DE112016006502T5

DE112016006502T5 - Beobachtungsverfahren unter Verwendung eines zusammengesetzten Mikroskops, umfassend ein gestürztes Lichtmikroskop und ein Rasterkraftmikroskop, Programm zum Ausführen des Beobachtungsverfahrens und zusammengesetztes Mikroskop

Info

Publication number: DE112016006502T5
Application number: DE112016006502.7T
Authority: DE
Inventors: Yoshitsugu UEKUSA; Nobuaki Sakai
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2016-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2018-12-13
Also published as: WO2017145381A1; JPWO2017145381A1; US20190011478A1

Abstract

Ein Beobachtungsverfahren unter Verwendung eines zusammengesetzten Mikroskops eines inversen Lichtmikroskops und eines Rasterkraftmikroskops umfasst einen Näherungsschritt (50) des Abtastens eines Cantilevers entlang einer Z-Achse, sodass sich eine Sonde einer Probenoberflächenschicht nähert, bis die Probenoberflächenschichtinformationen erfasst werden können, einen Cantilever-Beobachtungsschritt (51) des Beobachtens des Cantilevers durch das inverse Lichtmikroskop, um mindestens Forminformationen des Cantilevers zu erfassen, einen Beobachtungspositionsbewegungsschritt (52) zum Bewegen einer Beobachtungsposition des inversen Lichtmikroskops abwärts entlang der Z-Achse basierend auf mindestens einer Länge der Sonde, einen Fluoreszenzbeobachtungsschritt (53) des Ausführens von einer Fluoreszenzbeobachtung durch das inverse Lichtmikroskop, und einen Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt (54) des Abtastens des Cantilevers mindestens entlang der Z-Achse, um die Probenoberflächenschichtinformationen zu erfassen. Der Näherungsschritt, der Cantilever-Beobachtungsschritt und der Beobachtungspositionsbewegungsschritt werden in der Reihenfolge ausgeführt. Der Fluoreszenzbeobachtungsschritt wird nach dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt ausgeführt. Der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt wird nach dem Näherungsschritt (50) ausgeführt.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Beobachtungsverfahren unter Verwendung eines zusammengesetzten Mikroskops, umfassend ein inverses Lichtmikroskop und ein Rasterkraftmikroskop.
STAND DER TECHNIK
Ein zusammengesetztes Mikroskop ist ein Mikroskopsystem, das mindestens zwei Typen von Mikroskopen kombiniert, die unterschiedliche physikalische Informationen erfassen. Ein repräsentatives Beispiel dafür ist ein zusammengesetztes Mikroskop, das ein Lichtmikroskop, das Fluoreszenzbeobachtung ausführt, und ein Rasterkraftmikroskop, das eine feine Form einer Probenoberflächenschicht beobachtet, kombiniert. Dieses zusammengesetzte Mikroskop weist einen Vorteil auf, in der Lage zu sein, eine raumzeitliche Korrelation zwischen Fluoreszenzinformationen und Probenoberflächenschichtinformationen der gleichen Probe zu erfassen.
Für ein Lichtmikroskop eines solchen zusammengesetzten Mikroskops kann beispielsweise ein Ultrahochauflösungsmikroskop (Superauflösungsmikroskop) verwendet werden, in dem eine Auflösung entlang einer Z-Achse (nachfolgend als „Z-Auflösung“ bezeichnet) verbessert wird, indem anderes Licht als Fluoreszenzlicht vermindert wird, das von einer Fokuslage (wie einem konfokalen Mikroskop, STED und STORM) emittiert wird. Die Z-Auflösung eines konfokalen Mikroskops ist 500 nm bis 1000 nm, und ein Ultrahochauflösungsmikroskop hat in jüngsten Jahren eine Z-Auflösung von 100 nm oder weniger erreicht.
Ein herkömmliches Beispiel eines solchen zusammengesetzten Mikroskops ist beispielsweise in „Impact of Actin Rearrangement and Degranulation on the Membrane Structure of Primary Mast Cells: A Combined Atomic Force and Laser Scanning Confocal Microscopy Investigation“ (Biophysical Journal Band 96, Februar 2009, 1629-1639) offenbart.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
TECHNISCHE AUFGABE
In dem obigen herkömmlichen Beispiel wird eine Probe (eine Zelle) beobachtet, bei der fluoreszenzmarkierte Stoffe nur im Innern der Probe vorhanden sind. Wenn jedoch die fluoreszenzmarkierten Stoffe sowohl innerhalb als auch außerhalb der Probe vorhanden sind, kann es unmöglich sein, eine Positionskorrelation zwischen einem Beobachtungsbild des Lichtmikroskops, das heißt, Fluoreszenzinformationen, und einem Beobachtungsbild des Rasterkraftmikroskops, das heißt, Probenoberflächenschichtinformationen, korrekt zu erhalten.
15 bis 17 zeigen schematisch die Positionsbeziehung zwischen einer Probe 42, fluoreszenzmarkierten Stoffen 44 und einem Cantilever 22 des Rasterkraftmikroskops, das nahe der Oberflächenschicht der Probe 42 ist. 15 ist eine Figur, gesehen von oberhalb einer Z-Achse, und 16 ist eine Figur, gesehen von einer positiven X-Achsen-Richtung von 15.
In 15 bis 17 ist die Probe 42 beispielsweise eine Zelle, die fluoreszenzmarkierten Stoffe 44 sind beispielsweise fluoreszenzmarkierte Viren, und es wird angenommen, dass die Viren innerhalb und außerhalb der Probe 42 gestreut sind.
Das Rasterkraftmikroskop erfasst Oberflächenschichtinformationen der Probe 42. Andererseits führt das Lichtmikroskop Fluoreszenzbeobachtung aus. Die Fluoreszenzbeobachtung führt zu der Erfassung von Fluoreszenzinformationen, die in einer Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) umfasst sind, die sich entlang der Z-Achse befindet, und von den strichpunktierten Linien in (a), (b) und (c) von 17 gerahmt sind. In dem Lichtmikroskop kann die Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) frei entlang der Z-Achse gesetzt sein, wie in (a), (b) und (c) von 17 gezeigt. Daher ergibt sich, wenn sich die Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) nicht auf der Oberflächenschicht der Probe 42 befindet, das Problem, nicht in der Lage zu sein, Fluoreszenzinformationen in der Nachbarschaft der Oberflächenschicht der Probe 42 zu erfassen, die von dem Rasterkraftmikroskop beobachtet wird. Mit anderen Worten kann keine korrekte Positionskorrelation zwischen den Probenoberflächenschichtinformationen des Rasterkraftmikroskops und den Fluoreszenzinformationen des Lichtmikroskops erfasst werden. Überdies wird es schwieriger, eine korrekte Positionskorrelation in einem Lichtmikroskop mit hoher Z-Auflösung wie einem konfokalen Mikroskop und einem Ultrahochauflösungsmikroskop zu erhalten.
