WO2010086565A1 - Procede d'isolement ou de denombrement de microorganismes sur un milieu de culture gelose - Google Patents

Procede d'isolement ou de denombrement de microorganismes sur un milieu de culture gelose Download PDF

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WO2010086565A1
WO2010086565A1 PCT/FR2010/050146 FR2010050146W WO2010086565A1 WO 2010086565 A1 WO2010086565 A1 WO 2010086565A1 FR 2010050146 W FR2010050146 W FR 2010050146W WO 2010086565 A1 WO2010086565 A1 WO 2010086565A1
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culture medium
agar culture
suspension
sample
microorganisms
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PCT/FR2010/050146
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Bruno Colin
Aurélien COSTA
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bioMérieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the field of the invention is that of the analysis of target microorganisms in a complex sample. More particularly, the present invention relates to a method for isolating or even counting microorganisms on an agar culture medium from a liquid sample to be analyzed or a suspension of microorganisms.
  • Isolation of microorganisms on agar culture medium, from a liquid sample to be analyzed or a suspension of microorganisms, is a step often indispensable to many microbiological analysis processes. This step is used in particular to carry out identifications, to verify the microbial purity of a sample or to carry out a bacterial count by counting the isolated colonies thus obtained.
  • the sample to be analyzed contains an undetermined amount of germs that can range from zero to more than 10 8 bacteria per milliliter (ml).
  • a determined volume of each dilution thus produced is then spread on agar medium.
  • the Petri dishes corresponding to each of the dilutions are then incubated in a thermostated chamber. After microbial growth, it is possible to select the petri dish of agar medium whose microbial load on the box is sufficiently low to distinguish and possibly transplant isolated colonies.
  • EP-O 242 114 which describes an apparatus and a method for seeding a culture medium with a sample.
  • the method consists in making several segments of spreading from an inoculum. These segments are in the form of an arc and are made by means of four different spreading heads. A dilution effect of the sample is obtained by partial overlap of the subsequent segments.
  • the method described in the document is in fact very close to the manual reference isolation method which consists of producing several segments of spreading from a single inoculum by performing overlapping segments in order to load the seeding means. in bacteria and to obtain a depletion of bacteria during the subsequent spreading segment.
  • FR-A-2 694 570 describes a method and a system for depositing bacterial solutions on a culture medium using a stylet in fluid communication via a hose to a bacterial solution dispenser and fed by means of a cylinder.
  • the bacterial solution is deposited in the form of spirals or spots, by rotational displacement of the culture medium on an ad hoc platform at the same time that the bacterial solution is poured onto the medium.
  • Such a method can not be considered as an isolation method insofar as the bacterial solution is discharged throughout the movement of the medium by rotation. Indeed, there is no depletion in bacterial solution and therefore in bacteria.
  • a first objective of the present invention is therefore to provide a process for isolating microorganisms that is more efficient than the methods of the state of the art.
  • a second object of the present invention is to provide a method of enumeration more efficient than the methods of the state of the art.
  • a third objective of the present invention is to provide a method for isolating, or even counting, microorganisms making it possible to obtain isolated colonies on a very wide range of microorganism charges.
  • a fourth objective of the present invention is to provide a method for isolating, or even counting, microorganisms to obtain a reliable evaluation of the microorganism load of the sample or initial suspension (e).
  • a fifth object of the present invention is to provide a method of isolating, or even counting, microorganisms exploitable on a reduced surface of agar culture medium.
  • a second object of the present invention relates to a method of enumeration of microorganisms on an agar culture medium comprising the steps of:
  • the rupture and the restoration of the contact between the seeding means and the agar culture medium during the displacement of said means can be likened to a jump of said means.
  • This jump allows the seeding means to be depleted in sample or suspension. Indeed, as long as the seeding means is in contact with the agar culture medium, it entrains the liquid by capillary drainage.
  • said seeding means is removed from the surface of the culture medium, until the liquid recoil. There is no longer any entrainment of the liquid vein. During this recess, the seeding means carries with it a fraction of sample or suspension remained attached to said seeding means.
  • the displacement of the seeding means, while the latter is out of contact with the culture medium, is continued in a direction substantially parallel to the surface of said culture medium.
  • This displacement must be sufficient so that, when the contact between the seeding means and the agar culture medium is restored, this new contact point is sufficiently far from the last point of contact before rupture, to avoid any contact between the seeding medium and the previous spreading. Indeed, such contact may lead to sample transfer or suspension of the first spread, and associated bacteria, on the seeding means thus limiting the depletion phenomenon.
  • the seeding means resumes its horizontal displacement on the agar culture medium, causing the fraction of sample or suspension remained attached, by capillary drainage and allowing a new spread of this fraction.
