WO2010092785A1 - 蛍光検出装置及び蛍光検出方法 - Google Patents

蛍光検出装置及び蛍光検出方法 Download PDF

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fluorescence intensity
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中田成幸
土井恭二
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三井造船株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method for performing signal processing of a fluorescence signal obtained by receiving fluorescence emitted from a measurement object that has been irradiated with a laser beam.
  • a flow cytometer used in the medical and biological fields incorporates a fluorescence detection device that receives fluorescence from a fluorescent dye of a measurement object by irradiating laser light and identifies the type of the measurement object. .
  • a flow cytometer labels cells, DNA, RNA, enzymes, proteins, and other biological materials in suspension with a fluorescent reagent and applies pressure to the inside of the pipe line at a speed of about 10 m / sec.
  • the measurement object is allowed to flow in the flowing sheath liquid. Thereby, a laminar sheath flow is formed.
  • the fluorescence emitted from the fluorescent dye attached to the measurement object is received, and the measurement object is specified by identifying this fluorescence as a label.
  • This flow cytometer can measure, for example, the relative amounts of intracellular DNA, RNA, enzymes, proteins, and the like, and can analyze their functions in a short time.
  • a cell sorter or the like that identifies specific types of cells and chromosomes by fluorescence and selects and collects only the identified cells and chromosomes in a live state is used. In the use of this, it is required to specify more measurement objects accurately from fluorescence information in a short time.
  • Patent Document 1 many measurement objects can be accurately identified in a short time by calculating the fluorescence lifetime (fluorescence relaxation time) of fluorescence emitted from the measurement object by laser light irradiation.
  • a fluorescence detection apparatus and method are described.
  • the laser beam is intensity-modulated and irradiated to the measurement object, and the phase delay of the fluorescence signal of the fluorescence from the measurement object with respect to the modulation signal used for the laser beam intensity modulation is obtained.
  • the calculation of fluorescence relaxation time is described.
  • the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time can be calculated with high accuracy in a short time, but the range in which the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time can be calculated with a certain degree of accuracy is limited. It was. This is because the contribution of the phase delay to the fluorescence relaxation time is not constant but changes nonlinearly. In addition, due to mixing of noise components in the constituent circuits, quantum errors may occur when AD conversion is performed, and a large error may be given to fluorescence intensity or phase delay. For this reason, there is a problem that the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time cannot be calculated with a certain accuracy.
  • an object of the present invention is to provide a fluorescence detection apparatus and a fluorescence detection method capable of calculating the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time over a wide range with a certain accuracy in order to solve the above problems.
  • One embodiment of the present invention is a fluorescence detection device that performs signal processing of a fluorescence signal obtained by receiving fluorescence emitted from a measurement object that has been irradiated with laser light.
  • the device is A light source unit that modulates the intensity of the laser beam applied to the measurement object and emits the laser beam; A light receiving unit that outputs a fluorescence signal of fluorescence emitted from a measurement object irradiated with laser light; A light source control unit that generates a modulation signal for intensity-modulating laser light emitted from the light source unit; An amplifier that amplifies the fluorescence signal output from the light receiving unit, an in-phase component of the amplified fluorescence signal with respect to the modulation signal, and a 90-degree phase shift of the amplified fluorescence signal with respect to the modulation signal; A first processing unit comprising: a mixer that generates a phase component; and an AD converter that digitally converts the generated in-phase component and the 90-phase component.
  • a fluorescence phase lag with respect to the fluorescence intensity signal and the modulation signal is calculated, and using the calculated fluorescence intensity signal and the phase lag, the measurement object is measured.
  • Another embodiment of the present invention is a fluorescence detection method that performs signal processing of a fluorescence signal obtained by receiving fluorescence emitted from a measurement object that has been irradiated with laser light.
  • the method is Setting a frequency for intensity-modulating the laser light emitted from the laser light source unit and a signal level of the DC component, generating a modulation signal, and modulating the laser light using the modulation signal; Obtaining a fluorescence signal of fluorescence emitted from the measurement object that has been irradiated with the laser light; and
  • the fluorescence signal is amplified, and the amplified fluorescence signal has an in-phase component with respect to the modulation signal, and a 90-degree phase component of the amplified fluorescence signal that is shifted in phase by 90 degrees with respect to the modulation signal.
  • Generating and digitally converting the generated in-phase component and the generated 90-degree phase component Using the digitally converted in-phase component and the 90-degree phase component to calculate fluorescence intensity and fluorescence phase lag with respect to the modulation signal; Controlling an operation amount of at least one of the signal level of the DC component and the gain of the amplification so that the fluorescence intensity falls within a preset range; Calculate the value of the fluorescence intensity signal and the phase lag using the in-phase component and the 90-degree phase component obtained under the condition of the manipulated variable when the fluorescence intensity value falls within the set range, and calculate Calculating a fluorescence intensity and a fluorescence relaxation time of the fluorescence emitted from the measurement object using the value of the fluorescence intensity signal and the phase delay.
  • the fluorescence detection device and fluorescence detection method of the above aspect can calculate the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time over a wide range with a certain accuracy.
  • FIG. 2 is a diagram mainly showing a signal flow of the flow cytometer shown in FIG. 1.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating a schematic configuration of a control / signal processing unit of the flow cytometer illustrated in FIG. 1. It is a figure which shows the schematic structure of the data processing part of the flow cytometer shown in FIG. (A)
  • (b) is a figure explaining the effect by adjustment of phase delay (theta) used with the fluorescence detection apparatus and phase detection method of this invention
  • (c) is a figure explaining the effect by adjustment of fluorescence intensity. It is. It is a figure explaining the flow of one Embodiment of the fluorescence detection method of this invention.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a flow cytometer 10 using the fluorescence detection device of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram mainly showing the signal flow of the flow cytometer 10.
  • the flow cytometer 10 mainly includes a laser light source unit 22, light receiving units 24 and 26, a control / signal processing unit 28, a data processing unit (computer) 30, a pipe line 32, and a collection container 34.
  • a laser light source unit 22 light receiving units 24 and 26
  • control / signal processing unit 28 a data processing unit (computer) 30
  • pipe line 32 a pipe line 32
  • collection container 34 a collection container 34.
  • the laser light source unit 22 is a part that emits laser light having a wavelength in the visible light band of 350 nm to 800 nm and intensity-modulated by a controlled modulation signal. In the modulation signal, the frequency to be modulated and the signal level of the DC component are controlled.
  • the laser light source unit 22 includes a laser light source 22a, a lens system 22b (see FIG. 2), and a laser driver 22c (see FIG. 2).
  • the laser light source 22a emits laser light having a predetermined wavelength as CW (continuous wave) laser light having a constant intensity, and emits the CW laser light while modulating the intensity with frequency.
  • the lens system 22b (see FIG. 2) focuses the laser beam on a predetermined measurement point (measurement field) in the pipe line 32.
  • the laser driver 22c drives the laser light source 22a.
  • the laser light source unit 22 has a device configuration including one laser light source, but is not limited to one laser light source. A plurality of laser light sources can also be used. In this case, it is preferable that the laser light source unit 22 synthesizes laser light from a plurality of laser light sources using a dichroic mirror or the like to form laser light emitted toward the measurement field.
  • a semiconductor laser is used as a light source for emitting laser light.
  • the laser beam has an output of about 5 to 100 mW, for example.
  • the frequency (modulation frequency) for modulating the intensity of the laser light is slightly longer than the fluorescence relaxation time, for example, 10 to 200 MHz.
  • the laser driver 22c provided in the light source unit 22 is configured such that the level of the DC component of the intensity of the laser beam and the frequency of intensity modulation are controlled. That is, the intensity of the laser beam indicates an intensity change in which the DC component is intensity-modulated with a predetermined frequency, and the minimum intensity is greater than zero.
  • the light receiving unit 24 includes a photoelectric converter 24a (see FIG. 2), a lens system 24b (see FIG. 2) for converging forward scattered light to the photoelectric converter 24a, and a shielding plate 24c (see FIG. 2).
  • the photoelectric converter 24a is disposed so as to face the laser light source unit 22 with the pipe line 32 interposed therebetween, and the sample 12 receives the laser light forward scattered by the sample 12 passing through the measurement field, so that the sample 12 has the measurement field. A detection signal indicating that it passes is output.
  • the shielding plate 24c is provided on the front surface of the lens system 24b on the sample 12 side so that the laser beam does not directly enter the photoelectric converter 24a.
  • the signal output from the light receiving unit 24 is supplied to the control / signal processing unit 28 and the data processing unit 30, and the sample 12 passes through the measurement field in the pipe 32 in the control / signal processing unit 28 and the data processing unit 30. It is used as a trigger signal for informing the timing to perform, and an OFF signal at the end of measurement.
  • the light receiving unit 26 is arranged in a direction perpendicular to the emitting direction of the laser light emitted from the laser light source unit 22 and perpendicular to the moving direction of the sample 12 in the pipe 32.
  • the light receiving unit 26 includes a photoelectric converter 26a (see FIG. 2) that receives fluorescence emitted from the sample 12 irradiated in the measurement field.
  • the light receiving unit 26 includes a lens system 26b (see FIG. 2) that focuses the fluorescent signal from the sample 12, and a bandpass filter 26c (see FIG. 2).
  • the lens system 26b is configured to focus the fluorescence incident on the light receiving unit 26 on the light receiving surface of the photoelectric converter 26a.
