WO2011063549A1

WO2011063549A1 - 长效exendin4的类似物

Info

Publication number: WO2011063549A1
Application number: PCT/CN2009/001321
Authority: WO
Inventors: 吴晓琰; 龚铁军; 孙玉琨
Original assignee: Wu Xiaoyan; Gong Tiejun; Sun Yukun
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2011-06-03
Also published as: CN102712690B; CN102712690A

Description

说明书一

长效 Exendin 4的类似物

技术领域

本发明涉及 Exendin 4类似物的多肽，该多肽具有降低血糖作用，可用于治疗 2型糖尿病。本发明还提供了通过化学合成和重组 DNA生产工艺生产这些多肽的方法。

背景技术

世界各国糖尿病患者人数逐年增多，现在中国有 5000万，印度 6000万，美国 2000万，日本 600万，全球已达 2. 2亿。糖尿病患者分为两种，一是胰岛素依赖型糖尿病（1型糖尿病）和非胰岛素依赖型糖尿病（2型糖尿病）。其中， 2型糖尿病占糖尿病患者的 90%以上。

2型糖尿病患者表现了许多特征，如 β -细胞减少，餐后胰岛素分泌量不足，胰岛素分泌时间滞后，空腹及餐后血糖增高，糖化血红蛋白 HbAlc升高，胰岛素抵抗等。

根据美国 UKPDS对 2型糖尿病患者的多年跟踪研究报告指出目前 6类药物对 2 型糖尿病患者皆不能逆转糖尿病进程，不能遏制胰脏 β细胞的不断进行性的凋亡，也不能阻止糖尿病的并发症如冠心病、肾功能衰竭的发生和发展，改变糖尿病患者预后。因此需要研究新的 2型糖尿病治疗药物。

Exendin 4禾口 Exendin 3是南美产巨晰赐（Gi la monster, Heloderme Suspectum) 的唾液中分泌的两种多肽，其中 Exendin 4由 39个氨基酸残基组成，化学合成品作为抗 2型糖尿病药物， 2005年获美国 FDA批准，商品名为 Byetta, 2009年中国上市。

Exendin 4能促进胰岛素原的合成，促胰岛素分泌，降低空腹、餐后血糖，当血糖正常之后不再继续作用，因而不易产生低血糖昏迷、休克，安全性高。它能降低 HbAl c , 增加胰腺 β细胞数量及体积，增加 2型糖尿病患者胰岛素受体的敏感性，抑制胰高血糖素分泌等作用。每日注射 2次，每次 5-10ug。但也存在不足之处， Exendin 4来源于巨蜥蜴，而 GLP- 1是人的内源物质，临床试验报告 Exendin 4有 52%的患者产生抗体 ( Diabetes (1997) 46, 433-439； Diabetes Care (2002) 25, 330-336； JAMA (2002) 287, 373-379; Diabetes (1995) 44. 1249-1258； Diatetes (2002) 51 2796-2803； Diabetes Care (2000) 23 64-69； N. Engl. J. Med (2002) 346, 393-463； Lancet (1998) 352, 837-853)。另外， Exendin 4是化学合成品，价格十分昂贵。

发明内容

本发明的目的是针对目前市场对 Exendin 4有需要，而价格又十分昂贵的问题，本说明提供一个 Exendin 4的 32个氨基酸多肽衍生物。使其肽链长度与人源 GLP-1 相近，降低其免疫源性。结构中只含一个 Lys20残基，使脂肪酸酰化能专一的与 Lys20的 ε ( epsi lon ) - ΝΗ2结合形成脂肪酸酰化衍生物。另外本发明利用基因工程技术，大量生产该多肽的工艺，能降低成本，为广大 2型糖尿病患者提供一个新的治疗药物本发明的一个方面提供了结构发生改变，而仍具有降血糖活性 Exendin 4类似物，

本发明的 Exendin 4类似物其具有如下的结构式：

EW1 ( 1-32 )

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Xi-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Gln-X2-Glu-Glu-Glu-

Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Pro-X3

EW2 (1-32)

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Xi-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Gln-X2-Glu-Glu-Glu-

Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Gln-Gly-Gly-Pro-X3

其中： Xl=Phe或 Tyr

X2=Met、 Leu或 He ;

X3=Arg, OH或 NH2。

优选地， XI为 Tyr或 Phe， X2为 Met或 Leu，更优选地， X3为 Arg。

本发明的另一方面提供了含有上述 Exendin 4类似物的药物组合物，该组合物含有一种或多种具有上述结构式的化合物和一种药学上可接受的稀释剂或赋形剂，优选的该组合物为单位剂量形式，如片剂、丸剂、胶囊（包括持续释放或延迟释放形式）、粉剂、颗粒、酏剂、酊剂、糖浆和乳液，消毒的注射用溶液或悬液，气雾剂或液体喷剂，滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。例如，以片剂或胶囊的形式口服给药，上述活性药物组分可以与一种口服的无毒的药学可接受的惰性载体，如乙醇、甘油、水及其类似物结合。另外，本发明还提供了上述化合物及药物组合的在制备治疗疾病中的用途，优选的该疾病是 2型糖尿病。本发明的又一个方面提供了制备上述 Exendi n 4类似物及衍生物的基因工程方法。对于 X3为 Arg的上述化合物，可以用基因工程方法来合成，还可以通过化学方法来合成，但优选用基因工程方法来合成。对于 X3为 0H或 NH2的上述化合物，也可以通过化学方法以多肽合成仪进行合成。

