WO2010126137A1 - 抗カドヘリン抗体 - Google Patents

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WO2010126137A1
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antibody
cadherin
cdh3
cells
domain
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油谷　浩幸
黎臨 張
石井　敬介
克志 甲田
愛弥 阪本
恵子 勝見
大西　浩史
容子 粥川
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国立大学法人 東京大学
株式会社ペルセウスプロテオミクス
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Definitions

  • the present invention relates to an anti-cadherin antibody that recognizes a specific domain of cadherin and has high antibody-dependent cytotoxic activity.
  • Cancer is an important disease that occupies the top causes of death, but its therapeutic needs have not yet been met.
  • cancer treatment with molecular targeted drugs that design and treat drugs targeting specific molecules specifically expressed in cancer cells Has been actively studied.
  • Cadherin is an example of a molecule that can be a target for molecular therapeutics in cancer.
  • Cadherin is a membrane protein discovered as a molecule that is involved in cell adhesion with allophilic affinity in a calcium-dependent manner (Yoshida and Takeichi, Cell 28: 217-224, 1982).
  • Proteins having cadherin repeats (ECs) consisting of about 110 amino acid residues having high homology to each other are called cadherin superfamily, and there are over 120 types of proteins, which play an important role in maintaining a multicellular structure.
  • ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Proteins belonging to the cadherin superfamily can be broadly classified into 1) classical cadherin, 2) desmosomal cadherin, 3) protocadherin, and 4) others according to their structural characteristics.
  • Classical cadherins, major members of the cadherin superfamily are highly homologous to each other ( Figure 1). That is, it is a single transmembrane protein that is supposed to form a dimer, and has five cadherin domains of EC1-EC5 and an intracellular domain in the extracellular region.
  • Classical cadherin-mediated cell adhesion is characterized by adhesion between allogeneic cells, and is performed by cells recognizing the same type of cadherin molecules that are specifically expressed differently depending on the cell type.
  • EC1 cadherin domain 1
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • An object of the present invention is to provide an anti-cadherin antibody having high antibody-dependent cytotoxic activity.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above-mentioned problems and measured the antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity of the P-cadherin antibody, and found that it tends to be divided into two groups depending on the strength of the ADCC activity. .
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • an antibody with strong ADCC activity recognizes either the upstream region of EC1, cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5) with high probability.
  • Elements that define the ADCC activity of the antibody include the affinity of the Fc portion of the antibody for the Fc receptor of the effector cell, the affinity of the antibody for the antigen, and the epitope recognized by the antibody.
  • the antibody In order to exert ADCC activity, it is essential that the antibody binds to the antigen and the Fc receptor of the effector cell binds to the Fc site of the antibody. However, due to the difference in the region of CDH3 to which the antibody binds, the effector cell It is presumed that there is a spatial restriction in the binding of the antibody to the Fc site, resulting in a difference in ADCC activity.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the following inventions are provided.
  • the upstream region of EC1 indicates a region of 24 amino acid residues upstream of EC1 of E-cadherin, P-cadherin, N-cadherin, and a corresponding region of other cadherins.
  • the anti-cadherin antibody of the present invention recognizes a cadherin domain of cadherin upstream region of EC1, cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5), and has high antibody-dependent cytotoxic activity. And An antibody that can exert high cytotoxic activity is useful as a material for preparing a modified antibody or a modified antibody.
  • an anticancer action based on antibody-dependent cytotoxic activity can be exerted. That is, the anti-cadherin antibody of the present invention is useful as an anticancer agent.
  • FIG. 1 shows the mature protein sequence excluding E-cadherin (CDH1), N-cadherin (CDH2), P-cadherin (CDH3) signals and propeptide sequences.
  • FIG. 2 shows the adhesion mechanism of molecules belonging to the classical cadherin family.
  • FIG. 3 shows the results of flow cytometry obtained by reacting a human CDH3 forced expression cell line with a commercially available anti-human CDH3 antibody.
  • B CHO cell.
  • b 0.1 ⁇ g / ml of anti-CDH3 antibody
  • c 1 ⁇ g / ml of anti-CDH3 antibody FIG.
  • FIG. 4 shows typical flow cytometry results for 3 acquired antibodies and each cell line.
  • A CDH3 forced expression CHO cell
  • B CHO cell
  • C Lung cancer-derived cell line NCI-H358.
  • a anti-CDH3 antibody 0.01 ⁇ g / ml
  • b anti-CDH3 antibody 0.1 ⁇ g / ml
  • c anti-CDH3 antibody 1 ⁇ g / ml.
  • FIG. 5 shows the ADCC activity of each antibody.
  • FIG. 6 shows the correspondence of CDH3 partial length protein fragments 1 to 5 with the CDH3 extracellular region.
  • FIG. 7 shows the expression result of CDH3 partial length protein.
  • FIG. 8 shows the reaction of the CDH3 partial length protein and each antibody by Western blotting.
  • FIG. 9 shows the results of epitope analysis of PPMX13 using a peptide array. The numerical value on the X axis indicates the number of the peptide array.
  • FIG. 10 shows the expression results of CDH3 mRNA in various tumor tissues.
  • FIG. 11 shows the expression results of CDH3 in various tumor tissues.
  • FIG. 12 shows the antitumor effect of PPMX12-producing antibody in a xenograft transplanted with human lung cancer-derived cell line NCI-H351.
  • FIG. 13 shows the antitumor effect of PPMX12-producing antibody in a xenograft transplanted with human pancreatic cancer-derived cell line PK-45P.
  • FIG. 14 shows the antitumor effect of PPMX12-producing antibody in a xenograft transplanted with human skin cancer-derived cell line A431.
  • the antibody of the present invention recognizes the cadherin domain of either the upstream region of EC1, cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5), and has antibody-dependent cytotoxic activity when the antibody concentration is 1 ⁇ g / mL.
  • an anti-cadherin antibody 30% or more of an anti-cadherin antibody, an upstream region of EC1, a cadherin domain of either cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5), and an antibody concentration of 0.1 ⁇ g / mL
  • an anti-cadherin antibody characterized by having an antibody-dependent cytotoxic activity of 25% or more (for example, stronger than the activity of PPMX5), or an upstream region of EC1, cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 ( EC5) recognizes any cadherin domain, and ADCC has a maximum activity of 35 % Of an anti-cadherin antibody that is at least% (eg stronger than the activity of PPMX6).
  • the maximum activity of ADCC refers to the ADCC activity when the antibody concentration is increased and the increase in ADCC activity reaches a plateau.
  • the upstream region of EC1 of P-cadherin, P-cadherin and N-cadherin, cadherin domain 1 (EC1), cadherin domain 2 (EC2), cadherin domain 3 (EC3), cadherin domain 4 (EC4), cadherin Domain 5 (EC5) indicates the following areas, respectively.
  • the corresponding region of other cadherins can be determined by comparing the sequences of known cadherin proteins obtained from Genbank et al.
  • ADCC activity Antibody-dependent cytotoxic activity
  • the numerical value of ADCC activity in the present specification means antibody-dependent cytotoxic activity when measured under the same conditions as in Example 4. Specifically, it is as follows. (1) Preparation of effector cells Bone marrow cells were collected from the femurs of C3H / HeJ Jcl mice (8 weeks old, male, Claire Japan) and prepared to 2 ⁇ 10 6 cells / mL in RPMI1640 medium containing 10% FBS. The cells were cultured for 6 days in the presence of human IL-2 (PEPROTECH) 50 ng / mL and mouse GM-CSF (PEPROTECH) 10 ng / mL.