  • the bandpass filter 26c has a transmission wavelength band that is filtered so that fluorescence of a predetermined wavelength band is captured by the photoelectric converter 26a.
  • the light receiving unit 26 includes one photoelectric converter 26a, but the light receiving unit 26 may include a plurality of photoelectric converters. In this case, a dichroic mirror can be provided in front of the bandpass filler 26c to divide the fluorescence into frequency bands, and the photoelectric converters can receive the divided fluorescence.
  • the band pass filter 26c is a filter that is provided in front of the light receiving surface of each photoelectric converter 26a and transmits only fluorescence in a predetermined wavelength band.
  • the wavelength band of the transmitted fluorescence is set corresponding to the wavelength band of the fluorescence emitted by the fluorescent dye.
  • the photoelectric converter 26a is a sensor that includes, for example, a photomultiplier tube as a sensor and converts light received by the photoelectric surface into an electrical signal.
  • the received fluorescence is fluorescence emitted by intensity modulation as in the case of laser light intensity modulation, so that the output fluorescence signal is a signal having the same frequency as the laser light intensity modulation frequency. This fluorescence signal is supplied to the control / signal processing unit 28.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a configuration of the control / signal processing unit 28.
  • the control / signal processing unit 28 includes a modulation signal control unit 40, a frequency conversion unit 42, and an AD conversion unit 44.
  • the modulation signal control unit 40 generates a modulation signal for intensity modulation of the laser light, supplies the modulation signal to the laser driver 22c, and supplies the generated modulation signal to the frequency conversion unit 42.
  • the modulation signal control unit 40 includes a variable frequency oscillator 40a, a power splitter 40b, amplifiers 40c and 40d, a DC signal generator 40e, and a frequency counter 40f.
  • the frequency variable oscillator 40a is a part that oscillates at a frequency determined according to a control signal from the data processing unit 30 and generates a modulation signal.
  • a voltage control generator is preferably used for the frequency variable oscillator 40a.
  • the power splitter 40b evenly distributes the oscillated modulation signal and supplies the divided modulation signal to the amplifier 40c and the amplifier 40d, respectively.
  • the amplifier 40c amplifies the modulation signal and supplies it to the laser driver 22c.
  • the amplifier 40d amplifies the modulation signal and supplies it to a frequency conversion unit 42 described later. The reason why the modulation signal is supplied to the frequency conversion unit 42 is to use it as a reference signal in order to obtain the phase delay of the fluorescence signal output from the light receiving unit 26 with respect to the modulation signal.
  • the DC signal generator 40e generates a DC component of the modulation signal and supplies it to the laser driver 22c.
  • the signal of the DC component is supplied to the laser driver 22c by adjusting the intensity of the laser light so that the intensity of the fluorescence emitted from the sample 12 is adjusted to a predetermined intensity, thereby achieving a highly accurate phase delay. This is to ensure the calculation of the fluorescence relaxation time with high accuracy. That is, the intensity of the laser beam shows an intensity change in which intensity modulation is applied to the DC component, and the minimum intensity is set to be greater than zero.
  • the frequency counter 40f is a part that counts the frequency of the modulation signal oscillated by the variable frequency oscillator 40a. The count result of the frequency counter 40f is supplied to the data processing unit 30.
  • the variable frequency oscillator 40a and the DC signal generator 40e are respectively connected to the data processing unit 30, and the frequency of the modulation signal and the signal level of the DC component are controlled by the control signal from the data processing unit 30.
  • the frequency conversion unit 42 performs frequency conversion on the fluorescent signal supplied from the light receiving unit 26a to perform down conversion.
  • the frequency conversion unit 42 mainly includes a variable amplifier 42a, an IQ mixer 42b, and a low-pass filter 42c.
  • the variable amplifier 42a amplifies the fluorescence signal.
  • the variable amplifier 42 a is connected to the data processing unit 30, and the gain is controlled according to the control signal from the data processing unit 30.
  • the IQ mixer 42b performs frequency conversion (down-conversion) of the amplified fluorescence signal to a low frequency using the modulation signal supplied from the modulation signal control unit 40 as a reference signal, and the fluorescence signal is in phase with the modulation signal. A modulation signal whose phase is 90 degrees out of phase with the signal is generated.
  • the IQ mixer 42b includes a 90-degree phase shifter 42d (see FIG. 2) and mixers 42e (see FIG. 2) and 42f (see FIG. 2).
  • the 90-degree phase shifter 42d generates a signal whose phase is 90 degrees shifted from the modulation signal, and the modulation signal whose phase is in phase and the modulation signal whose phase is 90 degrees are supplied to the mixers 42e and 42f, respectively.
  • the supplied modulated signal having the same phase as that of the modulated signal whose phase is shifted by 90 degrees is used as a reference signal, and mixing processing is performed on the amplified fluorescence signal.
  • the mixed fluorescence signal is supplied to the low-pass filter 42c.
  • the low-pass filter 42c filters a signal in a predetermined frequency region lower than the modulation signal from the mixed fluorescent signal, and extracts a low-frequency signal.
  • the Re component (component in phase with the modulation signal) and the Im component (component whose phase is shifted by 90 degrees with respect to the modulation signal), whose main components are signal components in the frequency 0 region are obtained.
  • the obtained Re component and Im component are supplied to the AD conversion unit 44.
  • the AD converter 44 converts the supplied Re component and Im component into digital data.
  • the AD conversion unit 44 includes an amplifier 44a and an AD converter 44b.
  • the amplifier 44a amplifies the Re component and the Im component with a predetermined gain, and then supplies them to the AD converter 44b.
  • the AD converter 44 b converts the amplified Re component and Im component into digital data, and supplies the digitized Re component data and Im component data to the data processing unit 30.
  • the data processing unit 30 obtains the fluorescence phase delay ⁇ and the fluorescence intensity signal using the supplied Re component data and Im component data. Further, the data processing unit 30 uses the phase delay ⁇ when the value of the phase delay ⁇ falls within a preset range and the value of the fluorescence intensity signal falls within a preset intensity range, and the fluorescence relaxation time. ⁇ and the fluorescence intensity of the fluorescence at that time are calculated. More specifically, in order to adjust the frequency of the modulation signal generated by the frequency variable oscillator 40a until the calculated value of the phase delay ⁇ matches a preset target value, for example, 45 degrees within an allowable range. The modulation signal is controlled by generating the control signal.
  • the allowable range is, for example, ⁇ 5 degrees, ⁇ 2 degrees, or ⁇ 1 degrees, depending on the calculation accuracy of the target fluorescence relaxation time.
  • the control is in a stabilized state.
  • the data processing unit 30 adjusts the level of the DC component generated by the DC signal generator 40e or the gain of the variable amplifier 42a until the calculated fluorescence intensity signal value falls within a preset intensity range ( A control signal for adjusting the operation amount is generated. Thereby, the signal levels of the Re component and the Im component performed by the AD converter 44b are adjusted.
  • FIG. 4 is a diagram illustrating a schematic configuration of the data processing unit 30.
  • the data processing unit 30 includes a fluorescence intensity signal generation unit 30a, a fluorescence intensity calculation unit 30b, a phase lag calculation unit 30c, a signal control unit 30d, and a fluorescence relaxation time calculation unit 30e.
  • Each of these parts is a module formed by executing a program executable by a computer. That is, the data processing unit 30 generates each function by starting software on the computer.
  • the phase lag calculation unit 30c and the fluorescence relaxation time calculation unit 30e correspond to a processing unit that calculates the fluorescence phase lag with respect to the modulation signal from the fluorescence signal and calculates the fluorescence relaxation time of the fluorescence of the sample 12 using the phase lag. To do.
  • the fluorescence intensity signal generation unit 30a generates a fluorescence intensity signal by square-adding the Re component data and Im component data supplied from the AD converter 44b to obtain a square root.
  • the calculated fluorescence intensity signal is sent to the fluorescence intensity calculator 30b. Since the fluorescence intensity signal is a value obtained as a result of adjusting the DC component of the laser light and the gain of the variable amplifier 42a, the value changes greatly according to these adjustment results. Therefore, in the fluorescence intensity calculation unit 30b, the fluorescence intensity signal is corrected using information on the level and gain of the DC component that is the intensity of the laser light, and the fluorescence intensity is calculated.
  • the fluorescence intensity signal is time-series data calculated using Re component data and Im component data that are continuously supplied during a period in which the sample 12 passes through the laser beam measurement field.
  • the fluorescence intensity calculation unit 30b uses the fluorescence intensity signal calculated by the fluorescence intensity signal generation unit 30a as information on the level and gain of the DC component that is the intensity of the laser light. And correct the fluorescence intensity. Specifically, the fluorescence intensity is obtained by dividing the value of the fluorescence intensity signal by a coefficient determined from the DC component level and the value of the control signal for adjusting the gain of the variable amplifier 42a. The coefficient used for the division is obtained by referring to the LUT in which the DC component level and gain adjustment control signal values are associated with the coefficients.
  • the DC component of the laser light used for correction may be a signal value given by the control signal, or the intensity of forward scattered light measured by the light receiving unit 24 may be used.
  • the gain of the variable amplifier 42a may be a signal value given by the control signal, or a value obtained by separately measuring the gain may be used.
  • the determination instruction received from the signal control unit 30d is issued when the value of the fluorescence intensity signal under control generated by the fluorescence intensity signal generation unit 30a exceeds a predetermined set value and reaches a maximum value.
