WO2010001439A1 - 質量分析装置 - Google Patents

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梶原茂樹
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株式会社島津製作所
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    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0004—Imaging particle spectrometry
    • H—ELECTRICITY
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    • H01J49/0027—Methods for using particle spectrometers
    • H01J49/0031—Step by step routines describing the use of the apparatus
    • H—ELECTRICITY
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    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/004—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn

Definitions

  • the present invention relates to a mass spectrometer that performs mass analysis on each minute region included in a two-dimensional range on a sample and analyzes the obtained data. More specifically, the present invention cleaves specific ions, thereby The present invention relates to a mass spectrometer capable of performing MS / MS analysis for mass analysis of generated product ions.
  • the target protein is digested with an appropriate enzyme to form a mixture of peptide fragments, and then the peptide mixture is subjected to mass spectrometry.
  • a plurality of peaks having different m / z are generated due to the difference in the isotope composition.
  • the plurality of peaks are composed of peaks of ions (main ions) composed only of isotopes having the maximum natural abundance ratio, and peaks of ions (isotope ions) containing other isotopes.
  • a peak group composed of a plurality of peaks arranged at intervals of 1 Da to several Da, that is, an isotope peak group is formed.
  • a set of isotope peaks derived from a single peptide is selected as a precursor ion, and ions generated by cleaving this precursor ion Perform mass analysis of (product ion), that is, MS / MS analysis.
  • product ion mass analysis of
  • the above-described protein identification method basically assumes that a protein is extracted from a biological tissue such as a cell, and a sample is prepared through purification and separation.
  • a biological tissue such as a cell
  • a sample is prepared through purification and separation.
  • a microscopic mass spectrometer also referred to as an imaging mass spectrometer
  • a microscopic mass spectrometer it is possible to obtain distribution information (mapping image) of a substance in a two-dimensional range on a sample set on a preparation, for example.
  • distribution information mapping image
  • mass spectrum data for each micro area within a two-dimensional range on a sample in a micro mass spectrometer several configurations have been proposed.
  • Patent Document 2 For example, in the mass spectrometers described in Patent Document 2, Patent Document 3, Non-Patent Document 1, and the like, the irradiation position of laser light or particle beam for ionization is sequentially scanned on the sample, and the irradiation position moves. The ions generated from the irradiation position are separated and detected every m / z. Further, in the mass spectrometer described in Non-Patent Document 2, ions are generated almost simultaneously in two dimensions so as to reflect the two-dimensional distribution of the substance on the sample, and this is generated by a time-of-flight mass separator. Separate by z and detect with 2D detector.
  • the mass spectrum data obtained for each minute region in the two-dimensional range is analyzed and processed. It is necessary to identify substances (typically proteins) present in Moreover, in a mass spectrometer capable of MS / MS analysis, first, ions to be selected as a precursor are identified by analyzing mass spectrum data obtained as a result of mass analysis without cleaving the ions, An appropriate precursor is set for each minute region, and MS / MS spectrum data obtained by performing MS / MS analysis is analyzed to identify substances present in the minute region.
  • the technique (A) above it is possible to know m / z of a material that is spatially localized on the sample. Therefore, for example, it is possible to know m / z of a substance that does not exist in a part such as the nose or jaw and is localized in the brain or a specific part of the brain.
  • mass spectra of different spatial regions in a sample can be easily compared. Therefore, it is convenient to compare the mass spectra of each part such as the brain, nose, and jaw.
  • the distribution of the substance is clarified, but the substance that is recognized to be localized is not identified. Therefore, the operator can recognize that a certain substance is a substance to be noted (hereinafter referred to as “substance of interest”), but it is not clear what the substance of interest is.
  • substance of interest a substance to be noted
  • the average of the MS / MS spectrum of each measurement point obtained by the measurement is calculated, and an average MS / MS spectrum is obtained.
  • the information on the peak appearing in the MS / MS spectrum is subjected to, for example, a known database search to identify the target substance.
  • the above work is troublesome and cumbersome for the operator, is inefficient and takes time.
  • the MS / MS spectrum for calculating the average MS / MS spectrum is derived from an undesired substance other than the substance of interest.
  • it is difficult to increase the identification accuracy because a lot of peaks, that is, noises are included and the S / N is poor.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems, and the object of the present invention is to provide a mass capable of identifying a substance of interest localized on a sample with a simple operation and with high efficiency. It is to provide an analysis device. Another object of the present invention is to provide a mass spectrometer capable of improving the identification accuracy by improving the S / N of the MS / MS spectrum used for identification.
  • a first invention made to solve the above problems is a mass spectrometer capable of performing MS analysis and MS / MS analysis for each of a plurality of minute regions set within a two-dimensional range on a sample, a) MS analysis execution means for collecting MS spectrum data by performing MS analysis on each minute region within a predetermined two-dimensional range on the sample; b) a substance of interest specifying means for the operator to specify one or more substances of interest or their m / z with reference to the MS spectrum data; c) MS for collecting MS / MS spectrum data by executing MS / MS analysis using m / z of one or more designated substances of interest as a precursor for each minute region within the predetermined two-dimensional range.
  • / MS analysis execution means d) a region extracting means for extracting, for each substance of interest, a micro area in which the one or more substances of interest exist based on the MS spectrum data; e) An average spectrum for selecting the MS / MS spectrum data of the micro area extracted by the area extraction means from the MS / MS spectrum data and calculating an average MS / MS spectrum for each substance of interest using them.
  • a calculation means f) an identification means for identifying the substance of interest using an average MS / MS spectrum of the substance of interest; It is characterized by having.
  • a second invention made to solve the above problems is a mass spectrometer capable of performing MS analysis and MS / MS analysis for each of a plurality of minute regions set in a two-dimensional range on a sample.
  • MS analysis execution means for collecting MS spectrum data by performing MS analysis on each minute region within a predetermined two-dimensional range on the sample;
  • a substance-of-interest specifying means for an operator to specify one or more substances of interest or m / z thereof with reference to the MS spectrum data;
  • region extraction means for extracting, for each substance of interest, a minute region in which the one or more substances of interest exist based on the MS spectrum data;
  • MS / MS analysis for collecting MS / MS spectral data by executing MS / MS analysis using the m / z of the one or more substances of interest as a precursor for each of the microregions extracted by the region extraction means.
  • MS analysis execution means e) Average spectrum calculating means for calculating an average MS / MS spectrum for each substance of interest using the MS / MS spectrum data; f) an identification means for identifying the substance of interest using an average MS / MS spectrum of the substance of interest; It is characterized by having.
  • the mass spectrometer according to the first and second inventions is a type of mass spectrometer generally referred to as an imaging mass spectrometer, a microscopic mass spectrometer, or a mass spectrometer.
  • an ion source for ionizing a sample LDI typified by MALDI is often used, but is not limited thereto.
  • an ion trap that performs ion cleavage by CID is generally provided, but the ion cleavage method is not limited to this.
  • TOFMS is often used because the mass analyzer can achieve high mass resolution, but is not limited thereto.
  • the identifying means uses, for example, a known database search engine to collate peak information obtained from the average MS / MS spectrum with the database to identify hit substances. Can be cited as a candidate. Search engines and databases are appropriately selected according to the target substance.
  • a distribution image for rendering an m / z distribution image showing a spatial distribution in an arbitrary m / z or m / z range based on the MS spectrum data An imaging unit may be further provided, and an m / z distribution image may be used when an operator designates one or a plurality of substances of interest or m / z thereof by the substance of interest designation unit.
  • the operator designates the substance of interest having a specific spatial distribution on the sample or the m / z thereof by using the substance of interest designation means while confirming the m / z distribution image, for example.
