WO2010004075A1 - Dispositivo de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable - Google Patents

Dispositivo de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable Download PDF

Info

Publication number
WO2010004075A1
WO2010004075A1 PCT/ES2009/070278 ES2009070278W WO2010004075A1 WO 2010004075 A1 WO2010004075 A1 WO 2010004075A1 ES 2009070278 W ES2009070278 W ES 2009070278W WO 2010004075 A1 WO2010004075 A1 WO 2010004075A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reading
microarray
transducers
aqueous medium
electrical
Prior art date
Application number
PCT/ES2009/070278
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Antonio Baldi Coll
César FERNÁNDEZ SÁNCHEZ
Roberto De La Rica Quesada
Diana Lissette Bonilla Aguilar
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Priority to US12/737,438 priority Critical patent/US20110152124A1/en
Priority to CN2009801269807A priority patent/CN102089648A/zh
Priority to JP2011517182A priority patent/JP2011527427A/ja
Priority to CA2730644A priority patent/CA2730644A1/en
Priority to EP09793983A priority patent/EP2302370A1/en
Publication of WO2010004075A1 publication Critical patent/WO2010004075A1/es

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5088—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above confining liquids at a location by surface tension, e.g. virtual wells on plates, wires
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0241—Drop counters; Drop formers
    • B01L3/0262—Drop counters; Drop formers using touch-off at substrate or container
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0645—Electrodes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0241—Drop counters; Drop formers
    • B01L3/0268—Drop counters; Drop formers using pulse dispensing or spraying, eg. inkjet type, piezo actuated ejection of droplets from capillaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood

Definitions

  • the main object of the present invention is an electric microarray reading device that can be cleaned and reused more than once.
  • a microarray is a set of spots or test points of small dimensions (from a few nm to a few mm) on a flat support that allows many tests to be carried out in parallel, greatly increasing the speed and the analysis capacity with respect to series analysis systems .
  • Microarrays that use antibodies as a recognition element are based on different types of assay:
  • Sandwich type when the analyte is captured by an antibody immobilized on the support and quantified by a second labeled antibody.
  • Competitive type when copies of the analyte are immobilized in the spots of the surface of the support and the quantification of said analyte is performed indirectly from the labeled antibodies that bind to said spots in the presence of the sample to be analyzed.
  • the tags can be of the optical type (fluorescent molecule, quantum dot, enzyme whose product precipitates), radioactive (radioisotopes), or electrochemical (enzyme whose product is electroactive or electroactive nanoparticles).
  • optical type fluorescent molecule, quantum dot, enzyme whose product precipitates
  • radioactive radioactive
  • electrochemical electrochemical
  • microarrays are extended more widely and can be used in the places where it is needed (next to the patient's bed in a hospital or in the primary care center), the teams must improve in terms of cost, robustness, simplicity and size.
  • These analytical equipment basically consist of two distinct parts: the microarrays on which the test is performed and the device with which the reading of the result of said test is performed.
  • Other accessories are also included in the system, such as a robotic arm for the deposition of recognition components or samples on the spots or measuring points of the microarray (spoter), or a device with fluidic and reactive components to perform the test automatically.
  • the reading devices of electric type are the most robust, simple and of smaller size. However, they have the disadvantage of requiring a matrix of devices (electrodes or photodiodes) formed on the support itself, which forces the use of a new support and discarding the used one each time the test is performed.
  • the support in addition, is a complex and expensive element, since it must include electrical transducers, etc., instead of the supports commonly used in optical systems, which simply consist of a piece of functionalized glass or plastic
  • the present invention describes a device for reading microarrays of electric and reusable type that is based on the electrochemical measurement (amperometric, potentiometric or impedimetric) of the accumulation of products of an enzymatic reaction when a surface marked by enzymatic marks and a contact chemical substrate
  • the novelty of this device lies in the fact that the transducers in charge of carrying out the measurement are located in a different base than the microarray support, so that the reading device can be reused for as many analyzes as desired.
  • the reading device can work with the low-cost media used by the known optical systems.
  • this reading device only requirement for the use of this reading device is that the enzymatic mark used, when reacting with its corresponding chemical substrate, generates a product that can be detected by the transducers, that is, a product that modifies some electrical or chemical property of the medium in which the reaction occurs.
  • the transducers of the invention therefore, transform electrical or chemical quantities of a medium into electrical quantities.
  • the chemical substrate In the case of impedimetric transducers, it will be necessary for the chemical substrate to be a chemical species with a net charge different from that of the sum of the net charges of the products, so that when the enzymatic reaction occurs, the concentration of charged species changes, and therefore change the conductivity of the medium.
  • An example of this is the enzyme Ureasa, which reacts with urea (neutral species) produces ammonia and carbon dioxide. The ammonia is rapidly protonated giving rise to the ammonium ion (positively charged), while the carbon dioxide will partially become bicarbonate (negatively charged).
  • the enzymatic reaction must produce electroactive species.
  • An example is the enzyme alkaline phosphatase, which in the presence of p-aminophenyl phosphate produces p-aminophenol.
  • P-aminophenol is oxidized to a potential of less than 200 mV resulting in p-quinonaimine.
  • This enzyme / substrate system allows redox cycling to be used since p-quinonaimine can be reduced in turn to a potential of less than -200 mV resulting in p-aminophenol again.
  • the enzymatic reaction In the case of potentiometric transducers, the enzymatic reaction must produce ions that are detectable in the transducer.
  • the simplest case would be an enzyme that produces a pH change.
  • a microarray is formed by a flat support, on one of whose surfaces, which we will call “test surface”, there is a matrix of spots with an enzymatic mark.
  • the flat support can be any of the supports usually used with other types of reading equipment, for example optics, and can be made of materials such as glass or plastic, among others.
  • an electric and reusable microarray reading device comprising the following elements:
  • a base comprising support means for placing the microarray test surface parallel to a reading surface of the base.
  • the support means of the base must be such that the test surface of the microarray is facing parallel to the reading surface of the base.
  • the distance between both surfaces must be such that it allows a drop of an aqueous medium to simultaneously touch both surfaces, thus bringing the chemical substrate present in the aqueous medium and the enzymatic mark of the microarray spots into contact, and thus producing a chemical reaction that results in products that affect the electrical or chemical properties of the aqueous medium.
  • a matrix of transducers arranged on the reading surface of the base, which translate a variation of an electrical or chemical quantity into a variation of an electrical quantity.
  • the transducers are fixed to the reading surface of the base forming a matrix, so that, when the microarray is arranged on the support means, each transducer faces a spot.
  • a drop of aqueous medium containing the corresponding chemical substrate must be applied between each transducer and the respective spot facing it.
  • Drops of aqueous medium can be formed in any way, provided they are all of the same size, and do not touch each other.
  • a micropipette or a "spoter" type equipment could be used, although in a preferred embodiment of the invention, the microarray reading device of the invention comprises a means for applying drops of aqueous medium.
  • the means for applying drops of aqueous medium is integrated in the microarray reading device itself, and comprises a reservoir of aqueous medium coupled to the surface of the base opposite the reading surface, and a matrix of microchannels made in The device's own base.
  • Each microchannel connects the tank of aqueous medium with the point where each transducer is located, so that by modifying the pressure in the tank a controlled injection of aqueous medium is achieved, thus forming drops of uniform volume on top of each transducer.
  • the aqueous medium reservoir comprises an inlet and an outlet of aqueous medium, so that different liquids can be injected therewith.
  • the aqueous medium drop application medium is an applicator comprising an aqueous medium reservoir and a matrix of microchannels practiced on one of its walls.
  • the injection of fluid onto each transducer occurs until it is form a drop of the desired volume.
  • This can be done by directly forming a single drop or by depositing a multitude of small droplets ejected from the nozzle of the microchannel by some mechanism similar to that used by the inkjet printers, and which, upon joining the transducer, form the drop.
  • Being an applicator that is not integrated in the base it is necessary to position it so that each Microchannel faces a transducer. For this, the same support means used to place the microarray can be used.
  • Reading means connected to the transducers, that interpret the electrical signals of the transducers.
  • the enzymatic reaction begins to take place.
  • the transducer will measure a greater change in the concentration of products.
  • the drops are separated from each other and therefore the products accumulate in the volume thereof without interference between different points of the matrix. Therefore, the transducer matrix is connected to electronic measurement circuits capable of acquiring and processing the signal generated by each of said transducers.
  • the measurement can be made at the end of a certain time or for as long as the drops are in contact with the spots.
  • the second case allows measuring the dynamics of the enzymatic reaction, which can give more analytical information. For example, it may allow a greater dynamic range, since the evolution of product concentrations can be detected before a saturation value is reached.
  • an electrical reading method of a microarray is described using the reading device described above, which comprises the following operations:
