WO2010143295A1 - 多段型遺伝子増幅方法 - Google Patents

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WO2010143295A1
WO2010143295A1 PCT/JP2009/060759 JP2009060759W WO2010143295A1 WO 2010143295 A1 WO2010143295 A1 WO 2010143295A1 JP 2009060759 W JP2009060759 W JP 2009060759W WO 2010143295 A1 WO2010143295 A1 WO 2010143295A1
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droplet
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nucleic acid
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鉄雄 大橋
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株式会社島津製作所
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    • B01L7/54—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices using spatial temperature gradients

Definitions

  • the present invention relates to a multistage gene amplification method using a droplet manipulation device.
  • ⁇ -TAS micro total analysis system
  • the PCR method is a step of denaturing DNA by maintaining the target DNA for amplification in the presence of a primer, a heat-resistant DNA polymerase, a substrate, salts, and a buffer at a temperature of about 95 ° C., 50 ° C. to 60 ° C. And a step of annealing the primer to the template DNA, and a step of extending the complementary strand of the template DNA while maintaining the temperature at around 72 ° C.
  • DNA can be amplified by repeating a temperature cycle consisting of these steps 20 to 40 times.
  • Patent Document 1 An invention relating to a microchip in which a plurality of sample wells are arranged on a substrate by performing microfabrication on the substrate has been reported (see Patent Document 1).
  • operations up to extraction, purification, and amplification of DNA from a sample can be performed in a sample well on a substrate.
  • magnetic particles having a hydrophilic surface are used for DNA extraction, generation and amplification.
  • the magnetic particles having DNA attached to the surface are involved in DNA purification and amplification by moving on the substrate as the magnetic field fluctuates.
  • Patent Document 2 In recent years, there has been reported an invention relating to a chemical reaction apparatus capable of performing operations such as liquid feeding, fractionation, mixing, dilution, stirring, and temperature control on a reaction substrate (see Patent Document 2). .
  • a droplet containing magnetic particles having a hydrophilic surface is controlled by fluctuation of a magnetic field. And operation required for a chemical reaction can be performed without installing or installing fluid control elements, such as a pump, a valve, and a mixer, in a reaction substrate.
  • the nucleic acid adsorbed on the surface of the magnetic particles can be purified and amplified using the above chemical reaction apparatus. In the purification of nucleic acids, it is necessary to fix the droplets on a hydrophobic surface, and means using an electrostatic field has been reported (see Non-Patent Document 1).
  • non-sample-derived components other than nucleic acids often act in an inhibitory manner on the amplification reaction.
  • clinical biological samples such as blood contain a substance that inhibits the action of DNA polymerase used for gene amplification reaction. Therefore, nucleic acid purification using a disposable column is usually performed before the gene amplification reaction.
  • nucleic acid purification using a disposable column is usually performed before the gene amplification reaction.
  • nucleic acid purification using a column for removing an inhibitory substance requires labor and time to perform the treatment. Furthermore, the equipment used including a column is disposable and expensive. In addition, in cases where it is necessary to detect nucleic acids with high sensitivity from samples that contain many contaminants that inhibit the gene amplification reaction, even if the number of cycles in the temperature control program is increased to increase the sensitivity of PCR, The gain will soon reach its peak. On the other hand, the Nested PCR method often fails to obtain the resistance to the inhibitor sufficiently in the first reaction and fails in the second reaction. In addition, the nested PCR method collects the reaction product of the first time by hand, and thus not only takes time and effort, but also increases the risk of cross-contamination due to additional operations outside the reaction vessel. .
  • the present invention has been made to eliminate the above-mentioned disadvantages of the prior art, and is a rapid, simple and inexpensive multistage gene amplification method that is not easily affected by PCR-inhibiting components, has a low risk of cross-contamination.
  • the purpose is to provide.
  • the aspect of the present invention is as follows: (a) a droplet-shaped biological sample, a droplet-shaped first nucleic acid amplification reaction solution, and a droplet-shaped second nucleic acid amplification at different positions (B) inserting the magnetic carrier into the biological sample using a magnetic field and adsorbing the biological sample to the magnetic carrier; and (c) the magnetic carrier on which the biological sample is adsorbed. A step of extracting a part of the biological sample from the biological sample, and (d) using the magnetic field to which the biological sample is adsorbed inside the first nucleic acid amplification reaction solution.
  • the biological sample and the first nucleic acid amplification reaction liquid inserted and adsorbed on the magnetic carrier are mixed to form a first mixed droplet, and the first gene amplification reaction is performed on the first mixed droplet.
  • first mixing A step of pulling out the magnetic carrier from the droplet using a magnetic field, and (f) inserting the magnetic carrier into the second nucleic acid amplification reaction solution using the magnetic field, and the first mixed droplet adsorbed on the magnetic carrier and the second And a step of forming a second mixed droplet by mixing with the nucleic acid amplification reaction solution, and performing a second gene amplification reaction on the second mixed droplet.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an example of a droplet manipulation device used in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view as seen from the II direction of FIG.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the steps of fixing the biological sample and the first and second nucleic acid amplification reaction solutions in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a step of inserting a magnetic carrier into a biological sample in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an example of a droplet manipulation device used in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view as seen from the II direction of FIG.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the steps of fixing the biological sample and the first and second nucleic acid amplification reaction solutions in the multistage
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a step of moving the magnetic carrier to the second fixing means after extracting the magnetic carrier from the biological sample in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing steps of moving the first mixed droplet from the second fixing means in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing steps of moving the first mixed droplet to a position for performing the first thermal cycling reaction in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic diagram showing steps of performing a first thermal cycling reaction in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing steps of moving the first mixed droplet to the second fixing means in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a step of extracting a magnetic carrier from the first mixed droplet in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing steps of moving the magnetic carrier to the third fixing means in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing steps of moving the second mixed droplet from the third fixing means in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing a step of extracting a magnetic carrier from the first mixed droplet in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing steps of moving the magnetic carrier to the third fixing means in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of
  • FIG. 13 is a schematic diagram showing steps of moving the second mixed droplet to a position where the second thermal cycling reaction is performed in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a schematic diagram showing steps of performing a second thermal cycling reaction in the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 15 is an agarose gel electrophoresis image of an amplification product obtained using the multistage gene amplification method according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing a step of extracting a magnetic carrier from the first mixed droplet in the multistage gene amplification method according to the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 17 is a schematic diagram showing a step of discarding a magnetic carrier in the multistage gene amplification method according to the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 is a schematic diagram showing steps for preparing a new magnetic carrier in the multistage gene amplification method according to the second embodiment of the present invention.
  • FIG. 19 is a schematic diagram showing a step of inserting a new magnetic carrier into the first mixed droplet in the multistage gene amplification method according to the second embodiment of the present invention.
  • first and second embodiments described below exemplify apparatuses and methods for embodying the technical idea of the present invention
  • the technical idea of the present invention is a component article.
  • the material, shape, structure, arrangement, etc. are not specified below.
  • the technical idea of the present invention can be variously modified within the technical scope described in the claims.
  • the droplet manipulation device used in the multistage gene amplification method of the present invention is a device that uses a droplet-based microfluidic technology using magnetic particles or the like. As shown in FIGS. 1 and 2, the droplet manipulation device 20 used in the multistage gene amplification method of the present invention has a thickness of 0.3 mm in order to prevent external contamination in detection, analysis, etc. of reactants.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view as seen from the II direction in FIG. 1).
  • the droplet operating device 20 further has a water-repellent sheet 21 on the flat plate 26 having a surface to be a transport surface 20a for transporting the magnetic carrier 4 composed of the magnetic particles 41a, 41b, 41c,.
  • a water repellent sheet 21 for example, a fluororesin sheet such as polytetrafluoroethylene or a polypropylene sheet can be used.
  • the thickness of the water repellent sheet 21 is 0.5 to 0.015 mm.
  • Ra 0.1 ⁇ m
  • the magnetic field means 5 is moved closer to the lower surface of the transport surface 20a and the magnetic carrier 4 is moved by the movement of the magnetic field means 5. It can be expected that the followability of the movement of the magnetic carrier 4 accompanying the movement is improved.
  • the material used for the flat plate 26 and the side wall 27a of the droplet operating device 20 is preferably a material that is available at low cost so that it can be disposable and mass-produced. Further, in order to reduce the movement resistance when moving the droplets including the magnetic carrier 4, it is preferable to use a water-repellent material for the flat plate 26 and the side wall 27 a of the droplet operating device 20.
  • resin materials such as polypropylene, polytetrafluoroethylene, polyethylene, polyvinyl chloride, polystyrene, and polycarbonate can be suitably used.
  • the flat plate 26 and the side wall 27a of the droplet operating device 20 are made of a material having optical transparency. Preferably it is formed.
  • the flat plate 26, the side wall 27a, and the like of the droplet operating device 20 do not require special molding and processing as in the conventional flow path type device in order to reduce manufacturing costs and eliminate problems such as dead volume. A simple structure is preferred.