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Beobachtungsverfahren unter Verwendung eines zusammengesetzten Mikroskops bereitzustellen, das in der Lage ist, eine korrekte Positionskorrelation zwischen Fluoreszenzinformationen und Probenoberflächenschichtinformationen zu erfassen.
LÖSUNG DER AUFGABE
Die vorliegende Erfindung zielt gemäß einem Aspekt auf ein Beobachtungsverfahren unter Verwendung eines zusammengesetzten Mikroskops ab, umfassend ein inverses Lichtmikroskop, das mindestens Fluoreszenzbeobachtung von unterhalb einer Probe ausführt, und ein Rasterkraftmikroskop, das Probenoberflächenschichtinformationen von oberhalb der Probe erfasst. Das zusammengesetzte Mikroskop weist eine Z-Achse auf, die sich in einer Aufwärts- und Abwärts-Richtung erstreckt. Das inverse Lichtmikroskop umfasst einen Objekttisch, auf dem ein transparentes Substrat platziert ist, das die Probe hält, eine Objektivlinse, die unterhalb des Objekttisches angebracht ist, und einen Objektivlinsenantriebsaktuator, der die Objektivlinse entlang der Z-Achse antreibt. Das Rasterkraftmikroskop umfasst einen Cantilever, der oberhalb des Objekttisches angebracht ist und eine Sonde an seinem freien Ende aufweist, und einen Z-abtastenden Aktuator, der den Cantilever entlang der Z-Achse abtastet. Das Beobachtungsverfahren umfasst einen Näherungsschritt des Abtastens des Cantilevers entlang der Z-Achse, sodass sich die Sonde einer Probenoberflächenschicht nähert, bis die Probenoberflächenschichtinformationen erfasst werden können, einen Cantilever-Beobachtungsschritt des Beobachtens des Cantilevers durch das inverse Lichtmikroskop, um mindestens Forminformationen des Cantilevers zu erfassen, einen Beobachtungspositionsbewegungsschritt des Bewegens einer Beobachtungsposition des inversen Lichtmikroskops abwärts entlang der Z-Achse, basierend auf mindestens einer Länge der Sonde, einen Fluoreszenzbeobachtungsschritt des Ausführens von Fluoreszenzbeobachtung durch das inverse Lichtmikroskop, und einen Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt des Abtastens des Cantilevers mindestens entlang der Z-Achse, um die Probenoberflächenschichtinformationen zu erfassen. Der Näherungsschritt, der Cantilever-Beobachtungsschritt und der Beobachtungspositionsbewegungsschritt werden in der Reihenfolge ausgeführt. Der Fluoreszenzbeobachtungsschritt wird nach dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt ausgeführt. Der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt wird nach dem Näherungsschritt ausgeführt.
VORTEILHAFTE WIRKUNGEN DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird es möglich, eine korrekte Positionskorrelation zwischen Fluoreszenzinformationen und Probenoberflächenschichtinformationen zu erfassen.
Figurenliste

1 zeigt ein zusammengesetztes Mikroskop gemäß einer ersten Ausführungsform.
2 zeigt schematisch die Nachbarschaft einer Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird.
3 zeigt eine Schrittfolge des Beobachtungsverfahrens der ersten Ausführungsform.
4 zeigt schematisch die Nachbarschaft der Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird, das in 1 gezeigt ist.
5 zeigt schematisch die Nachbarschaft der Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird, das in 1 gezeigt ist, und zeigt einen Zustand, in dem ein Cantilever innerhalb einer Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) umfasst ist, und einen Zustand, in dem die Spitze einer Sonde und die Oberflächenschicht der Probe innerhalb der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) umfasst sind.
6 zeigt ein zusammengesetztes Mikroskop gemäß einer zweiten Ausführungsform.
7 zeigt eine Schrittfolge eines Beobachtungsverfahrens der zweiten Ausführungsform.
8 zeigt schematisch die Nachbarschaft einer Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird, das in 6 gezeigt ist, und zeigt sowohl einen Zustand unmittelbar nach einem Beobachtungspositionsbewegungsschritt als auch einen Zustand nach einem Zeitablauf.
9 zeigt ein zusammengesetztes Mikroskop gemäß einer dritten Ausführungsform.
10 zeigt eine Schrittfolge eines Beobachtungsverfahrens der dritten Ausführungsform.
11 zeigt eine Probe und eine Beobachtungsfläche der Probe.
12 zeigt einen Zustand, in dem Fluoreszenzinformationen und Probenoberflächenschichtinformationen überlagert und auf einem Monitor angezeigt sind.
13 zeigt einen Zustand, in dem die Fluoreszenzinformationen und die Probenoberflächenschichtinformationen überlagert sind, indem Forminformationen eines Cantilevers als Positionsreferenz verwendet und auf dem Monitor angezeigt werden.
14 zeigt schematisch die Nachbarschaft einer Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird, und zeigt einen Zustand, in dem fluoreszenzmarkierte Stoffe nur an dem Unterteil der Probe vorhanden sind.
15 zeigt schematisch die Probe, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird.
16 zeigt schematisch die Nachbarschaft der Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird.
17 zeigt schematisch die Nachbarschaft der Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird, und verschiedene Positionen einer Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite).

BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN
<Erste Ausführungsform>
Eine erste Ausführungsform wird nachfolgend mit Bezug auf 1 bis 5 beschrieben. 1 zeigt ein zusammengesetztes Mikroskop gemäß der vorliegenden Ausführungsform.
Das in 1 gezeigte zusammengesetzte Mikroskop umfasst ein inverses Lichtmikroskop 10, das Fluoreszenzbeobachtung in mindestens einer Probe 42 und einer Lösung 43 von unterhalb der Probe ausführt, ein Rasterkraftmikroskop 20, das Informationen einer Oberflächenschicht der Probe 42 (Probenoberflächenschichtinformationen) von oberhalb der Probe erfasst, und eine Steuerung 31, die das zusammengesetzte Mikroskop steuert. Das inverse Lichtmikroskop 10 besteht entweder aus einem konfokalen Mikroskop oder einem Ultrahochauflösungsmikroskop (Superauflösungsmikroskop). Das zusammengesetzte Mikroskop umfasst auch einen Monitor 32 zum Ausführen einer Anzeige der Beobachtungsergebnisse und Ähnlichem, und eine Eingabeeinrichtung 33 zum Ausführen der Eingabe von Anweisungen und Ähnlichem.