本发明改变 Exend i n 4的化学结构，从 C端缩短其肽链长度并改变氨基酸结构，保持其降血糖活性，从而使 Exendi n 4的肽链长度与人源 GLP- 1相近，降低免疫源性，肽链只含一个 Lys20，有利于脂肪酸的定点酰化形成长效衍生物。同时改构满足基因工程方法生产的需要，适合基因工程大量生产，降低成本，适应广大 2型糖尿病患者的需要，为广大 2型糖尿病患者提供一个新的治疗药物

附图说明

图 1是 Exendi n 4类似物基因片断的串联图；

图 2是基因工程法生产 Exendi n 4类似物的流程图；

图 3是 EW1与 Exend i n4降血糖作用的测定。

具体实施方式

实施例一：

用基因工程方法生产 EW 1

材料

EW 1

EcoRI Bgl II Arg Hi s Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asp Leu Ser Ser Gin Met Glu

^ _ ^ CGT CAC GGC GAA GGC ACC TAC ACC AGC GAT CTG AGC AGC CAG ATG GAA Glu Glu Ala Val Lys Leu Phe l ie Glu Trp Leu Val Asn Gly Gly Pro Arg

GAA GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG GTT AAC GGC GGC CCG CGT GGATCC TAG ^ ~

BamH I Sal I

( 1 ) 根据 EW1氨基酸序列及相应 DNA (正链）序列，合成 DNA片段

5' AATTCCAGATCTCGTCACGGCGAAGGCACCTACACCAGCGATCTGAGCAGCCAGATGG

AAGAAGAAGCGGTTAAACTGTTCATCGAATGGCTGGTTAACGGCGGCCCGCGTGGATC CTAGTCGAC 3'

合成 DNA片段

1 ) 5' AATTCCAGATCTCGTCACGGCGAAGGCACCTACACCAGCGATCTGAGCAGCCAGATGG 3' 4 ) 5' CTAGGATCCACGCGGGCCGCCGTTAACCAGCC 3'

5 ) 5' GTGCCTTCGCCGTGACGAGATCTGG 3'

6 ) 5' tcgaCTAGGATCCACGCGGGCCGCCGTTAACCAGCC 3'

(2) 按 PCR常规方法，合成 EWl基因，经 EcoR I /Sal I双酶切后，克隆到含 Lac启动子质粒中，测定 DNA序列与设计完全一致。

TCGAC

( 3 )参见图 1，按图示方案将 EW1基因进行串联，得到含 8个拷贝基因的质粒。定 DNA全序列，符合设计，转化 E. col i JM109。实施例二：

EW2

EcoR I Bgl II Asn Gly Arg His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asp Leu Ser Ser Gin Met Glu ^ _ ^ ^ _ ^ AAC GGC CGT CAC GGC GAA GGC ACC TAC ACC AGC GAT CTG AGC AGC CAG ATG GAA Glu Glu Ala Val Lys Leu Phe l ie Glu Trp Leu Val Gin Gly Gly Pro Arg

GAA GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG GTT CAG GGC GGC CCG CGT GGATCC TAG ^ _ ,

BamH I Sa i l 以 £ ₁的 1) 为模板，合成二个 DNA片段

487f： 5' ccaatgAATTCCAGATCTAACGGCCGTCACGGCGAAG 3' 487r : 5' aattGTCGACTAGGATCCACGCGGGCCGCCCTGAACCAGCCAT 3'

进行 PCR扩增，测定 DNA序列，构建 EW2基因工程菌。

gAAt TCC AGA TCT AAC GGC CGT CAC GGC GAA GGC ACC TAC ACC AGC GAT CTG AGC AGC CAG ATG GAA GA'

GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG GTT CAG GGC GGC CCG CGT G_

GA TCT AAC GGC CGT CAC GGC GAA GGC ACC TAC ACC AGC GAT CTG AGC AGC CAG ATG GAA GAA

GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG GTT CAG GGC GGC CCG CGT G_

GAA GCG GTT AAA CTG TTC ATC GAA TGG CTG GTT CAG GGC GGC CCG CGT GGA TCC TAGtcgac 实施例三：

EW1、 EW2的制备

( A ) 基因工程菌的发酵： Ewl基因工程菌接种于 300ml X 2瓶 LB培养基中，加

氨苄西林（Ampici ll in ) 使其最后浓度为 50 y g/ml， 37'C，摇床培养过夜

( 150rpm) 。第二日转至 20L New Brunswik 发酵罐培养，培养液组成为 M9 培养液，加葡萄糖浓度 1%，氨苄西林（Ampici ll in ) 浓度为 50 g/ml，通气量为 20L/_min，溶氧维持在 20%以上，防泡剂为国产泡敌， pH维持在 7〜8，用氨水调节。当菌体浓度达 log曲线中线，加 IPTG, 浓度为 0. 5mM，继续发酵 4〜6小时，离心收集菌体为湿重 30〜50g/L。