  • a first fixing means 6, a second fixing means 7, and a third fixing means 8 are provided under the droplet operating device 20.
  • the first fixing means 6 is disposed under the first cathode 6a (see FIG. 2) having a disc (flat plate) shape arranged in contact with the bottom surface of the flat plate 26, and below the first cathode 6a.
  • a first anode 6b having a frame shape, and a disc-shaped first conductive thin plate provided below the first anode 6b and insulated from the first cathode 6a and the first anode 6b. 6c is provided.
  • the second fixing means 7 is in contact with the bottom surface of the flat plate 26 and is disposed at a certain distance in the horizontal direction from the first cathode 6a, and has a second cathode 7a having a disc (flat plate) shape, A second anode 7b having a ring (frame) shape disposed under the cathode 7a, and a disk provided under the second anode 7b and insulated from the second cathode 7a and the second anode 7b ( A flat plate-like second conductive thin plate 7c.
  • the third fixing means 8 is in contact with the bottom surface of the flat plate 26 and is a third cathode having a disk (flat plate) shape that is disposed at a certain distance in the horizontal direction from the first cathode 6a and the second cathode 7a. 8a, a third anode 8b disposed under the third cathode 8a and having a ring (frame) shape, a third cathode 8a and a third anode 8b provided under the third anode 8b, An insulated (flat plate) -like third conductive thin plate 8c is provided.
  • the shapes of the conductive thin plate 7c and the third conductive thin plate 8c are not limited to a disc shape and a ring shape.
  • the electrodes of the first cathode 6a, the second cathode 7a, and the third cathode 8a are connected to the negative electrode (ground) side of the power source 22, and the first anode 6b, the second anode 7b, and the third anode 8b. Is connected to the positive side of the power source 22.
  • the strength of the electric field is preferably high enough to fix the droplets on the first fixing means 6, the second fixing means 7, and the third fixing means 8.
  • the magnitude of the voltage applied between the third cathode 8a and the third anode 8b is preferably in the range of 0.5 to 8 kV.
  • the voltages at the first fixing means 6, the second fixing means 7, and the third fixing means 8 can be individually varied and can be automatically controlled.
  • the movement control of the magnetic carrier 4 composed of the magnetic particles 41a, 41b, 41c,...
  • the magnetic field means 5 such as a magnet that can operate on a two-dimensional coordinate parallel to the transport surface 20a below the droplet operating device 20. This is done by moving (see FIGS. 3 to 14).
  • the size of the magnet used is preferably such that the magnetic particles 41a, 41b, 41c,... Can be aggregated, for example, a cylindrical neodymium magnet having a radius of 4 to 6 mm and a height of 10 mm.
  • the shape of a magnet etc. is not limited to a cylindrical shape. Magnets other than neodymium magnets such as ferrite, samakoba, alnico, and electromagnets can also be used.
  • the movement of the magnetic field means 5 can be automatically controlled by a control device (not shown).
  • a film heater 13 is disposed at the lower end of the flat plate 26.
  • the film heater 13 is set to a constant temperature by a control device (not shown).
  • the temperature on the conveyance surface 20a is the highest at the point immediately above where the film heater 13 is disposed, and the temperature continuously decreases as the distance from the film heater 13 increases. An area exists.
  • the magnetic particles 41a, 41b, 41c,... Constituting the magnetic carrier 4 are each formed of a magnetic material such as magnetite, ⁇ -iron oxide, manganese zinc ferrite, etc., and each responds to magnetism. Further, the magnetic particles 41a, 41b, 41c,... Have a chemical structure (for example, amino group, carboxyl group, epoxy group, avidin, biotin, digoxigenin, protein A, etc.) that specifically binds to the biological polymer on the surface. Protein G, complexed metal ions, or antibodies), or have a mode of specifically binding to a polymer by electrostatic force or van der Waals force.
  • the magnetic particles 41a, 41b, 41c,... Preferably have an average particle diameter of about 1 ⁇ m to 150 ⁇ m.
  • a droplet enclosing medium 24 that does not mix with the droplet 1 is enclosed in the droplet operating device 20.
  • the droplet encapsulating medium 24 is a chemically inert liquid, and does not inhibit various chemical reactions such as liquid separation, mixing, dilution, stirring, heating, and cooling (for example, hydrocarbons such as alkanes) , Perfluoroalkanes, chemicals in which some of the hydrogen atoms of the alkane are fluorine, hydrophobic liquid substances such as mineral oil, silicone oil, fatty acids, fatty acid esters, fatty acid amides, fatty acid ketones, fatty acid amines) .
  • the droplet encapsulating medium 24 is preferably a substance having a specific gravity smaller than 1.
  • a substance having a specific gravity smaller than 1 the droplet 1 sinks into the droplet encapsulating medium 24, so that the operability of the droplet 1 by the magnetic field means 5 is improved (see FIGS. 3 to 14).
  • a substance having low volatility specifically, Can prevent volatilization of the droplet encapsulating medium 24 and the droplet 1 by using mineral oil, silicone oil, fatty acid ester, oil or the like having a boiling point of 200 ° C. or less.
  • an insulator 23 such as a vinyl chloride sheet is provided under the flat plate 26, and the first cathode 6 a provided in contact with the bottom surface of the flat plate 26 and the first cathode 6 a are provided below.
  • the periphery of the provided first anode 6 b is covered with an insulator 23.
  • a first conductive thin plate 6 c is provided on the lower surface of the insulator 23.
  • the first conductive thin plate 6c, the second conductive thin plate 7c, and the third conductive thin plate 8c are formed of a single aluminum foil having a thickness of 45 ⁇ m. Further, in the droplet manipulation device 20 used in the multistage gene amplification method of the present invention, the diameter d 4 of the first conductive thin plate 6c, the second conductive thin plate 7c, and the third conductive thin plate 8c is 9 .5mm, first anode 6b, the outer diameter d 2 of the second anode 7b and the third anode 8b is 9.0 mm, the first anode 6b, the ring width of the second anode 7b and the third anode 8b d 3 is 1.2 mm, the first cathode 6a, the diameter d 1 of the second cathode 7a and the third cathode 8a is 5.5 mm.
  • the thickness t 1 of the water repellent sheet 21 is 0.05 mm
  • the thickness t 2 of the flat plate 26 on the bottom surface of the droplet operating device 20 is 0.3 mm.
  • the distance t 3 between the first cathode 6 a and the first anode 6 b in the thickness direction of the flat plate 26 of the first fixing means 6 is 0.36 mm
  • the first anode 6 b and the first anode 6 b in the thickness direction of the flat plate 26 are first.
  • the distance t 3 between the second cathode 7 a and the second anode 7 b in the thickness direction of the flat plate 26 of the second fixing means 7 is 0.36 mm, and the second anode 7 b in the thickness direction of the flat plate 26.
  • the distance t 4 between the second conductive thin plate 7c is 0.18 mm.
  • the third third of the cathode 8a and the third distance t 3 between anode 8b of 0.36mm in the thickness direction of the flat plate 26 of the fixing means 8, the third anode 8b in the thickness direction of the flat plate 26 When the distance t 4 between the third conductive thin plate 8c is 0.18 mm.
  • the “droplet” in the droplet manipulating apparatus 20 used in the multistage gene amplification method of the present invention refers to a lump of solution having a spherical shape or a shape close thereto due to the surface tension generated by the intermolecular force of the liquid. means.
  • the aqueous solution constituting the droplet 1 may contain a surfactant.
  • Surfactants include nonionic surfactants and ionic surfactants.
  • Nonionic surfactants include polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20 (registered trademark)), octylphenol poly (ethylene glycol ether) n (Triton X-100 (registered trademark)). It is done.
  • a nonionic surfactant is preferable in that it does not inhibit the reaction when a biochemical reaction is performed in the droplet 1.
  • examples of the ionic surfactant include sodium dodecyl sulfate and N-lauryl sarcosine.
  • a phenomenon in which the adsorption of the droplet 1 on the transport surface 20a of the droplet operating device 20 becomes strong by containing the surfactant is observed.
  • the surfactant can improve the operation accuracy of the droplet 1.
  • the surfactant also affects the fixation stability of the droplet 1 when the magnetic carrier 4 is separated from the droplet 1 containing the magnetic carrier 4.
  • the surfactant is preferably adjusted so as to be contained in the droplet 1 at a ratio of about 0.001 (v / v) to 1 (v / v)%.
  • FIGS. 3 to 14 schematically show the flat plate 26 forming the bottom surface of the droplet operating device 20 shown in FIGS. 1 and 2 and the transport surface 20a on the flat plate 26.
  • FIG. The droplet operating device 20 is in a state where the droplet encapsulating medium 24 of FIG. 2 is filled with silicone oil (Shin-Etsu Silicone KF96-20CS).
  • FIG. 15 shows the detection results by agarose gel electrophoresis of the amplification products obtained by the gene amplification reactions of this example and the comparative example (details will be described later).
  • examples of the biological sample to be prepared include animal and plant tissues, body fluids, excrement, and the like. Not only liquid samples but also suspensions of biological samples suspended in an appropriate solvent may be used.