Das zusammengesetzte Mikroskop weist eine X-Achse, eine Y-Achse und eine Z-Achse auf. Die Z-Achse erstreckt sich in Aufwärts- und Abwärts-Richtungen, das heißt, in der vertikalen Richtung. Die X-Achse ist orthogonal zu der Z-Achse. Die Y-Achse ist sowohl orthogonal zu der X-Achse als auch zu der Z-Achse.
Das inverse Lichtmikroskop 10 umfasst einen Objekttisch 11, auf dem ein transparentes Substrat 41 platziert ist, das die Probe 42 hält, eine Objektivlinse 12, die unterhalb des Objekttisches 11 angebracht ist, einen Objektivlinsenantriebsaktuator 13, der die Objektivlinse 12 entlang der Z-Achse antreibt, und eine Bildgebungseinheit 14 wie eine CCD-Kamera. Genauer gesagt weist der Objekttisch 11 eine Platzierungsoberfläche 11a auf, die in Kontakt mit einem Substrat 41 sein soll, und die Objektivlinse 12 ist unterhalb der Platzierungsoberfläche 11a des Objekttisches 11 angebracht.
Der Objektivlinsenantriebsaktuator 13, der die Objektivlinse 12 entlang der Z-Achse antreibt, wird von der Steuerung 31 gesteuert, sodass die Position der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) frei entlang der Z-Achse gesetzt werden kann, wie beispielsweise in (a), (b) und (c) von 17 gezeigt.
Die von dem inversen Lichtmikroskop 10 erfassten Fluoreszenzinformationen sind Informationen, die von dem inversen Lichtmikroskop 10 erfasst werden können, umfassend Informationen über beispielsweise Fluoreszenzsubstanzen wie Fluoreszenzfarbstoffe niedermolekularer organischer Verbindungen und Fluoreszenzproteine wie GFP bei der Beobachtung von Zellen, und Informationen über Caged-Verbindungen und Autofluoreszenz.
Als das inverse Lichtmikroskop 10 wird beispielsweise ein konfokales Mikroskop oder ein Ultrahochauflösungsmikroskop (superresolution microscope) wie STED oder STORM verwendet, in dem die Auflösung entlang der Z-Achse (nachfolgend als Z-Auflösung bezeichnet) verbessert wird, indem anderes Licht als Fluoreszenzlicht vermindert wird, das von einer Fokuslage emittiert wird. Die Z-Auflösung des konfokalen Mikroskops beträgt 500 nm bis 1000 nm, und die Z-Auflösung des Ultrahochauflösungsmikroskops erreicht maximal 100 nm oder weniger.
Das Rasterkraftmikroskop 20 wird auf dem inversen Lichtmikroskop 10 montiert. Das Rasterkraftmikroskop 20 umfasst einen Cantilever 22, der über den Objekttisch 11 angebracht ist und eine Sonde 21 an seinem freien Ende aufweist, ein Z-Piezoelektrikelement 25, das den Cantilever 22 entlang der Z-Achse fein abtastet, und einen Z-Grobanpassungsaktuator 26, der den Cantilever 22 grob entlang der Z-Achse abtastet. Der Cantilever 22 ist in einer Cantilever-Weise von einer Stütze 23 gestützt, und die Stütze 23 ist an dem Z-Piezoelektrikelement 25 durch eine Halterung 24 befestigt. Das Z-Piezoelektrikelement 25 und der Z-Grobanpassungsaktuator 26 bilden einen Z-Abtastaktuator 27, der den Cantilever 22 entlang der Z-Achse dank sowohl des Z-Piezoelektrikelements 25 als auch des Z-Grobanpassungsaktuators 26 abtastet. Das Rasterkraftmikroskop 20 umfasst auch einen XY-Abtastaktuator 28, der den Cantilever 22 entlang der X-Achse und der Y-Achse abtastet, und einen Versetzungssensor 29, der die Versetzung des Cantilevers 22 detektiert.
Ein Krümmungsradius der Spitze der Sonde 21 ist 10 nm oder weniger, was so dünn ist, dass die Spitze selbst mit einem Ultrahochauflösungsmikroskop nicht beobachtet werden kann.
Das Z-Piezoelektrikelement 25 und der XY-Abtastaktuator 28 können unter Verwendung eines Röhrchenscanners ausgestaltet sein, oder können beispielsweise unter Verwendung des Abtastmechanismus der japanischen Patentanmeldung KOKAI Veröffentlichung Nr. 2014-35252 ausgestaltet sein.
Der Z-Abtastaktuator 27 wird von der Steuerung 31 gesteuert, und tastet den Cantilever 22 entlang der Z-Achse gemäß einem Abtastsignal (nicht gezeigt) ab, das von der Steuerung 31 zugeführt wird.
Das Abtasten des Cantilevers 22 entlang der Z-Achse, wie in diesem Dokument beschrieben, umfasst nicht nur, den Cantilever 22 entlang der Z-Achse dynamisch oder statisch zu versetzen, sondern auch, den Cantilever 22 in einem versetzten Zustand zu halten.
Entsprechend tastet der Z-Abtastaktuator 27 den Cantilever 22 entlang der Z-Achse gemäß einem Z-Abtastsignal ab, das von der Steuerung 31 zugeführt wird, sodass er erlaubt, dass die Distanz entlang der Z-Achse zwischen der Spitze der Sonde 21 und der Oberflächenschicht der Probe 42 geändert wird. Er erlaubt auch, dass die Distanz aufrechterhalten bleibt.
Der Versetzungssensor 29 gibt ein Versetzungssignal aus, dass die Versetzung des Cantilevers 22 zu der Steuerung 31 angibt. Die Steuerung 31 erfasst Probenoberflächenschichtinformationen basierend auf dem Eingabeversetzungssignal.
Die Probenoberflächenschichtinformationen, die von dem Rasterkraftmikroskop 20 erfasst werden, sind beispielsweise Informationen über eine physikalische Wechselwirkung, die zwischen der Probe und der Sonde auftritt, wie eine ungleichmäßige Form der Probe, Viskoelastizitätsinformationen und elektrische Informationen. Beispielsweise sind die Informationen über die ungleichmäßige Form der Probe Bildinformationen der Probenoberflächenschicht, die mittels XY-Abtasten und Z-Abtasten des Cantilevers 22 erfasst werden, und die Viskoelastizitätsinformationen sind die Informationen über die Kraft, die zwischen der Sonde 21 und der Probe 42 wirkt, die mittels nur Z-Abtasten ohne XY-Abtasten des Cantilevers 22 erfasst werden.
Das transparente Substrat 41, das die Probe 42 hält, wird auf dem Objekttisch 11 des inversen Lichtmikroskops 10 platziert. Beispielsweise umfasst der Objekttisch 11 einen XY-Tisch (nicht gezeigt) und das Substrat 41 wird auf diesem XY-Tisch platziert. Die Probe 42, die Sonde 21 und der Cantilever 22 sind von der Lösung 43 umgeben, die von dem Substrat 41 gehalten wird.
