WO2011025078A1 - 봉한소체 또는 봉한관 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 또는 봉한관 염색방법 - Google Patents

봉한소체 또는 봉한관 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 또는 봉한관 염색방법 Download PDF

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WO
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bonghan
dyeing
corpuscle
trypan blue
duct
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소광섭
이병천
임재관
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서울대학교산학협력단
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    • A61K49/006—Biological staining of tissues in vivo, e.g. methylene blue or toluidine blue O administered in the buccal area to detect epithelial cancer cells, dyes used for delineating tissues during surgery
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Definitions

  • the present invention relates to a novel use of trypan blue, a dyeing composition comprising trypan blue, a dyeing composition for dyeing at least one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct, and at least any one of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct
  • the present invention relates to the use of blue and to a method of staining at least one of the Bonghan corpuscle and the Bonghan duct, and more particularly, the tree, which makes it possible to observe not only the visible parts of the Bonghan corpuscle or Bonghan duct, but also the parts that cannot be observed with the eyes.
  • a dyeing composition comprising pan blue, a dyeing composition for dyeing at least one of the Bonghan corpuscle and the Bonghan duct, the use of trypan blue for dyeing at least one of the Bonghan corpuscle and the Bonghan duct, and at least one of the Bonghan corpuscle and the Bonghan duct It relates to a dyeing method.
  • Trypan blue is known as a dye that selectively stains dead tissue or cells selectively blue, and is mainly used to measure cell counts or tissue activity in mice in the laboratory.
  • Acupuncture has no side effects that occur in the case of drug administration, so interest in it has recently increased rapidly, and research on this has been actively conducted.
  • the National Institute of Health (NIH) in the United States recognizes that acupuncture is particularly effective in chronic disease, and is increasing the funding for basic research and diagnostic medical device development.
  • Bonghan corpuscle and Meridian is Bonghan corpus
  • Bonghan corpuscle and Bonghan corpuscle are connected in a network like structure.
  • these Bonghan corpuscles and Bonghan ducts are said to exist not only on the skin but also on blood vessels, lymphatic vessels, or organ surfaces.
  • such Bonghan corpuscle or Bonghan duct had a problem that it is difficult to observe with eyes.
  • the relatively thick Bonghan corpuscle or Bonghan duct as part of the Bonghan corpuscle or Bonghan duct present in the intestinal surface can be observed with the aid of a microscope or the like.
  • there is a problem that most Bonghan corpuscles or Bonghan ducts that are not thickened cannot be observed.
  • the present invention is to solve a number of problems including the above problems, dyeing including trypan blue, so that not only visible parts of Bonghan corpuscle or Bonghan duct can be observed but also the parts that cannot be observed with the eyes.
  • the present invention provides a dyeing composition for dyeing at least one of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct, including trypan blue.
  • the IUPAC name of the trypan blue is (3Z, 3'Z) -3,3 '-[(3,3'-dimethylbiphenyl-4,4'-diyl) di (1Z) hydrazin-2-yl-1-ylidene ] bis (5-amino-4-oxo-3,4-dihydronaphthalene-2,7-disulfonic acid), the molecular formula is C 34 H 28 N 6 O 14 S 4 , it may be commercially available.
  • the dyeing composition may be 0.4% trypan blue.
  • the dyeing composition may be for staining at least one of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct distributed in the skin, blood vessels, lymphatic vessels and organs of the organism.
  • the present invention also provides the use of trypan blue for dyeing at least one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct.
  • the trypan blue may be 0.4% trypan blue.
  • the trypan blue may be for staining at least one of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct distributed in the skin, blood vessels, lymphatic vessels and organs of the organism.
  • the present invention also provides a method for staining at least one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct, which comprises dropping trypan blue onto a sample.
  • after dropping trypan blue on the sample it may be further comprising the step of washing the sample.
  • the washing may be by physiological saline or phosphate buffer.
  • the sample may be at least one of skin, blood vessels, lymphatic vessels and organs of the organism.
  • the present invention also provides a use of the dyeing agent of at least one of trypan blue, Bonghan corpuscle and Bonghan duct.
