinaten umfasst.
6. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden
Ansprüche, wobei das Ausrichten des aufgenommenen
Schnittbilds mit dem abgespeicherten Referenzbild
Ausrichten von 3D-Koordinaten mindestens eines
Subvolumens umfasst.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden
Ansprüche, wobei das Bereitstellen der Gewebeprobe mindestens einen Schritt aus der Gruppe umfasst, di besteht aus einem Fixieren der Gewebeprobe, einem Verfestigen der Gewebeprobe, einem Einfrieren der
Gewebeprobe, einem Einbetten der Gewebeprobe in einem Paraffinblock, einem Einschließen der Gewebeprobe in Kunstharz, und jedweder Kombination davon.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, wobei vor dem Aufnehmen des Schnittbilds de auf dem Substrat aufgezogenen histologischen Schicht eine Einfärbung der histologischen Schicht vorgenommen wird .
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Einfärbung eine Färbung aus der Gruppe umfasst, die besteht aus einer Übersichtsfärbung, einer Hämatoxylin-Eosin-Färbung, einer Azan-Färbung, einer Van-Gieson-Färbung, einer Sudan-I I I-Färbung, einer Alcianblau-Färbung, einer Kongorotfärbung, einer Berliner-Blau-Reaktionsfärbung, einer Gram-Färbung, einer Safranin-O-Färbung, einer Kresylechtfärbung, einer Fluoreszenzfärbung mittels DAPI, Cyanid, Cy3, Cy5, oder Fite, einer
immunohistochemischen Färbung, einer in-situ- Hybridisierungsfärbung, einer Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierungsfärbung, und jedweder Kombination davon
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, wobei das Aufnehmen des Referenzbilds der Schnittfläche der Gewebeprobe in Abhängigkeit von einer erfassten Position einer Mikrotomklinge in Bezug zur Gewebeprobe oder in Abhängigkeit von einer erfassten Position der Gewebeprobe automatisch durchgeführt wird.
Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden Ansprüche, wobei das Aufnehmen des Referenzbilds der Schnittfläche der Gewebeprobe in Abhängigkeit von der erfassten Position der Mikrotomklinge in Bezug zur
Gewebeprobe oder in Abhängigkeit von einer erfassten Position der Gewebeprobe nach einem Verstreichen einer vorgebbaren Latenzzeit durchgeführt wird.
12. Verfahren nach mindestens einem der voranstehenden
Ansprüche, wobei vor einem Aufnehmen des Referenzbilds der Schnittfläche der Gewebeprobe mindestens ein Marker an der Gewebeprobe angebracht wird.
13. Kameraträger, umfassend: eine Bodenplatte; und eine an der Bodenplatte angebrachte
Positioniereinrichtung, die ausgelegt ist zur räumlichen Positionierung einer Kamera in Bezug auf die
Bodenplatte, wobei die Positioniereinrichtung aufweist: ein Befestigungselement zur Befestigung der Kamera; und mindestens eine Stelleinheit, die ausgelegt ist zur Einstellung einer räumlichen Position des
Befestigungselements entlang mindestens einer Achse.
14. Kameraträger nach Anspruch 13, ferner umfassend eine
erste Stelleinheit, die ausgelegt ist zur Einstellung einer räumlichen Position des Befestigungselements entlang einer ungefähr parallel zur Bodenplatte
verlaufenden x-Achse mit einem Hub in einem Bereich von 2 cm bis 6 cm, und in typischer Weise von ungefähr 4 cm.
15. Kameraträger nach Anspruch 13 oder 14, ferner umfassend eine dritte Stelleinheit, die ausgelegt ist zur
Einstellung einer räumlichen Position des
Befestigungselements entlang einer ungefähr parallel zur Bodenplatte und orthogonal zur x-Achse verlaufenden y- Achse mit einem Hub in einem Bereich von 20 cm bis 40 cm, und in typischer Weise von ungefähr 30 cm.
16. Kameraträger nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis
15, ferner umfassend eine zweite Stelleinheit, die ausgelegt ist zur Einstellung einer räumlichen Position des Befestigungselements entlang einer ungefähr
orthogonal zur Bodenplatte verlaufenden z-Achse mit einem Hub in einem Bereich von 30 cm bis 50 cm, und in typischer Weise mit einem Hub von ungefähr 40 cm über der Bodenplatte.
17. Kameraträger nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis
16, ferner umfassend einen Umlenkspiegel, der ausgelegt ist zur Umlenkung eines Beobachtungsstrahlengangs um ungefähr 90 Grad.
18. Kameraträger nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis
17, wobei eine optische Achse der Kamera ungefähr senkrecht zur Bodenplatte ausgerichtet ist.
19. Kameraträger nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis
18, ferner umfassend eine Vibrationsdämpfung des
Kameraträgers, die bereitgestellt ist durch
vibrationsdämpfende Füße an der Bodenplatte, ein Gewicht der Bodenplatte, aktive Dämpfungselemente, einen schwingungsstabilisierten Tisch, oder jedwede
Kombination davon.
20. Kameraträger nach mindestens einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei die mindestens eine Stelleinheit elektrisch betrieben ist.
21. Messsystem zur Rekonstruktion eines histologischen
Volumens aus einem Stapel aufeinanderfolgender
Schnittbilder einer Gewebeprobe, umfassend: einen Kameraträger nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 20; eine auf dem Kameraträger angeordnete
Schnittvorrichtung, die ausgelegt ist zur Abtragung einer histologischen Schicht der Gewebeprobe; und eine an dem Kameraträger angebrachte Kamera, die ausgelegt ist zur Aufnahme eines Referenzbilds einer Schnittfläche der Gewebeprobe.
22. Messsystem nach Anspruch 21, wobei die Bodenplatte des Kameraträgers Justiermulden zum Einsetzen der
Schnittvorrichtung in den Kameraträger aufweist.
23. Messsystem nach Anspruch 21 oder 22, wobei die
Schnittvorrichtung ein Mikrotom umfasst.
24. Messsystem nach Anspruch 23, wobei das Mikrotom als ein Schlittenmikrotom oder als ein Rotationsmikrotom ausgebildet ist.
25. Messsystem nach mindestens einem der Ansprüche 21 bis 24, ferner umfassend eine Sensoreinheit, die ausgelegt ist zur Erfassung einer Position einer Mikrotomklinge in
Bezug zur Gewebeprobe bei der Abtragung einer
histologischen Schicht der Gewebeprobe.
Messsystem nach Anspruch 25, wobei die Sensoreinheit einen Sensor umfasst, der gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus einem Endlagenschalter, einem Taster, einem Ultraschallsensor, einem Lasersensor, einem
Infrarotsensor und jedweder Kombination davon.
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