  • the area extracting means extracts a micro area where the substance of interest exists based on the previously collected MS spectrum data.
  • the region extracting means determines that the substance of interest exists in the minute region when the m / z spectrum intensity of the substance of interest is equal to or higher than a predetermined threshold in the MS spectrum of the minute region. It is good to do. According to this configuration, it is possible to extract a minute region in which the substance of interest is estimated to exist in a certain amount or more.
  • the threshold value which is a criterion for determining the spectrum intensity, may be uniquely determined, but it is more preferable that the user can appropriately input and set it. This is because the number of micro-regions extracted by the region extraction means varies depending on the threshold level, thereby affecting the S / N of the calculated average MS / MS spectrum and changing the identification accuracy of the substance of interest. It is.
  • the average spectrum calculating means calculates the average MS / MS spectrum by using the MS / MS spectrum data already collected for the micro area extracted as described above.
  • the MS / MS analysis execution means executes MS / MS analysis on the microregion extracted as described above, and the average spectrum calculation means The average MS / MS spectrum is calculated using the MS / MS spectrum data. Therefore, in the mass spectrometer according to the first invention, an MS / MS analysis of a minute region that is not reflected in the average MS / MS spectrum is also executed, whereas in the mass spectrometer according to the second invention, the average MS / MS spectrum is performed. The MS / MS analysis is performed only on a minute region reflected in the above.
  • a plurality of minute regions for calculating an average MS / MS spectrum are set automatically or only by a simple operation.
  • the operation by the operator for identifying the substance of interest is very simple, the work efficiency is improved, and the time required for processing can be shortened.
  • the average MS / MS spectrum is calculated using only the MS / MS spectrum data of the minute region in which the substance of interest exists, the intensity of ions derived from the substance of interest in the average MS / MS spectrum increases, which is undesirable.
  • the noise intensity is low. That is, the S / N of the average MS / MS spectrum is improved. Thereby, the accuracy and reliability of the identification of the substance of interest can be improved.
  • the mass spectrometer of the second invention since the MS / MS analysis is not performed for a minute region that is not reflected in the average MS / MS spectrum of the substance of interest, the number of times of performing the MS / MS analysis itself can be reduced. This is advantageous for shortening the time required from the start of analysis to the end of identification.
  • movement shown in FIG. Schematic which shows a part of display image in the analysis operation
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a main part of an imaging mass spectrometer according to the present embodiment.
  • an ionization unit that ionizes a sample by an atmospheric pressure MALDI ionization method (AP-MALDI), and a microscopic observation unit that performs microscopic observation of the sample, in an airtight chamber 1 that is maintained in a substantially atmospheric pressure atmosphere, Is arranged. That is, the sample 3 is placed on the sample stage 2, and the sample stage 2 can be moved in at least two directions of the x axis and the y axis by the stage driving unit 24. When the sample stage 2 is at a position indicated by a solid line in FIG.
  • AP-MALDI atmospheric pressure MALDI ionization method
  • the laser beam 5 emitted from the laser irradiation unit 4 and converged by the lens 6 strikes the upper surface of the sample 3.
  • ions derived from the sample are generated on the sample 3 from the vicinity of the laser beam irradiation position 3a.
  • the ions generated from the sample 3 in the hermetic chamber 1 are transported into the vacuum chamber 10 through the ion transport tube 7.
  • the vacuum chamber 10 is evacuated by a vacuum pump (not shown).
  • the ions are converged by the ion lens 11 and sent to the ion trap 12 at the subsequent stage.
  • the ion trap 12 has a three-dimensional quadrupole configuration composed of a ring electrode and a pair of end cap electrodes.
  • a quadrupole electric field is formed inside the ion trap 12, which temporarily accumulates and holds ions, and discharges the ions almost simultaneously at a predetermined timing to the time-of-flight mass analyzer (TOFMS) 13. Send it in.
  • TOFMS time-of-flight mass analyzer
  • the TOFMS 13 includes a reflectron electrode 14, and ions are turned back by a DC electric field formed by the reflectron electrode 14.
  • Various ions introduced into the TOFMS 13 almost simultaneously are temporally separated according to m / z and reach the detector 15.
  • the detector 15 outputs a detection signal corresponding to the amount of ions that have reached.
  • the ion trap 12 can hold various ions once inside, select ions having a specific m / z as precursor ions, and cleave the precursor ions by CID (collision-induced dissociation).
  • CID collision-induced dissociation
  • the product ions generated by the cleavage are held inside the ion trap 12 and then emitted to the TOFMS 13 all at once, and the MS / MS analysis can be performed by performing mass analysis.
  • MS n analysis can also be performed by repeating ion selection and cleavage in the ion trap 12 a plurality of times.
  • the sample stage 2 can be moved to a position (observation position) 2B indicated by a dotted line in FIG. 1 along a guide 30 extending in the x-axis direction.
  • a CCD camera 31 is disposed above the observation position 2B and outside the hermetic chamber 1, and a transmission illumination unit 33 is disposed below the observation position 2B.
  • the light emitted from the transmission illumination unit 33 hits the lower surface of the sample 3 through the opening formed in the sample stage 2, and the sample image by the transmitted light is converted into a lens.
  • the image can be taken by the CCD camera 31 through 32.
  • a microscopic image taken by the CCD camera 31 can be displayed on the screen of the display unit 26 via the control unit 23 described later.
  • an illumination system for reflection observation and fluorescence observation may be provided separately.
  • an optical microscope may be provided so that the operator can directly observe the microscopic observation image.
  • the detection signal obtained by the detector 15 by MS analysis, MS / MS analysis or the like is converted into a digital value by the A / D converter 20 and input to the data processing unit 21.
  • the data processing unit 21 converts a time-of-flight spectrum indicating the relationship between the time of flight starting from the time when ions are emitted from the ion trap 12 and the signal intensity into an MS spectrum or an MS / MS spectrum, and converts this into a data storage unit. 22. Further, the data processing unit 21 executes data processing to be described later using the spectrum data stored in the data storage unit 22, finally identifies a substance present on the sample, and the identification result is used as the control unit 23. Is displayed on the screen of the display unit 26.
  • the control unit 23 controls each unit including the stage driving unit 24 in order to execute the mass analysis operation on the sample 3 (in FIG. 1, the description of such control signal lines is omitted for the sake of simplicity)
  • a microscopic observation image, an analysis result, and the like are displayed on the display unit 26.
  • the operation unit 25 is a keyboard, a pointing device, or the like, and is used for input setting of various parameters for analysis and various instructions.
  • the control unit 23 and the data processing unit 21 have, for example, a general-purpose personal computer as hardware and execute dedicated control / processing software installed in the computer, thereby achieving various control and data processing functions. It can be.
  • FIG. 2 is a flowchart showing the procedure of this analysis operation
  • FIGS. 3 to 5 are schematic views showing a part of an image displayed on the display unit 26 during the analysis operation.
  • the optical of the sample 3 by the CCD camera 31 is first controlled under the control of the control unit 23.
  • the target image is taken, and an optical image obtained by enlarging the surface of the sample 3 is displayed on the screen of the display unit 26 (step S10).
  • the operator views the optical image and operates the operation unit 25 to designate a region of interest as a mass analysis range (step S11).
  • a mass analysis range As shown in FIG. 3, it is assumed that an optical image 50 of the sample is displayed, and the operator designates a rectangular mass analysis range 51 on the optical image 50. Note that the mass spectrometric range that can be specified does not have to be rectangular, and can be any shape.