  • the composition or dye of the present invention is generally provided in the form of an aqueous composition.
  • the aqueous composition can be formulated by dissolving trypan blue, for example, in an aqueous medium such as physiological saline or phosphate buffered saline, if necessary.
  • the method of preparing the composition or dyeing agent of the present invention is not limited to the above method, and those skilled in the art can select a suitable method. It is also possible to prepare the composition or dye of the present invention as a composition in the form of a lyophilized powder by lyophilizing the aqueous composition.
  • composition or dyeing agent of the present invention as a pharmacologically and pharmaceutically acceptable additive, for example, excipients, disintegrating to disintegrating aids, binders, lubricants, coatings, pigments, diluents, bases, solubilizers to dissolve Adjuvants, isotonic agents, pH adjusters, stabilizers, propellants, pressure sensitive adhesives, and the like can be used.
  • excipients such as glucose, lactose, D-mannitol, starch, or crystalline cellulose
  • Disintegrating agents or disintegrating aids such as carboxymethyl cellulose, starch, or carboxymethyl cellulose calcium
  • Base such as petrolatum, liquid paraffin, polyethylene glycol, gelatin, kaolin, glycerin, purified water, or hard fat
  • Tonicity agents such as glucose, sodium chloride, D-mannitol, glycerin
  • PH adjusting agents such as inorganic acids, organic acids, inorganic bases or organic bases:
  • Additives for preparations such as a drug which can contribute to stabilization, such as vitamin A, vitamin E, coenzyme Q, can be added.
  • a dyeing composition comprising trypan blue of the present invention
  • a dyeing composition for dyeing at least one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct and use of trypan blue for dyeing at least one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct, and Bonghan corpuscle and Bonghan duct
  • at least one dyeing method at least any one of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct as a dyeing composition comprising trypan blue, so that not only the visible portion of Bonghan corpuscle or Bonghan duct, but also the part that cannot be observed by the eye
  • a dyeing composition for dyeing one, the use of trypan blue for dyeing at least one of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct, and the dyeing method of at least any one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct it is possible to implement a dyeing composition for dyeing one, the use of trypan blue for dyeing at least one of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct, and the dyeing method of at least any one of Bonghan corpuscle and
  • FIG. 1 is a photograph of a sample before staining in which a thick Bonghan corpuscle is observed.
  • FIG. 2 is a photograph of a sample of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct dyed by the dyeing method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a photograph of another sample stained Bonghan corpuscle and Bonghan duct by the dyeing method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a photograph of another sample stained Bonghan corpuscle and Bonghan duct by the dyeing method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a photograph of another sample of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct dyed by the dyeing method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a photograph of another sample stained Bonghan corpuscle and Bonghan duct by the dyeing method according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a photograph of a portion of the Bonghan duct dyed by the dyeing method according to an embodiment of the present invention superimposed with a DAPI stained image and the phase difference microscope image of the Bonghan duct.
  • the inventors of the present invention have studied the method of visualizing and observing Bonghan corpuscle and / or Bonghan duct, and as a result, have found that trypan blue can selectively stain Bonghan corpuscle and / or Bonghan duct, thereby completing the present invention.
  • Laboratory rats can be used in rats raised in a environment of 60% relative humidity and 23 ° C under 12 hour day / night cycles.
  • Anesthesia may be achieved by introducing urethane (1.5 g / kg) into the peritoneum.
  • Figure 1 is a photograph of the small intestine and surrounding small intestine adipose tissue obtained through a stereoscopic microscope called STZ10 of Olympus with a CCD camera called DP70 of Olympus, where a thickened Bonghan corpuscle is observed.
  • the milky white area indicated by arrow A is the thickened Bonghan corpuscle.
  • a plurality of Bonghan corpuscles are connected to the Bonghan ducts as described above, only some of the thick Bonghan corpuscles can be observed by the eye, and no Bonghan corpuscles connecting the other Bonghan corpuscles or Bonghan corpuscles can be observed at all. .