  • human IL-2 PEPROTECH
  • mouse GM-CSF PEPROTECH
  • target cells full-length CDH3-expressing CHO cells (EXZ1501) were used. After the cells are detached from the plate, suspended in HAM medium containing 10% FBS to 1 ⁇ 10 7 cells / mL, 51 Cr is added to a final concentration of 150 uCi, and 1.5% at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator. Incubate for hours.
  • the cells were washed twice with a medium, 10% FBS-containing HAM medium was added, and the cells were seeded on a 96-well U-bottom plate (NUNC) at 1 ⁇ 10 4 cells / well to serve as target cells.
  • NUNC 96-well U-bottom plate
  • the culture supernatant is collected, and the radioactivity in 100 ⁇ L of the culture supernatant is measured with a scintillation counter.
  • cadherin recognized by the antibody of the present invention is preferably classic cadherin. Examples include, but are not limited to, E-cadherin, N-cadherin, and P-cadherin.
  • cadherin or a partial peptide thereof can be used as an antigen for preparing the antibody of the present invention.
  • soluble CDH3 protein or the like can be used, but is not limited thereto.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody (polyclonal antibody and monoclonal antibody) of the present invention can be produced by any of various methods. Methods for producing such antibodies are well known in the art [see, for example, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989)].
  • cadherin or the cadherin domain of either cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5) is preferred.
  • the dose of the antigen per animal is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 ⁇ g when an adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant.
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or the like.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. Then, 6 to 60 days after the final immunization, the antibody titer is measured by enzyme immunoassay (ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) or EIA (enzyme immunoassay)), radioimmunoassay (RIA; radioimmunoassay), etc. On the day when the maximum antibody titer is shown, blood is collected to obtain antiserum.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • EC1 cadherin or its partial peptide, cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5)
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Aluminum hydroxide adjuvant aluminum hydroxide adjuvant
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days, preferably 1 to 14 days after the final immunization day.
  • antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells.
  • HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • myeloma cells include P3X63-Ag. 8).
  • Examples include mouse myeloma cell lines such as U1 (P3U1) and NS-1.
  • the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused.
  • Cell fusion is performed by using 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 antibody-producing cells and 2 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 6 in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 medium.
  • 1 / ml myeloma cells are mixed (a cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably 5: 1), and a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter.
  • the cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
  • the target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment.
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, a fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, and then plated on a microtiter plate at about 3 ⁇ 10 5 cells / well, and a selective medium is added to each well.
  • the culture is carried out with the selective medium changed. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma is collected, and an antibody that binds to the upstream region of EC1 of cadherin, EC4 or EC5 domain is produced by enzyme immunoassay, radioimmunoassay or the like. Hybridomas can be screened. Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally, a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell can be established.
  • a normal cell culture method or ascites collection method can be employed as a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma.
  • the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Culturing for 7 to 14 days, and antibodies are obtained from the culture supernatant.
  • hybridomas In the case of the ascites collection method, about 1 ⁇ 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and a homologous animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. Ascites are collected after 1-2 weeks.
  • known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography are appropriately selected, or a combination thereof is used. Can be purified.
  • the type of the antibody of the present invention is not particularly limited, and it is artificial for the purpose of reducing the foreign antigenicity against humans such as mouse antibody, human antibody, rat antibody, rabbit antibody, sheep antibody, camel antibody, avian antibody, etc. Any of a recombinant antibody modified into, for example, a chimeric antibody or a humanized antibody may be used.
  • the recombinant antibody can be produced using a known method.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable region and a human antibody heavy chain and light chain constant region, and a DNA encoding the murine antibody variable region.
  • a humanized antibody is obtained by transplanting the complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, to the complementarity determining region of a human antibody, and its general gene recombination technique is also known. . Specifically, several oligonucleotides were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody had an overlapping portion at the end. It is synthesized from nucleotides by PCR. Obtained DNA can be obtained by ligating with human antibody DNA encoding constant region, and then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (EP239400, International Publication WO96 / 02576, etc.) .
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with a desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to form a desired human antibody having binding activity to the antigen.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, 25WO94 / 25585).
  • WO 96/34096, WO 96/33735 ).
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared from the sequence and a human antibody can be obtained.
  • These antibodies recognize the cadherin domain of either the upstream region of EC1, cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5), and antibody-dependent cytotoxic activity when the antibody concentration is 1 ⁇ g / mL. Is 30% or more, recognizes the cadherin domain of either the upstream region of EC1, cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5), and antibody-dependent cytotoxic activity at an antibody concentration of 0.1 ⁇ g / mL Recognizes an cadherin domain of an antibody or an upstream region of EC1, cadherin domain 4 (EC4) or cadherin domain 5 (EC5), and ADCC has maximum activity Loss of the characteristic of being an antibody of 35% or more (for example, stronger than PPMX6 activity) Unless, monovalent antibodies, bivalent antibodies may be either a multivalent antibody may be an antibody fragment (fragment) minibodies or antibody modifications of such.
  • an antibody fragment or a low molecular weight antibody for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, ScFv (single chain Fv), diabody, etc., fused with Fc portion and added with ADCC activity may be used.
  • a gene encoding these antibodies may be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell.
  • a modified antibody an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can be used. It is also possible to bind a radioisotope, a chemotherapeutic agent or the like to the antibody rod, and particularly a radiolabeled antibody rod is useful. Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody bag. Antibody modification methods are known to those skilled in the art.
  • the antibody of the present invention exhibits high antibody-dependent cytotoxic activity, it can be used as a cytotoxic agent.
  • the cytotoxic agent of the present invention can damage cancer cells, for example, by contacting them with cancer cells expressing cadherin.
  • the cytotoxic agent of the present invention can appropriately contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, diluent and the like as necessary.
  • the cytotoxic agent of the present invention can be formulated as an injection, for example.
  • the dosage of the cytotoxic agent of the present invention depends on the symptom level, age and body weight of the patient, administration method, etc., and the weight of the antibody as the active ingredient is usually in the range of about 10 ng to about 100 mg / kg body weight. It is.
  • Example 1 Establishment of a CDH3-expressing CHO cell line
  • a CHO cell expressing full-length CDH3 was established.
  • (1) Preparation of CDH3 gene expression vector In order to insert the full-length human CDH3 DNA shown in SEQ ID NO: 1 into the mammalian expression vector pEF4 / myc-HisB (Invitrogen), two types of restriction enzymes KpnI (Takara Bio) and XbaI (Takara Bio) Biotechnology) at 37 ° C.
  • CDH3 full-length expression CHO clones were selected by Western blotting using an anti-c-Myc monoclonal antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As a result, the CDH3 full-length expression CHO cell line with high expression and good growth ( EXZ1501) was obtained. The results of measurement of this cell line and a commercially available anti-CDH3 antibody (R & D SYSTEMS) using a flow cytometer are shown in FIG.
  • Soluble CDH3 (sCDH3) protein lacking the C-terminal transmembrane region was prepared for use as an immunogen for producing anti-CDH3 antibody.
  • soluble CDH3 antigen expression vector Forward designed to amplify a portion corresponding to the CDH3 extracellular region (corresponding to 1-654 of SEQ ID NO: 2, hereinafter referred to as sCDH3 cDNA) using CDH3 full-length cDNA as a template PCR reaction was performed using a primer (SEQ ID NO: 7: CGCGGGTACCATGGGGCTCCCTCGT, (hCDH3FullFW)) and a reverse primer (SEQ ID NO: 8: CCGTCTAGATAACCCTCCCTTCAGGGTCC, (hCDH3SolbRV)). The reaction was performed using KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) under the reaction conditions of 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for
  • this sCDH3 cDNA was treated with two types of restriction enzymes KpnI and XbaI, and then treated with p4 / myc-HisB treated with KpnI and XbaI using T4 DNA ligase.