  • the control unit 23 performs MS analysis for each minute region in the designated mass analysis range 51 (step S12). That is, as shown in FIG. 4, the designated two-dimensional mass analysis range 51 is finely partitioned in a lattice shape in the x-axis and y-axis biaxial directions and has a small area 52 of ⁇ x ⁇ ⁇ y. Therefore, MS spectrum data representing the relationship between m / z and signal intensity is acquired for each micro area 52.
  • the laser beam 5 is irradiated toward the sample 3, and the laser on the sample 3 is accordingly accompanied. Ions generated from the irradiation position (actually a substantially circular range as shown in FIG. 4) are subjected to mass spectrometry.
  • the operator designates an arbitrary position within the previously designated mass analysis range 51 with the operation unit 25.
  • the data processing unit 21 reads out MS spectrum data corresponding to the designated position (small region) from the data storage unit 22 and displays the MS spectrum on the screen of the display unit 26.
  • the operator sees the MS spectrum and designates an appropriate m / z or m / z range (step S13).
  • the data processing unit 21 extracts the spectrum intensity corresponding to the designated m / z or m / z range from the MS spectrum data corresponding to each minute region, and displays the intensity by m / z.
  • a z distribution (mapping) image is created and displayed on the screen of the display unit 26 (step S14). For example, as shown in FIG.
  • the control unit 23 uses the designated m / z as a precursor ion for each minute region 52 in the mass spectrometry range 51 in which the MS analysis is performed in step S12. Each unit is operated so as to execute the MS / MS analysis set in (1). Accordingly, the data processing unit 21 collects MS / MS spectrum data for each minute region 52 and stores it in the data storage unit 22 (step S16).
  • m / z of a plurality of substances of interest it is necessary to perform MS / MS analysis with each m / z set as a precursor ion, and the time required for MS / MS analysis by that amount is become longer.
  • the data processing unit 21 extracts a minute region in which the spectrum intensity with respect to m / z of the substance of interest is greater than or equal to a threshold value from the MS spectrum data for each minute region collected in step S12 (step S17).
  • the threshold value that is the determination criterion may be input by the operator from the operation unit 25, or a predetermined default value may be used. Since the MS / MS spectrum data should be collected for all the extracted microregions, the data processing unit 21 reads out the extracted MS / MS spectrum data of the microregions from the data storage unit 22, An average MS / MS spectrum obtained by averaging the spectrum intensity values for each m / z is calculated (step S18). This is the average MS / MS spectrum for the substance of interest. If there are a plurality of substances of interest, the processes of steps S17 and S18 are executed for each substance of interest. Therefore, the same number of average MS / MS spectra as the number of substances of interest are created.
  • Step S19 information on peaks appearing in the average MS / MS spectrum (m / z, spectrum intensity, etc.) is collected, and the hit information is found by comparing the peak information with an existing database, and the substance of interest is identified.
  • the substance of interest is a protein
  • an amino acid sequence can be estimated and a protein identified by using a database search engine called MASCOT provided by Matrix Science.
  • MASCOT database search engine
  • the substance of interest is lipid
  • a search tool called “Lipid ⁇ Search” developed by the University of Tokyo can be used.
  • the hit protein / peptide is output from the amino acid sequence identification database together with a score indicating the reliability of the hit. Therefore, the proteins / peptides with scores greater than or equal to a predetermined value are arranged in descending order of the scores and are displayed on the display unit 26 as identification results (step S20).
  • the imaging mass spectrometer of the present embodiment As described above, according to the imaging mass spectrometer of the present embodiment, the distribution of the target substance of interest among various substances existing in an arbitrary two-dimensional range on the sample is confirmed, and the identification of the target substance is continuously performed. And automatically. Thereby, for example, identification of a substance localized at a specific site in a living tissue can be performed with high throughput.
  • FIG. 6 shows an MS / MS spectrum obtained by actual measurement performed to confirm the effect of the processing in steps S17 and S18.
  • FIG. 6 (a) shows an example of an MS / MS spectrum obtained by setting an ion having a high spectral intensity in the MS spectrum as a precursor and executing MS / MS analysis
  • FIG. 6 (b) shows the spectral intensity in the MS spectrum. It is an example of the MS / MS spectrum obtained by setting a small ion as a precursor and performing MS / MS analysis. In both cases, the product ion peak derived from the substance of interest is indicated by a bold line.
  • the product ion peak derived from the substance of interest is relatively high in (a), whereas the product ion peak derived from the substance of interest is relatively high in (a).
  • the intensity of is low, and peaks of intensity higher than this are scattered. If an average MS / MS spectrum is obtained by averaging a large number of MS / MS spectra having such a tendency, the intensity of the product ion peak derived from the substance of interest (for example, P1 in the figure) becomes low, resulting in an interest.
  • the intensity of the ion peak that is not related to the substance, that is, noise (for example, P2 in the figure) increases. Thereby, the S / N of the average MS / MS spectrum is deteriorated.
  • the MS / MS spectrum of the micro area where the substance of interest does not exist or is small in quantity is not used for calculating the average MS / MS spectrum. That is, the MS / MS spectrum as shown in FIG. 6A is used for calculating the average MS / MS spectrum, but the MS / MS spectrum as shown in FIG. 6B is not used for calculating the average MS / MS spectrum. . Therefore, the intensity of the ion peak derived from the substance of interest in the average MS / MS spectrum increases, and the intensity of the ion peak that is noise decreases. Thereby, the S / N of the average MS / MS spectrum is improved, and the identification accuracy of the substance of interest based on this is also increased.
  • step S17 only the MS / MS spectrum data of the minute region extracted in step S17 is used, and the average MS / MS spectrum is calculated in step S18.
  • MS spectral data There is a lot of MS spectral data. That is, in actuality, useless MS / MS analysis is being performed, and there is still room for shortening the processing time.
  • the flowchart shown in FIG. 7 improves this point. Except for steps S16 to S18 being replaced with S26 to S28 in the flowchart shown in FIG.
  • step S26 the processing of step S26 corresponding to step S17 is executed to narrow down a minute region where the substance of interest exists to some extent. Then, the MS / MS analysis using the m / z of the substance of interest as a precursor is performed only on the minute region selected as the substance of interest as described above, not the entire mass analysis range 51, and the MS / MS spectrum data is collected (step S27). Originally, since the MS / MS analysis is performed on a minute region where the substance of interest is present to some extent, as shown in FIG. 6 (a), MS / where the spectral intensity of the product ion peak derived from the substance of interest appears high. An MS spectrum is easily obtained. Then, the average spectrum is calculated by averaging all the obtained MS / MS spectra (step S28).
  • the number of times of execution of MS / MS analysis is generally significantly smaller than the processing of the above embodiment, which is effective in reducing the processing time.
  • the MS / MS spectrum having a relatively large noise component as shown in FIG. 6B is not reflected in the average MS / MS spectrum, the average MS / MS spectrum relates to product ions derived from the substance of interest in the average MS / MS spectrum. S / N is improved. As a result, the accuracy of identification of the substance of interest in step S19 is improved.
  • a distribution image in a specific m / z or m / z range is drawn one by one, and based on that, the operator can select the substance of interest.
  • the multivariate analysis method such as principal component analysis is applied to the MS spectrum data, and the analysis result is displayed, and using it, multiple substances of interest can be simultaneously displayed. It may be possible to specify.
  • a score indicating a relationship between a plurality of minute regions and a loading indicating a correlation between variables, that is, MS peaks can be obtained, and a loading plot in which a loading value is plotted on a graph with the principal component as an axis is used.
  • a mass peak that is specifically distributed in a minute region included in the mass analysis range can be extracted. Based on this, it becomes possible to specify a plurality of substances of interest at the same time, thereby shortening the analysis time and improving the reliability of the analysis.