  • the fat area indicated by arrow B Bonghan corpuscles or Bonghan corpuscles connecting Bonghan corpuscles cannot be observed at all.
  • FIG. 2 is a photograph of a sample obtained after such a step.
  • Figure 2 it can be seen that in addition to the thick Bonghan corpuscle (arrow A) shown in Figure 1 before the dyeing stained to the Bonghan duct (see the arrow C portion) in the fat portion indicated by the arrow B.
  • other tissues can be observed blue Bonghan corpuscle or Bonghan duct.
  • only the Bonghan duct, which appears in the arrow C portion in the fat portion indicated by the arrow B is not stained at all. That is, according to the dyeing method according to the present embodiment, it is possible to accurately dye only the corresponding portion up to the Bonghan corpuscle or Bonghan duct in the adipose tissue.
  • FIG. 3 is a photograph of a sample obtained after such a step. Specifically, Figure 3 is a photograph showing that the Bonghan corpuscle and Bonghan ducts present in the intestinal peritoneum near the spleen near the spleen of the experimental rat were selectively stained. Arrows in FIG. 3 indicate Bonghan corpuscles, and the remaining stained portions are Bonghan ducts connecting the Bonghan corpuscles.
  • the staining method according to this embodiment it can be seen that the capillaries are not stained at all. That is, according to the dyeing method according to the present embodiment, it is possible to accurately dye only the corresponding portion up to the Bonghan corpuscle or Bonghan duct in the adipose tissue.
  • Figure 4 is a photograph of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct of the other part of the experimental rat stained by the dyeing method according to this embodiment. Specifically, Figure 4 is a photograph of the membrane portion between the stomach and the small intestine, it can be seen that Bonghan corpuscles as indicated by the arrow and Bonghan ducts connecting the Bonghan corpuscles are selectively stained.
  • FIG. 5 is a photograph of the intestinal peritoneum around the spleen near the spleen of the experimental rat, in which the transparent arrows represent the stained floating Bonghan ducts and the other arrows represent the Bonghan ducts.
  • the dyeing method according to the present embodiment it is possible to observe the Bonghan ducts freely movable on the surface of the internal organs, and in particular, the Bonghan ducts on the tabernacle can be confirmed as a part of the network of such freely movable Bonghan ducts.
  • FIG. 6 is a photograph of the Bonghan corpuscle and Bonghan duct of another part of the experimental rat dyed by the dyeing method according to the present embodiment. Specifically, Figure 6 is a photograph of the abdominal fat portion of the experimental rat. As shown in Figure 6 through the dyeing method according to this embodiment can be stained Bonghan corpuscle, as shown in the circled portion and further can be stained Bonghan ducts as shown in the arrow. Thus, even if the Bonghan corpuscle and Bonghan duct are located in fat, according to the dyeing method according to the present embodiment, only Bonghan corpuscle and Bonghan duct can be dyed accurately.
  • FIG. 7 is a photograph of a portion of the Bonghan duct dyed by the dyeing method according to the present embodiment with a DAPI stained image and a phase contrast microscope image of the Bonghan duct.
  • 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (4', 6-diamidino-2-phenylindole) is a portion of the Bonghan duct visualized by staining with trypan blue as shown in FIG. (DAPI) and the image which superimposed the phase difference microscope image of the said part.
  • DAPI phase contrast microscope
  • a phase contrast microscope was used with Axiophot of Zeiss, Germany, and a confocal laser scanning microscope of Zeiss, Germany.
  • the dye composition comprising trypan blue according to the present embodiment, the use of at least one of trypan blue for dyeing Bonghan corpuscle and Bonghan duct, dyeing method of at least one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct, trypan
  • the use of dyes using blue not only the thick Bonghan corpuscles observed with the eye through conventional microscopes but also various Bonghan corpuscles and Bonghan ducts can be effectively dyed and observed, thus making Bonghan essential for meridian research. It could be a breakthrough in the study of bodies and Bonghan ducts.
