WO2010103683A1 - Ｄｎａ配列特異的結合化合物を含む局所用眼科疾患治療薬 - Google Patents

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ophthalmic disease
topical ophthalmic
pyrrole
disease therapeutic
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敏 陳
暢 崎元
隆義 渡部
昇 福田
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Definitions

  • the present invention relates to a topical ophthalmic disease therapeutic agent comprising a DNA sequence-specific binding compound. More specifically, the present invention relates to a topical ophthalmic disease therapeutic agent comprising pyrrole-imidazole polyamide (hereinafter also referred to as PIP) having a specific structure.
  • PIP pyrrole-imidazole polyamide
  • the cornea is a transparent tissue without highly organized blood vessels located in the front of the eye.
  • the cornea must be kept transparent in order to properly reflect light.
  • Eye injury due to alkali burn is a serious ocular surface disease compared with burns and acid trauma, and has a very poor prognosis.
  • Alkaline substances cause serious clinical problems in the cornea, such as white turbidity in the originally transparent cornea due to its deep penetration into tissues.
  • blindness due to alkali burn is one of the main causes of blindness due to acquired causes.
  • corneal cells such as corneal parenchymal cells and epithelial cells and influx of inflammatory cells such as monocytes and macrophages are involved in corneal lesion formation after alkaline tissue damage, resulting in permanent epithelial defects. It can be connected.
  • corneal surgery such as LASIK
  • corneal surgery performed for vision correction or after inflammation due to infection
  • an injury such as clouding of the cornea
  • the healing process of inflammation such as trauma after corneal surgery is considered to involve growth factors and cytokines similar to those caused by alkali burn trauma.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor ⁇
  • MMP matrix metalloproteinase
  • Non-patent Document 1 The conjunctivaization of the corneal surface accompanied by opacification due to the loss of corneal limbal stem cells and the vascularization of the corneal stroma all cause the impairment of the visual field of the patient in the late healing process.
  • TGF- ⁇ not only promotes migration of corneal epithelial cells and keratocytes, but also promotes mononuclear and macrophage chemotaxis, and induces keratocytes to differentiate into myofibroblasts. It has been shown.
  • TGF- ⁇ and its downstream MMP9 in the cornea that caused an inflammatory response due to external stimuli such as burns and infections is thought to be partly involved in local angiogenesis and inflammation, with TGF- ⁇ in part. Since it has expression of other cytokines such as vascular endothelial growth factor (hereinafter also referred to as “VEGF”) and monocyte macrophage chemotactic protein-1 (hereinafter also referred to as “MCP-1”), Makes damage worse.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • MCP-1 monocyte macrophage chemotactic protein-1
  • ophthalmic proliferative diseases such as tumor, proliferative diabetic retinopathy, pterygium, neovascular glaucoma, age-related macular degeneration, corneal neovascularization associated with corneal diseases are Known as a tissue proliferative disorder.
  • diseases with abnormal angiogenesis and fibrosis have been increasing in the ophthalmic field in recent years, and there is a high risk of vision loss and blindness. It is a syndrome that has become.
  • a drug delivery system (hereinafter also referred to as “DDS”) that efficiently delivers an active ingredient of a drug to a target tissue in the eye is necessary.
  • Drugs administered by eye drops often do not penetrate well through the cornea. The dropped drug flows with the tears or is absorbed into the body through the conjunctiva. Only about 5% of the instilled drug penetrates the cornea and reaches the ocular tissue, and the remaining 95% is lost by tear drainage. For this reason, regular drugs require frequent administration (every several hours), but eye drops during sleep are practically impossible, and it is necessary to develop eye drops with a long duration.
  • an aptamer therapeutic agent using a VGEF inhibitor already exists.
  • intravitreal administration due to the problem of drug delivery, it is necessary to inject such drugs frequently into the eye by intravitreal administration, so that administration is not easy and the eye needs to be administered frequently.
  • the risk of suffering from an infection is also increased by internal injection.
  • intravenous administration since it is systemic administration, the effect on the whole body becomes strong in order to maintain the drug concentration in the eye, and there are concerns about side effects and the like. Accordingly, there is a need to develop a therapeutic agent for topical ophthalmic diseases that does not require frequent administration.
  • Pyrrole imidazole polyamide is a chemically synthesized substance discovered by Dervan et al. Based on the fact that antibiotics duocarmycin-A and distamycin-A recognize DNA in a base-specific manner (Patent Document 1, Non-Patent Document 2). Non-Patent Document 3). PI polyamide recognizes double-stranded DNA in a base sequence-specific manner and binds to a minor groove of a DNA double helix structure, so that it is possible to specifically control the expression of a target gene (Non-patent Document 3). ).
  • PI polyamide is a novel molecular target because it is not degraded by nucleolytic enzymes in vivo and has high ability to bind to nucleic acids, unlike antisense gene, ribozyme, siRNA, etc.
  • As a therapeutic agent clinical application to anticancer agents and the like is expected, but the adaptation to ophthalmic diseases, eye drops, and behavior as a drug in the eyeball have not been studied.
  • inactivation of gene function by reverse genetics which is used to analyze the function of a specific gene, on the other hand, in the case of viral infection, cancer, and other diseases based on abnormal gene expression It has great potential for treatment. That is, it is known that inactivation of gene function can be performed at the DNA level by homologous recombination, or at the RNA level by antisense oligodeoxynucleotides or ribozymes.
  • homologous recombination generally has low recombination efficiency and is effective only in some cells.
  • the antisense oligodeoxynucleotide and ribozyme methods have restrictions on the target sequence and can be transferred to tissues and cells. However, there was a problem that it was easily degraded by ribonuclease.
  • pyrrole-imidazole polyamides can specifically recognize DNA base sequences and control the expression of specific genes from outside the cell. Has been reported.
  • Pyrrole imidazole polyamide (hereinafter also referred to as Py-Im polyamide) is a group of synthetic small molecules, and is composed of N-methylpyrrole units (hereinafter also referred to as Py) and N-methylimidazole units (hereinafter also referred to as Im) which are aromatic rings.
  • Py and Im can take a U-shaped conformation in the presence of ⁇ -aminobutyric acid by sequentially coupling and folding.
  • N-methylpyrrole unit (Py), N-methylimidazole unit (Im), ⁇ -alanine ( ⁇ ), and ⁇ -aminobutyric acid unit (also referred to as ⁇ linker) are mutually amide bonds (— C ( ⁇ O) —NH—), and its general structure and production method are known (Patent Documents 2 to 4).
  • Such synthetic polyamides can bind with high affinity and specificity to specific base pairs in the minor groove of the double helix DNA. Specific recognition of base pairs is dependent on one-to-one pairing of Py and Im. That is, in the U-shaped conformation in the minor groove of DNA, Py / Im or ⁇ / Im pair targets CG base pair, and Im / Py or Im / ⁇ targets GC base pair. Py / Py or ⁇ / ⁇ , Py / ⁇ , ⁇ / Py target both AT base pairs and TA base pairs (Non-Patent Documents 2, 3, 4, and 5).
  • a part of the CG base pair is a ⁇ / Im pair
  • a part of the GC base pair is an Im / ⁇ pair
  • a part of the AT and TA base pairs is It may be targeted by a ⁇ / ⁇ pair, a Py / ⁇ pair or a ⁇ / Py pair, respectively.
  • the start of transcription is considered to be an important point of gene regulation. Initiation of transcription requires several processes in which transcription factors that bind to specific recognition sequences in the gene promoter region form a complex and the complex binds to the DNA sequence.
  • the polyamide in the minor groove may interfere with gene regulation by blocking the binding of the transcription factor or its complex if binding to a specific sequence of the transcription factor or complex is important in gene expression. is there. This hypothesis has been proven in vitro and in vivo.
  • the 8-membered Py-Im polyamide bound inside the zinc finger recognition site (TFIIIA binding site) inhibited 5S RNA gene transcription.
  • Human cytomegalovirus (CMV) UL122-mediated early protein 2 (IE86) blocks recruitment of RNA polymerase II to the promoter and represses transcription of its associated gene. Synthetic polyamides can block the inhibition of IE86 and release the expression of its corresponding gene. Polyamides designed by Mapp et al. Act as artificial transcription factors and mediate gene transcription reactions.
  • TATA box binding protein also referred to as TBP
  • this transcription factor binding inhibition was also observed in the polyamide compound designed at a site 10 bases away from the binding sequence. It has been reported that transcription inhibition is recognized even in the polyamide designed around the factor recognition sequence (Non-patent Document 6).
  • the rat MMP9AP1 polyamide shown in the present application is designed to be separated from the 4-base transcription start point from the AP1 binding sequence, it can be easily imagined that binding inhibition to AP1 is brought out.
  • the present inventors specifically bind to specific regions of the promoter of transforming growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ) and matrix metalloprotease 9 (MMP9), thereby transforming growth factor ⁇ and matrix metalloprotease 9 gene. It has been found that pyrrole-imidazole polyamide capable of inhibiting the expression of is effective as a therapeutic agent for ophthalmic diseases for topical use, and has led to the present invention.
  • Py N-methylpyrrole unit
  • Im N-methylimidazole unit
  • TGF human transforming growth factor ⁇
  • -Also referred to as - ⁇ the base sequence of the gene promoter -555 to -528 (SEQ ID NO: 2), the base sequence -427 to -399 (SEQ ID NO: 4) or a part of the base sequence -384 to -355 (SEQ ID NO: 6) or In the minor groove of the double helix region (hereinafter referred to as the target region) including the whole and the complementary strand thereto, it can be folded at the site of the ⁇ -aminobutyric acid unit to take a U-shaped conformation, -Py / Im pairs for G base pairs, Im / Py pairs for GC base pairs, yes for AT and TA base pairs Also Py / Py pair correspond Re, comprising the pyrrole-imidazole polyamide, topical ophthalmic disease therapeutics.
  • the topical ophthalmic disease therapeutic agent according to (1) further comprising a ⁇ -alanine unit.
  • the target region is a base sequence of -544 to -538 (SEQ ID NO: 3), base sequence -416 to -410 (SEQ ID NO: 5) or base sequence of -373 to -366 (SEQ ID NO: 3) of the transforming growth factor ⁇ promoter.
  • the therapeutic agent for topical ophthalmic diseases according to any one of (1) to (6), which is a double helix region comprising a part or all of 7) and a complementary strand thereto.
  • target double helix region
  • target double helix region
  • the ⁇ -aminobutyric acid unit it can be folded into a U-shaped conformation, and for the CG base pair, the Py / Im pair is G Im / Py pair corresponds to -C base pair, and Py / Py pair corresponds to AT base pair and TA base pair.
  • the pyrrole-imidazole polyamide topical ophthalmic disease therapeutics.
  • 18. The topical ophthalmic disease therapeutic agent according to any one of (14) to (16), wherein the ophthalmic disease is an ophthalmic proliferative disease or an inflammatory disease.
  • the target region comprises a part or all of the base sequence ⁇ 2305 to ⁇ 2298 (SEQ ID NO: 26) or ⁇ 2311 to ⁇ 2304 (SEQ ID NO: 9) of the transforming growth factor ⁇ promoter and a complementary strand thereto.
  • the topical ophthalmic disease therapeutic agent according to any one of (14) to (19), which is a heavy helical region.
  • the Py / Im pair is Im / Py pair corresponds to GC base pair, and Py / Py pair corresponds to AT base pair and TA base pair.
  • a therapeutic agent for topical ophthalmic diseases comprising the pyrrole-imidazole polyamide.
  • the topical ophthalmic disease therapeutic agent according to any one of (25) to (27), wherein the ophthalmic disease is an ophthalmic proliferative disease or an inflammatory disease.
  • the target region comprises a part or all of base sequence ⁇ 77 to ⁇ 70 (SEQ ID NO: 12) or base sequence ⁇ 605 to ⁇ 599 (SEQ ID NO: 14) of the transforming growth factor ⁇ promoter and a complementary strand thereto.
  • the Py / Im pair is Im / Py pair corresponds to GC base pair, and Py / Py pair corresponds to AT base pair and TA base pair.
  • a topical ophthalmic disease therapeutic agent comprising the pyrrole-imidazole polyamide.