  • the predetermined set value is a lower limit value that defines a set range.
  • the fluorescence intensity can be obtained by dividing the value of the fluorescence intensity signal at this time by the value of the control signal.
  • the level of the DC component generated by the DC signal generator 40e and the gain of the variable amplifier 42a are adjusted so that the value of the fluorescence intensity signal falls within a preset intensity range. In the latter half of the measurement field, the fluorescence intensity is weak. At this time, the adjustment of the level of the DC component generated by the DC signal generator 40e and the gain of the variable amplifier 42a (adjustment of the operation amount) does not reach the target value even if the operation amount is maximized. On the other hand, since the fluorescence intensity gradually increases at the first half to the middle stage where the sample 12 passes through the measurement field, once the value of the fluorescence intensity signal enters the preset range at this stage, the manipulated variable is It is constant and not adjusted.
  • the fluorescence intensity calculation method integrates the value obtained by dividing the value of the fluorescence intensity signal being controlled by the coefficient determined by the value of the control signal during the control time, and this integrated value is calculated for the control time.
  • the value divided by can also be calculated as the fluorescence intensity value.
  • the phase delay calculation unit 30c calculates tan ⁇ 1 (Im / Re) (Im is the value of Im component data and Re is the value of Re component data) using the supplied Re component data and Im component data. Thus, the phase delay ⁇ is calculated.
  • the calculated phase delay ⁇ is supplied to the signal control unit 30d. Further, the calculated phase delay ⁇ is supplied to the fluorescence relaxation time calculation unit 30e.
  • the reason why the fluorescence relaxation time ⁇ can be obtained according to the above equation is that the fluorescence follows a relaxation response with a substantially first-order lag.
  • the frequency f of the modulation signal the frequency count result of the modulation signal supplied from the frequency counter 40f is used. Instead of using the frequency count result, the target frequency of the modulation signal determined by the signal control unit 30 using the control signal may be used.
  • the signal control unit 30d determines whether or not the value of the fluorescence intensity signal supplied from the fluorescence intensity signal generation unit 30a and the phase delay ⁇ supplied from the phase delay calculation unit 30c are within the separately set ranges. Then, a control signal is generated according to the determination result. That is, the signal control unit 30d controls the level of the DC component of the laser light emitted from the light source unit 22 and the gain of the variable amplifier 44b so that the value of the fluorescence intensity signal falls within a preset range.
  • the signal control unit 30d generates a control signal for adjusting the signal level of the DC component of the DC signal generator 40e, and sends it to the DC signal generator 40e. Supply.
  • the modulation signal whose DC component signal level has been adjusted is supplied to the laser driver 22c, and the intensity modulation of the laser light is adjusted.
  • a modulated signal with the signal level of the DC component adjusted is supplied to the laser driver 22c.
  • the signal control unit 30d generates a control signal for adjusting the gain of the variable amplifier 42a provided immediately after the light receiving unit 26a, and controls the gain of the variable amplifier 42a.
  • the preset range used for the determination is, for example, that the quantum level quantized by AD conversion is 30 of the total quantum level of AD conversion for the maximum values of time-series Re component data and Im component data. This is a range of values determined to be at least% (the level is 308 or more for 12 bits).
  • the modulation signal of the DC signal generator 40e is controlled and the gain of the variable amplifier 42 is controlled. However, either one of the controls may be performed.
  • the signal control unit 30d constantly monitors the fluorescence intensity signal generated by the fluorescence intensity signal generation unit 30a. When the value of the fluorescence intensity signal exceeds a predetermined set value and reaches a maximum value, correction is performed. Give decision instructions.
  • the signal control unit 30d is also a part that controls the frequency of the modulation signal so that the value of the phase delay ⁇ approaches 45 degrees.
  • To approach the preset value means that the value of the phase delay ⁇ after the control is closer to the preset value than the value of the phase delay ⁇ before the control before and after the control of the modulation signal. means.
  • the value of the phase delay ⁇ approaches the target value set in advance by this control, but it is preferable that the phase delay ⁇ converges within a preset allowable range with respect to the target value.
  • the signal control unit 30d When the value of the phase delay ⁇ does not coincide with the target value of 45 degrees within the allowable range, the signal control unit 30d generates a control signal for adjusting the oscillation frequency of the frequency variable oscillator 40a and supplies the control signal to the frequency variable oscillator 40a. . As a result, the modulation signal with the adjusted frequency is supplied to the laser driver 22c, and the intensity modulation of the laser light is adjusted.
  • the signal control unit 30d determines that a highly accurate phase delay ⁇ is obtained when the value of the fluorescence intensity signal falls within the set range and the phase delay ⁇ falls within the preset range, and calculates the fluorescence intensity.
  • the unit 30b and the fluorescence relaxation time calculation unit 30e are instructed to determine calculation of fluorescence intensity and calculation of fluorescence relaxation time.
  • FIG. 5A shows the relationship between the intensity modulation frequency (angular frequency 2 ⁇ f) of the laser beam and the phase delay ⁇ of the fluorescence at that time with respect to various fluorescence relaxation times ⁇ .
  • the sensitivity of the phase delay ⁇ is high at an angle of 45 degrees. Therefore, the phase delay ⁇ can be calculated at a highly sensitive position by controlling the frequency of the modulation signal so that the phase delay ⁇ approaches 45 degrees. That is, the phase delay ⁇ with high accuracy can be calculated.
  • the phase delay change ⁇ 1 when the phase delay ⁇ is 45 degrees within the allowable range is smaller than the phase delay ⁇ 2 in the other range. Therefore, when the phase delay ⁇ is 45 degrees within the allowable range, the error of the phase delay ⁇ due to the quantum error can be reduced.
  • FIG. 6 is a diagram illustrating a flow of an embodiment of the fluorescence detection method performed by the fluorescence detection apparatus 10. This embodiment is a method of adjusting the DC component of the intensity of the laser light, the amplification gain of the fluorescence signal immediately after receiving the fluorescence, and the frequency of the modulation signal in order to calculate the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time.
  • the modulation signal control unit 40 sets the signal level of the DC component of the modulation signal used for intensity modulation of the laser beam and the gain of the variable amplifier 42a of the frequency conversion unit 42. (Step S10). At the start of processing, the signal level and gain of the DC component set as default are set. Further, the modulation signal control unit 40 sets the frequency of the modulation signal based on the control signal from the data processing unit 30. For example, the frequency is set as a default. A modulation signal is generated using the set signal level and gain of the DC component and the frequency of the modulation signal, and laser light whose intensity is modulated is emitted from the laser light source 22a (step S12).
  • the laser beam is irradiated, and the fluorescence emitted from the sample 12 passing through the measurement field is received by the light receiving unit 26a, and the fluorescence signal is output (step S14).
  • the signal is amplified with the gain set by the variable amplifier 42a, supplied to the mixers 42e and 42f, and mixed to obtain the Re component and the Im component.
  • the Re component and the Im component are converted into digital signals by the AD conversion unit 44, and Re component data and Im component data are obtained (step S16).
  • the phase delay calculation unit 30c of the data processing unit 30 calculates the phase delay ⁇ of the fluorescence signal from the digitized Re component data and Im component data (step S18).
  • the signal control unit 30d determines whether or not the calculated phase delay ⁇ matches 45 degrees that is a preset target value within an allowable range (step S20).
  • a control signal for changing the frequency of the modulation signal is generated and supplied to the frequency variable oscillator 40a.
  • the frequency of the modulation signal is changed (step S22).
  • step S24 the signal control unit 30 further determines whether or not the value of the fluorescence intensity signal falls within a preset range.
  • a determination instruction for calculating the fluorescence intensity and the fluorescence relaxation time is issued to the fluorescence intensity calculation unit 30b and the fluorescence relaxation time calculation unit 30e.
  • the fluorescence intensity calculated by the fluorescence intensity calculation unit 30b and the fluorescence relaxation time calculated by the fluorescence relaxation time calculation unit 30e are determined as the measurement result of the sample 12 (step S26).
  • step S28 When the value of the fluorescence intensity signal does not fall within the preset range (in the case of No), the signal level and gain of the DC component used for the modulation signal are changed (step S28), and the process returns to step 10.
  • steps S10 to S24 and step S28 are repeated until the value of the fluorescence intensity signal falls within a preset range.
  • the value of the fluorescence intensity signal when the value of the fluorescence intensity signal falls within the preset range and becomes the maximum value is corrected and output based on the signal level of the DC component and the value of the gain control signal.
  • the calculated measurement result is output to an output device such as a display or a printer (not shown) together with the signal level of the DC component, the gain, and the frequency of the modulation signal.
  • the above-described fluorescence detection method determines whether or not the phase delay ⁇ falls within the set range, and if the determination result is affirmative, determines whether or not the value of the fluorescence intensity signal falls within the set range. Use processing. However, in the present embodiment, it is determined whether or not the value of the fluorescence intensity signal falls within the set range. If the determination result is affirmative, it is determined whether or not the phase delay ⁇ falls within the set range. Processing may be used.
  • Such control is preferably performed as follows when the flow cytometer shown in FIG. 1 is used. That is, it is assumed that the sample 12 is composed of a plurality of sample particles, and these sample particles intermittently pass through a measurement field by laser light one by one at a constant speed.