  • the insertion was performed according to the method to obtain the expression vector pEF4-sCDH3-myc-His.
  • soluble CDH3-expressing CHO cells were performed by Western blotting using an anti-c-Myc monoclonal antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY).
  • SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY an anti-c-Myc monoclonal antibody
  • EXZ1702 a soluble CDH3-expressing CHO cell line with a large amount of secretion into the culture supernatant and good growth.
  • the selected soluble CDH3-expressing CHO cell line (EXZ1702) uses 3 roller bottles with a culture area of 1,500 cm 2 , and 333 mL of serum-free medium CHO-S-SFM-II (Invitrogen) per roller bottle. The culture supernatant was collected for 72 hours.
  • the obtained culture supernatant is soluble by affinity chromatography using a HisTrap (registered trademark) HP column (GE Healthcare Bioscience) and gel filtration chromatography using a Superdex (registered trademark) 200 pg column (GE Healthcare Bioscience).
  • Type CDH3 protein was obtained.
  • Example 3 Preparation of anti-CDH3 monoclonal antibody (1) Preparation of monoclonal antibody using soluble CDH3 protein as immunogen 50 ⁇ g of soluble CDH3 protein dissolved in physiological saline and Titer-MAX Gold (registered trademark) (Titer Max) was mixed in an equal amount, and initial immunization was performed by intraperitoneal and subcutaneous injection of MRL / lpr mice (Japan SLC Co., Ltd.). The second and subsequent immunizations were carried out by mixing the similarly prepared soluble CDH3 protein equivalent to the amount of 25 ⁇ g protein and Titer-MAX Gold and injecting them intraperitoneally and subcutaneously.
  • Titer-MAX Gold registered trademark
  • mice Three days after the final immunization, spleen cells were aseptically prepared from mice, and cell fusion with mouse myeloma cells SP2 / O-Ag14 or P3-X63-Ag8.653 was carried out by the polyethylene glycol method according to a conventional method.
  • Anti-CDH3 antibody was selected by flow cytometry using a CHO cell line (EXZ1501) that expresses full-length CDH3.
  • a CHO cell line (EXZ1501) expressing full-length CDH3 was treated with 2 mM EDTA-PBS, detached from the culture plate, and then suspended in a FACS solution so as to be 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • This cell suspension was seeded in a 96-well plate at 50 ⁇ L / well, the hybridoma culture supernatant was added, reacted at 4 ° C. for 60 minutes, washed twice with FACS solution (200 ⁇ L / well), and then AlexaFluor 488. Labeled anti-mouse IgG • goat F (ab ′) 2 (Invitrogen) was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Then, after washing twice with a FACS solution, flow cytometry was performed to select hybridomas that showed a strong reaction in CDH3-expressing CHO cells.
  • FIG. 4 shows typical reaction results of an antibody obtained from the hybridoma and a CDH3-expressing CHO cell (EXZ1501), a parental CHO cell, and a cancer cell NCI-H358 in which CDH3 is confirmed to be highly expressed. Show. It was confirmed that all the selected hybridomas reacted with CDH3-expressing CHO cells (EXZ1501) and NCI-H358, but not with CHO cells.
  • ADCC activity is measured by a method in which an antibody is allowed to act on a radiolabeled target cell in the presence of an effector cell and its free radioactivity is measured. It was.
  • (1) Preparation of effector cells Bone marrow cells were collected from the femurs of C3H / HeJ Jcl mice (8 weeks old, male, Claire Japan) and prepared to 2 ⁇ 10 6 cells / mL in RPMI1640 medium containing 10% FBS. The cells were cultured for 6 days in the presence of human IL-2 (PEPROTECH) 50 ng / mL and mouse GM-CSF (PEPROTECH) 10 ng / mL. On the day of measurement, the cells were collected, washed with HAM medium containing 10% FBS, and used as an effector cell solution.
  • human IL-2 PEPROTECH
  • mouse GM-CSF PEPROTECH
  • target cells full-length CDH3-expressing CHO cells (EXZ1501) were used. After detaching the cells from the plate, the cells are suspended in HAM medium containing 10% FBS to 1 ⁇ 10 7 cells / mL, 51 Cr is added so that the final concentration is 150 uCi, and then 1. is added at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator. Cultured for 5 hours. The cells were washed twice with a medium, 10% FBS-containing HAM medium was added, and the cells were seeded on a 96-well U-bottom plate (NUNC) at 1 ⁇ 10 4 cells / well to serve as target cells.
  • NUNC 96-well U-bottom plate
  • Cytotoxic activity (%) (AC) / (BC) ⁇ 100
  • the test was performed in triplicate, and the cytotoxic activity (%) was calculated from the average value.
  • the test results are shown in Table 1 and FIG.
  • An antibody having an ADCC activity of 30% or more at an antibody concentration of 1 ⁇ g / mL was defined as a high ADCC activity group, and an antibody having a concentration of less than 30% was defined as a low ADCC activity group.
  • R & D-104805 indicates a commercially available anti-CDH3 antibody (R & D SYSTEMS).
  • BD-610227 indicates a commercially available anti-CDH3 antibody (BD BIOSCIENCE).
  • Negative Abs 1 and 2 represent antibodies that recognize antigens unrelated to CDH3. * S: High ADCC activity (more than 30% at antibody concentration of 1 ⁇ g / mL) W: Low ADCC activity (less than 30% when antibody concentration is 1 ⁇ g / mL)
  • the hybridoma PPMX12 that produces the antibody PPMX12 was founded on January 20, 2010 in the independent administrative corporation Product Evaluation Technology Foundation Patent Microorganism Depositary Center (Postal Code 292-0818, Kazusa Kamashika 2-5-8, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). Deposited under the Budapest Treaty under the deposit number NITE BP-865.
  • Example 5 Epitope classification of anti-CDH3 monoclonal antibody by CDH3 partial length expression protein Epitope classification of the obtained anti-CDH3 antibody was performed by Western blotting with a CDH3 partial sequence expression product.
  • CDH3 partial sequence expression fragments 1 to 5 were designed so that the sequences sufficiently overlapped between the fragments (FIG. 6).
  • CDH3 partial length protein expression vector PCR reaction was performed using the full-length CDH3 cDNA of Example 1 as a template and a primer set described below.
  • iProof High Fidelity DNA polymerase Bio-Rad
  • a gel containing a band close to the target size was cut out by agarose gel electrophoresis, and the target CDH3 cDNA fragment was obtained using a QIA (registered trademark) quick gel extraction kit.
  • Fragment 1 (positions 108-236 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACCCGATGGGGTGGTTGCTCCCAAATTCG (SEQ ID NO: 9)
  • Reverse primer AGATTACCTATCTAGACTACTGCCATCACAGAAGTACCTGGTAGG (SEQ ID NO: 10)
  • Fragment 2 (positions 132-348 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACCAAGTCTAATAAAGATAGAGACACCAAG (SEQ ID NO: 11)
  • Reverse primer AGATACTACCTTAGTAGACTACTCTCTCACCCATCATGGCCCACTGCATTCTCA (SEQ ID NO: 12)
  • Fragment 3 (positions 237 to 461 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACCGTGACAGCCACGGGATGAGGATGATG (SEQ ID NO: 13)
  • Reverse primer AGATTACCTATCTAGACTAGACACACACAGGCGCCCCCAGTG (SEQ ID NO: 14)
  • Fragment 4 (positions 349 to 550 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACCCCTGACGGTTCACTGATCTGGACG (SEQ ID NO: 15)
  • Reverse primer AGATTACCTATTAGTAGTAGGGCTCAGGGGACTGGGCCATGGTCATTTG (SEQ ID NO: 16)
  • Fragment 5 (positions 462 to 654 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACTACTACACTGCAGAAGACCCTGACAAGG (SEQ ID NO: 17)
  • Reverse primer AGATTACCTATCTAGACTAACCCTCCCTTCCAGGGTCCAGGGCAGGTTTC (SEQ ID NO: 18)
  • the expression of the CDH3 partial length protein was confirmed by the presence of a band at the expected position by carrying out Western blotting with an anti-Penta-His antibody (Qiagen) after electrophoresis of an E. coli culture solution. That is, an electrophoresis buffer corresponding to 1/10 volume of the above-mentioned E. coli culture solution was added, charged to a 5-20% gradient gel (Bio-Rad) under reducing conditions, and after electrophoresis, Immobilon (registered trademark) P (Millipore).