  • a plurality of substances (peptides) localized only in cancer cells of a sample digested with an enzyme are identified, an average MS / MS spectrum of each peptide is calculated, and a common identification is made from the plurality of average MS / MS spectra.
  • the protein identification accuracy can be expected to be improved by finding the protein to be processed.

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Abstract

　試料上の指定された質量分析範囲内の各微小領域のＭＳ分析が実行され、それにより得られたデータに基づいて、指定されたm/z又はm/z範囲の分布画像が作成されて表示画面上に描出される（Ｓ１０～Ｓ１４）。オペレータがこれを見て関心物質を特定しそのm/zを指示すると（Ｓ１５）、ＭＳスペクトル上でそのm/zの強度が閾値以上である微小領域が抽出され、その微小領域に対して関心物質のm/zをプリカーサとしてＭＳ／ＭＳ分析が実行される（Ｓ２６、Ｓ２７）。得られた各微小領域のＭＳ／ＭＳスペクトルデータから平均ＭＳ／ＭＳスペクトルが算出され（Ｓ２８）、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルに出現するピーク情報を利用して関心物質の同定が実行される（Ｓ１９）。

Description

質量分析装置
　本発明は、試料上の二次元範囲に含まれる各微小領域についてそれぞれ質量分析を実行し、得られたデータを解析処理する質量分析装置に関し、さらに詳しくは、特定のイオンを開裂させ、それにより生成されたプロダクトイオンの質量分析を行うＭＳ／ＭＳ分析が可能な質量分析装置に関する。
　近年、ポストゲノム研究として生体組織中のタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法（プロテオーム解析）の一つとして、近年、質量分析装置を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきている。そうした手法の１つとして、特定のイオンの選別と開裂操作とを伴うＭＳｎ分析（ｎ≧２）が可能な質量分析装置を用い、次のような手順でタンパク質のアミノ酸配列を決定する手法が知られている。
　まず目的とするタンパク質を適当な酵素で消化しペプチド断片の混合物としてから、そのペプチド混合物を質量分析に供する。このとき、各ペプチドを構成する元素には質量の異なる安定同位体が存在するため、同一のアミノ酸配列から成るペプチドであっても、その同位体組成の相違によってm/zの異なる複数のピークを生じる。その複数のピークは、天然存在比が最大の同位体のみで構成されたイオン（主イオン）のピークと、それ以外の同位体を含むイオン（同位体イオン）のピークとから成り、これらは１価の場合には、１Ｄａから数Ｄａ間隔で並んだ複数本のピークから成るピーク群、つまり同位体ピーク群を形成する。
　続いて、上記のようなペプチド混合物のマススペクトルデータの中から、単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーク群をプリカーサイオンとして選択し、このプリカーサイオンを開裂させることで生成されたイオン（プロダクトイオン）の質量分析、つまりＭＳ／ＭＳ分析を行う。以上のようにして得られたプロダクトイオンのマススペクトルパターンや、プリカーサイオンのマススペクトルパターンをデータベース検索に供することにより、被検ペプチドのアミノ酸配列を決定しタンパク質を同定することができる（例えば特許文献１など参照）。
　上述のようなタンパク質同定手法では基本的に、細胞などの生体組織からタンパク質を抽出し、精製・分離を経て試料を調製することを前提としている。しかしながら、生化学分野や医療分野などにおいては、生体内細胞をできるだけ壊すことなくその細胞に含まれるタンパク質の二次元的な分布情報を得たいという要求が非常に強い。こうした要求に応えるものとして、顕微鏡と質量分析装置との機能を兼ね備えた顕微質量分析装置（イメージング質量分析装置とも呼ばれる）の開発が鋭意進められている。顕微質量分析装置では、例えばプレパラートなどにセットされた試料上の二次元範囲の物質の分布情報（マッピング画像）を得ることが可能である。顕微質量分析装置において試料上の二次元範囲内の各微小領域に対するマススペクトルデータを取得するために、いくつかの構成が提案されている。
　例えば、特許文献２、特許文献３、非特許文献１などに記載の質量分析装置では、イオン化のためのレーザ光や粒子線の照射位置を試料上で順次走査し、その照射位置が移動する毎に照射位置から発生したイオンをm/z毎に分離して検出する。また、非特許文献２に記載の質量分析装置では、試料上の物質の二次元分布を反映するようにイオンを二次元状にほぼ一斉に発生させ、これを飛行時間型質量分離器でm/z毎に分離して二次元検出器で検出する。
　上記いずれの構成でも、試料上の二次元範囲内に存在する物質のマッピング画像を得るには、その二次元範囲内の各微小領域毎に得られるマススペクトルデータを解析処理し、それぞれの微小領域に存在する物質（典型的にはタンパク質）を特定する必要がある。また、ＭＳ／ＭＳ分析が可能である質量分析装置では、まずイオンを開裂させずに質量分析した結果として得られるマススペクトルデータを解析処理することによりプリカーサとして選択すべきイオンを特定し、次に各微小領域毎に適当なプリカーサを設定した上でＭＳ／ＭＳ分析を行うことで取得したＭＳ／ＭＳスペクトルデータを解析処理することにより該微小領域に存在する物質を同定する。
　上述のように複数の微小領域毎に得られたマススペクトルデータ又はＭＳ／ＭＳスペクトルデータに基づく結果の表示形態として、次の２つの例が知られている（例えば非特許文献３参照）。
　（Ａ）試料上の或る測定点（厳密には点とみなせる程度に面積の小さな微小領域）のマススペクトル又は複数点のマススペクトルの平均をとった平均マススペクトルを表示画面上に表示させ、これをオペレータが確認して着目するm/z範囲を指定する。すると、試料上の二次元範囲内の各測定点において、指定されたm/z範囲のスペクトル強度値に対応する色付けがなされたマッピング画像が表示画面上に描出される。
　（Ｂ）試料表面の光学画像又は特定のm/z（又はm/z範囲）の二次元的分布を示すマッピング画像上で、オペレータは着目する部分を任意形状のＲＯＩ（Region of Interest：関心領域）設定枠により指定する。すると、そのＲＯＩ設定枠で囲まれる範囲に含まれる複数の測定点のマススペクトルの平均が計算され、それにより作成された平均マススペクトルが表示画面上に描出される。
　上記（Ａ）の技術によれば、試料上で空間的に局在する物質のm/zを知ることができる。そのため、例えば、鼻、顎などの部位には存在せず、脳に、或いは脳の特定部位に局在する物質のm/zを知ることができる。一方、（Ｂ）の技術によれば、試料の中で異なる空間的領域のマススペクトルを容易に比較することができる。したがって、例えば脳、鼻、顎などの各部位のマススペクトルを比較するのに便利である。
　しかしながら、上記（Ａ）、（Ｂ）の技術では、物質の分布は明らかになるが、局在が認められる物質の同定は行われない。そのため、或る物質が着目すべき物質（以下「関心物質」という）であるということはオペレータが認識できるが、その関心物質が具体的に何であるのかは分からない。関心物質を同定するためには、例えば、次のような手順で作業を進める必要がある。まず、（Ａ）の技術により明らかになった関心物質の存在する部位を、（Ｂ）の技術により、光学画像又はマッピング画像上でオペレータがＲＯＩ設定枠により指定し、関心物質のm/zをプリカーサとするＭＳ／ＭＳ分析を実行させる。そして、その測定により得られた各測定点のＭＳ／ＭＳスペクトルの平均を計算して平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを求める。このＭＳ／ＭＳスペクトルに現れるピークの情報を、例えば既知のデータベース検索に供することで目的物質を同定する。