  • drops of aqueous medium can be created first on the transducers, and then placed the microarray, with the aid of some support means, parallel to the reading surface of the base, and at such a distance that each spot is faced with a transducer and the drop of aqueous medium touches them both.
  • the chemical reaction between the chemical substrate included in the aqueous medium and the enzymatic brand of the spot begins, forming as a result of the reaction products that modify some electrical property or chemistry of the aqueous medium that forms the drop.
  • the subsequent reading operation can be performed, either simultaneously on all transducers of the matrix, or sequentially by rows, columns or individually.
  • the base of the device so that there are no remains of the products of Ia Enzymatic reaction or enzymes that may have detached from the microarray.
  • the cleaning solution or solutions must have the ability to dissolve the products of the enzymatic reaction and denature the enzymes so that they completely lose their activity. Cleaning can end with a rinse in deionized water.
  • This cleaning can be done in a traditional way or, in accordance with a particular embodiment of the invention, by sucking the drops of aqueous medium generated and then injecting a cleaning solution, by means of applying drops of aqueous medium.
  • the means for applying drops of aqueous medium must be capable of creating negative pressures in the reservoir to which the microchannels are connected and of replacing the aqueous medium of the reservoir with a suitable cleaning solution.
  • Figure 1. It shows a scheme of a flat support microarray, with the different parts that compose it.
  • Figures 2.- Shows a diagram of an electric microarray reading device according to the invention.
  • Figures 3 and A Show two particular embodiments of means of application of drops of aqueous medium.
  • Figures 5 and 6.- Shows the first operations of the microarray electric reading procedure according to a particular embodiment of the invention.
  • Figure 7.- Shows a particular embodiment of the reading means according to the present invention.
  • Figure 1 shows a microarray (6) formed by a flat support (9), on whose test surface (7) an array of measuring points or spots (8) are arranged, which are marked with an enzymatic mark.
  • Figure 2 schematically shows the microarray reading device (1) according to the present invention. It is observed that it is formed by a base (2), on whose reading surface (4) there is a matrix of transducers (5) that react to a change in an electrical or chemical property of the aqueous medium.
  • the device (1) for reading microarrays of electric and reusable type of the example further comprises, on the sides of the base (2), support means (3), which serve to support the microarray (6) so that each spot (8) of the matrix is facing a transducer
  • the support means (3) basically comprise a flange that supports the microarray (6) during the reading process.
  • the reading means (10) which are they have represented in Fig. 7.
  • the manufacture of the base (2) and the transducer matrix (5) is made from pyrex glass wafers of 100 mm diameter.
  • the process begins with the deposition of a titanium, nickel and gold metal trilayer (the titanium is deposited on the pyrex with a thickness of 20 nm, the nickel on the titanium with a thickness of 50 nm and the gold on the nickel with a 50 nm thickness).
  • the three metals are deposited by sputtering.
  • a standard photolithography process is then carried out with a mask that contains the reasons for defining an array of pairs of interdigitated electrodes. Each pair of interdigitated electrodes has 14 fingers (seven on each electrode) 20 ⁇ m wide, 20 ⁇ m apart and with an interdigitated zone length of 500 ⁇ m.
  • connection tracks are defined that go from each electrode to the edge of the chip, where an area is defined for its connection to a printed circuit by means of wire welding.
  • the transducers form a rectangular matrix of 4x9 elements and are 6 mm apart between them. In a 100 mm wafer, two arrays of transducers (5) fit as described.
  • the attack of the metals after the photolithography is carried out in different attack solutions.
  • For the gold a mixture of 5700 ml of H 2 O, 435 g of Kl and 250 g of I 2 is used .
  • nickel a 1: 4 mixture of 70% HNO3: H 2 O is used.
  • titanium a 1: 10: 33 mixture of 49% HF: H 2 O: 1, 2-Propanediol is used.
  • the wafer is passed through a mechanical saw to separate the two transducer matrices (5).
  • the matrices are joined to a printed circuit in which the areas necessary for the connection by means of wire welding have been defined and which has a connector to electrically connect the electrodes to the instrumentation.
  • the wires are protected by a thermosetting polymer (Epotek H77).
  • the means of support (3) is manufactured with Polydimethylsloxane from a mold, and is welded to the transducer matrix by activation with oxygen plasma.
  • Figures 3 and 4 show respectively two preferred embodiments of aqueous medium application media.
  • these are integrated in the base (2 '), so that a tank
  • each transducer (5 ') has a central hole where the nozzle of each microchannel is.
  • the means of application of aqueous medium constitute an applicator formed by a reservoir (11 ") of aqueous medium in one of whose walls there are microchannels (12"), through which the aqueous medium is injected onto the transducers (5 ").
  • the support means (3 ") further comprise a second flange on which the aqueous medium applicator rests.
  • Figures 5 and 6 show some operations of a preferred embodiment of the process of the invention.
  • Figure 5 shows the micrroarray (6) and the reading device (1), where the operation of injecting a drop of aqueous medium on each transducer (5) has previously been carried out.
  • the microarray (6) is already prepared to be supported on the support means (3), moment that is collected in Figure 6, in which each drop of aqueous medium is already in contact with a spot (8), and by The chemical reaction between the enzymatic brand and the substrate has already begun.
  • Figure 7 shows the measurement instrumentation in the If the product of the chemical reaction between the enzymatic brand and the chemical substrate causes changes in the impedance of the aqueous medium of the drop.
  • the instrumentation comprises sources of alternating voltage excitation (15) and measuring circuits (16) of alternating current, which combined are capable of measuring the impedance seen in terminals of the interdigitated electrodes (17).
  • the figure shows the connection of said sources (15) and measuring circuits (16) with the electrodes (17).
  • the impedance transducers allow a row-column type connection. This makes practical the realization of matrices of large number of elements. For example, for a matrix of 1024 elements, 32 sources of alternating excitation (15) and 32 measuring circuits (16) of the current would suffice.
  • the current measurement circuits (16) have been implemented in the example with AD8674 operational amplifiers, with a precision feedback resistance of 100 k ⁇ .
  • the recording of the voltage values at the output of the operational amplifiers has been carried out by means of the analog inputs of the same card.
  • a program in LabView is used to control the acquisition process, process the acquired signals and obtain the impedance values presented by the transducers (5) over the reading time.
  • the acquisition process is developed according to the following sequence: First it excites a row of transducers (5) with an alternating voltage of 50 mV amplitude and 2 kHz frequency for 25 ms. The remaining sources (15) of excitation are maintained at OV. During this time the signal is acquired with the analog inputs connected to each of the transducer columns (5). Then we would proceed in the same way with the next row and so on until all rows of transducers had been read.
  • Ureasa in the presence of urea (neutral) produces ammonia and carbon dioxide.
  • the ammonia is rapidly protonated giving rise to the ammonium ion (positively charged), while the carbon dioxide will partially become bicarbonate (negatively charged). Therefore, the enzymatic reaction increases the conductivity of the original buffer.
  • the original buffer is formed by an aqueous solution of 0.1 M urea and 0.25 M glycine, with an approximate conductivity of 16 ⁇ S / cm.
  • the 1 ⁇ l volume buffer drops were deposited onto the transducers (5) manually using a micropipette.
  • a rabbit analyte G was used as a model analyte and a reverse phase type assay was applied. This consisted of making successive dilutions of a stock solution of said model analyte. Micro-drops of 1 ⁇ l_ volume were deposited, of each of the dilutions prepared in the support (9) of the microarray (6) (previously silanized glass slides). Once the analyte was immobilized, the microarray (6) was incubated with a solution of a goat antibody, rabbit anti-immunoglobulin G labeled with urease for one hour, during which time the specific interaction between the analyte and labeled antibody. After washing the microarray (6) with deionized water and drying in a stream of nitrogen, the reading was carried out with the matrix of impedance transducers (5).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)

