WO2010004057A1 - MATRICES TRIDIMENSIONALES DE MONETITA POROSA ESTRUCTURADA PARA INGENIERIA TISULAR Y REGENERACION OSEA, Y METODO DE PREPARACIόN DE LAS MISMAS - Google Patents

MATRICES TRIDIMENSIONALES DE MONETITA POROSA ESTRUCTURADA PARA INGENIERIA TISULAR Y REGENERACION OSEA, Y METODO DE PREPARACIόN DE LAS MISMAS Download PDF

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Maria Begoña CASTRO FEO
Maria Dolores Garcia Vazquez
Maite Del Olmo Basterrechea
Jorge Rubio Retama
Enrique Lopez Cabarcos
Carmen Rueda Rodriguez
Faleh TAMIMI MARIÑO
Mohammad Hamdan Ali Alkhraisat
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Definitions

  • the present invention is framed within tissue engineering and, in particular, bone regeneration.
  • the invention relates to a porous three-dimensional matrix of biocompatible monetite, of defined and biodegradable porosity, as well as the method of synthesis capable of producing said material and its applications.
  • These matrices constitute a perfect base for cell colonization and proliferation allowing its application in tissue engineering and bone regeneration thanks to its advantageous properties of biocompatibility, reabsorption, osteoinduction, revascularization, etc.
  • Biomaterials have been used for almost a century to repair or replace bone segments of the musculoskeletal system.
  • a bone-like material that is biocompatible, has no adverse biological reactions, is reabsorbable and gradually degrades as the new tissue forms, thus transferring the loads progressively to the new bone, avoiding Second surgical intervention for implant removal.
  • the surface of the bone Once fixed, they start releasing protons outside, in order to lower the pH of the external medium.
  • hydroxyapatite crystals that are part of the bone mineral component are solubilized. Bone hydroxyapatite is solubilized in amorphous calcium phosphate particles, which are eliminated by macrophages, or in Ca 2+ and PO 4 3 ' ions that accumulate in extracellular fluid. These ions diffuse into the blood capillaries entering the systemic circulation to be eliminated by the urine through the kidney. These released ions can also be reused by osteoblasts to form new bone. The osteoclasts are also responsible for the degradation of the organic phase of the bone through enzymatic processes.
  • the mechanical properties of the bone substitute should be as similar as possible to those of the spongy bone.
  • the material must also help the stability of the fracture and be sufficiently resistant to reduce the necessary time of immobilization or external support.
  • Said material must be biodegradable, biocompatible and osteoinductive, that is, it must attract mesenchin cells and other cell types located near the implant and favor its differentiation into osteoblasts, and also osteoconductors, that is, it must act as a template for the formation of new bone.
  • the non-absorbable materials used so far in bone implants are being replaced by the absorbable ones. These biomaterials do not interfere with the development and growth of the newly formed bone, since they are gradually replaced by host tissue. In addition, they have a greater biocompatibility, participate in a natural way in bone reconstruction and do not need to eliminate them, by surgery, after bone regeneration. These materials have to be maintained long enough for the correct regeneration of the bone and gradually disintegrate without causing damage to the patient and without intervening in the proper development and growth of the bone.
  • the biomaterials that form forming a mineral calcium phosphate have special interest in bone regeneration since they resemble the mineral phase of the natural bone and are susceptible to bone remodeling and reabsorption due to their metastable crystalline structure.
  • calcium phosphates stand out; hydroxyapatite (PAH), tricalcium phosphate (B-TCP) and dicalcium phosphate dihydrate (DCPD) (Stubbs et al, 2004; Schnettler et al 2004).
  • PAH hydroxyapatite
  • B-TCP tricalcium phosphate
  • DCPD dicalcium phosphate dihydrate
  • Hydroxyapatite has been one of the most interesting. This material is per se the inorganic phase of which the bones are formed and that is why it has been widely used in bone regeneration. Examples of this are some commercial products such as Interpore 200® Interpore 500®, Cerasorb® and Collagraft®. However, and because it has one of the most stable crystalline structures, the material suffers from a slow reabsorption.
  • PAH is the material with the highest biocompatibility, as it is the closest to the crystals formed by the bone, but it is not reabsorbable in vivo.
  • the degradation of this material is produced by contact with solutions with a low pH and by phagocytosis. Through the solution, amorphous calcium phosphate particles are released that can be eliminated by macrophages by phagocytosis or be embedded in the New bone formed. Macrophages can dissolve these particles and restore Ca and P to the organism pool (Frayssinet et al 1999; Be Spotifyd et al 1996). However, it has not been observed that these particles give rise to osteoclastic activation (Frayssinet et al 1999).
  • B-TCP has more osteoconductivity and better reabsorption than PAH (Franco et al 2006). It is considered as a moderately reabsorbable material, in vivo studies it has been observed that it takes at least one year for its reabsorption in animals and 6 to 8 months in humans (Wiltfang et al 2003; Suba et al 2004). Its degradation increases calcium deposits and this is associated with greater alkaline phosphatase activity, an enzyme that is involved in bone formation (Trisi et al 2003; Sugawara et al 2004).
  • the DCPD is also biocompatible, osteoconductive and the most reabsorbable because it is the most soluble at physiological pH. This allows new bone to form faster. It biodegrades in physiological environments and is reabsorbed by adjacent cells (Tris et al 2003). It is proven that it is reabsorbed in vivo, up to three times faster than PAH and B-TCP (Herrón et al 2003; Chow et al 2003; Tas & Bhaduri 2004; Tamini et al 2006;).
  • brushite is one of the materials of greatest interest in bone regeneration. Due to its interesting properties, there are currently brushite cements designed for setting in situ. Thus, for example, in US6733582 and US2006213398 patents, in-situ setting brushite cements are claimed, Chronoss Inject® being such a product already commercialized. However, this material has a great problem at the time of being sterilized since it decomposes when heated, which hinders its proper sterilization.
  • the Monetite is reabsorbed live in time and in a similar way. It dissolves at physiological pH, gradually in the extracellular tissues that surround the implant and the cells that colonize it, (endothelial cells, osteoclasts, osteoblasts, macrophages %) would be responsible for its elimination or reuse as it happens in the bone.
  • the biomaterial has an adequate porosity that allows the colonization and cell proliferation, vascularization, increase of the contact surface and therefore increase of the surface of interaction with the host tissue that allows the acceleration of bone regeneration. These characteristics must be accompanied by a correct rate of resorption that provides the cells with the time necessary for regeneration.
  • the present invention provides matrices composed of a material substantially composed of monetite (metastable phase of calcium phosphate of monetite), with a high thermal stability that allows the sterilization of the material by autoclaving, thus simplifying the sterilization processes and also, by its specific structural arrangement of pores, an arrangement that is obtained thanks to a specific design of the material, implies an improvement of the osteoinductive capacity of materials proposed by the state of the art since it is synthesized in the form of a porous block with macro characteristics, meso and microporosity defined by increasing the specific surface, as well as the area of contact with osteoblasts and facilitating the processes of nutrient transport for cells, a crucial factor for osteogeneration. All this together with its high resorption capacity in the appropriate period of time so that the adjacent cells colonic the material and can replace the reabsorbed material by physiological bone matrix.
  • the cells of the implant area, osteoblasts of the adjacent bone, mesenchymal stem cells of the bone marrow and endothelial cells of the systemic circulation must be able to colonize simultaneously and homogeneous biomaterial. This will allow the formation of a new physiological bone matrix as the biomaterial is resorbed and the development of a new vascular system, which will be the one that supplies the blood supply necessary for the survival of the new tissue.
  • porous structure An important property to take into account in relation to this aspect is the porous structure, because it influences both the biodegradability, the greater the porosity degree, the better the resorption, as in the cellular colonization.
  • the materials must have pore sizes and interconnections that allow colonization of both endothelial cells (for the formation of new blood vessels) and bone cells.
  • microporous and interconnected character which allows the diffusion of nutrients and gases and also of the metabolites characteristic of cellular activity.
  • Bone is not a compact material but has different porosities that intercommunicate. Interconnected pore systems communicate the solid (cortical) bone with the spongy (trabecular) bone ( Figure 12). These porosities range from 100-150 ⁇ m in the cortex to 500-600 ⁇ m in the spongy.
  • the present invention presents a new tissue engineering system, intended to regenerate the bone structure by addressing a healing strategy rather than merely repair. Said regeneration has application against osteoporosis.
  • Tissue engineering is considered as a discipline that improves, maintains and repairs pathologies in organs and tissues.
  • the creation of a system based on tissue engineering involves the integration of viable cells, a biocompatible material specially designed for a biomedical application and signaling molecules that regulate the cellular activities that are required at each moment of treatment.
  • the present invention provides structured matrices composed of a monetite material, in whose design the porosities of the bone have been taken into account, so that it is neovascularization and cell colonization. Said material is presented sterilized, ready for use and thanks to its specific design, it achieves a specific structural arrangement of pores, which implies an improvement of the osteoinductive capacity against other calcium phosphates, including other combinations of calcium phosphate that include monetite. .
  • Said matrices are obtained in the form of a porous block with defined macro, meso and microporosity characteristics that increase the specific surface, as well as the zone of contact with the osteoblasts, facilitating the processes of nutrient transport for the cells, a crucial factor for the osteogeneration
  • monetite matrices of the invention has taken into account the characteristic porosities of natural bone, porosities that allow neovascularization and cell colonization.
  • the new matrices of the invention are composed of the Monetita biomaterial, a dehydrated DPCD (DPC), ideal for bone regeneration.
  • Said matrices consist of at least 95% + -5% monetite, preferably 98% monetite and more preferably 100% monetite.
  • Traces of material correspond to beta tetracalcium phosphate. In vitro degradation of this material does not affect cell proliferation and is also bioactive, non-cytotoxic, non-mutagenic and hemocompatible.
  • the matrices of the invention are reabsorbed in the appropriate period of time so that the adjacent cells colonize the material and can replace the reabsorbed material by physiological bone matrix.
  • Matrix refers to any three-dimensional structure useful in bone regeneration that allows cell growth and proliferation of the invading cells.
  • the new design incorporates macroporos of 500 ⁇ m ⁇ 0.1 mm in a cylindrical form (in the form of a tunnel), which completely cross the structure of the material, for an adequate cellular colonization (in terms of different cell types and a sufficient number of each type) of the cells of adjacent tissues, as well as an integration with the recipient tissue.
  • macroporos 500 ⁇ m ⁇ 0.1 mm in a cylindrical form (in the form of a tunnel), which completely cross the structure of the material, for an adequate cellular colonization (in terms of different cell types and a sufficient number of each type) of the cells of adjacent tissues, as well as an integration with the recipient tissue.
  • a micropore network for a sufficient diffusion of nutrients, gases and waste products of cellular metabolism.
  • the material of the invention with a high percentage of porosity, especially macroporosity, in which there are pores with high diameters
  • the molar ratio of basic phosphate / acid phosphate is 1.6-1.8 during a time of approximately 10 minutes, the concentration of porogen 1-20% by weight and the retarder between 04-06% by weight; preferably mole ratio of basic phosphate / acid phosphate of 1,785, concentration of porogens 3-10% by weight and the retarder Ia is 0.54% by weight.
  • the molar ratio of basic phosphate / acid phosphate to carry out the mixture is 1.6-1.8, preferably 1,785, for a time of approximately 10 minutes.
  • Calcium carbonate is added in concentrations between 1-20% by weight, preferably between 3-10%.
  • the invention proposes the use of pyrophosphate in a proportion of 0.4-0.6% by weight, with 0.54% being the preferred option.
  • molds are filled that allow the matrices of the invention to be obtained, which have the uniform pore distribution indicated above, that is, a density of approximately 0.8 macropores / mm2, where 100% of the total porosity of the matrices , 75-60%, and more preferably 68.75% corresponds to the intrinsic porosity of the material (distributed in micro, meso and macropores, (see figure 3)), while 25-40% and more preferably 31 , 25% of the porosity is due to macropores with a diameter between 350- and 650 ⁇ m, more preferably 500 ⁇ m evenly distributed throughout the material.
  • the mold of the invention used for the development of the biomaterial refers to any mold that has cylindrical punches, whose base has a diameter of between 350- and 650 ⁇ m, more preferably 500 ⁇ m, and that are separated from each other between 0.4 and 0 , 6 mm, more preferably by 0.5 mm.