　上記のような作業はオペレータにとって面倒で煩雑であり、作業効率が悪く時間も掛かる。また、光学画像やマッピング画像上でＲＯＩ設定枠により指定できる範囲をあまり絞ることはできないため、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを計算するためのＭＳ／ＭＳスペクトルには関心物質以外の不所望の物質由来のピーク、つまりノイズが多く含まれてしまい、Ｓ／Ｎが悪いために同定精度を高めることが難しいという問題もある。
特開２００６－２８４５０９号公報 米国特許第５８０８３００号明細書 特開２００７－６６５３３号公報 小河潔、ほか５名、「顕微質量分析装置の開発」、島津評論 、株式会社島津製作所、２００６年３月３１日発行、第６２巻、第３・４号、ｐ．１２５－１３５ 内藤康秀、「生体試料を対象にした質量顕微鏡」、日本質量分析学会誌、Ｖｏｌ．５３、Ｎｏ．３、２００５年 「エムエスイメージング　バイオマップ（msimaging BioMap）」、[online]、エムエス・イメージング（MS imaging）、[平成２０年７月３日検索]、インターネット＜URL :　http://www.maldi-msi.org/index.php?option=com_content&task=view&id=14&Itemid=32＞
　本発明は上記課題を解決するために成されたものであり、その目的とするところは、簡単な作業で且つ効率よく、試料上に局在している関心物質の同定を行うことができる質量分析装置を提供することである。また、本発明の他の目的は、同定のために使用するＭＳ／ＭＳスペクトルのＳ／Ｎを改善することで、同定精度を向上させることができる質量分析装置を提供することである。
　上記課題を解決するために成された第１発明は、試料上の二次元範囲内に設定された複数の微小領域についてそれぞれＭＳ分析及びＭＳ／ＭＳ分析を実行可能な質量分析装置であって、
　a)試料上の所定の二次元範囲内の各微小領域に対しＭＳ分析を実行してＭＳスペクトルデータを収集するＭＳ分析実行手段と、
　b)前記ＭＳスペクトルデータを参照してオペレータが１乃至複数の関心物質又はそのm/zを指定するための関心物質指定手段と、
　c)指定された１乃至複数の関心物質のm/zをプリカーサとしたＭＳ／ＭＳ分析を、前記所定の二次元範囲内の各微小領域に対して実行しＭＳ／ＭＳスペクトルデータを収集するＭＳ／ＭＳ分析実行手段と、
　d)前記ＭＳスペクトルデータに基づいて、前記１乃至複数の関心物質が存在する微小領域を関心物質毎に抽出する領域抽出手段と、
　e)前記ＭＳ／ＭＳスペクトルデータの中から前記領域抽出手段により抽出された微小領域のＭＳ／ＭＳスペクトルデータを選別し、それらを用いて前記関心物質毎に平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出する平均スペクトル算出手段と、
　f)前記関心物質の平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いて該関心物質を同定する同定手段と、
　を備えることを特徴としている。
　また上記課題を解決するために成された第２発明は、試料上の二次元範囲内に設定された複数の微小領域についてそれぞれＭＳ分析及びＭＳ／ＭＳ分析を実行可能な質量分析装置であって、
　a)試料上の所定の二次元範囲内の各微小領域に対しＭＳ分析を実行してＭＳスペクトルデータを収集するＭＳ分析実行手段と、
　b)前記ＭＳスペクトルデータを参照してオペレータが１乃至複数の関心物質又はそのm/zを指定するための関心物質指定手段と、
　c)前記ＭＳスペクトルデータに基づいて、前記１乃至複数の関心物質が存在する微小領域を関心物質毎に抽出する領域抽出手段と、
　d)前記１乃至複数の関心物質のm/zをプリカーサとしたＭＳ／ＭＳ分析を、前記領域抽出手段により抽出された微小領域に対してそれぞれ実行してＭＳ／ＭＳスペクトルデータを収集するＭＳ／ＭＳ分析実行手段と、
　e)前記ＭＳ／ＭＳスペクトルデータを用いて前記関心物質毎に平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出する平均スペクトル算出手段と、
　f)前記関心物質の平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いて該関心物質を同定する同定手段と、
　を備えることを特徴としている。
　第１発明及び第２発明に係る質量分析装置は、一般に、イメージング質量分析装置、顕微質量分析装置、或いは質量分析顕微装置などと呼称される種類の質量分析装置である。試料をイオン化するイオン源はＭＡＬＤＩを代表とするＬＤＩが利用されることが多いが、これに限るものではない。また、ＭＳ／ＭＳ分析を行うために、ＣＩＤによるイオンの開裂を行うイオントラップを備えるのが一般的であるが、イオンの開裂の手法はこれに限るものではない。また、質量分析部は高い質量分解能を達成できることからＴＯＦＭＳが利用されることが多いが、これに限定されるものでもない。
　第１発明及び第２発明に係る質量分析装置において、同定手段は、例えば既知のデータベース検索エンジンを利用して、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルから得られるピーク情報をデータベースと照合し、ヒットする物質を同定候補として挙げるものとすることができる。検索エンジンやデータベースは、対象とする物質に応じて適宜選択される。
　第１発明及び第２発明に係る質量分析装置の一態様として、前記ＭＳスペクトルデータに基づいて任意のm/z又はm/z範囲の空間的分布を示すm/z分布画像を描出する分布画像描出手段をさらに備え、オペレータが前記関心物質指定手段により１乃至複数の関心物質又はそのm/zを指定する際にm/z分布画像を利用できるようにすることができる。オペレータ（ユーザ）は、例えば上記m/z分布画像を確認しながら、試料上で特異な空間分布を有する関心物質又はそのm/zを関心物質指定手段により指定する。すると、領域抽出手段は先に収集されたＭＳスペクトルデータに基づいて、その関心物質が存在する微小領域を抽出する。
　好ましくは、上記領域抽出手段は、或る微小領域のＭＳスペクトルにおいて前記関心物質のm/zのスペクトル強度が所定の閾値以上であるときに、その微小領域にその関心物質が存在すると判断する構成とするとよい。この構成によれば、関心物質が或る程度以上の量存在すると推定される微小領域を抽出することができる。スペクトル強度の判定基準である上記閾値は一義的に定めておいてもよいが、ユーザが適宜入力設定できるようにするとさらに好ましい。何故なら、領域抽出手段により抽出される微小領域の数は閾値のレベルによって異なり、それによって、算出される平均ＭＳ／ＭＳスペクトルのＳ／Ｎが影響を受け、関心物質の同定精度も変化するからである。
　第１発明に係る質量分析装置では、平均スペクトル算出手段は、上述のように抽出された微小領域に対し既に収集されているＭＳ／ＭＳスペクトルデータを用いて平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出する。一方、第２発明に係る質量分析装置では、ＭＳ／ＭＳ分析実行手段が上述のように抽出された微小領域に対しＭＳ／ＭＳ分析を実行し、平均スペクトル算出手段は、それによって収集された全てのＭＳ／ＭＳスペクトルデータを用いて平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出する。したがって、第１発明に係る質量分析装置では、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルに反映されない微小領域のＭＳ／ＭＳ分析も実行されるのに対し、第２発明に係る質量分析装置では、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルに反映される微小領域しかＭＳ／ＭＳ分析は実行されない。