2 zeigt schematisch eine Ansicht der Nachbarschaft der Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird, gesehen von einer positiven X-Achsen-Richtung. Die Probe 42 ist beispielsweise eine lebende Zelle, fluoreszenzmarkierte Stoffe 44 sind beispielsweise fluoreszenzmarkierte Viren, und es wird angenommen, dass die Viren innerhalb und außerhalb der Zelle gestreut sind.
Als Nächstes wird ein Betriebsfluss (Schritte eines Beobachtungsverfahrens) des zusammengesetzten Mikroskops der vorliegenden Ausführungsform mit dem obigen Aufbau unter Verwendung von 3 bis 5 beschrieben. 3 zeigt eine Schrittfolge eines Beobachtungsverfahrens der vorliegenden Ausführungsform. 4 und 5 zeigen schematisch die Nachbarschaft der Probenoberflächenschicht, die durch das zusammengesetzte Mikroskop beobachtet wird.
In dem Näherungsschritt 50 wird der Cantilever 22 entlang der Z-Achse abgetastet, indem der Z-Abtastaktuator 27 veranlasst wird, sich zu erstrecken und zusammenzuziehen, insbesondere indem das Z-Piezoelektrikelement 25, das den Z-Abtastaktuator 27 bildet, veranlasst wird, sich zu erstrecken oder indem der Z-Grobanpassungsaktuator 26 veranlasst wird, sich zusammenzuziehen, oder beides, sodass sich die Spitze der Sonde 21 der Oberflächenschicht der Probe 42 nähert, bis die Wechselwirkung zwischen der Spitze der Sonde 21 und der Oberflächenschicht der Probe 42 auftritt, das heißt, die Probenoberflächenschichtinformationen erfasst werden können, wie in 4 gezeigt.
In dem nächsten Cantilever-Beobachtungsschritt 51 wird der Cantilever 22 durch das inverse Lichtmikroskop 10 beobachtet, um die Forminformationen des Cantilevers 22 zu erfassen. Vorzugsweise wird der Wurzelbereich der Sonde 21 beobachtet, um Forminformationen des Wurzelbereichs des Cantilevers 22 zu erfassen. In diesem Cantilever-Beobachtungsschritt 51 wird der Cantilever 22 mittels Fluoreszenzbeobachtung der Autofluoreszenz des Cantilevers 22 oder Hellfeldbeobachtung beobachtet. In diesem Cantilever-Beobachtungsschritt 51 wird die Objektivlinse 12 von dem Objektivlinsenantriebsaktuator 13 entlang der Z-Achse angetrieben, um die Position der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) entlang der Z-Achse zu der Position einer Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) 56 einzustellen, die in (a) von 5 gezeigt ist. Der Cantilever 22 ist in der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) 56 umfasst.
In dem nächsten Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52 wird die Beobachtungsposition des inversen Lichtmikroskops 10, das heißt, die Position der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) in der Abwärtsrichtung der Probe 42 entlang der Z-Achse basierend auf mindestens der Länge der Sonde 21 beispielsweise um eine Distanz gleich der Länge der Sonde 21 bewegt. Folglich wird die Position der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) auf die Position einer Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) 57 eingestellt, die in (b) von 5 gezeigt ist. Die Spitze der Sonde 21 und die Oberflächenschicht der Probe 42 sind innerhalb der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) 57 umfasst.
In diesem Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52 wird die Position der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) 57 bewegt, indem die Objektivlinse 12 von dem Objektivlinsenantriebsaktuator 13 angetrieben wird. Der Antriebsbetrag kann einfach basierend auf der Länge der Sonde 21 eingestellt werden. Der Antriebsbetrag wird jedoch vorzugsweise basierend auf beispielsweise der Länge der Sonde 21, dem Brechungsindex der Lösung 43 und dem Brechungsindex von Immersionsöl eingestellt, wenn eine Ölimmersionsobjektivlinse als die Objektivlinse 12 verwendet wird.
Die Objektivlinse 12 wird von einem Verfahren des Antreibens der gesamten Einheit, umfassend das Äußere der Objektivlinse 12 oder von einem Verfahren des Antreibens mindestens einer Linse innerhalb der Objektivlinse 12 angetrieben. Im Fall des Verwendens einer Flüssigkeitsimmersionsobjektivlinse wie einer Ölimmersionsobjektivlinse, einer Wasserimmersionsobjektivlinse oder einer Silikonimmersionsobjektivlinse kann, wenn die gesamte Einheit der Objektivlinse 12 angetrieben wird, der Betrieb durch die Flüssigkeit Vibrationsgeräusche auf dem Substrat 41 erzeugen, auf dem die Probe 42 platziert ist. Somit ist das Verfahren des Antreibens mindestens einer Linse innerhalb der Objektivlinse 12 zu bevorzugen. In diesem Verfahren bewegt sich das Äußere der Objektivlinse 12 nicht, und somit wird der Einfluss der Vibrationsgeräusche auf das Substrat 41 vermindert. Überdies kann ein Aufbau eines Mikroskops verwendet werden, das in der Lage ist, einen Fokus zu bewegen, ohne eine Distanz zwischen einer Objektivlinse und einer Probe zu ändern, was in der japanischen Patentanmeldung KOKAI Veröffentlichung Nr. 2005-10516 offenbart wird.
Durch die obigen drei Schritte kann die Position der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) auf die Oberflächenschicht der Probe 42 eingestellt werden, wie in (b) von 5 gezeigt.
Dann werden ein Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 und ein Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 ausgeführt.
In dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 wird eine Fluoreszenzbeobachtung in der Probe 42 und der Lösung 43 durch das inverse Lichtmikroskop 10 ausgeführt.
In dem Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 tastet das Rasterkraftmikroskop 20 mindestens den Cantilever 22 entlang der Z-Achse ab, um Informationen auf der Oberflächenschicht der Probe 42 zu erfassen, was die Probenoberflächenschichtinformationen sind.
Der Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 und der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 können in der Reihenfolge ausgeführt werden, werden aber vorzugsweise zur gleichen Zeit ausgeführt, wenn es gewünscht ist, zeitvariable Positionskorrelation zu erfassen.
Der Start des Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritts 54 ist nicht darauf begrenzt, nach dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52 stattzufinden. Beispielsweise kann der Start des Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritts 54 unverzüglich nach dem Näherungsschritt 50 stattfinden, wenn die Funktionen des Cantilever-Beobachtungsschritts 51 und des Beobachtungspositionsbewegungsschritts 52 nicht gestört werden.