  • examples of the body fluid include blood, saliva, urine and the like.
  • examples of blood include human blood such as various anticoagulant-treated blood, fresh blood, and long-term frozen and refrigerated blood, and rodent blood.
  • each of the first nucleic acid amplification reaction solution 3a and the second nucleic acid amplification reaction solution 3b is directly above the second fixing means 7 and the third fixing means 8, respectively.
  • a voltage of 3 kV is applied between the second cathode 7a and the second anode 7b of the second fixing means 7 (a voltage of 3 kV is applied between the third cathode 8a and the third anode 8b of the third fixing means 8).
  • a voltage was applied), and the droplet-like first nucleic acid amplification reaction solution 3a and the droplet-like second nucleic acid amplification reaction solution 3b were fixed on the horizontal surface of the transport surface 20a.
  • the first nucleic acid amplification reaction solution 3a and the second nucleic acid amplification reaction solution 3b 20 mM Tris-HCl (pH 9.5), 8 mM MgCl2, 200 ⁇ M each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP, 0.2 (wt / wt) v)% BSA, each 0.4 ⁇ M primer, and 2.5 units / 50 ⁇ l Taq DNA polymerase (TaKaRa Taq) were used.
  • the ⁇ actin gene was used as a template gene.
  • a ⁇ -actin detection forward primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 and a ⁇ -actin detection reverse primer consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 2 were used.
  • 10 ⁇ L of healthy human whole blood is dropped as a biological sample 2 directly on the first fixing means 6, and the first A voltage of 3 kV was applied between the first cathode 6a and the first anode 6b of the fixing means 6 to fix the droplet-shaped biological sample 2 on the horizontal plane.
  • the biological sample 2 used here was used as it was collected from the subject without being dissolved in a cell lysate or the like. Furthermore, by placing 500 ⁇ g of the magnetic carrier 4 made of magnetic particles directly above the magnetic field means 5 disposed under the flat plate 26 and moving the magnetic field means 5 in the horizontal direction, the magnetic field means 5 is moved in the same direction (horizontal direction). The magnetic carrier 4 was moved by a magnetic field. Next, as shown in FIG. 4, the magnetic field means 5 is moved in the horizontal direction at a speed of 1 mm / second toward directly below the first fixing means 6 in which the biological sample 2 is fixed with an electric field.
  • the moving speed of the magnetic field means 5 at this time may be 1 to 15 mm / second, and is not limited to 1 mm / second.
  • the magnetic carrier 4 is moved in the horizontal direction by moving the magnetic field means 5 in the left direction of FIG.
  • the magnetic carrier 4 was pulled out.
  • a part (about 0.5 ⁇ L) of the biological sample 2 (not shown) adsorbed on the magnetic carrier 4 was collected.
  • the speed of the magnetic field means 5 when pulling out the magnetic carrier 4 from the biological sample 2 is not limited to 200 mm / second as long as the amount of the sample collected by the magnetic carrier 4 is small.
  • the magnetic carrier 4 can extract a part of the sample from the biological sample 2 quantitatively by moving the magnetic field means 5 in the horizontal direction at a constant speed and pulling it out from the biological sample 2. it can.
  • the amount of sample that can be collected can be controlled with good reproducibility by the amount of magnetic particles constituting the magnetic carrier 4.
  • the magnetic carrier 4 is moved in the horizontal direction using the magnetic field by moving the magnetic field means 5 upward in FIG.
  • the magnetic carrier 4 is inserted into the first nucleic acid amplification reaction solution 3a fixed directly above the electric field, and a part of the biological sample 2 is adsorbed as shown in FIG.
  • a first mixed droplet 12 was formed by mixing the nucleic acid amplification reaction solution 1a.
  • the first mixed droplet 12 was moved by moving the magnetic field means 5 in the forward direction of FIG. 6 at 1 mm / second and moving the magnetic carrier 4 in the horizontal direction using the magnetic field. .
  • the voltage between the second cathode 7a and the second anode 7b of the second fixing means 7 may be lowered or turned off.
  • the magnetic field means 5 is moved in the left direction of FIG. 7, and the first mixed droplet 12 is moved in the horizontal direction toward the end of the flat plate 26 on which the film heater 13 is disposed ( It was moved to the left in FIG. Next, as shown in FIG.
  • the magnetic carrier 4 was reciprocated horizontally at a speed of 15 mm / sec using a magnetic field, and the first mixed droplet 12 was subjected to a temperature gradient.
  • a 20-cycle thermal cycling reaction (first gene amplification reaction) was performed on a horizontal plane.
  • the moving speed of the magnetic field means 5 at this time is not limited to the above speed as long as it can move the entire amount of the first mixed droplet 12.
  • the temperature gradient on the horizontal plane is highest at a position directly above the film heater 13 and decreases substantially linearly as the distance from the film heater 13 increases.
  • the DNA denaturation step temperature is 95 ° C.
  • the primer annealing step temperature is 57 ° C.
  • the extension reaction step temperature is 72 ° C.
  • the magnetic carrier 4 is moved horizontally using a magnetic field for each step.
  • the first mixed droplet 12 was moved in the horizontal direction to the position of the specified temperature on the horizontal plane.
  • the reaction cycle was 95 ° C. for 5 seconds, 57 ° C. for 15 seconds, and 72 ° C. for 5 seconds as one cycle.
  • the first mixed droplet 12 is moved by moving the magnetic carrier 4 in the horizontal direction (upward in FIG. 9) using a magnetic field.
  • a magnetic field was returned to the position immediately above the second fixing means 7 and fixed with an electric field.
  • the magnetic carrier 4 is moved in the horizontal direction using a magnetic field by moving the magnetic field means 5 in the horizontal direction at 200 mm / second in the front direction (downward direction) in FIG.
  • the magnetic carrier 4 was extracted from the first mixed droplet 12.
  • amplified DNA fragments (not shown) remain around and inside the magnetic carrier 4 (between magnetic particles).
  • “adsorption” does not mean only a state in which a DNA to be amplified or a prepared biological sample is adsorbed on the magnetic particle surface by various interactions, as described above. It also refers to the state of physically staying in the gap between magnetic particles.
  • the magnetic field means 5 is secondly amplified by the electric field directly above the third fixing means 8 by the electric field.
  • the magnetic carrier 4 is moved upward in FIG. 11 using a magnetic field by moving in the horizontal direction at 1 mm / second directly below the liquid 3b, and inserted into the second nucleic acid amplification reaction liquid 3b.
  • a second mixed droplet 15 in which the magnetic carrier 4 on which the amplified DNA fragment is adsorbed (not shown) and the second nucleic acid amplification reaction solution 3b are mixed is formed.
  • the magnetic field means 5 is moved in the front direction (downward direction) in FIG. 12 at 1 mm / second, and the magnetic carrier 4 is moved in the horizontal direction using the magnetic field, whereby the second mixed droplet 15 is moved. Moved. At this time, in order to quickly move the second mixed droplet 15, the voltage applied between the third cathode 8a and the third anode 8b of the third fixing means 8 can be lowered or cut off. Good. Further, as shown in FIG. 13, by moving the magnetic field means 5 in the left direction in FIG. 13, the magnetic carrier 4 is moved in the horizontal direction using the magnetic field, and the second mixed droplet 15 is moved by the film heater 13. It moved on the horizontal surface toward the edge part of the arrange
  • the magnetic carrier 4 was reciprocated in the horizontal direction at a speed of 15 mm / sec using a magnetic field, and the second mixed droplet 15 was subjected to a temperature gradient.
  • a 20-cycle thermal cycling reaction (second gene amplification reaction) was performed on a horizontal plane. The conditions per cycle were the same as in the first gene amplification reaction.
  • FIG. 15 (F) Next, gene amplification reaction products were detected.
  • the second mixed droplet 15 is collected by a micropipette or the like, and after removing the magnetic carrier, the second mixed droplet 15 is subjected to 3.5% agarose gel electrophoresis. An amplification product in 15 was detected.
  • FIG. FIG. 15 (a) shows, as a comparative example of the present invention, only the steps (a) to (c) described above, and the cycle of the first gene amplification reaction in the step (c). The detection result about the supernatant of the first mixed droplet 12 when the number is 40 cycles is shown.
  • the total number of gene amplification reaction repeats when using the PCR method is preferably about 20 to 40 times.
  • the preferred number of repetitions of the first gene amplification reaction is 20 to 80% of the total number of repetitions, and more preferably 40 to 60% of the total number of repetitions.
  • the gene amplification reaction is not limited to the PCR method, but a Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) method, a Ligase Chain Reaction (LCR) method, Standard Displacement Amplification (SDA) method, Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids (ICAN) method etc. are also applicable.
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • LCR Ligase Chain Reaction
  • SDA Standard Displacement Amplification
  • ICAN Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids
  • the LCR method repeats a temperature cycle step consisting of two temperature conditions: a denaturation step of double-stranded DNA at 94 ° C. to 99 ° C., and a ligation step of ligating complementary gene fragments at 50 to 70 ° C. It is a reaction.
