WO2009128395A1 - ２－アミノフェノール又はその誘導体を有効成分とする骨形成促進剤 - Google Patents

２－アミノフェノール又はその誘導体を有効成分とする骨形成促進剤 Download PDF

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WO2009128395A1
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aminophenoxazin
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aminophenol
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正樹 三宅
恵三 河野
千加子 新井
慎平 牛尾
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株式会社林原生物化学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to an osteogenesis promoter, and more particularly to an osteogenesis promoter containing 2-aminophenol or a derivative thereof as an active ingredient.
  • the bone tissue in the body is constantly renewed by bone destruction (bone resorption) by osteoclasts and bone formation by osteoblasts. Maintained.
  • bone destruction bone resorption
  • osteoclasts are differentiated monocyte / macrophage progenitor cells, but differentiation into mature osteoclasts is physiologically abbreviated as macrophage-colony stimulating factor (hereinafter “M-CSF”).
  • M-CSF macrophage-colony stimulating factor
  • RNKL Ligand of Receptor Activator of NF- ⁇ B
  • interleukin-1 (hereinafter abbreviated as “IL-1”) produced from synovial cells and T cells activated by inflammation and tumor necrosis factor (hereinafter referred to as “TNF- ⁇ ”). ) Is activated by inflammatory cytokines, and the expression of RANKL, which is a physiological factor essential for differentiation into osteoclasts, is increased, and interleukin-6 (hereinafter, “ Abbreviated as “IL-6”) and nitric oxide (hereinafter abbreviated as “NO”). This production-induced NO promotes cartilage destruction by enhancing apoptosis of chondrocytes or decreasing cartilage matrix synthesis.
  • IL-1 interleukin-1
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • monocytes / macrophages are activated by NO, differentiation into osteoclasts is induced, and bone destruction proceeds.
  • TNF- ⁇ and IL-6 itself induce differentiation of osteoclast precursor cells into osteoclasts, and prostaglandin E 2 (hereinafter referred to as “PGE 2 ”) from osteoblasts induced by these inflammatory cytokines.
  • PGE 2 prostaglandin E 2
  • bone metabolic disorders diseases caused by bone metabolism abnormalities such as osteoporosis and rheumatoid arthritis (hereinafter referred to as “bone metabolic disorders”), it is considered that several factors overlap to form a pathological condition called bone destruction. It has been.
  • estradiol-containing hormone preparations for the treatment of disorders of bone metabolism such as osteoporosis and rheumatoid arthritis, bisphosphonate compounds, calcitonin preparations, active vitamin D 3 preparations, calcium preparations, isoflavone preparations, selective estrogen receptor modulators (SERM preparations) ), Estradiol-containing hormone preparations, and pharmaceuticals such as vitamin K 2 are generally used.
  • active vitamin D 3 derivatives, estradiol derivatives, third-generation bisphosphonate compounds, and the like have been developed with the aim of excellent therapeutic agents with few side effects.
  • hormone preparations may cause side effects. In some cases, the target of use may be limited.
  • 2-aminophenol also known as questionomycin B
  • 2-aminophenol is a compound represented by the following chemical formula 1, and is oxidatively polymerized to give 2-aminophenoxazin-3-one represented by the following chemical formula 2 (also known as QUESTIOMYB). Converts to thiomycin A) relatively easily.
  • 2-Aminophenol or a derivative thereof has long been known as a substance having antibacterial activity, and in particular, 2-aminophenoxazin-3-one is also known as a basic skeleton of actinomycin D, which is a potent anticancer agent. ing. Also, in Motohashi et al., “Medical Research Review”, Vol. 11, pp.
  • 2-aminophenoxazin-3-one and its derivatives have antitumor activity.
  • Shimamoto et al. “Clinical Cancer Research”, Vol. 7, pp. 704 to 708, 2001, one of its derivatives, 2-amino-4,4 ⁇ -dihydro-4 ⁇ , 7-dimethyl-phenoxazin-3-one is disclosed to exhibit cytotoxic activity against various tumor cells.
  • 2-aminophenoxazin-3-one has been disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-143101 for the treatment of viral diseases, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-272334 for the treatment of chlamydiasis, and Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • An object of the present invention is to provide an osteogenesis promoter that has fewer side effects than conventional osteogenesis promoters and is highly effective in preventing or improving bone metabolic disorders.
  • 2-aminophenol or a derivative thereof has an action of inducing differentiation of pre-osteoblasts into osteoblasts and promoting calcification. Furthermore, it was discovered that these compounds also have the effect of inhibiting bone destruction by suppressing the induction of osteoclast differentiation from macrophages, and these compounds are effective in the prevention or treatment of diseases of abnormal bone metabolism.
  • the present invention has been completed by finding that it has both a bone formation promoting action and a bone resorption inhibiting action.
  • the present invention solves the above problems by providing an osteogenesis promoter containing 2-aminophenol or a derivative thereof as an active ingredient.
  • an osteogenesis promoter that has fewer side effects than conventional osteogenesis promoters and is excellent in the effect of promoting osteogenesis.
  • the 2-aminophenol referred to in the present invention is a compound represented by the following chemical formula 1, and a commercially available product can be used regardless of its origin and origin as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • the derivative of 2-aminophenol as used in the present invention means 2-aminophenoxazin-3-one represented by the following chemical formula 2, which is an oxidized polymer of 2-aminophenol, and a derivative having the basic skeleton as the following. It is as effective as 2-aminophenol.
  • 2-Aminophenoxazin-3-one regardless of its origin or origin, can be produced by appropriate extraction and purification methods from plants and bacteria containing abundant sources, and the precursor 2-aminophenol can be oxidatively polymerized. Can be synthesized.
  • a method of reacting 2-aminophenol with a trivalent iron ion such as potassium ferricyanide described in JP-A-2003-2878, or 2-aminophenol described in JP-A-2-193984 It can be synthesized by a method of reacting with human or bovine hemoglobin.
  • Examples of 2-aminophenoxazin-3-one derivatives used in the present invention include those represented by the following general formula 1 or general formula 2, and salts thereof may also be used. Moreover, as long as the effect of this invention is exhibited, a commercial item can also be used regardless of the origin or origin.
  • those represented by the following general formula 1 include 2-amino-7-hydroxy-phenoxazin-3-one (in the general formula 1, R 5 is a hydroxy group, and R 1 to R 4 are Hydrogen atom), 2-amino-7-methoxy-phenoxazin-3-one (in the following general formula 1, R 5 is a methoxy group, R 1 to R 4 are hydrogen atoms), 2-amino-3,4-dimethoxy- 6,7-dimethoxycarbonyl-phenoxazin-3-one (in the following general formula 1, R 3 and R 4 are methoxy groups, R 6 and R 7 are methoxycarbonyl groups, R 1 , R 2 and R 5 are hydrogen atoms ), 2-acetylamino - phenoxazine-3-one (in the following general formula 1, R 1 is acetyl group, R 2 to R 5 is a hydrogen atom), 2-acetylamino-7-hydroxy - phenoxazine - - one (the)
  • 2-amino-10- (N-4′-aminobutyl) -phenoxazin-3-one (wherein R 1 to R 7 and R 9 in the general formula 2 are A hydrogen atom, R 8 is an aminobutyl group), 2-amino-7-hydroxy-10- (N-4′-aminobutyl) -phenoxazin-3-one (R 1 to R 4 , R 6 of formula 2) R 7 and R 9 are hydrogen atoms, R 5 is a hydroxy group, R 8 is an aminobutyl group), 2-amino-7-methoxy-10- (N-4′-aminobutyl) -phenoxazin-3-one (R 1 to R 4 , R 6 , R 7 and R 9 in the general formula 2 are hydrogen atoms, R 5 is a methoxy group, and R 8 is an aminobutyl group) and salts thereof.
  • sugars may be added to these 2-aminophenoxazin-3-ones and their derivatives, and these compounds by artificial methods to form glycosides, and water-soluble substances such as polyethylene glycol and pullulan. Including those having a binding polymer.
  • R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom (H), a hydroxy group (OH), an acetyl group (COCH 3 ), a hydroxyacetyl group (COCH 2 OH), and R 3 to R 7 are each independently a hydrogen atom (H), a hydroxy group (OH), a methoxy group (OCH 3 ), an ethoxy group (OC 2 H 5 ), a methoxycarbonyl group (COOCH 3 ), an ethoxycarbonyl group (COOC 2). H 5 )
  • R 1 and R 2 are each independently selected from a hydrogen atom (H), a hydroxy group (OH), an acetyl group (COCH 3 ), a hydroxyacetyl group (COCH 2 OH), and R 3 to R 7 and R 9 are each independently a hydrogen atom (H), a hydroxy group (OH), a methoxy group (OCH 3 ), an ethoxy group (OC 2 H 5 ), a methoxycarbonyl group (COOCH 3 ), or an ethoxycarbonyl group.
  • R 8 is an amino propyl group (CH 2 CH 2 CH 2 NH 2), is selected from amino-butyl group (CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 NH 2).
  • the disease of abnormal bone metabolism as used in the present invention refers to a disease in which bone balance caused by osteoclasts and bone formation by osteoblasts is lost, and the bone mass is reduced compared to healthy subjects. Including those with reserves. Specific examples include osteoporosis, rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, Paget's disease of bone, osteoarthritis, gouty arthritis, gingivitis, periodontal disease, and their reserves.
  • the bone formation promoting action referred to in the present invention means an action in which bone formation by osteoblasts is promoted to increase bone mass, and includes the case where bone loss is stopped or improved. Specifically, it means an action of promoting bone formation by promoting calcium deposition by increasing osteoblast activity, promoting differentiation, or increasing the number of cells.
  • the osteoclast-inhibiting action referred to in the present invention means an action to suppress bone loss due to increased bone destruction (bone resorption) in osteoclasts, and induces osteoclast differentiation from macrophages by RANKL stimulation.
  • Inhibition inhibition of IL-6 production from osteoblasts, inhibition of PGE 2 synthesis by inhibiting the activity of cyclooxygenase (hereinafter abbreviated as “COX”), and inducible monoxide
  • COX cyclooxygenase
  • inducible monoxide Includes the action of inhibiting the synthesis of macrophages into osteoclasts based on the action of inhibiting the synthesis of nitrogen by macrophages by suppressing the production of nitrogen synthase (hereinafter abbreviated as “iNOS”).
  • the NO synthesis inhibitory activity referred to in the present invention is exhibited by quantitatively decreasing iNOS in a cell, and the compound of the present invention is added to a cell having NO synthesis activity, for example, a macrophage cell. It can be examined by measuring the amount of NO produced by the action of iNOS.
  • macrophage cells mouse-derived cell line RAW264.7 cells or those collected from experimental animals such as mice can be used. The amount of NO produced can be measured by a conventional Griess method.
  • Cyclooxygenase (COX) inhibitory activity in the present invention in the COX-1 or COX-2 and arachidonic acid presence, by adding a compound of the invention as the test sample, measuring the amount of generated PGE 2, This can be confirmed by comparison with a control sample.
  • the 50% inhibitory concentration (IC 50 value) represents the concentration of the test sample required to inhibit PGE 2 synthesis by 50% compared to an uninhibited control sample. Further, by adding a test sample to cells having cyclooxygenase activity can also be confirmed by measuring the production of PGE 2.
  • the COX-1 / COX-2 ratio a ratio of an IC 50 value with respect to an IC 50 value and COX-2 relative to COX-1, as this value is larger, relative to COX-2 All selective inhibitors.
  • 2-aminophenol or a derivative thereof used in the present invention has a bone formation promoting action.
  • these compounds produce physiologically active substances involved in enhancing bone destruction, such as NO synthesis inhibitory action, PGE 2 production inhibitory action, cyclooxygenase activity inhibitory action, and IL-6 and other inflammatory cytokine production inhibitory actions. It has the effect
  • 2-aminophenol or a derivative thereof also has an action of enhancing the production of collagen constituting the matrix of bone and cartilage, foods, cosmetics, quasi-drugs intended for osteogenesis promoters, It has a wide variety of uses as pharmaceuticals.
  • the osteogenesis promoter of the present invention can be taken orally or transgastrically or enterally by a catheter or suppository.
  • the content of 2-aminophenol or its derivative as an active ingredient contained in the osteogenesis promoter is based on the total mass of the osteogenesis promoter, Usually, it is 0.01 to 100% by mass, preferably 0.1 to 50% by mass, more preferably 0.5 to 10% by mass, and the amount used is appropriately determined according to the degree of symptoms of bone metabolic disorder. It may be determined, may be taken every other day, may be taken every day, or may be taken once to several times a day.
  • the amount of intake is usually 0.05 to 100 mg / kg / body weight, preferably 0.5 to 50 mg / kg / body weight, more preferably 2.5 To 25 mg / kg ⁇ body weight.
  • osteogenesis promoter of the present invention other substances having an osteogenesis promoting action or a bone destruction inhibiting action can be appropriately blended as long as the action and effects of 2-aminophenol or a derivative thereof are not inhibited.
  • bisphosphonate compound, calcitonin preparation, active vitamin D 3 preparation, hormone preparation containing estradiol, SERM preparation, isoflavone preparation, vitamin K 2 , mineral (calcium, magnesium, etc.) preparation, trehalose examples thereof include substances having an action of inhibiting bone destruction and / or promoting bone formation, such as lactosucrose.
  • bisphosphonate compounds are particularly preferable because they enhance the osteogenesis promoting action of the osteogenesis promoter of the present invention synergistically or additively.
  • various optional components that are usually used in foods, quasi drugs, pharmaceuticals, and the like can be appropriately blended as necessary.
  • water, ethanol, glycerin, moisturizer, oil component, emulsifier, emulsion stabilizer, thickener, antioxidant, preservative, pH adjuster, fragrance, physiologically active substance, medicinal component, animal / plant extract, etc. can be mentioned.