  • the factors that influence the amount of sample or suspension retained on the seeding means during the contact break are essentially: the wettability of the agar culture medium;
  • the seeding means has a multitude of contact surfaces with said culture medium.
  • Such seeding means may be for example an applicator used with the PREVI TM Isola system, as protected in the patent application WO-A-2005071055.
  • the seeding means has a single contact surface with said culture medium.
  • Such means may be for example a oese, a platinum loop or a swab.
  • the displacement of the seeding means may advantageously be a rectilinear movement.
  • Straight movement means one or more rectilinear segments, possibly of different directions. Such a movement is conventionally used in the traditional process of isolation with a platinum handle or loop.
  • the displacement of the seeding means is a curvilinear displacement.
  • Such a movement is the one used in the PREVI TM Isola system.
  • the displacement of the seeding means follows the edges of the petri dish when it is a round box.
  • this curvilinear movement makes it possible to increase the length of the spreading.
  • the method according to the invention can be implemented by means of an automated system.
  • a particularly suitable system is the PREVI TM Isola system marketed by the applicant.
  • the number of times that the contact between said seeding means and the surface of the agar culture medium is broken and restored is between 2 and 6 times.
  • the volume of sample or suspension deposited on the agar culture medium is between 10 and 1000 ⁇ l.
  • the spreading segments are of variable lengths. Indeed, for the same isolation, it may be advantageous to produce successive spreading segments of different lengths. This is particularly the case for samples suspected of being excessively loaded with microorganisms.
  • Several spreading segments of limited length will make it possible to deplete the seeding means very rapidly, on a very small surface of culture medium.
  • the subsequent plating segments are longer in length to allow isolated colonies to be obtained.
  • FIG. 1 represents the views of a comparative analysis between an isolation carried out according to the traditional method and isolations carried out according to various procedures of the method of the invention, with a bacterial suspension at approximately 10 8 CFU / ml.
  • FIG. 2 represents the views of a comparative analysis between an isolation carried out according to the traditional method and isolations carried out according to various procedures of the method of the invention, with a bacterial suspension at approximately 10 7 CFU / ml.
  • FIG. 3 represents the snapshots of a comparative analysis between an isolation carried out according to the traditional method and an isolation carried out according to the method of the invention, followed by a count of the bacterial colonies, with suspensions having variable bacterial charges.
  • FIG. 4 represents the snapshots of a comparative analysis between a count of bacterial colonies, made according to the traditional method and a count of bacterial colonies, made according to the method of the invention, as well as the evaluation of the volume distribution factor. bacterial suspension after each contact resumption.
  • Example 1 Obtain isolated colonies from a highly contaminated solution on a reduced agar surface:
  • Figure IA no jump (suspension at approximately 10 8 CFU / ml)
  • Figure IB 5 jumps (suspension at approximately 10 8 CFU / ml)
  • Figure IC 6 jumps (suspension at approximately 10 8 CFU / ml) - Figure ID: 7 jumps (suspension at approximately 10 8 CFU / ml)
  • Figure 2A no jump (suspension at approximately 10 7 CFU / ml)
  • Figure 2B 3 jumps (suspension at approximately 10 7 CFU / ml)
  • Figure 2C 6 jumps (suspension at approximately 10 7 CFU / ml)
  • the width (10 cm) of the Petri dish is not sufficient to allow isolated colonies to be obtained with spreading by the traditional method, namely by displacing the means of spreading without making jump ( Figure IA).
  • Example 2 Interests of a jumping spread for the production of a model allowing a reliable count of the microbial load of a sample on an agar medium:
  • Procedure 100 ⁇ l of solutions loaded with Staphylococcus aureus at different concentrations obtained by successive 10-fold dilutions are deposited on the edge of an agar culture medium. This volume is then spread manually and rectilinearly using the applicator used on the PREVI TM Isola system. A control spread is achieved without jumping with the applicator. From a deposit identical to the control condition, a spread comprising 4 successive jumps is carried out in parallel, these 4 jumps defining 5 distinct zones, designated zone 1 to zone 5.
  • line A corresponds to the results obtained with a bacterial load of between 80,000 and 130,000 CFU.
  • Line B corresponds to the results obtained with a bacterial load of between 8,000 and 13,000 CFU.
  • Line C corresponds to the results obtained with a bacterial load of between 800 and 1300 CFU.
  • Line D corresponds to the results obtained with a bacterial load of between 80 and 130 CFU.
  • line A, right column, zones 4 and 5 have respectively 67 and 34 isolated colonies.
  • Line B, zones 3, 4 and 5 have respectively 116, 24 and 6 isolated colonies.
  • Zone 4 has no colony.