  • the total number of repetitions in the LCR method is preferably about 50 to 70.
  • the mixed droplets 12 and 15 are arranged on the transport surface 20a of the droplet manipulation device 20 in two temperature ranges necessary for the denaturation step and the ligation step, respectively. It may be transferred to.
  • the LAMP method, the SDA method, and the ICAN method carry out gene amplification reactions isothermally. Therefore, when these gene amplification reactions are selected, it is not necessary to move the mixed droplets 12 and 15 during the amplification reaction, and the mixed droplets 12 and 15 are amplified by the gene amplification on the transport surface 20a of the droplet operating device 20.
  • a gene amplification reaction is achieved by fixing in a temperature range necessary for the reaction.
  • the reaction solution is replaced when the reaction time of the first gene amplification reaction is 20 to 80%, more preferably 40 to 60% of the total reaction time of the gene amplification reaction. What is necessary is just to transfer to a 2nd gene amplification reaction.
  • the first nucleic acid amplification reaction solution 3a is replaced with the second nucleic acid amplification reaction solution 3b, thereby obtaining the sample-derived gene amplification method. Since the influence of the reaction-inhibiting component can be reduced, an amplification product can be efficiently obtained from the biological sample 2 without performing a pretreatment such as nucleic acid extraction or purification.
  • reaction liquid replacement, gene amplification reaction, and the like can be operated from the outside of the droplet operating device 20 by the magnetic field means 5.
  • a resin that can be obtained at low cost can be used as the material of the droplet operating device 20.
  • the droplet operating device 20 does not require microfabrication unlike the conventional flow channel device, it is not necessary to consider the problem of dead volume. Further, the droplet operating device 20 can provide a completely closed reaction field. Furthermore, since the amount of the biological sample 2 and the first nucleic acid amplification reaction solution 3a and the second nucleic acid amplification reaction solution 3b to be used is small, the reaction time is shortened. As a result, this is a merit of the trace chemical reaction. This leads to faster reaction.
  • an operation of replacing the magnetic carrier in the step after the first gene amplification reaction and before the mixing with the second nucleic acid amplification reaction solution I do.
  • the magnetic field means 5 is moved in the horizontal direction at 200 mm / sec, and the first magnetic carrier 4a is moved in the horizontal direction (upward in FIG. 16) using the magnetic field.
  • the first magnetic carrier 4 a is pulled out from the first mixed droplet 12.
  • the first magnetic carrier 4a is discarded.
  • a second magnetic carrier (new magnetic carrier) 4b is prepared. Thereafter, as shown in FIG. 19, the magnetic field means 5 is moved in the horizontal direction (downward in FIG. 19) at a speed of 1 mm / sec, thereby using the second magnetic carrier (new magnetic carrier) 4b as a magnetic field. It moves horizontally and is inserted into the first mixed droplet 12.
  • the multistage gene amplification method according to the second embodiment of the present invention includes the first magnetic carrier 4a in addition to the processing procedure of the multistage gene amplification method according to the first embodiment. It further includes a step of replacing the second magnetic carrier (new magnetic carrier) 4b.
  • This makes it possible to perform gene amplification with high amplification efficiency even when blood or liquid tissue containing a large amount of an inhibitor of gene amplification reaction such as protein or lipid is used as a sample.
  • the gene amplification reaction is performed in two stages with the replacement of the nucleic acid amplification reaction solution in between, but the present invention is not limited to this.
  • the present invention is not limited to this.
  • the present invention includes genetic diagnosis in the medical field, testing of brands, varieties, genetically modified foods in the food field, detection of pathogenic bacteria and viruses in the health field, genetic testing of genetically modified organisms related to bioremediation in the environmental field, or It has applicability in various fields that require highly sensitive gene detection, such as genetic testing in archeology and biological basic research.

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Abstract

　生体由来試料２、第１の核酸増幅反応液３a及び第２の核酸増幅反応液３bをそれぞれ固定するステップと、磁性キャリア４を生体由来試料２中に挿入し、生体由来試料２を磁性キャリア４に吸着させるステップと、磁性キャリアを生体由来試料２中から引き抜き、生体由来試料２の一部を採取するステップと、第１の核酸増幅反応液３aの内部に磁性キャリア４を挿入し、磁性キャリア４に吸着した生体由来試料２と第１の核酸増幅反応液３aとを混合して第１の混合液滴１２を形成するステップと、第１の混合液滴１２に対して第１の遺伝子増幅反応を行うステップと、第１の混合液滴１２から磁性キャリア４を引き抜くステップと、磁性キャリア４を第２の核酸増幅反応液３bの内部に挿入し、磁性キャリア４に吸着した第１の混合液滴１２と第２の核酸増幅反応液３bとを混合して第２の混合液滴１５を形成するステップと、第２の混合液滴１５に対して第２の遺伝子増幅反応を行うステップとを含む。

Description

多段型遺伝子増幅方法
　本発明は、液滴操作装置を用いた多段型遺伝子増幅方法に関する。
　近年、マイクロ総合分析システム（μ－TAS)と呼ばれるマイクロチップが、遺伝子検査分野、臨床遺伝子診断分野などにおいて注目されている。μ－TASのようなマイクロチップは、微量の核酸量で検査等を行うことができるため、被験者への負担を軽減することができる。
　微量な試料からデオキシリボ核酸（DNA）を増幅する有効な方法のひとつが、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法である。PCR法は、増幅の目的とするDNAを、プライマー、耐熱性DNAポリメラーゼ、基質、塩類、緩衝剤の存在下で、９５℃前後の温度で保持してDNAを変性させる工程、５０℃から６０℃の温度で保持して鋳型DNAにプライマーをアニーリングさせる工程、および７２℃前後の温度で保持して鋳型DNAの相補鎖の伸張反応を行う工程からなる。PCR法は、これらの工程からなる温度サイクルを２０～４０回繰り返すことにより、DNAを増幅することができる。
　基板に微細加工を施すことによって、基板上に試料ウェルを複数配置したマイクロチップに関する発明が報告されている（特許文献１参照）。特許文献１に記載の発明によれば、試料からのDNAの抽出、精製および増幅までの操作を、基板上の試料ウェル内において行うことができる。また、このとき、DNAの抽出、生成及び増幅には、親水性表面を持つ磁性粒子が用いられる。特許文献１に記載の発明において、表面にDNAを付着させた磁性粒子は、磁場の変動に伴って基板上を移動することで、DNAの精製および増幅に関わる。
　また、近年では、液体の送液、分取、混合、希釈、攪拌、温度制御等の操作を、反応基板上において行うことができる化学反応装置に関する発明が報告されている（特許文献２参照）。特許文献２に記載の発明も、親水性表面を持つ磁性体粒子を含んでいる液滴を、磁場の変動によって制御している。そして、化学反応に必要な操作を、反応基板内にポンプ、バルブ、ミキサー等の流体制御素子を設置あるいは施工せずに行うことができる。また、上記の化学反応装置を用いて、磁性体粒子の表面に吸着させた核酸の精製および増幅も行うことができる。核酸の精製では液滴を疎水性表面に固定する必要があるが、その手段として静電場を用いた手段が報告されている（非特許文献１参照）。
　PCRを代表とする遺伝子増幅反応を行う際に、核酸以外の試料由来目的外成分は、増幅反応に阻害的に働く場合が多い。特に、血液等の臨床生体試料には、遺伝子増幅反応に用いるDNAポリメラーゼの働きを阻害する物質を含むことが知られている。そこで、通常は、使い捨てカラムを用いた核酸の精製を、遺伝子増幅反応前に行う。また、PCR法で高感度な検出を行うためには、温度コントロールプログラムのサイクル数を増やすか、あるいは、ネスティッドPCRと呼ばれる、異なるプライマーセットを用いて２回のPCR反応を行う方法がある。
特開２００６－６１０３１号公報 特開２００８－１２４９０号公報
Tetsuo Ohashi, Hiroki Kuyama, Koichi Suzuki, Shin Nakamura.　"Control of aqueous droplets using magnetic and electrostatic forces."　Anal. Chim. Acta, 2008, 612, 218-225.