  • Said mold can be constructed of silicone, metal, resistant plastic material or any type of material that allows it to be applied in its use.
  • the mold can have any desired shape, depending on the shape and size of the biomaterial that is required to repair a particular bone defect for each patient, always maintaining the obtained biomaterial the characteristic porosity characteristics of the biomaterial of the invention, that is, cylindrical macroporos diameter between 350- and 650 ⁇ m, more preferably 500 ⁇ m in diameter, separated evenly between 0.4 and 0.6 mm, more preferably 0.5mm, in addition to the intrinsic porosity of the biomaterial.
  • the biomaterial of the invention can be presented in the form of tablets, sheets, cylinders, etc., and any other form that is useful for repairing a particular bone defect of a patient.
  • the products of the present invention find application in the field of tissue engineering, and bone regeneration.
  • the monetite matrices of the invention obtained through the defined molds, are applicable for the support and growth of cells and the previously defined applications
  • DPCD reabsorption Ia begins between 4 and 8 week time period which is suitable for the adjacent cells to colonize the material and can replace material reabsorbed by physiological bone matrix. This biodegradability is adjusted to what happens in the organism, where bone growth in defects can take place in a period of time between 2 and 6 months, depending on the type of bone and the size of the defect (Francone V. 2004 ).
  • the monetite can show very low resistance and elasticity with respect to that of the trabecular bone (elasticity 50-100 MPa and compression 5-10 MPa). However, it would be almost impossible to match the mechanical properties of the bone. And, it has been shown that it is sufficient for the material to achieve sufficient mechanical properties to support cell growth, since the cells, upon invading the material will form the organic phase of the implant and improve the mechanical properties.
  • Monetite material is biodegradable, absorbable, bioactive, has characteristics similar to bone. This material allows cell growth both on its surface as inside, once in the bone defect, it will allow the cells (endothelial, osteoblasts, osteoclasts ...) to form the necessary scaffold that will connect to the healthy bone. Subsequently, the monetite will be eliminated little by little, without undergoing transformation to hydroxy apatite, by the action of the osteoclasts, and the osteoblasts will synthesize the new mineral phase that will replace the monetite, completely eliminating the initial defect.
  • a first object of the present invention refers to a porous monetite material that has a total porosity distribution comprising less than 35% by volume of air, preferably 43-53% and more preferably 48%.
  • Another object of the invention relates to the porous monterite material having a hardness of at least 8 ⁇ 2 MPa.
  • a following object of the invention constitutes the porous monetite material having a defined porosity of 0 to 60% of micropores, 0 to 15% of mesopores and 0 to 50% of macropores, more preferably 52%, 13% and 35% respectively , where 25-40% of the pores, and more preferably 31% of the pores have a diameter between 350 and 650 ⁇ m, and more preferably 500 ⁇ m
  • Another object of the invention constitutes the porous or structured monetite matrices, constituted by the material of the described invention. These structured matrices are characterized by presenting a macropore distribution of
  • 350-650 ⁇ m in diameter and more preferably 500 ⁇ m are uniformly distributed along the matrix, and separated from each other by 0.4-0.6 mm, more preferably 0.5 mm.
  • Said macropores cross transversely, in the form of a tunnel, the matrix and are obtained thanks to a mold.
  • Another object of the invention is what the structured porous monetite matrices have a cylindrical shape, with a diameter of 10mm, a height of 5mm, and 64 cylindrical macropores with a diameter of 500 ⁇ m ⁇ 60 ⁇ m, uniformly separated 0.5 mm from each other that cross the material.
  • a following object of the invention constitutes the method of synthesis of porous monetite material characterized by presenting a mixing stage of a solid phase composed of basic calcium phosphates, acidic calcium phosphates, a porogen and a retarder, and the mixture thereof solid phase with distilled water to give rise to the liquid phase and a second stage of thermal transformation by autoclaving.
  • the basic calcium phosphate is beta tricalcium phosphate
  • the acidic calcium phosphate is calcium monophosphate and its molar ratio is 1.6-1.8, preferably 1,785
  • the porogen is calcium carbonate in concentration of 1-20% by weight, preferably 3-10%
  • the retardant is sodium pyrophosphate in concentration of 04-06% by weight, preferably 0.54%.
  • autoclaving said process is preferably carried out at 120-130 0 C and for 24-25 minutes.
  • Another object of the invention constitutes the mold characterized by presenting a homogeneous distribution of punches of 350-650 ⁇ m in diameter, preferably 500 ⁇ m in diameter uniformly spaced between 0.4-0.6 mm from each other, preferably 0.5mm.
  • Said mold can be composed of silicone, metal, resistant plastic or any other material that allows its application, being able to adopt any form required for the repair of a particular bone or tissue defect.
  • Another object of the invention relates to the particular case in which the mold consists of a cylinder with a diameter of 10mm, height of 5mm, and having 64 cylindrical punches with a base diameter of 500 ⁇ m ⁇ 60 ⁇ m, uniformly separated 0.5 mm from each other .
  • Another object of the invention constitutes the use of the mold for obtaining calcium phosphates, preferably the structured porous monetite material of the invention, which take the form of the mold.
  • a following object of the invention relates to the method of synthesis of the three-dimensional matrices of structured porous monetite characterized in that in addition to the two stages of the method of synthesis of a porous monetite material, it comprises between stages 1 and 2 a third stage consisting in the application of a mold in the cement during the setting to generate in it vertical cylindrical pores.
  • Another object of the invention relates to the use of porous monetite material as a support for cell cultures, as well as to the material comprising the cells.
  • Another object of the invention relates to the use of the three-dimensional matrices of porous monetite as well as the matrices comprising the cells. In both cases, said cells are mesenchymal cells, osteoblasts, osteoclasts, osteocytes, endothelial cells or combinations thereof.
  • Another object of the invention relates to the use of the porous monetite material in tissue regeneration, bone structure regeneration and osteoporosis.
  • a following object of the invention constitutes the use of porous monetite matrices structured in the same uses.
  • Figure 1 Design of an example of a mold used to obtain the monetite matrix, with a homogeneous distribution of vertical pores of 500 ⁇ 60 mm in diameter, regularly spaced and reproducible.
  • Figure 2 Photograph of one of the porous monetite matrix shapes seen in elevation (a) and in profile (b). In this image the cylindrical pores of equal size can be seen, distributed regularly by the structure of the matrix and how these pores completely cross the structure.
  • Figure 3 Pore distribution of the biomaterial.
  • the table shows the percentage of pores classified according to their diameter.
  • Figure 4 X-ray diffraction of the precursor porous brushite (before heat treatment) and porous monetite (after heat treatment) obtained after the material transformation and sterilization process.
  • the structural analysis of the samples (Rietvel analysis) after the autoclave sterilization shows that the material consists mainly of monetite 95 ⁇ 5% and the rest is ⁇ tricalcium phosphate (also called ⁇ -TCP).
  • ICSD 016132 ⁇ tricalcium phosphate
  • Figure 5 Pore diameter distribution for pores less than 360 ⁇ m measured with mercury porosimeter in the monetite biomaterial containing 5% calcium carbonate in its composition.
  • the image shows a diagram in which the pore volume can be observed as a function of the pore diameter, that is to say the number of pores (defined on the Y axis of the graph) that show a certain size (defined on the X axis of The graphic).
  • the 64 cylindrical pores made with the mold shown in Figure 1 are not included in this distribution since they are greater than 360 ⁇ m, which is the upper limit of measurement of the mercury porosimeter.
  • Figure 6 Front (a) and lateral (b) images of the amorphous monetite matrix, that is, without the structured porosity.
  • the porosity that is appreciated is inherent to the process of obtaining, the majority of the porosity of the biomaterial Io make up micropores, in which the cell colonization cannot be carried out,
  • Figure 7 Scanning electron microscopy images at different magnifications of the monetite biomaterial without controlled porosity. These images show a fundamentally microporous biomaterial (c) and with the minimum presence of some macropores (b) arranged randomly, by way of cavities, which in no case get through the matrix (a, b).
  • Figure 8 Scanning electron microscopy image in which the monetite biomaterial is observed with pores of 500 Dm distributed homogeneously throughout the matrix.
  • Figure 9 Scanning electron microscopy images of mesenchymal stem cells arranged in the monetite biomaterial of uncontrolled porosity. It can be seen that the cells are arranged on the surface of the matrix, without the possibility of colonizing its interior, since they have a size significantly larger than the microporosity that characterizes the biomaterial.
  • Figure 10 Scanning electron microscopy images at different magnifications of a matrix of macroporous monetite. The macropores allow mesenchymal stem cells to colonize the surface of the biomaterial (a) and enter through the pores (b, d). In (c) we observe the cross section of a macropore. (c) Cells interact with each other by emitting cytoplasmic prolongations, just as occurs in a physiological tissue.
  • Figure 11 Proliferation of mesenchymal stem cells arranged on the monetite material with uncontrolled porosity (gray) versus those arranged on the structured macroporosity biomaterial (black).
  • Figure 12 Bone tissue morphological scheme: 1. Cortical bone. 2. Trabecular bone. 3 Haver system. 4 Blood vessel. 5 Havers Channel. 6 Volkmann Channel. 7 Periosteum. 8 Bone lining. 9 Glasses of the periosteum. 10 Osteoclasts 11 Osteoblast. 12 Osteocytes.
  • the solid phase comprises but is not limited to an acidic calcium phosphate, a basic calcium phosphate, a porogen such as calcium carbonate and a setting retardant such as sodium pyrophosphate.
  • the solid phase of the calcium cement consists of a basic calcium phosphate and acidic calcium phosphate.
  • the basic calcium phosphate is tricalcium-beta phosphate ( ⁇ -TCP) and the acidic calcium phosphate is calcium monophosphate.
  • ⁇ -TCP tricalcium-beta phosphate
  • the two components are mixed in a molar ratio of 1,785 in mortar with hand for 10 minutes.
  • Calcium carbonate is added in concentrations between 1-20% (weight / weight) preferably between 3-10%.
  • Sodium pyrophosphate 0.54% (weight / weight) is used as a retarder of the setting reaction.
  • ⁇ -TCP tricalcium-beta phosphate
  • the powder is then screened and the powder having a particle size smaller than 322 ⁇ m is used.
  • the liquid phase consists of distilled or double distilled water.
  • the solid phase formed by 0.8 g of anhydrous calcium monophosphate, 1.4 g of beta tricalcium phosphate, 12 mg of sodium pyrophosphate and 110 mg of carbonate is weighed and 0.77 ml of the liquid phase is mixed in a liquid powder ratio (P / L) of 3 on a glass plate for 30 s.
  • the cement is set for 30 minutes in a water bath at 37 0 C.
  • the biomaterial is then washed several times in distilled water to remove acid residues in the medium until it reaches a pH close to 7, which is optimal for cell growth to be carried out in later stages.
  • sterilization is carried out.
  • the process used for said sterilization comprises autoclaving the set material in a temperature range 120-130 0 C for 24-25 minutes. During this process the brushite is transformed into monetite.
  • Example 2 Method of synthesis of the amorphous porous monetite matrix.
  • the resulting cement, brushite is arranged on a surface shaped of interest for setting and subsequent sterilization, thus obtaining a matrix amorphous, with little presence of macropores and irregular distribution of them, as can be seen in figures 5 a and b,
  • Figure 2 shows a porous matrix of monetite produced by the process described in the invention.
  • the resulting material shows a spongy appearance with a given pore distribution.
  • Figure 4 shows the diffraction diagram of the samples before and after heat treatment in the autoclave. It can be seen in Figure 4 that the heat treatment in addition to sterilizing the material causes the crystalline transformation of the brushite to monetite structure.
  • Example 4 Concrete realization of a monetite tablet with structured porosity
  • the structured porous monetite matrix will favor a correct bone regeneration by providing the appropriate conditions for the correct colonization and cell proliferation.
  • the cells were cultured in the biomaterial for 7 days, after which, the biomatrix on whose surface the cells had been adhered by scanning electron microscopy (SEM) was analyzed, to observe the ability of adhesion and colonization of said cells on the porous monetite biomaterial.