  • the signal control unit 30d adjusts the signal level of the DC component of the modulation signal and makes it variable so that the value of the fluorescence intensity signal falls within a preset range immediately after the laser beam of the sample particles starts to pass through the measurement field. Control of the gain of the amplifier 42a is started.
  • the data processing unit 30 finds an operation amount in which the value of the fluorescence intensity signal falls within a preset range before the laser beam of the sample particles passes through the measurement field.
  • the data processing unit 30 calculates the fluorescence relaxation time from the phase delay obtained under the found operation amount condition and the frequency of the modulation signal. Further, the data processing unit 30 calculates the fluorescence intensity from the value of the fluorescence intensity signal and the operation amount at the set time. At this time, the frequency of the modulation signal is also controlled.
  • the following measuring method may be carried out. That is, it is assumed that the sample 12 is housed in a fixed container and is irradiated with laser light in a stationary state.
  • the signal control unit 30 controls the signal level of the DC component of the modulation signal and the gain of the variable amplifier 42a so that the value of the fluorescence intensity signal falls within a preset range, and this control is settled.
  • the fluorescence relaxation time is calculated using the phase delay of the fluorescence of the measurement object. Further, the fluorescence intensity is calculated from the value of the fluorescence intensity signal when the control is settled and the operation amount. At this time, the frequency of the modulation signal is also controlled.
  • the phase delay ⁇ and the fluorescence intensity with a certain accuracy can be obtained in a wide range.
  • the signal levels of the Re component and the Im component are low, noise may be included in these components due to noise mixed in the Re component and the Im component in the IQ mixer 42b, the low-pass filter 42c, the AD converter 44b, and the like. If AD conversion is performed in this state, an error at the time of quantization increases, and an error of the phase delay ⁇ calculated thereafter increases.
  • the signal levels of the Re component and the Im component can be kept constant by allowing the fluorescence intensity signal calculated from the Re component and the Im component to fall within a preset range, The error of the phase delay ⁇ can be kept constant and can be restrained.
  • the present embodiment gives the phase delay fluorescence relaxation time by adjusting the frequency of the modulation signal of the laser light so that the phase delay approaches the target value of 45 degrees.
  • the nonlinear contribution can be made constant.
  • this embodiment can expand the range which can calculate fluorescence relaxation time with a fixed precision.
  • tan ⁇ ( ⁇ being a phase lag) that is a non-linear part can be set to a substantially constant value, not limited to the fluorescence relaxation time.
  • the contribution of tan ⁇ differs greatly between when the phase delay ⁇ is large and when it is small, and it is possible to prevent the accuracy from changing.
  • phase delay ⁇ is calculated at a high sensitivity of the phase delay with respect to the frequency of the modulation signal, so that a highly accurate fluorescence relaxation time can be calculated.
  • both the phase lag and the fluorescence intensity signal are controlled, but the phase lag is not controlled, and the fluorescence intensity is determined without determining whether the phase lag ⁇ matches the target value within the allowable range. It is also possible to determine and control only whether or not the signal falls within a preset range.
  • the value of the fluorescence intensity signal calculated using the digitally converted in-phase component and 90-degree phase component falls within a preset range.
  • the amount of operation of at least one of the signal level of the DC component of the modulation signal used for intensity modulation and the gain of the amplifier is adjusted.
  • this embodiment controls the amount of operation of at least one of the DC component signal level of the modulation signal used for intensity modulation and the gain of the amplifier so that the value of the light intensity falls within a preset range.
  • the frequency of intensity modulation is controlled so that the phase lag of approaches to 45 degrees.

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Abstract

　蛍光検出装置は、レーザ光の照射を受けた測定対象物が発する蛍光を受光するとき、レーザ光源部から出射するレーザ光を強度変調するための変調信号を生成し、この変調信号を用いてレーザ光を変調する。このレーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を取得し、この蛍光信号から、蛍光強度と変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出する。その際、蛍光検出装置は、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように、変調信号のＤＣ成分の信号レベルと蛍光信号の出力直後の増幅のゲインの操作量を制御する。操作量が整定した後、蛍光強度を算出し、位相遅れを用いて測定対象物の発する蛍光の蛍光緩和時間を算出する。