  • the topical ophthalmic disease therapeutic agent according to any one of (36) to (38), wherein the ophthalmic disease is an ophthalmic proliferative disease or an inflammatory disease.
  • the target region comprises part or all of the base sequence -94 to -87 (SEQ ID NO: 16) or base sequence -591 to -586 (SEQ ID NO: 18) of the matrix metalloproteinase 9 promoter and a complementary strand thereto.
  • the topical ophthalmic disease therapeutic agent according to any one of (36) to (41), which is a double helix region.
  • a therapeutic agent for local ophthalmic diseases for treating trauma due to alkali burn, trauma after corneal surgery, and ophthalmic proliferative diseases or inflammatory diseases.
  • a reagent for basic experiments using this gene can be obtained.
  • the nucleotide sequence of the human TGF- ⁇ promoter region is shown.
  • the rTGF- ⁇ (GBP1201) PIP compound binding site in the rat TGF- ⁇ promoter region is shown.
  • the rTGF- ⁇ (GBP1203) PIP compound binding site in the rat TGF- ⁇ promoter region is shown.
  • the rMMP9AP1PIP compound binding site in the rat MMP-9 promoter region is shown.
  • the rMMP9NF ⁇ BPIP compound binding site in the rat MMP-9 promoter region is shown.
  • the nucleotide sequence of the human MMP-9 promoter region is shown.
  • the hMMP9AP1PIP compound binding site in the human MMP-9 promoter region is shown.
  • the hMMP9NF ⁇ BPIP compound binding site in the human MMP-9 promoter region is shown.
  • a PIP compound (hTGF- ⁇ (GBP1101)) that binds to the human TGF- ⁇ promoter nucleotide sequence -544 to -538 is shown.
  • a PIP compound (hTGF- ⁇ (GBP1105)) that binds to the human TGF- ⁇ promoter nucleotide sequence -416 to -410 is shown.
  • a PIP compound (hTGF- ⁇ (GBP1106)) that binds to the human TGF- ⁇ promoter nucleotide sequence -373 to -366 is shown.
  • a PIP compound (rTGF- ⁇ (GBP1201)) that binds to the rat TGF- ⁇ promoter nucleotide sequence -2311 to -2304 is shown.
  • a PIP compound (rTGF- ⁇ (GBP1203)) that binds to the rat TGF- ⁇ promoter nucleotide sequence -2305 to -2298 is shown.
  • a PIP compound (hMMP9AP1) that binds to the human MMP-9 (AP-1) promoter base sequence -77 to -70 is shown.
  • a PIP compound (hMMP9NF ⁇ B) that binds to the human MMP-9 (NF- ⁇ B) promoter base sequence from -605 to -599 is shown.
  • a PIP compound (rMMP9AP1) that binds to the rat MMP-9 (AP-1) promoter base sequence -94 to -87 is shown.
  • the PIP compound (rMMP9NF ⁇ B) which binds to the rat MMP-9 (NF- ⁇ B) promoter base sequence ⁇ 591 to ⁇ 586 is shown.
  • Figure 3 shows the effect of the PIP compound of the present invention in a rat model after alkaline trauma. The results of evaluation of corneal opacity and ulceration are shown.
  • RTGF- ⁇ 1 (GBP1201) PIP and MMP-9PIP significantly cured corneal opacity and ulceration compared to controls. The results of evaluation of corneal opacity and ulceration are shown.
  • RTGF- ⁇ 1 (GBP1201) PIP significantly cured corneal opacity and ulceration compared to controls. The result of evaluation of the degree of corneal defect is shown. Compared to controls, MMP-9PIP and TGF- ⁇ (GBP1201) PIP significantly healed corneal defects early (about twice as fast). The results of evaluation of corneal opacity and ulceration are shown. RTGF- ⁇ 1 (GBP1201) PIP significantly cured corneal opacity and ulceration compared to controls. The result of the real-time RT-PCR assay for examining the expression level of TGF- ⁇ mRNA by rTGF- ⁇ (GBP1201) is shown.
  • the result of the real-time RT-PCR assay for examining the expression level of MMP-9 mRNA by rTGF- ⁇ 1 (GBP1201) is shown.
  • the result of real-time RT-PCR assay for examining the expression level of TGF- ⁇ mRNA by rTGF- ⁇ 1 (GBP1201) is shown.
  • the result of the real-time RT-PCR assay which investigates the expression level of MMP-9 mRNA by rMMP9AP1 is shown.
  • a PIP compound hereinafter also referred to as rTGF- ⁇ (GBP1201) FITC
  • FITC FITC
  • a mismatched polyamide for the rat TGF- ⁇ promoter nucleotide sequence -2311 to -2304 is shown.
  • a PIP compound (hereinafter also referred to as rMMP9AP1FITC) that binds to the FITC-labeled rat MMP-9 (AP-1) promoter base sequence -94 to -87 is shown.
  • 1 shows the intracorneal distribution of FITC-labeled rat rTGF- ⁇ (GBP1201) PIP compound administered after alkaline trauma at 1 hour, 1 day, 4 days, and 7 days.
  • 1 shows the distribution in the cornea one hour after FITC-labeled rat rTGF- ⁇ (GBP1201) PIP compound administered after alkaline trauma.
  • the result of the immunohistochemical test of the rat eye by rTGF- ⁇ 1 (GBP1201) PIP is shown.
  • 2 shows a TIC (total ion chromatography) chart and an electrospray ionization mass spectrometry spectrum of the PIP compounds hTGF- ⁇ (GBP1105) and (GB1106) of the present invention.
  • 2 shows a TIC (total ion chromatography) chart and an electrospray ionization mass spectrometry spectrum of the PIP compound hTGF- ⁇ (GBP1101) of the present invention.
  • RP-HPLC charts of the PIP compounds rTGF- ⁇ (GBP1201) and rMMP9AP1FITC of the present invention are shown in (a) and (b), respectively.
  • RP-HPLC charts of the PIP compounds rMMP9AP1 and rTGF- ⁇ (GBP1201) FITC of the present invention are shown in (a) and (b), respectively.
  • 2 shows an RP-HPLC chart of the PIP compound rMMPNF ⁇ of the present invention.
  • 2 shows an RP-HPLC chart of the PIP compound hMMP9AP1 of the present invention.
  • 2 shows an RP-HPLC chart of the PIP compound hMMP9NF ⁇ of the present invention.
  • FIG. 2 shows an RP-HPLC chart of the PIP compound rTGF- ⁇ (GBP1201) of the present invention. The results of examining the binding specificity and affinity of rTGF- ⁇ (GBP1201) PIP for target DNA are shown.
  • A shows the result of gel shift assay. Lane 1 shows the results of single-stranded DNA, lane 2 shows the results of double-stranded DNA, and lane 3 shows the results of rTGF- ⁇ (GBP1201) and double-stranded DNA.
  • B shows the results of the BIACORE assay.
  • D) shows the results of an rTGF- ⁇ 1 promoter expression suppression assay in a promoter using a luciferase reporter plasmid obtained by subcloning the promoter region of rTGF- ⁇ 1. Reporter gene expression induced by addition of PMA was suppressed by addition of GBP1201 and GBP1203, but not by mismatched polyamide.
  • the structural formula (a) and the RP-HPLC chart (b) of the PIP compound mismatch polyamide used in the experiment of FIG. 40 of the present invention are shown.
  • 2 shows an RP-HPLC chart of the PIP compound rTGF- ⁇ 1 (GBP1203) of the present invention.
  • the N-methylpyrrole unit, the N-methylimidazole unit, and the ⁇ -aminobutyric acid unit (hereinafter also referred to as ⁇ linker) are linked to each other by an amide bond (—C ( ⁇ O) —NH—).
  • ⁇ linker ⁇ -aminobutyric acid unit
  • the general structure and manufacturing method thereof are known (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
  • pyrrole-imidazole polyamide can be produced by an automatic synthesis method using a solid phase method (solid phase Fmoc method) using Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) (Patent Document 3).
  • solid phase Fmoc method solid phase Fmoc method
  • Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl) Patent Document 3
  • the terminal of pyrrole-imidazole polyamide can be cut out from the solid support as a carboxylic acid residue, so that various functional groups can be introduced into the molecular terminal to produce derivatives of pyrrole-imidazole polyamide.
  • a compound having an alkylating ability for DNA such as duocarmycin, pyrrolobenzodiazepine, bleomycin, enediyne compound, nitrogen mustard, and derivatives thereof can be introduced as necessary.
  • the solid phase Fmoc method is an automatic synthesis method using a commercially available protein (peptide) synthesizer, it is also possible to synthesize conjugates (conjugates) of naturally occurring proteins or non-natural proteins and pyrrole imidazole polyamides.
  • the Fmoc method has milder reaction conditions than the t-BOC method, it is possible to introduce organic compounds other than proteins (including compounds having a functional group unstable under acidic conditions). For example, it is also possible to automatically synthesize a conjugate of pyrrole-imidazole polyamide and DNA or RNA (or their derivatives).
  • a pyrrole-imidazole polyamide having a carboxyl group at the terminal can be synthesized.
  • Specific examples thereof include pyrrole imidazole polyamide having a ⁇ -alanine residue ( ⁇ -aminopropionic acid residue) or a ⁇ -aminobutyric acid residue at the terminal.
  • a pyrrole-imidazole polyamide having a ⁇ -alanine residue or a ⁇ -aminobutyric acid residue at the end is, for example, an aminopyrrole carboxylic acid, aminoimidazole carboxylic acid, ⁇ -alanine or ⁇ -aminobutyric acid, each having an amino group protected with Fmoc.
  • aminopyrrole carboxylic acid examples include, for example, 4-amino-2-pyrrole carboxylic acid, 4-amino-1-methyl-2-pyrrole carboxylic acid, 4-amino-1-ethyl-2-pyrrole carboxylic acid, Examples include 4-amino-1-propyl-2-pyrrole carboxylic acid and 4-amino-1-butyl-2-pyrrole carboxylic acid.
  • aminoimidazole carboxylic acid examples include, for example, 4-amino-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-methyl-2-imidazole carboxylic acid, 4-amino-1-ethyl-2-imidazole carboxylic acid, Examples include 4-amino-1-propyl-2-imidazolecarboxylic acid, 4-amino-1-butyl-2-imidazolecarboxylic acid, and the like.
  • a conjugate of pyrrole imidazole polyamide and FITC fluorescein isothiocyanate
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the resulting conjugate can be used to prove that the pyrrole-imidazole polyamide recognizes a specific DNA sequence.
  • the pyrrole imidazole compound of the present invention is a pyrrole imidazole polyamide containing an N-methylpyrrole unit (Py), an N-methylimidazole unit (Im), and a ⁇ -aminobutyric acid unit, and the base sequence of human transforming growth factor ⁇ - 555 to -528 (SEQ ID NO: 2), -427 to -399 (SEQ ID NO: 4) region, -384 to -355 (SEQ ID NO: 6) region, nucleotide sequence of rat transforming growth factor ⁇ -2316 to -2287 (SEQ ID NO: 25) region, -2322 to -2293 (SEQ ID NO: 8) region, human matrix metalloproteinase 9 base sequence -88 to -59 (SEQ ID NO: 11) region, -616 to -588 (SEQ ID NO: 8) 13), nucleotide sequence of rat matrix metalloprotease 9 -105 to -76 (SEQ ID NO:
  • the pyrrole-imidazole polyamide includes a Py / Py pair corresponding to each of the AT base pair and the TA base pair.
  • the normal DNA helix has two types of grooves.
  • the wide and deep groove is called the main groove (major groove), and the narrow and shallow groove is called the minor groove.
  • the pyrrole-imidazole polyamide can be bonded in a non-conjugated manner with high affinity and specificity to a minor groove formed by a specific base pair.
  • the pyrrole-imidazole polyamide Py / Im or ⁇ / Im pair is connected to the minor groove CG base pair, and the Im / Py or Im / ⁇ pair is connected to the GC base pair.
  • the AT base pair and the TA base pair correspond to Py / Py or ⁇ / ⁇ , Py / ⁇ , and ⁇ / Py pairs, respectively.