　いずれにしても、第１発明及び第２発明に係る質量分析装置によれば、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出するための複数の微小領域が自動的に又は簡単な操作のみよって設定されるので、関心物質同定のためのオペレータによる作業は非常に簡単になり、作業効率も上がり、処理に要する時間を短縮することができる。また、関心物質が存在する微小領域のＭＳ／ＭＳスペクトルデータのみを利用して平均ＭＳ／ＭＳスペクトルが算出されるため、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて関心物質由来のイオンの強度が高くなり、不所望のノイズの強度は低くなる。つまり、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルのＳ／Ｎが向上する。それによって、関心物質の同定の精度と信頼性を向上させることができる。
　また第２発明に係る質量分析装置によれば、関心物質の平均ＭＳ／ＭＳスペクトルに反映されない微小領域についてはＭＳ／ＭＳ分析が実施されないので、ＭＳ／ＭＳ分析の実施回数自体を減らすことができ、分析開始から同定終了までの所要時間を短縮するのに有利である。
本発明の一実施例によるイメージング質量分析装置の要部の構成図。 本実施例のイメージング質量分析装置における分析動作の手順を示すフローチャート。 図２に示した分析動作における表示画像の一部を示す概略図。 図２に示した分析動作における表示画像の一部を示す概略図。 図２に示した分析動作における表示画像の一部を示す概略図。 実測により得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの一例であり、（ａ）はスペクトル強度が大きなイオンをプリカーサに設定したときのＭＳ／ＭＳスペクトル、（ｂ）はスペクトル強度が小さなイオンをプリカーサに設定したときのＭＳ／ＭＳスペクトル。 別の実施例のイメージング質量分析装置における分析動作の手順を示すフローチャート。
符号の説明
１…気密室
２…試料ステージ
３…試料
３ａ…レーザ光照射位置
４…レーザ照射部
５…レーザ光
６…レンズ
７…イオン輸送管
１０…真空チャンバ
１１…イオンレンズ
１２…イオントラップ
１３…ＴＯＦＭＳ
１４…リフレクトロン電極
１５…検出器
２０…Ａ／Ｄ変換器
２１…データ処理部
２２…データ記憶部
２３…制御部
２４…ステージ駆動部
２５…操作部
２６…表示部
３０…ガイド
３１…ＣＣＤカメラ
３２…レンズ
３３…透過照明部
５０…光学画像
５１…質量分析範囲
５２…微小領域
５３…ＭＳスペクトル
５４ａ、５４ｂ…m/z分布画像
　以下、本発明に係る質量分析装置の一実施例であるイメージング質量分析装置の構成と動作を、添付図面を参照しつつ説明する。
　図１は本実施例によるイメージング質量分析装置の要部の構成図である。このイメージング質量分析装置では、略大気圧雰囲気に維持される気密室１内に、試料を大気圧ＭＡＬＤＩイオン化法（ＡＰ－ＭＡＬＤＩ）によりイオン化するイオン化部、及び試料の顕微観察を行う顕微観察部、が配置されている。即ち、試料３は試料ステージ２上に載置され、試料ステージ２はステージ駆動部２４により少なくともｘ軸、ｙ軸の二軸方向に移動自在である。試料ステージ２が図１中に実線で示す位置にあるとき、レーザ照射部４から出射され、レンズ６により収束されたレーザ光５は試料３の上面に当たる。このレーザ光５の照射により、試料３上でレーザ光照射位置３ａ付近から試料由来のイオンが発生する。
　気密室１内で試料３から発生したイオンは、イオン輸送管７を通して真空チャンバ１０内に輸送される。真空チャンバ１０は図示しない真空ポンプにより真空排気された状態にある。真空チャンバ１０内において、イオンはイオンレンズ１１により収束されてその後段のイオントラップ１２に送り込まれる。イオントラップ１２はリング電極と一対のエンドキャップ電極とから成る３次元四重極型の構成である。イオントラップ１２の内部には四重極電場が形成され、これによってイオンを一時的に蓄積・保持し、所定のタイミングでほぼ一斉にそれらイオンを吐き出して飛行時間型質量分析器（ＴＯＦＭＳ）１３に送り込む。ＴＯＦＭＳ１３はリフレクトロン電極１４を備え、リフレクトロン電極１４により形成される直流電場によりイオンを折返し飛行させる。ほぼ一斉にＴＯＦＭＳ１３に導入された各種イオンはm/zに応じて時間的に分離されて検出器１５に到達する。検出器１５は到達したイオンの量に応じた検出信号を出力する。
　イオントラップ１２は、各種イオンを一旦内部に保持した後に、特定のm/zを有するイオンをプリカーサイオンとして選別し、そのプリカーサイオンをＣＩＤ（衝突誘起解離）により開裂させることができる。そして、開裂によって生成されたプロダクトイオンをイオントラップ１２の内部に保持した後にＴＯＦＭＳ１３に向けて一斉に出射させ、これを質量分析することによりＭＳ／ＭＳ分析を実施することができる。なお、イオントラップ１２内でイオンの選別と開裂とを複数回繰り返すことにより、ＭＳｎ分析を行うこともできる。
　気密室１内で試料ステージ２は、ｘ軸方向に延伸するガイド３０に沿って図１中に点線で示す位置（観察位置）２Ｂに移動可能である。観察位置２Ｂの上方で気密室１の外側にはＣＣＤカメラ３１が配置され、観察位置２Ｂの下方には透過照明部３３が設置されている。試料ステージ２が観察位置２Ｂに来るように移動された状態では、透過照明部３３から出射した光が試料ステージ２に形成されている開口を通して試料３の下面に当たり、その透過光による試料像をレンズ３２を通してＣＣＤカメラ３１で撮影可能である。ＣＣＤカメラ３１で撮影された顕微画像は後述する制御部２３を介して表示部２６の画面上に表示可能である。もちろん、このような透過観察のほかに反射観察や蛍光観察のための照明系を別途設けてもよい。また、ＣＣＤカメラ３１で撮像する代わりに、光学顕微鏡を設け、オペレータが直接的に顕微観察画像を観察できるようにしてもよい。
　ＭＳ分析、ＭＳ／ＭＳ分析等により検出器１５で得られた検出信号は、Ａ／Ｄ変換器２０によりデジタル値に変換されてデータ処理部２１に入力される。データ処理部２１は、イオンがイオントラップ１２から出射された時点を起点とした飛行時間と信号強度との関係を示す飛行時間スペクトルをＭＳスペクトルやＭＳ／ＭＳスペクトルに変換し、これをデータ記憶部２２に格納する。さらにデータ処理部２１は、データ記憶部２２に格納されたスペクトルデータを用いた後述するデータ処理を実行し、最終的には、試料上に存在する物質を同定し、その同定結果を制御部２３を通して表示部２６の画面上に表示する。
　制御部２３は試料３に対する質量分析動作を実行するためにステージ駆動部２４を始めとする各部を制御する（図１では煩雑になるためにそうした制御信号線の記載は省略している）とともに、顕微観察画像や分析結果などを表示部２６に表示する。また、操作部２５はキーボードやポインティングデバイスなどであり、分析のための各種のパラメータの入力設定や各種の指示に利用される。
　制御部２３やデータ処理部２１は例えば汎用のパーソナルコンピュータをハードウエアとして、該コンピュータにインストールされた専用の制御／処理ソフトウエアを実行することにより、各種の制御やデータ処理の機能を達成する構成とすることができる。
　次に、本実施例のイメージング質量分析装置における特徴的な分析動作を、図２～図５を参照しつつ説明する。図２はこの分析動作の手順を示すフローチャート、図３～図５は分析動作の中で表示部２６に表示される画像の一部を示す概略図である。
　分析対象である生体由来の試料３が試料ステージ２上に載置され、オペレータが操作部２５から分析の開始を指示すると、制御部２３による制御の下に、まずＣＣＤカメラ３１による試料３の光学的撮影が行われ、表示部２６の画面上には試料３の表面を拡大した光学画像が表示される（ステップＳ１０）。オペレータはこの光学画像を見て操作部２５を操作することにより、興味のある部位を質量分析範囲として指定する（ステップＳ１１）。ここでは、図３に示すように、試料の光学画像５０が表示され、その光学画像５０上でオペレータが矩形状の質量分析範囲５１を指定したものとする。なお、指定可能な質量分析範囲は矩形状である必要はなく、任意の形状とすることができる。