　しかしながら、阻害物質除去のためのカラムによる核酸精製は、処理を行うために手間と時間が必要になる。更に、カラムをはじめとする使用器材は、使い捨てのため、費用もかかる。また、遺伝子増幅反応を阻害する夾雑物が多い試料から高感度で核酸を検出する必要がある場合などにおいて、PCRの高感度化を図るために、温度コントロールプログラムのサイクル数を増やしても、遺伝子増幅率はすぐに頭打ちになってしまう。一方、ネスティッド（Nested）PCR法は、１回目の反応で阻害物質への耐性を十分に得ることができずに、２回目の反応に失敗することが多い。更に、ネスティッドPCR法は、１回目の反応産物を手作業で回収するため、手間や時間がかかるだけでなく、反応容器外での追加操作によるクロスコンタミネーションの危険性も増大するという問題がある。
　本発明は、上述した従来技術の欠点を除くためになされたものであって、PCR阻害成分に影響されにくく、クロスコンタミネーションの危険性が少なく、迅速且つ簡便で安価な多段型遺伝子増幅方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するために、本発明の態様は、（イ）異なる位置に、液滴状の生体由来試料、液滴状の第１の核酸増幅反応液および液滴状の第２の核酸増幅反応液をそれぞれ固定するステップと、（ロ）磁性キャリアを生体由来試料中に磁界を用いて挿入し、生体由来試料を磁性キャリアに吸着させるステップと、（ハ）生体由来試料が吸着した磁性キャリアを、生体由来試料中から磁界を用いて引き抜き、生体由来試料の一部を採取するステップと、（ニ）第１の核酸増幅反応液の内部に生体由来試料が吸着した磁性キャリアを磁界を用いて挿入し、磁性キャリアに吸着した生体由来試料と第１の核酸増幅反応液とを混合して第１の混合液滴を形成し、第１の混合液滴に対して第１の遺伝子増幅反応を行うステップと、（ホ）第１の混合液滴から磁性キャリアを磁界を用いて引き抜くステップと、（ヘ）磁性キャリアを第２の核酸増幅反応液の内部に磁界を用いて挿入し、磁性キャリアに吸着した第１の混合液滴と第２の核酸増幅反応液とを混合して第２の混合液滴を形成し、第２の混合液滴に対して第２の遺伝子増幅反応を行うステップとを含む多段型遺伝子増幅方法であることを要旨とする。
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法に用いる液滴操作装置の一例を示す斜視図である。 図２は、図１のI－I方向からみた断面図である。 図３は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、生体由来試料と第１及び第２の核酸増幅反応液とを固定するステップを示す模式図である。 図４は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、磁性キャリアを生体由来試料に挿入するステップを示す模式図である。 図５は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、磁性キャリアを生体由来試料から引き抜いた後、第２の固定手段に移動するステップを示す模式図である。 図６は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第１の混合液滴を第２の固定手段から移動するステップを示す模式図である。 図７は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第１の混合液滴を第１のサーマルサイクリング反応を行う位置まで移動するステップを示す模式図である。 図８は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第１のサーマルサイクリング反応を行うステップを示す模式図である。 図９は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第１の混合液滴を第２の固定手段に移動するステップを示す模式図である。 図１０は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第１の混合液滴から磁性キャリアを引き抜くステップを示す模式図である。 図１１は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、磁性キャリアを第３の固定手段に移動するステップを示す模式図である。 図１２は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第２の混合液滴を第３の固定手段から移動するステップを示す模式図である。 図１３は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第２の混合液滴を第２のサーマルサイクリング反応を行う位置まで移動するステップを示す模式図である。 図１４は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第２のサーマルサイクリング反応を行うステップを示す模式図である。 図１５は、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法を用いて得られる増幅産物についてのアガロースゲル電気泳動像である。 図１６は、本発明の第２の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第１の混合液滴から磁性キャリアを引き抜くステップを示す模式図である。 図１７は、本発明の第２の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、磁性キャリアを廃棄するステップを示す模式図である。 図１８は、本発明の第２の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、新たな磁性キャリアを用意するステップを示す模式図である。 図１９は、本発明の第２の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、新たな磁性キャリアを第１の混合液滴の内部に挿入するステップを示す模式図である。
　次に、図面を参照して、本発明の第１及び第２の実施の形態について説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号が付してある。但し、図面は模式的なものであり、装置やシステムの構成等は現実のものとは異なることに留意すべきである。また、図面相互間においても互いの構成等が異なる部分が含まれていることは勿論である。
　また、以下に示す第１及び第２の実施の形態は、本発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、本発明の技術的思想は、構成物品の材質、形状、構造、配置等を下記のものに特定するものでない。本発明の技術的思想は、特許請求の範囲に記載された技術的範囲内において、種々の変更を加えることができる。
（第１の実施の形態）
－液滴操作装置－
　本発明の多段型遺伝子増幅方法に用いる液滴操作装置について説明を行う。本発明の多段型遺伝子増幅方法に用いる液滴操作装置は、磁気粒子等を用いた液滴ベースでのマイクロフルイディスク技術を用いた装置である。図１及び図２に示すように、本発明の多段型遺伝子増幅方法に用いる液滴操作装置２０は、反応物の検出、分析等における外部からのコンタミネーションを防ぐために、厚さ０．３mm、縦幅３０mm、横幅９０mmのポリプロピレン製の平板２６と、平板２６の周辺部に設けられた高さ１０mmの側壁２７a、２７b、２８a及び２８bと、平板２６と側壁２７a、２７b、２８a及び２８bで囲まれた領域を密閉する５mm厚のガラス製の蓋２９とで直方体の形状をなし、完全閉鎖系の反応場を形成している。（図２は図１のI－I方向からみた断面図である。）。液滴操作装置２０は、磁気粒子４１a、４１b、４１c、・・・からなる磁性キャリア４を搬送するための搬送面２０aとなる表面を有する撥水シート２１を平板２６上に更に有する。撥水シート２１としては、例えばポリテトラフルオロエチレン等のフッ素樹脂のシート又はポリプロピレンシートを用いることができる。また、撥水シート２１の厚みとしては、０．５から０．０１５mmである。
　搬送面２０aは、表面が平滑であることが好ましく、特に表面粗さRa＝０．１μm（JIS B 0601-1994）以下であることが好ましい。搬送面２０aを表面粗さRa＝０．１μm以下とすることにより、磁場手段５を搬送面２０aの下方に近づけて、磁場手段５の移動により磁性キャリア４を移動させる際に、磁場手段５の移動に伴う磁性キャリア４の移動の追従性が向上することが期待できる。
　液滴操作装置２０の平板２６及び側壁２７a等に用いられる材質としては、使い捨てができて且つ量産できるように、安価に入手可能な材質であることが好ましい。また、磁性キャリア４を含む液滴等を移動する際に移動抵抗を下げるために、液滴操作装置２０の平板２６及び側壁２７a等は、撥水性の材質を用いることが好ましい。そのような材料としては、例えば、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリカーボネート等の樹脂素材を好適に用いることができる。また、吸光度、蛍光、化学発光、生物発光、屈折率の変化などの測定において光学的な検出を行うために、液滴操作装置２０の平板２６及び側壁２７a等は、光透過性を有する材質で形成されていることが好ましい。液滴操作装置２０の平板２６及び側壁２７a等は、製造にかかるコストを抑え、且つデッドボリューム等の問題をなくすために、従来型流路式デバイスのような特殊な成型、加工を必要としない簡単な構造であることが好ましい。