  • 2-aminophenol or a derivative thereof used in the present invention is very hydrophobic, when used in the form of a solution, after previously mixing with oil, lecithin, polyethylene glycol, saccharides, etc., What is necessary is just to mix with a small amount or an appropriate amount of water, and to use as an emulsification thru
  • it may be in the form of micelles encapsulated in liposomes or dissolved in an organic solvent such as acetone together with a hydrophilic-hydrophobic polymer and then mixed with water and encapsulated in the polymer.
  • the dosage form of the osteogenesis promoter of the present invention may be in a form suitable for oral ingestion or gastric / enteral administration, for example, liquid, tablet, troche, pill, aqueous suspension, oil suspension, Examples include dispersible powders or granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups, and elixirs.
  • oral, gastric and enteral administration topical administration such as subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravascular, intraperitoneal, etc., or respiratory tract, pulmonary administration by inhalation, spraying, etc. Can be administered parenterally, and a dosage form suitable for these is also optional.
  • the dosage in the case of parenteral administration may be determined as appropriate according to the degree of the symptom of abnormal bone metabolism, and may be administered every other day or every day, once to several times a day. It may be administered separately. In this case, the dose is usually 0.0005 to 20 mg / kg / body weight, preferably 0.005 to 5 mg / kg / body weight, more preferably 2-aminophenol or a derivative thereof. 0.05 to 2.5 mg / kg body weight.
  • the osteogenesis promoter of the present invention is an effective ingredient other than the active ingredient of the osteogenesis promoter of the present invention for the purpose of improving or suppressing pain, inflammation and the like accompanying abnormal bone metabolism within the range where the desired effect is obtained.
  • analgesics such as acetaminophen and phenacetin
  • potentiators of analgesic action of analgesics such as caffeine, H2-antagonists, aluminum hydroxide, magnesium hydroxide, simethicone, diuretics, analgesic anti A histamine drug, a non-analgesic antihistamine, etc. are mentioned, What is necessary is just to use together with these 1 type, or 2 or more types.
  • the bone formation-promoting agent of the present invention can be used, for example, for bone metabolism abnormal diseases accompanied by bone destruction such as rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, osteoarthritis, gouty arthritis, gingivitis, periodontal disease, osteoporosis, especially bone destruction It can be used as a prophylactic agent, ameliorating agent, or therapeutic agent for bone metabolic disorders associated with inflammatory reactions.
  • the osteogenesis promoter of the present invention has an anti-inflammatory action in addition to the osteogenesis promoting action, it can also be used in applications such as inflammatory diseases, analgesics, and antipyretics.
  • the osteogenesis promoter of the present invention can also be used as a therapeutic agent for various cancers in which COX-2 is overexpressed.
  • the osteogenesis promoter of the present invention is administered in the form of a dosage unit preparation containing a pharmaceutically acceptable base material, additives and excipients. Moreover, it can be applied not only to the treatment or prevention of diseases of abnormal bone metabolism in humans, but also to livestock such as mice, rats, horses, cows, sheep, pigs, dogs, cats, chickens, poultry and pets.
  • the solid obtained by drying the reaction solution under reduced pressure was dissolved in 450 ml of methanol, centrifuged to remove undissolved solids, and then dried again under reduced pressure.
  • the obtained solid was dissolved in 200 ml of ethyl acetate, 200 ml of 0.005N hydrochloric acid aqueous solution was added and stirred, and then the ethyl acetate layer was recovered with a separatory funnel. After repeating this operation three times, the obtained ethyl acetate layer was concentrated under reduced pressure until the liquid volume became 15 ml, and this was followed by a silica gel chromatography column (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • ⁇ Experiment 2 Effect on mouse preosteoblast cell line MC3T3-E1> ⁇ -MEM medium (Gibco Invitrogen) containing 10 volume% fetal calf serum (sold by JR Scientific, hereinafter abbreviated as “FCS”) in a 24-well plate (sold by Becton Dickinson).
  • FCS fetal calf serum
  • FCS-added ⁇ -MEM medium 10 volume% fetal calf serum
  • the powdery 2-aminophenoxazin-3-one prepared in Experiment 1 as a test substance or 2-aminophenol as its starting material is dissolved in ethanol. Used. As a positive control, it used as a therapeutic agent for osteoporosis, and, using vitamin K 2 having a function of promoting the deposition of calcium into the bone (Ca).
  • a differentiation-inducing medium (10 vol% FCS-added ⁇ -MEM medium + 10 mM ⁇ -glycerophosphate (sold by Sigma) +10 mM HEPES (DOJINDO Wako Pure Chemicals) supplemented with this test substance or positive control to the concentration shown in Table 1 Kogyo Co., Ltd.) was added at 2 ml / well. Furthermore, as a negative control, a differentiation induction medium supplemented with ethanol used as a solvent so that the final concentration was 0.1% by mass was added and cultured.
  • ALP Alkaline phosphatase activity
  • AP is 2-aminophenol in Table 1
  • QA means 2-amino-phenoxazine-3-one (QUEStionable thio mycin A)
  • VK means vitamin K 2.
  • culture is performed once every 3 or 4 days on the same day for all wells in the differentiation induction medium containing the test substance or positive control at the same concentration as the first addition or in the negative control differentiation induction medium.
  • the measured value when the test substance or the positive control is added is divided by the measured value of the negative control and multiplied by 100 to obtain a relative value with the measured value of the negative control as 100%, and the rate of increase in ALP activity (% ) are also shown in Table 1.
  • Method for measuring osteocalcin> On the ninth day from the start of the culture, the cell culture supernatant was collected and measured using a commercially available EIA kit for measuring mouse osteocalcin (available from Biomedical Technologies Inc., MA. USA).
  • the measured value when the test substance or positive control is added is divided by the measured value of the negative control and multiplied by 100 to obtain a relative value with the measured value of the negative control as 100%, and the increase rate of the secretion amount of osteocalcin It is also shown in Table 1 as (%).
  • Dulbecco's PBS (-) available from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. was added to each well from which the culture supernatant had been removed to wash the cells.
  • ⁇ Cell viability> The cells are stained with an alamar blue dye (trade name “Alamar Blue Assay”, sold by Trek Diagnostics Systems, Inc.) by a conventional method, and measured with a fluorescent plate reader (sold by Molecular Devices), The measured value when the test substance or the positive control is added is divided by the measured value of the negative control and multiplied by 100 to obtain a relative value with the measured value of the negative control as 100%, and the cell viability (% ) Are also shown in Table 1.
  • alamar blue dye trade name “Alamar Blue Assay”, sold by Trek Diagnostics Systems, Inc.
  • a fluorescent plate reader sold by Molecular Devices
  • the ALP activity and the amount of calcium deposition of MC3T3-E1 cells cultured with 2-aminophenol (AP) or 2-aminophenoxazin-3-one (QA) added to the medium As compared with the case where only ethanol used as a culture was added (negative control), it increased depending on the added concentration.
  • the amount of osteocalcin secreted is determined when 2-aminophenol (AP) or 2-aminophenoxazin-3-one (QA) is added to the medium at 1 or 2 ⁇ M, and only ethanol used as a solvent is added. Increased compared to (negative control).
  • Vitamin K 2 was used as a positive control also, in the case of adding only ethanol to the medium than the (negative control), ALP activity and calcium deposition amount, but rose in dependence on the added concentration of 10 ⁇ M In addition, ALP activity was suppressed reversibly. Moreover, secretion of osteocalcin, the addition of vitamin K 2 so as to be 10 [mu] M, compared to negative controls, increase was observed. When compared with the rate of increase in the amount of calcium deposited, 2-aminophenoxazin-3-one showed a stronger calcium deposition enhancing action than vitamin K 2 used as a positive control.
  • 2-aminophenol and its derivatives have the effect of inducing differentiation of preosteoblasts into osteoblasts and promoting calcification in the cells, and these substances can be used in chronic joints. It shows that it can be used as an osteogenesis promoter or calcification promoter for bone metabolism disorders such as rheumatism, osteoporosis, periodontal disease, and the reserves. It also shows that 2-aminophenoxazin-3-one (QA) is superior to 2-aminophenol (AP) in terms of the strength of promoting bone formation. Furthermore, 2-aminophenol and 2-aminophenoxazin-3-one used in this experiment did not affect cell viability at any concentration used in the experiment. The cytotoxicity of aminophenol and 2-aminophenoxazin-3-one was judged to be weak.
  • MC3T3-E1 cells were seeded in a 24-well plate, and one of the differentiation induction media in which the test substance was dissolved was added at 2 ml / well to the semi-confined cells. Once every 3 or 4 days, all wells were cultured on the same day for 20 days while changing the medium with a differentiation-inducing medium containing the same kind and concentration of the test substance as the first added one.
  • the amount of calcium deposited in the cells on the 20th day from the start of the culture was measured, and the amount of calcium deposited in the cells cultured in the medium supplemented with the derivative of 2-aminophenoxazin-3-one was Divide by the amount of calcium deposited in cells cultured in a medium supplemented with phenoxazin-3-one and multiply by 100 to give a relative value with the amount of calcium deposited when 2-aminophenoxazine-3-one added as 100%. Obtained and shown in Table 2 as the Ca (calcium) deposition rate (%).
  • the cell viability (%) is obtained by the same method as in Experiment 2 and is also shown in Table 2.
  • the cell survival rate (%) was expressed as a relative value with the survival rate of cells cultured in a medium supplemented with 2-aminophenoxazin-3-one being 100%. The test was conducted in 3 wells per sample.
  • test substance 2-aminophenoxazin-3-one was added to the concentration shown in Table 3, and lipolipin as an inducer of NO and PGE 2 production was added.
  • Polysaccharide was added at 2 ⁇ g / ml and IFN- ⁇ at 10 IU / ml, and RPMI-1640 medium containing 10 vol% FCS was added to make the volume 200 ⁇ l. After culturing this at 37 ° C.
  • osteoprogenitor cell line MC3T3-E1 cells from C57BL / 6 mice expressing it as a RANKL ligand. It was done as follows. Specifically, bone marrow cells were collected from the femurs of C57BL / 6 mice (female, 7 weeks old, sold by Charles River Japan, Inc.) by a conventional method, washed twice with ⁇ -MEM medium, and added with 10% by volume FCS. The suspension was suspended in ⁇ -MEM medium and adjusted to a concentration of 4 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • MC3T3-E1 cells are suspended in a 50 ⁇ g / ml mitomycin C (hereinafter sometimes abbreviated as “MMC”) solution, kept in a water bath at 37 ° C. for 30 minutes, and then placed in ⁇ -MEM medium. The cells were washed 3 times and suspended in ⁇ -MEM medium supplemented with 10% by volume FCS to a concentration of 4 ⁇ 10 5 cells / ml. Add 100 ⁇ l / well of this bone marrow cell suspension and 50 ⁇ l / well of MMC-treated MC3T3-E1 cells to a 48-well plate (Becton Dickinson, trade name “Multiwell TM 48-well”).
  • MMC mitomycin C
  • Recombinant human M-CSF 120 ng / ml, sold by Pepro Tech was added at 50 ⁇ l / well. Further, 2-aminophenoxazin-3-one of the test substance dissolved in 10% by volume FCS-added ⁇ -MEM medium was added to this well at 50 ⁇ l / well at 37 ° C. The culture was started. As a negative control, the cells were cultured for 9 days in a medium supplemented only with M-CSF.
  • alendonate alendronate, sold by LKT Laboratories
  • raloxifene hydrochloride raloxifene, sold by LKT Laboratories
  • Table 5 shows the results of the test conducted after incubation.
  • the culture is carried out once every 3 or 4 days on the same day for all wells, a medium containing the same concentration of M-CSF as that initially added and the test substance or positive control, or M-CSF.
  • the culture was performed for 9 days while the medium was changed with a negative control medium containing.
  • the test was performed in 3 wells per sample.
  • mice bone marrow cells were treated with TRAP in the presence of M3CSF and RANKL ligand-expressing MC3T3-E1 cells only (see 2-aminophenoxazin-3-one concentration of 0 ⁇ M). Differentiated into positive cells.
  • 2-aminophenoxazin-3-one was added and cultured in the presence of M-CSF and MC3T3-E1 cells, it was the same as in the case of alendonate or raloxifene hydrochloride added as a positive control.
  • mouse bone marrow cells produced IL-6 in the presence of M-CSF and MC3T3-E1 cells alone (2-aminophenoxazin-3-one concentration 0 ⁇ M), whereas When phenoxazin-3-one was added, its production was suppressed.
  • ⁇ Experiment 7 Effect of mouse spleen macrophages on differentiation into osteoclasts in the presence of M-CSF and soluble RANKL> Since it was confirmed in Experiment 6 that osteoclasts can be induced from bone marrow cells by co-culture with MC3T3-E1 cells expressing RANKL ligand, soluble in the presence of M-CSF using mouse spleen macrophages The following tests were conducted to examine the effect of 2-aminophenoxazin-3-one on the differentiation of macrophages into osteoclasts by RANKL (soluble RANKL is abbreviated as “sRANKL”). .
  • spleen cells were collected from BALB / c mice (female, 7 weeks old, sold by Charles River Japan, Inc.) by a conventional method, washed twice with ⁇ -MEM medium (MP Biomedical), and then a 48-well plate. (Becton Dickinson, trade name “Multiwell TM 48 well”) was suspended in ⁇ -MEM medium supplemented with 10% by volume FCS and seeded at 8 ⁇ 10 4 cells / well. Macrophages attached to the plate after 2 hours incubation at 37 ° C. with 5% by volume CO 2 were washed twice with ⁇ -MEM medium, and then fresh 10% by volume FCS-added ⁇ -MEM medium was 200 ⁇ l / well.
  • ⁇ -MEM medium MP Biomedical
  • test substance aminophenoxazin-3-one
  • the differentiation-inducing medium so as to have the concentrations shown in Table 6, and the culture was continued.
  • the cells in each well were stained using a TRAP staining kit that selectively stains osteoclasts as in Experiment 5, and stained under a microscope.
  • the number of TRAP positive cells was counted.
  • the results are also shown in Table 6.
  • bone marrow cells were similarly cultured in a medium supplemented with M-CSF alone and a medium supplemented with M-CSF and sRANKL.