  • zones 1, 2 and 3 have respectively 115, 14 and 1 isolated colonies. The charge is quite low, zones 4 and 5 are virgin of all bacteria.
  • zone 1 which is the deposition zone of the 100 ⁇ l of suspension
  • zone 2 the volume deposited is of the order of 15% of the initial volume.
  • zone 3 it is between 1 and 2% of the volume that is deposited.
  • the number of colonies is approximately divided by ten.
  • zone-level solution volume distribution data By combining zone-level solution volume distribution data with the corresponding enumeration values, it is possible by a simple mathematical approach to design a computational model that allows an evaluation of the initial microbial load present in the base sample. In view of the improvement that besides the automation of the seeding, this method would allow by a single seeding to accurately count the microbial load of a solution over a wide range of microbial load.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'isolement de microorganismes sur un milieu de culture gélose comprenant les étapes consistant à :Déposer sur ledit milieu de culture gélose, un volume déterminé d'un échantillon à analyser susceptible de contenir lesdits microorganismes ou d'une suspension desdits microorganismes, Appliquer un moyen d'ensemencement sur ledit milieu de culture gélose, en contact avec le volume d'échantillon ou de suspension, Déplacer le moyen d'ensemencement de façon à étaler tout ou partie du volume d'échantillon ou de suspension, sur la surface du milieu de culture gélose, le déplacement dudit moyen d'ensemencement étant discontinu, de sorte que durant ce déplacement, le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli à au moins une reprise, créant des segments d'étalement et entraînant un appauvrissement du moyen d'ensemencement en échantillon ou en suspension, et Incuber ledit milieu de culture gélose dans des conditions permettant la croissance de microorganismes.

Description

PROCEDE D'ISOLEMENT OU DE DENOMBREMENT DE MICROORGANISMES SUR UN MILIEU DE CULTURE GELOSE
Le domaine de l'invention est celui de l'analyse de microorganismes cibles dans un échantillon complexe. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé d'isolement, voire de dénombrement, de microorganismes sur un milieu de culture gélose à partir d'un échantillon liquide à analyser ou d'une suspension de microorganismes.
L'isolement de microorganismes sur milieu de culture gélose, à partir d'un échantillon liquide à analyser ou d'une suspension de microorganismes, est une étape souvent indispensable à de nombreux procédés d'analyse microbiologique. Cette étape est notamment utilisée pour réaliser des identifications, vérifier la pureté microbienne d'un échantillon ou encore effectuer un dénombrement bactérien par comptage des colonies isolées ainsi obtenues.
L'une des problématiques majeures pour cette étape d'isolement des bactéries est liée au rapport entre la quantité de microorganismes à étaler et la surface exploitable. En effet, la plupart des supports de milieux géloses ont une surface ne permettant l'isolement que d'une quantité de bactéries comprise entre 15 et 300 UFC (Unité Formant Colonie) donnant tout autant de colonies après croissance.
Dans la plupart des cas, l'échantillon à analyser contient une quantité indéterminée de germes pouvant varier de zéro à plus de 108 bactéries par millilitre (ml). Ainsi, pour s'assurer d'un isolement efficace, il est nécessaire en amont de l'étalement sur milieu de culture gélose, de procéder à une série de dilutions en cascade (fréquemment d'un facteur 10), afin de réduire par paliers successifs la charge microbienne de l'échantillon. Un volume déterminé de chaque dilution ainsi réalisée est ensuite étalé sur milieu gélose. Les boites de Pétri correspondant à chacune des dilutions sont ensuite incubées dans une enceinte thermostatée. Après croissance microbienne, il est possible de sélectionner la boite de pétri de milieu gélose dont la charge microbienne sur boite est suffisamment faible pour distinguer et éventuellement repiquer des colonies isolées.
Dans l'optique de réaliser un dénombrement microbien, il est indispensable d'utiliser une boite de pétri ne comprenant que des colonies isolées. Le résultat obtenu de cette façon est considéré fiable lorsqu'il est compris entre 15 et 300 colonies isolées. Bien qu'efficace, la réalisation de méthodes classiques d'isolement telles que décrites précédemment présentent l'inconvénient d'être très laborieuses et de consommer un nombre important de réactifs (boites de pétri, tubes de diluants, oeses etc., générateur d'un volume élevé de déchets (autoclavage, coût du traitement).