  • the molecule is folded at the site of the ⁇ -aminobutyric acid unit in the pyrrole-imidazole polyamide molecule to take a U-shaped conformation.
  • a pyrrole imidazole polyamide in which the minor groove base pair and Py-Im pair do not correspond as described above is referred to as a mismatch or mismatch polyamide in the present application.
  • the nucleotide sequences of the human transforming growth factor ⁇ and the human matrix metalloproteinase 9 gene regulatory region are as shown in FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) and FIG. 6 (SEQ ID NO: 10).
  • Human transforming growth factor ⁇ (GBP1101) (hereinafter also referred to as hTGF- ⁇ (GBP1101)) of the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention has a molecular formula C 84 H 103 N 30 O 16 and a molecular weight of 1788.91. / 2006/018967 is a structure in which a positive charge is added to the polyamide compound in 2006/2006967 to improve the structure of binding to DNA and increasing water solubility.
  • Human transforming growth factor ⁇ (GBP1105) (hereinafter referred to as hTGF- ⁇ (GBP1105) ) and also referred to) is the molecular formula C 76 H 94 N 30 O 15 , a molecular weight of 1667.75, human transforming growth factor beta (GBP1106) (hereinafter, hTGF- ⁇ (GBP1106) also called) molecular formula C 88 H 106 N 34 O 17 , The molecular weight is 192.00.
  • the target sequence of the hTGF- ⁇ gene regulatory region is that GBP1101 is the fat-specific sequence (FSE2) binding region of the region of base sequence -555 to -528 (SEQ ID NO: 2), more specifically- 544 to -538 (SEQ ID NO: 3), and GBP1105 is a region of base sequence -427 to -399 (SEQ ID NO: 4) including the AP1 binding sequence, more specifically, -416 to -410 (SEQ ID NO: 5).
  • GBP1106 is a region of ⁇ 384 to ⁇ 355 (SEQ ID NO: 6) containing the AP1 binding sequence, more specifically ⁇ 373 to ⁇ 366 (SEQ ID NO: 7), and binds to the vicinity of the transcription factor binding site. Suppresses the expression of the TGF- ⁇ 1 gene.
  • the pyrrole-imidazole polyamide hTGF- ⁇ (GBP1101), hTGF- ⁇ (GBP1105), and hTGF- ⁇ (GBP1106) of the present invention are as shown below.
  • the nucleotide sequence of the rat transforming growth factor ⁇ gene regulatory region is as shown in FIGS.
  • the rat pyrrole-imidazole polyamide compound rat transforming growth factor ⁇ (GBP1201) and (GBP1203) (hereinafter also referred to as rTGF- ⁇ (GBP1201) and rTGF- ⁇ (GBP1203)) has the molecular formula C 76 H 93 N 30 O 15 , molecular weight 1666.7 and molecular formula C 78 H 97 N 28 O 15 , molecular weight 1665.8
  • the target sequence of its rTGF- ⁇ gene regulatory region (FIGS.
  • the Rukoto suppresses the expression of rTGF-.beta.1 gene.
  • the pyrrole-imidazole polyamide rTGF- ⁇ (GBP1201) of the present invention is as shown below.
  • the human matrix metalloprotease 9AP1 (hereinafter also referred to as hMMP9AP1) of the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention has a molecular formula C 75 H 93 N 31 O 15 and a molecular weight of 1668.6, and its target sequence is the human matrix metalloprotease 9 gene Among the regions of ⁇ 653 to ⁇ 24 of the regulatory region (SEQ ID NO: 10), it is a region of ⁇ 88 to ⁇ 59 (SEQ ID NO: 11) including the AP1 binding region and the GT box regulatory region, and more specifically, ⁇ 77 By binding to 8 bases of agtcaca (SEQ ID NO: 12) in the region of -70, the expression of the human matrix metalloprotease 9 gene is suppressed.
  • the human matrix metalloprotease 9NF ⁇ (hereinafter also referred to as hMMP9NF ⁇ ) of the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention has a molecular formula C 66 H 84 N 24 O 13 , a molecular weight of 1421.3, and its target sequence is matrix metalloprotease 9 gene regulation Among the regions -653 to -24 of the region (SEQ ID NO: 10), it is a region of -616 to -588 (SEQ ID NO: 13) including the NF ⁇ region, and more specifically, tggaatt of the region of -605 to -599. By binding to 7 bases of (SEQ ID NO: 14), the expression of matrix metalloprotease 9 gene is suppressed.
  • the pyrrole-imidazole polyamide hMMP9AP1 and hMMPNF ⁇ of the present invention are as shown below.
  • the rat matrix metalloproteinase 9AP1 (hereinafter also referred to as rMMP9AP1) of the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention has a molecular formula C 75 H 93 N 31 O 15 and a molecular weight of 1668.74, and its target sequence is the rat matrix metalloprotease 9 gene.
  • the regulatory regions it is a region of ⁇ 105 to ⁇ 76 (SEQ ID NO: 15) including the AP1 binding region and the GT box regulatory region, and more specifically binds to 8 bases of ⁇ 94 to ⁇ 87 (SEQ ID NO: 16). By doing so, the expression of the matrix metalloprotease 9 gene is suppressed.
  • the rat matrix metalloprotease 9NF ⁇ (hereinafter also referred to as rMMP9NF ⁇ ) of the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention has a molecular formula C 66 H 84 N 24 O 13 and a molecular weight of 1421.5, and its target sequence is the rat matrix metalloprotease 9 gene Among the regulatory regions, it is a region of ⁇ 602 to ⁇ 575 (SEQ ID NO: 17) including the NF ⁇ region, and more specifically, by binding to 6 bases of (SEQ ID NO: 18) of the region of ⁇ 591 to ⁇ 586. Inhibits the expression of the matrix metalloproteinase 9 gene.
  • the pyrrole-imidazole polyamide rMMP9AP1 and rMMPNF ⁇ of the present invention are as shown below.
  • rMMP9AP1 rMMP9NF ⁇ Since the matrix metalloproteinase 9 gene sequence is highly conserved in mammals, the rMMP9AP1 and rMMP9NF ⁇ PIP compounds can also be used for humans.
  • ophthalmic proliferative diseases include tumors, proliferative diabetic retinopathy, pterygium, neovascular glaucoma, age-related macular degeneration, corneal neovascularization associated with corneal diseases, etc., but are not limited thereto. It is not a thing.
  • ophthalmic inflammatory diseases include, but are not limited to, keratitis laughing cell infiltration associated with infectious diseases, keratitis, conjunctivitis, allergic diseases, and hay fever.
  • the topical ophthalmic disease therapeutic drug may be any form of ophthalmic disease therapeutic drug such as intravitreal drug, subconjunctival injection, eye drop, ointment and the like, unless otherwise specified.
  • the topical ophthalmic disease therapeutic agent may contain general pharmaceutically acceptable additive components such as diluents and excipients.
  • the present inventors have shown that trauma caused by alkali burn can be treated by administering pyrrole-imidazole polyamide that selectively suppresses transforming growth factor ⁇ and matrix metalloproteinase 9 gene to the eye without using intraocular injection. It was. In conventional pharmacotherapy for intraocular diseases, it is difficult to maintain the effective drug concentration in the cornea because the drug administered by eye drops is washed away by tears, and frequent eye drops must be administered. .
  • the present inventor has shown that the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention is continuously present in corneal cells by administration by eye drops, and heals turbidity in the eye after alkali burn.
  • the measurement of the amount of mRNA in the cornea by RT-PCR also showed that the pyrroleimidazole compound of the present invention passed through the cornea and suppressed the expression of TGF- ⁇ and MMP-9 genes in the cornea.
  • the rat model data presented in this application can be said to show the same effect in the human eye as the effect in the human eye of the same mammal. Therefore, the topical ophthalmic disease therapeutic agent containing the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention can be treated without frequent ophthalmic administration, digestion of the basement membrane, fibroblast infiltration, This is advantageous in that risk can be avoided. Moreover, since it can administer easily irrespective of injection, it is advantageous also in the point that QOL in a patient improves remarkably.
  • the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention since it is known that the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention stays in the nucleus, it is not necessary to administer it several times a day as in the case of normal eye drops. For example, once-a-day ophthalmic administration is sufficient. It produces an advantageous effect to exert its effect. Therefore, the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention is a novel compound that compensates for the drawbacks of the target gene inhibitor in the ophthalmic field, and the effect of selectively suppressing the gene in the eyeball and surrounding tissues is recognized. Treatments for individual diseases that could not be solved by these treatment methods can be easily found by screening for target compounds.
  • the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention can be easily developed as a vitreous administration or a local injection. Furthermore, the pyrrole-imidazole polyamide compound of the present invention can be used as a functional test reagent used for molecular biological research and drug development research in the ophthalmic field due to its gene selective effect.
  • Automated solid phase synthesis includes DMF wash, removal of Fmoc group with 20% piperidine / DMF, methanol wash, 60 min coupling with monomer in the presence of HATU and DIEA (4 equivalents each), methanol wash, as required Consisting of protection with acetic anhydride / pyridine and a final DMF wash.
  • Py-Im polyamides were generally obtained in moderate yields (10-30%).
  • FITC coupling A 4-fold excess of fluorescein (0.40 mmol) and DIEA (without HATU) dissolved in DMF was flushed through the column for 60 minutes.
  • General procedure After removing the Fmoc group of the Fmoc- ⁇ -alanine-Wang resin, the resin was washed successively with methanol. The coupling step was performed with Fmoc amino acid followed by washing with methanol. These steps were repeated many times until the entire sequence was introduced. After completing the coupling step, the N-terminal amino group was protected as necessary or coupled with FITC, washed with DMF, and the reaction vessel was removed.
  • Decomposition as carboxylic acid The synthetic polyamide was isolated after the decomposition step (5 ml of a mixture of 91% TFA-3% / TIS-3% DMS-3% water / resin 0.1 mmol) by cold ethyl ether precipitation.
  • Decomposition as amine The synthetic polyamide was isolated after the decomposition step (5 mL of N, N-dimethylaminopropylamine / 0.1 mmol of resin, 50 ° C. overnight) by cold ethyl ether precipitation.
  • hTGF- ⁇ (GBP1101), hTGF- ⁇ (GBP1105), hTGF- ⁇ (GBP1106), rTGF- ⁇ (GBP1201), rTGF- ⁇ (GBP1203), hMMP9AP1, hMMP9NF ⁇ , rMMP9NF120 ⁇ , rMMP9TNF ⁇ FITC, rTGF- ⁇ (GBP1201) mismatch, rMMP9AP1-FITC, rTGF- ⁇ (GBP1203) mismatch are shown in 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 27, 28 and 29, 41a, respectively. .
  • the RP-HPLC chart of hTGF- ⁇ (GBP1105) and hTGF- ⁇ (GBP1106) is shown in FIG. 33, and the TIC (total ion chromatography) chart and electrospray ionization mass spectrometry spectrum of hTGF- ⁇ (GBP1101) are shown in FIG.
  • hMMP9AP1 37 shows the RP-HPLC chart of hMMP9NF ⁇
  • FIG. 38 shows the RP-HPLC chart of hMMP9NF ⁇
  • FIG. 39 shows the RT-PCR chart of rTGF- ⁇ (GBP1201).
  • FIG. 41 (b) shows an RP-HPLC chart of GF- ⁇ (GBP1203) mismatch
  • FIG. 42 shows an RT-PCR chart of rTGF- ⁇ (GBP1203).
  • the Biacore assay can measure the real-time binding affinity of rTGF- ⁇ (GBP1201) PIP to target DNA.
  • the biotin-labeled oligo DNA was annealed to be double-stranded, and immobilized on a sensor chip SA (Biacore, Uppsala, Sweden) to which streptavidin had been immobilized in advance.
  • the interaction kinetics were examined using the Biacore 2000 system (Biacore, Uppsala, Sweden) for rTGF- ⁇ (GBP1201) PIP, mismatch (FIG. 41 (a)), and biotin-labeled oligo DNA. Data processing was performed according to the protocol recommended by Biacore 2000.
  • antibiotic eye ointment Tarivid ophthalmic ointment 0.3% (Santen Pharmaceutical) was administered daily at 5 pm and two more The rats were administered as a non-alkali burn control, and rats were observed daily at the time of instillation and ophthalmic ointment application, and corneal findings were observed every evening.