Abstract

El objeto principal de la presente invención es un dispositivo de lectura eléctrica de microarrays que se puede limpiar y volver a utilizar más de una vez. El dispositivo (1, 1', 1 ") de lectura de microarrays (6) tiene las siguientes partes: una base (2, 2', 2"), que tiene unos medios de apoyo (3, 3', 3") para situar la superficie de test (7) del microarray (6) en paralelo a una superficie de lectura (4) de la base (2, 2', 2"); una matriz de transductores (5, 5', 5"), dispuestos sobre la superficie de lectura (4) de la base (2, 2', 2"), que traducen una variación de una magnitud eléctrica o química en una variación de una magnitud eléctrica; y unos medios de lectura (10), conectados a los transductores (5, 5', 5"), que interpretan las señales eléctricas de los transductores (5, 5', 5").

Description

DISPOSITIVO DE LECTURA DE MICROARRAYS DE TIPO ELÉCTRICO
Y REUTILIZABLE
D E S C R I P C I Ó N
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El objeto principal de Ia presente invención es un dispositivo de lectura eléctrica de microarrays que se puede limpiar y volver a utilizar más de una vez.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Desde su aparición a finales de Ia década de 1980, los biochips o microarrays han permitido llevar a cabo interpretaciones cuantitativas de muchos e importantes fenómenos biológicos. Un microarray es un conjunto de spots o puntos de ensayo de pequeñas dimensiones (desde pocos nm a pocos mm) sobre un soporte plano que permite realizar muchos ensayos en paralelo, aumentando enormemente Ia velocidad y Ia capacidad de análisis respecto a sistemas de análisis en serie.
Estos elementos están diseñados para analizar el contenido proteico, las interacciones proteína-proteína, proteína-ADN, proteína- ligando, Ia presencia de mutaciones del ADN, patrones de expresión de genes, etc., de muestras biológicas complejas. Los microarrays que utilizan anticuerpos como elemento de reconocimiento se basan en diferentes tipos de ensayo:
Tipo sandwich, cuando el analito es capturado por un anticuerpo inmovilizado en el soporte y cuantificado mediante un segundo anticuerpo marcado. Tipo competitivo cuando copias del analito se inmovilizan en los spots de Ia superficie del soporte y Ia cuantificación de dicho analito se realiza indirectamente a partir de los anticuerpos marcados que se unen a dichos spots en presencia de Ia muestra que se desea analizar.
Tipo fase inversa cuando Ia muestra se adsorbe directamente en Ia superficie del soporte y el analito es reconocido por anticuerpos marcados.
En todos ellos Ia cuantificación se realiza por medio de Ia detección de una marca, que está unida a un anticuerpo. En el caso de chips de
ADN Ia marca se une a los fragmentos de ADN o ARN a analizar. Las marcas pueden ser de tipo óptico (molécula fluorescente, punto quántico, enzima cuyo producto precipita), radioactivo (radioisótopos), o electroquímico (enzima cuyo producto es electroactivo o nanopartículas electroactivas). Este último tipo de marcas tienen Ia ventaja de que permiten una instrumentación de lectura puramente eléctrica, y por Io tanto más compacta, robusta y barata que Ia de las más ampliamente utilizadas marcas fluorescentes. Existen productos en el mercado que utilizan este tipo de lectura, como por ejemplo el lector Electrasense de COMBIMATRIX (WO2008051196). La empresa Nanoident Technologies, anuncia también sistemas compactos con lectura eléctrica de microarrays basados en una matriz de fotodiodos orgánicos impresos en el mismo soporte donde se realiza el ensayo (WO2006026796).
Sin embargo, para que el uso de microarrays se extienda de forma más amplia y se pueda utilizar en los lugares en que se necesita (junto a Ia cama del paciente en un hospital o en los centro de atención primaria), los equipos deben mejorar en términos de coste, robustez, sencillez y tamaño. Estos equipos analíticos constan básicamente de dos partes diferenciadas: los microarrays sobre los que se realiza el ensayo y el dispositivo con que se realiza Ia lectura del resultado de dicho ensayo. En algunos casos también se incluyen otros complementos en el sistema, como un brazo robótico para Ia deposición de componentes de reconocimiento o muestras sobre los spots o puntos de medida del microarray (spoter), o un equipo con componentes fluídicos y reactivos para realizar el ensayo automáticamente.
Los dispositivos de lectura de tipo eléctrico son los más robustos, sencillos y de menor tamaño. Sin embargo, presentan el inconveniente de requerir una matriz de dispositivos (electrodos o fotodiodos) formados sobre el propio soporte, Io cual obliga a utilizar un soporte nuevo y desechar el usado cada vez que se realiza el ensayo. El soporte, además, es un elemento complejo y costoso, ya que debe incluir transductores eléctricos, etc., en lugar de los soportes habitualmente utilizados en los sistemas ópticos, que consisten simplemente en un trozo de vidrio o plástico funcionalizado
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe un dispositivo de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable que está basado en Ia medida electroquímica (amperométrica, potenciométrica o impedimétrica) de Ia acumulación de productos de una reacción enzimática al entrar en contacto una superficie marcada por marcas enzimáticas y un sustrato químico. La novedad de este dispositivo reside en que los transductores encargados de realizar Ia medida se encuentran en una base diferente al soporte del microarray, de manera que el dispositivo de lectura se puede reutilizar para tantos análisis como se desee. Además el dispositivo de lectura puede funcionar con los soportes de bajo coste utilizados por los conocidos sistemas ópticos. El único requerimiento para el uso de este dispositivo de lectura es que Ia marca enzimática utilizada, al reaccionar con su substrato químico correspondiente, genere un producto que pueda ser detectado por los transductores, es decir, un producto que modifique alguna propiedad eléctrica o química del medio en que se produce Ia reacción. Los transductores de Ia invención, por tanto, transforman magnitudes eléctricas o químicas de un medio en magnitudes eléctricas.
En el caso de transductores impedimétricos, será necesario que el substrato químico sea una especie química con carga neta diferente a Ia de Ia suma de las cargas netas de los productos, de manera que al producirse Ia reacción enzimática cambie Ia concentración de especies cargadas, y por Io tanto cambie Ia conductividad del medio. Un ejemplo de ello es el enzima Ureasa, que al reaccionar con Ia urea (especie neutra) produce amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco se protona rápidamente dando lugar al ion amonio (cargado positivamente), mientras que el dióxido de carbono se convertirá parcialmente en bicarbonato (cargado negativamente).
En el caso de transductores amperométricos, Ia reacción enzimática debe producir especies electroactivas. Un ejemplo es el enzima fosfatasa alcalina, que en presencia de p-aminofenilfosfato produce p-aminofenol. El p-aminofenol se oxida a un potencial menor de 200 mV dando lugar a p- quinonaimina. Este sistema de enzima/substrato permite utilizar el redox cycling ya que Ia p-quinonaimina puede ser reducida a su vez a un potencial menor de -200 mV dando lugar nuevamente a p-aminofenol.
En el caso de transductores potenciometricos, Ia reacción enzimática debe producir iones que sean detectables en el transductor. El caso más simple seria una enzima que produzca un cambio de pH.
En el presente documento, diremos que un microarray está formado por un soporte plano, en una de cuyas superficies, que denominaremos "superficie de test", hay una matriz de spots con una marca enzimática. El soporte plano puede ser cualquiera de los soportes habitualmente utilizados con otros tipos de equipos de lectura, por ejemplo ópticos, y puede ser de materiales como vidrio o plástico, entre otros.