Mit anderen Worten werden der Näherungsschritt 50, der Cantilever-Beobachtungsschritt 51 und der Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52 in der Reihenfolge ausgeführt, und der Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 wird nach Ausführen des Näherungsschritts 50, des Cantilever-Beobachtungsschritts 51 und des Beobachtungspositionsbewegungsschritts 52 in der Reihenfolge ausgeführt; der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 wird jedoch nach dem Näherungsschritt 50 ausgeführt. Der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 wird vorzugsweise nach dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52 ausgeführt.
Um die obigen Schritte auszuführen, wird ein Programm zum Ausführen des Beobachtungsverfahrens in der Steuerung 31 installiert.
Indem das Beobachtungsverfahren der vorliegenden Ausführungsform ausgeführt wird, können die Fluoreszenzinformationen in der Nachbarschaft einer Oberflächenschicht einer Probe 42 korrekt erfasst werden, von der Schichtinformationen von einem Rasterkraftmikroskop 20 erfasst werden. Folglich kann eine genaue Positionskorrelation zwischen den Probenoberflächenschichtinformationen und den Fluoreszenzinformationen erfasst werden.
In der vorliegenden Ausführungsform ist ein Krümmungsradius der Spitze einer Sonde 10 nm oder weniger, und die Spitze der Sonde ist so dünn, dass die Spitze selbst mit einem Ultrahochauflösungsmikroskop nicht beobachtet werden kann; somit wird eine Positionen einer Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) auf die Oberflächenschicht der Probe 42 eingestellt, indem erstens die Spitze einer Sonde 21 mittels eines Näherungsschritts 50 nahe der Oberflächenschicht der Probe 42 gebracht wird, zweitens ein Cantilever 22 mittels eines Cantilever-Beobachtungsschritts 51 beobachtet wird, und zuletzt die Position der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) eines inversen Lichtmikroskops 10 basierend auf der Länge der Sonde 21 mittels eines Beobachtungspositionsbewegungsschritts 52 bewegt wird.
Die höchste Genauigkeit wird erzielt, indem der Cantilever 22, vorzugsweise der Wurzelbereich der Sonde 21 des Cantilevers 22, als eine Positionsreferenz der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) verwendet wird.
<Zweite Ausführungsform>
Die vorliegende Ausführungsform wird nachfolgend mit Bezug auf 6 bis 8 beschrieben. 6 zeigt ein zusammengesetztes Mikroskop gemäß der vorliegenden Ausführungsform. In 6 sind die Teile, die von den gleichen Bezugszeichen bezeichnet werden wie die Teile, die in 1 gezeigt sind, die gleichen Teile, und ausführliche Beschreibungen davon werden weggelassen.
In dem zusammengesetzten Mikroskop, das in 6 gezeigt ist, wird eine Folgesteuerungssteuerung 60 zu dem zusammengesetzten Mikroskop, das in 1 gezeigt ist, hinzugefügt.
Ein Abtastsignal A für die Feinbewegung, das von einer Steuerung 31 ausgegeben wird, wird einem Z-Piezoelektrikelement 25 zugeführt, und ein Abtastsignal B für die Grobbewegung, das von der Steuerung 31 ausgegeben wird, wird einem Z-Grobanpassungsaktuator 26 zugeführt. Mit anderen Worten wird das Abtastsignal, das sowohl aus dem Abtastsignal A als auch dem Abtastsignal B besteht, die von der Steuerung 31 ausgegeben werden, einem Z-Abtastaktuator 27 zugeführt, der aus dem Z-Piezoelektrikelement 25 und dem Z-Grobanpassungsaktuator 26 besteht.
Der Z-Abtastaktuator 27 wird von der Steuerung 31 gesteuert, und tastet einen Cantilever 22 entlang der Z-Achse gemäß dem Abtastsignal ab, das von der Steuerung 31 zugeführt wird.
Das Abtasten des Cantilevers 22 entlang der Z-Achse, wie in diesem Dokument beschrieben, umfasst nicht nur, den Cantilever 22 entlang der Z-Achse dynamisch oder statisch zu versetzen, sondern auch, den Cantilever 22 in einem versetzten Zustand zu halten.
Entsprechend tastet der Z-Abtastaktuator 27 den Cantilever 22 entlang der Z-Achse gemäß dem Abtastsignal ab, das von der Steuerung 31 zugeführt wird, um zu erlauben, dass die Distanz entlang der Z-Achse zwischen der Spitze der Sonde 21 und der Oberflächenschicht einer Probe 42 geändert wird. Er erlaubt auch, dass die Distanz aufrechterhalten bleibt.
Das Abtastsignal A und das Abtastsignal B, die jeweils dem Z-Piezoelektrikelement 25 und dem Z-Grobanpassungsaktuator 26 zugeführt werden, nämlich das Abtastsignal, das dem Z-Abtastaktuator 27 zugeführt wird, werden auch einer Folgesteuerungssteuerung 60 zugeführt.
Die Folgesteuerungssteuerung 60 steuert den Objektivlinsenantriebsaktuator 13, sodass eine Objektivlinse 12 angetrieben wird, um dem Abtasten des Cantilevers 22 entlang der Z-Achse zu folgen.
Insbesondere steuert die Folgesteuerungssteuerung 60 den Objektivlinsenantriebsaktuator 13 basierend auf dem Abtastsignal, das aus dem Abtastsignal A und dem Abtastsignal B besteht.
Diese Folgesteuerungssteuerung 60 erzeugt ein Antriebssignal C basierend auf dem Abtastsignal, das aus dem Abtastsignal A und dem Abtastsignal B besteht, und führt das Antriebssignal C dem Objektivlinsenantriebsaktuator 13 zu.
Insbesondere erhält die Folgesteuerungssteuerung 60 zuerst den Ausdehnungs- und Zusammenziehungsbetrag des Z-Piezoelektrikelements 25 und des Z-Grobanpassungsaktuators 26 von dem zugeführten Abtastsignal A bzw. dem Abtastsignal B. Als Nächstes erhält die Steuerung den Versetzungsbetrag des Cantilevers 22 entlang der Z-Achse basierend auf dem Erstreckungs- und Zusammenziehungsbetrag des Z-Piezoelektrikelements 25 und dem Ausdehnungs- und Zusammenziehungsbetrag des Z-Grobanpassungsaktuators 26. Überdies erhält die Steuerung einen Antriebsbetrag der Objektivlinse 12 von dem Versetzungsbetrag des Cantilevers 22 entlang der Z-Achse. Dann erhält erzeugt die Steuerung das Antriebssignal C basierend auf dem Versetzungsbetrag, um ihn dem Objektivlinsenantriebsaktuator 13 zuzuführen.
Der Antriebsbetrag des Objektivlinsenantriebsaktuators 13 wird beispielsweise basierend auf der Länge der Sonde 21, dem Brechungsindex der Probe 42 und dem Brechungsindex von Immersionsöl eingestellt, wenn eine Ölimmersionsobjektivlinse als die Objektivlinse 12 verwendet wird.