  • risedronate (Risedronate, sold by LKT Laboratories) used as a therapeutic agent for osteoporosis was added instead of aminophenoxazin-3-one, and cultured in the same manner.
  • culture is performed once every 3 or 4 days on the same day for all wells, and the medium is replaced with a medium containing the test substance or positive control at the same concentration as the first added or a negative control medium. The culture was continued for 14 days. The test was performed in 3 wells per sample.
  • mouse macrophages do not differentiate into TRAP-positive cells in the presence of M-CSF alone, but coexist with M-CSF and sRANKL (2-aminophenoxazine-3-one).
  • the concentration of the cells was differentiated into TRAP positive cells.
  • 2-aminophenoxazin-3-one was added together with M-CSF and sRANKL
  • M-CSF and sRANKL were added in the same manner as when risedronate used as a positive control was added and cultured.
  • the increase in the number of TRAP positive cells depending on the concentration was suppressed.
  • ⁇ Experiment 8 Effect of TNF- ⁇ or IL-1 on osteoblast activation> Since rheumatoid arthritis and periodontal disease are usually accompanied by inflammation, inflammatory cytokines (IL-1, TNF- ⁇ ) produced from activated synovial cells and T cells are secreted at the inflammation site. Thus, osteoblasts are activated, the expression of RANKL, which is a physiological factor essential for differentiation into osteoclasts, is increased, and the production of IL-6 and NO is increased. This production-induced NO enhances the apoptosis of chondrocytes or decreases the synthesis of cartilage matrix, and therefore promotes the destruction of cartilage at the inflammatory site.
  • RANKL which is a physiological factor essential for differentiation into osteoclasts
  • monocytes / macrophages are activated by NO, differentiation into osteoclasts is induced, and bone destruction (bone resorption) proceeds. Furthermore, there is a direct differentiation induction pathway from osteoclast precursor cells to osteoclasts by TNF- ⁇ itself. Thus, in rheumatoid arthritis, it is considered that several pathways overlap to form a pathological condition of bone destruction. Therefore, a test for examining the effect of 2-aminophenoxazin-3-one on the activation of osteoblasts by TNF- ⁇ or IL-1 was conducted using MC3T3-E1 cells as osteoblasts as follows. It was done.
  • MC3T3-E1 cells prepared in 10% by volume FCS-added ⁇ -MEM medium to a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / ml were prepared in a 96-well microplate (available from Becton Dickinson, trade name “Microtest TM 96 ”) at 50 ⁇ l / well.
  • 2-aminophenoxazin-3-one diluted in the same medium was added at 50 ⁇ l / well so that the concentrations shown in Table 7 or 8 were obtained.
  • Cell proliferation was determined by adding 100 ⁇ l / well of an Alamar Blue stock solution diluted 4-fold in the same medium and incubating at 5% by volume CO 2 at 37 ° C. for 2 to 3 hours, followed by absorbance at 544/590 nm. Was measured. The test was performed in 3 wells per sample.
  • the measurement results of NO production and IL-6 production in the presence of recombinant human IL-1 ⁇ are shown in Table 7, and the measurement results in the presence of recombinant human TNF- ⁇ are also shown in Table 8.
  • MC3T3-E1 cells were present only in the presence of recombinant human IL-1 ⁇ or recombinant human TNF- ⁇ (see 2-aminophenoxazin-3-one concentration of 0 ⁇ M). NO and IL-6 production was observed. When cultured by adding 2-aminophenoxazin-3-one together with recombinant human IL-1 ⁇ , NO and IL are compared to when cultured with only recombinant human IL-1 ⁇ . The production of -6 was strongly suppressed.
  • ⁇ Experiment 9 Effect of mouse spleen macrophages on differentiation into osteoclasts in the presence of M-CSF and TNF- ⁇ >
  • Induction of differentiation from macrophages into osteoclasts is not limited to the pathway by osteoblasts, but especially in diseases such as rheumatoid arthritis and periodontal disease, chronically produced TNF- ⁇ and IL-1 are M- It has been revealed that there is also a pathway that directly acts on macrophages in the presence of CSF to induce differentiation into osteoclasts. Therefore, a test for examining the effect of 2-aminophenoxazin-3-one on differentiation induction from macrophages into osteoclasts in the presence of TNF- ⁇ and M-CSF was performed as follows.
  • spleen cells were collected from C57BL / 6 mice (female, 7 weeks old, sold by Charles River Japan, Inc.) by a conventional method, washed twice with ⁇ -MEM medium, and then added to ⁇ -MEM medium supplemented with 10% FCS. The suspension was suspended and seeded in a 48-well plate (trade name “Multiwell TM 48-well”, sold by Becton Dickinson) at 6 ⁇ 10 4 cells / well. Mouse spleen macrophages that had been incubated for 2 hours at 37 ° C.
  • FCS-added ⁇ -MEM medium was 200 ⁇ l / Wells and recombinant human M-CSF (60 ng / ml, sold by Pepro Tech) were added at 100 ⁇ l / well, followed by culturing at 37 ° C. for 5 days. The culture supernatant of each well was completely removed by aspiration, and 10 volume% FCS-added ⁇ -MEM medium containing 20 ng / ml human recombinant M-CSF and 20 ng / ml recombinant human TNF- ⁇ was added. Added at 200 ⁇ l / well.
  • 2-aminophenoxazin-3-one as a test substance was added to the medium so as to have a concentration shown in Table 9, and the culture was continued for 14 days. Culturing was continued for 14 days in a medium supplemented with M-CSF and TNF- ⁇ as a negative control. After removing the culture supernatant, as in Experiment 6, the cells in each well were stained using a TRAP staining kit that selectively stains osteoclasts, and the number of stained TRAP-positive cells was counted under a microscope. The results are also shown in Table 9. As a positive control, risedronate was added instead of aminophenoxazin-3-one, and culture was performed in the same manner.
  • culture is performed once every 3 or 4 days on the same day for all wells, and the medium is replaced with a medium containing the test substance or positive control at the same concentration as the first added or a negative control medium.
  • the culture was continued for 14 days.
  • the test was performed in 3 wells per sample.
  • 2-aminophenoxazin-3-one was added together with M-CSF and TNF- ⁇
  • M-CSF was added in the same manner as when risedronate used as a positive control was added and cultured.
  • the increase in the number of TRAP-positive cells depending on the concentration was observed.
  • 2-aminophenoxazin-3-one like risedronate used as a positive control, can suppress the differentiation of macrophages into osteoclasts induced by inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ . ing.
  • 2-aminophenoxazine is also used in a system in which RAW-264.7 cells of the macrophage cell line are stimulated with recombinant human TNF- ⁇ to induce differentiation into osteoclasts.
  • -3-one was found to suppress the increase in the number of TRAP-positive cells depending on its concentration.
  • mice Forty ddy mice (8 weeks old, male, sold by Nippon Charles River Co., Ltd.) were randomly divided into 10 groups of 4 groups, and 10 groups of 3 ovaries were extracted. The remaining 10 animals per group, as control 1, performed only laparotomy without removing the ovaries. From the day after the ovary was removed, 10 animals in each of the 2 groups were treated with 2-aminophenoxazin-3-one at a dose of either 3 mg / kg ⁇ body weight or 10 mg / kg ⁇ body weight using a gastric sonde, It was administered 5 times / week and reared for 4 weeks.
  • control 2 The remaining 10 animals (control 2) from which the ovaries had been removed and 10 animals in control 1 group were given an aqueous solution containing 1.5% of 1N hydrochloric acid and 0.5% by mass of carboxymethylcellulose, respectively. Used and dosed 5 times / week and raised for 4 weeks. 29 days after the ovariectomy operation, blood was collected from the abdominal vena cava under ether anesthesia, and then the mouse was dissected and the right femur was removed. The femur was immersed in 70% by volume ethanol overnight, and then tissues such as attached muscle were removed and dried overnight in an oven at 110 ° C. The dried femur was put into a crucible, heated in an oven at 950 ° C.
  • femur bone ash mass, Ca, Mg and P as compared to mice (control 2) administered with an aqueous solution containing 5% and carboxymethylcellulose 0.5% by weight with a gastric sonde for 4 weeks. Any decrease in the content of was suppressed.
  • the amount of osteocalcin in the serum is higher than that of a laparotomy-only mouse (control 1) in which the ovaries are not removed, and after removing the ovaries, an aqueous solution containing 1.5% by mass of 1N hydrochloric acid and 0.5% by mass of carboxymethylcellulose.
  • mice administered with a gastric tube for 4 weeks (Control 2), the concentration decreased.
  • osteocalcin binds to calcium efficiently. It shows that bone formation is promoted by being taken up by cells.
  • the body weight of the mice was measured. As a result, there was no difference between the four groups in the increase or decrease in the body weight throughout the test period, and 2-aminophenoxazin-3-one was toxic even if taken orally. It was judged to be a low and safe compound.
  • the cell name “NHDF”) was suspended at 5.0 ⁇ 10 5 cells / ml, and 50 ⁇ l / well was added to a 96-well microplate (available from Becton Dickinson). 2 and cultured for 1 day. The culture supernatant of each well was removed, and 10 volume% FC-added D-MEM containing 100 ⁇ M ascorbic acid 2-glucoside (trade name “AA2G”, sold by Hayashibara Biochemical Co., Ltd.) was added at 100 ⁇ l / well. did.
  • a solution prepared by dissolving 2-aminophenoxazin-3-one prepared in Experiment 1 as a test substance in DMSO to 4 mM was diluted with 10% by volume FCS-added D-MEM, and added at 100 ⁇ l / well. The final concentration of each well was adjusted to the concentration shown in Table 11. After culturing at 37 ° C. under 5% by volume CO 2 for 3 days, the medium was replaced with the same composition, and the culturing was further continued for 3 days.
  • a 1 mM acetic acid solution of pepsin (sold by Sigma) (pepsin concentration 1 mg / ml) was added at 50 ⁇ l / well at room temperature.
  • the pepsin digest was obtained by shaking for 4 hours.
  • the digested product is pipetted and collected in a 1.5 ml centrifuge tube, and 200 ⁇ l / tube of a color developing reagent of a commercially available collagen quantification kit (trade name “Sircol Collagen Assay Kit”) is added.
  • the mixture was mixed by inverting at room temperature for 30 minutes.
  • the tube for centrifugation was centrifuged as it was at 4 ° C. for 10 minutes (15000 rpm), the supernatant was removed, 50 ⁇ l of 1N NaOH was added to dissolve the precipitate, and the absorbance at 560/650 nm was measured.
  • a known amount of collagen as a standard product was appropriately diluted, digested with pepsin in the same manner, similarly treated with a coloring reagent, and the absorbance was measured to prepare a standard curve. The results of calculating the amount of collagen in NHDF cells based on this standard curve are also shown in Table 11.
  • ⁇ Bone formation promoter 2-Aminophenoxazin-3-one synthesized by the method described in Experiment 1 with respect to 75 parts by mass of anhydrous crystalline ⁇ -maltose powder (trade name “FINE TOSE”, sold by Hayashibara Corporation), or synthesis thereof 2-aminophenol used as a raw material was added in a proportion of 25 parts by mass and mixed uniformly to prepare a powdery osteogenesis promoter.
  • This product can be used as it is, tableted, encapsulated, or added to a soft drink or the like.
  • This product is used as an osteogenesis promoter, osteoporosis, rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, Paget's disease, osteoarthritis, gouty arthritis, gingivitis, periodontal disease and other bone metabolic disorders and its It is suitable for suppressing the decrease in bone mass of the reserve army or promoting the increase in bone mass.
  • ⁇ Bone formation promoter> instead of 25 parts by mass of 2-aminophenoxazin-3-one used in Example 1, the derivative of 2-aminophenoxazin-3-one synthesized in Experiment 3 was 2-amino-7-hydroxy-phenoxazine- 3-one, 2-amino-7-methoxy-phenoxazin-3-one, 2-amino-3,4 dimethoxy-6,7-dimethoxycarbonyl-phenoxazin-3-one, 2- (N-hydroxy) acetyl Powdered in the same manner as in Example 1 except that 25 parts by mass of amino-phenoxazin-3-one or 2-amino-10- (N-4'-aminobutyl) -phenoxazin-3-one was added A bone formation promoter was prepared.
  • This product can be used as it is, tableted, encapsulated, or added to a soft drink or the like.
  • This product is used as an osteogenesis promoter, osteoporosis, rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, Paget's disease, osteoarthritis, gouty arthritis, gingivitis, periodontal disease and other bone metabolic disorders and its It is suitable for suppressing the decrease in bone mass of the reserve army or promoting the increase in bone mass.
  • ⁇ Bone formation promoter 1 part by weight of sugar ester is added to 99 parts by weight of any of the powdered osteogenesis promoters prepared in Example 1 or 2, mixed homogeneously, and compressed into tablets by a conventional method.
  • a tablet containing about 50 mg of 2-aminophenoxazin-3-one or a derivative thereof or 50 mg of 2-aminophenol was obtained.
  • This product is used as an osteogenesis promoter, osteoporosis, rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, Paget's disease, osteoarthritis, gouty arthritis, gingivitis, periodontal disease and other bone metabolic disorders and its It is suitable for suppressing the decrease in bone mass of the reserve army or promoting the increase in bone mass.
  • this product since this product has COX inhibitory activity and nitric oxide synthesis inhibitory activity, it can be administered orally to treat or prevent various inflammatory diseases such as rheumatism and gastritis, cancer, Alzheimer's disease, and analgesics. It can also be used as an antipyretic.