Description

蛍光検出装置及び蛍光検出方法
　本発明は、レーザ光の照射を受けた測定対象物が発する蛍光を受光することにより得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。
　医療、生物分野で用いられるフローサイトメータには、レーザ光を照射することにより測定対象物の蛍光色素からの蛍光を受光して、測定対象物の種類を識別する蛍光検出装置が組み込まれている。
　具体的には、フローサイトメータは、懸濁液中の細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質を蛍光試薬でラベル化し、圧力を与えて毎秒１０ｍ以内程度の速度で管路内を流れるシース液に測定対象物を流す。これにより、ラミナーシースフローが形成される。このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光をラベルとして識別することで測定対象物を特定する。
　このフローサイトメータは、例えば、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白質等の細胞内相対量を計測し、またこれらの働きを短時間で解析することができる。また、特定のタイプの細胞や染色体を蛍光によって特定し、特定した細胞や染色体のみを生きた状態で短時間で選別収集するセル・ソータ等が用いられる。
　これの使用においては、より多くの測定対象物を、短時間に正確に蛍光の情報から特定することが要求されている。
　下記特許文献１には、レーザ光の照射による測定対象物から発せられる蛍光の蛍光寿命（蛍光緩和時間）を算出することで、多くの測定対象物を、短時間に正確に特定することができる蛍光検出装置および方法が記載されている。
　当該文献によると、レーザ光を強度変調して測定対象物に照射し、測定対象物からの蛍光の蛍光信号の、レーザ光の強度変調に用いた変調信号に対する位相遅れを求め、この位相遅れから、蛍光緩和時間を算出することが記載されている。
特開２００６－２２６６９８号公報
　この装置および方法では、蛍光強度や蛍光緩和時間を精度高く短時間に算出することができるが、蛍光強度や蛍光緩和時間を一定の精度で算出することのできる範囲は、限られた範囲となっていた。これは、位相遅れが蛍光緩和時間に与える寄与が一定でなく非線形に変化することに由来する。また、構成回路でのノイズ成分の混入により、ＡＤ変換を行うとき量子誤差が生じ蛍光強度や位相遅れに大きな誤差を与える場合もある。このため、一定の精度で蛍光強度や蛍光緩和時間を算出することができないといった問題がある。
　そこで、本発明は、上記問題点を解決するために、蛍光強度および蛍光緩和時間を、広範囲で一定の精度で算出することのできる蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。
　本発明の一態様は、レーザ光の照射を受けた測定対象物が発する蛍光を受光することにより得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置である。
　当該装置は、
　測定対象物に照射するレーザ光を強度変調して出射する光源部と、
　レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
　前記光源部から出射するレーザ光を強度変調するための変調信号を生成する光源制御部と、
　前記受光部で出力された蛍光信号を増幅する増幅器と、増幅した前記蛍光信号の、前記変調信号に対する同相成分と、増幅した前記蛍光信号の、前記変調信号に対して９０度位相のシフトした９０度位相成分と、を生成するミキサと、生成した前記同相成分と前記９０度位相成分をデジタル変換するＡＤ変換器と、を有する第１の処理部と、
　デジタル変換した前記同相成分と前記９０度位相成分とを用いて、蛍光強度信号と前記変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出し、算出した前記蛍光強度信号と前記位相遅れを用いて測定対象物の蛍光の蛍光強度と蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、
　前記蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように、前記強度変調に用いる変調信号のＤＣ成分の信号レベルおよび前記増幅器のゲインの少なくとも一方の操作量の制御を行う信号制御部と、を有する。
　本発明の他の一態様は、レーザ光の照射を受けた測定対象物が発する蛍光を受光することにより得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法である。
　当該方法は、
　レーザ光源部から出射するレーザ光を強度変調するための周波数とＤＣ成分の信号レベルを設定して変調信号を生成し、この変調信号を用いてレーザ光を変調するステップと、
　前記レーザ光の照射を受けた測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を取得するステップと、
　前記蛍光信号の増幅を行い、前記増幅をした前記蛍光信号の、前記変調信号に対する同相成分と、増幅した前記蛍光信号の、前記変調信号に対して９０度位相のシフトした９０度位相成分とを生成し、生成した前記同相成分と前記９０度位相成分をデジタル変換するステップと、
　デジタル変換された前記同相成分と前記９０度位相成分とを用いて、蛍光強度と前記変調信号に対する蛍光の位相遅れとを算出するステップと、
　前記蛍光強度が予め設定された範囲に入るように、前記ＤＣ成分の信号レベルおよび前記増幅のゲインの少なくとも一方の操作量を制御するステップと、
　前記蛍光強度の値が前記設定された範囲に入るときの前記操作量の条件で得られる前記同相成分と前記９０度位相成分とを用いて蛍光強度信号の値と前記位相遅れを算出し、算出した前記蛍光強度信号の値と前記位相遅れを用いて、測定対象物の発する蛍光の蛍光強度と蛍光緩和時間を算出するステップと、を有する。
　上記態様の蛍光検出装置及び蛍光検出方法は、蛍光強度および蛍光緩和時間を、広範囲で一定の精度で算出することができる。
本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの概略構成図である。 図１に示すフローサイトメータの信号の流れを中心に示す図である。 図１に示すフローサイトメータの制御・信号処理部の概略の構成を示す図である。 図１に示すフローサイトメータのデータ処理部の概略の構成を示す図である。 （ａ）および（ｂ）は、本発明の蛍光検出装置及び位相検出方法で用いる位相遅れθの調整による効果を説明する図であり、（ｃ）は、蛍光強度の調整による効果を説明する図である。 本発明の蛍光検出方法の一実施形態のフローを説明する図である。
　以下、本発明の蛍光検出装置を好適に用いたフローサイトメータを基に詳細に説明する。
　図１は、本発明の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータ１０の概略構成図である。
  図２は、フローサイトメータ１０の信号の流れを中心に示す図である。
　フローサイトメータ１０は、主に、レーザ光源部２２と、受光部２４、２６と、制御・信号処理部２８と、データ処理部（コンピュータ）３０と、管路３２と、回収容器３４と、を有する。
　レーザ光源部２２は、３５０ｎｍ～８００ｎｍの可視光帯域の波長を有し、制御された変調信号により強度変調されたレーザ光を出射する部分である。変調信号は、変調する周波数とＤＣ成分の信号レベルが制御されている。
　レーザ光源部２２は、レーザ光源２２ａと、レンズ系２２ｂ（図２参照）と、レーザドライバ２２ｃ（図２参照）と、を有する。レーザ光源２２ａは、所定の波長のレーザ光を強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、かつこのＣＷレーザ光の強度を周波数で変調しながら出射する。レンズ系２２ｂ（図２参照）は、レーザ光を管路３２中の所定の測定点（測定場）に集束させる。レーザドライバ２２ｃ（図２参照）は、レーザ光源２２ａを駆動する。
　レーザ光源部２２は、１つのレーザ光源からなる装置構成であるが、１つのレーザ光源に限定されない。複数のレーザ光源を用いることもできる。この場合、レーザ光源部２２は、複数のレーザ光源からのレーザ光を、ダイクロイックミラー等を用いて合成して、測定場に向けて出射されるレーザ光を形成することが好ましい。
　レーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光は、例えば５～１００ｍＷ程度の出力である。一方、レーザ光の強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長く、例えば１０～２００ＭＨｚである。
　光源部２２に設けられるレーザドライバ２２ｃは、レーザ光の強度のＤＣ成分のレベル及び強度変調の周波数が制御されるように構成されている。すなわち、レーザ光の強度は、ＤＣ成分に、定められた周波数による強度変調が載った強度変化を示し、最低強度は０より大きくなっている。
　受光部２４は、光電変換器２４ａ（図２参照）と、光電変換機２４ａに前方散乱光を収束させるレンズ系２４ｂ（図２参照）と、遮蔽板２４ｃ（図２参照）とを有する。
　光電変換器２４ａは、管路３２を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、測定場を通過する試料１２によって前方散乱するレーザ光を受光することにより、試料１２が測定場を通過する旨の検出信号を出力する。
　遮蔽板２４ｃは、レーザ光が光電変換器２４ａに直接入射しないようにレンズ系２４ｂの試料１２側前面に設けられている。この受光部２４から出力される信号は、制御・信号処理部２８およびデータ処理部３０に供給され、制御・信号処理部２８およびデータ処理部３０において試料１２が管路３２中の測定場を通過するタイミングを知らせるトリガ信号、測定終了のＯＦＦ信号として用いられる。
　一方、受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつ管路３２中の試料１２の移動方向に対して垂直方向に配置されている。受光部２６は、測定場にて照射された試料１２が発する蛍光を受光する光電変換器２６ａ（図２参照）を備える。
　受光部２６は、光電変換器２６ａの他に、試料１２からの蛍光信号を集束させるレンズ系２６ｂ（図２参照）と、バンドパスフィルタ２６ｃ（図２参照）とを有する。
　レンズ系２６ｂは、受光部２６に入射した蛍光を光電変換器２６ａの受光面に集束させるように構成されている。バンドパスフィルタ２６ｃは、フィルタリングして光電変換器２６ａで所定の波長帯域の蛍光が取り込まれるように、透過波長帯域が設定されている。