  • a dyeing composition comprising trypan blue
  • a dyeing composition for dyeing at least one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct and use of trypan blue for dyeing at least any one of Bonghan corpuscle and Bonghan duct, and at least any of Bonghan corpuscle and Bonghan duct
  • One dyeing method can be applied to at least one of Bonghan corpuscles and Bonghan ducts distributed in the skin, blood vessels, lymphatic vessels and organs of the organism in addition to the tissues described above.
  • Effective visualization of at least one of the Bonghan corpuscle and the Bonghan duct by allowing the effective dyeing of at least one of the Bonghan corpuscle and the Bonghan duct through the use of a dyeing composition for staining at least one of the Bonghan corpuscle and the Bonghan duct, including trypan blue Can be enabled.

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Abstract

본 발명은 봉한소체 또는 봉한관의 눈에 띄는 부분뿐만 아니라 눈으로 관찰이 불가능하던 부분까지 관찰할 수 있도록 하는, 트리판 블루를 포함하는, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나를 염색하기 위한 염색 조성물을 제공하며, 또한, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하기 위한 트리판 블루의 용도와, 트리판 블루를 시료 상에 떨어트리는 단계를 포함하는, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법을 제공한다.

Description

봉한소체 또는 봉한관 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 또는 봉한관 염색방법
본 발명은 트리판 블루의 신규 용도에 관한 것으로, 트리판 블루를 포함하는 염색 조성물로서 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하는 염색 조성물과, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법에 관한 것이며, 더 상세하게는 봉한소체 또는 봉한관의 눈에 띄는 부분뿐만 아니라 눈으로 관찰이 불가능하던 부분까지 관찰할 수 있도록 하는, 트리판 블루를 포함하는 염색 조성물로서 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하는 염색 조성물과, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법에 관한 것이다.
트리판 블루(trypan blue)는 선택적으로 죽은 조직 또는 세포를 선택적으로 청색으로 염색하는 염료로 알려져 있으며, 주로 세포 계수 또는 실험실에서 쥐의 조직 활성을 측정하기 위해 사용된다.
한편, 고전 한의학(혹은 중의학) 이론에 따르면 인체에는 경락이 있는바, 이 경락은 치료효과가 있다고 알려져 있는 특이한 반응점(경혈점)들을 연결한 체표 상의 선들을 말한다. 한의학 원리에 따르면 이 경혈점들이 각각 대응하는 내부 장기의 상태와 밀접한 관련이 있는바, 침술의 원리는 침 등으로 해당 경혈점을 적절히 자극함으로써 장기의 질병 등의 상태를 조절하는 것이다.
침술은 약물투여 등의 경우에 발생하는 부작용이 없어 최근 이에 대한 관심이 급속히 증대되고 있으며 이에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다. 미국의 NIH(National Institute of Health)에서는 특히 침술이 만성질환에 있어서 그 효과가 큼을 인정하였으며 이에 대한 기초 연구 및 진단 의료기 개발을 위한 연구비를 증액하고 있다.
그러나 침술의 정확한 원리는 아직까지 명확히 규명되지 않았으며 침을 이용한 치료의 객관적인 기준도 완벽하게 확립되지 않은 실정이다. 특히, 침술 시술 시 해당 경혈 위치의 정확한 결정은 시술자의 지극히 주관적인 판단에 의해 이루어지고 있으며, 침술이 성행하고 있는 아시아 국가조차에서도 몇몇 경혈의 정확한 위치 판정문제에 대해서는 표준화가 이루어지지 않았다.
한편, 봉한이론에 따르면 경혈점은 봉한소체이고 경락은 봉한관이라고 하며, 신체 곳곳에 봉한소체와 봉한관이 그물망과 같은 구조로 연결되어 있다고 한다. 특히, 이러한 봉한소체와 봉한관은 피부뿐만 아니라 혈관, 림프관 내부 또는 장기 표면에도 존재하고 있다고 한다. 그러나 이러한 봉한소체 또는 봉한관은 눈으로 관찰하기 어렵다는 문제점이 있었다. 즉, 장 표면 등에 존재하는 봉한소체 또는 봉한관의 일부로서 상대적으로 비후한 봉한소체 또는 봉한관은 현미경 등의 도움을 받아 눈으로 관찰할 수 있으나, 그 구체적인 모습까지 파악하는 것은 용이하지 않다는 문제점이 있었다. 또한, 비후하지 않은 대부분의 봉한소체 또는 봉한관은 관찰할 수 없다는 문제점이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 봉한소체 또는 봉한관의 눈에 띄는 부분뿐만 아니라 눈으로 관찰이 불가능하던 부분까지 관찰할 수 있도록 하는, 트리판 블루를 포함하는 염색 조성물로서 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하는 염색 조성물과, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은, 트리판 블루를 포함하는, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나를 염색하기 위한 염색 조성물을 제공한다.