Por tanto, de acuerdo con un primer aspecto de Ia invención, se describe un dispositivo de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable que comprende los siguientes elementos:
1 ) Una base, que comprende unos medios de apoyo para situar Ia superficie de test del microarray en paralelo a una superficie de lectura de Ia base.
Los medios de apoyo de Ia base deben ser tales que Ia superficie de test del microarray quede enfrentada en paralelo a Ia superficie de lectura de Ia base. Además, Ia distancia entre ambas superficies debe ser tal que permita que una gota de un medio acuoso toque simultáneamente ambas superficies, poniendo así en contacto el sustrato químico presente en el medio acuoso y Ia marca enzimática de los spots del microarray, y produciéndose así una reacción química que resulta en unos productos que afectan a propiedades eléctricas o químicas del medio acuoso.
2) Una matriz de transductores, dispuestos sobre Ia superficie de lectura de Ia base, que traducen una variación de una magnitud eléctrica o química en una variación de una magnitud eléctrica.
Los transductores están fijados a Ia superficie de lectura de Ia base formando una matriz, de tal modo que, cuando el microarray se dispone sobre los medios de apoyo, cada transductor queda enfrentado a un spot.
Para poder efectuar Ia lectura, se debe aplicar una gota de medio acuoso que contenga el substrato químico correspondiente entre cada transductor y el respectivo spot enfrentado al mismo. Las gotas de medio acuoso pueden formarse de cualquier modo, siempre que todas sean del mismo tamaño, y que no se toquen unas con otras. Por ejemplo, se podría utilizar una micropipeta o un equipo tipo "spoter", aunque en una realización preferida de Ia invención, el dispositivo de lectura de microarrays de Ia invención comprende un medio de aplicación de gotas de medio acuoso.
Preferentemente, el medio de aplicación de gotas de medio acuoso está integrado en el propio dispositivo de lectura de microarrays, y comprende un depósito de medio acuoso acoplado a Ia superficie de Ia base opuesta a Ia superficie de lectura, y una matriz de microcanales practicados en Ia propia base del dispositivo. Cada microcanal conecta el depósito de medio acuoso con el punto en el que está situado cada transductor, de modo que modificando Ia presión en el depósito se consigue una inyección controlada de medio acuoso, formándose así gotas de volumen uniforme encima de cada transductor. Además, el depósito de medio acuoso comprende una entrada y una salida de medio acuoso, de manera que se pueden inyectar con él diferentes líquidos.
En otra realización preferida, el medio de aplicación de gotas de medio acuoso es un aplicador que comprende un depósito de medio acuoso y una matriz de microcanales practicados en una de sus paredes.
Al igual que el medio de aplicación de gotas de medio acuoso descrito en el párrafo anterior, situando correctamente el aplicador sobre Ia superficie de lectura de Ia base y modificando Ia presión en el depósito, se produce Ia inyección de fluido sobre cada transductor hasta que se forma una gota del volumen deseado. Esto se puede hacer formando directamente una gota única o depositando una multitud de pequeñas gotas expulsadas desde Ia boquilla del microcanal por algún mecanismo similar al utilizado por las impresoras de inyección de tinta, y que al irse uniendo sobre el transductor van formando Ia gota. Al tratarse de un aplicador que no está integrado en Ia base, es necesario posicionarlo de modo que cada microcanal quede enfrentado a un transductor. Para ello, se pueden utilizar los mismos medios de apoyo utilizados para colocar el microarray.
3) Unos medios de lectura, conectados a los transductores, que interpretan las señales eléctricas de los transductores.
Una vez las gotas están en contacto con los spots del microarray marcados enzimáticamente, Ia reacción enzimática empieza a tener lugar. En los spots donde exista mayor concentración de Ia marca enzimática, el transductor medirá un cambio mayor en Ia concentración de productos. Las gotas están separadas entre si y por Io tanto los productos se acumulan en el volumen de las mismas sin que se produzca interferencia entre diferentes puntos de Ia matriz. Por tanto, Ia matriz de transductores está conectada a unos circuitos electrónicos de medida capaces de adquirir y procesar Ia señal generada por cada uno de dichos transductores. La medida se puede realizar al final de un tiempo determinado o durante todo el tiempo que las gotas están en contacto con los spots. El segundo caso permite medir Ia dinámica de Ia reacción enzimática, Io cual puede dar mayor información analítica. Por ejemplo, puede permitir un mayor rango dinámico, ya que se puede detectar Ia evolución de las concentraciones de producto antes de que se llegue a un valor de saturación.
De acuerdo con un segundo aspecto de Ia invención, se describe un procedimiento de lectura eléctrica de un microarray utilizando el dispositivo de lectura descrito anteriormente, que comprende las siguientes operaciones:
a) Poner en contacto los spots del microarray con las gotas de medio acuoso, produciéndose en cada gota una reacción química que modifica una propiedad eléctrica o química del medio acuoso que forma Ia gota. Esta operación se puede realizar de dos modos diferentes. De acuerdo con una realización particular, se pueden crear en primer lugar gotas de medio acuoso sobre los transductores, y a continuación colocar el microarray, con ayuda de unos medios de apoyo, en paralelo a Ia superficie de lectura de Ia base, y a una distancia tal que cada spot quede enfrentado a un transductor y Ia gota de medio acuoso los toque a ambos.
En otra realización particular, es posible disponer en primer lugar el microarray sobre los medios de apoyo y, a continuación, inyectar el medio acuoso sobre los transductores hasta formar gotas de un tamaño suficiente como para que cada una de ellas esté en contacto simultáneamente con el transductor y con el spot enfrentado al mismo.
b) Leer, mediante unos medios de lectura, Ia señal eléctrica generada por cada uno de los transductores en respuesta a Ia modificación de una propiedad eléctrica o química del medio acuoso que forma Ia gota.
Una vez una gota de medio acuoso entra en contacto con un spot marcado enzimáticamente, comienza Ia reacción química entre el sustrato químico incluido en el medio acuoso y Ia marca enzimática del spot, formándose como resultado de Ia reacción unos productos que modifican alguna propiedad eléctrica o química del medio acuoso que forma Ia gota. La subsiguiente operación de lectura se puede realizar, bien simultáneamente sobre todos los transductores de Ia matriz, o bien secuencialmente por filas, columnas o individualmente.
c) Lavar Ia superficie de lectura del dispositivo y reutilizarlo para nuevas pruebas.
Es importante que, una vez realizada Ia lectura y antes de realizar una nueva lectura, se limpien los transductores y Ia superficie de lectura de
Ia base del dispositivo para que no queden restos de los productos de Ia reacción enzimática ni de enzimas que se puedan haber desprendido del microarray. En este sentido, Ia solución o soluciones de limpieza deben tener Ia capacidad de disolver los productos de Ia reacción enzimática y desnaturalizar los enzimas para que pierdan por completo su actividad. La limpieza puede acabar con un enjuagado en agua desionizada.
Esta limpieza se puede hacer de modo tradicional o bien, de acuerdo con una realización particular de Ia invención, succionando las gotas de medio acuoso generadas e inyectando a continuación una solución de limpieza, mediante el medio de aplicación de gotas de medio acuoso. Para llevar a cabo esta operación del procedimiento, el medio de aplicación de gotas de medio acuoso debe ser capaz de crear presiones negativas en el depósito al que están conectados los microcanales y de sustituir el medio acuoso del depósito por una solución de limpieza adecuada.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar Ia descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de Ia invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica de Ia misma, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado Io siguiente:
Figura 1.- Muestra un esquema de un microarray de soporte plano, con las diferentes partes que Io componen.
Figuras 2.- Muestra un esquema de un dispositivo de lectura eléctrica de microarrays de acuerdo con Ia invención. Figuras 3 y A - Muestran dos realizaciones particulares de medios de aplicación de gotas de medio acuoso.
Figuras 5 y 6.- Muestra las primeras operaciones del procedimiento de lectura eléctrica de microarrays de acuerdo con una realización particular de Ia invención.
Figura 7.- Muestra una realización particular de los medios de lectura de acuerdo con Ia presente invención.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
La Figura 1 muestra un microarray (6) formado por un soporte plano (9), sobre cuya superficie de test (7) se dispone una matriz de puntos de medida o spots (8), que son marcados con una marca enzimática.
La Figura 2 muestra de forma esquemática el dispositivo (1 ) de lectura de microarrays de acuerdo con Ia presente invención. Se observa que está formado por una base (2), sobre cuya superficie de lectura (4) hay una matriz de transductores (5) que reaccionan ante un cambio en una propiedad eléctrica o química del medio acuoso.
El dispositivo (1 ) de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable del ejemplo comprende además, en los laterales de Ia base (2), unos medios de apoyo (3), que sirven para apoyar el microarray (6) de forma que cada spot (8) de Ia matriz quede enfrentado a un transductor
(5). En este ejemplo, los medios de apoyo (3) comprenden básicamente un reborde que sirve de apoyo al microarray (6) durante el proceso de lectura. Aunque no se observa en las figuras, en Ia superficie opuesta a Ia superficie de lectura (4) se encuentran los medios de lectura (10), que se han representado en Ia Fig. 7.
La fabricación de Ia base (2) y Ia matriz de transductores (5) se realiza a partir de obleas de vidrio tipo pyrex de 100 mm de diámetro. El proceso empieza con Ia deposición de una tricapa metálica de titanio, níquel y oro (el titanio se deposita sobre el pyrex con un grosor de 20 nm, el níquel sobre el titanio con un grosor de 50 nm y el oro sobre el níquel con un grosor de 50 nm). Los tres metales se despositan por pulverización catódica. A continuación se realiza un proceso de fotolitografía estándar con una máscara que contiene los motivos para definir una matriz de pares de electrodos interdigitados. Cada par de electrodos interdigitados tiene 14 dedos (siete en cada electrodo) de 20 μm de ancho, separados 20 μm y con una longitud de Ia zona interdigitada de 500 μm. Con Ia misma máscara se definen las pistas de conexión que van desde cada electrodo hasta el borde del chip, donde se define una área para su conexión a un circuito impreso mediante soldadura de hilo. Los transductores forman una matriz rectangular de 4x9 elementos y están separados 6 mm entre ellos. En una oblea de 100 mm caben dos matrices de transductores (5) como Ia descrita. El ataque de los metales posterior a Ia fotolitografía se realiza en diferentes soluciones de ataque. Para el oro se utiliza una mezcla de 5700 mi de H2O, 435 g de Kl y 250 g de I2. Para el níquel se utiliza una mezcla 1 :4 de HNO3 al 70% : H2O. Para el titanio se utiliza una mezcla 1 :10:33 de HF 49% : H2O : 1 ,2-Propanodiol.
Una vez definidos los electrodos Ia oblea se pasa por una sierra mecánica para separar las dos matrices de transductores (5). Las matrices se unen a un circuito impreso en el que se han definido las áreas necesarias para Ia conexión mediante soldadura por hilo y que tiene un conector para conectar eléctricamente los electrodos a Ia instrumentación. Tras realizar Ia soldadura con hilo de todos los electrodos se protegen los hilos mediante un polímero termocurable (Epotek H77). El medio de apoyo (3) se fabrica con Polidimetilsyloxano a partir de un molde, y se suelda a Ia matriz de transductores mediante activación con plasma de oxigeno.
Las Figuras 3 y 4, por su parte, muestran respectivamente dos realizaciones preferidas de medios de aplicación de medio acuoso. En Ia figura 3, éstos están integrados en Ia base (2'), de modo que un depósito
(11') de medio acuoso formado en Ia superficie opuesta a Ia superficie de lectura (4) inyecta el medio acuoso a través de una matriz de microcanales
(12') que atraviesan Ia base (2') hasta el lugar en el que está situado cada transductor (5'). En este ejemplo, los transductores (5') tienen un orificio central donde está Ia boquilla de cada microcanal.
En Ia Figura 4, los medios de aplicación de medio acuoso constituyen un aplicador formado por un depósito (11 ") de medio acuoso en una de cuyas paredes hay unos microcanales (12"), a través de los cuales se inyecta el medio acuoso sobre los transductores (5"). Para que cada microcanal quede enfrentado a un tranductor (5"), los medios de apoyo (3") comprenden además un segundo reborde sobre el que se apoya el aplicador de medio acuoso.
Las Figuras 5 y 6 muestran algunas operaciones de una realización preferida del procedimiento de Ia invención. En particular, Ia Figura 5 muestra el micrroarray (6) y el dispositivo de lectura (1 ), donde previamente se ha llevado a cabo Ia operación de inyectar una gota de medio acuoso sobre cada transductor (5). El microarray (6) está ya preparado para ser apoyado en los medios de apoyo (3), momento que se recoge en Ia Figura 6, en Ia que cada gota de medio acuoso ya están en contacto con un spot (8), y por Io tanto ha comenzado ya Ia reacción química entre Ia marca enzimática y el sustrato.
Finalmente, Ia Figura 7 muestra Ia instrumentación de medida en el caso de que el producto de Ia reacción química entre Ia marca enzimática y el sustrato químico provoque cambios en Ia impedancia del medio acuoso de Ia gota. La instrumentación comprende fuentes de excitación de tensión alterna (15) y circuitos de medida (16) de corriente alterna, que combinados son capaces de medir Ia impedancia vista en terminales de los electrodos (17) interdigitados. En Ia figura se observa conexión de dichas fuentes (15) y circuitos medidores(16) con los electrodos (17). Como se puede apreciar, los transductores impedimétricos permiten un conexionado tipo fila-columna. Esto hace que sea práctica Ia realización de matrices de gran número de elementos. Por ejemplo, para una matriz de 1024 elementos bastaría con 32 fuentes de excitación alterna (15) y 32 circuitos de medida (16) de Ia corriente. De hecho, con una multiplexación adecuada es suficiente una sola fuente de excitación (15) y un solo circuito de medida (16) de Ia corriente. En el caso de que el número de elementos de Ia matriz sea muy elevado, el número de soldaduras por hilo que se necesitarían también Io seria. Para solventar este problema se puede utilizar una tecnología de fabricación con dos niveles de metal y conectar los electrodos (17) a nivel de oblea por filas y columnas como se muestra en Ia Figura 7. De esta manera, el número de soldaduras por hilo que se necesitan para encapsular una matriz de transductores de (n x m) es tan solo de (n + m). En el ejemplo que aquí se describe, las fuentes de excitación son las salidas analógicas de una tarjeta Nl USB-6259 de National Instruments. Los circuitos de medida (16) de corriente se han implementado en el ejemplo con amplificadores operacionales AD8674, con una resistencia de realimentación de precisión de 100 kΩ. El registro de los valores de tensión a Ia salida de los amplificadores operacionales se ha realizado mediante las entradas analógicas de Ia misma tarjeta. Un programa en LabView sirve para controlar el proceso de adquisición, procesar las señales adquiridas y obtener los valores de impedancia que presentan los transductores (5) a Io largo del tiempo de lectura. El proceso de adquisición se desarrolla según Ia siguiente secuencia: Primero se excita una fila de transductores (5) con una tensión alterna de 50 mV de amplitud y 2 kHz de frecuencia durante 25 ms. El resto de fuentes (15) de excitación se mantiene a OV. Durante este tiempo se adquiere Ia señal con las entradas analógicas conectadas a cada una de las columnas de transductores (5). A continuación se procedería de igual forma con Ia siguiente fila y así hasta que todas las filas de transductores hubieran sido leídas.