  • SEM scanning electron microscopy
  • the images obtained by SEM demonstrate that mesenchymal stem cells are capable of adhering perfectly to the biomaterial, adopting adequate morphology and that they also establish intercellular contacts, as occurs in a physiological tissue (Fig. 10 cyd ).
  • the cells are perfectly dispensed with the biomaterial, interacting maximally with it and emitting cytoplasmic extensions (filipodes), which increase the contact surface and increase the level of intercellular contact.

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Abstract

La presente invención se enmarca dentro del a ingeniería tisular y, en concreto dentro de Ia regeneración ósea. La invención se refiere a una matriz tridimensional porosa de monetita biocompatible, de porosidad definida y biodegradable así como al método de síntesis capaz de producir dicho material y sus aplicaciones. Estas matrices constituyen una base perfecta para Ia colonización y proliferación celular permitiendo su aplicación ingeniería tisular y regeneración ósea gracias a sus ventajosas propiedades de biocompatibilidad, reabsorción, osteoinducción, revascularización etc.

Description

Matrices tridimensionales de monetita porosa estructurada para ingeniería tisular y regeneración ósea, y método de preparación de las mismas.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se enmarca dentro de Ia ingeniería tisular y, en concreto dentro de Ia regeneración ósea. La invención se refiere a una matriz tridimensional porosa de monetita biocompatible, de porosidad definida y biodegradable, así como al método de síntesis capaz de producir dicho material y a sus aplicaciones. Estas matrices constituyen una base perfecta para Ia colonización y proliferación celular permitiendo su aplicación en ingeniería tisular y regeneración ósea gracias a sus ventajosas propiedades de biocompatibilidad, reabsorción, osteoinducción, revascularización, etc.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La pérdida de masa y calidad ósea es un grave problema de salud que resulta aún más frecuente en pacientes de edad avanzada.
El éxito en la regeneración de un defecto óseo utilizando materiales tridimensionales, que inicialmente son colonizados por células progenitoras in vitro, depende en gran medida de las características y estructura del material.
Desde hace casi un siglo se utilizan biomateriales para reparar o reemplazar segmentos óseos del sistema musculoesquelético.
El uso de injertos de hueso autógeno, es decir del propio individuo, es un método muy utilizado para rellenar cavidades óseas y para reconstrucciones quirúrgicas. Sin embargo, existe un suministro limitado de hueso y además se somete al paciente a un trauma adicional para obtener el injerto. Otra opción Ia constituyen los aloinjertos de donantes que también presentan inconvenientes como una velocidad de neoformación ósea más lenta, inferior capacidad osteogénica, velocidad de reabsorción, menor revascularización así como un mayor riesgo de respuesta inmunogénica y transmisión de agentes patógenos.
Lo ideal es obtener un material similar al hueso, que sea biocompatible, no presente reacciones biológicas adversas, sea reabsorbible y se degrade de forma paulatina a medida que se forma el nuevo tejido, transfiriendo así las cargas de forma progresiva al nuevo hueso, evitando una segunda intervención quirúrgica para Ia extracción del implante. Un material cuyos productos de degradación sean de fácil eliminación y no tóxicos, que sea osteoinductivo e induzca Ia formación de tejido óseo.
En el organismo, Ia degradación y reabsorción del hueso Ia llevan a cabo los osteoclastos. Éstas son unas células derivadas de los monocitos, las cuales se fijan a
Ia superficie del hueso. Una vez fijadas, empiezan a liberar protones al exterior, con el fin de descender el pH del medio externo. Con este ambiente ácido se consiguen solubilizar los cristales de hidroxiapatita que forman parte del componente mineral del hueso. La hidroxiapatita del hueso se solubiliza en partículas de fosfato de calcio amorfos, que son eliminados por los macrófagos, o en iones de Ca 2+ y PO4 3' que se acumulan en el líquido extracelular. Estos iones difunden hacia los capilares sanguíneos entrando en Ia circulación sistémica para ser eliminados por Ia orina a través del riñon. Estos iones liberados también pueden ser reutilizados por los osteoblastos para formar hueso nuevo. Los osteoclastos son los encargados también de Ia degradación de Ia fase orgánica del hueso mediante procesos enzimáticos.
La investigación en nuevos biomateriales para reparación ósea trata de reducir al máximo Ia necesidad del injerto óseo, buscando un sustituto artificial que con el tiempo se reabsorba y/o integre con el hueso adyacente y además sirva de fijación en fracturas osteoporóticas. Las propiedades mecánicas del sustituto óseo deben ser Io mas parecidas posibles a las del hueso esponjoso. El material debe además ayudar a Ia estabilidad de Ia fractura y ser suficientemente resistente para disminuir el tiempo necesario de inmovilización o soporte externo. Dicho material debe ser biodegradable, biocompatible y osteoinductivo, es decir debe atraer células mesenquinales y otros tipos celulares situados cerca del implante y favorecer su diferenciación en osteoblastos, y también osteoconductor, es decir debe actuar como molde para Ia formación de nuevo hueso. Buscando una similitud con Io que sucede en el organismo, se están sustituyendo los materiales no reabsorbibles utilizados hasta ahora en los implantes óseos por los reabsorbibles. Estos biomateriales no interfieren en el desarrollo y crecimiento del hueso nuevo formado, ya que son reemplazados de forma gradual por tejido del huésped. Además, presentan una mayor biocompatibilidad, participan de una manera natural en Ia reconstrucción ósea y no se necesita eliminarlos, mediante cirugía, tras Ia regeneración del hueso. Estos materiales tienen que mantenerse el tiempo suficiente para que se de Ia correcta regeneración del hueso y desintegrarse gradualmente sin producir daños al paciente y sin intervenir en el correcto desarrollo y crecimiento del hueso.
Los biomateriales que fraguan formando un fosfato calcico mineral tienen especial interés en regeneración ósea ya que se asemejan a Ia fase mineral del hueso natural y son susceptibles de remodelado óseo y de reabsorción debido a su estructura cristalina metaestable.
Entre los materiales reabsorbibles que se están empleando como sustitutos óseos destacan los fosfatos de calcio; hidroxiapatita (HAP), fosfato tricalcico (B-TCP) y el fosfato dicálcico dihidratado (DCPD) (Stubbs et al, 2004; Schnettler et al 2004). Estos materiales poseen una excelente biocompatibilidad por su parecido químico y cristalino al componente mineral del hueso, pero presentan diferencias en cuanto a Ia solubilidad y capacidad de reabsorción in vivo.
La hidroxiapatita (HAP) ha sido uno de los que más interés ha generado. Este material, es per se Ia fase inorgánica de Ia que están formados los huesos y es por ello por Io que ha sido ampliamente utilizado en regeneración ósea. Ejemplo de ello son algunos productos comerciales como Interpore 200® Interpore 500®, Cerasorb® y Collagraft®. Sin embargo, y debido a que presenta una de las estructuras cristalinas más estables, el material adolece de una lenta reabsorción.
La HAP es el material que presenta mayor biocompatibilidad, por ser el más parecido a los cristales formados por el hueso, pero no es reabsorbible in vivo. La degradación de este material se produce por contacto con soluciones con un pH bajo y por fagocitosis. Mediante Ia disolución se liberan partículas de fosfato calcico amorfo que pueden ser eliminados por los macrófagos por fagocitosis o quedar embebidos en el nuevo hueso formado. Los macrófagos pueden disolver estas partículas y restaurar el Ca y P al pool del organismo (Frayssinet et al 1999; Benahmed et al 1996). Sin embargo, no se ha observado que estas partículas den lugar a activación osteoclástica (Frayssinet et al 1999).
Todos los estudios realizados corroboran Ia resistencia de este material a Ia degradación una vez está implantado en el organismo, debido a su escasa solubilidad a pH fisiológicos. Implantes de este tipo en animales, se reabsorben un 5,4% en 6 meses frente a diferencia de los basados en B-TCP, que Io hacen en un 85%. (Eggli et al 1988).
En el hombre, los implantes realizados con Bio-Oss (HAP) se consideran como no reabsorbibles, ya que los estudios llevados a cabo demuestran que se necesita entre 3-6 años para que se reabsorban debido a Ia actividad osteoclástica (Taylor et al 2002). La presencia de este material en el organismo durante tanto tiempo puede interferir en el proceso de remodelado óseo, así como en Ia capacidad de osteointegración (Affe et al 2005; De Boever 2005).
A causa de esto, este material ha sido tradicionalmente empleado en mezclas con material orgánico como polímeros para aumentar su reabsorción. Ejemplos de estas aplicaciones están descritos en US5866155 dónde se describe Ia incorporación de hidroxiapatita en matrices de poliláctico ó en US-A5741329 que es una variación de US5866155 donde se pretende corregir algunos defectos derivados de Ia acidificación local del medio tras Ia incorporación de los cementos en el organismo.
Por ello, con el fin de mejorar Ia capacidad de reabsorción de los fosfatos calcicos e incrementar su capacidad osteconductora, en los últimos años se han utilizado fases cristalinas de fosfato calcico menos estables que Ia hidroxiapatita 6. como el B-TCP y DCPD (Brushita) que presentan mejor solubilidad y reabsorción in vivo.
El B-TCP presenta más osteoconductividad y una mejor reabsorción que Ia HAP (Franco et al 2006). Se considera como un material moderadamente reabsorbible, en estudios in vivo se ha observado que se necesita al menos un año para su reabsorción en animales y de 6 a 8 meses en humanos (Wiltfang et al 2003; Suba et al 2004). Su degradación aumenta los depósitos de calcio y esto está asociado a una mayor actividad fosfatasa alcalina, enzima que interviene en Ia formación de hueso (Trisi et al 2003; Sugawara et al 2004).
EI DCPD es también biocompatible, osteoconductivo y el más reabsorbible por ser el más soluble a pH fisiológicos. Esto permite que se forme hueso nuevo de forma más rápida. Se biodegrada en ambientes fisiológicos y es reabsorbido por las células adyacentes (Tris et al 2003). Esta comprobado que se reabsorbe in vivo, hasta tres veces más rápido que Ia HAP y el B-TCP (Herrón et al 2003; Chow et al 2003; Tas & Bhaduri 2004; Tamini et al 2006;).
Estudios sugieren que parte del material DPDC puede convertirse en HAP después de su implante, esto puede retrasar varias semanas Ia eliminación del implante por parte de los osteoclastos (Constanz et al 1998). Esta conversión puede hacer que las células acidifiquen el medio y disminuya Ia biocompatibilidad del material junto con una reducción en su reabsorción. La adición de sales de Mg y de Ca (carbonato calcico) o su combinación con B-TCP pueden evitar esta conversión.
Usando este material se observa que se da de manera equilibrada, generación de hueso y eliminación del material a partir de Ia 4a semana (Fallet et al 2006) y Ia 8a semana postintervención (Constanz et al 1998). Esto es importante ya que si Ia degradación fuera mayor que Ia síntesis se crearía inestabilidad y reacciones inflamatorias.
Así, entre estos fosfatos calcicos, Ia brushita (DPCD) es uno de los materiales de mayor interés en Ia regeneración ósea. Debido a sus interesantes propiedades existen en al actualidad cementos de brushita diseñados para el fraguado in situ. Así por ejemplo en las patentes US6733582 y US2006213398 son reivindicados cementos de brushita de fraguado in situ siendo Chronoss Inject® un producto de este tipo ya comercializado. Sin embargo este material tiene un gran problema a Ia hora de ser esterilizado ya que se descompone cuando se calienta Io que dificulta su apropiada esterilización.
El estado de Ia técnica contempla diferentes publicaciones relativas a Ia esterilización de cementos que pueden ser empleados como sucedáneos de material óseo, así como sobre los métodos empleados para realizar dichas matrices y su esterilización.
Sin embargo, tal y como refleja Ia solicitud de patente JP2004018459, cuando dichos cementos son esterilizados por autoclave, las características de dichos cementos se ven alteradas traduciéndose en Ia obtención de sucedáneos de mineral óseo que no reúnen las características necesarias para su empleo en regeneración ósea en cuanto a reabsorción, estabilidad y colonización y demás propiedades esenciales.