상기 트리판 블루의 IUPAC 명칭은 (3Z,3'Z)-3,3'-[(3,3'-dimethylbiphenyl-4,4'-diyl)di(1Z)hydrazin-2-yl-1-ylidene]bis(5-amino-4-oxo-3,4-dihydronaphthalene-2,7-disulfonic acid)이고, 분자식은 C34H28N6O14S4이며, 시판품일 수 있다.
이러한 본 발명의 다른 특징에 의하면, 상기 염색 조성물은 0.4% 트리판 블루인 것으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 상기 염색 조성물은 생물의 피부, 혈관, 림프관 및 장기에 분포된 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나를 염색하기 위한 것으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하기 위한 트리판 블루의 용도를 제공한다.
이러한 본 발명의 다른 특징에 의하면, 상기 트리판 블루는 0.4% 트리판 블루인 것으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 상기 트리판 블루는 생물의 피부, 혈관, 림프관 및 장기에 분포된 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나를 염색하기 위한 것으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 트리판 블루를 시료 상에 떨어트리는 단계를 포함하는, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법을 제공한다.
이러한 본 발명의 다른 특징에 의하면, 트리판 블루를 시료 상에 떨어트린 후, 상기 시료를 세척하는 단계를 더 포함하는 것으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 상기 세척은 생리식염수 또는 인산완충액에 의한 것으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 의하면, 상기 시료는 생물의 피부, 혈관, 림프관 및 장기 중 적어도 어느 하나인 것으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 트리판 블루의, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색제 제조용도를 제공한다.
본 발명의 조성물 또는 염색제는, 일반적으로는 수성 조성물의 형태로 제공된다. 수성 조성물은, 예컨대, 계면활성제를 생리식염수나 인산 완충액 생리식염수 등의 수성매체에 필요에 따라서 트리판 블루를 용해시켜 제제화 할 수 있다. 다만, 본 발명의 조성물 또는 염색제의 제조방법은 상기 방법에 한정되지 않으며, 당업자가 적당한 방법을 선택할 수 있다. 상기 수성 조성물을 동결건조함으로써 동결건조분말 형태의 조성물로서 본 발명의 조성물 또는 염색제를 제조하는 것도 가능하다.
본 발명의 조성물 또는 염색제를 제조하기 위해서는, 약리학적, 제제학적으로 허용할 수 있는 첨가물로서, 예컨대, 부형제, 붕해제 내지 붕해보조제, 결합제, 활택제, 코팅제, 색소, 희석제, 기제, 용해제 내지 용해보조제, 등장화제, pH 조절제, 안정화제, 분사제, 및 점착제 등을 사용할 수 있다. 예를 들면, 포도당, 유당, D-만니톨, 전분, 또는 결정 셀룰로오스 등의 부형제; 카르복시메틸 셀룰로오스, 전분, 또는 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘 등의 붕해제 또는 붕해보조제; 바셀린, 유동파라핀, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 카올린, 글리세린, 정제수, 또는 경화유(hard fat) 등의 기제; 포도당, 염화나트륨, D-만니톨, 글리세린 등의 등장화제; 무기산, 유기산, 무기염기 또는 유기염기 등의 pH 조절제: 비타민 A, 비타민 E, 코엔자임 Q 등 안정화에 기여할 수 있는 약제 등의 제제용 첨가물을 첨가할 수 있다.