　受光部２６は、１つの光電変換器２６ａを有するが、受光部２６は、複数の光電変換器を有することもできる。この場合、ダイクロイックミラーをバンドパスフィラー２６ｃの前に設けて、蛍光を周波数帯域別に分け、この分けた蛍光を光電変換器それぞれが受光するように構成にすることができる。
　バンドパスフィルタ２６ｃは、各光電変換器２６ａの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光のみが透過するフィルタである。透過する蛍光の波長帯域は、蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定される。
　光電変換器２６ａは、例えば光電子増倍管をセンサとして備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光する蛍光は、レーザ光の強度変調と同様に、強度変調して発する蛍光であるので、出力される蛍光信号はレーザ光の強度変調の周波数と同じ周波数を持った信号となる。この蛍光信号は、制御・信号処理部２８に供給される。
　図３は、制御・信号処理部２８の構成を示す図である。制御・信号処理部２８は、変調信号制御部４０と、周波数変換部４２と、ＡＤ変換部４４と、を有する。
　変調信号制御部４０は、レーザ光の強度変調のための変調信号を生成し、レーザドライバ２２ｃに供給するとともに、生成した変調信号を周波数変換部４２に供給する。
　変調信号制御部４０は、周波数可変発振器４０ａと、パワースプリッタ４０ｂと、増幅器４０ｃ，４０ｄと、ＤＣ信号発生器４０ｅと、周波数カウンタ４０ｆとを有する。
　周波数可変発振器４０ａは、データ処理部３０からの制御信号に応じて定められた周波数で発振して、変調信号を生成する部分である。周波数可変発振器４０ａには、例えば、電圧制御発生器が好適に用いられる。
　パワースプリッタ４０ｂは、発振した変調信号を均等に分配し、分割した変調信号を増幅器４０ｃと増幅器４０ｄにそれぞれ供給する。
　増幅器４０ｃは、変調信号を増幅してレーザドライバ２２ｃに供給する。増幅器４０ｄは、変調信号を増幅して、後述する周波数変換部４２に供給する。周波数変換部４２に変調信号を供給するのは、受光部２６から出力された蛍光信号の、変調信号に対する位相遅れを求めるために、参照信号として用いるためである。
　ＤＣ信号発生器４０ｅは、変調信号のＤＣ成分を生成しレーザドライバ２２ｃに供給する。ＤＣ成分の信号をレーザドライバ２２ｃへ供給するのは、レーザ光の強度を調整することで、試料１２が発する蛍光の強度を所定の強度になるように調整し、これにより、精度の高い位相遅れの値、さらには精度の高い蛍光緩和時間の算出を保証するためである。すなわち、レーザ光の強度は、ＤＣ成分に強度変調が載った強度変化を示し、最低強度は０より大きくなるようにするためである。
　周波数カウンタ４０ｆは、周波数可変発振器４０ａにて発振した変調信号の周波数をカウントする部分である。周波数カウンタ４０ｆのカウント結果は、データ処理部３０に供給される。
　周波数可変発振器４０ａとＤＣ信号発生器４０ｅは、それぞれ、データ処理部３０と接続されており、データ処理部３０からの制御信号により、変調信号の周波数およびＤＣ成分の信号レベルが制御されている。
　周波数変換部４２は、受光部２６ａから供給された蛍光信号に周波数変換を行ってダウンコンバージョンを施す。周波数変換部４２は、可変増幅器４２ａと、ＩＱミキサ４２ｂと、ローパスフィルタ４２ｃを主に有する。
　可変増幅器４２ａは、蛍光信号を増幅する。可変増幅器４２ａは、データ処理部３０と接続され、データ処理部３０からの制御信号に従ってゲインが制御されている。
　ＩＱミキサ４２ｂは、増幅された蛍光信号を、変調信号制御部４０から供給された変調信号を参照信号として、低周波への周波数変換（ダウンコンバージョン）を行い、蛍光信号の、変調信号と同相の信号と、位相が９０度ずれた変調信号を生成する。
　ＩＱミキサ４２ｂは、９０度位相シフタ４２ｄ（図２参照）と、ミキサ４２ｅ（図２参照），４２ｆ（図２参照）を有する。９０度位相シフタ４２ｄにより、変調信号と位相が９０度ずれた信号が生成され、位相が同相の変調信号と位相が９０度ずれた変調信号がそれぞれミキサ４２ｅ、４２ｆに供給される。
　ミキサ４２ｅ，４２ｆでは、供給された位相が同相の変調信号と位相が９０度ずれた変調信号を参照信号とし、増幅された蛍光信号とミキシング処理を行う。ミキシングされた蛍光信号は、ローパスフィルタ４２ｃに供給される。
　ローパスフィルタ４２ｃは、ミキシングされた蛍光信号から、変調信号より低い所定の周波数領域の信号をろ過し、低周波信号を取り出す。これにより、周波数０領域の信号成分を主成分とする、蛍光信号のＲｅ成分（変調信号に同相の成分）とＩｍ成分（変調信号に対して位相が９０度シフトした成分）が求められる。求められたＲｅ成分とＩｍ成分は、ＡＤ変換部４４に供給される。
　ＡＤ変換部４４は、供給されたＲｅ成分とＩｍ成分とをデジタルデータに変換する。ＡＤ変換部４４は、増幅器４４ａとＡＤ変換器４４ｂとを有する。増幅器４４ａは、所定のゲインでＲｅ成分とＩｍ成分を増幅した後、ＡＤ変換器４４ｂに供給する。ＡＤ変換器４４ｂは、増幅されたＲｅ成分とＩｍ成分をデジタルデータに変換し、デジタル化したＲｅ成分データとＩｍ成分データをデータ処理部３０に供給する。
　データ処理部３０は、供給されたＲｅ成分データおよびＩｍ成分データを用いて蛍光の位相遅れθおよび蛍光強度信号を求める。さらに、データ処理部３０は、位相遅れθの値が予め設定された範囲に入り、かつ、蛍光強度信号の値が予め設定された強度範囲に入るときの位相遅れθを用いて、蛍光緩和時間τとそのときの蛍光の蛍光強度を算出する。
　より詳しく説明すると、算出された位相遅れθの値が、許容範囲内で、予め設定された目標値、例えば４５度に一致するまで、周波数可変発振器４０ａで生成する変調信号の周波数を調整するための制御信号を生成することで、変調信号を制御する。ここで、許容範囲は、目標とする蛍光緩和時間の算出精度にも依存するが、例えば、±５度、±２度あるいは±１度である。位相遅れθの値が、目標とする値に対して予め設定された許容範囲内に入るとき、制御は整定された状態となる。
　さらに、データ処理部３０は、算出された蛍光強度信号の値が、予め設定された強度範囲に入るまで、ＤＣ信号発生器４０ｅで生成するＤＣ成分のレベル、あるいは可変増幅器４２ａのゲインの調整（操作量の調整）を行うための制御信号を生成する。これにより、ＡＤ変換器４４ｂで行うＲｅ成分とＩｍ成分の信号レベルは調整される。
　図４は、データ処理部３０の概略の構成を示す図である。データ処理部３０は、蛍光強度信号生成部３０ａと、蛍光強度算出部３０ｂと、位相遅れ算出部３０ｃと、信号制御部３０ｄと、蛍光緩和時間算出部３０ｅとを有する。これらの各部分は、コンピュータが実行可能なプログラムを実行することで形成されるモジュールである。すなわち、データ処理部３０は、コンピュータ上で、ソフトウェアを起動することにより各機能が生成される。
　位相遅れ算出部３０ｃと蛍光緩和時間算出部３０ｅは、蛍光信号から、変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出し、この位相遅れを用いて試料１２の蛍光の蛍光緩和時間を算出する処理部に対応する。
　蛍光強度信号生成部３０ａは、ＡＤ変換器４４ｂから供給されたＲｅ成分データとＩｍ成分データとを二乗加算して平方根を求めることにより、蛍光強度信号を生成する。算出された蛍光強度信号は蛍光強度算出部３０ｂに送られる。蛍光強度信号は、レーザ光のＤＣ成分及び可変増幅器４２ａのゲインが調整された結果の値であるので、これらの調整結果に応じて値が大きく変化する。したがって、蛍光強度算出部３０ｂにおいて、蛍光強度信号は、レーザ光の強度であるＤＣ成分のレベルとゲインとの情報を用いて補正されて蛍光強度が算出される。しかし、この補正による蛍光強度の算出は、信号制御部３０ｄから後述する決定指示を受けたとき、はじめて行われる。
　なお、蛍光強度信号は、試料１２がレーザ光の測定場を通過する期間に連続して供給されるＲｅ成分データとＩｍ成分データを用いて算出される時系列データである。
　蛍光強度算出部３０ｂは、信号制御部３０ｄから受ける決定指示に応じて、蛍光強度信号生成部３０ａで算出された蛍光強度信号を、レーザ光の強度であるＤＣ成分のレベルとゲインとの情報を用いて補正し、蛍光強度を算出する。具体的には、蛍光強度信号の値を、ＤＣ成分のレベルおよび可変増幅器４２ａのゲインの調整の制御信号の値から定められる係数で除算することにより、蛍光強度が求められる。なお、除算に用いる係数は、ＤＣ成分のレベルおよびゲインの調整の制御信号の値と、係数とを関連付けたＬＵＴを参照して得られる。
　補正に用いるレーザ光のＤＣ成分は、制御信号が与える信号値でもよいし、受光部２４で計測された前方散乱光の強度を用いることもできる。可変増幅器４２ａのゲインは、制御信号が与える信号値でもよいし、ゲインを別途計測した結果の値を用いることもできる。
信号制御部３０ｄから受ける決定指示は、蛍光強度信号生成部３０ａで生成される制御中の蛍光強度信号の値が所定の設定値を超えて最大値になったときに出される。ここで、所定の設定値とは、設定された範囲を定める下限値である。このときの蛍光強度信号の値を制御信号の値で除算することにより、蛍光強度が得られる。
　蛍光強度信号の値は、予め設定された強度範囲に入るように、ＤＣ信号発生器４０ｅで生成するＤＣ成分のレベルおよび可変増幅器４２ａのゲインの調整（操作量の調整）を行うが、試料１２が測定場を通過する後半部は、蛍光強度が弱くなる。このとき、ＤＣ信号発生器４０ｅで生成するＤＣ成分のレベルおよび可変増幅器４２ａのゲインの調整（操作量の調整）では、操作量を最大にしても目標値に達しない。一方、試料１２が測定場を通過する前半部～中間部の段階では、蛍光強度が徐々に強くなるので、この段階において蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に一旦入ると、操作量は調整されず一定となる。このとき、蛍光強度信号の値は、上記範囲を定める設定値を超えて最大値になる。したがって、このときの蛍光強度信号の値を、このときの制御信号の値で定まる係数で除算することにより、蛍光強度を求める。
　蛍光強度の算出方法は、上記方法により値を算出する他に、制御中の蛍光強度信号の値を制御信号の値で定まる係数で除算した値を制御時間中積算し、この積算値を制御時間で除算した値を、蛍光強度の値として算出することもできる。
　位相遅れ算出部３０ｃは、供給されたＲｅ成分データとＩｍ成分データを用いてｔａｎ-1(Ｉｍ／Ｒｅ)（ＩｍはＩｍ成分データの値、ＲｅはＲｅ成分データの値である）を算出することで、位相遅れθを算出する。算出された位相遅れθは信号制御部３０ｄに供給される。また、算出された位相遅れθは蛍光緩和時間算出部３０ｅに供給される。
　蛍光緩和時間算出部３０ｅは、信号制御部３０ｄからの決定指示に応じて、位相遅れ算出部３０ｃから供給された位相遅れθを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝１／（２πｆ）・ｔａｎθに従って求める。蛍光緩和時間τを、上記式に従って求めることができるのは、蛍光は、略１次遅れの緩和応答に従うからである。なお、変調信号の周波数ｆは、周波数カウンタ４０ｆから供給される変調信号の周波数のカウント結果が用いられる。周波数のカウント結果を用いる替わりに、信号制御部３０が制御信号で定めた変調信号の目標の周波数であってもよい。