Como sucede con el DPCD, Ia Monetita se reabsorbe ¡n vivo en tiempo y modo similar. Se disuelve a pH fisiológicos, de manera gradual en los tejidos extracelulares que envuelven el implante y las propias células que Io colonizan, (células endoteliales, osteoclastos, osteoblastos, macrófagos...) serían los responsables de su eliminación o reutilización como sucede en el hueso.
Documentos como US20060263443 presentan Monetita, fosfato dicálcico anhidro (DCPA), obtenido por deshidratación de Brushita, en combinación con otros biomateriales de fosfato calcico. Debido a la combinación, los resultados de esterilización no han sido aceptables para Ia utilización de estos materiales en implantes y regeneración ósea. Adicionalmente, estos materiales constituyen intermediarios de reacción y no estructuras con capacidad propia para ser empleadas en el campo técnico de Ia regeneración ósea.
Adicionalmente, para una correcta regeneración ósea, es necesario que el biomaterial presente una porosidad adecuada que permita Ia colonización y proliferación celular, vascularización, aumento de Ia superficie de contacto y por tanto aumento de Ia superficie de interacción con el tejido huésped que permita Ia aceleración de Ia regeneración ósea. Estas características deben ir acompañadas de una correcta tasa de reabsorción que proporcione a las células el tiempo necesario para Ia regeneración
Así, Ia presente invención proporciona matrices compuestas de un material sustancialmente compuesto de monetita (fase metaestable de fosfato calcico de monetita), con una elevada estabilidad térmica que permite Ia esterilización del material mediante autoclavado, simplificando así los procesos de esterilización y que además, por su disposición específica estructural de poros, disposición que se obtienen gracias a un diseño específico del material, supone una mejora de Ia capacidad osteoinductiva de materiales propuestos por el estado de Ia técnica ya que es sintetizada en forma de bloque poroso con unas características de macro, meso y microporosidad definidas incrementando Ia superficie específica, así como Ia zona de contacto con los osteoblastos y facilitando los procesos de transporte de nutrientes para las células, factor crucial para Ia osteogeneración. Todo ello junto con su elevada capacidad de reabsorción en el periodo de tiempo adecuado para que las células adyacentes colonicen el material y puedan reemplazar el material reabsorbido por matriz ósea fisiológica.
La degradación in vitro del material de Ia invención no afecta a Ia proliferación celular y además es bioactivo, no citotóxico, no mutagénico y hemocompatible
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN.
Para que un biomaterial pueda dar lugar a una regeneración ósea estable, las células de Ia zona del implante, osteoblastos del hueso adyacente, células madre mesenquimales de Ia médula ósea y células endoteliales de Ia circulación sistémica, deben ser capaces de colonizar de forma simultánea y homogénea el biomaterial. Esto permitirá Ia formación de una nueva matriz ósea fisiológica a medida que se va resorbiendo el biomaterial y el desarrollo de un nuevo sistema vascular, que será el que suministre el aporte sanguíneo necesario para Ia supervivencia del nuevo tejido.
Una propiedad importante a tener en cuenta en relación a este aspecto es Ia estructura porosa, porque influye tanto en Ia biodegradabilidad, a mayor grado de porosidad mejor es Ia reabsorción, como en Ia colonización celular. Los materiales deben poseer tamaños de poros e interconexiones que permitan Ia colonización tanto de células endoteliales (para Ia formación de nuevos vasos sanguíneos) como de las células óseas. Además, el carácter microporoso e ¡nterconectado, que permite Ia difusión de nutrientes y gases y también de los metabolitos propios de Ia actividad celular. El hueso no es un material compacto sino que posee porosidades diferentes que se intercomunican. Sistemas de poros interconectados comunican el hueso macizo (cortical) con el esponjoso (trabecular) (Figura 12). Estas porosidades van desde los 100-150 μm en el cortical a 500-600 μm en el esponjoso.
La presente invención presenta un nuevo sistema de ingeniería tisular, destinado a regenerar Ia estructura ósea abordando una estrategia curativa en vez de meramente reparadora. Dicha regeneración tiene aplicación frente a Ia osteoporosis. La ingeniería tisular se plantea como una disciplina que mejora, mantiene y repara patologías en órganos y en tejidos. La creación de un sistema basado en Ia ingeniería tisular implica Ia integración de células viables, un material biocompatible diseñado especialmente para una aplicación biomédica y moléculas de señalización que regulan las actividades celulares que se requieren en cada momento del tratamiento.
Así, Ia presente invención proporciona matrices estructuradas compuestas de un material de monetita, en cuyo diseño se han tenido en cuenta las porosidades del hueso, para que se de Ia neovascularización y Ia colonización celular. Dicho material se presenta esterilizado, listo para su uso y gracias a su diseño específico, consigue una disposición específica estructural de poros, que supone una mejora de Ia capacidad osteoinductiva frente a otros fosfatos de calcio, incluidos otras combinaciones de fosfato de calcio que incluyan monetita.
Dichas matrices son obtenidas en forma de bloque poroso con unas características de macro, meso y microporosidad definidas que incrementan Ia superficie específica, así como Ia zona de contacto con los osteoblastos, facilitando los procesos de transporte de nutrientes para las células, factor crucial para Ia osteogeneración.
El diseño de estas matrices de monetita de Ia invención ha tenido en cuenta las porosidades características del hueso natural, porosidades que permiten Ia neovascularización y Ia colonización celular.
Las nuevas matrices de Ia invención están compuestas por el biomaterial Monetita, un DPCD deshidratado (DPC), ideal para Ia regeneración ósea. Dichas matrices están constituidas al menos por un 95% +-5% de monetita, preferiblemente por un 98% de monetita y más preferiblemente por un 100% de monetita. Las trazas de material corresponden a fosfato tetracálcico beta. La degradación ¡n vitro de este material no afecta a Ia proliferación celular y además es bioactivo, no citotóxico, no mutagénico y hemocompatible
Gracias a su diseño y composición, las matrices de Ia invención se reabsorben en el periodo de tiempo adecuado para que las células adyacentes colonicen el material y puedan reemplazar el material reabsorbido por matriz ósea fisiológica. Matriz se refiere a cualquier estructura tridimensional de utilidad en regeneración ósea que permita el crecimiento y proliferación celular de las células que Ia invadan.
Como células se entiende:
células madre mesequimales adultas obtenidas preferentemente del tejido adiposo, pero también pueden ser de médula ósea o cualquier otra localización que se haya demostrado que puede ser fuente de estas células. Estas células pueden utilizarse diferenciadas hacia Ia estirpe osteoblástica o endotelial.
- Osteoblastos obtenidos de fragmentos de hueso.
- Células endoteliales.
- Combinaciones de células madre mesenquimales adultas no diferenciadas o diferenciadas hacia Ia estirpe osteoblástica o endotelial, osteoblastos, osteoclastos, osteocitos de hueso y células endoteliales.
Macroporos: cuando los poros presentan diámetros mayores o iguales a 100 mieras.
Mesoporos: cuando los poros presentan diámetros menores de 100 mieras pero mayores o iguales a 10 mieras.
Microporos: Cuando los poros presentan un diámetro menor de 10 mieras.
Material amorfo: Aquel que no presenta una distribución homogénea de su porosidad
Material Estructurado: Aquel que presenta una porosidad uniforme a Io largo del material. El material de Ia presente invención es una material estructurado con una macroporosidad uniforme que se confiere una serie de propiedades ideales para su uso en regeneración ósea.
Osteoinducción: neoformación ósea por aposición hasta el material, formando un armazón para Ia proliferación celular con actividad osteoblástica, formando hueso nuevo. Es el acto o proceso de estimular Ia osteogénesis. Osteogénesis: generación o desarrollo de tejido óseo, a través de Ia diferenciación de las células mesenquimáticas hacia osteoblastos.
Regeneración ósea: formación de hueso nuevo que, tras un proceso de remodelado, sea idéntico al preexistente. En Ia regeneración ósea origina una respuesta en Ia que están involucrados los vasos sanguíneos, las células y Ia matriz extracelular. El biomaterial de Ia invención encuentra aplicación en Ia ingeniería tisular y regeneración ósea y, por tanto, puede emplearse en el tratamiento de las siguientes patologías óseas:
• Pseudoartrosis hipertrófica y no hipertrófica
• Osteonecrosis
• Osteoporosis
• Defectos óseos producidos tras Ia retirada de una prótesis, extirpación de un tumor, por desórdenes bioquímicos y metabólicos o enfermedades congénitas.
• Tratamiento de lesiones y traumatismos
• Tratamiento de fracturas óseas
• Cualquier patología en Ia que sea necesaria Ia reparación del tejido óseo.
• Tratamiento de defectos óseos maxilofaciales.
• Aumento óseo previa a Ia aplicación de implantes dentales
Colonización celular: capacidad de expansión de las células sobre el biomaterial, siendo capaces de proliferar y aumentar Ia población celular hasta invadir toda Ia matriz. Una medida de Ia capacidad de colonización de una matriz es el análisis del número de células sobre el biomaterial a Io largo del tiempo (datos de Ia gráfica de proliferación).
Adhesión celular: capacidad que presentan las células de unirse a otras células o a una matriz. La adhesión se puede producir por interacciones específicas como las fuerzas eletrostáticas y está regulada por proteínas específicas denominadas moléculas de adhesión. La capacidad de adhesión a un biomaterial puede analizarse mediante Ia visualización al microscopio de las células dispuesta sobre el biomaterial. La superficie de contacto entre las células y biomaterial, será una medida representativa de Ia afinidad que presenten las células por ese biomaterial.
En un primer aspecto Ia presente invención hace referencia a matrices tridimensionales estructuradas compuestas por un material biocompatible formado por monetita porosa, en adelante material y matrices de Ia invención, que comprende matrices tridimensionales de monetita porosa con una distribución de poros que comprende al menos un 35% en volumen de aire, preferentemente entre 43-53%, y más preferentemente 48% distribuidos en:
• De 0 a 60 % con diámetro medio menores de 10 μm (microporos)
• De 0 a 15 % en poros de tamaño medio entre 10 y 100 μm, (mesoporos)
• De 0 a 50 % en poros de tamaño superior a 100 μm(macroporos) de los cuales:
El 25-40% de esto macroporos se corresponde a macroporos cilindricos de entre 350-600μm de diámetro, separados uniformemente entre 0,4-0,5mm entre si; y el 25-10% restante se corresponde a Ia macroporosidad propia del material (superior a 100μm, pero inferior a 350-600μ)
Preferentemente,
• un 52% ±5 en poros con diámetro medio menores de 10 μm (microporos)
• un 13 % ±5 en poros de tamaño medio entre 10 y 100 μm, (mesoporos)
• un 35% ±5 en poros de tamaño superior a 100 μm(macroporos) de los cuales: El 31 ,25% de esto macroporos se corresponde a macroporos cilindricos de 500 μm de diámetro, separados uniformemente 0,5 mm entre si
Es decir, las matrices de Ia invención se caracterizan por presentar una distribución homogéneas de Ia porosidad que se traduce en una densidad de aproximadamente 0.8 macroporos /mm2, donde, del 100% de Ia porosidad total de las matrices,
• 75-60% corresponde a Ia porosidad intrínseca al material, mientras que
• el 25-40 % de Ia porosidad se debe a los macroporos uniformemente distribuidos a Io largo del material.
Preferentemente:
• 68,75 % corresponde a Ia porosidad intrínseca al material (distribuida en micro, meso y macroporos, (ver figura 3)), mientras que
• el 31 ,25 % de Ia porosidad se debe a los macroporos uniformemente distribuidos a Io largo del material.
Dicho material muestra dureza de al menos 8 ±2 MPa medida a partir de Ia fuerza de tensión diametral.
Así, los materiales que se emplean en osteogénesis deben imitar Ia morfología, estructura y función del hueso para conseguir una correcta integración en el tejido del huésped.