Se describe a continuación un ejemplo de uso de un dispositivo (1 ) de lectura de microarrays (6) de tipo eléctrico y reutilizable basado en transductores (5) impedimétricos para medir los resultados en un microarray (6) que utiliza Ia ureasa como marca enzimática.
La Ureasa, en presencia de urea (neutra) produce amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco se protona rápidamente dando lugar al ion amonio (cargado positivamente), mientras que el dióxido de carbono se convertirá parcialmente en bicarbonato (cargado negativamente). Por Io tanto, Ia reacción enzimática hace aumentar Ia conductividad del tampón original. El tampón original está formado por una solución acuosa de urea 0.1 M y glicina 0.25 M, con una conductividad aproximada de 16 μS/cm. En este ejemplo, las gotas de tampón, de 1 μl de volumen se depositaron sobre los transductores (5) manualmente utilizando una micropipeta. En Ia preparación del microarray, se empleó como analito modelo a detectar una inmunoglobulina G de conejo y se aplicó un ensayo de tipo fase inversa. Este consistió en realizar diluciones sucesivas de una solución madre de dicho analito modelo. Se depositaron microgotas de 1 μl_ de volumen, de cada una de las diluciones preparadas en el soporte (9) del microarray (6) (portaobjetos de vidrio previamente silanizado). Una vez inmovilizado el analito, el microarray (6) se incubó con una disolución de un anticuerpo de cabra, anti-inmunoglobulina G de conejo marcado con ureasa durante una hora, tiempo durante el cual tuvo lugar Ia interacción específica entre el analito y el anticuerpo marcado. Tras lavar el microarray (6) con agua desionizada y secar en corriente de nitrógeno, se procedió a Ia lectura del mismo con Ia matriz de transductores (5) impedimétricos.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. Dispositivo (1 , 1 ', 1 ") de lectura de microarrays (6) de tipo eléctrico y reutilizable, donde el microarray (6) comprende un soporte (9) plano en cuya superficie de test (7) hay una matriz de spots (8) con una marca enzimática, caracterizado porque comprende:
una base (2, 2', 2"), que comprende unos medios de apoyo (3, 3', 3") para situar Ia superficie de test (7) del microarray (6) en paralelo a una superficie de lectura (4) de Ia base (2, 2', 2");
una matriz de transductores (5, 5', 5"), dispuestos sobre Ia superficie de lectura (4) de Ia base (2, 2', 2"), que traducen una variación de una magnitud eléctrica o química en una variación de una magnitud eléctrica; y
unos medios de lectura (10), conectados a los transductores (5, 5', 5"), que interpretan las señales eléctricas de los transductores (5, 5', 5").
2. Dispositivo (1 , 1 ', 1 ") de lectura eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con Ia reivindicación 1 , caracterizado porque Ia base (2, 2', 2") y Ia matriz de transductores (5, 5', 5") están fabricados a partir de una oblea de vidrio tipo pirex.
3. Dispositivo (1 , 1 ', 1 ") de lectura eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque los transductores (5, 5', 5") se eligen de Ia siguiente lista: transductores impedimétricos, transductores amperométricos y transductores potenciométricos.
4. Dispositivo (1 , 1 ', 1 ") de lectura eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque los medios de lectura (10) comprenden circuitos electrónicos que adquieren y procesan las señales eléctricas generadas por los transductores (5, 5', 5").
5. Dispositivo (1 , 1 ', 1 ") de lectura eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque además comprende un medio de aplicación de gotas de medio acuoso para formar una gota de medio acuoso sobre cada transductor (5, 5', 5").
6. Dispositivo (1 ") de lectura eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con Ia reivindicación 5, caracterizado porque el medio de aplicación de gotas de medio acuoso es un aplicador que comprende un depósito (11 ") de medio acuoso y una matriz de microcanales (12") practicados en una de sus paredes.
7. Dispositivo (1 ') de lectura eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con Ia reivindicación 5, caracterizado porque el medio de aplicación de gotas de medio acuoso comprende un depósito (11 ') de medio acuoso situado junto a Ia superficie de Ia base (2') opuesta a Ia superficie de lectura (4), y una matriz de microcanales (12') practicados en Ia base (2').
8. Dispositivo (1 ') de lectura eléctrica de un microarray (6) de acuerdo con Ia reivindicación 7, caracterizado porque los microcanales (12') comprenden una boquilla situada en un orificio central de los transductores (5')
9. Procedimiento de lectura de un microarray (6), donde el microarray (6) comprende un soporte (9) plano en cuya superficie de test (7) hay una matriz de spots (8) con una marca enzimática y donde el dispositivo (1 , 1 ', 1 ") de lectura comprende una base (2, 2', 2") sobre cuya superficie de lectura (4) se dispone una matriz de transductores (5, 5', 5") que transforman una modificación de una propiedad eléctrica o química en una modificación de una propiedad eléctrica, caracterizado porque comprende las siguientes operaciones:
disponer en paralelo Ia superficie de lectura (4) de Ia base (2, 2', 2") y Ia superficie de test (8) del microarray (6), de modo que cada spot (8) está enfrentado a un transductor (5, 5', 5") con una gota de un medio acuoso en contacto con ambos;
leer, mediante unos medios de lectura (10), Ia señal eléctrica generada por cada uno de los transductores (5, 5', 5") en respuesta a Ia modificación de una propiedad eléctrica o química del medio acuoso que forma Ia gota;
lavar Ia superficie de lectura (4) del dispositivo (1 ) y reutilizarlo para nuevas lecturas.
10. Procedimiento de lectura de un microarray (6) de acuerdo con Ia reivindicación 9, caracterizado porque Ia gota de medio acuoso se añade antes de acercar los spots (8) del microarray (6) a los transductores (5, 5', 5").
11. Procedimiento de lectura de un microarray (6) de acuerdo con Ia reivindicación 9, caracterizado porque Ia gota de medio acuoso se añade después de acercar los spots (8) del microarray (6) a los transductores (5, 5', 5'").
12. Procedimiento de lectura de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , caracterizado porque Ia operación de lectura se realiza durante todo el tiempo que cada gota de medio acuoso permanece en contacto con los spots (8) y transductores (5, 5', 5").
13. Procedimiento de lectura de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , caracterizado porque Ia operación de lectura se realiza solamente una vez un tiempo predeterminado después de entrar las gotas de medio acuoso en contacto con los spots..
14. Procedimiento de lectura de un microarray (6) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-13, caracterizado porque Ia operación de lavar el dispositivo (1 , 1 ', 1 ") de lectura se efectúa inyectando una solución de limpieza mediante un medio de aplicación de gotas de medio acuoso.
PCT/ES2009/070278 2008-07-11 2009-07-08 Dispositivo de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable WO2010004075A1 (es)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/737,438 US20110152124A1 (en) 2008-07-11 2009-07-08 Electrical and reusable device for reading microarrays
CN2009801269807A CN102089648A (zh) 2008-07-11 2009-07-08 用于读取微阵列的电气可重用设备
JP2011517182A JP2011527427A (ja) 2008-07-11 2009-07-08 マイクロアレイ読み取りのための再利用可能な電気装置
CA2730644A CA2730644A1 (en) 2008-07-11 2009-07-08 Electrical and reusable device for reading microarrays
EP09793983A EP2302370A1 (en) 2008-07-11 2009-07-08 Electrical and reusable device for reading microarrays