　信号制御部３０ｄは、蛍光強度信号生成部３０ａから供給された蛍光強度信号の値と位相遅れ算出部３０ｃから供給された位相遅れθが、それぞれ別々に設定された範囲に入るか否かを判定し、判定結果に応じて、制御信号を生成する。
　すなわち、信号制御部３０ｄは、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように、光源部２２から出射されるレーザ光のＤＣ成分のレベルおよび可変増幅器４４ｂのゲインを制御する。
　判定結果、蛍光強度信号の値が設定された範囲に入らない場合、信号制御部３０ｄは、ＤＣ信号発生器４０ｅのＤＣ成分の信号レベルを調整する制御信号を生成し、ＤＣ信号発生器４０ｅに供給する。これにより、レーザドライバ２２ｃにＤＣ成分の信号レベル調整された変調信号が供給され、レーザ光の強度変調は調整される。これにより、レーザドライバ２２ｃにＤＣ成分の信号レベルの調整された変調信号が供給される。また、信号制御部３０ｄは、受光部２６ａ直後に設けられた可変増幅器４２ａのゲインを調整する制御信号を生成し、可変増幅器４２ａのゲインを制御する。ここで、判定に用いる予め設定された範囲とは、例えば、時系列のＲｅ成分データとＩｍ成分データの最大値について、ＡＤ変換により量子化される量子レベルが、ＡＤ変換の量子レベル全体の３０％以上（１２ビットの場合レベルが３０８以上）になるように定められた値の範囲をいう。
　本実施形態では、ＤＣ信号発生器４０ｅの変調信号の制御と可変増幅器４２のゲインの制御を行うが、いずれか一方の制御が行われてもよい。
　また、信号制御部３０ｄは、蛍光強度信号生成部３０ａで生成された蛍光強度信号を常時監視し、蛍光強度信号の値が、所定の設定値を超えて最大値になったときに、補正の決定指示を出す。
　また、信号制御部３０ｄは、位相遅れθの値が４５度に近づくように、変調信号の周波数を制御する部分でもある。予め設定された値に近づくとは、変調信号の制御の前と後では、制御後の位相遅れθの値は、制御前の位相遅れθの値に比べて予め設定された値に近いことを意味する。位相遅れθの値は、この制御により予め設定された目標とする値に近づくが、この目標とする値に対して、予め設定された許容範囲内で収束することが好ましい。
　信号制御部３０ｄは、位相遅れθの値が許容範囲内で目標値である４５度に一致しない場合、周波数可変発振器４０ａの発振周波数を調整する制御信号を生成し、周波数可変発振器４０ａに供給する。これにより、レーザドライバ２２ｃに周波数の調整された変調信号が供給され、レーザ光の強度変調は調整される。
　信号制御部３０ｄは、蛍光強度信号の値が設定された範囲に入り、かつ、位相遅れθが予め設定された範囲に入る場合、精度の高い位相遅れθが得られたと判定し、蛍光強度算出部３０ｂ及び蛍光緩和時間算出部３０ｅに、蛍光強度の算出と蛍光緩和時間の算出の決定指示をする。
　このように、蛍光強度信号の値と位相遅れθがいずれも設定された範囲に入る場合、精度の高い位相遅れθが得られる。したがって、精度の高い蛍光緩和時間が算出される。本発明では、少なくとも、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るか否かを判定することで、精度の高い位相遅れθが得られる。
　図５（ａ）には、レーザ光の強度変調の周波数（角周波数２πｆ）とそのときの蛍光の位相遅れθとの関係を、種々の蛍光緩和時間τに関して示している。
　位相遅れθが４５度で各角周波数２πｆに対する位相遅れθの角度変化が最大となる。すなわち、角度４５度で位相遅れθの感度が高くなっている。したがって、位相遅れθを４５度に近づけるように変調信号の周波数を制御することにより、感度の高い位置で位相遅れθを算出することができる。すなわち、精度の高い位相遅れθを算出することができる。
　また、ＡＤ変換器４４ｂでＡＤ変換を行うとき、図５（ｂ）に示すように、Ｒｅ成分やＩｍ成分に誤差が含まれて、ＡＤ変換における量子化レベルが１つ変動する場合を想定する。このとき、位相遅れθが許容範囲内で４５度にある場合の位相遅れの変化Δθ1は、それ以外の範囲にある位相遅れΔθ2に比べて小さい。したがって、位相遅れθが許容範囲内で４５度である場合は、量子誤差による位相遅れθの誤差を小さくすることができる。
　さらに、図５（ｃ）に示すように、量子化レベルが大きいＡ点と、小さいＢ点を想定した場合、Ｉｍ成分の誤差により、Ｂ点からＢ’点に変化したときの位相角の変化は、Ａ点からＡ’に変化したときの位相角の変化に比べて大きい。したがって、Ｒｅ成分データおよびＩｍ成分データから算出される蛍光強度信号の値を、予め設定された範囲に入るようにすることで、ＡＤ変換時に含まれる誤差に対して一定の精度を持った位相遅れθを求めることができる。
　図６は、蛍光検出装置１０で行われる蛍光検出方法の一実施形態のフローを説明する図である。この実施形態は、蛍光強度と蛍光緩和時間の算出のために、レーザ光の強度のＤＣ成分と、蛍光の受光直後の蛍光信号の増幅ゲインと、変調信号の周波数とを調整する方法である。
　まず、データ処理部３０からの制御信号に基づいて、変調信号制御部４０において、レーザ光の強度変調に用いる変調信号のＤＣ成分の信号レベルと、周波数変換部４２の可変増幅器４２ａのゲインが設定される（ステップＳ１０）。これらは、処理開始時は、デフォルト設定されているＤＣ成分の信号レベルとゲインが設定される。
　さらに、変調信号制御部４０において、データ処理部３０からの制御信号に基づいて変調信号の周波数が設定される。例えば周波数がデフォルト設定される。以上の設定されたＤＣ成分の信号レベル及びゲインと変調信号の周波数とを用いて変調信号を生成し、レーザ光源２２ａから強度変調されたレーザ光が出射される（ステップＳ１２）。
　次に、レーザ光が照射され、測定場を通過する試料１２が発する蛍光が受光部２６ａで受光され、蛍光信号が出力される（ステップＳ１４）。
　次に、可変増幅器４２ａで設定されたゲインで増幅され、ミキサ４２ｅ，４２ｆに供給され、ミキシングされて、Ｒｅ成分およびＩｍ成分が求められる。さらに、Ｒｅ成分およびＩｍ成分は、ＡＤ変換部４４でデジタル信号に変換され、Ｒｅ成分データおよびＩｍ成分データが得られる（ステップＳ１６）。
　次に、データ処理部３０の位相遅れ算出部３０ｃでは、デジタル化したＲｅ成分データおよびＩｍ成分データから、蛍光信号の位相遅れθが算出される（ステップＳ１８）。
　次に、信号制御部３０ｄでは、算出された位相遅れθが、許容範囲内で予め設定された目標値である４５度に一致するか否かが判定される（ステップＳ２０）。ここで、位相遅れθが許容範囲内で目標値である４５度に一致する場合、変調信号の周波数は変更する制御信号が生成され、周波数可変発振器４０ａに供給される。こうして、変調信号の周波数が変更される（ステップＳ２２）。ここで、周波数の変更は、算出された位相遅れθを用いて、例えば、周波数ｆ＝２πｆ1／ｔａｎ（θ）（ｆ1は、現在設定されている変調信号の周波数）となるように行われる。
　こうして、位相遅れθが許容範囲内で目標値である４５度に一致するまで、ステップＳ１０～Ｓ２２を繰り返す。
　ステップＳ２０の判定で、肯定された場合（Ｙｅｓの場合）、信号制御部３０では、さらに、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るか否かが判定される（ステップＳ２４）。蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入る場合（Ｙｅｓの場合）、蛍光強度算出部３０ｂと蛍光緩和時間算出部３０ｅに、蛍光強度と蛍光緩和時間を算出する決定指示を出す。こうして、蛍光強度算出部３０ｂで算出された蛍光強度と、蛍光緩和時間算出部３０ｅで算出された蛍光緩和時間が、試料１２の計測結果として決定される（ステップＳ２６）。
　蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入らない場合（Ｎｏの場合）、変調信号に用いるＤＣ成分の信号レベルとゲインが変更され（ステップＳ２８）、ステップ１０に戻される。
　こうして、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るまで、ステップＳ１０～Ｓ２４及びステップＳ２８が繰り返される。こうして、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲内に入り最大値となるときの蛍光強度信号の値は、ＤＣ成分の信号レベルとゲインの制御信号の値に基づいて補正されて、出力される。
　算出された計測結果は、ＤＣ成分の信号レベル、ゲイン、変調信号の周波数とともに、図示されないディスプレイあるいはプリンタ等の出力装置に出力される。
　上述の蛍光検出方法は、位相遅れθが設定された範囲に入るか否かを判定し、判定結果が肯定された場合、蛍光強度信号の値が設定された範囲に入るか否かを判定する処理を用いる。しかし、本実施形態は、蛍光強度信号の値が設定された範囲に入るか否かを判定し、判定結果が肯定された場合、位相遅れθが設定された範囲に入るか否かを判定する処理を用いてもよい。
　このような制御は、図１に示すフローサイトメータで行う場合、以下のように実施するとよい。
　すなわち、試料１２は複数のサンプル粒子で構成され、このサンプル粒子はレーザ光による測定場を一定速度で１つずつ断続的に通過する場合を想定する。この場合、信号制御部３０ｄは、サンプル粒子のレーザ光の測定場の通過の開始直後に、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように、変調信号のＤＣ成分の信号レベルおよび可変増幅器４２ａのゲインの制御を開始する。データ処理部３０は、サンプル粒子のレーザ光の測定場の通過終了前に蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入る操作量を見出す。データ処理部３０は、この見出された操作量の条件で得られる位相遅れと変調信号の周波数から蛍光緩和時間を算出する。さらに、データ処理部３０は、設定された時点での蛍光強度信号の値と操作量から蛍光強度を算出する。このとき、同時に、変調信号の周波数の制御も行う。
　また、試料１２が、キュベット等の一定の容器に収容され、静止した状態で、レーザ光の照射を受ける測定装置を用いる場合、以下の測定方法を実施するとよい。すなわち、試料１２が一定の容器に収容され、静止した状態で、レーザ光の照射を受ける場合を想定する。この場合、信号制御部３０は、蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように変調信号のＤＣ成分の信号レベルおよび可変増幅器４２ａのゲインの制御を行って、この制御が整定したときの測定対象物の蛍光の位相遅れを用いて前記蛍光緩和時間を算出する。さらに、制御が整定したときの蛍光強度信号の値と操作量から蛍光強度を算出する。このとき、同時に、変調信号の周波数の制御も行う。