  • the cornea can be inspected by using a flowless test paper (Showa Yakuhin Kako) to determine the corneal damage according to the corneal fluorescein test. went. The transparency of the cornea was observed daily with a microscope and observed until complete reepithelialization was observed. When no corneal fluorescent staining was observed, complete re-epithelialization was defined.
  • a flowless test paper Showa Yakuhin Kako
  • Complementary DNA strands by reverse transcription were synthesized by SuperScript TM First-Strandkit (Invitrogen Life Technologies, Corp.).
  • SYBR Premix Ex Taq Kit (Takara Bio) was used for real-time RT-PCR (Thermal cycler Dice Real Time system TP800, Takara Bio Inc., Japan).
  • Primers for TGF- ⁇ 1 are (forward 5′-CCA AGG AGA CGG AAT ACA GG-3 ′, SEQ ID NO: 19; reverse 5′-AGC TGT GCA GGT GTT GAG C-3 ′, SEQ ID NO: 20; 194 bp PCR product).
  • Primers for MMP-9 were (forward, 5′-TTC GAC GCT GAC AAG AAG TG-3 ′, SEQ ID NO: 21; reverse 5′-AGG GGA GTC CTC GTG GTA GT-3 ′, SEQ ID NO: 22; 156 bp PCR product).
  • Primers for GAPDH were (forward, 5′-ACA TCA AAT GGG GTG ATG CT-3 ′, SEQ ID NO: 23; reverse 5′-GTG GTT CAC ACC CAT CAC AA-3 ′, SEQ ID NO: 24; 161 bp PCR Product).
  • Two-Step RT-PCR mixture 25 ⁇ l is, SYBR Premix E X Taq12.5 ⁇ l, each of the forward and reverse primer 0.5 [mu] l, RNase-free water 10.5Myueru, consisting mold CDNA1myueru.
  • Real-time cycle conditions were performed by a reaction system of 95 ° C., 10 seconds, 95 ° C., 5 seconds 60 ° C., and 30 seconds. Quantification of TGF- ⁇ 1 and MMP-9 genes was normalized by comparison with GAPDH expression.
  • the synthesized FITC polyamide was dissolved in a 0.1% acetic acid solution, adjusted to a concentration of 1 ⁇ Mol / L, and 5 ⁇ l was dropped into the center of the cornea 1 hour after induction of trauma to 8 alkaline trauma model rats.
  • Two animals were euthanized 1 hour, 1st day, 4th day, 7th day after FITC polyamide instillation, the eyeballs were removed, and OCT compound (Miles, Elkhart, IN, USA) was placed in a plastic container for frozen section specimens. ), Frozen with liquid nitrogen, and stored in an ultra-low temperature refrigerator at -80 degrees. The frozen section was sliced into 5 ⁇ m and observed with an Olympus fluorescence microscope.
  • FIG. 30A and FIG. 31 show examples in which FITC-labeled rTGF- ⁇ (GBP1201) polyamide is observed for fluorescence one hour after administration, and nuclei of corneal epithelium and corneal stromal cells show green FITC fluorescence.
  • the nuclei of corneal cells appear white on the left in the figure, and appear white due to fluorescent FITC. The left is the same corneal specimen with white light.
  • Intense fluorescence from FITC was observed at the same position as DAPI staining, which was observed in all corneal tissues, corneal epithelial cells, capsule parenchymal cells and epithelial cells. This suggests that in the use of the present invention, the polyamide compound will continue to exhibit a medicinal effect without being spilled into the tears even if the administration frequency is reduced. In fact, this was also demonstrated by the fact that once a day administration was sufficiently effective in the rat alkaline trauma model. As a result, rTGF- ⁇ (GBP1201) penetrated from the damaged capsule epithelial layer into the corneal stroma and epithelial layer, and was distributed in the nucleus of the whole cell. A fluorescent signal was also detected in the anterior chamber. In addition, even after 24 hours, it remained in the nucleus and was at a level detectable in corneal cells (FIG. 30B).
  • TGF- ⁇ 1 TGF- ⁇ 1 protein was expressed even in the cornea that was not damaged, and the expression was detected only in the epithelial layer (FIG. 32, normal). After alkaline trauma, the corneal epithelial layer was destroyed and lost completely. Corneal parenchymal cells were activated and proliferated to repair such defects. On day 1, TGF- ⁇ 1 was strongly expressed in the activated anterior corneal stroma. No immunohistological differences were seen with rTGF- ⁇ (GBP1201) PIP and controls (FIGS. 32A and B). On day 4, strong TGF- ⁇ 1 immune responses were detected in both regenerated epithelial cells of the corneal stroma and proliferated keratocytes (FIG.
  • FIG. 32F showed well regenerated epithelium and corneal stroma, almost the same cornea as normal cells.
  • the control group (FIG. 32E) showed a pronounced cell hyperplasia (presumed to be proliferated corneal and transdifferentiated myofibroblasts) and a strong immune response to TGF- ⁇ 1 in the corneal stroma. .
  • APRE-19 cells human retinal pigment epithelium-derived cells
  • FBS Invitrogen
  • the present invention relates to a topical ophthalmic disease therapeutic agent comprising a DNA sequence-specific binding compound. More specifically, the present invention relates to a topical ophthalmic disease therapeutic agent comprising pyrrole-imidazole polyamide (hereinafter also referred to as PIP) having a specific structure.
  • PIP pyrrole-imidazole polyamide

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Abstract

　本発明はＤＮＡ配列特異的結合化合物による局所用眼科疾患治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる局所用眼科疾患治療薬を提供する。　トランスフォーミング増殖因子β遺伝子及びマトリックスメタロプロテネース９遺伝子を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる局所用眼科疾患治療薬である。

Description

ＤＮＡ配列特異的結合化合物を含む局所用眼科疾患治療薬
　本発明はＤＮＡ配列特異的結合化合物を含む局所用眼科疾患治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド（以下ＰＩＰとも言う）を含んでなる局所用眼科疾患治療薬に関する。
　角膜は、眼の前部に位置する高度に組織された血管の無い透明な組織である。角膜は光を適切に反射するために透明に保たれていなければならない。アルカリバーンによる眼の傷害は、熱傷や酸による外傷に比べ重篤な眼表面疾患であり、予後が非常に悪い。アルカリ物質は組織への深達性が強いため本来透明な角膜に白く濁りを生じるなど、角膜に深刻な臨床的問題を起こす。また、従来の治療により適切に治癒することはほとんど無いため、深刻で永続的な視覚機能障害の原因となりうる。アルカリバーンによる失明は後天的な原因による失明の主因の一つである。
　アルカリバーンにおける角膜実質細胞及び上皮細胞などの角膜細胞の活性化及び単核やマクロファージなどの炎症性細胞の流入はアルカリ組織ダメージ後の角膜傷害の病変形成に関与し、永続的な上皮の欠損につながり得るものである。
　治癒過程の促進及び瘢痕組織の予防は、角膜損傷後の二つの重要な臨床的考慮事項であるが、アルカリバーン後の角膜に生じる組織破壊や後期瘢痕に多くの成長因子やサイトカインが関与すると考えられている。
　また、視力矯正等のために行われる角膜手術（例えばレーシック等）後や感染症による炎症発生後においても、角膜が白濁するといった傷害が起こることがある。このような角膜手術後の外傷などの炎症の治癒過程も、アルカリバーンによる外傷と同様の成長因子やサイトカインが関与すると考えられている。
　アルカリバーン後に分泌されるトランスフォーミング増殖因子β（以下「ＴＧＦ－β」とも言う）により、創傷治癒過程が誘導され、ＴＧＦ－βの刺激により、マトリックスメタロプロテアーゼ（以下「ＭＭＰ」とも言う）が分泌され、基底膜の分解、さらに繊維芽細胞の誘導、血管の新生といった感染症や外部刺激への防御メカニズムを促す。角膜の基底膜の崩壊は角膜実質の潰瘍化又は穿孔の発症に貢献するとともに角膜上皮の再生を妨げると考えられる。角膜縁幹細胞の損失による不透明化を伴う角膜表面の結膜化と角膜実質の血管新生の全てが、後期治癒過程の患者の視野の機能障害を引き起こす（非特許文献１）。また近年の抗生物質等による感染がコントロールされる臨床現場を前提とすれば、基底膜が分解されないこと、細胞浸潤・血管新生が起こらないことのほうが創傷治癒において利点が多いと考えられる。
　また、ＴＧＦ－βは、角膜上皮細胞及び角膜実質細胞の移動を促進するだけでなく、単核及びマクロファージの走化性を促進し、及び角膜実質細胞を筋繊維芽細胞への分化を誘導することが示されている。熱傷等の外部刺激や感染症により炎症反応を起こした角膜におけるＴＧＦ－βおよびその下流のＭＭＰ９の過剰発現は、ＴＧＦ－βが一部分において、局所的な血管新生及び炎症にそれぞれ関与すると考えられている、血管内皮成長因子（以下「ＶＥＧＦ」とも言う）及び単球マクロファージ走化性タンパク質―１（以下「ＭＣＰ－１」とも言う）等の他のサイトカイン類の発現を有することから、傷害組織のダメージを悪化させる。
　更に、アルカリバーンによる外傷のみならず、腫瘍、増殖糖尿病網膜症、翼状片、血管新生緑内障、加齢黄班変性症、角膜疾患に合併する角膜血管新生などの眼科増殖性疾患は、眼科領域の組織増殖性疾患として知られている。特に高齢化に伴い、異常血管新生や繊維化形成を伴う疾患は眼科領域で近年増加傾向にあり、視力低下や失明の危険性が高く、外科的手術を必要とし易再発性であるなど特に問題となっている症候群である。炎症性疾患においても同様の細胞浸潤、血管新生が見られることより、感染症、角膜炎、結膜炎、アレルギー性疾患、花粉症、に合併する角膜炎笑細胞浸潤などにおいても同様の発症機序が考えられる。このような症候群においても、アルカリバーンによる外傷の治癒過程と同様の成長因子やサイトカイン関与があると考えられている。
　視覚障害を起こすケースでは、多くの場合、角膜上皮幹細胞を含む角膜縁上皮の自家移植片又は同種移植片の外科的移植が行われる。このような移植は両目をアルカリによって傷害したケースなどの緊急性の高いケースにおいて有効に行われるが、長期にわたる薬剤による免疫抑制が必要であるため潜在的に感染のリスクが増加し、他の望ましくない副作用を生ずるとともに移植そのものも困難となる重篤な症例が特にアルカリ外傷で多い。さらに多くの角膜移植の適応がある待機視覚障害者が存在し、現実的には６ケ月以上待たないと角膜移植が受けられない患者が良好なアイバンクにおいても３分の１に達する、また全国のアイバンクの調査（平成１６年）では、３年以上移植を待たなければならないという結果が出ている現実もある。
　眼内疾患の薬物療法においては、医薬品の有効成分を眼内の標的組織へ効率よく送り込むドラッグデリバリーシステム（以下「ＤＤＳ」とも言う）が必要である。点眼で投与した薬剤はたいていの場合、角膜を通して十分には浸透しない。滴下した薬剤は涙液と一緒に流れてしまうか、結膜を通って体内に吸収されてしまう。点眼で投与された薬剤のうち角膜に浸透して眼組織に到達するのは、約５％のみに過ぎず、残りの９５％は涙の排出によって失われる。このため、通常の薬剤では頻回（数時間毎）の投与が必要になるが、睡眠中の点眼は現実的に不可能であり、持続時間の長い点眼剤の開発が必要である。
　加齢黄班変性症の治療方法としては既にＶＧＥＦ阻害剤によるアプタマー治療薬が存在する。しかしながら、上記ドラックデリバリーの問題から、このような薬剤は硝子体内投与により頻回に眼内に注射して投与することが必要であるため投与が容易でなく、頻繁に投与する必要があるほど眼内注射により感染症に罹患する危険も上昇するといった欠点を有する。静脈投与による場合は、全身投与となるため、眼内での薬剤濃度を保つために全身への影響も強くなり、副作用等が懸念される。従って、頻回に投与する必要がない局所用眼科疾患治療薬の開発も必要とされている。
　ピロールイミダゾールポリアミドは抗生物質であるｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ－Ａとｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ－ＡがＤＮＡを塩基特異的に認識することを基に、Ｄｅｒｖａｎらにより見出された化学合成物質である（特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。ＰＩポリアミドは二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造のマイナーグルーブに結合することから、標的遺伝子の発現を特異的に制御する事が可能である（非特許文献３）。また、ＰＩポリアミドは、これまでの遺伝子発現制御薬であるアンチセンス・リボザイム・ｓｉＲＮＡ等と異なり、生体内において核酸分解酵素によって分解されず、核酸への結合能が高いことから、新規の分子標的治療薬として、抗癌剤等への臨床応用が期待されるところであるが、眼科疾患への適応、点眼、眼球内での薬剤としての動態に関しては検討されていない。
　逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、癌、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、相同組換えは組換え効率が一般に低く一部の細胞でしか効果がみられない、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。
　一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。
　ピロールイミダゾールポリアミド（以下Ｐｙ－Ｉｍポリアミドとも言う）は一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）及びＮ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）から構成されている（特許文献１、非特許文献１）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ－アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを採ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ－メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）、βアラニン(β)及びγ－アミノ酪酸単位（γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献２～４）。
　このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍもしくはβ／Ｉｍ対はＣ－Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／ＰｙもしくはＩｍ／βはＧ－Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／Ｐｙもしくはβ／β、Ｐｙ／β、β／ＰｙはＡ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献２，３，４，５）。最近の研究によれば、Ａ－Ｔ対及びＴ－Ａ対に対するＰｙ－Ｉｍポリアミド化合物の非選択性の問題は、Ｐｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３－ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果として得られるＨｐ／Ｐｙ対が優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている。
　また好ましくは、Ｃ－Ｇ塩基対の一部がβ／Ｉｍ対によって、Ｇ－Ｃ塩基対の一部がＩｍ／β対によって、そしてＡ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対の一部がβ／β対、Ｐｙ／β対又はβ／Ｐｙ対によって、それぞれ標的とされてもよい。
　一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモーター領域において特異的な認識配列に結合する転写因子が複合体を形成し、その複合体がＤＮＡ配列と結合するいくつかの過程を必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子もしくは、複合体の特定配列への結合が遺伝子発現において重要であれば、転写因子もしくはその複合体の結合を遮断して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏで証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ－Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）プロモーター中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ－１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ－１配列、及びＥＴＳ－１配列が包含される。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモーターにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する。さらに、この転写因子の結合阻害はＴＡＴＡボックスに対するＴＡＴＡ　ｂｏｘ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰとも言う）の結合阻害実験において、結合配列より１０塩基はなれた部位に設計されたポリアミド化合物においても競争阻害が認められ、転写因子認識配列の周囲に設計したポリアミドでも転写阻害が認められることが報告されている（非特許文献６）。さらに本願で示すラットＭＭＰ９ＡＰ１ポリアミドはＡＰ１結合配列よりも４塩基転写開始点よりに離れて設計されているがＡＰ１に対する結合阻害が引き出されることが容易に想像できる。
ＷＯ９８／４９１４２　Ａ１ 特許第３０４５７０６号 特開２００１－１３６９７４ ＷＯ０３／０００６８３　Ａ１ ＷＯ／２００６／０１８９６７　Ａ１
Saika S. et al. American Journal of Pathology 2005;166(5)1405-1418. Sugiyama et al: Proc Natl Acad Sci U S A. 1996; 93: 14405-144410. Dervan: Bioorg Med. Chem. 2001;9: 215-35. Trauger J.W. et al: Nature 1996;382:559-561. White S. et al: Chem Biol 1997;4:569-578. Ehley J.A.et al. Mol Cell Biol 2002; 22(6) 1723-1733.
　これまで、アルカリバーンによる外傷及び角膜手術後の外傷を治療するための、眼内注射投与によらない点眼等の局所用眼科疾患治療薬は報告されていない。更に、頻回投与の必要がない眼科増殖性疾患を治療するための局所用眼科疾患治療薬は報告されていない。
　従って、アルカリバーンによる外傷、角膜手術後の外傷及び眼科増殖性疾患を治療するための局所用眼科疾患治療薬が求められている。
　本発明者らは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）及びマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）のプロモーターの特定の領域に特異的に結合することにより、トランスフォーミング増殖因子β及びマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドが局所用眼科疾患治療薬として有効に作用することを見出し、本発明をなすに至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
　（１）Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（以下ＴＧＦ－βとも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列－５５５～－５２８（配列番号２）、塩基配列－４２７～－３９９（配列番号４）又は塩基配列－３８４～－３５５（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
　（２）更にβアラニン単位を含む（１）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（３）更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む（１）又は（２）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（４）眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である（１）～（３）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（５）眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である（１）～（３）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（６）点眼剤の形態である、（１）～（５）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（７）前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列－５４４～－５３８（配列番号３）、塩基配列－４１６～－４１０（配列番号５）又は塩基配列－３７３～－３６６（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）～（６）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（８）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）～（７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　（９）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）～（７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　（１０）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）～（７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　（１１）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
　（１２）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　（１３）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
　（１４）Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ラットトランスフォーミング増殖因子β（以下ＴＧＦ－βとも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列－２３１６～－２２８７（配列番号２５）又は－２３２２～－２２９３（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
　（１５）更にβアラニン単位を含む（１４）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（１６）更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む（１４）又は（１５）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（１７）眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である（１４）～（１６）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（１８）眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である（１４）～（１６）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（１９）点眼剤の形態である、（１４）～（１８）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（２０）前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列－２３０５～－２２９８（配列番号２６）又は－２３１１～－２３０４（配列番号９）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１４）～（１９）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（２１）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１４）～（２０）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
　（２２）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表わされる（１４）～（２０）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　（２３）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　（２４）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　（２５）Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９（以下ｈＭＭＰ－９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列－８８～－５９（配列番号１１）又は塩基配列－６１６～－５８８（配列番号１３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
　（２６）更にβアラニン単位を含む（２５）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（２７）更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む（２５）又は（２６）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（２８）眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である（２５）～（２７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（２９）眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である（２５）～（２７）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（３０）点眼剤の形態である、（２５）～（２９）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（３１）前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列－７７～－７０（配列番号１２）又は塩基配列－６０５～－５９９（配列番号１４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（２５）～（３０）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（３２）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（２５）～（３１）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　（３３）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（２５）～（３１）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
　（３４）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
　（３５）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
　（３６）Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ラットマトリックスメタロプロテアーゼ９（以下ｒＭＭＰ－９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列－１０５～－７６（配列番号１５）又は塩基配列－６０２～－５７５（配列番号１７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
　（３７）更にβアラニン単位を含む（３６）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（３８）更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む（３６）又は（３７）に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（３９）眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である（３６）～（３８）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（４０）眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である（３６）～（３８）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（４１）点眼剤の形態である、（３６）～（４０）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（４２）前記標的領域がマトリックスメタロプロテアーゼ９プロモーターの塩基配列－９４～－８７（配列番号１６）又は塩基配列－５９１～－５８６（配列番号１８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（３６）～（４１）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
　（４３）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（３６）～（４２）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
　（４４）前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（３６）～（４２）のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　（４５）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　（４６）下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　本発明によれば、アルカリバーンによる外傷、角膜手術後の外傷及び眼科増殖性疾患又は炎症性疾患を治療するための局所性眼科疾患治療薬を得ることができる。また、本発明によれば、この遺伝子を用いた基礎実験の試薬を得ることができる。