본 발명의 트리판 블루를 포함하는 염색 조성물로서 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하는 염색 조성물과, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법에 따르면, 봉한소체 또는 봉한관의 눈에 띄는 부분뿐만 아니라 눈으로 관찰이 불가능하던 부분까지 관찰할 수 있도록 하는, 트리판 블루를 포함하는 염색 조성물로서 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하는 염색 조성물과, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법을 구현할 수 있다.
도 1은 비후한 봉한소체가 일부 관찰되는 염색 전 시료의 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 염색방법에 의해 봉한소체와 봉한관이 염색된 시료의 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 염색방법에 의해 봉한소체와 봉한관이 염색된 다른 시료의 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 염색방법에 의해 봉한소체와 봉한관이 염색된 또 다른 시료의 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 염색방법에 의해 봉한소체와 봉한관이 염색된 또 다른 시료의 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 염색방법에 의해 봉한소체와 봉한관이 염색된 또 다른 시료의 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 염색방법에 의해 염색된 봉한관의 부분을 DAPI로 염색한 사진과 봉한관의 위상차 현미경 이미지를 중첩한 사진이다.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명자들은 봉한소체 및/또는 봉한관을 시각화하여 관찰할 수 있는 방법에 관하여 연구한 결과, 트리판 블루가 봉한소체 및/또는 봉한관을 선택적으로 염색할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
먼저 마취제를 이용하여 실험용 쥐를 전신마취시킨다. 실험용 쥐로는 12시간 낮/밤 사이클 하에서 60%의 상대습도와 23℃의 온도의 환경 하에서 사육된 쥐를 이용할 수 있다. 마취는 우레탄 (1.5g/kg)을 복막 내부로 투입함으로써 이루어질 수 있다.
전신마취가 충분히 이루어진 후, 백선(medial alba)을 절개한다. 도 1은 올림푸스 사의 DP70이라는 CCD 카메라로 올림푸스 사의 STZ10이라는 입체현미경을 통해 획득한, 실험용 쥐의 소장과 소장 주위 지방 조직의 사진으로, 비후한 봉한소체가 일부 관찰된다. 예컨대 화살표 A로 표시한 우유빛 흰 부분이 비후한 봉한소체가 존재하는 부분이다. 그러나 전술한 바와 같이 복수개의 봉한소체들이 봉한관들로 연결되어 있음에도 불구하고, 눈으로는 비후한 봉한소체만 일부 관찰할 수 있을 뿐, 다른 봉한소체들이나 봉한소체들을 연결하는 봉한관들은 전혀 관찰할 수 없다. 특히 화살표 B로 표시한 지방 부분에는 봉한소체들이나 봉한소체들을 연결하는 봉한관들을 전혀 관찰할 수 없다.
이 상태에서 복강 내에 존재하는 위, 간, 소장, 대장 및 방광 등과 같은 장기들에 피펫이나 주사기를 이용하여 0.4% 트리판 블루(trypan blue)를 떨어트린다. 3~4 밀리미터와 같은 수 밀리미터의 트리판 블루를 떨어트릴 수 있다. 이러한 트리판 블루로는 미국의 시그마 회사가 판매하는 0.4% 트리판 블루를 이용할 수 있다. 이후 대략 60초 후 생리식염수(saline) 또는 인산완충액(phosphate buffered saline)을 장기에 자극을 주지 않을 정도로 주사기 등으로 장기에 뿌려, 장기를 세척한다. 세척은 복수회에 걸쳐 이루어질 수 있으며, 예컨대 pH 7.4의 인산완충액을 이용할 수 있다. 이러한 인산완충액으로는 미국의 시그마 회사가 판매하는 pH 7.4의 인산완충액을 이용할 수 있다.