　図１に示すように液滴操作装置２０の下には、第１の固定手段６、第２の固定手段７、第３の固定手段８が設けられている。第１の固定手段６は、平板２６の底面に接して配置された円盤（平板）形状を有する第１の陰極６a（図２参照）と、第１の陰極６aの下に配置され、リング（枠）形状を有する第１の陽極６bと、第１の陽極６bの下に設けられ、第１の陰極６aおよび第１の陽極６bと絶縁された円盤（平板）状の第１の導電性薄板６cを備える。第２の固定手段７は、平板２６の底面に接し、第１の陰極６aから水平方向に一定距離をおいて配置された、円盤（平板）形状を有する第２の陰極７aと、第２の陰極７aの下に配置され、リング（枠）形状を有する第２の陽極７bと、第２の陽極７bの下に設けられ、第２の陰極７aおよび第２の陽極７bと絶縁された円盤（平板）状の第２の導電性薄板７cを備える。第３の固定手段８は、平板２６の底面に接し、第１の陰極６aおよび第２の陰極７aから水平方向に一定距離をおいて配置された、円盤（平板）形状を有する第３の陰極８aと、第３の陰極８aの下に配置され、リング（枠）形状を有する第３の陽極８bと、第３の陽極８bの下に設けられ第３の陰極８aおよび第３の陽極８bと絶縁された（平板）状の第３の導電性薄板８cを備える。ここで、第１の陰極６a、第２の陰極７a、第３の陰極８a、第１の陽極６b、第２の陽極７b、第３の陽極８bおよび第１の導電性薄板６c、第２の導電性薄板７c、第３の導電性薄板８cのそれぞれの形状は、円盤状およびリング状に限定されない。第１の陰極６a、第２の陰極７a、第３の陰極８aの電極は、電源２２の負極（グランド）側に接続され、第１の陽極６b、第２の陽極７b、第３の陽極８bは、電源２２の正極側に接続されている。電源２２から第１の陰極６aと第１の陽極６b間に生じる電場（電界）を印加することにより、第１の固定手段６の上方の搬送面２０a上に液滴（図２及び図３参照）を固定させる。同様に、電源２２から第２の陰極７aと第２の陽極７b間に生じる電場（電界）を印加することにより、第２の固定手段７の上方の搬送面２０a上に液滴（図２及び図３参照）を固定させる。同様に、電源２２から第３の陰極８aと第３の陽極８b間に生じる電場（電界）を印加することにより、第３の固定手段８の上方の搬送面２０a上に液滴（図２及び図３参照）を固定させる。電界の強度は、第１の固定手段６、第２の固定手段７、第３の固定手段８上に液滴を固定することができる程度に十分に高いことが好ましい。ここで、第１の固定手段６の第１の陰極６aと第１の陽極６b間、第２の固定手段７の第２の陰極７aと第２の陽極７b間、第３の固定手段８の第３の陰極８aと第３の陽極８b間にそれぞれ印加する電圧の大きさとしては、０．５～８kVの範囲が好ましい。また、第１の固定手段６、第２の固定手段７及び第３の固定手段８における電圧は、それぞれ個々に変動させることができ、且つ自動制御することが可能である。磁気粒子４１a、４１b、４１c・・・からなる磁性キャリア４の移動制御は、液滴操作装置２０の下方において、搬送面２０aに平行な２次元座標上を稼動可能な磁石等の磁場手段５を移動させることによって行う（図３～図１４参照）。使用する磁石等の大きさとしては、磁気粒子４１a、４１b、４１c・・・が凝集できる程度であることが好ましく、例えば、半径４～６mm、高さ１０mmの円筒形ネオジム磁石である。ただし、磁石等の形状は円筒形に限定されない。ネオジム磁石以外の磁石、例えばフェライト、サマコバ、アルニコ、さらには電磁石も利用できる。磁場手段５の移動は、図示しない制御装置によって自動制御することができる。また、図１の左下に示したように平板２６の下の端部には、フィルムヒーター１３が配置されている。フィルムヒーター１３は図示しない制御装置によって一定の温度に設定されている。搬送面２０a上の温度は、フィルムヒーター１３が配置されている直上の地点が最も高温であり、フィルムヒーター１３から距離が離れるに従って連続的に温度が低下するため、搬送面２０a上には温度変化領域が存在している。
　磁性キャリア４を構成する磁気粒子４１a、４１b、４１c、・・・は、それぞれマグネタイト、γ－酸化鉄、マンガン亜鉛フェライト等の磁性体から形成されており、それぞれ磁気に応答する。また、磁気粒子４１a、４１b、４１c、・・・は、表面に生体由来高分子と特異的に結合する化学構造（例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、アビジン、ビオチン、ジゴキシゲニン、プロテインA、プロテインG、錯体化した金属イオン、あるいは抗体）を有するか、もしくは、静電気力やファンデルワールス力により高分子と特異的に結合する様態を有する。ここで、磁気粒子４１a、４１b、４１c、・・・は、１μm～１５０μm程度の平均粒径であることが好ましい。
　図２に示すように液滴操作装置２０内には、液滴１と混じり合わない液滴封入媒体２４が封入されている。液滴封入媒体２４は、化学的に不活性な液体であり、液体の分取、混合、希釈、攪拌、加熱、冷却などの種々の化学反応を阻害しない物質（例えば、アルカン等の炭化水素類、パーフルオロアルカン類、アルカンの水素原子の一部がフッ素である化学物質、ミネラルオイル、シリコーンオイル、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸アミド、脂肪酸ケトン、脂肪酸アミン類などの疎水性の液体物質）を指す。また、液滴封入媒体２４は、比重が１より小さい物質であることが好ましい。比重が１より小さい物質を用いることにより、液滴１が液滴封入媒体２４中に沈むため、磁場手段５による液滴１の操作性が向上する（図３～図１４参照）。また、本発明の多段型遺伝子増幅方法に用いる液滴操作装置２０のように、比較的高温条件下で行われる耐熱性酵素を用いた生化学反応に関しては、揮発性の低い物質、具体的には沸点が２００℃以下のミネラルオイル、シリコーンオイル、脂肪酸エステル、油脂等を用いることにより、液滴封入媒体２４および液滴１の揮発を防ぐことができる。
　図２に示すように、平板２６の下には塩化ビニルシート等の絶縁体２３が設けられ、平板２６の底面に接して設けられた第１の陰極６aおよび、第１の陰極６aの下に設けられた第１の陽極６bの周囲は、絶縁体２３で覆われている。また、絶縁体２３の下面には第１の導電性薄板６cが設けられている。図示を省略しているが、第２の陰極７a、第２の陽極７b、第２の導電性薄板７c、第３の陰極８a、第３の陽極８b、第３の導電性薄板８cについても同様である。第１の導電性薄板６c、第２の導電性薄板７c、第３の導電性薄板８cは、厚さ４５μmの１枚のアルミニウム箔等で形成されている。また、本発明の多段型遺伝子増幅方法に用いる液滴操作装置２０においては、第１の導電性薄板６c、第２の導電性薄板７c及び第３の導電性薄板８cの直径d４は、９．５mm、第１の陽極６b、第２の陽極７b及び第３の陽極８bの外径d２は９．０mm、第１の陽極６b、第２の陽極７b及び第３の陽極８bのリング幅d３は１．２mm、第１の陰極６a、第２の陰極７a及び第３の陰極８aの直径d１は５．５mmである。また、撥水シート２１の厚さt１は０．０５mm、液滴操作装置２０の底面の平板２６の厚さt２は０．３mmである。第１の固定手段６の平板２６の厚さ方向における第１の陰極６aと第１の陽極６b間の距離t３は０．３６mm、平板２６の厚さ方向における第１の陽極６bと第１の導電性薄板６c間の距離t４は０．１８mmである。同様に、第２の固定手段７の平板２６の厚さ方向における第２の陰極７aと第２の陽極７b間の距離t３は０．３６mm、平板２６の厚さ方向における第２の陽極７bと第２の導電性薄板７c間の距離t４は０．１８mmである。同様に、第３の固定手段８の平板２６の厚さ方向における第３の陰極８aと第３の陽極８b間の距離t３は０．３６mm、平板２６の厚さ方向における第３の陽極８bと第３の導電性薄板８c間の距離t４は０．１８mmである。
　ここで、本発明の多段型遺伝子増幅方法に用いる液滴操作装置２０における「液滴」とは、液体の分子間力によって発生する表面張力により、球形あるいはそれに近い形状を持った溶液の塊を意味する。
　液滴１を構成する水溶液には、界面活性剤が含有されていてもよい。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤が挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ツイン（Tween）２０（登録商標））、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）n（トリトン（Triton）X-100（登録商標））が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、液滴１内で生化学反応を行う際に、反応を阻害しない点で好ましい。イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム、N－ラウリルサルコシンが挙げられる。界面活性剤を含有することによって、液滴操作装置２０の搬送面２０a上への液滴１の吸着が強くなる現象が観察される。その結果、搬送面２０a上の一定の位置への液滴１の固定が容易に実現できるため、界面活性剤は、液滴１の操作精度を向上させることができる。また、界面活性剤は、磁性キャリア４を含有する液滴１から磁性キャリア４を分離する際の、液滴１の固定安定性にも影響を与える。なお、界面活性剤は、０．００１（v/v）～１（v/v）％程度の割合で、液滴１中に含まれるように調整することが好ましい。
－多段型遺伝子増幅方法－
　図３～図１５に示す実施例に基づいて、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法を説明する。図３～図１４には、図１及び図２で示した液滴操作装置２０の底面を形成する平板２６と平板２６上の搬送面２０aを模式的に図示している。液滴操作装置２０は、図２の液滴封入媒体２４としてシリコーンオイル（信越シリコーン　KF96-20CS）を満たした状態である。図１５には、本実施例及び比較例の遺伝子増幅反応で得られた増幅産物のアガロースゲル電気泳動による検出結果を示す（詳細は後述する）。
　ここで、本発明において、用意する生体由来試料としては、動植物組織、体液、***物等が挙げられ、液状試料に限らず生体由来試料を適当な溶媒に懸濁した懸濁液でもよい。体液としては、血液、唾液、尿等が挙げられる。血液としては、各種抗凝固剤処理血、新鮮血、長期冷凍冷蔵血等のヒト血液やげっ歯類血液などが挙げられる。