Está comprobado que Ia estructura determinada por Ia porosidad y el diámetro de poro de los materiales usados en regeneración ósea influye en Ia formación del hueso tanto in vitro como in vivo. Los poros son necesarios para que se dé Ia formación de tejido óseo, ya que permiten Ia migración y Ia proliferación de los osteoblastos y células mesenquimales y también Ia vascularización. Así, el material de Ia invención proporciona las condiciones necesarias para conseguir Ia correcta regeneración del hueso gracias a sus características de porosidad que permiten Ia colonización y proliferación de los tipos celulares necesarios para tal efecto. Resultados ¡n vitro llevados a cabo con matrices de otros materiales muestran que, una baja porosidad estimula Ia osteogénesis ya que se produce agregación celular Io que suprime Ia proliferación estimulando Ia osteogénesis. Estos mismos experimentos muestran que una elevada porosidad no afecta a Ia adhesión celular pero si aumenta Ia proliferación ya que hay un aumento de Ia superficie de contacto y también se facilita el transporte de oxígeno y nutrientes (Takahashi et al, 2004). Según estos resultados, Ia osteogénesis no se ve afectada por el tamaño de poro pero si aumenta con un número bajo de poros.
Por otro lado, in vivo, se requiere una integración y penetración de las células en el material así como Ia vascularización del mismo, para que se incorpore al tejido del individuo. Una elevada porosidad y tamaño de poro, como Ia proporcionada por las matrices de Ia invención facilita estos requerimientos.
Inicialmente, según primeros estudios el diámetro mínimo requerido para Ia formación de hueso se consideraba en torno a 100μm, para que pudieran llevarse a cabo los procesos de migración y transporte celular. Sin embargo, en la actualidad, se proponen diámetros superiores a 300 μm ya que Ia presencia de estos macroporos aumenta Ia formación de hueso debido a que permiten Ia formación de capilares en su interior. La vascularización afecta al desarrollo de Ia osteogénesis. Los poros con diámetros pequeños favorecen condiciones de hipoxia y no inducen osteogénesis sino condrogénesis.
Así, los poros largos y grandes en forma de túnel de Ia matriz de Ia invención permiten su vascularización y el desarrollo de Ia osteogénesis.
Además, los poros con diámetros elevados aumentan Ia superficie de contacto, Io que aumenta también Ia superficie de interacción con el tejido huésped, Io que va a acelerar Ia degradación que realizan los macrófagos.
En el caso de los materiales amorfos, Ia red vascular que se pueda llegar a formar es irregular en Ia estructura del biomaterial y no podrá conectar con Ia red vascular del hueso, de manera que el implante no podrá integrarse de forma eficaz con el tejido del receptor. Sin embargo, Ia estructura adoptada por las matrices de Ia presente invención tiene en cuenta Ia incorporación de poros con el tamaño adecuado para que convivan las especies celulares requeridas y se pueda formar un entramado óseo y vascular en todo el implante y además se permita Ia conexión con Ia zona receptora, para que se pueda dar lugar Ia integración tisular.
El nuevo diseño incorpora macroporos de 500μm ± 0.1 mm en forma cilindrica (en forma de túnel), que atraviesan totalmente Ia estructura del material, para una colonización celular adecuada (en cuanto a diferentes tipos celulares y a número suficiente de cada tipo) de las células de los tejidos adyacentes, así como una integración con el tejido receptor. Además, en toda Ia estructura contiene una red de microporos, para una suficiente difusión de nutrientes, gases y productos de desecho del metabolismo celular.
Tal y como se observa en las figura 10 Ia ventaja en cuanto a Ia colonización celular de las matrices de Ia invención puede verse reflejada en estudios directos de visualización celular al microscopio electrónico de barrido. Sin embargo, tal y como se muestra en Ia figura 9, los biomateriales amorfos, que muestran una distribución de macroporos irregular, producidos en ei proceso de obtención del cemento de Ia presente invención, presentan poros que no conectan Ia estructura interna. Es decir, el número de macroporos es insuficiente para que se pueda dar una colonización adecuada de las células, quedando estas relegadas en su mayoría a Ia superficie del material.
El éxito en el proceso de formación de un nuevo hueso está directamente relacionado con Ia cantidad de células formadoras de hueso que intervengan en el proceso, así como en Ia formación de una consistente red vascular por todo el biomaterial. Así, tal y como se muestra en Ia figura 9 las matrices de material estructurado de Ia invención, que presentan una distribución homogénea de macroporos permiten una amplia colonización celular por todo el biomaterial, una mayor difusión de nutrientes y de moléculas de señalización que van a determinar el comportamiento celular.
Por Io tanto el material de la invención, con un porcentaje elevado de porosidad, especialmente de macroporosidad, en el que hay poros con diámetros elevados
(>300μm, en concreto entre 350 y 650 μrn, y más preferentemente 500 μm) y en forma de túneles continuos, aumentará Ia osteointegración del implante después de Ia cirugía.
En un segundo aspecto, Ia presente invención hace referencia al método de síntesis del material de Ia invención, que comprende Ia formación de una matriz porosa de monetita que comprende:
- Formación de una fase sólida, correspondiente a una matriz porosa de brushita mediante Ia utilización combinada de porógenos, retardante y métodos mecánicos durante Ia reacción de fraguado entre un fosfato calcico ácido y un fosfato calcico básico.
- Mezcla de Ia fase sólida con agua destilada para dar lugar a Ia fase líquida
- Aplicación en el cemento obtenido en Ia etapa 2, de un molde con punzones cilindricos, que presentan un diámetro de 350 y 650 μm, y más preferentemente 500 μm, durante el fraguado para generar en las matrices poros cilindricos verticales de entre 350 y 650 μm, y más preferentemente 500 μm de diámetro, homogéneamente separados entre 04-0.6 mm y más preferentemente separados por 0.5mm de distancia.
- Transformación térmica y esterilización de Ia brushita porosa a monetita porosa.
En concreto, en el método de síntesis empleado, el producto obtenido en Ia etapa 1 , da lugar a una fase sólida que se mezcla con agua destilada para dar lugar a una fase líquida. Como realización preferente, Ia invención propone el uso de fosfato tricálcico - beta como fosfato calcico básico, y monofostato calcico como fosfato ácido.
Según Ia invención, para llevar a cabo Ia mezcla, Ia relación molar de fosfato básico/ fosfato ácido es de 1.6-1 ,8 durante un tiempo de aproximadamente 10 minutos, Ia concentración de porógeno 1-20% en peso y Ia de retardante entre 04-06% en peso; preferentemente relación molar de fosfato básico/ fosfato ácido de 1.785, concentración de porógenos 3-10% en peso y Ia de retardante es 0,54% en peso. La relación molar de fosfato básico/ fosfato ácido para llevar a cabo Ia mezcla es de 1.6-1,8, preferentemente 1.785, durante un tiempo de aproximadamente 10 minutos. El carbonato calcico se añade en concentraciones entre 1-20% en peso, preferiblemente entre 3-10%. Como retardante de Ia reacción de fraguado Ia invención propone el empleo de pirofosfatosódico en una proporción del 0,4 - 0,6 %en peso, siendo 0,54% Ia opción preferencial.
Esta fase sólida así obtenida es mezclada con Ia fase líquida (agua destilada), en una relación (P/L) de 3.
Con respecto a fosfatos calcicos ácidos y básicos, porógenos y retardantes a emplear en Ia invención, el experto en Ia materia conoce los distintos posibles compuestos y combinaciones a emplear.
Con Ia pasta obtenida se rellenan moldes que permiten obtener las matrices de Ia invención, que presentan Ia distribución de poros uniforme anteriormente indicada, es decir, una densidad de aproximadamente 0.8 macroporos /mm2, donde, del 100% de Ia porosidad total de las matrices, el 75-60%, y más preferentemente el 68,75 % corresponde a Ia porosidad intrínseca al material (distribuida en micro, meso y macroporos, (ver figura 3)), mientras que el 25-40% y más preferentemente el 31 ,25 % de Ia porosidad se debe a los macroporos de diámetro entre 350- y 650μm, más preferentemente 500μm uniformemente distribuidos a Io largo del material.
El molde de Ia invención, empleado para el desarrollo del biomaterial se refiere a cualquier molde que presente punzones cilindricos, cuya base presente un diámetro de entre 350- y 650μm, más preferentemente 500μm, y que estén separados entre si entre 0,4 y 0,6 mm, más preferiblemente por 0.5mm. Dicho molde puede estar construido en silicona, metal, material plástico resistente o cualquier tipo de material que Ie permita ser aplicado en su uso.
El molde puede presentar cualquier forma deseada, en función de Ia forma y tamaño de biomaterial que se requiera para reparar un defecto óseo particular para cada paciente, manteniendo siempre el biomaterial obtenido las características de porosidad características del biomaterial de Ia invención, es decir macroporos cilindricos de diámetro de entre 350- y 650μm, más preferentemente 500μm de diámetro, separados uniformemente entre si entre 0,4 y 0,6 mm, más preferiblemente 0.5mm, además de Ia porosidad intrínseca del biomaterial.
Así, el biomaterial de Ia invención puede presentarse en forma de pastillas, láminas, cilindros, etc., y cualquier otra forma que sea útil para reparar un defecto óseo particular de un paciente.
En un aspecto preferente de Ia invención, el molde presenta Ia forma de una pastilla o cilindro de diámetro 10mm y altura 5mm que presenta 64 punzones cilindricos de diámetro 500μm +_60μm, separados 500μm entre si.
El empleo de este molde preferente da lugar a pastillas de monetita de diámetro 10mm y altura 5mm que presentan una distribución uniforme de 64 macroporos de diámetro 500μm +_60μm, separados 500μm entre si.
Un minuto después de iniciar el fraguado del cemento, este se dispone durante aproximadamente 30 minutos en el molde, antes de que finalice su solidificación, y se retira, habiéndose formado los poros determinados por el molde. Una vez ha fraguado totalmente, Ia matriz de brushita formada se somete a autoclavado entre 120 y 13O0C durante 24-25 minutos, produciéndose su conversión a Monetita, completamente esterilizada y apta para su uso.
Los productos de Ia presente invención encuentran aplicación en el campo de Ia ingeniería tisular, y regeneración ósea. Así las matrices de monetita de Ia invención, obtenidas a través de los moldes definidos son de aplicación para el soporte y crecimiento de células y las aplicaciones anteriormente definidas
En un aspecto preferido Ia invención hace referencia al uso del material de Ia invención como soporte de crecimiento células mesenquimales de distintos orígenes, osteoblastos, células endoteliales y combinaciones de células madre mesenquimales adultas no diferenciadas o diferenciadas hacia Ia estirpe osteoblástica o endotelial, osteoblastos, osteoclastos, osteocitos de hueso y células endoteliales, para su empleo en regeneración ósea.
Las matrices de Monetita de Ia invención, se reabsorben in vivo en tiempo y modo similar que el DCPD, evitando el inconveniente de su transformación en HA. Así, dichas matrices se disolverán a pH fisiológicos, de manera gradual en los tejidos extracelulares que envuelven el implante y las propias células que Io colonizan, (células endoteliales, osteoclastos, osteoblastos, macrófagos...) serán los responsables de su eliminación o reutilización como sucede en el hueso. Además, su combinación con Carbonato Calcico, en el proceso de su obtención, evita su transformación a HAP.
Tal y como sucede con el DPCD su reabsorción comienza entre Ia 4a y 8a semana, periodo de tiempo que es adecuado para que las células adyacentes colonicen el material y puedan reemplazar el material reabsorbido por matriz ósea fisiológica. Esta biodegradabilidad está ajustada a Io que ocurre en el organismo, en donde el crecimiento óseo en los defectos puede tener lugar en un periodo de tiempo comprendido entre 2 y 6 meses, dependiendo del tipo de hueso y del tamaño del defecto (Francone V. 2004).
Además de Ia biodegradabilidad, otras propiedades como Ia rugosidad y textura del material de la invención se han tenido en cuenta en el estudio del material. Así, según las pruebas biológicas realizadas a las matrices de monetita porosa con macroporosidad homogénea de Ia invención, se demuestra una adhesión al material superior al 95%, donde las células no cambian su morfología en contacto con el material, y colonizan toda Ia superficie comunicándose entre ellas como en cualquier tejido funcional.
Hay que tener en cuenta que Ia monetita puede mostrar resistencia y elasticidad muy baja con respecto a Ia del hueso trabecular (elasticidad 50-100 MPa y compresión 5- 10 MPa). Sin embargo, sería casi imposible igualar las propiedades mecánicas del hueso. Y, se ha demostrado que es suficiente con que el material alcance propiedades mecánicas suficientes para soportar el crecimiento celular, ya que las células, al invadir el material formarán Ia fase orgánica del implante y mejorarán las propiedades mecánicas. Las matrices de material de monetita porosa definida de Ia invención, con dureza de al menos 8 +_2 MPa medida como tensión de rotura, cumplen con este requisito.