　上記のように質量分析範囲５１が指定されると、制御部２３は指定された質量分析範囲５１内の各微小領域毎にそれぞれＭＳ分析を実行する（ステップＳ１２）。即ち、図４に示したように、指定された二次元状の質量分析範囲５１内をｘ軸、ｙ軸の二軸方向に格子状に細かく区画した、Δｘ×Δｙの大きさの微小領域５２を考え、各微小領域５２毎にm/zと信号強度との関係を表すＭＳスペクトルデータを取得する。ステージ駆動部２４により試料ステージ２がｘ軸、ｙ軸方向に所定距離ステップ（Δｘ、Δｙ）移動される毎に、試料３に向けてレーザ光５が照射され、それに伴って試料３上のレーザ照射位置（実際には図４に示したように略円形の範囲）から発生したイオンが質量分析に供される。
　但し、１回のレーザ光照射だけで十分な量のイオン発生が期待できない場合には、同一の微小領域５２に対して短時間のレーザ光照射を複数回繰り返し、各レーザ光照射毎に発生したイオンを前述の如くイオントラップ１２に蓄積した上でＴＯＦＭＳ１３により質量分析するようにするとよい。このようにして、図４に示したような細かく区画した多数の微小領域５２のそれぞれについて、各微小領域５２に存在する物質を反映したＭＳスペクトルデータが得られ、これがデータ記憶部２２に格納される。
　次にオペレータは、先に指定した質量分析範囲５１内の任意の位置を操作部２５で指定する。すると、データ処理部２１はデータ記憶部２２から、指定された位置（微小領域）に対応するＭＳスペクトルデータを読み出し、表示部２６の画面上にＭＳスペクトルを表示する。そのＭＳスペクトルを見てオペレータは、適宜のm/z又はm/z範囲を指定する（ステップＳ１３）。この指定を受けたデータ処理部２１は、各微小領域に対応するＭＳスペクトルデータから、指定されたm/z又はm/z範囲に対応するスペクトル強度を抽出し、その強度を色分けで示すm/z分布（マッピング）画像を作成して表示部２６の画面上に表示する（ステップＳ１４）。例えば図５に示すように、表示されたＭＳスペクトル５３上でオペレータが特定のピークを指示すると、そのピークに対応したm/zのm/z分布画像５４ａ、５４ｂが描出される。このようにＭＳスペクトル上で異なるm/z又はm/z範囲をオペレータが指定することで、それぞれのm/z又はm/z範囲の分布画像を描出することができる。
　オペレータはこのm/z分布画像を目視で確認し、関心物質のm/zを特定して操作部２５により指示する（ステップＳ１５）。即ち、図５に示したようなm/z分布画像を確認し、オペレータが着目している試料上の部位に局所的に存在している物質を関心物質とし、そのm/zを指示する。例えば、m/z分布画像５４ｂで示される物質が関心物質であると判断すれば、m/z＝Ｍ２を指示する。このとき指示する関心物質は１つである必要はなく、複数であってもよい。
　オペレータにより関心物質のm/zが指定されると、制御部２３は、ステップＳ１２でＭＳ分析を実行した質量分析範囲５１内の各微小領域５２について、それぞれ、指定されたm/zをプリカーサイオンに設定したＭＳ／ＭＳ分析を実行するように各部を動作させる。これに伴い、データ処理部２１は各微小領域５２毎にＭＳ／ＭＳスペクトルデータを収集してデータ記憶部２２に保存する（ステップＳ１６）。複数の関心物質のm/zが指定されている場合には、各m/zをプリカーサイオンに設定したＭＳ／ＭＳ分析をそれぞれ実行する必要があり、その分だけＭＳ／ＭＳ分析に要する時間は長くなる。
　次にデータ処理部２１は、ステップＳ１２で収集した各微小領域毎のＭＳスペクトルデータから、関心物質のm/zに対するスペクトル強度が閾値以上であるような微小領域を抽出する（ステップＳ１７）。判断基準である閾値は、オペレータが操作部２５から入力設定できるようにしてもよいし、或いは予め決められたデフォルト値を用いるようにしてもよい。ここで抽出された微小領域については全てＭＳ／ＭＳスペクトルデータが収集されている筈であるから、データ処理部２１は抽出された微小領域のＭＳ／ＭＳスペクトルデータをデータ記憶部２２から読み出し、各m/z毎にスペクトル強度値を平均した平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出する（ステップＳ１８）。これが関心物質に対する平均ＭＳ／ＭＳスペクトルである。関心物質が複数ある場合には、各関心物質についてステップＳ１７、Ｓ１８の処理を実行する。したがって、関心物質の数と同数の平均ＭＳ／ＭＳスペクトルが作成される。
　その後、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルに現れているピークの情報（m/z、スペクトル強度など）を収集し、そのピーク情報を既存のデータベースと照合することによりヒットする物質を見つけ、関心物質を同定する（ステップＳ１９）。一例として、関心物質がタンパク質である場合には、マトリックスサイエンス社が提供するマスコット（ＭＡＳＣＯＴ）と呼ばれるデータベース検索エンジンを用いることでアミノ酸配列を推定し、タンパク質を同定することができる。また、関心物質が脂質である場合には、東京大学が開発したリピッドサーチ（Lipid Search）と呼ばれる検索ツールを利用することができる。例えば前者の場合、マスコットのＭＳ／ＭＳイオンサーチを利用すると、アミノ酸配列同定用データベースからヒットするタンパク質・ペプチドがそのヒットの信頼度を示すスコアとともに出力される。そこで、所定以上のスコアが得られたタンパク質・ペプチドをスコアの高い順に並べ、それを同定結果として表示部２６に表示する（ステップＳ２０）。
　以上のように本実施例のイメージング質量分析装置によれば、試料上の任意の二次元範囲に存在する各種物質の中で着目する関心物質の分布を確認し、その関心物質の同定まで連続的に且つ自動的に行うことができる。それによって、例えば生体組織の中の特定部位に局在する物質の同定などを高いスループットで実施することができる。
　上記ステップＳ１７、Ｓ１８の処理の効果を確認するために行った実測により得られたＭＳ／ＭＳスペクトルを図６に示す。図６（ａ）はＭＳスペクトルにおいてスペクトル強度が大きなイオンをプリカーサに設定してＭＳ／ＭＳ分析を実行して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの例、図６（ｂ）はＭＳスペクトルにおいてスペクトル強度が小さなイオンをプリカーサに設定してＭＳ／ＭＳ分析を実行して得られたＭＳ／ＭＳスペクトルの例である。いずれも、関心物質由来のプロダクトイオンピークを太線で示してある。（ａ）と（ｂ）とを比較すれば明らかなように、（ａ）では関心物質由来のプロダクトイオンピークの強度が相対的に高いのに対し、（ｂ）では関心物質由来のプロダクトイオンピークの強度が低く、これよりも高い強度のピークが散見される。このような傾向の多数のＭＳ／ＭＳスペクトルを平均化して平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを求めてしまうと、結果的に関心物質由来のプロダクトイオンピーク（例えば図中のＰ１）の強度は低くなり、関心物質とは関連がない、つまりノイズであるイオンピーク（例えば図中のＰ２）の強度が上がる。それにより、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルのＳ／Ｎは悪くなる。
　これに対し、上記ステップＳ１７、Ｓ１８の処理によれば、関心物質の存在しない又は存在量が少ない微小領域のＭＳ／ＭＳスペクトルは平均ＭＳ／ＭＳスペクトルの算出に利用されない。つまり図６（ａ）のようなＭＳ／ＭＳスペクトルは平均ＭＳ／ＭＳスペクトルの算出に利用されるが、図６（ｂ）のようなＭＳ／ＭＳスペクトルは平均ＭＳ／ＭＳスペクトルの算出に利用されない。そのため、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて関心物質由来のイオンピークの強度が高くなり、ノイズであるイオンピークの強度は低くなる。それにより、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルのＳ／Ｎは良好になり、これに基づく関心物質の同定精度も高まる。