（a）図３に示すように、第２の固定手段７及び第３の固定手段８の直上に、それぞれ第１の核酸増幅反応液３a及び第２の核酸増幅反応液３bを２．５μLずつ滴下し、第２の固定手段７の第２の陰極７aと第２の陽極７b間に３kVの電圧を（第３の固定手段８の第３の陰極８aと第３の陽極８b間に３kVの電圧を）印加して、搬送面２０aの水平面上に、液滴状の第１の核酸増幅反応液３a及び液滴状の第２の核酸増幅反応液３bを固定させた。第１の核酸増幅反応液３a及び第２の核酸増幅反応液３bとしては、２０mM Tris-HCl（pH９．５）,８mM MgCl2, 各２００μMのdATP, dCTP, dGTPおよびdTTP, ０．２（wt/v）％BSA, 各０．４μMのプライマー, ２．５units/５０μlのTaq DNAポリメラーゼ（宝酒造　TaKaRa Taq）を用いた。また、鋳型遺伝子としてはβアクチン遺伝子を用いた。プライマーとしては、配列番号１の塩基配列からなるβアクチン検出用フォワードプライマーおよび配列番号２の塩基配列からなるβアクチン検出用リバースプライマーを用いた。次に、第１の核酸増幅反応液３a及び第２の核酸増幅反応液３bと同様に、第１の固定手段６の直上に、生体由来試料２として健常人全血を１０μL滴下し、第１の固定手段６の第１の陰極６aと第１の陽極６b間に３kVの電圧を印加して、水平面上に液滴状の生体由来試料２を固定させた。また、ここで使用する生体由来試料２は、細胞溶解液等に溶解させずに、被験者から採取したものをそのまま用いた。更に、平板２６の下に配置された磁場手段５の直上に磁気粒子からなる磁性キャリア４を５００μg置き、磁場手段５を水平方向に移動させることにより、磁場手段５と同方向（水平方向）に磁界により磁性キャリア４を移動させた。次に、図４に示すように、磁場手段５を、直上に生体由来試料２を電界で固定した第１の固定手段６の真下に向かって、１mm/秒の速度で水平方向に移動させることで、磁性キャリア４を水平方向に移動し、生体由来試料２の内部に挿入して、生体由来試料２の一部を磁性キャリア４に吸着させた。このときの磁場手段５の移動速度としては、１～１５mm/秒であればよく、１mm/秒に限定されない。
（b）次に、図５に示すように、磁場手段５を図５の左方向に２００mm/秒で動かすことで、磁性キャリア４を水平方向に移動し、生体由来試料２から磁界を用いて磁性キャリア４を引き抜いた。この際、磁性キャリア４に吸着している図示しない生体由来試料２の一部（約０．５μL）が採取された。ここで、生体由来試料２から磁性キャリア４を引き抜くときの磁場手段５の速度は、磁性キャリア４によって採取される試料の量が微量になる程度の速度であればよく、２００mm/秒に限定されない。このように、磁場手段５を水平方向に一定の速度で移動して、生体由来試料２から引き抜くことにより、磁性キャリア４は、生体由来試料２から試料の一部を定量的に採取することができる。更に、磁性キャリア４を構成する磁気粒子の量によって、採取できる試料の量は再現性良く制御することができる。このような磁気粒子による採取によって、生体由来試料２を第１の核酸増幅反応液３aへ過剰に持ち込むことを防止することができる。次に、図５に示すように、磁場手段５を１mm/秒で図５の上方向に移動させることによって、磁性キャリア４を磁界を用いて水平方向に移動し、第２の固定手段７の直上に電界で固定されている第１の核酸増幅反応液３aの内部に挿入し、図６に示すように、生体由来試料２の一部が吸着している（図示省略）磁性キャリア４と第１の核酸増幅反応液３aとを混合した第１の混合液滴１２を形成させた。
（c）次に、磁場手段５を図６の手前方向に１mm/秒で移動し、磁性キャリア４を磁界を用いて水平方向に移動させることで、第１の混合液滴１２を移動させた。このとき、第１の混合液滴１２の移動を速やかに行うために、第２の固定手段７の第２の陰極７aと第２の陽極７b間の電圧は下げるか、あるいは切ってもよい。更に、図７に示すように、磁場手段５を図７の左方向に移動させ、第１の混合液滴１２をフィルムヒーター１３が配置されている平板２６の端部に向かって、水平方向（図７の左方向）に移動させた。次に、図８に示すように、磁場手段５の移動によって、磁性キャリア４を磁界を用いて１５mm/秒の速度で水平方向に往復させ、第１の混合液滴１２を温度勾配のかかった水平面上で２０サイクルのサーマルサイクリング反応（第１の遺伝子増幅反応）を行った。このときの磁場手段５の移動速度は、第１の混合液滴１２を全量移動できる速度であればよく、上記の速度に限定されない。水平面上の温度勾配は、フィルムヒーター１３の直上の位置が最も高く、フィルムヒーター１３から離れるほど略線形に低下していく。DNAの変性工程の温度を９５℃、プライマーのアニーリング工程の温度を５７℃、伸張反応工程の温度を７２℃に規定し、各工程毎に、磁性キャリア４を磁界を用いて水平方向に移動することにより、第１の混合液滴１２を水平面上の規定温度の位置に水平方向に移動させた。反応サイクルは、９５℃で５秒、５７℃で１５秒、７２℃で５秒を１サイクルとした。
（d）第１の遺伝子増幅反応の終了後、図９に示すように、磁性キャリア４を磁界を用いて水平方向（図９において上方向）に移動することにより、第１の混合液滴１２を、第２の固定手段７の直上に戻して電界で固定した。次に、図１０に示すように、磁場手段５を図１０の手前方向（下方向）に２００mm/秒で水平方向に移動することによって、磁性キャリア４を磁界を用いて水平方向に移動し、第１の混合液滴１２から磁性キャリア４を引き抜いた。このとき、磁性キャリア４の周りおよび内部（磁気粒子間）には、図示しない増幅されたDNA断片が留まっている。ここで、本発明において「吸着」とは、増幅の目的とするDNA自体もしくは用意した生体由来の試料が、磁気粒子表面に各種相互作用により吸着した状態のみを指すのではなく、上述のように磁気粒子の間隙に物理的に滞留する状態も指す。次に、図１１に示すように、磁性キャリア４を図１１の左方向に移動した後、磁場手段５を、第３の固定手段８の直上に電界で固定されている第２の核酸増幅反応液３bの真下に１mm/秒で水平方向に移動させることによって、磁性キャリア４を磁界を用いて図１１の上方向に移動し、第２の核酸増幅反応液３bの内部に挿入し、図１２に示すように、増幅されたDNA断片が吸着している（図示省略）磁性キャリア４と第２の核酸増幅反応液３bとを混合した第２の混合液滴１５を形成させた。
（e）その後、磁場手段５を図１２の手前方向（下方向）に１mm/秒で移動し、磁性キャリア４を磁界を用いて水平方向に移動させることによって、第２の混合液滴１５を移動させた。このとき、第２の混合液滴１５の移動を速やかに行うために、第３の固定手段８の第３の陰極８aと第３の陽極８b間に印加する電圧は下げるか、あるいは切ってもよい。更に、図１３に示すように、磁場手段５を図１３の左方向に移動させることにより、磁性キャリア４を磁界を用いて水平方向に移動し、第２の混合液滴１５をフィルムヒーター１３が配置されている平板２６の端部に向かって水平面上を移動させた。次に、図１４に示すように、磁場手段５の移動によって、磁性キャリア４を磁界を用いて１５mm/秒の速度で水平方向に往復させ、第２の混合液滴１５を温度勾配のかかった水平面上で２０サイクルのサーマルサイクリング反応（第２の遺伝子増幅反応）を行った。なお、１サイクル当たりの条件は、第１の遺伝子増幅反応と同様とした。
（f）次に、遺伝子増幅反応産物の検出を行った。第２の遺伝子増幅反応終了後、第２の混合液滴１５をマイクロピペット等によって回収し、磁性キャリアを除いた後、３．５％アガロースゲル電気泳動を行うことで、第２の混合液滴１５中の増幅産物を検出した。検出結果を図１５（b）に示す。なお、図１５（a）は本発明の比較例として、上述の（a）から（c）までの工程のみを行ったものであって、（c）の工程における第１の遺伝子増幅反応のサイクル数を４０サイクルとしたときの第１の混合液滴１２の上清についての検出結果を示している。
　図１５（a）に示すように、第１の核酸増幅反応液３aのみを使用して、反応液の置換を行わなかった場合は、βアクチン遺伝子の増幅産物のバンドはほとんど確認することができなかった。そのため、直接血液が混入する、図８で示した第１の遺伝子増幅反応だけでは、十分な増幅効率が得られないことが示唆された。それに対して、図１５（b）に示す第１及び第２の遺伝子増幅反応を実施した結果からは、図１５（a）に示す結果と比べて、はっきりとしたβアクチン遺伝子の増幅産物（３７３bp）のバンドが検出された。
　図１５からわかるように、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、第１の遺伝子増幅反応と第２の遺伝子増幅反応とを実施すれば、クロスコンタミネーションの危険性がより少なく、より迅速、簡便、安価で且つより高感度な遺伝子検査が可能となる。
　本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、PCR法を用いた場合の遺伝子増幅反応の繰り返し回数の総数としては、２０～４０回程度となることが好ましい。また、第１の遺伝子増幅反応の好ましい繰り返し回数としては、繰り返し回数の総数の２０～８０％であり、更に好ましくは繰り返し回数の総数の４０～６０％である。
　また、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法において、遺伝子増幅反応としてはPCR法に限定されず、Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法、Ligase Chain Reaction(LCR)法、Standard Displacement Amplification(SDA)法、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids(ICAN) 法等も適用可能である。上述の遺伝子増幅反応を用いる場合は、選択した遺伝子増幅反応に応じた組成の反応液を核酸増幅反応液３a、３bとして用意する。
　ここで、LCR法は、９４℃～９９℃における２本鎖DNAの変性工程、並びに、５０～７０℃における相補的な遺伝子断片を連結させるライゲーション工程の２つの温度条件からなる温度サイクル工程を繰り返す反応である。LCR法における繰り返し回数の総数は、５０～７０回程度が好ましい。遺伝子増幅反応としてLCR法を選択した場合は、液滴操作装置２０の搬送面２０a上において、変性工程及びライゲーション工程各々に必要な２つの温度域に、混合液滴１２、１５が配置されるように移送すればよい。