  • the transfer film was lightly washed with TBS-T (0.05% Tween (registered trademark) 20, TBS), shaken with TBS containing 40% BSA for 1 hour, and then 10% Block Ace (registered trademark) (Snow Brand Milk Products).
  • TBS-T 0.05% Tween (registered trademark) 20, TBS
  • Block Ace registered trademark
  • Each anti-CDH3 antibody diluted with TBS-T was added and shaken for 1 hour.
  • HRP-anti-mouse IgG antibody GE Healthcare Biosciences
  • X-ray film RX-u Fluji Film
  • ECL registered trademark
  • -Plus GE Healthcare Bioscience
  • the region recognized by each antibody was determined by the reactivity with each CDH3 partial length protein (Table 2).
  • the correspondence relationship with the region recognized by each antibody on the CDH3 sequence shown in SEQ ID NO: 2 is shown below.
  • R & D-104805 indicates a commercially available anti-CDH3 antibody (R & D SYSTEMS).
  • BD-610227 indicates a commercially available anti-CDH3 antibody (BD BIOSCIENCE).
  • Negative Abs 1 and 2 represent antibodies that recognize an antigen unrelated to CDH3. * S: High ADCC activity (more than 30% at antibody concentration of 1 ⁇ g / mL) W: Low ADCC activity (less than 30% when antibody concentration is 1 ⁇ g / mL)
  • Example 6 Anti-CDH3 Monoclonal Antibody Epitope Determination Using Peptide Array
  • a peptide array (Reptopepe manufactured by JPT Peptide Technologies) was used for antibody PPMX13 considered to correspond to the border region. ) To determine the epitope in more detail.
  • a peptide (108, which was synthesized by sliding a region corresponding to the extracellular region of CDH3 (corresponding to positions 108 to 563 of SEQ ID NO: 2) by 13 amino acids from the N-terminal by 2 amino acids. -120, 110-122 ... 551-563) are immobilized on a glass slide and blocked with SuperBlock® (PIERCE). And reacted. After washing 3 times with TBS-T, detection was performed with DyLight649 fluorescently labeled anti-mouse antibody (PIERCE). Those that did not react with the epitope search target antibody were measured as negative controls. The measurement results are shown in FIG. A strong signal was observed in the region corresponding to the amino acid sequence at positions 446-472, 490-504 of CDH3 shown in SEQ ID NO: 2, and it was presumed to be an epitope of the antibody.
  • ADCC highly active antibodies were concentrated in the upstream region of EC1, EC4 and EC5. Indicated.
  • RNA was prepared from normal human tissue and various cancer tissues from a sample collected by laser microdissection method using ISOGEN (Nippon Gene) according to a standard method. did. Gene expression of each 10 ng of RNA was analyzed using GeneChip U-133B (Affymetrix) according to Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). When an average expression score of all genes was set to 100 and a gene whose expression was enhanced in cancer cells was searched, CDH3 was highly expressed in lung cancer, colon cancer and pancreatic cancer (FIG. 10B). Further, when the expression of CDH3 mRNA in pancreatic cancer tissues having different degrees of differentiation was examined, tissues with high expression were recognized regardless of the degree of differentiation (FIG. 10C).
  • Example 8 Expression of CDH3 protein in cancer tissue by immunohistochemical staining
  • immunostaining was performed on a cancer specimen tissue array.
  • the cancer cell tissue array is manufactured by Shanghai Outdo Biotech Co., Ltd., pancreatic cancer (adenocarcinoma), lung cancer (adenocarcinoma), lung cancer (squamous cell carcinoma) and colon cancer (glandular gland). Cancer).
  • Each tissue array slide was deparaffinized and activated with 10 mM Tris 1 mM EDTA (pH 9.0) at 95 ° C. for 40 minutes.
  • Example 9 Anti-Tumor Effect in Xenograft Model
  • the anti-tumor effect of anti-CDH3 antibody was determined using a xenograft grafted with human lung cancer-derived cell line NCI-H358, human skin cancer-derived cell line A431, and human pancreatic cancer-derived cell line PK-45P. Confirmed with. NCI-H358 and PK-45P were cultured in 10% FBS-containing RPMI1640 medium, A431 was cultured in 10% FBS-containing DMEM medium, and 5 ⁇ subcutaneously in the right ventral region of SCID mice (female, 7 weeks old, Japan Marie). The cells were transplanted to 106 cells / mouse.
  • RCB1205-producing antibody anti-pertussis toxin mouse IgG antibody
  • 7.5 mg / kg was administered from the tail vein. The administration was started when the average tumor diameter reached 90 mm3, and was administered twice a week (every 3 days or 4 days).
  • Administered intravenously The administration was started when the average tumor diameter reached 120 mm3, and was administered twice a week (every 3 days or 4 days).
  • Administration was started when the average tumor diameter reached 110 mm 3 and was performed twice a week (every 3 or 4 days) 6 times.