도 2는 이와 같은 단계를 거친 후 획득한 시료의 사진이다. 도 2에서 알 수 있는 바와 같이, 염색 전 사진인 도 1에서 나타난 비후한 봉한소체(화살표 A) 외에 화살표 B로 표시한 지방 부분 내의 봉한관(화살표 C 부분 참조)까지 염색된 것을 알 수 있다. 물론 그 외의 다른 조직에서도 푸른색으로 염색된 봉한소체나 봉한관을 관찰할 수 있다. 특히, 화살표 B로 표시한 지방 부분 내에서 화살표 C 부분에 나타나는 봉한관만 염색되고 그 주위의 지방조직 등은 전혀 염색되지 않았음을 알 수 있다. 즉, 본 실시예에 따른 염색방법에 따르면, 지방조직 내의 봉한소체 또는 봉한관까지 해당 부분만을 정확하게 염색할 수 있다.
상기 실시예에서는 실험용 쥐의 소장과 소장 주위 지방 조직에 분포하는 봉한소체 또는 봉한관을 염색하는 방법 및 그 결과물에 대해 설명하였다. 이하에서는 타 기관에서의 봉한소체 또는 봉한관을 염색하는 방법 및 그 결과물에 대해 설명한다.
먼저 마취제를 이용하여 실험용 쥐를 전신마취시킨다. 전신마취가 충분히 이루어진 후, 백선(medial alba)을 절개한다. 이 상태에서 복강 내에 존재하는 위, 간, 소장, 대장 및 방광 등과 같은 장기들에 피펫이나 주사기를 이용하여 0.4% 트리판 블루(trypan blue)를 수 밀리미터, 예컨대 3~4 밀리미터 떨어트린다. 이후 대략 20~30초 후 생리식염수(saline) 또는 인산완충액(phosphate buffered saline)을 장기에 자극을 주지 않을 정도로 주사기 등으로 장기에 뿌려, 장기를 세척한다.
도 3은 이와 같은 단계를 거친 후 획득한 시료의 사진이다. 구체적으로 도 3은 실험용 쥐의 비장 근방 위장 주변의 장내 복막에 존재하는 봉한소체와 봉한관이 선택적으로 염색된 것을 보여주는 사진이다. 도 3에서의 화살표들은 봉한소체들을 가리키며, 염색된 나머지 부분은 봉한소체들을 연결하는 봉한관들이다. 특히, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 실시예에 따른 염색방법에 따르면 모세 혈관은 전혀 염색되지 않았음을 알 수 있다. 즉, 본 실시예에 따른 염색방법에 따르면, 지방조직 내의 봉한소체 또는 봉한관까지 해당 부분만을 정확하게 염색할 수 있다.
도 4는 실험용 쥐의 다른 부분의 봉한소체와 봉한관이 본 실시예에 따른 염색방법에 의해 염색된 사진이다. 구체적으로 설명하면 도 4는 위와 소장 사이의 장막 부분의 사진으로, 화살표로 표시된 것과 같은 봉한소체들과 이 봉한소체들을 연결하는 봉한관들이 선택적으로 염색된 것을 알 수 있다.
도 5는 실험용 쥐의 비장 근방 위장 주변의 장내 복막의 사진으로, 투명 화살표는 염색된 부유(floating) 봉한관을 나타내며, 다른 화살표들은 봉한관들을 나타낸다. 이와 같이 본 실시예에 따른 염색방법에 따르면, 내부 장기 표면 상에서 자유롭게 이동 가능한 봉한관들을 관찰할 수 있으며, 특히 장막 상의 봉한관들이 이러한 자유롭게 이동 가능한 봉한관들의 네트워크의 일부임까지도 실체로 확인할 수 있다.
도 6은 실험용 쥐의 또 다른 부분의 봉한소체와 봉한관이 본 실시예에 따른 염색방법에 의해 염색된 사진이다. 구체적으로, 도 6은 실험용 쥐의 복부 지방 부분의 사진이다. 도 6에 도시된 것과 같이 본 실시예에 따른 염색방법을 통해 원으로 표시된 부분에서와 같이 봉한소체를 염색할 수 있으며 나아가 화살표로 표시된 부분에서와 같이 봉한관들 역시 염색할 수 있다. 이와 같이 봉한소체와 봉한관이 지방 속에 위치하더라도 본 실시예에 따른 염색방법에 따르면 정확하게 봉한소체와 봉한관만을 염색할 수 있다.