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200802068 2008-07-11
ES200802068A ES2334745B1 (es) 2008-07-11 2008-07-11 Dispositivo de lectura de microarrays de tipo electrico y reutilizable.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010004075A1 true WO2010004075A1 (es) 2010-01-14

Family

ID=41506719

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2009/070278 WO2010004075A1 (es) 2008-07-11 2009-07-08 Dispositivo de lectura de microarrays de tipo eléctrico y reutilizable

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20110152124A1 (es)
EP (1) EP2302370A1 (es)
JP (1) JP2011527427A (es)
KR (1) KR20110034661A (es)
CN (1) CN102089648A (es)
CA (1) CA2730644A1 (es)
ES (1) ES2334745B1 (es)
WO (1) WO2010004075A1 (es)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017092875A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Method for producing a plurality of measurement regions on a chip and chip having a plurality of measurement regions

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050106742A1 (en) * 2003-08-30 2005-05-19 Hans-Peter Wahl Method and device for determining analytes in a liquid
WO2006026796A1 (de) 2004-09-08 2006-03-16 Nanoident Technologies Ag Vorrichtung zum auswerten biochemischer proben
WO2008051196A2 (en) 2005-09-21 2008-05-02 Combimatrix Corporation Process to detect binding events on an electrode microarray using enzymes

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4320069B2 (ja) * 1998-09-28 2009-08-26 セイコーエプソン株式会社 センサーデバイス作成方法
JP2001083158A (ja) * 1999-09-17 2001-03-30 Fuji Photo Film Co Ltd マクロアレイと支持具を用いた分析方法とその為の用具
WO2003012147A1 (en) * 2001-02-20 2003-02-13 Datascope Investment Corp. Method for reusing standard blots and microarrays utilizing dna dendrimer technology
CN1605861A (zh) * 2004-11-15 2005-04-13 东南大学 电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的制备和检测方法
JP3930517B2 (ja) * 2005-03-23 2007-06-13 株式会社東芝 生体分子の定量分析チップ、及び、定量分析方法、定量分析装置及びシステム
US7453916B2 (en) * 2005-09-08 2008-11-18 Intel Corporation High throughput optical micro-array reader capable of variable pitch and spot size array processing for genomics and proteomics

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050106742A1 (en) * 2003-08-30 2005-05-19 Hans-Peter Wahl Method and device for determining analytes in a liquid
WO2006026796A1 (de) 2004-09-08 2006-03-16 Nanoident Technologies Ag Vorrichtung zum auswerten biochemischer proben
WO2008051196A2 (en) 2005-09-21 2008-05-02 Combimatrix Corporation Process to detect binding events on an electrode microarray using enzymes

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DE THE RICA, R ET AL.: "Local detection of enzymatic ion generatiom with polycrystalline silicon interdigitated elctrodes and its application to biosensing.", APPLIED PHYSICS LETTERS, vol. 90, 2007, XP012096094 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2302370A1 (en) 2011-03-30
CN102089648A (zh) 2011-06-08
JP2011527427A (ja) 2011-10-27
KR20110034661A (ko) 2011-04-05
ES2334745A1 (es) 2010-03-15
ES2334745B1 (es) 2011-02-14
CA2730644A1 (en) 2010-01-14
US20110152124A1 (en) 2011-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2691647T3 (es) Método y aparato para la detección de dianas usando virus unidos a electrodos
US8962279B2 (en) Solid-phase chelators and electronic biosensors
Bakker et al. Electrochemical sensors
US7348183B2 (en) Self-contained microelectrochemical bioassay platforms and methods
US6846638B2 (en) Method and system for rapid biomolecular recognition of amino acids and protein sequencing
JP4216712B2 (ja) マイクロ流体式化学検定装置および方法
US8444835B2 (en) Electronic and fluidic interface
US20030134267A1 (en) Sensor for detecting biomolecule using carbon nanotubes
US20090178935A1 (en) Miniaturised Biosensor with Optimized Amperometric Detection
Colozza et al. Origami paper-based electrochemical (bio) sensors: State of the art and perspective
Dalavoy et al. Immobilization of DNAzyme catalytic beacons on PMMA for Pb 2+ detection
KR101218987B1 (ko) 바이오칩 및 그 제조 방법, 이를 이용한 분석 대상 물질 검출 방법
US8067249B2 (en) Method for functionalizing biosensor chips
ES2334745B1 (es) Dispositivo de lectura de microarrays de tipo electrico y reutilizable.
US20130040848A1 (en) Methods and Devices for Detecting Structural Changes in a Molecule Measuring Electrochemical Impedance
JP4744910B2 (ja) バイオセンサ、マルチバイオセンサ及びこれを用いた多成分測定システム
JP6759881B2 (ja) 生体分子検出装置および生体分子検出装置の製造方法
KR101729489B1 (ko) 전도성 입자들과 이에 대응하는 폴리뉴클레오티드들의 조합을 이용한 바이오 센서 및 이를 이용하여 전기적 신호를 검출하는 방법
US9995703B2 (en) Device similar to electrochemical camera and method for producing device
US20040259138A1 (en) Method for printing biomolecules
JP5470300B2 (ja) バイオチップの製造方法
Willner et al. Bioelectronics–An Introduction
KR100531787B1 (ko) 전기화학 발광 방식의 인터컬레이터를 이용하는 항원검출기 및 항원 검출방법
Khuda Development of Nucleic Acid Driven Peptide and Protein Sensors and Their Integration with Automated Microfluidics
JP2006508353A (ja) 荷電分子の輸送のための、ないし結合特異的分離のための方法及び装置

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980126980.7

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09793983

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009793983

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011517182

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2730644

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 819/CHENP/2011

Country of ref document: IN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20117002956

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12737438

Country of ref document: US