  • ⁇ Bone formation promoter> The following ingredients were blended to obtain a powdery osteogenesis promoter. 41 parts by weight of powdered bone formation promoter prepared in Example 1 or 2 Lactosucrose (powder, lactosucrose purity 90%) 5 parts by weight powdered rice 41 parts by weight glycosylated ascorbic acid (Hayashibara Co., Ltd.) Commercial sales, 1 part by mass, “Asco Fresh”) Kotarahim extract powder 0.2 parts by weight mineral yeast (zinc, selenium, chromium, copper, manganese, 1 part by weight molybdenum and iodine) Carnitine Appropriate vitamin A Appropriate vitamin D Appropriate amount Thiamine hydrochloride Appropriate amount Riboflavin Appropriate amount Pyridoxine hydrochloride Appropriate amount Cyanocobalamin Appropriate amount Choline hydrogen tartrate Appropriate nicotinic acid amide Appropriate amount Tocopherol acetate Ap
  • this product can also be used for the prevention and treatment of all life-week diseases as an inhibitor of blood sugar elevation, an absorption inhibitor of carbohydrates and lipids, and an agent for improving metabolism of sugars and lipids.
  • ⁇ Bone formation promoter> Dentifrice was manufactured with the following formulation. Insoluble sodium metaphosphate 26.0% by mass Glycerin 25.0% by mass Dicalcium phosphate 15.0% by mass Sodium lauryl sulfate 1.5% by mass Tragacanth gum 1.4% by mass Fragrance 1.0% by mass 2-Aminophenoxazine produced in Experiment 1 0.1% by mass 3-one or 2-aminophenol (sold by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Saccharin 0.1% by mass Copper chlorophyllin sodium 1.0% by mass 28.9% by mass of water
  • This product is used as an osteogenesis promoter, osteoporosis, rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, Paget's disease, osteoarthritis, gouty arthritis, gingivitis, periodontal disease and other bone metabolic disorders and its It is suitable for suppressing the decrease in bone mass of the reserve army or promoting the increase in bone mass.
  • ⁇ Bone formation promoter 20 g of vegetable oil and 0.5 g of 2-aminophenoxazin-3-one or 2-aminophenol were mixed and mixed under heating. To this mixed solution, 0.6 g of purified egg yolk lecithin and 5.5 g of glycerin were added and dissolved by vigorous stirring while warming, and then an appropriate amount of distilled water was added and stirred with a Polytron homogenizer to prepare an emulsion. .
  • This emulsified liquid is further emulsified with a microfluidizer, and then distilled water is added to the emulsified liquid to make 100 ml, followed by filtration with a filter having a pore size of 0.45 ⁇ m, so that 2-aminophenoxazin-3-one or 2-amino An injection in which fat particles containing about 400 ⁇ g / ml of phenol were dispersed was prepared.
  • This product is used as an osteogenesis promoter, osteoporosis, rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, Paget's disease, osteoarthritis, gouty arthritis, gingivitis, periodontal disease and other bone metabolic disorders and its It is suitable for suppressing the decrease in bone mass of the reserve army or promoting the increase in bone mass.
  • This product is used as an osteogenesis promoter, osteoporosis, rheumatoid arthritis, rheumatoid spondylitis, Paget's disease, osteoarthritis, gouty arthritis, gingivitis, periodontal disease and other bone metabolic disorders and its It is suitable for suppressing the decrease in bone mass of the reserve army or promoting the increase in bone mass.
  • this product since this product has COX inhibitory activity and nitric oxide synthesis inhibitory activity, it can also be used as a therapeutic or preventive agent for various inflammatory diseases such as rheumatism, cancer, Alzheimer's disease, an analgesic agent and an antipyretic agent. .
  • 2-aminophenol or its derivatives differentiate preosteoblasts into osteoblasts and promote calcium deposition on the cells.
  • 2-aminophenol or a derivative thereof has an action of suppressing osteoclast activity and suppressing bone resorption by an NO synthesis inhibitory action, an IL-6 production inhibitory action, and a PGE 2 synthesis inhibitory action.
  • 2-aminophenol or a derivative thereof is useful as an osteogenesis promoter because it has low toxicity even when taken orally or parenterally and is safe even if used for a long time.

Abstract

　効果に優れ、副作用の少ない骨形成促進剤を提供することを課題とし、２－アミノフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する骨形成促進剤を提供することによって、上記課題を解決する。

Description

２－アミノフェノール又はその誘導体を有効成分とする骨形成促進剤
　本発明は骨形成促進剤に関するものであり、とりわけ、２－アミノフェノール又はその誘導体を有効成分とする骨形成促進剤に関するものである。
　生体内の骨組織は、破骨細胞による骨破壊（骨吸収）と骨芽細胞による骨形成とで絶えず更新されており、健常者では、そのバランスが保たれているので、一定の骨量が維持されている。一方、閉経後骨粗鬆症においては、骨破壊量が骨形成量を上回るために骨量の減少を生じている。破骨細胞は、単球／マクロファージ系前駆細胞が分化したものであるが、成熟破骨細胞への分化は生理的には、マクロファージ－コロニー刺激因子（以下、「Ｍ－ＣＳＦ」と略記する。）や、骨芽細胞、ストローマ細胞、それに活性化Ｔ細胞上に発現されたＬｉｇａｎｄ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－κＢ（以下、「ＲＡＮＫＬ」と略記する。）が関与していることが明らかとなっている。また、慢性関節リューマチでは、炎症により活性化した滑膜細胞やＴ細胞から産生されるインターロイキン－１（以下、「ＩＬ－１」と略記する。）や腫瘍壊死因子（以下、「ＴＮＦ－α」と略記する。）などの炎症性サイトカインにより骨芽細胞が活性化され、破骨細胞への分化に必須の生理的因子であるＲＡＮＫＬの発現が亢進すると共に、インターロイキン－６（以下、「ＩＬ－６」と略記する。）や一酸化窒素（以下、「ＮＯ」と略記する。）の産生を誘導する。この産生誘導されたＮＯは、軟骨細胞のアポトーシスを亢進したり、軟骨基質合成を低下させることにより軟骨破壊を促進する。またＮＯにより単球／マクロファージが活性化され、破骨細胞へと分化が誘導され骨破壊が進行する。さらにＴＮＦ－αやＩＬ－６自身による破骨前駆細胞の破骨細胞への分化誘導や、これら炎症性サイトカインにより誘導される骨芽細胞からのプロスタグランジンＥ２（以下、「ＰＧＥ２」と略記する。）の産生による破骨細胞の形成などが、骨代謝異常に関与していることもわかっている（例えば、クゾクレア　サルバトーレ（ＣＵＺＺＯＣＲＥＡ　ＳＡＬＶＡＴＯＲＥ）ら著、『エンドクリノロジー』、第１４４巻、第３号、第１０９８乃至１１０７頁、２００３年、コバヤシ　ヤスヒロら著、『ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー』、第２８０巻、第１２号、第１１３９５乃至１１４０３頁、２００５年を参照）。このように、骨粗鬆症や慢性関節リューマチなどの骨代謝異常により引き起こされる疾患（以下、「骨代謝異常疾患」という。）では、幾つかの要因が重なり合って骨破壊という病態が形成されるものと考えられている。
　骨粗鬆症や慢性関節リューマチなどの骨代謝異常疾患の治療には、通常、ビスフォスフォネート化合物、カルシトニン製剤、活性型ビタミンＤ３製剤、カルシウム製剤、イソフラボン製剤、選択的エストロジェン受容体調節剤（ＳＥＲＭ製剤）、エストラジオール含有のホルモン製剤、ビタミンＫ２等の医薬品が一般に使用されている。また、副作用の少ない優れた治療薬をめざして、活性型ビタミンＤ３誘導体、エストラジオール誘導体、第３世代ビスフォスフォネート系化合物等の開発がおこなわれている。しかし、前記薬剤を用いた骨代謝異常疾患の治療法は必ずしも満足できるものではなく、しかも、ホルモン製剤は副作用を惹起することがあるので、その使用には医師の処方が欠かせず、副作用の面から使用対象が限定される場合もある。したがって、これらの治療剤は、健常者が予防剤として普段から常用するなどということはできなかった。また、骨代謝異常疾患、とりわけ、骨粗鬆症や変形関節炎などの発症率は加齢に伴って急激に増大し、高齢者のクオリティーオブライフ（ＱＯＬ）低下の大きな要因となっている。本格的な高齢化社会を迎えた今日では、健康にして快適な老後を過ごすためにも、骨代謝異常疾患を予防乃至治療する目的で、家庭で手軽に常用でき、効果的で、且つ、穏やかな作用を有する骨形成促進剤の開発が鶴首されている。
　一方、２－アミノフェノール（別名：クエスチオマイシンＢ）は、下記化学式１で示される化合物であり、酸化重合して、下記化学式２で示される２－アミノフェノキサジン－３－オン（別名：クエスチオマイシンＡ）に比較的容易に変換する。２－アミノフェノール又はその誘導体は、抗菌活性を持つ物質として古くから知られており、特に、２－アミノフェノキサジン－３－オンは、強力な抗癌剤であるアクチノマイシンＤの基本骨格としても知られている。また、モトハシら著、『メディカル・リサーチ・レビュー』、第１１巻、第２５０乃至２５４頁、１９９１年には、２－アミノフェノキサジン－３－オン及びその誘導体が抗腫瘍活性を有していることが開示されており、特にシマモトら著、『クリニカル・キャンサー・リサーチ』、第７巻、第７０４乃至７０８頁、２００１年にはその誘導体の一つの２－アミノ－４，４α－ジヒドロ－４α，７－ジメチル－フェノキサジン－３－オンが、各種の腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すことが開示されている。さらに近年、２－アミノフェノキサジン－３－オンは、特開２００４－１４３１０１号公報ではウイルス性疾患の治療に、特開２００５－２７２３３４号公報ではクラミジア症の治療に、特開２００５－６０３２５号公報ではヘリコバクター属が関与する消化器疾患の治療に有効であることが開示されている。また、本願と同じ出願人は、国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００７／７００７７号明細書において、２－アミノフェノール及びその誘導体が、ＰＧＥ２の産生を抑制することから、炎症性の疾患に有効であることを開示している。
化学式１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
化学式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明は、従来の骨形成促進剤よりも副作用が少なく、骨代謝異常疾患の予防乃至改善効果の高い骨形成促進剤を提供することを課題とするものである。
　本発明者等が鋭意研究したところ、２－アミノフェノール又はその誘導体は、前骨芽細胞を骨芽細胞へと分化誘導し、石灰化を促進する作用を有することを発見した。さらに、これらの化合物は、マクロファージからの破骨細胞の分化誘導を抑制することで、骨破壊を抑制する作用も併せ持つことを発見し、これらの化合物が、骨代謝異常疾患の予防乃至治療に有効な骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両方を併せ持っていることを見いだして本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、２－アミノフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する骨形成促進剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
　本発明によれば、従来の骨形成促進剤よりも副作用が少なく、また、骨形成促進効果に優れる骨形成促進剤を提供することができる。