ヒトＴＧＦ－βプロモーター領域の塩基配列を示す。 ラットＴＧＦ－βプロモーター領域におけるｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物結合部位を示す。 ラットＴＧＦ－βプロモーター領域におけるｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０３）ＰＩＰ化合物結合部位を示す。 ラットＭＭＰ－９プロモーター領域におけるｒＭＭＰ９ＡＰ１ＰＩＰ化合物結合部位を示す。 ラットＭＭＰ－９プロモーター領域におけるｒＭＭＰ９ＮＦκＢＰＩＰ化合物結合部位を示す。 ヒトＭＭＰ－９プロモーター領域の塩基配列を示す。 ヒトＭＭＰ－９プロモーター領域におけるｈＭＭＰ９ＡＰ１ＰＩＰ化合物結合部位を示す。 ヒトＭＭＰ－９プロモーター領域におけるｈＭＭＰ９ＮＦκＢＰＩＰ化合物結合部位を示す。 ヒトＴＧＦ－βプロモーター塩基配列－５４４～－５３８に結合するＰＩＰ化合物（ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０１））を示す。 ヒトＴＧＦ－βプロモーター塩基配列－４１６～－４１０に結合するＰＩＰ化合物（ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５））を示す。 ヒトＴＧＦ－βプロモーター塩基配列－３７３～－３６６に結合するＰＩＰ化合物（ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１1０６））を示す。 ラットＴＧＦ－βプロモーター塩基配列－２３１１～－２３０４に結合するＰＩＰ化合物（ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１））を示す。 ラットＴＧＦ－βプロモーター塩基配列－２３０５～－２２９８に結合するＰＩＰ化合物（ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０３））を示す。 ヒトＭＭＰ－９（ＡＰ－１)プロモーター塩基配列－７７～－７０に結合するＰＩＰ化合物（ｈＭＭＰ９ＡＰ１）を示す。 ヒトＭＭＰ－９（ＮＦ－κＢ）プロモーター塩基配列－６０５～－５９９に結合するＰＩＰ化合物（ｈＭＭＰ９ＮＦκＢ）を示す。 ラットＭＭＰ－９（ＡＰ－１)プロモーター塩基配列－９４～－８７に結合するＰＩＰ化合物（ｒＭＭＰ９ＡＰ１）を示す。 ラットＭＭＰ－９（ＮＦ－κＢ）プロモーター塩基配列－５９１～－５８６に結合するＰＩＰ化合物（ｒＭＭＰ９ＮＦκＢ）を示す。 アルカリ外傷後におけるラットモデルによる本発明のＰＩＰ化合物の効果を示す。 角膜の不透明度及び潰瘍化の評価の結果を示す。対照と比較してｒＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ及びＭＭＰ－９ＰＩＰは、有意に角膜の不透明度及び潰瘍化を治癒した。 角膜の不透明度及び潰瘍化の評価の結果を示す。対照と比較してｒＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、有意に角膜の不透明度及び潰瘍化を治癒した。 角膜欠損の程度の評価の結果を示す。対照と比較してＭＭＰ－９ＰＩＰ及びＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、有意に角膜欠損を早期（約２倍の速さ）に治癒した。 角膜の不透明度及び潰瘍化の評価の結果を示す。対照と比較してｒＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、有意に角膜の不透明度及び潰瘍化を治癒した。 ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）によるＴＧＦ－βｍＲＮＡの発現量を調べるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイの結果を示す。 ｒＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１２０１）によるＭＭＰ－９ｍＲＮＡの発現量を調べるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイの結果を示す。 ｒＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１２０１）によるＴＧＦ－βｍＲＮＡの発現量を調べるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイの結果を示す。 ｒＭＭＰ９ＡＰ１によるＭＭＰ－９ｍＲＮＡの発現量を調べるリアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイの結果を示す。 ＦＩＴＣ標識したラットＴＧＦ－βプロモーター塩基配列－２３１１～－２３０４に結合するＰＩＰ化合物（以下、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＦＩＴＣとも言う）を示す。 ラットＴＧＦ－βプロモーター塩基配列－２３１１～－２３０４に対するミスマッチポリアミドを示す。 ＦＩＴＣ標識したラットＭＭＰ－９（ＡＰ－１)プロモーター塩基配列－９４～－８７に結合するＰＩＰ化合物（以下、ｒＭＭＰ９ＡＰ１ＦＩＴＣとも言う）を示す。 アルカリ外傷後に投与したＦＩＴＣ標識ラットｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物の一時間、１日、４日、及び７日目の角膜内分布を示す。 アルカリ外傷後に投与したＦＩＴＣ標識ラットｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物の一時間後の角膜内分布を示す。 ｒＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰによるラット眼の免疫組織化学試験の結果を示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）及び（ＧＢ１１０６）のＴＩＣ（ｔｏｔａｌ　ｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｍ）チャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０１）のＴＩＣ（ｔｏｔａｌ　ｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｍ）チャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）及びｒＭＭＰ９ＡＰ１ＦＩＴＣのＲＰ－ＨＰＬＣチャートをそれぞれ（ａ）及び（ｂ）に示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｒＭＭＰ９ＡＰ１及びｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＦＩＴＣのＲＰ－ＨＰＬＣチャートをそれぞれ（ａ）及び（ｂ）に示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｒＭＭＰＮＦκβのＲＰ－ＨＰＬＣチャートを示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｈＭＭＰ９ＡＰ１のＲＰ－ＨＰＬＣチャートを示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｈＭＭＰ９ＮＦκβのＲＰ－ＨＰＬＣチャートを示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）のＲＰ－ＨＰＬＣチャートを示す。 標的ＤＮＡに対する、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰの結合特異性及び親和性を調べた結果を示す。（Ａ）はゲルシフトアッセイの結果を示す。レーン１は一本鎖ＤＮＡ、レーン２は二本鎖ＤＮＡ、レーン３はｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）と二本鎖ＤＮＡの結果を示す。（Ｂ）は、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイの結果を示す。グラフでは、下から、０ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、及び３００ｎＭの濃度のｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）の結果を示す。（Ｃ）は、ＢＩＡＣＯＲＥアッセイの結果を示す。グラフでは、下から、０ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、及び３００ｎＭの濃度のミスマッチポリアミドの結果を示す。Ｄ）ｒＴＧＦ－β１のプロモータ領域をサブクローンしたルシフェレースリポータプラスミドを用いたプロモータにおけるｒＴＧＦ－β１プロモータ発現抑制アッセイの結果をを示す。ＰＭＡの添加により誘導されるリポータ遺伝子発現が、ＧＢＰ１２０１およびＧＢＰ１２０３の添加で抑制され、ミスマッチポリアミドでは抑制されなかった。 本発明の図４０の実験に使用したＰＩＰ化合物ミスマッチポリアミドの構造式（ａ）とＲＰ－ＨＰＬＣチャート（ｂ）の結果を示す。 本発明のＰＩＰ化合物ｒＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１２０３）のＲＰ－ＨＰＬＣチャートを示す。 本発明のＦＩＴＣ標識ヒトｈＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１１０５）ＰＩＰ化合物のヒト網膜上皮細胞ＡＰＲＥ－１９における添加３０分、２時間、６時間後の細胞内分布(核内)局在を示す。
　本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ－メチルピロール単位、Ｎ－メチルイミダゾール単位及びγ－アミノ酪酸単位（以下γリンカーとも言う）は互いにアミド結合（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１～３参照）。
　例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９－フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ－ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
　上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ－アラニン残基（β－アミノプロピオン酸残基）やγ－アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ－アラニン残基又はγ－アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β－アラニン又はγ－アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
　アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４－アミノ－２－ピロールカルボン酸、４－アミノ－１－メチル－２－ピロールカルボン酸、４－アミノ－１－エチル－２－ピロールカルボン酸、４－アミノ－１－プロピル－２－ピロールカルボン酸、４－アミノ－１－ブチル－２－ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４－アミノ－２－イミダゾールカルボン酸、４－アミノ－１－メチル－２－イミダゾールカルボン酸、４－アミノ－１－エチル－２－イミダゾールカルボン酸、４－アミノ－１－プロピル－２－イミダゾールカルボン酸、４－アミノ－１－ブチル－２－イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
　固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
　本発明のピロールイミダゾール化合物は、Ｎ－メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング増殖因子βの塩基配列－５５５～－５２８（配列番号２）、－４２７～－３９９（配列番号４）の領域、－３８４～－３５５（配列番号６）の領域、ラットトランスフォーミング増殖因子βの塩基配列－２３１６～－２２８７（配列番号２５）の領域、－２３２２～－２２９３（配列番号８）の領域、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９の塩基配列－８８～－５９（配列番号１１）の領域、－６１６～－５８８（配列番号１３）の領域、ラットマトリックスメタロプロテアーゼ９の塩基配列－１０５～－７６（配列番号１５）の領域、及び－６０２～－５７５（配列番号１７）の領域の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
　通常ＤＮＡの螺旋の骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ－Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍもしくはβ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／ＰｙもしくはＩｍ／β対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙもしくはβ／β、Ｐｙ／β、β／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ－アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
　副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ－Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
　ヒトトランスフォーミング増殖因子β及びヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域の塩基配列は図１（配列番号１）及び図６（配列番号１０）に示す通りである。
　本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のヒトトランスフォーミング増殖因子β（ＧＢＰ１１０１）（以下、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０１）とも言う）は分子式Ｃ８４Ｈ１０３Ｎ３０Ｏ１６、分子量１７８８．９１であり、特許文献５ＷＯ／２００６／０１８９６７におけるポリアミド化合物にＤｐを付加することで正電荷をくわえＤＮＡへの結合と水溶性を増す構造に改良したものでヒトトランスフォーミング増殖因子β（ＧＢＰ１１０５）（以下、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）とも言う）は、分子式Ｃ７６Ｈ９４Ｎ３０Ｏ１５、分子量１６６７．７５であり、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（ＧＢＰ１１０６）（以下、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０６）とも言う）は分子式Ｃ８８Ｈ１０6Ｎ３４Ｏ１７、分子量１９１２．００である。そのｈＴＧＦ－β遺伝子調節領域（配列番号１）の標的配列はＧＢＰ１１０１が、塩基配列－５５５～－５２８（配列番号２）の領域の脂肪特異性配列（ＦＳＥ２）結合領域、より具体的には－５４４～－５３８（配列番号３）であり、ＧＢＰ１１０５がＡＰ１結合配列を含む塩基配列－４２７～－３９９（配列番号４）の領域、より具体的には－４１６～－４１０（配列番号５）であり、ＧＢＰ１１０６がＡＰ１結合配列を含む－３８４～－３５５（配列番号６）の領域、より具体的には－３７３～－３６６（配列番号７）であり、転写因子結合部位付近に結合することにより、ＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制する。
　本発明のピロールイミダゾールポリアミドｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０１）、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０６）は下記に示す通りである。
ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　ラットトランスフォーミング増殖因子β遺伝子調節領域の塩基配列は図２及び図３に示す通りである。
　本発明の（ピロールイミダゾールポリアミド化合物のラットトランスフォーミング増殖因子β（ＧＢＰ１２０１）及び（ＧＢＰ１２０３）（以下、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）及びｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０３）とも言う）は、分子式Ｃ７６Ｈ９３Ｎ３０Ｏ１５、分子量１６６６．７及び分子式Ｃ７８Ｈ９７Ｎ２８Ｏ１５、分子量１６６５．８である。そのｒＴＧＦ－β遺伝子調節領域（図２及び図３）の標的配列はそれぞれ、ＡＰ１結合配列を含む塩基配列－２３２２～－２２９３（配列番号８）の領域、より具体的には－２３１１～－２３０４（配列番号９）であり、又は、－２３１６～－２２８７（配列番号２５）の領域、より具体的には－２３０５～－２２９８（配列番号２６）であり、転写因子結合部位付近に結合することにより、ｒＴＧＦ－β１遺伝子の発現を抑制する。
　本発明のピロールイミダゾールポリアミドｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）は下記に示す通りである。
ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９ＡＰ１（以下、ｈＭＭＰ９ＡＰ1とも言う）は、分子式Ｃ７５Ｈ９３Ｎ３１Ｏ１５、分子量１６６８．６を有し、その標的配列はヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域（配列番号１０）の－６５３～－２４の領域のうち、ＡＰ１結合領域およびＧＴ　ｂｏｘ　調節領域を含む－８８～－５９（配列番号１１）の領域であり、より具体的には－７７～－７０の領域のａｇｔｃａｇｃａ（配列番号１２）の８塩基に結合することにより、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を抑制する。
　本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９ＮＦκβ（以下、ｈＭＭＰ９ＮＦκβとも言う）は、分子式Ｃ６６Ｈ８４Ｎ２４Ｏ１３、分子量１４２１．３を有し、その標的配列はマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域（配列番号１０）の－６５３～－２４の領域のうち、ＮＦκβ領域を含む－６１６～－５８８（配列番号１３）の領域であり、より具体的には－６０５～－５９９の領域のｔｇｇａａｔｔ（配列番号１４）の７塩基に結合することにより、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を抑制する。
　本発明のピロールイミダゾールポリアミドｈＭＭＰ９ＡＰ１及びｈＭＭＰＮＦκβは下記に示す通りである。
ｈＭＭＰ９ＡＰ１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
ｈＭＭＰ９ＮＦκβ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のラットマトリックスメタロプロテアーゼ９ＡＰ１（以下、ｒＭＭＰ９ＡＰ1とも言う）は、分子式Ｃ７５Ｈ９３Ｎ３１Ｏ１５、分子量１６６８．７４を有し、その標的配列はラットマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域のうち、ＡＰ１結合領域及びＧＴ　ｂｏｘ調節領域を含む－１０５～－７６（配列番号１５）の領域であり、より具体的には－９４～－８７（配列番号１６）の８塩基に結合することにより、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を抑制する。
　本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物のラットマトリックスメタロプロテアーゼ９ＮＦκβ（以下、ｒＭＭＰ９ＮＦκβとも言う）は、分子式Ｃ６６Ｈ８４Ｎ２４Ｏ１３、分子量１４２１．５を有し、その標的配列はラットマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子調節領域のうち、ＮＦκβ領域を含む－６０２～－５７５（配列番号１７）の領域であり、より具体的には－５９１～－５８６の領域の（配列番号１８）の６塩基に結合することにより、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の発現を抑制する。
　本発明のピロールイミダゾールポリアミドｒＭＭＰ９ＡＰ１及びｒＭＭＰＮＦκβは下記に示す通りである。
ｒＭＭＰ９ＡＰ1
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
ｒＭＭＰ９ＮＦκβ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　なお、マトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子配列は哺乳類において高度に保存されているため、ｒＭＭＰ９ＡＰ１及びｒＭＭＰ９ＮＦκβＰＩＰ化合物はヒトに対しても使用することができる。
　本発明において、眼科増殖性疾患とは、腫瘍、増殖糖尿病網膜症、翼状片、血管新生緑内障、加齢黄班変性症、角膜疾患に合併する角膜血管新生などを示すが、これらに限定されるものではない。