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Abstract

　本発明の目的は、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗カドヘリン抗体を提供することである。本発明によれば、ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４(ＥＣ４)またはカドヘリンドメイン５(ＥＣ５)の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつ抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％以上である、抗カドヘリン抗体が提供される。

Description

抗カドヘリン抗体
　本発明は、カドヘリンの特定のドメインを認識し、かつ高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗カドヘリン抗体に関する。
　癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。
　癌における分子治療薬の標的となりうる分子として、カドヘリンが挙げられる。カドヘリンは、カルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である（Ｙｏｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ　２８：２１７ー２２４,１９８２）。相互にホモロジーが高い約１１０アミノ酸残基からなるカドヘリンリピート（ＥＣｓ）を持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、１２０種類以上のタンパク質が存在し、多細胞構造の維持に重要な役割を果たしている。
　癌細胞で発現が上昇する例が報告されており、正常組織と比較して癌組織でのカドヘリンの発現が高い癌細胞に対しては、カドヘリンを認識する抗体に抗癌剤を結合させた薬剤や、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙーｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を有する抗体を癌の治療に用いることが検討されている（ＷＯ２００２／０９７３９５号公報、ＷＯ２００７／１０２５２５号公報）。
　カドヘリンスーパーファミリーに属するタンパク質は、その構造の特徴により１）古典的カドヘリン、２）デスモゾームカドヘリン、３）プロトカドヘリン、４）その他に大きく分類することができる。カドヘリンスーパーファミリーの主要なメンバーである古典的カドヘリンは相互にホモロジーが高い（図１）。すなわち、２量体を形成するとされている１回膜貫通型タンパク質で、細胞外領域にＥＣ１－ＥＣ５の５つのカドヘリンドメインと細胞内ドメインを持つ。古典的カドヘリンを介する細胞接着は同種細胞間での接着という特徴があり、細胞種により特異的に発現の状態が異なる同種のカドヘリン分子を細胞が相互に認識することによって行われる。Ｅ－カドヘリンはＥ－カドヘリンを認識して結合し、Ｐ－カドヘリンはＰ－カドヘリンを認識して結合するという機序で同種細胞相互が接着する（図２）。
カドヘリン相互の同種／異種の認識は細胞外ドメインのＮ端に位置するカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）によるとされる（Ｎｏｓｅ　Ａ.  ｅｔ　ａｌ.,　Ｃｅｌｌ　６１：１４７－１５５,  １９９０）。Ｋｌｉｎｇｅｌらは、ヒトＰ－カドヘリンのアミノ酸配列の第１位～第２１３位（配列番号２）とヒトＥ－カドヘリンの対応する領域を入れ替えると、Ｅ－カドヘリンとは結合せず、Ｐ－カドヘリンと結合することを示している（Ｋｌｉｎｇｅｌ　Ｈ.  ｅｔ　ａｌ.,　Ｊ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１１３：２８２９ー３６,  ２０００）。このように、Ｅ－カドヘリン、Ｐ－カドヘリンをはじめとする古典的カドヘリンは同一の機序で相互に結合すると考えられる。
　近年、分子標的薬として多くの癌治療用の抗体医薬が実際に上市され治療効果を上げている。抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙーｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は、すでに上市されている抗癌剤であるトラスツズマブ、リツキシマブ等の主要な抗腫瘍メカニズムであり、ＡＤＣＣ活性の増強は治療効果の向上、副作用の低減等につながる。そのため、よりＡＤＣＣ活性が高い抗体を探索する研究や、ＡＤＣＣ活性を増強する技術の開発が行われている。例えば、抗体のＦｃ部分に結合する糖鎖の末端のフコースを除去する技術（ＷＯ００／６１７３９号公報）、Ｆｃ部分のアミノ酸を置換することによりエフェクター細胞との親和性を高めＡＤＣＣ活性を増強する技術（ＷＯ２００８／１２１１６０号公報）が開発されている。
　上記の通り、ＡＤＣＣ活性を有する抗体を癌の治療薬として用いるというコンセプトは公知である。しかし、ドメイン構造とＰ－カドヘリンを含む古典的カドヘリンの機能との関連についての報告はあるが、ＡＤＣＣ活性の強さと古典的カドヘリンの構造との関連を示唆するものはない。
ＷＯ２００２／０９７３９５号公報 ＷＯ２００７／１０２５２５号公報 ＷＯ００／６１７３９号公報 ＷＯ２００８／１２１１６０号公報
Ｙｏｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ　２８：２１７－２２４,  １９８２ Ｎｏｓｅ　Ａ.  ｅｔ　ａｌ.,　Ｃｅｌｌ　６１：１４７－１５５,  １９９０ Ｋｌｉｎｇｅｌ　Ｈ.  ｅｔ　ａｌ.,　Ｊ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１１３：２８２９ー３６,  ２０００
　本発明は、高い抗体依存性細胞傷害活性を有する抗カドヘリン抗体を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、Ｐ－カドヘリン抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を測定したところ、ＡＤＣＣ活性の強弱で２群に分かれる傾向があることを見出した。そこで、各抗体が認識している領域により分類を行ったところ、ＡＤＣＣ活性が強い抗体は、ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかを高い確率で認識していることが判明した。
　抗体のＡＤＣＣ活性を規定する要素としては、抗体のＦｃ部分のエフェクター細胞のＦｃレセプターへの親和性、抗体の抗原に対する親和性、抗体が認識するエピトープが挙げられる。ＡＤＣＣ活性が発揮されるためには、抗原に抗体が結合し、抗体のＦｃ部位にエフェクター細胞のＦｃレセプターが結合することが必須であるが、抗体が結合するＣＤＨ３の領域の違いにより、エフェクター細胞の抗体のＦｃ部位への結合に空間的な制限がありＡＤＣＣ活性の差を生じていることが推定される。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつ抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％以上である、抗カドヘリン抗体。
（２）カドヘリンがＰ－カドヘリンである、（１）に記載の抗体。
（３）可溶型Ｐ－カドヘリンを免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）モノクローナル抗体である、（１）から（３）の何れかに記載の抗体。
（５）（４）に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（６）（１）から（４）の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
（７）癌細胞に投与される、（６）に記載の細胞障害剤。
　なお、本明細書においてＥＣ１の上流領域とは、Ｅ－カドヘリン、Ｐ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリンのＥＣ１の上流側２４アミノ酸残基の領域、および、他のカドヘリンの対応する領域を示す。
　本発明の抗カドヘリン抗体は、カドヘリンのＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、高い抗体依存性細胞傷害活性を有することを特徴とする。高い細胞傷害活性を発揮しうる抗体は、修飾抗体、改変抗体を作製するための材料として有用である。また、本発明の抗カドヘリン抗体をカドヘリンが発現する癌に投与することにより、抗体依存性細胞障害活性を機序とする抗癌作用を発揮することができる。即ち、本発明の抗カドヘリン抗体は、抗癌剤として有用である。
図１は、Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）、Ｎ－カドヘリン（ＣＤＨ２）、Ｐ－カドヘリン（ＣＤＨ３）のシグナル及びプロペプチド配列を除いた成熟タンパク質の配列を示す。 図２は、古典的カドヘリンファミリーに属する分子の接着機序を示す。 図３は、ヒトＣＤＨ３強制発現細胞株と市販抗ヒトＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリの結果を示す。Ａ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＨＯ細胞。ａ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体０.０１μｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体０．１μｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体１μｇ／ｍｌ 図４は、取得抗体３例と各細胞株との典型的なフローサイトメトリ結果を示す。Ａ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩ-Ｈ３５８。ａ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体０．０１μｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体０．１μｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体１μｇ／ｍｌ。 図５は、各抗体のＡＤＣＣ活性を示す。 図６は、ＣＤＨ３部分長タンパク質断片１から５のＣＤＨ３細胞外領域との対応を示す。 図７は、ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現結果を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５ 図８は、ＣＤＨ３部分長タンパク質と各抗体のウェスタンブロット法による反応を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５ 図９は、ペプチドアレイを用いたＰＰＭＸ１３のエピトープ解析の結果を示す。Ｘ軸の数値はペプチドアレイの番号を示す。Ａ：ＰＰＭＸ１３、Ｂ：１次抗体無し 図１０は、各種腫瘍組織のＣＤＨ３のｍＲＮＡの発現結果を示す。Ａ：正常組織、Ｂ：各種癌組織、Ｃ：膵臓癌分化度 図１１は、各種腫瘍組織でのＣＤＨ３の発現結果を示す。 図１２は、ヒト肺癌由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５１を移植したゼノグラフトにおけるＰＰＭＸ１２産生抗体の抗腫瘍効果を示す。 図１３は、ヒト膵臓癌由来細胞株ＰＫ－４５Ｐを移植したゼノグラフトにおけるＰＰＭＸ１２産生抗体の抗腫瘍効果を示す。 図１４は、ヒト皮膚癌由来細胞株Ａ４３１を移植したゼノグラフトにおけるＰＰＭＸ１２産生抗体の抗腫瘍効果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明の抗体は、ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつ抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％以上であることを特徴とする抗カドヘリン抗体、ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつ抗体濃度０．１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が２５％以上（例えばＰＰＭＸ５の活性より強い）であることを特徴とする抗カドヘリン抗体、または、ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつＡＤＣＣの最大活性が３５％以上（例えばＰＰＭＸ６の活性より強い）である抗カドヘリン抗体である。ここで、ＡＤＣＣの最大活性とは、抗体濃度を上げてＡＤＣＣ活性の上昇がプラトーに達したときのＡＤＣＣ活性をいう。
　本明細書においてＰ－カドヘリン、Ｐ－カドヘリンおよびＮ－カドヘリンのＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）、カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）、カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）、カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）は、それぞれ次の領域を示す。また、他のカドヘリンの対応する領域は、Ｇｅｎｂａｎｋ等より得られる公知のカドヘリンタンパク質の配列を比較することによって決定することができる。配列の比較は公知のプログラム、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＪＤ　ｅｔ　ａｌ.,　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２　（２２）：　３６７３ー３６８０、１９９４）またはＣｌｕｓｔａｌＸ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＪＤ　ｅｔ　ａｌ.,　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５　（２４）：　４８７６ー４８８２,  １９９７）などを用いて行うことが可能である。