도 7은 본 실시예에 따른 염색방법에 의해 염색된 봉한관의 부분을 DAPI로 염색한 사진과 봉한관의 위상차 현미경 이미지를 중첩한 사진이다. 구체적으로 설명하면, 도 2에 도시된 것과 같이 트리판 블루를 이용하여 염색하여 시각화된 봉한관의 부분을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole)(DAPI)로 염색한 이미지와, 해당 부분의 위상차 현미경 이미지를 중첩한 사진이다. 신속하고 광 안정성 있는 착색을 위해, 미국 Molecular Probes 사의 프롤롱 골드 안티페이드 시약(Prolong Gold antifade reagent)를 DAPI와 함께 사용하였다. 위상차 현미경은 독일 자이즈(Zeiss) 사의 Axiophot을 이용하였으며, 독일 자이즈 사의 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope)을 이용하였다.
종래 비후한 봉한소체 또는 봉한관 등의 연구를 통해, 봉한소체 또는 봉한관의 특징이 봉한관을 따라 종방향으로 배열된 간상의 세포핵들임이 밝혀진 바 있다. 또한 종래의 비후한 봉한소체 또는 봉한관 등의 연구를 통해, 봉한소체 또는 봉한관의 특징이 다발 모양 모습인 것이 밝혀진 바 있다. 본 실시예에 따라 트리판 블루로 염색된 부분을 DAPI로 염색한 사진에서는 도 7에서와 같이 간상의 세포핵들이 나타나며, 본 실시예에 따라 트리판 블루로 염색된 부분에 대한 위상차 현미경 이미지에서는 도 7에서와 같이 다발 모양 모습이 정확하게 드러난다. 이를 통해 본 실시예에 따른 염색방법으로 염색된 부분이 봉한소체 또는 봉한관임을 확인할 수 있다.
이와 같이 본 실시예에 따른 트리판 블루를 포함하는 염색 조성물과, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법과, 트리판 블루를 이용한 염색제 제조용도에 따르면, 종래 현미경 등을 통해 눈으로 관찰할 수 있었던 비후한 봉한소체뿐만 아니라 그 외의 다양한 봉한소체들과 봉한관들을 효과적으로 염색하여 이들을 관찰할 수 있으며, 따라서 경락 연구에 필수적인 봉한소체들과 봉한관들의 연구에 획기적인 발판일 될 수 있다.
이러한 트리판 블루를 포함하는 염색 조성물로서 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하는 염색 조성물과, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색용 트리판 블루의 용도와, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법은, 상술한 바와 같은 조직 외에도 생물의 피부, 혈관, 림프관 및 장기에 분포하는 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나에도 적용될 수 있음은 물론이다.
본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
트리판 블루를 포함하는, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나를 염색하기 위한 염색 조성물의 이용을 통해, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나의 효과적인 염색이 가능하도록 하여, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나의 효과적인 시각화가 가능하도록 할 수 있다.

Claims (11)

  1. 트리판 블루를 포함하는, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나를 염색하기 위한 염색 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 염색 조성물은 0.4% 트리판 블루인 것을 특징으로 하는 염색 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염색 조성물은 생물의 피부, 혈관, 림프관 및 장기에 분포된 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나를 염색하기 위한 것임을 특징으로 하는 염색 조성물.
  4. 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나를 염색하기 위한 트리판 블루의 용도.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 트리판 블루는 0.4% 트리판 블루인 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서,
    상기 트리판 블루는 생물의 피부, 혈관, 림프관 및 장기에 분포된 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 하나를 염색하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  7. 트리판 블루를 시료 상에 떨어트리는 단계를 포함하는, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색방법.
  8. 제7항에 있어서,
    트리판 블루를 시료 상에 떨어트린 후, 상기 시료를 세척하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 염색방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세척은 생리식염수 또는 인산완충액에 의한 것임을 특징으로 하는 염색방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 시료는 생물의 피부, 혈관, 림프관 및 장기 중 적어도 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염색방법.
  11. 트리판 블루의, 봉한소체 및 봉한관 중 적어도 어느 하나의 염색제 제조용도.
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