El material monetita es biodegradable, reabsorbible, bioactivo, presenta características similares al hueso. Este material permite el crecimiento celular tanto en su superficie como en su interior, una vez en el defecto óseo, permitirá que las células (endoteliales, osteoblastos, osteoclastos...) formen el andamio necesario que se conectará al hueso sano. Posteriormente Ia monetita se irá eliminando poco a poco, sin sufrir transformación a Hidroxi apatito, por acción de los osteoclastos, y los osteoblastos irán sintetizando Ia nueva fase mineral que irá sustituyendo Ia monetita, eliminando por completo el defecto inicial.
Así, un primer objeto de Ia presente invención se refiere a un material de monetita porosa que presenta una distribución de porosidad total que compréndela menos un 35% en volumen de aire, preferentemente del 43-53% y más preferentemente 48%.
Otro objeto de invención se refiere al material de monterita porosa que presenta una dureza de al menos 8 ±2 MPa.
Otro objeto de invención se refiere al material de monetita porosa cuyo contenido en monetita es al menos del 90%, preferentemente 95% y más preferentemente 100%.
Un siguiente objeto de invención Io constituye el material de monetita porosa que presenta una porosidad definida de 0 a 60 % de microporos, 0 a 15 % de mesoporos y 0 a 50 % de macroporos, más preferentemente 52 %, 13 % y 35 % respectivamente, donde el 25-40% de los poros, y más preferentemente el 31% de los poros presenta un diámetro de entre 350 y 650 μm, y más preferentemente de 500 μm
Otro objeto de invención Io constituyen las matrices de monetita porosa o estructuradas, constituidas por el material de Ia invención descrito. Dichas matrices estructuradas están caracterizadas por presentar una distribución de macroporos de
350-650μm de diámetro y más preferiblemente 500μm están uniformemente distribuidos a Io largo de Ia matriz, y separados entre si por 0,4-0.6 mm, más preferiblemente 0,5 mm. Dichos macroporos atraviesan transversalmente, en forma de túnel, Ia matriz y son obtenidos gracias a un molde.
Otro objeto de invención Io constituyen las matrices de monetita porosa estructurada que presentan forma cilindrica, de diámetro de 10mm, altura de 5mm, y 64 macroporos cilindricos con diámetro de 500 μm ±60 μm, uniformemente separados 0,5 mm entre si que atraviesan transversalmente el material. Un siguiente objeto de invención Io constituye el método de síntesis de material de monetita porosa que se caracteriza por presentar una etapa de mezcla de una fase sólida compuesta por fosfatos calcicos básicos, fosfatos calcicos ácidos, un porógeno y un retardante, y Ia mezcla de esta fase sólida con agua destilada para dar lugar a Ia fase líquida y una segunda etapa de transformación térmica por autoclavado. Este método se caracteriza porque preferentemente, el fosfato calcico básico es fosfato tricálcico beta, el fosfato calcico ácido es monofosfato calcico y su relación molar es 1.6-1,8, preferentemente 1.785; el agente porógeno es carbonato calcico en concentración de 1-20% en peso, preferentemente 3-10%, y el retardante es pirofosfato sódico en concentración de 04-06% en peso, preferentemente 0,54%. En cuanto al autoclavado, dicho procedimiento se lleva a cabo preferentemente a 120-130 0C y durante 24-25 minutos.
Otro objeto de Ia invención Io constituye el molde caracterizado por presentar una distribución homogénea de punzones de 350-650 μm de diámetro, preferiblemente 500 μm de diámetro separados uniformemente entre 0,4-0,6 mm entre si, preferiblemente 0.5mm. Dicho molde puede estar compuesto por silicona, metal, plástico resistente o cualquier otro material que permita su aplicación, pudiendo adoptar cualquier forma requerida para Ia reparación de un defecto óseo o tisular particular.
Otro objeto de invención se refiere al caso particular en que el molde consiste en un cilindro de diámetro de 10mm, altura de 5mm, y presentar 64 punzones cilindricos con diámetro de base de 500 μm ±60 μm, uniformemente separados 0,5 mm entre si.
Otro objeto de invención Io constituye el uso del molde para Ia obtención de fosfatos calcicos, preferentemente el material de monetita poroso estructurado de Ia invención, que adopten Ia forma del molde.
Un siguiente objeto de invención se refiere al método de síntesis de las matrices tridimensionales de monetita porosa estructurada caracterizado porque en adición a las dos etapas del método de síntesis de un material de monetita porosa, comprende entre las etapas 1 y 2 una tercera etapa que consiste en Ia aplicación de un molde en el cemento durante el fraguado para generar en él poros cilindricos verticales. Otro objeto de invención se refiere al uso del material de monetita porosa como soporte para cultivos celulares, así como al material que comprende las células. Otro objeto de invención se refiere al uso de las matrices tridimensionales de monetita porosa así como a las matrices que comprenden las células. En ambos casos, dichas células son células mesenquimales, osteoblastos, osteoclastos, osteocitos, células endoteliales o combinaciones de ellas.
Otro objeto de invención se refiere al uso del material de monetita porosa en regeneración tisular, regeneración de estructura ósea y osteoporosis. Un siguiente objeto de invención Io constituye el uso de las matrices de monetita porosa estructuradas en los mismos usos.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.
Figura 1: Diseño de un ejemplo de molde utilizado para Ia obtención de Ia matriz de monetita, con una distribución homogénea de poros verticales de 500 ± 60 mm, de diámetro, regularmente espaciados y de forma reproducible.
Figura 2: Fotografía de una de las formas de matriz de monetita porosa vista de alzado (a) y de perfil (b). En esta imagen se pueden apreciar los poros cilindricos de igual tamaño, distribuidos de forma regular por Ia estructura de Ia matriz y cómo estos poros atraviesan completamente Ia estructura.
Figura 3: Distribución de poros del biomaterial. En Ia tabla se observa el porcentaje de poros clasificados según su diámetro.
Figura 4: Difracción de rayos X de Ia brushita porosa precursora (antes del tratamiento térmico) y monetita porosa (después del tratamiento térmico) obtenida tras el proceso de transformación y esterilización del material. Los 3 picos más altos que aparecen en ei gráfico de difracción de rayos X, definen en el caso del gráfico superior (a) a Ia Brushita y en el gráfico inferior (b) son característicos de Ia monetita. El análisis estructural de las muestras (análisis de Rietvel) después de Ia esterilización con autoclave muestra que el material consta principalmente de monetita 95±5 % y el resto es fosfato tricálcico β (también denominado β-TCP). Para establecer Ia composición del material el diagrama de difracción del biomaterial se comparó con diagramas modelo de brushita (ICSD 016132) y de monetita (ICSD 38128).
Figura 5: Distribución del diámetro de poro para poros menores de 360 μm medida con porosímetro de mercurio en el biomaterial de monetita que contiene 5% de carbonato calcico en su composición. La imagen muestra un diagrama en el que se puede observar el volumen de poro en función del diámetro del poro, es decir Ia cantidad de poros (definida en el eje Y de Ia gráfica) que muestran un tamaño determinado (definido en el eje X de Ia gráfica). Los 64 poros cilindricos realizados con el molde mostrado en Ia figura 1 no están incluidos en esta distribución ya que son mayores de 360 μm que es el límite superior de medida del porosímetro de mercurio.
Figura 6: Imágenes frontal (a) y lateral (b) de Ia matriz de monetita amorfa, es decir, sin Ia porosidad estructurada. La porosidad que se aprecia es inherente al proceso de obtención, Ia mayoría de Ia porosidad del biomaterial Io componen microporos, en los que no puede llevarse a cabo Ia colonización celular, (c) Imagen del diseño de Ia matriz de monetita con los poros de tamaño definido en torno a los 500 Dm, distribuidos de forma homogénea en todo el volumen del biomaterial.
Figura 7: Imágenes de microscopía electrónica de barrido a diferentes aumentos, del biomaterial de monetita sin porosidad controlada. En estas imágenes se aprecia un biomaterial fundamentalmente microporoso (c) y con Ia presencia mínima de algunos macroporos (b) dispuestos de forma aleatoria, a modo de oquedades, que en ningún caso llegan a atravesar Ia matriz (a, b).
Figura 8: Imagen de microscopía electrónica de barrido en Ia que se observa el biomaterial de monetita con poros de 500 Dm distribuidos de forma homogénea por toda la matriz.
Figura 9: Imágenes de microscopía electrónica de barrido de las células madre mesenquimales dispuestas en el biomaterial de monetita de porosidad no controlada. Se puede apreciar que las células se disponen en Ia superficie de Ia matriz, sin posibilidad de colonizar su interior, puesto que tienen un tamaño significativamente mayor que Ia microporosidad que caracteriza al biomaterial. Figura 10: Imágenes de microscopía electrónica de barrido a distintos aumentos de una matriz de monetita macroporosa. Los macroporos permiten a las células madre mesenquimales colonizar Ia superficie del biomaterial (a) e introducirse por los poros (b, d). En (c) observamos el corte transversal de un macroporo. (c) Las células ¡nteraccionan entre ellas emitiendo prolongaciones citoplasmáticas, al igual que ocurre en un tejido a nivel fisiológico.
Figura 11: Proliferación de las células madre mesenquimales dispuestas sobre el material de monetita con porosidad no controlada (gris) frente a las dispuestas sobre el biomaterial de macroporosidad estructurada (negro).
Figura 12: Esquema morfológico del tejido óseo: 1. Hueso cortical. 2. Hueso trabecular. 3 Sistema de havers. 4 Vaso sanguíneo. 5 Canal de Havers. 6 Canal de Volkmann. 7 Periostio. 8 Revestimiento óseo. 9 Vasos del periostio. 10 Osteoclastos. 11 Osteoblasto. 12 Osteocitos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar pero no limitan Ia presente invención.
Ejemplo 1 : Método de síntesis del material de Ia invención.
Para llevar a cabo Ia síntesis del material de Ia invención se procedió a mezclar con agua bidestilada (fase líquida) una fase sólida.
La fase sólida comprende pero no se limita a un fosfato calcico ácido, un fosfato calcico básico, un agente porógeno como carbonato calcico y un retardante del fraguado como el pirofosfato sódico.
1.1 Preparación de Ia fase sólida
La fase sólida del cemento calcico consta de un fosfato calcico básico y fosfato calcico ácido. El fosfato calcico básico es fosfato tricálcico-beta (β-TCP) y el fosfato calcico ácido es monofosfato calcico. Se mezclan los dos componentes en una relación molar de 1.785 en mortero con mano durante 10 minutos. Se añade el carbonato calcico en concentraciones entre 1-20% (peso/peso) preferiblemente entre 3-10%. Se emplea el pirofosfato sódico 0.54% (peso/peso) como retardante de Ia reacción de fraguado.
En concreto, para Ia preparación de fosfato tricálcico-beta (β-TCP) se mezclan 34.42g de DCPD y 10.01 g CC (en relación molar 2:1) en un mortero de cristal y se homogeniza con mano durante 15 minutos. Se calienta Ia mezcla en horno (Veckstar) a 900 0C durante 14 horas. La síntesis del β-TCP ocurre según Ia reacción:
2CaHPO4 -2H2O + CaCO3 → Ca3 (PO4 )2 + 5H2O + CO2
A continuación, se tamiza el polvo y se utiliza el polvo que tiene tamaño de partícula menor de 322 μm.
1.2 Preparación de Ia fase líquida y Síntesis de esponjas de monetita
La fase líquida está constituida por agua destilada o bidestilada.
Se pesa Ia fase sólida formado por 0.8 g de monofosfato calcico anhidro, 1.4 g de fosfato tricálcico beta, 12 mg de pirofosfato sódico y 110 mg de carbonato y se mezcla 0,77 mi de Ia fase líquida en una relación polvo líquido (P/L) de 3 en una placa de vidrio durante 30 s.
1.3 Proceso de fraguado
Se fragua el cemento durante 30 minutos en baño de agua a 370C.