　本発明において、眼科炎症性疾患とは、感染症、角膜炎、結膜炎、アレルギー性疾患、花粉症、に合併する角膜炎笑細胞浸潤などを示すが、これらに限定されるものではない。
　本発明において、局所用眼科疾患治療薬は、特に限定しない限り、硝子体内投与薬、結膜下注射薬、点眼剤、軟膏剤等の眼科疾患治療薬のいかなる形態の剤形であってよい。
　本発明において、局所用眼科疾患治療薬には、希釈剤、賦形剤等の一般的な薬学的に許容可能な添加成分を含んでもよい。
　本発明者らは、トランスフォーミング増殖因子β及びマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子を選択的に抑制するピロールイミダゾールポリアミドを眼内注射によらないで眼に投与することにより、アルカリバーンによる外傷を治療できることを示した。
　従来の眼内疾患の薬物療法においては、点眼で投与した薬剤が涙液により、洗い流され有効薬剤濃度を持続的に角膜で維持することは困難であるため、頻回の点眼投与が必要である。本発明者は、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物が、点眼による投与により持続的に角膜細胞内に存在し、アルカリバーン後の眼中の濁りを治癒することを示した。
　また、ＲＴ－ＰＣＲによる角膜におけるｍＲＮＡ量の測定においても、本発明のピロールイミダゾール化合物は角膜を通過して角膜中のＴＧＦ－β及びＭＭＰ－９遺伝子の発現を抑制したことが示された。
　本願が示したラットモデルによるデータは、同じ哺乳類であるヒトの眼内における効果として、ヒトの眼内においても同様の効果を示すといえる。
　従って、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物を含む局所用眼科疾患治療薬は、頻回の点眼投与をすることなく治療が可能となり、薬効濃度の低下による、基底膜の消化、繊維芽細胞の浸潤、リスクを回避できる点で有利である。また、注射によらず容易に投与できることからも患者におけるＱＯＬが著しく向上する点においても有利である。
　更に、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物は核内にとどまることが分かっているため、通常の点眼薬のように一日に何度も投与する必要が無く、例えば一日一回の点眼投与で十分効果を発揮するため有利な効果を奏する。
　従って、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物は、眼科領域で標的遺伝子の阻害剤の欠点を補う新規化合物であり、眼球内及び周囲組織で遺伝子の抑制を選択的に行う効果が認められることより、従来の治療法で解決できなかった個々の疾患に対する治療を標的化合物のスクリーニングにより簡易的に発見できる。
　また、硝子体投与薬や局所注射薬による投与による治療を必要とする眼科疾患治療薬としても、上記のように本発明のＰＩＰ化合物が細胞中の核内にとどまることから頻回の投与が必要ではなくなり、頻回の眼内投与により惹起される感染症への罹患の危険率も低下する。また、静脈投与の場合の全身への高い薬剤濃度を保つことによる副作用も防ぐことができる。従って、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物は、硝子体投与や局所注射薬としても開発を容易にするものである。
　更に、本発明のピロールイミダゾールポリアミド化合物は、その遺伝子選択的効果により、眼科領域における分子生物学的研究や薬剤開発研究に使用する機能検査試薬としても使用しうる。
１．プロモーターに対応するＰｙ－Ｉｍポリアミドの合成
（１）ヒト及びラットトランスフォーミング増殖因子β遺伝子、並びにヒト及びラットマトリックスメタロプロテアーゼ９遺伝子の転写制御部位に対応するＰｙ－Ｉｍポリアミドの設計
　Ｉ．材料及び方法
　Ｐｙ－Ｉｍポリアミドとして、上記の本発明に係るＰＩＰ化合物を設計した。
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ－Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
　ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ－β－アラニン－ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、メタノール洗浄、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ－Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０－３０％）で得られた。
　ＦＩＴＣカップリング：４倍過剰のフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（ＨＡＴＵなし）をＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
　一般的手順：　Ｆｍｏｃ－β－アラニン－Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をメタノールで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでメタノールでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。
　カルボン酸としての分解：合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ－３％／ＴＩＳ－３％ＤＭＳ－３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。
　アミンとしての分解：　合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ、Ｎ－ジメチルアミノプロピルアミン５ｍＬ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。
　精製：　最終精製は、１０ｍＬ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＴＦＡ／水又は０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（アセトニトリル）の直線勾配を用いて、３５０ｎｍのＵＶ検出、又は、１ｍＬ／ｍｉｎの流速の分析用ＲＰ－ＨＰＬＣで緩衝液Ａ（０．１％ＡｃＯＨ／水）中Ｂ（ＭｅＣＮ）の直線勾配を用いて、２５４ｎｍのＵＶ検出により行った。ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０１）、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０６）、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０３）、ｈＭＭＰ９ＡＰ1、ｈＭＭＰ９ＮＦκβ、ｒＭＭＰ９ＡＰ1、ｒＭＭＰ９ＮＦκβ、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）－ＦＩＴＣ、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ミスマッチ、ｒＭＭＰ９ＡＰ1-ＦＩＴＣ、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０３）ミスマッチをそれぞれ９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２７、２８及び２９、４１ａに示す。また、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）及びｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０６）のＲＰ－ＨＰＬＣチャートは図３３に、ｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０１）のＴＩＣ（ｔｏｔａｌ　ｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｇｒａｍ）チャートとエレクトロスプレーイオン化質量分析スペクトルを図３４に、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）及びｒＭＭＰ９ＡＰ１ＦＩＴＣのＲＰ－ＨＰＬＣチャートを図３５ａに、ｒＭＭＰ９ＡＰ１及びｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＦＩＴＣのＲＰ－ＨＰＬＣチャートを図３５ｂに、ｒＭＭＰＮＦκβのＲＰ－ＨＰＬＣチャートを図３６に、ｈＭＭＰ９ＡＰ１のＲＰ－ＨＰＬＣチャートを図３７に、ｈＭＭＰ９ＮＦκβのＲＰ－ＨＰＬＣチャートを図３８に、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）のＲＴ－ＰＣＲのチャートを図３９に、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０３）ミスマッチのＲＰ－ＨＰＬＣチャートを図４１（ｂ）に、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０３）のＲＴ－ＰＣＲのチャートを図４２にそれぞれ示す。
２．アルカリバーン動物モデルの作製
　８週齢のオスWisterラットを、用意しジエチルエーテルにより麻酔後、Ｓａｉｋａら（Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏ．，２００５）に従って５μｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液を成体Wisterラットの両眼もしくは片眼の角膜中心部点眼する一般的方法で麻酔下に投与し、点眼１０秒後に１０ｍｌのリン酸緩衝液でアルカリ液を角膜表面から洗い流し、アルカリバーンラットモデルを作製した。
３．標的ＤＮＡに対するｒＴＧＦ－β１（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰの結合特異性及び親和性
　Ｉ．方法
　ゲルシフトアッセイのためにＡＰ－１結合サイトを含む、ＴＧＦ－β１プロモーターに対応する蛍光標識マッチオリゴＤＮＡを合成した。試験に適切なセンス及びアンチセンスオリゴＤＮＡをアニールさせ、二重鎖オリゴＤＮＡを用意した。１μＭのＤＮＡを５０μＭのＰＩＰ化合物と１時間３７℃でインキュベートし、２０％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動にて分離し、蛍光イメージアナライザーＬＡＳ－３０００（フジフィルム、東京、日本）によって可視化した。
　ビアコアアッセイは、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰの標的ＤＮＡに対するリアルタイムの結合親和性を測定することができる。
　ビオチン標識オリゴＤＮＡはアニールして二重鎖にし、ストレプトアビジンをあらかじめ固定したセンサーチップＳＡ（ビアコア社、ウプサラ、スウェーデン）に固定した。
ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ、ミスマッチ（図４１（ａ））、及びビオチン標識オリゴＤＮＡについて、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００システム（ビアコア社、ウプサラ、スウェーデン）を用いて相互作用の動力学を調べた。データ処理はＢｉａｃｏｒｅ２０００により推奨されたプロトコールに準じて実施した。
　ＩＩ．結果
　ゲルシフトアッセイにより、本発明のｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、標的ＤＮＡに特異的に結合した（図４０）。一方、ミスマッチポリアミドには結合しなかった。
　ビアコアアッセイによって、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ及びミスマッチポリアミドに対する動力学的解析を行った。表面プラズモン共鳴センサーグラムから、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰは、標的ＤＮＡに対する高い結合親和性を示し、ＫＤ＝５．１２±３．４３Ｅ－０９が算出され、ミスマッチポリアミドに比べ１４９倍の親和性を示した。
４．本発明のピロールイミダゾールポリアミドのアルカリバーンラットにおける効果
　Ｉ．方法
　アルカリバーンによる外傷を惹起させてから１時間後（午前９時）、５μｌの０．１％酢酸水に溶解した１μＭｏｌ／LのｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物及び１μＭｏｌ／L（ｒＭＭＰ９ＡＰ１およびｒＭＭＰ９ＮＦｋＢの１：１混合物（以下ｒＭＭＰ９ＰＩＰともいう）を、角膜中央部に滴下することによってラットの右眼に一日１回午前９時に、１週間にわたり連日投与した。コントロールとして０．１％酢酸水溶液を上記と同様に左眼に投与した。同様の実験を６匹のラットで行った。０．１％酢酸溶液を使用したのは、本発明のＰＩＰ化合物を当該水溶液に溶かして使用していた為である。また感染症の発生を防ぐため、抗生物質眼軟膏Tarivid ophthalmic ointment 0.3％（参天製薬）を毎日午後５時に投与した。さらに２匹のラットをアルカリバーン非誘導コントロールとして、薬剤投与を行った。ラットは毎日点眼時に及び眼軟膏塗布時に観察し、角膜所見を毎夕方観察撮影した。水溶性フルオレセインは、実質層が露出するような潰瘍や創傷部分のみを染色する性質があり、その性質を利用して角膜の状態を検査することができるフローレス試験紙（昭和薬品化工）を用いて角膜フルオレセイン検査に準じて角膜損傷部の判定を行った。
　角膜の透明性は毎日顕微鏡で観察し、完全な再上皮化が観察されるまで観察を行った。角膜の蛍光染色が観察されなくなった時、完全な再上皮化がされたと定義した。
　角膜の不透明度及び潰瘍化の評価
　角膜の透明度は以下の通り判断した。
　グレード０：不透明度なし
　グレード１：角膜表面の３分の１未満が曇っている
　グレード２：角膜表面の３分の２未満が曇っている
　グレード３：角膜表面の３分の２以上が曇っている
　グレード４：ほとんど全ての表面が曇っており、瞳孔辺縁の視覚化を不透明性が妨げている状態
　角膜欠損の程度の評価
　グレード０：欠損又は潰瘍化なし
　グレード１：潰瘍化が角膜の前部３分の１に制限されている
　グレード２：潰瘍化が角膜の中部３分の１まで拡張している
　グレード３：潰瘍化が角膜の後部３分の１まで拡張している
　グレード４：デスメ膜瘤の形成
　グレード５：穿孔
　ＩＩ．結果
　ラットにおけるアルカリ外傷後の角膜所見を図１８に示す。角膜の不透明度及び潰瘍化の評価の結果は図１９及び２１に、角膜欠損の程度の評価の結果は図２０及び２２に示す。対照と比較して　ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物、及びｒＭＭＰ９ＰＩＰは、有意に角膜の不透明度及び潰瘍化、並びに角膜欠損を治癒した。
５．リアルタイムＲＴ－ＰＣＲアッセイ（ｍＲＮＡ発現の測定）
　Ｉ．材料及び方法
　４匹のラットをアルカリによって処理した後、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ポリアミド、及びｒＭＭＰ９ＰＩＰをそれぞれ０．１％酢酸溶液に溶解し、１μＭｏｌ／Ｌの濃度に調整し、外傷誘発１時間後に５μｌを角膜中央部に滴下した。２４時間、５、１０及び３０日後に屠殺した。ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ化合物及びｒＭＭＰ９ＰＩＰ化合物で処理した群及び対照群について傷害を受けた角膜領域を切り取るために、３ｍｍのディスポーザル生検パンチを使用した。Ｓａｉｋａ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏ，２００５及びＳａｉｋａ　Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００５に記載された方法に従い、総ＲＮＡを調製し、定量的ＲＴ－ＰＣＲを実施してＴＧＦ－β１及びＭＭＰ－９ｍＲＮＡのレベルを評価した。
　逆転写による相補的ＤＮＡ鎖はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＦｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄｋｉｔ（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．）によって合成された。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｔｈｅｒｍａｌ　ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ｓｙｓｔｅｍ　ＴＰ８００，Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ　Ｉｎｃ．，Ｊａｐａｎ）は、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）を使用した。ＴＧＦ－β１のためのプライマーは、（フォワード、５’－ＣＣＡ　ＡＧＧ　ＡＧＡ　ＣＧＧ　ＡＡＴ　ＡＣＡ　ＧＧ－３’，配列番号１９；　リバース　５’－ＡＧＣ　ＴＧＴ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＧＴＴ　ＧＡＧ　Ｃ－３’，配列番号２０；　１９４ｂｐのＰＣＲ産物）を使用した。ＭＭＰ－９のためのプライマーは、（フォワード、５’－ＴＴＣ　ＧＡＣ　ＧＣＴ　ＧＡＣ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＴＧ－３’，配列番号２１；　リバース　５’－ＡＧＧ　ＧＧＡ　ＧＴＣ　ＣＴＣ　ＧＴＧ　ＧＴＡ　ＧＴ－３’，配列番号２２；　１５６ｂｐのＰＣＲ産物）を使用した。ＧＡＰＤＨのためのプライマーは、（フォワード、５’－ＡＣＡ　ＴＣＡ　ＡＡＴ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ＣＴ－３’，配列番号２３；　リバース　５’－ＧＴＧ　ＧＴＴ　ＣＡＣ　ＡＣＣ　ＣＡＴ　ＣＡＣ　ＡＡ－３’，配列番号２４；　１６１ｂｐのＰＣＲ産物）を使用した。ツーステップＲＴ－ＰＣＲ混合物２５μｌは、ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥＸＴａｑ１２．５μｌ、夫々のフォワード及びリバースプライマー０．５μｌ、ＲＮａｓｅフリー水１０．５μｌ、鋳型ｃＤＮＡ１μｌからなる。リアルタイムサイクル条件は、９５℃、１０秒、９５℃、５秒　６０℃、３０秒の反応系によって行った。ＴＧＦ－β１およびＭＭＰ－９遺伝子の定量はＧＡＰＤＨ発現と比較することによって標準化した。
　ＩＩ．結果
　本発明のポリアミドがラット角膜におけるＴＧＦ－β及びＭＭＰ－９ｍＲＮＡの発現の減少と相関しているかどうかを調べるために、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって、本発明のポリアミドで処理したラット角膜細胞と０．１％酢酸水溶液によるコントロールのＴＧＦ－β１及びＭＭＰ－９ｍＲＮＡ発現レベルを比較した。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによる分析は、ＴＧＦ－βＰＩＰ及びＭＭＰ９ＰＩＰ化合物の処理によってラット角膜におけるＴＧＦ－βｍＲＮＡ及びＭＭＰ９ｍＲＮＡが有意に減少したことが分かった（図２３～２６）。
６．本発明のピロールイミダゾールポリアミドのアルカリバーンラットにおける角膜内細胞の核内への迅速な送達効果
　Ｉ．方法
　ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ポリアミドとｒＭＭＰ－９ＮＦｋＢ、ｒＭＭＰ９ＡＰ１ポリアミドの角膜内細胞核内への移行を確認するため、各ポリアミドをＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒ－Ｉ（ＦＩＴＣ）でラベルしたＦＩＴＣポリアミドの合成を行った（図２７及び図２９）。合成したＦＩＴＣポリアミドを０．１％酢酸溶液に溶解し、１μＭｏｌ／Ｌの濃度に調整し、アルカリ外傷モデルラット８匹に、外傷誘発１時間後に５μｌを角膜中央部に滴下した。２匹ずつを、ＦＩＴＣポリアミド点眼後、１時間、１日目、４日目、７日目に安楽死させ、眼球を摘出、凍結切片標本用プラスチック容器にＯＣＴコンパウンド（Ｍｉｌｅｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ，ＵＳＡ）で抱埋し、液体窒素で凍結、－８０度の超低温冷蔵庫に保存した。凍結切片５μｍに薄切し、オリンパス蛍光顕微鏡で観察した。
　ＩＩ．結果
　本発明ポリアミドは、角膜内に速やかに浸透し角膜のほぼ全ての細胞の核内に到達すると考えられた。また単回投与においても１週間後にも細胞核内の蛍光の観察が可能な細胞が存在した。図３０Ａ及び図３１にＦＩＴＣラベルしたｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ポリアミドを投与一時間後の蛍光観察において、角膜上皮、角膜内間質細胞の核が緑色のＦＩＴＣの蛍光を示している例を示す。図左白くぬけて見えるのが角膜の細胞の核であり、蛍光ＦＩＴＣにより白く見える。左が白色光による同一角膜検体。ＤＡＰＩ染色と同じ位置にＦＩＴＣによる強い蛍光が観察され、これは、すべての角膜組織、角膜上皮細胞、皮膜実質細胞及び上皮細胞において観察された。このことは、本発明用途においてポリアミド化合物が、投与回数を少なくしても涙液に流されること無く、持続的に薬効を示すであろうことを示唆している。実際このことはラットアルカリ外傷モデルにおいて１日一回の投与で十分に効果が得られていることからも実証された。この結果によりｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）は、傷害皮膜上皮層から、角膜間質層及び上皮層に浸透し、細胞全体の核に分布した。蛍光シグナルは前房においても検出された。また、２４時間後でも、核にとどまり、角膜細胞において検出可能なレベルであった（図３０Ｂ）。
７．免疫組織化学試験
　Ｉ．方法
　ラットにおいて角膜外傷誘発後、１時間、１、４及び７日目に眼球を摘出し、ＯＣＴ化合物（マイルズ、エルクハート、インディアナ州、ＵＳＡ）に包埋した。凍結切片を、５μｍの厚さに切断し、組織学的及び免疫組織学的分析を行った。ウサギ－抗ヒトＴｇｆ－β１ポリクロナール抗体を（ヤナイヒラ株式会社、日本、カタログ番号Ｙ２４１）を第一抗体として１：１０００に希釈して使用した。４つの非外傷の角膜を正常対照として、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ処理眼及びモック処理眼との比較に使用した。第一抗体の特異性を決定するために負の対照も含まれた。
　ＩＩ．結果
　免疫組織化学的分析により、外傷を受けていない角膜においてもＴＧＦ－β１タンパク質がわずかながら発現していること、及び当該発現は上皮層にのみで検出された（図３２、正常）。アルカリ外傷の後、角膜上皮層は、破壊され完全に失われた。角膜実質細胞は、このような欠損を修復するために活性化され増殖した。１日目にはＴＧＦ－β１は、活性化された前方の角膜実質で強く発現した。ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）ＰＩＰ及び対照では、免疫組織学的差異は見られなかった（図３２Ａ及びＢ）。４日目には、角膜実質層の再生した上皮細胞及び増殖した角膜実質細胞の両方に強いＴＧＦ－β１免疫反応が検出された（図３２Ｃ）。ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）処理角膜（図３２Ｄ）では、角膜実質層の再生した上皮細胞においてＴＧＦ－β１免疫反応が弱く検出され、角膜実質においてより細胞性が少ない層状の上皮を示し、炎症細胞の浸潤が起きていないことと繊維細胞が局所で増えていないことがわかった。対照群では、角膜実質はより厚く膨張しておりより紡錘形のＴｇｆ－β１陽性角膜実質細胞を示し、浸潤炎症細胞は前方部分に集合しＴｇｆ－β１陽性をしめした（図３２Ｃ）。７日目には、ｒＴＧＦ－β（ＧＢＰ１２０１）処理角膜（図３２Ｆ）では、よく再生した上皮及び角膜実質を示し、ほぼ正常細胞と同様の角膜を示した。対照群（図３２Ｅ）では、顕著な細胞過形成（増殖した角膜実質細胞及びトランス分化した筋線維芽細胞であると推定される）及び角膜実質層でのＴＧＦ－β１に対する強い免疫応答を示した。
８．ｉｎ　ｖｉｔｒｏ網膜細胞における蛍光標識ヒトhＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）ＰＩＰの分布
　Ｉ．材料及び方法
（Ａ）ＡＰＲＥ－１９細胞（ヒト網膜色素上皮由来細胞）は、６ウェルプレートの各ウェルに３Ｘ１０４個となるよう播種した。２ｍｌの１０％ＦＢＳ（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤ－ＭＥＭ／Ｆ－１２培地にて３７℃、５％、ＣＯ２で培養した。培養２４時間後、ＡＰＲＥ－１９細胞に蛍光標識ＦＩＴＣ結合ヒトｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）を最終濃度５μＭで成長培地に添加し３０分、２時間、６時間培養した。細胞は洗浄しＦＢＳフリー培地を添加した。生存細胞を×２０の倍率で観察し４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３４２（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｃｏｒｐ．，　Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって染色し、再度観察した。
　ＩＩ．結果
　ＦＩＴＣ結合ヒトｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）ＰＩＰは、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＰＲＥ－１９細胞を培養している成長培地に添加された３０分後では、はっきりしないが、２時間ですべての細胞の核における局在が観察された。添加から６時間後であってもＦＩＴＣ結合ヒトｈＴＧＦ－β（ＧＢＰ１１０５）ＰＩＰは、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＰＲＥ－１９細胞の核にとどまっていることが確認された（図４３）。このことは、既にヒトｈＴＧＦ－βの発現抑制作用が既知のＧＢＰ１１０５においてヒト眼組織（網膜色素上皮細胞）に対する取り込みが期待されることを示す。
９．統計解析
　結果は平均値±ＳＥで表現した。統計的有意性はスチューデントｔ－検定により評価した。０．０５未満のｐ値を有意であると判定した。
　本発明はＤＮＡ配列特異的結合化合物を含む局所用眼科疾患治療薬に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド（以下ＰＩＰとも言う）を含んでなる局所用眼科疾患治療薬に関する。
　配列番号１９　フォワードプライマー
　配列番号２０　リバースプライマー
　配列番号２１　フォワードプライマー
　配列番号２２　リバースプライマー
　配列番号２３　フォワードプライマー
　配列番号２４　リバースプライマー

Claims (46)

  1. 　Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトトランスフォーミング増殖因子β（以下ＴＧＦ－βとも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列－５５５～－５２８（配列番号２）、塩基配列－４２７～－３９９（配列番号４）又は塩基配列－３８４～－３５５（配列番号６）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
  2. 　更にβアラニン単位を含む請求項１に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  3. 　更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項１又は２に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  4. 　眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である請求項１～３のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  5. 　眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である請求項１～３のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  6. 　点眼剤の形態である、請求項１～５のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  7. 　前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列－５４４～－５３８（配列番号３）、塩基配列－４１６～－４１０（配列番号５）又は塩基配列－３７３～－３６６（配列番号７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１～６のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  8. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１～７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  9. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１～７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  10. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１～７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  11. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  12. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  13. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  14. 　Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ラットトランスフォーミング増殖因子β（以下ＴＧＦ－βとも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列－２３１６～－２２８７（配列番号２５）又は－２３２２～－２２９３（配列番号８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
  15. 　更にβアラニン単位を含む請求項１４に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  16. 　更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項１４又は１５に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  17. 　眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である請求項１４～１６のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  18. 　眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である請求項１４～１６のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  19. 　点眼剤の形態である、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  20. 　前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの－２３０５～－２２９８（配列番号２６）又は－２３１１～－２３０４（配列番号９）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項１４～１９のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  21. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１４～２０のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  22. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項１４～２０のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  23. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  24. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  25. 　Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９（以下ｈＭＭＰ－９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列－８８～－５９（配列番号１１）又は塩基配列－６１６～－５８８（配列番号１３）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
  26. 　更にβアラニン単位を含む請求項２５に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  27. 　更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項２５又は２６に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  28. 　眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である請求項２５～２７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  29. 　眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である請求項２５～２７のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  30. 　点眼剤の形態である、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  31. 　前記標的領域がトランスフォーミング増殖因子βプロモーターの塩基配列－７７～－７０（配列番号１２）又は塩基配列－６０５～－５９９（配列番号１４）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項２５～３０のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  32. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項２５～３１のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  33. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項２５～３１のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  34. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  35. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  36. 　Ｎ－メチルピロール単位（以下Ｐｙとも言う）、Ｎ－メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍとも言う）及びγ－アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ラットマトリックスメタロプロテアーゼ９（以下ｒＭＭＰ－９とも言う）遺伝子プロモーターの塩基配列－１０５～－７６（配列番号１５）又は塩基配列－６０２～－５７５（配列番号１７）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域と言う）の副溝内において、前記γ－アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ－Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ－Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ－Ｔ塩基対及びＴ－Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる、局所用眼科疾患治療薬。
  37. 　更にβアラニン単位を含む請求項３６に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  38. 　更にフルオレセインイソチオシアネート単位を含む請求項３６又は３７に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  39. 　眼科疾患がアルカリバーンによる外傷又は角膜手術後の外傷である請求項３６～３８のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  40. 　眼科疾患が眼科増殖性疾患又は炎症性疾患である請求項３６～３８のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  41. 　点眼剤の形態である、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  42. 　前記標的領域がマトリックスメタロプロテアーゼ９プロモーターの塩基配列－９４～－８７（配列番号１６）又は塩基配列－５９１～－５８６（配列番号１８）の一部又は全部とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である請求項３６～４１のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
  43. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項３６～４２のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
  44. 　前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される請求項３６～４２のいずれか一項に記載の局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  45. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  46. 　下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含む局所用眼科疾患治療薬。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
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