　なお、上記実施例のデータ処理では、ステップＳ１７で抽出した微小領域のＭＳ／ＭＳスペクトルデータのみを用い、ステップＳ１８で平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出しているので、収集されたものの使用されないＭＳ／ＭＳスペクトルデータが少なからず存在する。つまり、実際には無駄なＭＳ／ＭＳ分析が実行されていることになり、まだ処理時間を短縮できる余地がある。この点を改良したのが、図７に示すフローチャートである。図２に示したフローチャートの中でステップＳ１６～Ｓ１８がＳ２６～Ｓ２８に入れ替えられている以外は、全く同じ処理動作である。
　具体的には、ＭＳ／ＭＳ分析を実行する前に、ステップＳ１７に相当するステップＳ２６の処理を実行することで、関心物質が或る程度以上存在している微小領域を絞る。そして、質量分析範囲５１内全体ではなく、上記のように関心物質が存在するとして選択した微小領域に対してのみ、その関心物質のm/zをプリカーサとしたＭＳ／ＭＳ分析を実行し、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータを収集する（ステップＳ２７）。もともと関心物質が或る程度以上存在している微小領域をＭＳ／ＭＳ分析しているから、図６（ａ）に示したように、関心物質由来のプロダクトイオンピークのスペクトル強度が高く現れるＭＳ／ＭＳスペクトルが得られ易い。そして、得られた全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを平均化処理して平均スペクトルを算出する（ステップＳ２８）。
　これにより、一般にＭＳ／ＭＳ分析の実行回数は上記実施例の処理に比べて大幅に少なくて済むので、処理時間を短縮するのに有効である。また、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルには、図６（ｂ）に示したようなノイズ成分が相対的に大きなＭＳ／ＭＳスペクトルは反映されなくなるので、平均ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて関心物質由来のプロダクトイオンに関するＳ／Ｎが良好になる。その結果、ステップＳ１９における関心物質の同定の精度が向上する。
　また、上記実施例では、ステップＳ１３～Ｓ１５の処理で関心物質を特定する際に、特定のm/z又はm/z範囲の分布画像を１つずつ描出し、それに基づいてオペレータが関心物質であるか否かを判断できるようにしていたが、ＭＳスペクトルデータに対し主成分分析などの多変量解析の手法を適用してその解析結果を表示し、それを利用して複数の関心物質を同時に特定できるようにしてもよい。
　具体例を簡単に説明する。例えば、各微小領域毎に得られたＭＳスペクトルデータを多変量の入力値として多変量解析の一手法である主成分分析（ＰＣＡ：Principal Component Analysis）により分析する。主成分分析は、多数の変数を少数の指標値でもって表わすようにするもので、詳しくは、例えば、宮下芳勝、佐々木慎一著「ケモメトリックス」、共立出版（１９９５年）などの文献にその方法が記載されている。また、主成分分析の演算処理をパーソナルコンピュータやワークステーション上で行うためのソフトウエアは種々のものが入手可能である。
　主成分分析では、複数の微小領域の関係を示すスコアと、変数つまりＭＳピークの相関関係を示すローディングとを求めることができ、主成分を軸とするグラフ上にローディング値をプロットしたローディングプロットにより、質量分析範囲に含まれる微小領域に特的に分布するマスピークを抽出することができる。それに基づき、複数の関心物質を同時に特定することが可能となり、解析時間の短縮、解析の信頼性の向上が図れる。例えば、酵素により消化した試料の癌細胞にのみ局在する複数個の物質（ペプチド）を特定し、各ペプチドの平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出し、それら複数の平均ＭＳ／ＭＳスペクトルから共通に同定されるタンパク質を見つけることで、タンパク質の同定精度の向上が期待できる。
　なお、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更、修正、追加を行っても本願請求の範囲に包含されることは明らかである。

Claims (4)

  1. 　試料上の二次元範囲内に設定された複数の微小領域についてそれぞれＭＳ分析及びＭＳ／ＭＳ分析を実行可能な質量分析装置であって、
    　a)試料上の所定の二次元範囲内の各微小領域に対しＭＳ分析を実行してＭＳスペクトルデータを収集するＭＳ分析実行手段と、
    　b)前記ＭＳスペクトルデータを参照してオペレータが１乃至複数の関心物質又はそのm/zを指定するための関心物質指定手段と、
    　c)指定された１乃至複数の関心物質のm/zをプリカーサとしたＭＳ／ＭＳ分析を、前記所定の二次元範囲内の各微小領域に対して実行しＭＳ／ＭＳスペクトルデータを収集するＭＳ／ＭＳ分析実行手段と、
    　d)前記ＭＳスペクトルデータに基づいて、前記１乃至複数の関心物質が存在する微小領域を関心物質毎に抽出する領域抽出手段と、
    　e)前記ＭＳ／ＭＳスペクトルデータの中から前記領域抽出手段により抽出された微小領域のＭＳ／ＭＳスペクトルデータを選別し、それらを用いて前記関心物質毎に平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出する平均スペクトル算出手段と、
    　f)前記関心物質の平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いて該関心物質を同定する同定手段と、
    　を備えることを特徴とする質量分析装置。
  2. 　試料上の二次元範囲内に設定された複数の微小領域についてそれぞれＭＳ分析及びＭＳ／ＭＳ分析を実行可能な質量分析装置であって、
    　a)試料上の所定の二次元範囲内の各微小領域に対しＭＳ分析を実行してＭＳスペクトルデータを収集するＭＳ分析実行手段と、
    　b)前記ＭＳスペクトルデータを参照してオペレータが１乃至複数の関心物質又はそのm/zを指定するための関心物質指定手段と、
    　c)前記ＭＳスペクトルデータに基づいて、前記１乃至複数の関心物質が存在する微小領域を関心物質毎に抽出する領域抽出手段と、
    　d)前記１乃至複数の関心物質のm/zをプリカーサとしたＭＳ／ＭＳ分析を、前記領域抽出手段により抽出された微小領域に対してそれぞれ実行しＭＳ／ＭＳスペクトルデータを収集するＭＳ／ＭＳ分析実行手段と、
    　e)前記ＭＳ／ＭＳスペクトルデータを用いて前記関心物質毎に平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを算出する平均スペクトル算出手段と、
    　f)前記関心物質の平均ＭＳ／ＭＳスペクトルを用いて該関心物質を同定する同定手段と、
    　を備えることを特徴とする質量分析装置。
  3. 　請求項１又は２に記載の質量分析装置であって、
    　前記領域抽出手段は、或る微小領域のＭＳスペクトルにおいて前記関心物質のm/zのスペクトル強度が所定の閾値以上であるときに、その微小領域にその関心物質が存在すると判断することを特徴とする質量分析装置。
  4. 　請求項１又は２に記載の質量分析装置であって、
    　前記ＭＳスペクトルデータに基づいて任意のm/z又はm/z範囲の空間的分布を示すm/z分布画像を描出する分布画像描出手段をさらに備え、オペレータが前記関心物質指定手段により１乃至複数の関心物質又はそのm/zを指定する際にm/z分布画像を利用できるようにしたことを特徴とする質量分析装置。
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