La reacción de fraguado ocurre según Ia reacción:
Ca3(PO4)Z + Ca(H2PO4)2 + 8H2O → 4CaHPO4.2H2O
Durante Ia reacción de fraguado el bicarbonato reacciona con los hidrogeniones del medio descomponiéndose en dióxido de carbono formando unos huecos y generando así una matriz esponjosa de brushita. 1.4 Proceso de lavado
A continuación el biomaterial se lava varias veces en agua destilada para eliminar restos de ácidos en el medio hasta llegar a un pH cercano a 7, Io cual resulta óptimo para el crecimiento celular que se llevara a cabo en etapas posteriores.
1.5 Proceso de transformación de Brushita a monetita
Una vez se obtiene el material fraguado mediante el proceso descrito en anteriormente, se procede a Ia esterilización del mismo. El proceso empleado para dicha esterilización comprende autoclavar el material fraguado en un rango de temperatura 120-1300C durante 24-25 minutos. Durante este proceso Ia brushita se transforma en monetita.
Proceso de transformación de brushita a monetita:
CaHPO4.2H2O → 12O0C → CaHPO4 + 2H2O (gas)
Ejemplo 2: Método de síntesis de Ia matriz de monetita porosa amorfa.
Una vez hecha Ia mezcla de los compuestos, tal y como se describe anteriormente (ejemplo 1.1 a 1.2), el cemento resultante, brushita, se dispone sobre una superficie con forma de interés para su fraguado y su posterior esterilización, obteniéndose así, una matriz amorfa, con escasa presencia de macroporos y distribución irregular de los mismos, tal y como se puede observar en las figuras 5 a y b,
Ejemplo 3: Matriz de monetita porosa estructurada
Tras Ia obtención del cemento mediante el proceso descrito en los ejemplo 1.1 a 1.2, un minuto después de iniciar el fraguado se aplicó al cemento durante 30 segundos el molde de silicona que se muestra en Ia figura 1. Una vez el material ha fraguado se procede a su esterilización tal y como se describe anteriormente (ejemplo 1.5).
El empleo del molde permitió obtener un material que presenta poros cilindricos con un tamaño medio de 500 ±60 μm y que permiten conectar los micro y macroporos generados por el porógeno. La figura 2 muestra una matriz porosa de monetita producida mediante el proceso descrito en Ia invención. Como resultado de Ia generación de dióxido de carbono durante Ia reacción de fraguado así como Ia aplicación del molde descrito anteriormente, el material resultante muestra un aspecto esponjoso con una distribución de poros dada. Obteniendo de esta forma un biomaterial estéril de monetita, con porosidad estructurada que puede ser utilizado sin más tratamientos como matriz para crecimiento celular.
La figura 4 muestra el diagrama de difracción de las muestras antes y después del tratamiento térmico en el autoclave. Se puede observar en Ia figura 4 que el tratamiento térmico además de esterilizar el material provoca Ia transformación cristalina de Ia estructura de brushita a monetita.
Ejemplo 4: Realización concreta de una pastilla de monetita con porosidad estructurada
A modo de ejemplo y con el fin de obtener cementos con características óptimas el componente en polvo formado por 0.8 g de monofosfato calcico anhidro, 1.4 g de fosfato tricálcico beta, 12 mg de pirofosfato sódico y 110 mg de carbonato calcico se mezcló durante 30 segundos con 0.77 mi de agua. Un minuto después de iniciar el fraguado se aplicó al cemento durante 30 segundos el molde que se describe a continuación.
El molde empleado, para Ia realización concreta de este ejemplo, consiste en molde de silicona circular con una superficie de 78,5mm2. El molde contiene distribuidos de forma homogénea 64 punzones cilindricos (como los que pueden observarse en Ia figura 1) de 0,6 cm de altura y de diámetro comprendido entre 500 ± 60μm. La distancia entre los cilindros es de 0,5mm. En Ia pastilla de monetita porosa resultante, el 15% del volumen total de Ia muestra corresponde a los 64 poros cilindricos obteniéndose así, un biomaterial con una densidad de 0,8 poros/mm2.
El empleo de este molde permitió obtener un material con poros cilindricos homogéneamente distribuidos, con un tamaño medio de poro de 500 ±60 μm que permiten conectar los micro y macroporos generados por el porógeno. Durante la reacción de fraguado, tal y como se describe en el ejemplo 1.3, el bicarbonato reacciona con los hidrogeniones del medio descomponiéndose en dióxido de carbono formando unos huecos y generando así una matriz esponjosa de brushita.
A continuación el biomaterial se lava varias veces en agua destilada para eliminar restos de ácidos en el medio hasta llegar a un pH cercano a 7, que es el óptimo para el crecimiento celular.
Posteriormente el material se esteriliza. En el proceso de esterilización en autoclave a 130 0C durante 24 minutos Ia brushita se transforma en monetita obteniéndose así un biomaterial estéril de monetita que puede ser utilizado sin más tratamientos como matriz para crecimiento celular
Así, el material resultante consiste en una pastilla cilindrica esponjosa constituida por Ia biomatriz estructurada porosa de Ia invención de 0,5 cm de altura y 1cm de diámetro de superficie con macroporos distribuidos en su superficie de forma homogénea, tal y como se muestran en Ia figura 6c. El porcentaje de los distintos tamaños de poro del biomaterial se muestran en Ia tabla de Ia figura 3.
Ejemplo 5: Estudio macroscópico comparativo de Ia matriz amorfa y Ia matriz porosa de Ia invención.
A continuación se llevo a cabo un ensayo comparativo de estructura microscópica de las matrices amorfas y las porosas. Para llevar a cabo dicho ensayo se emplearon técnicas de microscopía electrónica de barrido mediante procedimientos conocidos para un experto en la materia.
5.1 Estructura microscópica de Ia Matriz de monetita porosa amorfa
El biomaterial dispuesto en forma de matriz amorfa (figuras 6 a, b), obtiene una porosidad no controlada. Es decir, muestran una distribución de macroporos irregular, producida durante el proceso de obtención del cemento, descrito en los ejemplos 1 y 2. Los macroporos de Ia matriz amorfa son huecos en el biomaterial y no conectan Ia estructura interna. En cuanto al número y distribución de macroporos, se observa Ia escasez de los mismos. La presencia de macroporos es mínima y están dispuestos de forma aleatoria.
Así, estas estructuras no favorecerán una correcta regeneración ósea al no proporcionar las condiciones necesarias para Ia correcta colonización y proliferación celular.
5.2 Estructura microscópica de Ia Matriz de monetita porosa estructurada
La figura 7, por Io contrario, muestra una matriz de monetita con macroporos estructurados. En Ia imagen de microscopía de barrido se puede apreciar Ia distribución homogénea de los macroporos.
Al contrario que Ia estructura anterior, Ia matriz de monetita porosa estructurada favorecerá una correcta regeneración ósea al proporcionar las condiciones adecuadas para Ia correcta colonización y proliferación celular.
Ejemplo 6: Estudio comparativo de bioactividad entre Ia matriz de monetita porosa amorfa y Ia matriz de monetita porosa estructurada
La bioactividad de un material va a depender tanto de su composición químico-física como de su estructura.
Así en el presente ejemplo se lleva a un estudio para determinar el efecto que tiene el empleo de Ia matriz amorfa o de Ia matriz estructurada indicadas sobre Ia capacidad de proliferación de células madre mesenquimales, una de las estirpes celulares implicadas en el proceso de regeneración ósea junto con los osteoblastos del tejido receptor.
Una vez obtenida Ia biomatriz porosa, tal y como se ha descrito anteriormente, se procedió a su lavado con medio de cultivo de pH 7.4 durante una o dos horas para hidratar y neutralizar el pH (cambiando el medio de cultivo 2 o 3 veces). Posteriormente, células madre mesenquimales adultas de tejido adiposo fueron sembradas directamente sobre el material, a una concentración de 0,5.106-6.106 células por cm2. Trascurridas dos horas de Ia siembra, se adicionó medio de cultivo hasta cubrir todo el material, renovándolo cada dos o tres días. Las células se cultivaron en el biomaterial durante 7 días, tras Io cual, se procedió a analizar Ia biomatriz en cuya superficie se habían adherido las células por microscopía electrónica de barrido (SEM), para observar Ia capacidad de adhesión y colonización de dichas células sobre el biomaterial de monetita porosa.
Las imágenes obtenidas por SEM (ver figura 10 a y b), demuestran que las células madre mesenquimales son capaces de adherirse perfectamente al biomaterial, adoptando una morfología adecuada y que además establecen contactos intercelulares, como ocurre en un tejido a nivel fisiológico (fíg. 10 c y d). Como puede observarse en las figuras 10 c y d las células se expenden perfectamente con el biomaterial, interaccionando de forma máxima con el mismo y emitiendo prolongaciones citoplasmáticas (filipodios), que aumentan Ia superficie de contacto e incrementan el nivel de contacto intercelular.
El biomaterial estructurado proporciona una mayor superficie en Ia que las células se pueden adherir, proliferar e iniciar a realizar sus funciones en el proceso de regeneración ósea. Es decir, pueden iniciar Ia creación de nueva matriz ósea que va a sustituir al biomaterial y expresar moléculas de señalización que potenciarán y dirigirán el remodelado óseo y Ia neovascularización.
Por el contrario, el empleo de Ia matriz amorfa como soporte para el crecimiento celular, muestra que Ia distribución aleatoria de poros no es adecuada para que se pueda dar lugar una colonización eficiente de las células (figura 9 a y b), quedando estas relegadas en su mayoría a Ia superficie de Ia matriz puesto que tienen un tamaño significativamente mayor que Ia microporosidad que caracteriza al biomaterial.
Los resultados tal y como se muestran en Ia figura 11 demuestran que en Ia matriz de monetita de porosidad estructurada se cuantifican un mayor número de células. A las 24 de cultivo las células en Ia matriz de monetita de porosidad estructura proliferan 1.5 veces más con respecto a las que se encuentran en Ia matriz de monetita amorfa, llegando a ser Ia proliferación 1.8 veces superior a las 48 horas de cultivo.
En Ia matriz de Ia monetita amorfa, las células a Io largo del tiempo dan valores de proliferación inferiores al número de células dispuestas en el tiempo 0 horas. Estas células no tienen sitio para distribuirse y se compactan en los macroporos sin continuidad de Ia superficie, inhibiendo su proliferación y localizándose solamente en Ia superficie del material sin posibilidad de colonizar su interior, solamente podrían introducirse en los escasos macroporos dispuestos de forma aleatoria. Estos macroporos se encuentran a modo de oquedades que, en ningún caso penetran por toda Ia estructura, Io que dificultaría su interacción con el tejido circundante in vivo y Ia llegada de nutrientes y oxígeno a todas las células. Estas células solo pueden distribuirse por Ia superficie del biomaterial. Estas células se compactan por falta de espacio, inhibiendo su proliferación y localizándose Ia mayoría de ellas tan solo en Ia superficie del material.
Sin embargo las células dispuestas en Ia matriz de monetita con porosidad estructurada se distribuyen por todos los poros, en el interior de estos y por Ia superficie del material dando valores de crecimiento superiores al tiempo 0 horas. Estas células no se compactan al tener mayor superficie de contacto con el material y por tanto no inhiben su crecimiento.
Estudio de Ia inducción de las proteínas osteogénicas en el biomaterial de Monetita con los macroporos estructurados:
Ejemplo 7: Determinación del efecto osteoinductor del material de monetita porosa estructurada
El biomaterial de Monetita estructurado tiene una distribución macroporosa que favorece Ia distribución homogénea de las células por toda Ia matriz. Además esta disposición porosa permite mejor Ia llegada de nutrientes, gases y las moléculas de señalización producidas por las mismas células. Todo ello determina que las células se encuentren en mejores condiciones y que puedan intercomunicarse de forma más efectiva para expresar su fenotipo osteogénico. Por este motivo, es posible que Ia nueva estructura del biomaterial potencie el efecto osteoinductivo de Ia naturaleza de Ia matriz (derivado del fosfato calcico, al igual que el hueso), e induzca Ia expresión de genes relacionados con Ia diferenciación osteogénica.