Zusätzlich zu der Steuerung des Objektivlinsenantriebsaktuators 13 mittels der Folgesteuerungssteuerung 60 basierend auf dem Abtastsignal sind verschiedene Variationen möglich. Beispielsweise kann ein Versetzungssensor in dem Z-Abtastaktuator 27 vorgesehen sein, und der Objektivlinsenantriebsaktuator 13 kann basierend auf Informationen des Abtastbetrags (gleich dem Versetzungsbetrag des Cantilevers 22) des Z-Abtastaktuators 27 gesteuert werden, die von dem Versetzungssensor erfasst werden.
Überdies kann die Folgesteuerungssteuerung 60 in die Steuerung 31 des zusammengesetzten Mikroskops eingebaut sein.
7 zeigt eine Schrittfolge eines Beobachtungsverfahrens der vorliegenden Ausführungsform. Das Beobachtungsverfahren der vorliegenden Ausführungsform umfasst einen Beobachtungspositionsfolgeschritt 71 zusätzlich zu den Schritten in dem Beobachtungsverfahren, das in der ersten Ausführungsform beschrieben ist, und in 3 gezeigt ist.
Der Beobachtungspositionsfolgeschritt 71 umfasst einen Beobachtungspositionsfolgestartschritt 72, einen Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 und einen Beobachtungspositionsfolgeendschritt 74. Mit anderen Worten umfasst der Beobachtungspositionsfolgeschritt 71 einen Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53.
In dem Beobachtungspositionsfolgeschritt 71 wird die Beobachtungsposition des inversen Lichtmikroskops 10 entlang der Z-Achse bewegt, sodass das Abtasten des Cantilevers 22 entlang der Z-Achse folgt. Mit anderen Worten treibt der Objektivlinsenantriebsaktuator 13 die Objektivlinse 12 an, sodass die Objektivlinse 12 dem Abtasten des Cantilevers 22 entlang der Z-Achse folgt.
In dem Beobachtungsverfahren der vorliegenden Ausführungsform werden die nachfolgend beschriebenen Schritte unter Befolgung des Beobachtungspositionsbewegungsschritts 52 von 3 ausgeführt, der in der ersten Ausführungsform beschrieben wird. Punkt (a) von 8 zeigt einen Zustand unverzüglich nach dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52.
Der Beobachtungspositionsfolgeschritt 71 wird zwischen dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52 und dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 gestartet. Mit anderen Worten wird ein Beobachtungspositionsfolgestartschritt 72 zwischen dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52 und dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 ausgeführt.
Nachdem der Beobachtungspositionsfolgestartschritt 72 gestartet ist, werden der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 und der Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 gestartet.
In dem Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 tastet ein Rasterkraftmikroskop 20 mindestens den Cantilever 22 entlang der Z-Achse ab, um Informationen auf der Oberflächenschicht der Probe 42 zu erfassen, was Probenoberflächenschichtinformationen sind.
In dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 wird eine Fluoreszenzbeobachtung in der Probe 42 und der Lösung 43 durch das inverse Lichtmikroskop 10 ausgeführt.
Der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 und der Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 werden vorzugsweise zur gleichen Zeit ausgeführt, wenn es wünschenswert ist, um eine zeitvariable Positionskorrelation zu erfassen.
Der Start des Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritts 54 ist nicht darauf begrenzt, nach dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt 52 stattzufinden. Beispielsweise kann der Start des Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritts 54 unverzüglich nach dem Näherungsschritt 50 stattfinden, wenn die Funktionen des Cantilever-Beobachtungsschritts 51 und des Beobachtungspositionsbewegungsschritts 52 nicht gestört werden.
Nachdem der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 und der Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 beendet sind, wird der Beobachtungspositionsfolgeschritt 71 beendet. Mit anderen Worten wird der Beobachtungspositionsfolgeendschritt 74 ausgeführt.
Um die obigen Schritte auszuführen, wird ein Programm zum Ausführen des Beobachtungsverfahrens in der Steuerung 31 installiert. Wie von der obigen Beschreibung zu verstehen ist, kann die gleiche vorteilhafte Wirkung wie die erste Ausführungsform in der vorliegenden Ausführungsform erhalten werden. Mit anderen Worten können die Fluoreszenzinformationen in der Nachbarschaft der Oberflächenschicht der Probe 42 korrekt erfasst werden, die von dem Rasterkraftmikroskop 20 erfasst wird. Folglich kann eine genaue Positionskorrelation zwischen den Probenoberflächenschichtinformationen und den Fluoreszenzinformationen erfasst werden.
Überdies weist die vorliegende Ausführungsform die folgende vorteilhafte Wirkung auf. Beispielsweise können, in dem Fall, in dem die Probe 42 eine lebende Zelle ist, und sich die Position ihrer Oberflächenschicht entlang der Z-Achse von (a) zu (b) und (c) von 8 über die Zeit ändert, die Fluoreszenzinformationen in der Nachbarschaft der Oberflächenschicht der Probe 42 nicht korrekt erfasst werden, wenn der Beobachtungspositionsfolgeschritt 71 nicht ausgeführt wird. In der vorliegenden Ausführungsform können, da andererseits der Beobachtungspositionsfolgeschritt 71 ausgeführt wird, die Fluoreszenzinformationen in der Nachbarschaft der Oberflächenschicht der Probe 42 korrekt erfasst werden, selbst wenn sich die Position der Oberflächenschicht der Probe 42 entlang der Z-Achse vorübergehend über eine Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) 57 hinaus ändert.
<Dritte Ausführungsform>
Eine dritte Ausführungsform wird nachfolgend mit Bezug auf 9 bis 12 beschrieben. 9 zeigt ein zusammengesetztes Mikroskop gemäß der vorliegenden Ausführungsform. In 9 sind die Teile, die von den gleichen Bezugszeichen bezeichnet werden wie die Teile, die in 6 gezeigt sind, die gleichen Teile, und ausführliche Beschreibungen davon werden weggelassen.
Das zusammengesetzte Mikroskop der vorliegenden Ausführungsform unterscheidet sich von dem zusammengesetzten Mikroskop der zweiten Ausführungsform, das in 6 gezeigt ist, nur in Bezug auf die Steuerung. Das zusammengesetzte Mikroskop der vorliegenden Ausführungsform, das in 9 gezeigt ist, umfasst eine Steuerung 34 anstelle der Steuerung 31 der zweiten Ausführungsform.
Die Steuerung 34 führt eine Bildverarbeitung von sich überlagernden Probenoberflächenschichtinformationen und Fluoreszenzinformationen aus. Ein Monitor 32 zeigt ein Bild an, in dem die Probenoberflächenschichtinformationen und die Fluoreszenzinformationen überlagert sind.