・Ｐ－カドヘリン（ＣＤＨ３）
ＥＣ１の上流領域：配列番号２のアミノ酸配列の第１０８位～第１３１位
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号２のアミノ酸配列の第１３２位～第２３６位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号２のアミノ酸配列の第２３７位～第３４８位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号２のアミノ酸配列の第３４９位～第４６１位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号２のアミノ酸配列の第４６２位～第５５０位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号２のアミノ酸配列の第５５１位～第６５４位
・Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）
ＥＣ１の上流領域：配列番号４のアミノ酸配列の第１５５位～第１７８位
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号４のアミノ酸配列の第１７９位～第２８３位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号４のアミノ酸配列の第２８４位～第３９５位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号４のアミノ酸配列の第３９６位～第５０７位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号４のアミノ酸配列の第５０８位～第５９７位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号４のアミノ酸配列の第５９８位～第７０４位
・Ｎ－カドヘリン（ＣＤＨ２）
ＥＣ１の上流領域：配列番号６のアミノ酸配列の第１６０位～第１８３位
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号６のアミノ酸配列の第１８４位～第２８８位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号６のアミノ酸配列の第２８９位～第４０２位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号６のアミノ酸配列の第４０３位～第５１８位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号６のアミノ酸配列の第５１９位～第６０７位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号６のアミノ酸配列の第６０８位～第７１９位
　抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）は、公知の方法で測定することが可能である。本明細書のＡＤＣＣ活性の数値は、実施例４における測定と同様の条件で測定した場合の抗体依存性細胞傷害活性を意味する。具体的には以下の通りである。
（１）エフェクター細胞の調製
　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウス（８週齢、オス、日本クレア社）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２ｘ１０6個／ｍＬに調製し、ヒトＩＬ－２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）５０ｎｇ／ｍＬ、マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）１０ｎｇ／ｍＬ存在下で６日間培養した。測定当日に細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地で洗浄後、エフェクター細胞溶液とした。
（２）標的細胞の調製
　標的細胞として、全長ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）を用いた。細胞をプレートから剥離後、１ｘ１０7個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地に懸濁し、終濃度１５０ｕＣｉとなるように51Ｃｒを加え、５％炭酸ガスインキュベーター中３７℃で１．５時間培養した。この細胞を培地で２回洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地を加え、１ｘ１０4個／ウェルとなるように９６ウェルＵ底プレート（ＮＵＮＣ社）に播き、標的細胞とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
標的細胞にそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ濃度に調製した抗体溶液を５０μＬ／ウェル分注した後、室温で１５分間インキュベーションし、次いでエフェクター細胞１００μＬ（１ｘ１０5細胞／ウェル）を分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養する。培養上清を回収し、培養上清１００μＬ中の放射活性をシンチレーションカウンターで測定する。細胞傷害活性は以下の式で求めることができる。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ－Ｃ）／（Ｂ－Ｃ）×１００
Ａ：各抗体添加ウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｂ：標的細胞に２％ＮＰ４０溶液１００μＬ、　１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地５０μＬを添加したウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｃ：標的細胞にエフェクター細胞を含む１０％ＦＢＳ含有培地１５０μＬを加えたウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
　本発明の抗体が認識するカドヘリンの種類は古典的カドヘリンが望ましい。例としてＥ－カドヘリン、Ｎ－カドヘリン、Ｐ－カドヘリンを挙げる事ができるが、これに限定されるものではない。
　本発明の抗体を作成するための抗原としては、カドヘリン又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、可溶型ＣＤＨ３タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばＳａｍｂｒｏｏｋ,  Ｊ　ｅｔ　ａｌ.,　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ,  Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照]。
（ａ）ポリクローナル抗体の作製
　ポリクローナル抗体を作製するためには、カドヘリン又はその部分ペプチドであるＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインが好ましい）を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１～１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１～１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２～５週間間隔で、１～１０回、好ましくは２～５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６～６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｕｍｅーｌｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓｙ）又は　ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ））、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ　ａｓｓａｙ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（ｂ）モノクローナル抗体の作製
　モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、カドヘリン又はその部分ペプチドであるＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインが好ましい）を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１～１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１～１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２～５週間間隔で、１～１０回、好ましくは２～５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１～６０日後、好ましくは１～１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
　細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えば　Ｐ３Ｘ６３－Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ－１などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
　次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０6～１×１０7個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０5～２×１０6個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００～６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０5個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、カドヘリンのＥＣ１の上流領域、ＥＣ４またはＥＣ５ドメインと結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
　樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水採取法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩー１６４０培地、MEM培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％　ＣＯ2濃度）で７～１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
　腹水採取法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０7個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１～２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
　本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体　のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体　定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００号公報　、国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報など）。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ　ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体　を得ることもできる（特公平１ー５９８７８参照）。また、ヒト抗体　遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７,  ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２,  ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６,  ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体　の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体 を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７, ＷＯ９２／２０７９１, ＷＯ９３／０６２１３, ＷＯ９３／１１２３６, ＷＯ９３／１９１７２, ＷＯ９５／０１４３８, ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
　また、これらの抗体 は、ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつ抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％以上、ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつ抗体濃度０．１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が２５％以上（例えばＰＰＭＸ５の活性より強い） 抗体、または、ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつＡＤＣＣの最大活性が３５％以上（例えばＰＰＭＸ６の活性より強い）抗体であるという特性を失わない限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよく、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体 や抗体の修飾物などであってもよい。また、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ）、ＤｉａｂｏｄｙなどにＦｃ部分を融合しＡＤＣＣ活性を付加したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体 を使用することもできる。又、抗体 に放射性同位元素、化学療法剤等を結合することも可能であり、特に放射性標識抗体 は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体 に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法は当業者に公知である。