　本発明でいう２－アミノフェノールとは、下記化学式１で示される化合物であり、本発明の効果を発揮する限り、その起源や由来を問わず、市販品を用いることもできる。本発明でいう２－アミノフェノールの誘導体とは、２－アミノフェノールの酸化重合体である下記化学式２で示される２－アミノフェノキサジン－３－オン及びそれを基本骨格とする誘導体を意味し、２－アミノフェノールと同等以上の効果を発揮する。２－アミノフェノキサジン－３－オンは、その起源や由来を問わず、それを豊富に含む植物、細菌などから適宜の抽出・精製方法により製造したり、前駆体の２－アミノフェノールを酸化重合させて合成することができる。例えば、特開２００３－２８７８号公報に記載の、２－アミノフェノールとフェリシアン化カリウムなどの３価の鉄イオンとを反応させる方法や、特開平２－１９３９８４号公報に記載の、２－アミノフェノールとヒト又はウシのヘモグロビンとを反応させる方法により合成することができる。
　化学式１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　化学式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　本発明で用いられる２－アミノフェノキサジン－３－オンの誘導体としては、例えば、下記一般式１又は一般式２で表されるものがあり、これらの塩類であってもよい。また、本発明の効果を発揮する限り、その起源や由来を問わず、市販品を用いることもできる。具体的には、下記一般式１で表されるものとしては、２－アミノ－７－ヒドロキシ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ５がヒドロキシ基、Ｒ１乃至Ｒ４が水素原子）、２－アミノ－７－メトキシ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ５がメトキシ基、Ｒ１乃至Ｒ４が水素原子）、２－アミノ－３，４ジメトキシ－６，７－ジメトキシカルボニル－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ３及びＲ４がメトキシ基、Ｒ６及びＲ７がメトキシカルボニル基、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５が水素原子）、２－アセチルアミノ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ２乃至Ｒ５が水素原子）、２－アセチルアミノ－７－ヒドロキシ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ５がヒドロキシ基、Ｒ２乃至Ｒ４が水素原子）、２－（Ｎ－ヒドロキシ）アセチルアミノ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ２がヒドロキシ基、Ｒ３乃至Ｒ５が水素原子）、２－（２－ヒドロキシアセチル）アミノ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ１がヒドロキシアセチル基、Ｒ２乃至Ｒ５が水素原子）、２－アセチルアミノ－７－メトキシ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ５がメトキシ基、Ｒ２乃至Ｒ４が水素原子）、７－ヒドロキシ－２－（２－ヒドロキシアセチル）アミノ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ１がヒドロキシアセチル基、Ｒ５がヒドロキシ基、Ｒ２乃至Ｒ４が水素原子）、２－アミノ－４，６，７－トリメトキシ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ３乃至Ｒ５がメトキシ基、Ｒ１及びＲ２が水素原子）、２－（Ｎ－ヒドロキシ）アセチルアミノ－フェノキサジン－３－オン（下記一般式１において、Ｒ１がヒドロキシ基、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３乃至Ｒ７が水素原子）などが挙げられる。また、下記一般式２で表されるものとしては、２－アミノ－１０－（Ｎ－４′－アミノブチル）－フェノキサジン－３－オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ８がアミノブチル基）、２－アミノ－７－ヒドロキシ－１０－（Ｎ－４′－アミノブチル）－フェノキサジン－３－オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ５がヒドロキシ基、Ｒ８がアミノブチル基）、２－アミノ－７－メトキシ－１０－（Ｎ－４′－アミノブチル）－フェノキサジン－３－オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ５がメトキシ基、Ｒ８がアミノブチル基）などやこれらの塩類を挙げることができ、２－アミノ－１０－［４′－（Ｎ－ジエチルアミノ）ブチル］－フェノキサジン－３－オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ８がジエチルアミノブチル基）や２－アミノ－１０－（４′－Ｎ－ピペリジノブチル）－フェノキサジン－３－オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ８がピペリジノブチル基）などの２－アミノ－１０－（Ｎ－４′－アミノブチル）－フェノキサジン－３－オンの誘導体が挙げられる。また、前記２－アミノフェノキサジン－３－オンやその誘導体の塩類や、これらの化合物に、さらに、人工的な手法により、糖を付加して配糖体にしたり、ポリエチレングリコールやプルランなどの水溶性ポリマーを結合させたものも含む。
一般式１： 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （但し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、アセチル基（ＣＯＣＨ３）、ヒドロキシアセチル基（ＣＯＣＨ２ＯＨ）から選ばれ、Ｒ３乃至Ｒ７は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、メトキシ基（ＯＣＨ３）、エトキシ基（ＯＣ２Ｈ５）、メトキシカルボニル基（ＣＯＯＣＨ３）、エトキシカルボニル基（ＣＯＯＣ２Ｈ５）から選ばれる。）
一般式２：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （但し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、アセチル基（ＣＯＣＨ３）、ヒドロキシアセチル基（ＣＯＣＨ２ＯＨ）から選ばれ、Ｒ３乃至Ｒ７及びＲ９は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、メトキシ基（ＯＣＨ３）、エトキシ基（ＯＣ２Ｈ５）、メトキシカルボニル基（ＣＯＯＣＨ３）、エトキシカルボニル基（ＣＯＯＣ２Ｈ５）から選ばれ、Ｒ８は、アミノプロピル基（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アミノブチル基（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）から選ばれる。
　本発明でいう骨代謝異常疾患とは、破骨細胞による骨破壊と骨芽細胞による骨形成とのバランスがくずれて、骨量が健常者よりも減少する疾患をいい、骨量が健常者よりも低い状態にある場合や、その予備軍を含む。具体的には、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病やその予備軍などを例示することができる。
　本発明でいう骨形成促進作用とは、骨芽細胞による骨形成が促進されて、骨量が増加する作用を意味し、骨量の減少を停止乃至改善する場合を含む。具体的には、骨芽細胞の活性の上昇や分化の促進、或いは、その細胞数の増加などによって、カルシウムの沈着を促進し、骨形成を促進する作用を意味する。また、本発明でいう破骨抑制作用とは、破骨細胞における骨破壊（骨吸収）の亢進による骨量減少を抑制する作用を意味し、ＲＡＮＫＬ刺激によるマクロファージからの破骨細胞の分化誘導の抑制、骨芽細胞からのＩＬ－６の産生の抑制、さらには、シクロオキシゲナーゼ（以下、「ＣＯＸ」と略記する。）の活性を阻害することでＰＧＥ２の合成の阻害、及び、誘導型一酸化窒素合成酵素（以下、「ｉＮＯＳ」と略記する。）の産生を抑制することでマクロファージによるＮＯの合成を阻害するなどの作用に基づき、マクロファージの破骨細胞への分化誘導を抑制する作用を含む。
　本発明でいうＮＯの合成阻害作用は、細胞におけるｉＮＯＳが量的に減少することによって発揮され、ＮＯの合成活性を有する細胞、例えば、マクロファージ細胞に本発明の化合物を添加して、当該細胞のｉＮＯＳの作用により産生するＮＯ量を測定することにより調べることができる。マクロファージ細胞としては、マウス由来の細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞や、マウスなどの実験動物から採取したものを用いることができる。産生するＮＯ量は常法のＧｒｉｅｓｓ法により測定できる。Ｇｒｉｅｓｓ法とは、ＮＯをスルファニルアミドとＮ－（１－ナフチル）エチレンジアミンの混合物（Ｇｒｉｅｓｓ試薬）中に添加し、ジアゾ化カップリング反応により生成する赤色のアゾ色素を５４０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＮＯの代謝物のＮＯ２ －を定量する方法である。
　本発明でいうシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性阻害作用は、ＣＯＸ－１又はＣＯＸ－２及びアラキドン酸共存下において、試験試料としての本発明の化合物を添加することによって、ＰＧＥ２の生成量を測定し、対照試料と比較することによって確認することができる。５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は、非阻害の対照試料と比較し、ＰＧＥ２合成を５０％阻害するために必要な試験試料の濃度を表す。また、シクロオキシゲナーゼ活性を有する細胞に試験試料を添加して、ＰＧＥ２の生成量を測定することによっても確認することができる。また、ＣＯＸ－１／ＣＯＸ－２比とは、ＣＯＸ－１に対してのＩＣ５０値とＣＯＸ－２に対してのＩＣ５０値の比であり、この値が大きいほど、ＣＯＸ－２に対しての選択的阻害剤であることを意味する。
　上記のとおり、本発明で用いられる２－アミノフェノール又はその誘導体は、骨形成促進作用を有する。しかも、これらの化合物は、ＮＯ合成阻害作用、ＰＧＥ２産生抑制作用、シクロオキシゲナーゼ活性阻害作用、ＩＬ－６などの炎症性サイトカインの産生抑制作用などの、骨破壊の亢進に関与する生理活性物質の産生を抑制する作用を有している。しかも、２－アミノフェノール又はその誘導体は、骨や軟骨の基質を構成するコラーゲン産生を増強する作用も有していることから、骨形成促進剤を目的とする食品、化粧品、医薬部外品、医薬品としての多種多様の用途を有している。また、本発明の骨形成促進剤は、経口的に摂取、或いは、カテーテルや座剤等により経胃又は経腸的に投与することができる。経口摂取物又は経胃・経腸投与物の形態の場合、骨形成促進剤に含まれる有効成分としての２－アミノフェノール又はその誘導体の含有量は、骨形成促進剤の総質量に対して、通常、０．０１乃至１００質量％、好ましくは０．１乃至５０質量％、より好ましくは０．５乃至１０質量％であり、使用量としては、骨代謝異常疾患の症状の程度に応じて適宜決定すればよく、隔日で摂取しても、毎日摂取してもよく、１日１回乃至数回に分けて摂取してもよい。摂取量は、通常、２－アミノフェノール又はその誘導体としての一回の摂取量が、０．０５乃至１００ｍｇ／ｋｇ・体重、好ましくは０．５乃至５０ｍｇ／ｋｇ・体重、より好ましくは２．５乃至２５ｍｇ／ｋｇ・体重である。
　本発明の骨形成促進剤には、２－アミノフェノール又はその誘導体の作用効果を阻害しない範囲で、他の骨形成促進作用乃至骨破壊抑制作用を有する物質を適宜配合することができる。具体的には、例えば、ビスフォスフォネート化合物、カルシトニン製剤、活性型ビタミンＤ３製剤、エストラジオール含有のホルモン製剤、ＳＥＲＭ製剤、イソフラボン製剤、ビタミンＫ２、ミネラル（カルシウム、マグネシウムなど）製剤、トレハロース、ラクトスクロースなどの骨破壊を抑制、及び／又は、骨形成促進する作用を有する物質を例示することができ、なかでも、ビスフォスフォネート化合物、エストラジオール含有のホルモン製剤、ＳＥＲＭ製剤、イソフラボン製剤、カルシウム製剤などは、本発明の骨形成促進剤の骨形成促進作用を相乗的乃至相加的に高めるので特に好ましい。
　上記成分の他に通常食品、医薬部外品や医薬品等に用いられる各種任意の成分を必要に応じて適宜配合することができる。例えば、水、エタノール、グリセリン、保湿剤、油性成分、乳化剤、乳化安定剤、増粘剤、抗酸化剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、香料、生理活性物質、薬効成分、動・植物エキス等が挙げられる。また、本発明で使用する２－アミノフェノール又はその誘導体は、疎水性が非常に強いので、溶液の形態で使用する場合には、予め、オイル、レシチン、ポリエチレングリコール、糖類等と混合した後、少量の或いは適量の水と混合して、乳化乃至懸濁液として使用すればよい。また、リポソームに封入したり、親－疎水性ポリマーと共にアセトンなどの有機溶媒に溶解した後、有機溶媒を除去して、水と混合し、該ポリマーに封入したミセルの形態としてもよい。
　本発明の骨形成促進剤の剤形は、経口摂取又は経胃・経腸投与に適した形態であればよく、例えば、液状、錠剤、トローチ、丸薬、水性懸濁液、油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、乳剤、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップ、エリキシルなどの形態が挙げられる。また、経口・経胃・経腸投与以外にも皮下、皮内、筋肉内などの局所投与、血管内や腹腔内などへの投与、又は、吸飲、噴霧等による経気道、経肺投与などの非経口投与によることもでき、これらに適した剤形とすることも随意である。また、その所定量を飲食品に添加した形態で摂取することもできる。非経口的投与の場合の投与量としては、骨代謝異常疾患の症状の程度に応じて適宜決定すればよく、隔日で投与しても、毎日投与してもよく、１日１回乃至数回に分けて投与してもよい。その場合の投与量は、通常、２－アミノフェノール又はその誘導体としての一回の投与量が、０．０００５乃至２０ｍｇ／ｋｇ・体重、好ましくは０．００５乃至５ｍｇ／ｋｇ・体重、より好ましくは０．０５乃至２．５ｍｇ／ｋｇ・体重である。
　また、本発明の骨形成促進剤は、所期の効果が得られる範囲で、骨代謝異常疾患に伴う痛みや炎症などを改善乃至抑制する目的で、本発明の骨形成促進剤の有効成分以外の薬剤と併用することができる。具体的には、例えば、アセトアミノフェン、フェナセチンなどの鎮痛剤、カフェインなどの鎮痛剤の鎮痛作用の増強剤、Ｈ２－アンタゴニスト、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、シメチコン、利尿薬、鎮痛性抗ヒスタミン薬、非鎮痛性抗ヒスタミン薬などが挙げられ、これらの１種又は２種以上と併用すればよい。
　本発明の骨形成促進剤は、例えば、関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病、骨粗鬆症などの骨破壊を伴う骨代謝異常疾患、とりわけ骨破壊に炎症性反応を伴う骨代謝異常疾患の予防剤、改善剤、治療剤として利用することができる。また、本発明の骨形成促進剤は、骨形成促進作用に加えて、抗炎症作用なども併せ持つので、炎症性疾患や鎮痛剤、解熱剤などの用途でも利用できる。さらに本発明の骨形成促進剤は、ＣＯＸ－２が過剰発現している各種の癌の治療剤として利用することもできる。
　本発明の骨形成促進剤は、製剤学上許容可能な基材や添加剤や賦形剤を含む投与単位調合物の形で投与される。また、ヒトの骨代謝異常疾患の治療又は予防のみならず、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリなどの家畜、家禽やペット等にも適用できる。
　以下、実験で本発明の詳細を説明する。
＜実験１：２－アミノフェノキサジン－３－オンの合成＞
　２－アミノフェノールを原料にして２－アミノフェノキサジン－３－オンを合成した。すなわち、５５０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）の２－アミノフェノール（和光純薬工業株式会社販売）を５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、それに０．１規定（Ｎ）の塩酸２２５ｍｌを加えた後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整した。この溶液に５００ｍｌの５ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液を撹拌しながら５分間かけて滴下し、さらに２６℃で３０分間反応させた。反応液を減圧下で乾燥して得られた固形物を４５０ｍｌのメタノールに溶解し、遠心分離して未溶解の固形分を除去した後、再度減圧下で乾燥した。得られた固形物を２００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、２００ｍｌの０．００５Ｎ塩酸水溶液を加え、撹拌した後、分液ロートで酢酸エチル層を回収した。この操作を３回繰り返した後、得られた酢酸エチル層を減圧下で液量が１５ｍｌになるまで濃縮し、これを常法にしたがい、シリカゲルクロマトグラフィーカラム（和光純薬工業株式会社販売、商品名『ワコーゲルＣ２００』）及び逆相Ｃ３０クロマトグラフィーカラム（野村化学株式会社販売、商品名『デベロシルＣ３０』、又は、東ソー株式会社販売、商品名『ＨＷ－４０Ｆ』）により精製し、乾燥して、粉末状の２－アミノフェノキサジン－３－オン２２０ｍｇを得た。