Para determinar este efecto inductor de Ia osteogénesis debido a Ia nueva estructura macroporosa, se realizan análisis de Ia expresión de genes relacionados con Ia diferenciación ósea, mediante RT-PCR, comparando Ia estructura de Ia matriz de Monetita amorfa con respecto a Ia porosa estructurada. Para ello se va lleva a cabo el siguiente experimento:
1.- Disposición de células madre mesenquimales adultas obtenidas del tejido adiposo y osteoblastos de hueso humano, sobre las matrices porosas de Monetita amorfa y estructurada, a una concentración de 106 células/cm3.
2.- Mantenimiento en cultivo durante 7 días sobre los biomateriales, para permitir que Ia estructura del biomaterial actúe sobre el comportamiento celular.
3.- Extracción del RNA de las células que se encuentran sobre los biomateriales y análisis de Ia expresión de los siguientes genes mediante RT-PCR: fosfatasa alcalina, osteopontina, osteonectina y osteocalcina. Estos genes se encuentran directamente relacionados con el proceso de diferenciación ósea y se activan a medida que las células madre mesenquimales y los osteoblastos llevan a cabo su proceso diferenciación hacia hueso.
Los resultados indican una inducción de Ia expresión de genes osteoinductores en las células que se encuentran en el biomaterial de Monetita estructurada con respecto a Ia amorfa.
En las células madre mesenquimales se produce una inducción en los genes de diferenciación temprana osteopontina y osteonectina y en menor medida de los genes de diferenciación tardía fosfatasa alcalina y osteocalcina, con respecto a las células dispuestas en Ia Monetita amorfa.
Con respecto a los osteoblastos, se observa una inducción de Ia expresión de genes de diferenciación tardía como Ia fosfatasa alcalina y Ia osteoclacina.
Estos resultados demuestran que Ia estructura del biomaterial tiene una influencia directa en el comportamiento celular. La distribución macroporosa homogénea y con poros capaces de atravesar Ia estructura en su totalidad, dándose una mayor interconexión porosa, permite una mayor comunicación intercelular y un mejor estado celular por el acceso a los nutrientes y los gases. Esta situación permite expresar de forma más efectiva el fenotipo celular y potencia el efecto osteoinductor producido por Ia composición del biomaterial. Este efecto se verá multiplicado cuando el biomaterial sea incorporado al defecto óseo in vivo, en donde las señales osteogénicas se multiplicarán en el entorno del defecto óseo, para que pueda darse una reparación tisular. Estas señales reclutarán osteoblastos del hueso y células madre mesenquimales de Ia médula ósea, que podrán invadir el biomaterial de forma homogénea, y producir nueva matriz ósea que irá sustituyendo al biomaterial que se va resorbiendo, para producir una reparación estable.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Material de monetita porosa caracterizado por presentar una distribución de porosidad total que comprende al menos un 35% en volumen de aire.
2. Material de monetita porosa según reivindicación 1 que preferentemente presenta una distribución de porosidad total que comprendida en el rango de
43-53 % en volumen de aire.
3. Material de monetita porosa según reivindicaciones anteriores que más preferentemente presenta una distribución de porosidad total que comprende 48% en volumen de aire.
4. Material de monetita porosa estructurado, caracterizado porque al menos el 15% del volumen de aire de Ia porosidad total se debe a Ia presencia de macroporos que presentan un diámetro entre 350 y 650 μm.
5. Material de monetita porosa según reivindicación 4 caracterizado porque dichos macroporos presentan un diámetro de preferentemente 500 μm
6. Material de monetita porosa caracterizado por presentar una dureza de al menos 8 ±2 MPa
7. Material de monetita porosa según reivindicaciones anteriores caracterizado porque el contenido en monetita del material es al menos del 90%.
8. Material de monetita porosa según reivindicación 7 caracterizado porque el contenido en monetita del material es preferentemente del 95%.
9. Material de monetita porosa según reivindicaciones 7 y 8 caracterizado porque el contenido en monetita del material es más preferentemente del 100%.
10. Material de monetita porosa según reivindicaciones anteriores caracterizado porque en dicha distribución de porosidad:
- De 0 a 60 % de los poros consiste en microporos que presentan un diámetro medio menor de 10 μm - De 0 a 15 % de los poros consiste en mesoporos que presentan un diámetro medio entre 10 y 100 μm
De 0 a 50 % de los poros consiste en macroporos que presentan un diámetro medio superior a 100 μm
11. Material de monetita porosa según reivindicación 10 caracterizado porque en dicha distribución de porosidad, preferentemente:
- El 52 % de los poros consiste en microporos que presentan un diámetro medio menor de 10 μm
El 13 % de los poros consiste en mesoporos que presentan un diámetro medio entre 10 y 100 μm
El 35 % de los poros consiste en macroporos que presentan un diámetro medio superior a 100 μm
12. Material de monetita porosa según reivindicaciones anteriores caracterizado porque el 25-40% de los macroporos presentan un diámetro entre 350 y 650 μm.
13. Material de monetita porosa según reivindicación 12 caracterizado porque el 31% de los macroporos presenta un diámetro de 500 μm.
14. Matriz tridimensional de monetita porosa amorfa caracterizada por estar constituida por el material según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
15. Matriz tridimensional de monetita porosa estructurada caracterizada por estar constituida por el material según reivindicaciones 1 a 13.
16. Matriz tridimensional de monetita porosa según reivindicación 15 caracterizada porque los macroporos de 350-650μm de diámetro están uniformemente distribuidos a Io largo del material.
17. Matriz tridimensional de monetita porosa según reivindicación 16 caracterizada porque dicha distribución uniforme implica una separación de 0,4-0.6 mm entre cada macroporo de 350-650 μm de diámetro.
18. Matriz tridimensional de monetita porosa según reivindicación 17 caracterizada porque los macroporos presentan 500 μm de diámetro y están separados 0,5 mm entre si.
19. Matriz tridimensional según reivindicaciones 16 a 18 caracterizada porque dichos macroporos atraviesan transversalmente, en forma de túnel, Ia matriz.
20. Matriz tridimensional según reivindicaciones 15 a 19 caracterizada porque los macroporos uniformes son obtenidos gracias a un molde.
21. Matriz tridimensional según reivindicación 20 caracterizada porque el molde presenta punzones cilindricos con diámetro de base de entre 350 y 650 μm, separados entre 0.4 y 0.6 mm entre si.
22. Matriz tridimensional según reivindicación 21 caracterizada porque los punzones cilindricos presentan un diámetro de 500μm y están separados 0.5 mm entre si
23. Matriz tridimensional según reivindicación 20 a 22 caracterizada porque el molde presenta forma cilindrica, diámetro de 10mm, altura de 5mm, y 64 punzones cilindricos con diámetro de base de 500 μm ±60 μm, uniformemente separados 0,5 mm entre si.
24. Matriz tridimensional según reivindicación 23 caracterizada por presentar forma cilindrica diámetro de 10mm, altura de 5mm, y 64 macroporos cilindricos con diámetro de 500 μm ±60 μm, uniformemente separados 0,5 mm entre si que atraviesan transversalmente el material.
25. Matriz tridimensional según reivindicaciones 15 a 24 caracterizada por presentar una velocidad de reabsorción que se adapta a las condiciones necesarias para Ia regeneración tisular.
26. Método de síntesis de un material de monetita porosa caracterizado por comprender las etapas de
1) Mezcla de una fase sólida compuesta por fosfatos calcicos básicos, fosfatos calcicos ácidos, un porógeno y un retardante. Que es fraguado por adición de agua destilada, dando lugar a Ia fase líquida
2) 2) Transformación térmica y esterilización del material precursor formado.
27. Método de síntesis según reivindicación 26 caracterizado porque en Ia etapa 1 Ia relación molar de fosfato básico/ fosfato ácido es de 1.6-1 ,8, Ia concentración de porógenoes 1-20% en peso, Ia de retardante entre 04-06% en peso y Ia proporción (P/L) es de 3.
28. Método de síntesis según reivindicación 26 caracterizado porque en Ia etapa 1 Ia relación molar de fosfato básico/ fosfato ácido es de1.785, Ia concentración de porógenoes 3-10% en peso y Ia de retardante es 0,54% en peso
29. Método de síntesis según reivindicaciones 26-28 caracterizado porque en Ia etapa 1 el fosfato calcico ácido es monofosfato calcico, el fosfato calcico básico es fosfato tricálcico beta, el agente porógeno carbonato calcico y el retardante es pirofosfato sódico.
30. Método de síntesis según reivindicaciones 26 a 29 caracterizado porque el producto de Ia fase 1 es Brushita.
31. Método de síntesis según reivindicaciones 26 a 30 caracterizado porque en Ia etapa 2, Ia esterilización térmica se lleva a cabo por autoclavado.
32. Método de síntesis según reivindicación 31 caracterizado porque dicho autoclavado se lleva a cabo a 120-130 0C y durante 24-25 minutos.
33. Material de monetita porosa caracterizado por ser obtenido a través del método según reivindicaciones 26 a 32.
34. Molde caracterizado por presentar una distribución homogénea de punzones de 350-650 μm de diámetro separados uniformemente entre 0,4-0,6 mm entre si.
35. Molde según reivindicación 34 caracterizado por estar compuesto por silicona, metal, plástico resistente o cualquier otro material que permita su aplicación.
36. Molde según reivindicaciones 34 a 35 caracterizado porque puede adoptar cualquier tipo de forma requerida para Ia reparación de un defecto óseo o tisular particular.
37. Molde según reivindicaciones 34 a 36 caracterizado por consistir en un cilindro de diámetro de 10mm, altura de 5mm, y presentar 64 punzones cilindricos con diámetro de base de 500 μm ±60 μm, uniformemente separados 0,5 mm entre si.
38. Uso del molde según reivindicaciones 34 a 37 para Ia obtención de fosfatos calcicos que adopten su forma.
39. Uso del molde según reivindicación 38 caracterizado porque el fosfato de calcio consiste en el material de monetita poroso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
40. Método de síntesis de matrices tridimensionales de monetita porosa estructurada caracterizado porque en adición a las dos etapas del método de síntesis de un material de monetita porosa según reivindicaciones 26 a 32, comprende entre las etapas 1 y 2 del método según reivindicaciones 26 a 32 una tercera etapa que consiste en Ia aplicación de un molde en el cemento durante el fraguado para generar en poros cilindricos verticales.
41. Método según reivindicación 40 caracterizado porque el molde empleado consiste en el molde según las reivindicaciones 34 a 37.
42. Método según reivindicación 38 caracterizado porque el molde consiste en el molde según Ia reivindicación 37.
43. Matriz tridimensional de monetita porosa estructurada caracterizada por ser obtenida a través del método según cualquiera de las reivindicaciones 40 a 41.
44. Matriz tridimensional de monetita porosa caracterizada por ser obtenida a través del método según reivindicación 42.
45. Uso del material de monetita porosa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 33 como soporte para cultivos celulares.
46. Uso de las matrices tridimensionales de monetita porosa según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, 43 y 44 como soporte para cultivos celulares.
47. Material de monetita porosa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 y 33 caracterizado porque adicionalmente comprende células.
48. Material de monetita porosa según reivindicación 47 caracterizado porque dichas células son células mesenquimales, osteoblastos, osteoclastos, osteocitos, células endoteliales o combinaciones de ellas.
49. Matrices tridimensionales de monetita porosa según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, 43 y 44 caracterizadas porque adicionalmente comprenden células.
50. Matrices tridimensionales de monetita porosa según reivindicación 49, caracterizadas porque dichas células son células mesenquimales, osteoblastos, osteoclastos, osteocitos, células endoteliales o combinaciones de ellas.
51. Uso del material de monetita porosa según cualquiera de las reivindicaciones
1-13, 33, 47 y 48 para regeneración tisular.
52. Uso del material de monetita según reivindicación 51 para regeneración de estructura ósea.
53. Uso del material de monetita según reivindicación 52, caracterizada porque dicha regeneración ósea se lleva a cabo para combatir Ia osteoporosis.
54. Uso de las matrices tridimensionales de monetita porosa según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 25, 43, 44, 49 y 50 para regeneración tisular.
55. Uso de las matrices tridimensionales según reivindicación 54 para regeneración de estructura ósea.
56. Uso de las matrices tridimensionales según reivindicación 55 caracterizado porque dicha regeneración ósea se lleva a cabo para combatir Ia osteoporosis.
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