10 zeigt eine Schrittfolge eines Beobachtungsverfahrens der vorliegenden Ausführungsform. Das Beobachtungsverfahren der vorliegenden Ausführungsform umfasst einen Bildanzeigeschritt 81 und einen Beobachtungsendschritt 82, zusätzlich zu den Schritten in dem Beobachtungsverfahren, das in der zweiten Ausführungsform beschrieben und in 7 gezeigt ist.
In dem Bildanzeigeschritt 81 sind die Probenoberflächenschichtinformationen, die in dem Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 erfasst werden, und die Fluoreszenzinformationen, die in dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 erfasst werden, überlagert und werden auf dem Monitor 32 angezeigt.
Der Bildanzeigeschritt 81 wird, nachdem der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 und der Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 beendet sind, und vor dem Beobachtungspositionsfolgeendschritt 74 ausgeführt.
Die jeweiligen Informationen, die in dem Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54 und dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 erfasst werden, können in beliebigen Arten von Einheiten sein; beispielsweise Linieneinheiten, Bildeinheiten oder Videoeinheiten. In der vorliegenden Ausführungsform werden die jeweiligen Informationen beschrieben, als wären sie in Bildeinheiten.
In dem Bildanzeigeschritt 81 wird beispielsweise, wenn eine Fläche 91 einer Probe 90 beobachtet wird, wie in 11 gezeigt, ein Bild 94, in dem Fluoreszenzinformationen 92 und Probenoberflächenschichtinformationen 93 überlagert sind, auf dem Monitor 32 angezeigt, wie in 12 gezeigt ist.
In dem Bildanzeigeschritt 81 können die Fluoreszenzinformationen 92 und die Probenoberflächenschichtinformationen 93 überlagert und auf dem Monitor 32 angezeigt werden, indem Forminformationen 95 des Cantilevers 22 verwendet werden, die in dem Cantilever-Beobachtungsschritt 51 als eine Positionsreferenz auf einer XY-Ebene senkrecht zu der Z-Achse erfasst werden, wie in 13 gezeigt. Insbesondere kann eine Referenzposition 97 der Fluoreszenzinformationen 92 bestimmt werden, indem die Forminformationen 95 des Cantilevers 22 und die Fluoreszenzinformationen 92 überlagert werden, eine Referenzposition 96 der Oberflächenschichtinformationen 93 kann bestimmt werden, indem die Forminformationen 95 des Cantilevers 22 und die Probenoberflächenschichtinformationen 93 überlagert werden, und ein überlagertes Bild der Fluoreszenzinformationen 92 und der Probenoberflächenschichtinformationen 93 kann erzeugt werden, indem die Referenzposition 97 und die Referenzposition 96 verwendet und auf dem Monitor 32 angezeigt werden.
In dem Beobachtungsendschritt 82 wird bestimmt, ob die Beobachtung beendet ist oder nicht. Wenn die Beobachtung hier nicht beendet ist, kehrt der Prozess zurück zu dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt 53 und dem Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt 54. Wenn die Beobachtung hier beendet ist, fährt der Prozess fort mit dem Beobachtungspositionsfolgeendschritt 74.
Um die obigen Schritte auszuführen, ist ein Programm zum Ausführen des Beobachtungsverfahrens in der Steuerung 34 installiert.
Wie von der obigen Beschreibung verstanden wird, kann in der vorliegenden Ausführungsform, da die Fluoreszenzinformationen 92 und die Probenoberflächenschichtinformationen 93 überlagert und angezeigt sind, eine genauere Positionskorrelation zwischen den Probenoberflächenschichtinformationen und den Fluoreszenzinformationen erfasst werden.
Die vorteilhafte Wirkung der vorliegenden Erfindung ist nicht auf den Fall beschränkt, in dem die fluoreszenzmarkierten Stoffe 44 sowohl innerhalb als auch außerhalb der Probe 42 vorhanden sind, wie in 2 gezeigt. In der vorliegenden Erfindung kann die gleiche vorteilhafte Wirkung erhalten werden, selbst in dem Fall, in dem die fluoreszenzmarkierten Stoffe 44 nur im Innern der Probe 42 vorhanden sind.
Beispielsweise erfasst, wie in 14 gezeigt, wenn die fluoreszenzmarkierten Stoffe 44 nicht in der Nachbarschaft der Oberflächenschicht der Probe 42 vorhanden sind, sondern nur an dem Unterabschnitt der Probe 42 vorhanden sind, das inverse Lichtmikroskop 10 unvermeidbar Fluoreszenzinformationen des Unterabschnitts der Probe 42 wenn es versucht, Fluoreszenzinformationen zu erfassen, ohne der vorliegenden Erfindung zu folgen. Mit anderen Worten erfasst das inverse Lichtmikroskop 10 Fluoreszenzinformationen an einer Position entlang der Z-Achse, die weitestgehend von der Oberflächenschicht der Probe 42 abweicht, die von dem Rasterkraftmikroskop 20 beobachtet wird (in dem Maße, dass die Positionskorrelation nicht diskutiert werden kann). Die in diesem Fall zu erfassenden Fluoreszenzinformationen sind, dass „die fluoreszenzmarkierten Stoffe 44 nicht in der Probenoberflächenschicht vorhanden sind“, und dies sind die korrekten Fluoreszenzinformationen. Diese korrekten Fluoreszenzinformationen können jedoch nicht mit dem herkömmlichen zusammengesetzten Mikroskop erfasst werden. Überdies ist das wichtigste Problem, dass das herkömmliche zusammengesetzte Mikroskop „nicht erkennen kann, dass die Fluoreszenzinformationen an einer Position entlang der Z-Achse, die weitestgehend abweicht, erfasst werden.“
In der vorliegenden Erfindung ist die Position der Z-Auflösungsbreite (Z-Beobachtungsbreite) des inversen Lichtmikroskops 10 ungeachtet des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins der fluoreszenzmarkierten Stoffe 44 zu der Oberflächenschicht der Probe 42 ausgerichtet. Daher kann die vorliegende Erfindung auch ein solches Problem lösen.
Die vorteilhafte Wirkung der vorliegenden Erfindung ist nicht auf den Fall beschränkt, in dem die Probe 42 in der Lösung 43 vorhanden ist. Beispielsweise wird in „dem Fall, in dem die fluoreszenzmarkierten Stoffe 44 nur im Innern der Probe 42 vorhanden sind“, was oben beschrieben ist, die vorteilhafte Wirkung erhalten, selbst wenn die Probe 42 in der Umgebung vorhanden ist.