＜実験２：マウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞に及ぼす影響＞
　２４穴プレート（ベクトンデキンソン社販売）に、１０容量％のウシ胎児血清（ＪＲサイエンティフィック社販売、以下、ウシ胎児血清を「ＦＣＳ」と略記する。）を含むα－ＭＥＭ培地（ギブコ　インビトロジェン社販売）（以下、「１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地」という。）に浮遊させたマウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（以下、「ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞」という。）を５．０×１０４細胞／２ｍｌ／ウエルで播種後、３７℃、５容量％ＣＯ２下で３日間培養した。セミコンフレント状態になった細胞の培養上清を除去後、被験物質として実験１で調製した粉末状の２－アミノフェノキサジン－３－オン又はその始発原料の２－アミノフェノールをエタノールに溶解して使用した。また陽性対照として、骨粗鬆症治療剤として使用され、且つ、骨へのカルシウム（Ｃａ）の沈着を促進する作用を有するビタミンＫ２を使用した。この被験物質又は陽性対照を、表１に示す濃度となるように添加した分化誘導培地（１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地＋１０ｍＭ　β‐グリセロフォスフェート（シグマ社販売）＋１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ　和光純薬工業株式会社販売））を２ｍｌ／ウエルで添加した。さらに、陰性対照として、溶媒として使用したエタノールを最終濃度が０．１質量％となるように添加した分化誘導培地を添加して培養した。骨芽細胞の分化前期の指標となるアルカリフォスファターゼ活性（ＡＬＰ）、骨芽細胞の分化後期の指標となるオステオカルシンの分泌量、骨芽細胞による骨形成の指標となるＣａ沈着量、及び、細胞の生存率を下記方法により、それぞれ測定した。なお、表１における「ＡＰ」は２－アミノフェノール、「ＱＡ」は２－アミノフェノキサジン－３－オン（クエスチオマイシンＡ）、「ＶＫ」はビタミンＫ２を意味する。また、培養は、３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ濃度の被験物質又は陽性対照を含む分化誘導培地、或いは、陰性対照の分化誘導培地による培地交換をおこないながら、酵素活性及びオステオカルシンの分泌量測定用の細胞は９日間、Ｃａ沈着量の測定用の細胞は２０日間培養した。試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。
＜ＡＬＰ活性の測定方法＞
　培養開始９日目に、培養上清を除去後、各ウエルに付着した細胞を０．２５Ｍスクロースで３回洗浄後、市販のＡＬＰ活性測定キット（和光純薬工業株式会社販売、商品名「ラボアッセイＴＭＡＬＰ」）を使用して測定した。この培養上清を除去したウエルに、まず酵素反応緩衝液として、２５ｍＭのスクロースと１ｍＭのＭｇＣｌ２とを含有する５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）を０．９ｍｌ／ウエルで添加した。さらに、この反応緩衝液に、基質として２．５ｍＭ　ｐ－ニトロフェノールリン酸溶液を０．１ｍｌ／ウエルで添加し、２５℃で１０分間反応した。０．２ＮのＮａＯＨで２倍希釈（反応停止）後、遊離したｐ－ニトロフェノールを４０５ｎｍの吸光度で測定した。被験物質又は陽性対照を添加した場合の測定値を、陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値を求め、ＡＬＰ活性の上昇率（％）として表１に併せて示す。
＜オステオカルシンの測定方法＞
　培養開始９日目に、細胞培養上清を回収し、市販のマウスオステオカルシン測定用のＥＩＡキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．社販売、ＭＡ．ＵＳＡ）を使用して測定した。被験物質又は陽性対照を添加した場合の測定値を、陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値を求め、オステオカルシンの分泌量の上昇率（％）として表１に併せて示す。
＜沈着Ｃａ量測定方法＞
　培養開始２０日目に、培養上清を除去した各ウエルに、ダルベッコＰＢＳ（－）（日水製薬株式会社販売）を加えて、細胞を洗浄した。ダルベッコのＰＢＳ（－）を除去後、２Ｎの塩酸を０．５ｍｌ／ウエル加えて、細胞に沈着したカルシウムを溶解し、市販のカルシウム測定キット（和光純薬工業株式社販売、商品名「カルシウムＣテストワコー」）を使用して測定した。被験物質又は陽性対照を添加した場合の測定値を、陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値を求め、カルシウムの沈着量上昇率（％）として表１に併せて示す。
＜細胞の生存率＞
　細胞を、常法によりアラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）色素（トレック　ダイアゴノスティック　システムズ社販売、商品名「アラマーブルーアッセイ」）で染色し、蛍光プレートリーダー（モレキュラー　デバイス社販売）により測定して、被験物質又は陽性対照を添加した場合の測定値を、陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値を求めて、細胞の生存率（％）として表１に併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表１から明らかなように、培地に２－アミノフェノール（ＡＰ）又は２－アミノフェノキサジン－３－オン（ＱＡ）を添加して培養したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞のＡＬＰ活性及びカルシウム沈着量は、溶媒として使用したエタノールのみを添加して培養した場合（陰性対照）に比して、添加した濃度に依存して上昇した。オステオカルシンの分泌量は、培地に２－アミノフェノール（ＡＰ）又は２－アミノフェノキサジン－３－オン（ＱＡ）を１又は２μＭ添加した場合に、溶媒として使用したエタノールのみを添加して培養した場合（陰性対照）に比して、上昇した。また、陽性対照として使用したビタミンＫ２も、エタノールのみを培地に添加した場合（陰性対照）に比して、ＡＬＰ活性及びカルシウム沈着量が、添加した濃度に依存して上昇したものの、１０μＭの添加では、ＡＬＰ活性が逆に抑制された。また、オステオカルシンの分泌量は、ビタミンＫ２を１０μＭとなるように添加した場合に、陰性対照に比して、上昇が認められた。カルシウムの沈着量の上昇率で比較すると、２－アミノフェノキサジン－３－オンは、陽性対照として使用したビタミンＫ２よりも強いカルシウム沈着の増強作用を示した。これらの結果は、２－アミノフェノール及びその誘導体は、前骨芽細胞の骨芽細胞への分化を誘導して、該細胞におけるカルシウム沈着を促進する作用を有し、これらの物質が、慢性関節リューマチ、骨粗鬆症、歯周病等の骨代謝異常疾患やその予備軍に骨形成促進剤、或いは、カルシウム沈着促進剤として利用できることを物語っている。また、骨形成促進作用の強さの点では、２－アミノフェノール（ＡＰ）よりも２－アミノフェノキサジン－３－オン（ＱＡ）の方が優れていることを物語っている。さらに、本実験で使用した２－アミノフェノール及び２－アミノフェノキサジン－３－オンは、実験に使用した何れの濃度においても、細胞の生存率に影響を与えることはなかったことから、２－アミノフェノール及び２－アミノフェノキサジン－３－オンの細胞毒性は弱いと判断した。
＜実験３：マウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞のカルシウム沈着に及ぼす２－アミノフェノキサジン－３－オンの誘導体の影響＞
　実験２で、２－アミノフェノキサジン－３－オンが、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞のカルシウム沈着を強く増強することが確認されたので、２－アミノフェノキサジン－３－オンの誘導体に同様の活性があることを確認する試験をおこなった。表２に示す５種類の２－アミノフェノキサジン－３－オンの誘導体を常法により合成し、被験物質として使用した。実験２で使用したものと同じ分化誘導培地に被験物質を各々最終濃度が２μＭとなるように溶解した。実験２と同様に２４穴プレートにＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を播種して、セミコンフレントの状態になった細胞に、被験物質を溶解した分化誘導培地のいずれかを、２ｍｌ／ウエルで添加した。３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ種類、濃度の被験物質を含む分化誘導培地による培地交換をおこないながら２０日間培養した。実験２と同じ方法で、培養開始２０日目の細胞のカルシウム沈着量を測定し、２－アミノフェノキサジン－３－オンの誘導体を添加した培地で培養した細胞のカルシウム沈着量を、２－アミノフェノキサジン－３－オンを添加した培地で培養した細胞のカルシウム沈着量で除し、１００倍して、２－アミノフェノキサジン－３－オン添加時のカルシウム沈着量を１００％とする相対値を求め、Ｃａ（カルシウム）沈着率（％）として表２に併せて示す。また、実験２と同じ方法で細胞生存率（％）を求めて表２に併せて示す。なお、細胞生存率（％）は、２－アミノフェノキサジン－３－オンを添加した培地で培養した細胞の生存率を１００％とした相対値で示した。また、試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表２から明らかなように、試験に使用した５種類の２－アミノフェノキサジン－３－オンの誘導体は、何れも、２－アミノフェノキサジン－３－オンと同様に、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞のカルシウム沈着を増強する作用を示した。このカルシウム沈着増強作用の強さの点からは、２－アミノフェノキサジン－３－オンが最も強く、２－アミノ－７－ヒドロキシ－フェノキサジン－３－オン、２－アミノ－３，４－ジメトキシ－６，７－ジメトキシカルボニル－フェノキサジン－３－オン及び２－アミノ－１０－（Ｎ－４′－アミノブチル）－フェノキサジン－３－オンがそれに次ぐ強さを示した。
＜実験４：マクロファージからのＮＯ、ＰＧＥ２産生抑制活性＞
　骨量減少の原因となる骨破壊の進行には、ＮＯや炎症性のサイトカインなどが関与していることが知られている。そこでマウスマクロファージ細胞株を用いて、マクロファージからのＮＯ、ＰＧＥ２産生に及ぼす２－アミノフェノール誘導体の影響を調べる試験を以下のようにおこなった。すなわち、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ－２６４．７を、細胞濃度１×１０６細胞／ｍｌになるように、１０容量％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地（シグマ　アルドリッチ社販売）に浮遊させて、細胞浮遊液を調製した。これを９６穴マイクロプレートに５０μｌ／ウエル添加し、表３に示す濃度となるように被験物質の２－アミノフェノキサジン－３－オンを添加し、さらに、ＮＯ及びＰＧＥ２産生の誘導剤としてリポ多糖を２μｇ／ｍｌ及びＩＦＮ－γを１０ＩＵ／ｍｌとなるように添加し、１０容量％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地を加えて液量を２００μｌとした。これを、３７℃で２日間培養した後、培養上清を常法のＧｒｉｅｓｓ法に供してＮＯ量を、また、市販の抗ＰＧＥ２抗体による測定キット（アマシャムバイオサイエンス社販売、商品名「ＰＧＥ２ＥＩＡキット」）に供してＰＧＥ２量を測定した。陽性対照として、ＣＯＸ阻害剤であるインドメタシン（和光純薬工業株式会社販売）、アスピリン（和光純薬工業株式会社販売）、ＣＯＸ－２選択的阻害剤であるＮＳ－３９８（和光純薬工業株式会社販売）を用意し、上記と同様にして実験をおこなった。また陰性対照（表３の濃度０μＭ）として、上記被験物質又は陽性対照を添加しない系を設けた。結果を表３に示す。なお、表３における「ＱＡ」は２－アミノフェノキサジン－３－オン（クエスチオマイシンＡ）、「ＮＳ」はＮＳ－３９８、「ＩＮ」はインドメタシン、「ＡＳ」はアスピリンを意味し、被験物質又は陽性対照を加えたときのＮＯ産生量（％）、ＰＧＥ２産生量（％）、マクロファージの増殖（％）は、被験物質又は陽性対照添加時の各々の測定値を陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値で示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表３から明らかなように、２－アミノフェノキサジン－３－オン（表３における「ＱＡ」）は、マクロファージの増殖を低下させることなく、ＮＯの産生及びＰＧＥ２の産生を抑制した。また、本実験で得られた各細胞抽出液に含まれるｉＮＯＳの量を、抗ｉＮＯＳ抗体を用いるウエスタンブロッティング解析により調べたところ、濃度依存的に２－アミノフェノキサジン－３－オンによりｉＮＯＳ量が減少した。よって、２－アミノフェノキサジン－３－オンによるＮＯの産生阻害活性は、ｉＮＯＳの量を減少させることによって発揮されるものと考えられた。この結果は、２－アミノフェノール又はその誘導体を経口的又は非経口的に患者に投与した場合、ＮＯ及びＰＧＥ２の産生を抑制することにより、骨破壊を抑制できることを示している。
＜実験５：ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２阻害活性＞
　上記実験４の結果を検証するために、ＰＧＥ２の合成系に必須の酵素であるＣＯＸの酵素活性が阻害されるかどうか調べた。『ＣＯＸインヒビタースクリーニングアッセイキット』（ケイマン社販売）により、ＣＯＸ－１又はＣＯＸ－２、及び、基質としてのアラキドン酸が存在する反応系に、試験試料として２－アミノフェノキサジン－３－オン又は２－アミノフェノールを表４に示す濃度となるように添加し、抗ＰＧＥ２抗体を用いたＥＩＡにより、生成したＰＧＥ２の量を測定し、ＣＯＸの活性量とした。なお、対照として試験試料を添加しない系を設け、２－アミノフェノキサジン－３－オン又は２－アミノフェノールを添加したときの活性量を、対照の活性量で除し、対照の測定値を１００％とした相対値を求めて、ＣＯＸ－１又はＣＯＸ－２の残存活性率として表４に併せて示す。また試験試料の各濃度での残存活性率をグラフにプロットし、ＣＯＸ－１又はＣＯＸ－２の活性を５０％阻害するときの２－アミノフェノキサジン－３－オン又は２－アミノフェノールの濃度（ＩＣ５０）を算出した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表４から明らかなように、２－アミノフェノール及び２－アミノフェノキサジン－３－オンは、ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２の活性を阻害した。その効果はＩＣ５０値で比較すると、モル比で４乃至６倍（≒２８÷６．４４乃至４．８３）、質量比で２乃至３倍程度、２－アミノフェノールよりも２－アミノフェノキサジン－３－オンの方が優れていた。また、ＣＯＸ－１／ＣＯＸ－２比は、ＩＣ５０値から計算すると２－アミノフェノールが約１（≒２８．０÷２７．７）、２－アミノフェノキサジン－３－オンが約１．３（≒６．４４÷４．８３）であり、アスピリン（ＣＯＸ－１／ＣＯＸ－２比＝０．２４）やインドメタシン（ＣＯＸ－１／ＣＯＸ－２比＝０．０３）などの非ステロイド系のＣＯＸ阻害剤よりもＣＯＸ－２に対する選択性が高く、ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２活性に対するＩＣ５０値はほぼ同じとなった。この結果は、２－アミノフェノール又は２－アミノフェノキサジン－３－オンを経口又は非経口的に患者に投与した場合、ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２の活性の両方を阻害することにより、骨破壊を促進する作用を有するＰＧＥ２の産生を抑制して、骨破壊を抑制できることを示している。