　また、LAMP法、SDA法及びICAN法は、等温にて遺伝子増幅反応を行う。従って、これらの遺伝子増幅反応を選択した場合、増幅反応の間、混合液滴１２、１５の移動は不要であり、混合液滴１２、１５を液滴操作装置２０の搬送面２０a上の遺伝子増幅反応に必要な温度域に固定することで遺伝子増幅反応が達成される。等温遺伝子増幅反応の場合、第１の遺伝子増幅反応の反応時間が、遺伝子増幅反応の全反応時間に対して２０～８０％、より好ましくは４０～６０％を経た段階で反応液の置換を行い、第２の遺伝子増幅反応に移行すればよい。
　上記のように、本発明の第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法では、第１の核酸増幅反応液３aを第２の核酸増幅反応液３bへと置換することによって、試料由来の反応阻害成分の影響を軽減できるため、核酸の抽出さらには精製といった前処理を行わなくても、生体由来試料２から効率良く増幅産物を得ることができる。また、反応液の置換や遺伝子増幅反応などを、磁場手段５によって液滴操作装置２０の外部から操作することができる。また、液滴操作装置２０の材質は、安価に入手可能な樹脂を用いることができる。また、液滴操作装置２０は、従来型流路式デバイスのような微細加工を必要としないため、デッドボリュームの問題を考慮する必要がなくなる。また、液滴操作装置２０は、完全閉鎖系の反応場を提供することができる。更に、使用する生体由来試料２や第１の核酸増幅反応液３a及び第２の核酸増幅反応液３bの量が微量で済むため、反応時間が短縮され、その結果、微量化学反応のメリットである反応の高速化につながる。
（第２の実施の形態）
　第２の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法の一例について説明する。血液や液状の組織を直接試料として用いる場合、磁性キャリアが細胞の残骸等で覆われることにより、遺伝子増幅反応の阻害成分が磁性キャリア表面に留まり、結果として、第２の遺伝子増幅反応における増幅効率の低下を引き起こす。
　上記の問題を解決するため、第２の実施の形態においては、第１の遺伝子増幅反応の実施の後、第２の核酸増幅反応液との混合の前の工程において、磁性キャリアを置換する操作を行う。
（a）まず、第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法と同様に、図３～図５に示すステップを行う。磁場手段５を１mm/秒で水平方向に移動させることによって、第１の磁性キャリア４aを磁界を用いて水平方向に移動し、第２の固定手段７の直上に電界により固定した第１の核酸増幅反応液３aの内部に挿入し、生体由来試料２の一部が吸着している（図示省略）第１の磁性キャリア４aと第１の核酸増幅反応液３aとを混合させ、図６に示すように、第１の混合液滴１２を形成させる。
（b）その後、図１６に示すように、磁場手段５を２００mm/秒で水平方向に移動し、第１の磁性キャリア４aを磁界を用いて水平方向（図１６の上方向）に移動することによって、第１の混合液滴１２から第１の磁性キャリア４aを引き抜く。その後、図１７に示すように、第１の磁性キャリア４aを廃棄する。
（c）次に、図１８に示すように、第２の磁性キャリア（新たな磁性キャリア）４bを用意する。その後、図１９に示すように、磁場手段５を１mm/秒の速度で水平方向（図１９の下方向）に移動することによって、第２の磁性キャリア（新たな磁性キャリア）４bを磁界を用いて水平方向に移動し、第１の混合液滴１２の内部に挿入する。
（d）その後は、図６のステップに戻る。以降のステップは、第２の磁性キャリア（新たな磁性キャリア）４bを用いることの他は、第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法と実質的に同様のため、重複した記載を省略する。
　以上のように、本発明の第２の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法は、第１の実施の形態に係る多段型遺伝子増幅方法の処理手順に加えて、第１の磁性キャリア４aを第２の磁性キャリア（新たな磁性キャリア）４bに置換するステップを更に含む。これによって、タンパクや脂質など遺伝子増幅反応の阻害物質を多く含む血液や液状の組織を試料として用いる場合であっても、遺伝子の増幅を高い増幅効率で行うことが可能となる。
（その他の実施の形態）
　上記のように、本発明は第１及び第２の実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述及び図面は本発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
　更に、第１及び第２の実施の形態において、遺伝子増幅反応は、核酸増幅反応液の置換を挟んで２段階で行っているが、これに限定されるものではない。増幅する遺伝子の種類や測定試料の条件によって、核酸増幅反応液の置換の回数を増やして、３段階、４段階・・・で遺伝子増幅反応を行うことも可能である。
　このように、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を含むことは勿論である。したがって、本発明の技術的範囲は上記の説明から妥当な請求の範囲に係る発明特定事項によってのみ定められるものである。
（配列表の説明）
　本明細書の配列表に記載された配列番号１及び２は以下の配列を示す。
［配列番号：１］βアクチン検出用フォワードプライマーの塩基配列。
［配列番号：２］βアクチン検出用リバースプライマーの塩基配列。
　本発明は、医療分野における遺伝子診断、食品分野における銘柄・品種・遺伝子組み換え食物等の検査、保健分野における病原菌・ウイルス等の検出、環境分野におけるバイオレメディエーション等に関わる遺伝子組み換え生物の遺伝子検査、あるいは考古学や生物学的基礎研究における遺伝子鑑定などの、高感度な遺伝子検出を必要とする様々な分野で利用可能性を有する。

Claims (9)

  1. 　異なる位置に、液滴状の生体由来試料、液滴状の第１の核酸増幅反応液および液滴状の第２の核酸増幅反応液をそれぞれ固定するステップと、
    　磁性キャリアを前記生体由来試料中に磁界を用いて挿入し、前記生体由来試料を前記磁性キャリアに吸着させるステップと、
    　前記生体由来試料が吸着した磁性キャリアを、前記生体由来試料中から磁界を用いて引き抜き、前記生体由来試料の一部を採取するステップと、
    　前記第１の核酸増幅反応液の内部に前記生体由来試料が吸着した磁性キャリアを磁界を用いて挿入し、前記磁性キャリアに吸着した前記生体由来試料と前記第１の核酸増幅反応液とを混合して第１の混合液滴を形成し、前記第１の混合液滴に対して第１の遺伝子増幅反応を行うステップと、
    　前記第１の混合液滴から前記磁性キャリアを磁界を用いて引き抜くステップと、
    　前記磁性キャリアを前記第２の核酸増幅反応液の内部に磁界を用いて挿入し、前記磁性キャリアに吸着した前記第１の混合液滴と前記第２の核酸増幅反応液とを混合して第２の混合液滴を形成し、前記第２の混合液滴に対して第２の遺伝子増幅反応を行うステップと
    　を含むことを特徴とする多段型遺伝子増幅方法。
  2. 　前記第１の遺伝子増幅反応が、前記第１の混合液滴を形成した後、磁界を用いて前記磁性キャリアを前記第１の混合液滴から引き抜いて廃棄し、新たな磁性キャリアを、前記第１の混合液滴の内部に磁界を用いて挿入して、前記第１の混合液滴に対して第１の遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする請求項１に記載の多段型遺伝子増幅方法。
  3. 　前記第２の遺伝子増幅反応が、前記第２の混合液滴を形成した後、磁界を用いて前記磁性キャリアを前記第２の混合液滴から引き抜いて廃棄し、新たな磁性キャリアを、前記第２の混合液滴の内部に磁界を用いて挿入して、前記第２の混合液滴に対して第２の遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする請求項１又は２に記載の多段型遺伝子増幅方法。
  4. 　前記生体由来試料及び前記第１及び第２の核酸増幅反応液が、前記磁性キャリアが水平方向に搬送される搬送面の下方に配置された第１、第２、第３の固定手段によりそれぞれ電界を用いて固定されることを特徴とする請求項１に記載の多段型遺伝子増幅方法。
  5. 　前記第１、第２、第３の固定手段が、それぞれ前記搬送面に垂直方向に離間した陰極と陽極とを備え、
    　前記陰極と陽極との間にそれぞれ電圧を印加して前記搬送面の下方から上方に及ぶ電界をそれぞれ発生させることにより、前記生体由来試料及び前記第１及び第２の核酸増幅反応液を前記搬送面上にそれぞれ固定することを特徴とする請求項４に記載の多段型遺伝子増幅方法。
  6. 　前記磁性キャリアが、１つあるいは複数の磁気粒子からなることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の多段型遺伝子増幅方法。
  7. 　遺伝子増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応によって行われることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の多段型遺伝子増幅方法。
  8. 　温度勾配を有する領域内で、前記磁性キャリアを磁界を用いて往復移動させて、前記第１の遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子増幅方法。
  9. 　温度勾配を有する領域内で、前記磁性キャリアを磁界を用いて往復移動させて、前記第２の遺伝子増幅反応を行うことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子増幅方法。
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