( B) 细胞破碎：收集的菌体用 pH 7. 0 Tris 缓冲液 20mM匀浆，之后加溶菌酶

lg/L , 37°C保温 1小时，冷冻一 20°C 过夜，超声破碎 3次，每次 1分钟左右，离心收集沉淀， 2M Urea 打碎洗涤 1次，再打碎水洗 1次。

( C) 分离、纯化包涵体：沉淀溶于 8M 尿素，分子筛 Sephadex G-100 A2S0nm 检测，透析过夜， DEAE pH8.0-9.0梯度洗脱，蛋白电泳确定目标蛋白。

(D) 融合蛋白的裂解：二羧酸溶解， pH7.5条件下加入 1〜2%。高纯度猪胰蛋白酶 37Ό 搅拌 2〜3小时， HPLC追踪。完成酶解反应后以蠕动泵 30000 分子量超滤除去胰蛋白酶。

(E) 制备型 HPLC纯化。

(F) 冷冻干燥获得产品。实施例四：

肉豆蔻酸酰化的 EW2衍生物制备

(A) 取 EW2融合蛋白 10g溶于 100ml水中，加 50ml 2M的羟胺并调节 pH 9.0，加盐酸胍使其最终浓度为 5M， 45°C保温过夜。

称取肉豆蔻酸（Maristic acid) 1.14g， N_羟基琥珀酸亚胺

(N-hydroxysuccinimide) 0.6g, Ν， Ν' -二环己基碳酰亚胺 (DCCI) 1.03g溶于 50ml 二氧六环（dioxane) 中，室温搅拌， 4小时后，过滤除去脲素衍生物，取清液 20ml 加入（A) 中，加 ΙΟΟμ Ι四甲基胍（Tetrameltyl- guanidine) ，室温激烈搅拌下反应 4小时后用 2N HC1调至 pH 3-4， 8000rpm离心，将沉淀用乙醇洗涤 2次，将脂肪酸酰化的 Ew2溶于水中，以碳酸氢钠粉末调至 pH7〜8 ，按重量的 1〜2%。加高纯度猪胰蛋白酶 37°C 搅拌反应 2〜3小时， HPLC追踪。制备型 HPLC纯化。冷冻干燥获得产品。实施例五：

EWi、 EW2的降血糖作用的测定

C57BL/6的 8周龄小鼠，禁食过夜（只给饮水）

对照组、 EWi组、 Exendin 4组

每组 4只，腹腔注射药物一次，然后注射 30%葡萄糖溶液 300 μ ΐ，每 2小时注射一次葡萄糖， 20分钟后睚旁取静脉血 5 μ 1，以葡萄糖氧化酶试纸测定快速血糖，参见图 2，结果表明 EWi的降血糖作用与 Exendin 4相当。

Claims

权利要求书

1. 长效 Exendin 4类似物，其结构式为：

EW1 ( 1 -32 )

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Xi-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Gln-X2-Glu-Glu-Glu-

Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Leu-Asn-Gly-Gly-Pro-X3

其中： Xl=Phe或 Tyr;

X2=Met或 Leu或 lie;

X3=Arg或 OH或 NH2。

2. 长效 Exendin 4类似物，其结构式为：

EW2 ( 1 -32)

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Xl-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Ser-Gln-X2-Glu-Glu-Glu-

Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Val-Gln-Gly-Gly-Pro-X3

其中： Xl=Phe或 Tyr;

X2=Met或 Leu或 l ie;

X3=Arg或 OH或 NH2。

3. 如权利要求 1或 2所述的 Exendin 4类似物，其中，肽链长度为 32个氨基酸。

4. 如权利要求 1或 2所述的 Exendi n 4类似物，其中，所述的 X3是 0H或- NH2。

5. 如权利要求 1或 2所述的 Exendin 4类似物，其中，所述的 Lys₂Q的 ε ( epsi lon 的缩写） -NH2是肉豆蔻酸或棕榈酸酰化物。

6. 一种含有如权利要求 1或 2所述的 Exendin 4类似物的药物组合物，其进一步含有药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

7. 如权利要求 6所述的药物组合物，其中，所述的载体选自于如下一组物质：乙醇、甘油和水。

8. 如权利要求 1或 2所述的 Exendin 4类似物，其用途为：用于制备治疗糖尿病的药物，其中，所述的糖尿病是 2型糖尿病。

9. 如权利要求 6或 7所述的药物组合物，其用途为：用于制备治疗糖尿病的药物，其中，所述的糖尿病是 2型糖尿病。