＜実験６：マウス骨髄細胞とＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の共培養によるマウスマクロファージの破骨細胞への分化に及ぼす影響＞
　実験４及び５により、２－アミノフェノール及びその誘導体に、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制し骨破壊を抑制する作用があることが示された。そこで、破骨細胞形成の主要な経路として知られている、マクロファージ－コロニー刺激因子（以下、「Ｍ－ＣＳＦ」という場合がある。）の共存下におけるＲＡＮＫＬリガンド刺激により骨髄細胞が破骨細胞に分化する系に及ぼす、２－アミノフェノキサジン－３－オンの影響を調べる試験を、ＲＡＮＫＬリガンドとしてこれを発現しているＣ５７ＢＬ／６マウス由来の骨芽前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を使用して、以下のようにおこなった。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢、日本チャールスリバー社販売）の大腿骨より、常法により骨髄細胞を採集して、α－ＭＥＭ培地にて２回洗浄後、１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地に浮遊させて、４×１０６細胞／ｍｌの濃度に調製した。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞は、予め５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（以下、「ＭＭＣ」と略記する場合がある。）溶液に浮遊させて、３７℃のウオーターバスで３０分間保持した後、α－ＭＥＭ培地にて３回洗浄して、１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地に浮遊させて、４×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製した。４８ウエルプレート（ベクトンデキンソン社販売、商品名「マルチウエルＴＭ４８ウエル」）に、この骨髄細胞の浮遊液を１００μｌ／ウエルと、ＭＭＣ処理したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の浮遊液を５０μｌ／ウエルで加え、組換型ヒトＭ－ＣＳＦ（１２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ社販売）を５０μｌ／ウエル添加した。さらに、このウエルに表５に示す濃度となるように、１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地に溶解した被験物質の２－アミノフェノキサジン－３－オンを５０μｌ／ウエルで加えて、３７℃で培養を開始した。陰性対照としてＭ－ＣＳＦのみを添加した培地で９日間培養した。培養開始９日後に、培養上清を全量除去し、破骨細胞を選択的に染色するＴＲＡＰ（Ｔａｒｔａｒａｔｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色キット（シグマ　アルドリッチ社販売、商品名「Ａｃｉｄ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｋｉｔ」）を用いて、各ウエルの細胞を染色し、顕微鏡下で、染色されたＴＲＡＰ陽性細胞数を計測した結果を表５に併せて示す。さらに、培養開始３日目に培養上清の一部をサンプリングして、上清中のＩＬ－６産生量を酵素抗体法（ＥＩＡ）により測定して表５に併せて示す。また、陽性対照として、骨粗鬆症治療剤として使用されているアレンドネート（Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社販売）又は塩酸ラロキシフェン（Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ、ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社販売）を、アミノフェノキサジン－３－オンに替えて添加し、同様に培養して試験をおこなった結果を表５に併せて示す。なお、培養は、３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ濃度のＭ－ＣＳＦと、被験物質又は陽性対照とを含む培地、或いは、Ｍ－ＣＳＦを含む陰性対照の培地による培地交換をおこないながら９日間培養した。試験は１サンプルあたり３ウエルで実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　表５から明らかなように、マウス骨髄細胞は、Ｍ－ＣＳＦとＲＡＮＫＬリガンドを発現しているＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞のみの共存下（２－アミノフェノキサジン－３－オンの濃度０μＭ参照）で、ＴＲＡＰ陽性細胞へ分化した。これに対して、Ｍ－ＣＳＦとＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の共存下に、２－アミノフェノキサジン－３－オンを加えて培養した場合には、陽性対照として添加したアレンドネート又は塩酸ラロキシフェンの場合と同様に、Ｍ－ＣＳＦとＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞のみの共存下で培養した場合に比して、その濃度に依存したＴＲＡＰ陽性細胞数の増加の抑制が認められた。また、マウス骨髄細胞は、Ｍ－ＣＳＦとＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞とのみの共存下（２－アミノフェノキサジン－３－オンの濃度０μＭ）では、ＩＬ－６を産生したのに対して、２－アミノフェノキサジン－３－オンを添加した場合には、その産生の抑制が認められた。この結果は、２－アミノフェノキサジン－３－オンは、陽性対照として使用したアレンドネート又は塩酸ラロキシフェンと同様に、骨髄細胞の破骨細胞への分化を抑制できるので、慢性関節リューマチ、骨粗鬆症、歯周病等の骨代謝異常疾患やその予備群における骨破壊を抑制できることを物語っている。また、２－アミノフェノキサジン－３－オンによるこの抑制効果は、骨粗鬆症治療剤のアレンドネートより強いことを物語っている。
＜実験７：マウス脾臓マクロファージのＭ－ＣＳＦ及び可溶性ＲＡＮＫＬ共存下での破骨細胞への分化に及ぼす影響＞
　実験６においてＲＡＮＫＬリガンドを発現しているＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞との共培養により、骨髄細胞から破骨細胞を誘導できることが確認されたので、マウス脾臓マクロファージを使用してＭ－ＣＳＦの共存下における可溶性のＲＡＮＫＬ（以下、可溶性のＲＡＮＫＬを「ｓＲＡＮＫＬ」と略記する。）による、マクロファージの破骨細胞への分化に及ぼす２－アミノフェノキサジン－３－オンの影響を調べる試験を以下のようにおこなった。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢、日本チャールスリバー社販売）より、常法により脾臓細胞を採集し、α－ＭＥＭ培地（ＭＰ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社販売）にて２回洗浄後、４８ウエルプレート（ベクトンデキンソン社販売、商品名「マルチウエルＴＭ４８ウエル」）に、１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地に浮遊させて、８×１０４細胞／ウエルとなるように播種した。５容量％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベーションして、プレートに付着させたマクロファージを、α－ＭＥＭ培地にて２回洗浄後、新鮮な１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地を２００μｌ／ウエルと、１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地に溶解したヒト組換型Ｍ－ＣＳＦ（６０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ社販売）を１００μｌ／ウエルとを添加して、５容量％ＣＯ２、３７℃で５日間培養した。各ウエルの培養上清を完全に吸引除去して、２０ｎｇ／ｍｌの組換型ヒトＭ－ＣＳＦと、２．５ｎＭのｓＲＡＮＫＬ（オリエンタル酵母株式会社販売）を含む破骨細胞の分化誘導用の１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地を３００μｌ／ウエルで添加した。さらに、この分化誘導用の培地には、表６に示す濃度となるように被験物質のアミノフェノキサジン－３－オンを加えて、培養を継続した。培養開始１４日後に、培養上清を全量除去後、実験５と同様に、破骨細胞を選択的に染色するＴＲＡＰ染色キットを用いて、各ウエルの細胞を染色し、顕微鏡下で、染色されたＴＲＡＰ陽性細胞数を計測した。結果を表６に併せて示す。陰性対照として、Ｍ－ＣＳＦのみを添加した培地及びＭ－ＣＳＦとｓＲＡＮＫＬとを添加した培地で同様に骨髄細胞を培養した。また、陽性対照として、骨粗鬆症治療剤として使用されているリセドロネート（Ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、ＬＫＴ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社販売）を、アミノフェノキサジン－３－オンに替えて添加し、同様に培養をおこなった。なお、培養は、３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ濃度の被験物質又は陽性対照を含む培地、或いは、陰性対照の培地による培地交換をおこないながら１４日間培養した。試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　表６から明らかなように、マウスマクロファージは、Ｍ－ＣＳＦのみの共存下では、ＴＲＡＰ陽性細胞への分化は認められず、Ｍ－ＣＳＦとｓＲＡＮＫＬとを共存（２－アミノフェノキサジン－３－オンの濃度０μＭ参照）させると、ＴＲＡＰ陽性細胞へ分化した。これに対して、Ｍ－ＣＳＦとｓＲＡＮＫＬと共に、２－アミノフェノキサジン－３－オンを添加した場合には、陽性対照として使用したリセドロネートを添加して培養した場合と同様に、Ｍ－ＣＳＦとｓＲＡＮＫＬとの共存下で培養した場合に比して、その濃度に依存したＴＲＡＰ陽性細胞数の増加の抑制が認められた。この結果は、２－アミノフェノキサジン－３－オンは、骨粗鬆症治療剤として使用されているリセドロネートと同様に、生理的なリガンドのｓＲＡＮＫＬの共存下で誘導される、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制できるので、骨芽細胞などが活性化されてＲＡＮＫＬの発現が過剰となった場合でも、慢性関節リューマチ、骨粗鬆症、歯周病等の骨代謝異常疾患における骨破壊を阻止できることを物語っている。また、２－アミノフェノキサジン－３－オンによるこの抑制効果は、市販の骨粗鬆症治療剤のリセドロネートよりも強いことを物語っている。
＜実験８：ＴＮＦ－α又はＩＬ－１による骨芽細胞活性化に及ぼす影響＞
　慢性関節リューマチや歯周病は、通常、炎症を伴っているので、その炎症部位では、活性化した滑膜細胞やＴ細胞から産生される炎症性サイトカイン（ＩＬ－１、ＴＮＦ－α）が分泌されて、骨芽細胞が活性化され、破骨細胞への分化に必須の生理的因子であるＲＡＮＫＬの発現が亢進すると共に、ＩＬ－６やＮＯの産生が亢進されている。この産生誘導されたＮＯは、軟骨細胞のアポトーシスを亢進したり、軟骨基質合成を低下させるので、炎症部位では軟骨の破壊が促進される。またＮＯにより単球／マクロファージが活性化され、破骨細胞へと分化が誘導され骨破壊（骨吸収）が進行する。さらにＴＮＦ－α自身による破骨前駆細胞から破骨細胞への直接の分化誘導の経路も存在する。このように、慢性関節リューマチでは、幾つかの経路が重なり合って骨破壊という病態が形成されるものと考えられている。そこで、ＴＮＦ－α又はＩＬ－１による骨芽細胞の活性化に及ぼす２－アミノフェノキサジン－３－オンの影響を調べる試験を、骨芽細胞として、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を使用して以下のようにおこなった。すなわち、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地にて５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製したものを９６穴マイクロプレート（ベクトンデキンソン社販売、商品名「マイクロテストＴＭ９６」）に５０μｌ／ウエルで添加した。次に表７又は８に示す濃度となるように、同培地で希釈した２－アミノフェノキサジン－３－オンを５０μｌ／ウエル添加した。さらに、同培地に溶解した組換型ヒトＴＮＦ－α又は組換型ヒトＩＬ－１βを１００μｌ／ウエル（各々の終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）添加して、５容量％ＣＯ２、３７℃で３日間培養した。陰性対照として培地のみ、或いは、ＩＬ－１β又はＴＮＦ－αのみを添加した培地を使用した。陽性対照として表７又は８に示す濃度のリセドロネートを、２－アミノフェノキサジン－３－オンに替えて添加して同様に培養をおこなった。培養後、上清中のＮＯ産生量をＧｒｉｅｓｓ試薬にて、ＩＬ－６産生量を特異的ＥＩＡにて測定した。細胞の増殖は、アラマーブルー原液を同培地にて４倍希釈したものを、１００μｌ／ウエル添加して、５容量％ＣＯ２、３７℃で２～３時間インキュベーションした後、５４４／５９０ｎｍの吸光度を測定した。試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。組換型ヒトＩＬ－１β共存下でのＮＯ産生量及びＩＬ－６産生量の測定結果を表７に、組換型ヒトＴＮＦ－α共存下での測定結果を表８に併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表７及び８から明らかなように、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞は、組換型ヒトＩＬ－１β又は組換型ヒトＴＮＦ－αのみの共在下（２－アミノフェノキサジン－３－オンの濃度０μＭ参照）で、ＮＯ及びＩＬ－６の産生が認められた。組換型ヒトＩＬ－１βと共に２－アミノフェノキサジン－３－オンを添加して培養した場合には、組換型ヒトＩＬ－１βのみを添加して培養した場合に比して、ＮＯ及びＩＬ－６の産生が強く抑制された。また、組換型ヒトＴＮＦ－αと共に２－アミノフェノキサジン－３－オンを添加して培養した場合には、組換型ヒトＴＮＦ－αのみを添加して培養した場合に比して、ＩＬ－６の産生が強く抑制された。陽性対照として使用したリセドロネートは、２μＭの添加の場合に、組換型ヒトＩＬ－１βとの共存下で誘導されるＮＯの産生を抑制したものの、抑制の程度は、２－アミノフェノキサジン－３－オンよりも弱かった。この結果は、２－アミノフェノキサジン－３－オンが、ＩＬ－１βにより、骨芽細胞が活性化されて産生するＮＯやＩＬ－６の産生や、ＴＮＦ－αによって誘導されるＩＬ－６の産生を効果的に抑制することにより、マクロファージから破骨細胞への分化誘導を抑制できることを物語っている。また、２－アミノフェノキサジン－３－オンによるこの抑制効果は、市販の骨粗鬆症治療剤のリセドロネートよりも強いことを物語っている。さらに、具体的なデータは示さないが、本実験で使用した２－アミノフェノキサジン－３－オンは、何れの濃度においても、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の生存率に影響を与えることはなかったことから、２－アミノフェノキサジン－３－オンの細胞毒性は弱いと判断した。
＜実験９：マウス脾臓マクロファージのＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－α共存下における破骨細胞への分化に及ぼす影響＞