Certaines méthodes manuelles se sont vues automatisées grâce à la mise au point de dispositif. C'est le cas par exemple du document EP-O 242 114 qui décrit un appareil et une méthode d'ensemencement d'un milieu de culture avec un échantillon. La méthode consiste à réaliser plusieurs segments d'étalement à partir d'un inoculum. Ces segments sont sous la forme d'arc de cercle et sont réalisés au moyen de quatre têtes d'étalement différentes. Un effet de dilution de l'échantillon est obtenu par chevauchement partiel des segments subséquents. La méthode décrite dans le document est en fait très proche de la méthode d'isolement manuelle de référence qui consiste à réaliser plusieurs segments d'étalement à partir d'un seul inoculum en réalisant des chevauchements des segments afin de charger le moyen d'ensemencement en bactéries et d'obtenir un appauvrissement en bactéries lors du segment d'étalement subséquent.
Le document FR- A-2 694 570 décrit un procédé et un système pour déposer des solutions bactériennes sur un milieu de culture à l'aide d'un stylet en communication fluidique via un tuyau à un distributeur de solution bactérienne et alimenté au moyen d'un vérin. La solution bactérienne est déposée sous forme de spirales ou de spots, par déplacement en rotation du milieu de culture sur une plateforme ad hoc en même temps que la solution bactérienne est déversée sur le milieu. Une telle méthode ne peut être considérée comme une méthode d'isolement dans la mesure où la solution bactérienne est déversée tout au long du déplacement du milieu par rotation. En effet, il n'y a pas d'appauvrissement en solution bactérienne et donc en bactéries.
Plus récemment, de nouvelles méthodes d'isolement ont vu le jour, permettant l'amélioration de l'épuisement bactérien par l'usage d'un applicateur optimisé (WO-A-2005071055). C'est le cas notamment de la méthode d'ensemencement mise en œuvre dans l'automate commercialisé par la demanderesse sous la référence PREVI™ Isola. La mise en oeuvre de cette nouvelle méthode d'isolement permet l'obtention de colonies isolées à partir d'une gamme plus large de charge microbienne dans l'échantillon initial à analyser. En dépit de l'amélioration apportée par l'utilisation de cet applicateur optimisé, la contrainte liée au rapport charge microbienne / surface de gélose reste réelle et l'utilisation de cette technique peut trouver ses limites avec des échantillons très fortement contaminés. De plus, cette technique ne permet pas à l'heure actuelle de réaliser une évaluation précise de la charge microbienne de l'échantillon initial du fait de la proximité des colonies difficiles à compter.
II ressort de l'état de la technique considéré qu'il n'existe pas de méthode d'isolement, voire de dénombrement de microorganismes, simple à mettre en œuvre à partir d'un échantillon à analyser ou d'une suspension bactérienne, sur un unique milieu de culture gélose et qui permette d'obtenir, sur une surface limitée de gélose, des colonies isolées quelle que soit la charge bactérienne initiale dudit échantillon ou de ladite suspension.
Un premier objectif de la présente invention est donc de fournir un procédé d'isolement de microorganismes plus performant que les procédés de l'état de la technique. Un deuxième objectif de la présente invention est de fournir un procédé de dénombrement plus performant que les procédés de l'état de la technique. Un troisième objectif de la présente invention est de fournir un procédé d'isolement, voire de dénombrement, de microorganismes permettant l'obtention de colonies isolées sur gamme de charges en microorganismes très large.
Un quatrième objectif de la présente invention est de fournir un procédé d'isolement, voire de dénombrement, de microorganismes permettant d'obtenir une évaluation fiable de la charge en microorganismes de l'échantillon ou de la suspension initial(e).
Un cinquième objectif de la présente invention est de fournir un procédé d'isolement, voire de dénombrement, de microorganismes exploitable sur une surface réduite de milieu de culture gélose.
Ces objectifs parmi d'autres sont atteints par la présente invention, qui concerne en premier lieu, un procédé d'isolement de microorganismes sur un milieu de culture gélose comprenant les étapes consistant à :
• Déposer sur ledit milieu de culture gélose, un volume déterminé d'un échantillon à analyser susceptible de contenir lesdits microorganismes ou d'une suspension desdits microorganismes,
• Appliquer sur ledit milieu de culture gélose, en contact avec le volume d'échantillon ou de suspension, un moyen d'ensemencement,
• Déplacer le moyen d'ensemencement de façon à étaler tout ou partie du volume d'échantillon ou de suspension sur la surface du milieu de culture gélose, le déplacement horizontal dudit moyen d'ensemencement étant discontinu, de sorte que durant ce déplacement, le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli à au moins une reprise, créant des segments d'étalement successifs et entraînant un appauvrissement du moyen d'ensemencement en échantillon ou en suspension, et
• Incuber ledit milieu de culture gélose dans des conditions permettant la croissance de microorganismes.