　このように、蛍光信号から得られた蛍光強度信号を用いて、Ｒｅ成分およびＩｍ成分の信号レベルを調整することにより、一定の精度の位相遅れθと蛍光強度を広い範囲で求めることができる。Ｒｅ成分及びＩｍ成分の信号レベルが低い場合、ＩＱミキサ４２ｂやローパスフィルタ４２ｃやＡＤ変換器４４ｂ等においてノイズがＲｅ成分及びＩｍ成分に混入することにより、これらの成分に誤差が含まれ得る。この状態でＡＤ変換を行うと、量子化時の誤差が大きくなり、この後算出する位相遅れθの誤差が大きくなる。しかし、Ｒｅ成分およびＩｍ成分から算出される蛍光強度信号を予め設定された範囲に入るようにすることで、Ｒｅ成分およびＩｍ成分の信号レベルを一定に保つことができるので、本実施形態は、位相遅れθの誤差を一定に抑えることができ、また抑制することができる。
　また、蛍光緩和時間を算出する際、位相遅れが目標値である４５度に近づくように、レーザ光の変調信号の周波数を調整することにより、本実施形態は、位相遅れの蛍光緩和時間に与える非線形の寄与を一定にすることができる。このため、本実施形態は、一定の精度で蛍光緩和時間を算出できる範囲を拡げることができる。例えば、蛍光が１次遅れの緩和応答とした場合、本実施形態は、非線形の部分であるｔａｎθ（θを位相遅れとする）を蛍光緩和時間に限らず略一定の値とすることができるので、位相遅れθが大きい場合と小さい場合でｔａｎθの寄与が大きく異なり、精度が変化することを防止できる。
　特に、位相遅れθを４５度に近づけることにより、変調信号の周波数に対する位相遅れの感度の高いところで位相遅れが算出されるので、精度の高い蛍光緩和時間を算出することができる。
　上記説明では、いずれも位相遅れと蛍光強度信号が制御されるが、位相遅れの制御を行わず、位相遅れθが許容範囲内で目標値に一致するか否かを判定することなく、蛍光強度信号が予め設定された範囲に入るか否かのみを判定し、制御することもできる。
　以上、本実施形態は、蛍光強度および蛍光緩和時間を算出する際、デジタル変換した同相成分と９０度位相成分とを用いて算出される蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように、強度変調に用いる変調信号のＤＣ成分の信号レベルおよび増幅器のゲインの少なくとも一方の操作量を調整する。これにより、本実施形態は、ＡＤ変換時の量子化の誤差に基づく蛍光強度および位相遅れの誤差を一定のレベル内に抑制することができる。このため、本実施形態は、一定の精度で蛍光強度および蛍光緩和時間を算出できる範囲を拡げることができる。
　さらに、本実施形態は、光強度の値が予め設定された範囲に入るように、強度変調に用いる変調信号のＤＣ成分の信号レベルおよび増幅器のゲインの少なくとも一方の操作量を制御する他、蛍光の位相遅れが４５度に近づくように、強度変調の周波数を制御する。これにより、本実施形態は、精度の高い蛍光強度と蛍光緩和時間を広い範囲で算出できる。算出する蛍光緩和時間の長短が大きくても、精度高く算出できる。
　以上、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
１０　フローサイトメータ
１２　試料
２２　レーザ光源部
２２ａ　レーザ光源
２２ｂ，２４ｂ，２６ｂ　レンズ系
２２ｃ　レーザドライバ
２４，２６　受光部
２４ａ，２６ａ　光電変換機
２６ｃ　遮蔽板
２８　制御・信号処理部
３０　データ処理部（コンピュータ）
３０ａ　蛍光強度信号生成部
３０ｂ　蛍光強度算出部
３０ｃ　位相遅れ算出部
３０ｄ　信号制御部
３０ｅ　蛍光緩和時間算出部
３２　管路
３４　回収容器
４０　変調信号制御部
４０ａ　周波数可変発振器
４０ｂ　パワースプリッタ
４０ｃ，４０ｄ，４４ａ　増幅器
４０ｅ　ＤＣ信号発生器
４２　周波数変換部
４２ａ　可変増幅器
４２ｂ　ＩＱミキサ
４２ｃ　ローパスフィルタ
４２ｄ　９０度位相シフタ
４２ｅ，４２ｆ　ミキサ
４４　ＡＤ変換部
４４ｂ　ＡＤ変換器

Claims (10)

  1. 　レーザ光の照射を受けた測定対象物が発する蛍光を受光することにより得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出装置であって、
    　測定対象物に照射するレーザ光を強度変調して出射する光源部と、
    　レーザ光の照射された測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を出力する受光部と、
    　前記光源部から出射するレーザ光を強度変調するための変調信号を生成する光源制御部と、
    　前記受光部で出力された蛍光信号を増幅する増幅器と、増幅した前記蛍光信号の、前記変調信号に対する同相成分と、増幅した前記蛍光信号の、前記変調信号に対して９０度位相のシフトした９０度位相成分と、を生成するミキサと、生成した前記同相成分と前記９０度位相成分をデジタル変換するＡＤ変換器と、を有する第１の処理部と、
    　デジタル変換した前記同相成分と前記９０度位相成分とを用いて、蛍光強度信号と前記変調信号に対する蛍光の位相遅れを算出し、算出した前記蛍光強度信号と前記位相遅れを用いて測定対象物の蛍光の蛍光強度と蛍光緩和時間を算出する第２の処理部と、
    　前記蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように、前記強度変調に用いる変調信号のＤＣ成分の信号レベルおよび前記増幅器のゲインの少なくとも一方の操作量の制御を行う信号制御部と、を有することを特徴とする蛍光検出装置。
  2. 　前記信号制御部は、前記蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るときの前記操作量を見出した後、前記第２の処理部は、この見出した前記操作量の下で得られる蛍光強度信号の値と前記操作量を用いて測定対象物の蛍光の前記蛍光強度を算出し、前記位相遅れを用いて測定対象物の蛍光の蛍光緩和時間を算出する、請求項１に記載の蛍光検出装置。
  3. 　測定対象物は複数のサンプル粒子で構成され、このサンプル粒子はレーザ光による測定場を一定速度で１つずつ断続的に通過し、
    　前記信号制御部は、前記サンプル粒子のレーザ光の測定場の通過の開始直後に、前記蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るように、前記操作量の制御を開始し、前記サンプル粒子の前記レーザ光の測定場の通過終了前に、前記蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入る前記操作量は見出され、見出された前記操作量の条件で得られる前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出するとともに、予め設定された前記範囲に入る蛍光強度信号の値と前記操作量とを用いて前記蛍光強度を算出する、請求項２に記載の蛍光検出装置。
  4. 　前記測定対象物は、一定の容器に収容され、静止した状態で、レーザ光の照射を受け、
    　前記信号制御部は、前記蛍光強度の値が予め設定された範囲に入るように前記操作量の制御を行い、
    　前記第２の処理部は、前記制御が整定したとき前記蛍光強度と前記蛍光緩和時間を算出する、請求項２に記載の蛍光検出装置。
  5. 　前記信号制御部は、前記操作量の制御の他に、前記蛍光の位相遅れの角度が４５度に近づくように、前記強度変調の周波数を制御し、前記周波数の制御が整定したときの蛍光強度信号の値と位相遅れを用いて前記蛍光強度と前記蛍光緩和時間を算出する、請求項１～４のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
  6. 　レーザ光の照射を受けた測定対象物が発する蛍光を受光することにより得られる蛍光信号の信号処理を行う蛍光検出方法であって、
    　レーザ光源部から出射するレーザ光を強度変調するための周波数とＤＣ成分の信号レベルを設定して変調信号を生成し、この変調信号を用いてレーザ光を変調するステップと、
    　前記レーザ光の照射を受けた測定対象物から発する蛍光の蛍光信号を取得するステップと、
    　前記蛍光信号の増幅を行い、前記増幅をした前記蛍光信号の、前記変調信号に対する同相成分と、増幅した前記蛍光信号の、前記変調信号に対して９０度位相のシフトした９０度位相成分とを生成し、生成した前記同相成分と前記９０度位相成分をデジタル変換するステップと、
    　デジタル変換された前記同相成分と前記９０度位相成分とを用いて、蛍光強度と前記変調信号に対する蛍光の位相遅れとを算出するステップと、
    　前記蛍光強度が予め設定された範囲に入るように、前記ＤＣ成分の信号レベルおよび前記増幅のゲインの少なくとも一方の操作量を制御するステップと、
    　前記蛍光強度の値が前記設定された範囲に入るときの前記操作量の条件で得られる前記同相成分と前記９０度位相成分とを用いて蛍光強度信号の値と前記位相遅れを算出し、算出した前記蛍光強度信号の値と前記位相遅れを用いて、測定対象物の発する蛍光の蛍光強度と蛍光緩和時間を算出するステップと、を有することを特徴とする蛍光検出方法。
  7. 　前記蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入るときの前記操作量を見出した後、この見出した操作量の条件の下で得られる蛍光強度信号の値と位相遅れを用いて、測定対象物の蛍光の前記蛍光強度と前記蛍光緩和時間を算出する、請求項６に記載の蛍光検出方法。
  8. 　測定対象物は複数のサンプル粒子で構成され、このサンプル粒子はレーザ光による測定場を一定速度で１つずつ断続的に通過し、
    　前記サンプル粒子のレーザ光の測定場の通過の開始直後に、前記蛍光強度の値が予め設定された範囲に入るように、前記操作量の制御を開始し、前記サンプル粒子の前記レーザ光の測定場の通過終了前に、前記蛍光強度信号の値が予め設定された範囲に入る前記操作量は見出され、見出された前記操作量の条件で得られる前記位相遅れと前記変調信号の周波数から前記蛍光緩和時間を算出するとともに、予め設定された前記範囲に入る蛍光強度信号の値と前記操作量とを用いて前記蛍光強度を算出する、請求項７に記載の蛍光検出方法。
  9. 　前記測定対象物は、一定の容器に収容され、静止した状態で、レーザ光の照射を受け、
    　前記蛍光強度の値が予め設定された範囲に入るように前記操作量の制御を行って、前記制御が整定したときの蛍光強度信号の値と測定対象物の蛍光の位相遅れを用いて前記蛍光強度と前記蛍光緩和時間を算出する、請求項７に記載の蛍光検出方法。
  10. 　前記操作量を制御するステップでは、前記操作量の制御の他に、前記蛍光の位相遅れの角度が４５度に近づくように、前記強度変調の周波数を制御し、前記周波数の制御が整定したときの蛍光強度信号の値と位相遅れを用いて前記蛍光強度と前記蛍光緩和時間を算出する、請求項６～９のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
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