Claims

Beobachtungsverfahren unter Verwendung eines zusammengesetzten Mikroskops, umfassend ein inverses Lichtmikroskop, das mindestens eine Fluoreszenzbeobachtung von unterhalb einer Probe ausführt, und ein Rasterkraftmikroskop, das Probenoberflächenschichtinformationen von oberhalb der Probe erfasst, wobei das zusammengesetzte Mikroskop eine Z-Achse aufweist, die sich in einer Aufwärts- und Abwärts-Richtung erstreckt, wobei das inverse Lichtmikroskop einen Objekttisch, auf dem ein transparentes Substrat platziert ist, das die Probe hält, eine Objektivlinse, die unterhalb des Objekttisches angebracht ist, und einen Objektivlinsenantriebsaktuator, der die Objektivlinse entlang der Z-Achse antreibt, umfasst, wobei das Rasterkraftmikroskop einen Cantilever, der oberhalb des Objekttisches angebracht ist und eine Sonde an seinem freien Ende aufweist, und einen Z-Abtastaktuator umfasst, der den Cantilever entlang der Z-Achse abtastet, wobei das Beobachtungsverfahren umfasst: einen Näherungsschritt des Abtastens des Cantilevers entlang der Z-Achse, sodass sich die Sonde einer Probenoberflächenschicht nähert, bis die Probenoberflächenschichtinformationen erfasst werden können; einen Cantilever-Beobachtungsschritt des Beobachtens des Cantilevers durch das inverse Lichtmikroskop, um mindestens Forminformationen des Cantilevers zu erfassen; einen Beobachtungspositionsbewegungsschritt des Bewegens einer Beobachtungsposition des inversen Lichtmikroskops abwärts entlang der Z-Achse basierend auf mindestens einer Länge der Sonde; einen Fluoreszenzbeobachtungsschritt des Ausführens von einer Fluoreszenzbeobachtung durch das inverse Lichtmikroskop; und einen Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt des Abtastens des Cantilevers mindestens entlang der Z-Achse, um die Probenoberflächenschichtinformationen zu erfassen, wobei der Näherungsschritt, der Cantilever-Beobachtungsschritt und der Beobachtungspositionsbewegungsschritt in der Reihenfolge ausgeführt werden, wobei der Fluoreszenzbeobachtungsschritt nach dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt ausgeführt wird, und der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt nach dem Näherungsschritt ausgeführt wird.
Beobachtungsverfahren nach Anspruch 1, wobei der Beobachtungspositionsbewegungsschritt einen Objektivlinsenantriebsschritt des Antreibens der Objektivlinse umfasst.
Beobachtungsverfahren nach Anspruch 1, wobei der Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt nach dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt ausgeführt wird.
Beobachtungsverfahren nach Anspruch 1, überdies umfassend einen Beobachtungspositionsfolgeschritt des Bewegens der Beobachtungsposition des inversen Lichtmikroskops entlang der Z-Achse, sodass die Beobachtungsposition dem Abtasten des Cantilevers entlang der Z-Achse folgt, wobei der Beobachtungspositionsfolgeschritt den Fluoreszenzbeobachtungsschritt umfasst, wobei der Beobachtungspositionsfolgeschritt zwischen dem Beobachtungspositionsbewegungsschritt und dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt gestartet wird.
Beobachtungsverfahren nach Anspruch 4, wobei mindestens einer, der Beobachtungspositionsbewegungsschritt und/oder der Beobachtungspositionsfolgeschritt, einen Objektivlinsenantriebsschritt des Antreibens der Objektivlinse umfasst.
Beobachtungsverfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, überdies umfassend einen Bildanzeigeschritt des Anzeigens eines Bilds mittels Überlagern der Probenoberflächenschichtinformationen, die in dem Probenoberflächenschichtinformationserfassungsschritt erfasst werden, und Fluoreszenzinformationen, die in dem Fluoreszenzbeobachtungsschritt erfasst werden.
Beobachtungsverfahren nach Anspruch 6, wobei der Bildanzeigeschritt die Fluoreszenzinformationen überlagert, und die Probenoberflächenschichtinformationen unter Verwendung der Forminformationen des Cantilevers überlagert sind, die in dem Cantilever-Beobachtungsschritt als eine Positionsreferenz auf einer XY-Ebene senkrecht zu der Z-Achse erfasst werden.
Beobachtungsverfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, wobei das inverse Lichtmikroskop eines, ein konfokales Mikroskop oder ein Ultrahochauflösungsmikroskop, ist.
Programm zum Ausführen des Beobachtungsverfahrens nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8.
Zusammengesetztes Mikroskop, in dem das Programm nach Anspruch 9 installiert ist.
Zusammengesetztes Mikroskop, umfassend ein inverses optisches Mikroskop, das mindestens eine Fluoreszenzbeobachtung ausführt, und ein Rasterkraftmikroskop, das Probenoberflächenschichtinformationen erfasst, das eine Z-Achse aufweist, die sich in einer Aufwärts- und Abwärts-Richtung erstreckt, und umfassend: einen Objekttisch, auf dem ein transparentes Substrat platziert ist, das eine Probe hält; eine Objektivlinse, die unterhalb des Objekttisches angebracht ist; einen Objektivlinsenantriebsaktuator, der die Objektivlinse entlang der Z-Achse antreibt; einen Cantilever, der oberhalb des Objekttisches angebracht ist und eine Sonde an seinem freien Ende aufweist; einen Z-Abtastaktuator, der den Cantilever entlang der Z-Achse abtastet; und eine Folgesteuerungssteuerung, die den Objektivlinsenantriebsaktuator steuert, sodass die Objektivlinse angetrieben wird, um dem Abtasten des Cantilevers entlang der Z-Achse zu folgen.
Zusammengesetztes Mikroskop nach Anspruch 11, wobei die Folgesteuerungssteuerung den Objektivlinsenantriebsaktuator basierend auf einem Abtastsignal steuert, das dem Z-Abtastaktuator zugeführt wird.
Zusammengesetztes Mikroskop nach Anspruch 11 oder 12, wobei der Z-Abtastaktuator ein Z-Piezoelektrikelement, das den Cantilever entlang der Z-Achse fein bewegt, und einen Z-Grobanpassungsaktuator umfasst, der den Cantilever entlang der Z-Achse grob bewegt.
Zusammengesetztes Mikroskop nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 13, umfassend eine Steuerung, die die Probenoberflächenschichtinformationen und Fluoreszenzinformationen überlagert, und einen Monitor, der ein Bild anzeigt, in dem die Oberflächenschichtinformationen und die Fluoreszenzinformationen überlagert sind.
Zusammengesetztes Mikroskop nach einem beliebigen der Ansprüche 11 bis 14, wobei das inverse Lichtmikroskop eines, ein konfokales Mikroskop oder ein Ultrahochauflösungsmikroskop, ist.