Un deuxième objet de la présente invention concerne un procédé de dénombrement de microorganismes sur un milieu de culture gélose comprenant les étapes consistant à :
• Déposer sur ledit milieu de culture gélose, un volume déterminé d'un échantillon à analyser susceptible de contenir lesdits microorganismes ou d'une suspension desdits microorganismes,
• Appliquer sur ledit milieu de culture gélose, en contact avec le volume d'échantillon ou de suspension, un moyen d'ensemencement,
• Déplacer le moyen d'ensemencement de façon à étaler tout ou partie du volume d'échantillon ou de suspension sur la surface du milieu de culture gélose, le déplacement horizontal dudit moyen d'ensemencement étant discontinu, de sorte que durant ce déplacement, le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli à au moins une reprise, créant des segments d'étalement successifs et entraînant un appauvrissement du moyen d'ensemencement en échantillon ou en suspension,
• Incuber ledit milieu de culture gélose dans des conditions permettant la croissance de microorganismes, et
• Compter les colonies de microorganismes présentes à la surface du milieu de culture gélose.
Selon l'invention, la rupture et le rétablissement du contact entre le moyen d'ensemencement et le milieu de culture gélose pendant le déplacement dudit moyen peut s'apparenter à un saut dudit moyen. Ce saut permet au moyen d'ensemencement d'être appauvri en échantillon ou suspension. En effet, tant que le moyen d'ensemencement est en contact avec le milieu de culture gélose, il entraîne le liquide par drainage capillaire. Lors de la rupture de contact entre le moyen d'ensemencement et le milieu de culture gélose, ledit moyen d'ensemencent est éloigné de la surface du milieu de culture, jusqu'au décrochement du liquide. Il ne se produit alors plus d'entraînement de la veine liquide. Lors de ce décrochement, le moyen d'ensemencement entraîne avec lui une fraction d'échantillon ou de suspension restée accrochée audit moyen d'ensemencement.
Le déplacement du moyen d'ensemencement, pendant que ce dernier est hors de contact avec le milieu de culture, est poursuivi selon une direction sensiblement parallèle à la surface dudit milieu de culture. Ce déplacement doit être suffisant pour que, lorsque le contact entre le moyen d'ensemencement et le milieu de culture gélose est rétabli, ce nouveau point de contact soit suffisamment loin du dernier point de contact avant rupture, afin d'éviter tout contact entre le moyen d'ensemencement et l'étalement précédent. En effet, un tel contact peut entraîner un transfert de d'échantillon ou de suspension du premier étalement, et des bactéries associées, sur le moyen d'ensemencement limitant ainsi le phénomène d'appauvrissement. Par ailleurs, ceci reviendrait à réaliser un isolement traditionnel, dans lequel durant un étalement le moyen d'ensemencement recoupe les étalements précédents, afin d'être rechargé.
Lorsque le contact est rétabli, le moyen d'ensemencement reprend son déplacement horizontal sur le milieu de culture gélose, entraînant la fraction d'échantillon ou de suspension restée accrochée, par drainage capillaire et permettant un nouvel étalement de cette fraction.
Plusieurs sauts successifs du moyen d'ensemencement peuvent être réalisés, de sorte qu'à chaque rupture de contact, un décrochement de liquide se produit, accentuant l'appauvrissement en échantillon ou suspension du moyen d'ensemencement.
Les facteurs qui influent sur la quantité d'échantillon ou suspension retenue sur le moyen d'ensemencement lors de la rupture de contact sont essentiellement : - la mouillabilité du milieu de culture gélose
- la tension superficielle de l'échantillon ou de la suspension.
Ces deux paramètres influencent l'angle de contact entre la fraction liquide d'échantillon ou de suspension et la surface du milieu de culture et donc la force nécessaire pour rompre la veine liquide. Ces deux paramètres sont par essence variables selon le type de milieu de culture gélose utilisé, mais également le type d'échantillon ou de suspension à analyser.
Avantageusement, dans les procédés selon l'invention, le moyen d'ensemencement présente une multitude de surfaces de contact avec ledit milieu de culture. Un tel moyen d'ensemencement peut être par exemple un applicateur utilisé avec le système PREVI™ Isola, tel que protégé dans la demande de brevet WO-A-2005071055. Alternativement, le moyen d'ensemencement présente une seule surface de contact avec ledit milieu de culture. Un tel moyen peut être par exemple une oese, une anse de platine ou un écouvillon.
Le déplacement du moyen d'ensemencement peut avantageusement être un déplacement rectiligne. Par mouvement rectiligne, on entend un seul ou plusieurs segments rectilignes, éventuellement de directions différents. Un tel mouvement est classiquement utilisé dans le procédé traditionnel d'isolement à l'aide d'une oese ou d'une anse de platine.