　本発明の抗体は、高い抗体依存性細胞傷害活性を示すことから、細胞傷害剤として使用することができる。本発明の細胞傷害剤は、例えばカドヘリンを発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。
　本発明の細胞傷害剤には、本発明の抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。本発明の細胞傷害剤としては、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の細胞傷害剤の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約１０ｎｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１　ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株の樹立
　抗ＣＤＨ３抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の樹立を行った。
（１）ＣＤＨ３遺伝子発現ベクターの作製
配列番号１に示す全長ヒトＣＤＨ３ＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）へ挿入するため、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社）及びＸｂａＩ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢへＴ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）により常法に従って挿入し、発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ－Ｈｉｓを得た。
（２）ＣＤＨ３安定発現株の取得
  ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5細胞のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ－Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ社）に混合し１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
　ＣＤＨ３全長発現ＣＨＯのクローン選抜は、抗ｃ-Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果、発現量が高く、かつ増殖が良好なＣＤＨ３全長発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を得た。この細胞株と市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社）のフローサイトメーターによる測定結果を図３に示す。
実施例２ 可溶型ＣＤＨ３抗原の作製
   抗ＣＤＨ３抗体作製の免疫原とするため、Ｃ末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型ＣＤＨ３（ｓＣＤＨ３）タンパク質を作製した。
（１）可溶型ＣＤＨ３抗原発現ベクターの作製
　ＣＤＨ３全長ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＣＤＨ３細胞外領域に相当する部分（配列番号２の１－６５４に相当、以下ｓＣＤＨ３ｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたフォワードプライマー （配列番号７：ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴ、（ｈＣＤＨ３ＦｕｌｌＦＷ））とリバースプライマー （配列番号８：ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣ、（ｈＣＤＨ３ＳｏｌｂＲＶ））を用いてＰＣＲ反応を行った。反応にはＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃－１５秒、５５℃－３０秒、６８℃－９０秒、３０サイクルの反応条件で行った。
 その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約２．０ｋｂｐのバンドを含むゲル断片を切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて、目的のｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを得た。
 このｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢへ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターｐＥＦ４－ｓＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓを得た。
（２）可溶型ＣＤＨ３タンパク質の発現
　ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5 個のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４－ｓＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に混合、１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ）を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
　可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞の選抜は、抗ｃ-Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）が得られた。選択された可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）は、培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ－ＩＩ（インビトロジェン社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型ＣＤＨ３タンパク質を得た。
実施例３　抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体の作製
（１）可溶型ＣＤＨ３タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した５０μｇの可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ－ＭＡＸ　Ｇｏｌｄ（登録商標）（タイターマックス社）を等量混合し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当の可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ－ＭＡＸ　Ｇｏｌｄを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４あるいはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３との細胞融合を行った。
（２）抗ＣＤＨ３抗体産生ハイブリドーマの選抜
　抗ＣＤＨ３抗体の選抜は、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を用いたフローサイトメトリで行った。
　すなわち、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ‘）2（インビトロジェン社）を加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞にて強い反応が認められるハイブリドーマを選抜した。
　当該ハイブリドーマより得られた抗体と、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）、親株であるＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３が高発現であると確認されている癌細胞ＮＣＩ-Ｈ３５８との典型的な反応結果を図４に示す。選抜したハイブリドーマ全てが、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）およびＮＣＩ-Ｈ３５８と反応し、ＣＨＯ細胞とは反応しないことを確認した。
実施例４　抗ＣＤＨ３抗体の抗体依存性細胞傷害 （ＡＤＣＣ） 活性の測定
　ＡＤＣＣ活性の測定は、放射性ラベルした標的細胞にエフェクター細胞存在下、抗体を作用させ、その遊離放射活性を測定する方法によった。
（１）エフェクター細胞の調製
　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウス（８週齢、オス、日本クレア社）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２ｘ１０6個／ｍＬに調製し、ヒトＩＬ－２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）５０ｎｇ／ｍＬ、マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）１０ｎｇ／ｍＬ存在下で６日間培養した。測定当日に細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地で洗浄後、エフェクター細胞溶液とした。
（２）標的細胞の調製
　標的細胞として、全長ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）を用いた。細胞をプレートから剥離後、１ｘ１０7個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地に懸濁し、終濃度）１５０ｕＣｉとなるように51Ｃｒを加え、５％炭酸ガスインキュベーター中３７℃で１．５時間培養した。この細胞を培地で２回洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地を加え、１ｘ１０4個／ウェルとなるように９６ウェルＵ底プレート（ＮＵＮＣ社）に播き、標的細胞とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
　標的細胞にそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ濃度になるよう調製した抗体溶液を５０μＬ／ウェル分注した後、室温で１５分間インキュベートした。次いで、エフェクター細胞１００μＬ（１ｘ１０5細胞／ウェル）を分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養上清を回収し、培養上清１００μＬ中の放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。
　このとき、細胞傷害活性は以下の式で求めた。
   細胞傷害活性（％）＝（Ａ－Ｃ）／（Ｂ－Ｃ）×１００
Ａ：各抗体添加ウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｂ：標的細胞に２％ＮＰ４０溶液１００μＬ、 １０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地５０μＬを添加したウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｃ：標的細胞にエフェクター細胞を含む１０％ＦＢＳ含有培地１５０μＬを加えたウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
　試験は３重に測定し、その平均値から細胞傷害活性（％）を算出した。
　試験結果を表１および図５に示す。ＡＤＣＣ活性を有する抗体の中でも特に強い活性を持つ抗体群が認められた。抗体濃度１μｇ／ｍＬのときのＡＤＣＣ活性が３０％以上であった抗体を高ＡＤＣＣ活性群、３０％未満であった抗体を低ＡＤＣＣ活性群とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Ｒ＆Ｄ-１０４８０５は、市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社）を示す。
ＢＤー６１０２２７は、市販抗ＣＤＨ３抗体（ＢＤ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）を示す。
Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ａｂ１、２は、ＣＤＨ３とは無関係な抗原を認識する抗体を示す。
＊Ｓ：高ＡＤＣＣ活性（抗体濃度１μｇ／ｍＬのときに３０％以上）
　Ｗ：低ＡＤＣＣ活性（抗体濃度１μｇ／ｍＬのときに３０％未満）
　抗体ＰＰＭＸ１２を産生するハイブリドーマＰＰＭＸ１２は、２０１０年１月２０日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－８６５としてブダペスト条約の下で寄託されている。
実施例５ ＣＤＨ３部分長発現タンパク質による抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体のエピトープ分類
　得られた抗ＣＤＨ３抗体のエピトープ分類は、ＣＤＨ３部分配列発現物とのウェスタンブロット法により行った。ＣＤＨ３部分配列発現物は各断片間で十分に配列が重複するように断片１から５を設計した（図６）。