Alternativement, le déplacement du moyen d'ensemencement est un déplacement curviligne. Un tel mouvement est celui utilisé dans le système PREVI™ Isola. En effet, le déplacement du moyen d'ensemencement suit les bords de la boite de Pétri lorsque celle-ci est une boite ronde. Par ailleurs, lorsque la moyen d'ensemencement présente plusieurs surfaces de contact avec le milieu de culture, ce déplacement curviligne permet d'augmenter la longueur de l'étalement.
Avantageusement, le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre au moyen d'un système automatisé. Un système particulièrement adapté est le système PREVI™ Isola commercialisé par la demanderesse.
Selon un mode de réalisation préférentiel, le nombre de fois où le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli est compris entre 2 et 6 fois.
Selon un autre mode de réalisation préférentiel, le volume d'échantillon ou de suspension déposé(e) sur le milieu de culture gélose est compris(e) entre 10 et lOOOμl.
Sur un mode de réalisation particulièrement avantageux, les segments d'étalement sont de longueurs variables. En effet, pour un même isolement, il peut être intéressant de réaliser des segments d'étalement successifs de longueurs différentes. C'est le cas notamment pour des échantillons suspectés d'être excessivement chargés en microorganismes. Plusieurs segments d'étalement de longueur limitée vont permettre d'appauvrir le moyen d'ensemencement de façon très rapide, sur un très petite surface de milieu de culture. Les segments d'étalement subséquents sont, par contre, de longueur plus importante pour permettre l'obtention de colonies isolées. Les buts et avantages du procédé selon l'invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée qui suit, en lien avec le dessin dans lequel :
La figure 1 représente les clichés d'une analyse comparative entre un isolement réalisé selon la méthode traditionnelle et des isolements réalisés selon différents modes opératoires de la méthode de l'invention, avec une suspension bactérienne à environ 108 UFC/ml.
La figure 2 représente les clichés d'une analyse comparative entre un isolement réalisé selon la méthode traditionnelle et des isolements réalisés selon différents modes opératoires de la méthode de l'invention, avec une suspension bactérienne à environ 107 UFC/ml.
La figure 3 représente les clichés d'une analyse comparative entre un isolement réalisé selon la méthode traditionnelle et un isolement réalisé selon la méthode de l'invention, suivi d'un dénombrement des colonies bactériennes, avec des suspensions présentant des charges bactériennes variables.
La figure 4 représente les clichés d'une analyse comparative entre un dénombrement des colonies bactériennes, réalisés selon la méthode traditionnelle et un dénombrement des colonies bactériennes, réalisés selon la méthode de l'invention, ainsi que l'évaluation du facteur de distribution de volume de suspension bactérienne après chaque reprise de contact.
EXEMPLES
Exemple 1 : Obtention de colonies isolées à partir d'une solution fortement contaminée, sur une surface de gélose réduite :
Mode opératoire : lOOμl d'une solution fortement chargée en Staphylococcus aureus (107 ou 108 UFC/ml) sont déposés sur le bord d'une boite de milieu de culture gélose. Ce volume est ensuite étalé manuellement et de façon rectiligne à l'aide d'un moyen d'étalement constitué l'applicateur utilisé avec le système PREVI™ Isola, tel que protégé dans la demande de brevet WO-A-2005071055. Un étalement témoin est réalisé sans effectuer de saut avec l'applicateur. A partir d'un dépôt identique à la condition témoin, différentes étalements sont réalisés en parallèle avec ajout d'un nombre croissant de sauts durant l'étalement.
Figure IA : aucun saut (suspension à environ 108 UFC/ml) - Figure IB : 5 sauts (suspension à environ 108 UFC/ml)
Figure IC : 6 sauts (suspension à environ 108 UFC/ml) - Figure ID : 7 sauts (suspension à environ 108 UFC/ml)
Figure 2A : aucun saut (suspension à environ 107 UFC/ml) - Figure 2B : 3 sauts (suspension à environ 107 UFC/ml)
Figure 2C : 6 sauts (suspension à environ 107 UFC/ml)
Après incubation, une recherche des colonies isolées est effectuée et une mesure de la longueur d'étalement nécessaire à l'obtention de ces colonies est réalisée.
Résultats :
Concernant la suspension à 108 UFC/ml, la largeur (10 cm) de la boite de Pétri n'est pas suffisante pour permettre l'obtention de colonies isolées avec un étalement par la méthode traditionnelle, à savoir en déplaçant le moyen d'étalement sans réaliser de saut (figure IA).
Lorsque 5 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 7,5 cm de longueur d'étalement.
Lorsque 6 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 4,5 cm de longueur d'étalement.
Lorsque 7 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 1,5 cm de longueur d'étalement.
Concernant la suspension à 107 UFC/ml, avec un étalement par la méthode traditionnelle, les premières colonies isolées apparaissent après 7,2 cm de longueur d'étalement (figure 2A).
Lorsque 3 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 3 cm de longueur d'étalement. Lorsque 6 sauts du moyen d'étalement sont réalisés de manière régulière sur le milieu de culture, les premières colonies isolées apparaissent après 4 cm de longueur d'étalement.
Les résultats obtenus montrent que, lorsqu'on effectue des sauts avec le moyen d'ensemencement lors de l'étalement de l'échantillon sur le milieu de culture, l'épuisement en bactéries est plus performant permettant ainsi l'obtention de colonies isolées sur une surface réduite de milieu de culture gélose. Par ailleurs, on constate que plus le nombre de sauts est important, plus la longueur d'étalement de l'échantillon nécessaire à l'obtention de colonies isolées est réduite.
Exemple 2 : Intérêts d'un étalement par saut pour la réalisation d'un modèle permettant un dénombrement fiable de la charge microbienne d'un échantillon sur un milieu gélose :
Mode opératoire : lOOμl de solutions chargées en Staphylococcus aureus à différentes concentrations obtenues par dilutions successives d'un facteur 10 sont déposés sur le bord d'un milieu de culture gélose. Ce volume est ensuite étalé manuellement et de façon rectiligne à l'aide de l'applicateur utilisé sur le système PREVI™ Isola. Un étalement témoin est réalisé sans effectuer de saut avec l'applicateur. A partir d'un dépôt identique à la condition témoin, un étalement comprenant 4 sauts successifs est réalisé en parallèle, ces 4 sauts définissant 5 zones distinctes, désignées zone 1 à zone 5.
Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 3, sur laquelle, la colonne de gauche correspond aux étalements témoins et la colonne de droite aux étalements selon la procédé selon l'invention, avec sauts successifs.
Par ailleurs, la ligne A correspond aux résultats obtenus avec une charge bactérienne comprise entre 80 000 et 130 000 UFC.
La ligne B correspond aux résultats obtenus avec une charge bactérienne comprise entre 8 000 et 13 000 UFC. La ligne C correspond aux résultats obtenus avec une charge bactérienne comprise entre 800 et 1 300 UFC.
La ligne D correspond aux résultats obtenus avec une charge bactérienne comprise entre 80 et 130 UFC.
Après incubation des milieux de culture, un dénombrement des colonies isolées est effectué sur chaque zone délimitée par un saut de peigne réalisé lors de l'étalement. Résultats :
II apparaît en premier lieu, que certaines zones ne sont pas dénombrables du fait de la proximité des colonies non isolées.
Les résultats témoins (sans saut) montrent qu'avec un étalement classique, un dénombrement n'est réalisable qu'avec la charge bactérienne la plus faible (de l'ordre de 100 UFC). Ainsi, comme on peut le voir, figure 3, ligne D, colonne de gauche, environ 80 colonies sont isolées.
L'optimisation de l'étalement, par sauts (4 dans cet exemple), permet avec une même charge initiale de délimiter clairement plusieurs zones dont certaines présentent uniquement des colonies isolées et donc comptables.
Ainsi, ligne A, colonne de droite, les zones 4 et 5 comptent respectivement 67 et 34 colonies isolées.
Ligne B, les zones 3, 4 et 5 comptent respectivement 116, 24 et 6 colonies isolées.
Ligne C, les zones 2, 3 et 5 comptent respectivement 113, 11 et 2 colonies isolées. La zone 4 ne comporte aucune colonie.
Ligne D, les zones 1, 2 et 3 comptent respectivement 115, 14 et 1 colonies isolées. La charge étant assez faible, les zones 4 et 5 sont vierges de toutes bactéries.
Dans cet exemple, on observe ainsi une relation étroite entre la charge bactérienne de la suspension et la première zone dénombrable. Il apparaît en effet un décalage de la première zone dénombrable avec l'augmentation d'un facteur 10 de la charge microbienne. La répartition est présentée dans le tableau 1 ci-dessous:
Figure imgf000012_0001
Tableau 1 Ainsi, un modèle mathématique apparaît aisément réalisable pour permettre, à partir de la lecture d'une ou plusieurs zone(s) dénombrable(s), d'obtenir une évaluation relativement précise de la charge bactérienne initiale de la solution.
Exemple 3 : Evaluation du facteur de distribution de volume de solution par la méthode d'étalement par saut
Mode opératoire :
A partir d'une solution calibrée à une charge bactérienne théorique de lOOO UFC/ml, on dépose lOOμl de solution dans la zone de dépôt que l'on étale avec l'applicateur utilisé sur le système PREVI™ Isola, en effectuant ou non des sauts. Le nombre de saut effectués étant compris entre 5 et 8. Après incubation, un dénombrement est réalisé sur chacune des zones délimitées par les sauts. Les résultats sont regroupés sur la figure 4. La ligne A correspond à un étalement sans saut. Les lignes B, C, D et E correspondent respectivement à des étalements avec 5, 6, 7 et 8 sauts.