（１）ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現ベクターの作製
  実施例１の全長ＣＤＨ３ｃＤＮＡをテンプレートとし、後述のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行った。この反応にはｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（バイオラッド社）を用い、条件は９８℃－１０秒、６０℃－１０秒、７２℃－３０秒、３５サイクルで行なった。アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近いバンドを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キットを用いて、目的のＣＤＨ３ｃＤＮＡ断片を得た。
　このＣＤＨ３断片を大腸菌発現ベクターｐＣｏｌｄ（登録商標）ＴＦ（タカラバイオ社）へ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＣｏｌｄＴＦにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、各断片を発現するための発現ベクターを得た。
以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い各断片を得た。
断片１（配列番号２の１０８位－２３６位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＴＧ（配列番号：９）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧ（配列番号：１０）
断片２（配列番号２の１３２位－３４８位）
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 （２）ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現
　（１）のＣＤＨ３断片の発現ベクターを使用して、常法により大腸菌Ｒｏｓｓｅｔｔａ（登録商標）２（メルク社）を形質転換し、ＬＢ培地中で培養。６００ｎｍの吸光値が０．４となった段階で、３０分間氷冷し、イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）濃度を０．５ｍＭとし、２０℃で１８時間培養後、回収した。
　ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現は、大腸菌培養液を電気泳動後、抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体（キアゲン社）によるウェスタンブロット法を実施し、予想された位置にバンドが存在する事で確認した。
　即ち、上述した大腸菌培養液量の１／１０量に相当する泳動緩衝液を加え、還元条件下５－２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、イモビロン（登録商標）Ｐ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、１０％ブロックエース（登録商標）（雪印乳業社）入りＴＢＳ－Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ－Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ－Ｔで希釈したＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ－Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ（登録商標）－Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線フィルムＲＸ－ｕ（富士フイルム社）にて検出した。得られた結果を図７に示す。
（３）ＣＤＨ３部分配列発現物を用いた抗体エピトープ分類
　上述の各ＣＤＨ３部分長タンパク質を発現させた大腸菌溶解物を還元条件下、５－２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いて、イモビロンＰ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、短冊状に等間隔で切断し、１０％ブロックエース入りＴＢＳ－Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ－Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ－Ｔで希釈したＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ－Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ－Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線Ｆｉｌｍ　ＲＸ－ｕ（富士フイルム社）にて検出した。得られた結果を図８に示す。
　各ＣＤＨ３部分長タンパク質との反応性により、各抗体が認識する領域を決定した（表２）。
　配列番号２で示されるＣＤＨ３配列上の各抗体が認識する領域との対応関係を以下に示す。
ＥＣ１の上流領域：１０８位―１３１位
ＥＣ１：１３２位―２３６位
ＥＣ２：２３７位―３４８位
ＥＣ３：３４９位―４６１位
ＥＣ４：４６２位―５５０位
ＥＣ５：５５１位―６５４位
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Ｒ＆Ｄ-１０４８０５は、市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社）を示す。
ＢＤー６１０２２７は、市販抗ＣＤＨ３抗体（ＢＤ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）を示す。
Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ａｂ１、２は、ＣＤＨ３とは無関係の抗原を認識する抗体を示す。
＊Ｓ：高ＡＤＣＣ活性（抗体濃度１μｇ／ｍＬのときに３０％以上）
　Ｗ：低ＡＤＣＣ活性（抗体濃度１μｇ／ｍＬのときに３０％未満）
実施例６　ペプチドアレイを用いた抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体エピトープ決定
　前述したＣＤＨ３部分長発現タンパク質によるエピトープ決定において、その境界領域に相当したと考えられる抗体ＰＰＭＸ１３を対象に、ペプチドアレイ（ＪＰＴ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｒｅｐｌｉｔｏｐｅ）を用いてより詳細にエピトープ決定を行った。
　具体的には、ＣＤＨ３の細胞外領域に相当する領域（配列番号２の１０８位－５６３位に相当）を、Ｎ端から１３残基ずつ、２アミノ酸残基ずつスライドして合成したペプチド（１０８位－１２０位、１１０位－１２２位・・・５５１位－５６３位）をガラススライドに固相化、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ （ＰＩＥＲＣＥ社）にてブロッキングしたものを調製し、１次抗体としてエピトープ検索対象の抗体と反応させた。ＴＢＳ－Ｔで３度洗浄後、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９蛍光標識した抗マウス抗体（ＰＩＥＲＣＥ社）で検出した。エピトープ検索対象の抗体を反応させないものを陰性コントロールとして測定した。測定結果を図９に示す。配列番号２に示されたＣＤＨ３のアミノ酸配列４４６位－４７２位、４９０位－５０４位に相当する領域に強いシグナルが観察され、当該抗体のエピトープと推定された。
　実施例５および６で決定された抗体の認識領域の結果と併せ、ＡＤＣＣ活性との関連を検討したところ、ＥＣ１の上流領域、ＥＣ４及びＥＣ５の領域にＡＤＣＣ高活性抗体が集中している事が示された。
実施例７　正常組織および癌組織でのＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現
　正常ヒト組織および各種癌組織より、レーザーマイクロダイセクション法（Ｌａｓｅｒ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）で回収したサンプルよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い定法に従って全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ各１０ｎｇをＧｅｎｅＣｈｉｐＵ－１３３Ｂ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）に準じて遺伝子発現を解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ＣＤＨ３は肺癌、大腸癌、膵臓癌で発現が高かった（図１０Ｂ）。また、分化度の異なる膵臓癌組織におけるＣＤＨ３ｍＲＮＡの発現を検討したところ、分化度に関わらず発現が高い組織が認められた（図１０Ｃ）。
実施例８　免疫組織化学染色による癌組織でのＣＤＨ３タンパク質の発現
　癌臨床検体でのＣＤＨ３タンパク質の発現を確認するため、癌検体組織アレイで免疫染色を行った。
　癌細胞組織アレイは、上海芯超生物科技有限公司社（Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｏｕｔｄｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｃｏ．,Ｌｔｄ．）製の、膵癌（腺癌）、肺癌（腺癌）、肺癌（扁平上皮癌）および大腸癌（腺癌）を使用した。
　各組織アレイスライドを脱パラフィン処理し、１０ｍＭＴｒｉｓ １ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐH９．０）で９５℃４０分賦活化を行った。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ（Ｄａｋｏ社）付属のブロッキング試薬にて内在性ペルオキシダーゼの不活性化を行った後、抗ＣＤＨ３抗体６１０２２７（ＢＤ　ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ社）、およびネガティブコントロールとして抗ＨＢｓ抗体Ｈｙｂ－３４２３と５μｇ／ｍLの濃度で４℃一晩反応させた。抗体溶液を洗い流した後に、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属のポリマー二次抗体試薬と室温３０分間反応させた。ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋Ｋｉｔ付属の発色試薬にて発色を行い、ヘマトキシリンエオジン溶液にて核染色を行った。
　図１１に結果を示す。癌細胞は抗ＣＤＨ３抗体で染色され正常細胞は染色されなかった。
実施例９　ゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍効果
　抗ＣＤＨ３抗体の抗腫瘍効果を、ヒト肺癌由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８、ヒト皮膚癌由来細胞株Ａ４３１、およびヒト膵臓癌由来細胞株ＰＫ－４５Ｐを移植したゼノグラフトで確認した。
　ＮＣＩ－Ｈ３５８およびＰＫ－４５Ｐは１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地、Ａ４３１は１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて培養し、ＳＣＩＤマウス（メス、７週齢、日本クレア)の右腹側部皮下に５×１０６個／マウスとなるように移植した。
　ＮＣＩ－Ｈ３５８移植マウスを６群に分け（ｎ＝８）、各群にＰＰＭＸ１２産生抗体を０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、対照抗体としてＲＣＢ１２０５産生抗体（抗百日咳毒素マウスＩｇＧ抗体）７．５ｍｇ／ｋｇを尾静脈より投与した。投与は、平均腫瘍径が９０ｍｍ３となった時点で開始し、週２回（３日または４日毎）に８回行った。
　ＰＫ－４５Ｐ移植マウスを２群に分け（ｎ＝８）、各群にＰＰＭＸ１２産生抗体を７．５ｍｇ／ｋｇ、対照抗体としてＲＣＢ１２０５産生抗体（抗百日咳毒素マウスＩｇＧ抗体）７．５ｍｇ／ｋｇを尾静脈より投与した。投与は、平均腫瘍径が１２０ｍｍ３となった時点で開始し、週２回（３日または４日毎）に７回行った。
　Ａ４３１移植マウスを２群に分け（ｎ＝８）、各群にＰＰＭＸ１２産生抗体を７．５ｍｇ／ｋｇ、対照抗体としてＲＣＢ１２０５産生抗体（抗百日咳毒素マウスＩｇＧ抗体）７．５ｍｇ／ｋｇを尾静脈より投与した。投与は、平均腫瘍径が１１０ｍｍ３となった時点で開始し、週２回（３日または４日毎）に６回行った。
　投与日に腫瘍サイズおよび体重を測定した。最終投与の後さらに１週間観察し、体重、腫瘍サイズ、腫瘍重量の測定を行った。それぞれの結果を図１２～図１４に示す。ＰＰＭＸ１２産生抗体は、全ての試験で抗腫瘍活性を示した。また、ＮＣＩ－Ｈ３５８移植マウスを用いた試験では投与量依存的に抗腫瘍効果が増強することが確認された。

Claims (7)

  1. ＥＣ１の上流領域、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）またはカドヘリンドメイン５（ＥＣ５）の何れかのカドヘリンドメインを認識し、かつ抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％以上である、抗カドヘリン抗体。
  2. カドヘリンがＰ－カドヘリンである、請求項１に記載の抗体。
  3. 可溶型Ｐ－カドヘリンを免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. モノクローナル抗体である、請求項１から３の何れかに記載の抗体。
  5. 請求項４に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
  6. 請求項１から４の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
  7. 癌細胞に投与される、請求項６に記載の細胞障害剤。
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