Résultats :
Le nombre de colonies isolées pour chaque zone est reporté dans le tableau 2 ci- dessous :
Figure imgf000013_0001
Tableau 2
En considérant la répartition des bactéries comme homogène dans la suspension, il est ainsi possible de déterminer le volume de suspension étalé sur chaque zone, en faisant une simple règle de trois. Les résultats sont regroupés dans le tableau 3 ci-dessous :
Figure imgf000014_0001
Tableau 3
L'analyse des résultats obtenus ci-dessous montre une certaine homogénéité dans la répartition des volumes. En effet, en tenant compte du fait que l'étalement est réalisé manuellement, et par conséquent avec une reproductibilité limitée, on observe aux niveaux des zones 1 à 3 un profil sensiblement similaire de répartition du volume de suspension.
Ainsi, dans la zone 1 qui est la zone de dépôt des 100 μl de suspension, environ 80 % du volume initial reste. Dans la zone 2, le volume déposé est de l'ordre de 15 % du volume initial. Enfin, dans la zone 3, c'est entre 1 et 2% du volume qui est déposé. Les valeurs ainsi obtenues d'une zone à l'autre sont assez proches d'une répartition logarithmique.
Autrement dit, d'une zone à la suivante, le nombre de colonies est environ divisé par dix.
En combinant des données de répartition des volumes de solution par zone, et les valeurs de dénombrement correspondantes, il est possible par une approche mathématique simple de concevoir un modèle de calcul permettant une évaluation de la charge microbienne initiale présente dans l'échantillon de base. Compte tenu de l'amélioration que peut par ailleurs apporter l'automatisation de l'ensemencement, cette méthode permettrait par un unique ensemencement de dénombrer avec précision la charge microbienne d'une solution sur une gamme large de charge microbienne.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'isolement de microorganismes sur un milieu de culture gélose comprenant les étapes consistant à : • Déposer sur ledit milieu de culture gélose, un volume déterminé d'un échantillon à analyser susceptible de contenir lesdits microorganismes ou d'une suspension desdits microorganismes,
• Appliquer un moyen d'ensemencement sur ledit milieu de culture gélose, en contact avec le volume d'échantillon ou de suspension, • Déplacer le moyen d'ensemencement de façon à étaler tout ou partie du volume d'échantillon ou de suspension, sur la surface du milieu de culture gélose, le déplacement dudit moyen d'ensemencement étant discontinu, de sorte que durant ce déplacement, le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli à au moins une reprise, créant des segments d'étalement successifs et entraînant un appauvrissement du moyen d'ensemencement en échantillon ou en suspension, et
• Incuber ledit milieu de culture gélose dans des conditions permettant la croissance de microorganismes.
2. Procédé de dénombrement de microorganismes sur un milieu de culture gélose comprenant les étapes consistant à :
• Déposer sur ledit milieu de culture gélose, un volume déterminé d'un échantillon à analyser susceptible de contenir lesdits microorganismes ou d'une suspension desdits microorganismes,
• Appliquer sur ledit milieu de culture gélose, en contact avec le volume d'échantillon ou de suspension, un moyen d'ensemencement,
• Déplacer le moyen d'ensemencement de façon à étaler tout ou partie du volume d'échantillon ou de suspension, sur la surface du milieu de culture gélose, le déplacement dudit moyen d'ensemencement étant discontinu, de sorte que durant ce déplacement, le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli à au moins une reprise, créant des segments d'étalement successifs et entraînant un appauvrissement du moyen d'ensemencement en échantillon ou en suspension, et • Incuber ledit milieu de culture gélose dans des conditions permettant la croissance de microorganismes
• Compter les colonies de microorganismes présentes à la surface du milieu de culture gélose.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le moyen d'ensemencement présente une multitude de surfaces de contact avec ledit milieu de culture.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le moyen d'ensemencement présente une seule surface de contact avec ledit milieu de culture.
5. Procédé selon l'une des revendications précédentes dans lequel le déplacement du moyen d'ensemencement est un déplacement rectiligne.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le déplacement du moyen d'ensemencement est un déplacement curviligne.
7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, mis en œuvre au moyen d'un système automatisé.
8. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le nombre de fois où le contact entre ledit moyen d'ensemencement et la surface du milieu de culture gélose est rompu et rétabli est compris entre 2 et 6 fois.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel le volume déposé sur le milieu de culture gélose est compris entre 10 et lOOOμl.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel les segments d'étalement sont de longueurs variables.
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