　マクロファージから破骨細胞への分化誘導は、骨芽細胞による経路のみではなく、特に慢性関節リューマチや歯周病のような疾患では慢性的に産生されたＴＮＦ－αやＩＬ－１が、Ｍ－ＣＳＦの共存下で直接マクロファージに作用して破骨細胞へと分化を誘導する経路もあることが明らかとなっている。そこで、ＴＮＦ－α及びＭ－ＣＳＦ共存下におけるマクロファージからの破骨細胞への分化誘導に及ぼす２－アミノフェノキサジン－３－オンの影響を調べる試験を以下のようにおこなった。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢、日本チャールスリバー社販売）より、常法により脾臓細胞を採集し、α－ＭＥＭ培地にて２回洗浄後、１０％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地に浮遊させ、４８ウエルプレート（ベクトンデキンソン社販売、商品名「マルチウエルＴＭ４８ウエル」）に、６×１０４細胞／ウエルとなるように播種した。５容量％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベーションして、プレートに付着させたマウス脾臓マクロファージを、α－ＭＥＭ培地にて２回洗浄後、新鮮な１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地を２００μｌ／ウエルと、組換型ヒトＭ－ＣＳＦ（６０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏ　Ｔｅｃｈ社販売）を１００μｌ／ウエルとを添加した後、３７℃で５日間培養した。各ウエルの培養上清を完全に吸引除去して、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換型Ｍ－ＣＳＦと、２０ｎｇ／ｍｌの組換型ヒトＴＮＦ－αを含む１０容量％ＦＣＳ加α－ＭＥＭ培地を２００μｌ／ウエルで添加した。さらに、この培地中に、表９に示す濃度となるように被験物質として２－アミノフェノキサジン－３－オンを加えて、培養を１４日間継続した。陰性対照としてＭ－ＣＳＦとＴＮＦ－αを添加した培地で培養を１４日間継続した。培養上清を除去後、実験６と同様に、破骨細胞を選択的に染色するＴＲＡＰ染色キットを用いて、各ウエルの細胞を染色し、顕微鏡下で、染色されたＴＲＡＰ陽性細胞数を計測した結果を表９に併せて示す。陽性対照として、リセドロネートをアミノフェノキサジン－３－オンに替えて添加し、同様に培養をおこなった。なお、培養は、３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ濃度の被験物質又は陽性対照を含む培地、或いは、陰性対照の培地による培地交換をおこないながら１４日間培養した。試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　表９から明らかなように、マウス脾臓マクロファージは、Ｍ－ＣＳＦとＴＮＦ－αとの共存下（２－アミノフェノキサジン－３－オンの濃度０μＭ参照）で、ＴＲＡＰ陽性細胞へ分化した。これに対して、Ｍ－ＣＳＦとＴＮＦ－αと共に、２－アミノフェノキサジン－３－オンを添加した場合には、陽性対照として使用したリセドロネートを添加して培養した場合と同様に、Ｍ－ＣＳＦとＴＮＦ－αとのみの共存下で培養した場合に比して、その濃度に依存したＴＲＡＰ陽性細胞数の増加の抑制が認められた。この結果は、２－アミノフェノキサジン－３－オンは、陽性対照として使用したリセドロネートと同様に、ＴＮＦ－αなどの炎症性サイトカインにより誘導されるマクロファージの破骨細胞への分化を抑制できることを物語っている。なお、具体的なデータは示さないが、マクロファージ細胞株のＲＡＷ－２６４．７細胞を組換型ヒトＴＮＦ－αで刺激して、破骨細胞に分化誘導させる系においても、２－アミノフェノキサジン－３－オンは、リセドロネートと同様に、その濃度に依存したＴＲＡＰ陽性細胞数の増加の抑制が認められた。
＜実験１０：骨粗鬆症モデルマウスに及ぼす影響＞
　実験２乃至９において、２－アミノフェノール又はその誘導体が、骨形成の促進作用と骨破壊の抑制作用を併せ持つことが確認されたので、２－アミノフェノールの誘導体の及ぼす骨粗鬆症への影響を調べる試験を、骨粗鬆症モデルマウスを使用して以下のようにおこなった。すなわち、被験物質として１Ｎの塩酸１．５質量％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液に溶解した２－アミノフェノキサジン－３－オンを使用した。４０匹のｄｄｙマウス（８週齢、雄、日本チャールスリバー株式会社販売）を、ランダムに４群各１０匹に分けて、３群各１０匹の卵巣を摘出した。残りの１群１０匹は、対照１として、卵巣を摘出することなく開腹のみを実施した。卵巣を摘出した翌日から、２群各１０匹には２－アミノフェノキサジン－３－オンを、３ｍｇ／ｋｇ・体重又は１０ｍｇ／ｋｇ・体重のいずれかの量で、胃ゾンデを使用して、５回／週投与して、４週間飼育した。卵巣を摘出した残りの１群１０匹（対照２）及び対照１の１群１０匹には、１Ｎの塩酸１．５％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を、各々、胃ゾンデを使用して、５回／週投与して、４週間飼育した。卵巣摘出手術２９日後に、エーテル麻酔下で、腹大静脈から全採血した後、マウスを解剖して、右大腿骨を摘出した。この大腿骨を、７０容量％エタノールに一晩浸漬後、付着した筋肉などの組織を除去し、１１０℃のオーブンで一晩乾燥した。乾燥後の大腿骨をるつぼに入れ、９５０℃のオーブンで６時間加熱して灰化して、その質量を測定した。さらに、各マウスの大腿骨の骨灰分中のカルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、リン（Ｐ）量を、ＩＣＰ発光分析法（株式会社リガク販売、商品名「ＩＣＰ－ＡＥＳ　ＣＩＲＯＳ１２０」）により測定した。その結果を表１０に示す。また、採血した血液から血清を分離して、実験２と同じ方法で、血清中のオステオカルシン量を測定した結果を表１０に併せて示す。なお、マウスへの被験物質又は対照の投与は、全てのマウスに対して同じ日におこなった。
　表１０から明らかなように、卵巣を摘出していない開腹のみのマウス（対照１）に比べて、卵巣を摘出後、１Ｎの塩酸１．５質量％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を４週間胃ゾンデで投与したマウス（対照２）では、大腿骨の骨灰化質量、Ｃａ、Ｍｇ及びＰの含有量が何れも減少した。これに対して、卵巣を摘出後、２－アミノフェノキサジン－３－オンを、胃ゾンデで３ｍｇ／ｋｇ・体重又は１０ｍｇ／ｋｇ・体重投与したマウスでは、卵巣を摘出後、１Ｎの塩酸１．５％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を４週間胃ゾンデで投与したマウス（対照２）に比して、投与量に依存して、大腿骨の骨灰化質量、Ｃａ、Ｍｇ及びＰの含有量の減少が何れも抑制された。また、血清中のオステオカルシン量は、卵巣を摘出しない開腹のみのマウス（対照１）に比べて、卵巣を摘出後、１Ｎの塩酸１．５質量％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を４週間経胃ゾンデで投与したマウス（対照２）で、その濃度が低下した。これに対して、卵巣を摘出後、２－アミノフェノキサジン－３－オンを、胃ゾンデで３ｍｇ／ｋｇ・体重又は１０ｍｇ／ｋｇ・体重投与したマウスでは、卵巣を摘出後１Ｎの塩酸１．５質量％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を４週間胃ゾンデで投与したマウス（対照２）よりも、投与量に依存して、さらにその濃度が低下した。この結果は、２－アミノフェノキサジン－３－オンが、骨形成促進剤として骨粗鬆症などの骨代謝異常疾患の改善に優れた効果を発揮できることを物語っている。また、血清中のオステオカルシン量が、２－アミノフェノキサジン－３－オンの投与量に依存して減少することは、骨粗鬆症のエストロジェンによる治療の場合と同様に、オステオカルシンがカルシウムと結合して効率よく細胞に取り込まれて、骨形成が促進されていることを物語っている。なお、試験期間中、マウスの体重を計測したところ、試験期間を通じて、体重の増減に、４群間で差は認められず、２－アミノフェノキサジン－３－オンは経口摂取しても毒性の低い、安全な化合物であると判断した。
＜実験１１：コラーゲン産生に及ぼす影響＞
　骨形成には、骨や軟骨の基質としてコラーゲンが重要な役割を担っている。そこで、コラーゲン産生に及ぼす２－アミノフェノールの誘導体の影響を調べる試験を、２－アミノフェノールの誘導体として２－アミノフェノキサジン－３－オンを使用して、以下のようにおこなった。すなわち、１０容量％ＦＣＳ加ダルベッコのＭＥＭ培地（日本水産株式会社販売、以下、ダルベッコのＭＥＭ培地を「Ｄ－ＭＥＭ」と略記する。）にヒト胎児由来正常繊維芽細胞（倉敷紡績株式会社販売、細胞名「ＮＨＤＦ」）を５．０×１０５細胞／ｍｌとなるように浮遊させ、９６穴マイクロプレート（ベクトンデキンソン社販売）に、５０μｌ／ウエル添加して、３７℃、５容量％ＣＯ２下で１日間培養した。この各ウエルの培養上清を除去し、１００μＭのアスコルビン酸２－グルコシド（株式会社林原生物化学研究所販売、商品名「ＡＡ２Ｇ」）を含む１０容量％ＦＣ加Ｄ－ＭＥＭを１００μｌ／ウエルで添加した。さらに、被験物質として実験１で調製した２－アミノフェノキサジン－３－オンを４ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解した溶液を、１０容量％ＦＣＳ加Ｄ－ＭＥＭで希釈して、１００μｌ／ウエル添加して、各ウエルの最終濃度が表１１に示す濃度となるように調整した。３７℃、５容量％ＣＯ２下で３日間培養後、同じ組成の培地に交換して、さらに、３日間培養を継続した。この各ウエルのＮＨＤＦ細胞中のコラーゲン量を測定するために、培養上清を除去後、ペプシン（シグマ社販売）の１ｍＭ酢酸溶液（ペプシン濃度１ｍｇ／ｍｌ）を、５０μｌ／ウエル添加し、室温で４時間振とうして、ペプシン消化物を得た。この消化物をピペッティングして、１．５ｍｌ容の遠心用チューブに回収し、市販のコラーゲン定量キット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社販売、商品名「Ｓｉｒｃｏｌ　Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ」）の発色用試薬を２００μｌ／チューブ添加して、室温で３０分間、転倒混和した。混和後、遠心用チューブを、そのまま、４℃で１０分間遠心後（１５０００ｒｐｍ）、上清を除去し、１ＮのＮａＯＨを５０μｌ添加して沈殿を溶解して、５６０／６５０ｎｍの吸光度を測定した。標準品として既知量のコラーゲンを適宜希釈して、同様にペプシン消化し、同様に発色用試薬を加えて処理して、その吸光度を測定して標準曲線を作成した。この標準曲線に基づき、ＮＨＤＦ細胞中のコラーゲン量を計算した結果を表１１に併せて示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１１から明らかなように、２－アミノフェノキサジン－３－オンは、アスコルビン酸存在下でのコラーゲン産生を、濃度依存的に増強した。この結果は、２－アミノフェノール及びその誘導体は、骨や軟骨を構成するコラーゲンの産生を、アスコルビン酸の存在下で増強する作用を有する点からも、骨形成促進剤として優れていることを物語っている。なお、この実験で使用した濃度では、２－アミノフェノキサジン－３－オンのＮＨＤＦ細胞に対す細胞毒性は認められなかった。
　以上の実験結果は、２－アミノフェノールやその誘導体が、骨芽細胞を活性化して骨形成を促進すると共に、破骨細胞による骨吸収を抑制する作用を併せ持っているので、効果的に、骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少を抑制乃至骨量を増加させることができることを物語っている。また、２－アミノフェノールやその誘導体のもつ破骨細胞による骨吸収抑制は、ＲＡＮＫＬリガンドなどにより誘導されるマクロファージの破骨細胞への分化の抑制や、その分化を誘導する炎症性サイトカインの産生を抑制して、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制する作用によることを物語っている。さらに、２－アミノフェノールやその誘導体は、細胞毒性も弱いことから、骨形成促進剤、骨代謝改善剤、カルシウムの沈着促進剤、或いは、骨代謝異常疾患治療剤として有用であることを物語っている。
　以下、実施例で本発明の実施の形態を具体的に説明するが、本発明の技術範囲は、この実施例により、何ら限定的に解釈されるべきものではない。
＜骨形成促進剤＞
　無水結晶α－マルトース粉末（商品名『ファイントース』、株式会社林原商事販売）７５質量部に対して、実験１に記載の方法で合成した２－アミノフェノキサジン－３－オン、又は、その合成原料として使用した２－アミノフェノールを２５質量部の割合で添加して均一に混合して、粉末状の骨形成促進剤を調製した。本品は、そのままで、打錠して、カプセルに封入して、或いは、清涼飲料等に添加して利用することができる。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。
＜骨形成促進剤＞
　実施例１で使用した２－アミノフェノキサジン－３－オン２５質量部に替えて、実験３で合成した２－アミノフェノキサジン－３－オンの誘導体の２－アミノ－７－ヒドロキシ－フェノキサジン－３－オン、２－アミノ－７－メトキシ－フェノキサジン－３－オン、２－アミノ－３，４ジメトキシ－６，７－ジメトキシカルボニル－フェノキサジン－３－オン、２－（Ｎ－ヒドロキシ）アセチルアミノ－フェノキサジン－３－オン、又は、２－アミノ－１０－（Ｎ－４′－アミノブチル）－フェノキサジン－３－オンを２５質量部添加した以外は、実施例１と同じ方法で粉末状の骨形成促進剤を調製した。本品は、そのままで、打錠して、カプセルに封入して、或いは、清涼飲料等に添加して利用することができる。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。
＜骨形成促進剤＞
　実施例１又は２で調製した粉末状の骨形成促進剤のいずれか９９質量部に対して１質量部のシュガーエステルを添加し均質に混合し、常法により打錠して、一錠２００ｍｇ当り、２－アミノフェノキサジン－３－オン又はその誘導体を約５０ｍｇ、或いは、２－アミノフェノールを５０ｍｇ含む錠剤を得た。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。また、本品は、ＣＯＸ阻害活性及び一酸化窒素合成阻害活性を有していることから、経口投与により、リューマチ、胃炎などの各種炎症性疾患、癌、アルツハイマー病の治療又は予防剤、鎮痛剤や解熱剤としても利用できる。
＜骨形成促進剤＞
　下記の成分を配合し、粉末状の骨形成促進剤を得た。
実施例１又は２で調製した粉末状の骨形成促進剤　　　　　　　４１質量部
　のいずれか１種
ラクトスクロース（粉末、ラクトスクロース純度９０％）　　　　５質量部
粉飴　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４１質量部
糖転移アスコルビン酸（株式会社林原商事販売、　　　　　　　　１質量部
　商品名「アスコフレッシュ」）
コタラヒム抽出物粉末　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２質量部
ミネラル酵母（亜鉛、セレン、クロム、銅、マンガン、　　　　　１質量部
　モリブデン、ヨウ素含有）
カルニチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
ビタミンＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
ビタミンＤ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
塩酸チアミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
リボフラビン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
塩酸ピリドキシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
シアノコバラミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
酒石酸水素コリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
ニコチン酸アミド　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
パントテン酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
酢酸トコフェロール　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
コエンザイムＱ１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
α－リポ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
硫酸鉄　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
リン酸水素カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
アラビアガム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
　本品は、そのままで、打錠して、カプセルに封入して、或いは、清涼飲料などに添加して、骨形成促進剤として摂取することにより、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。また、本品は、血糖の上昇抑制剤、糖質や脂質の吸収抑制剤、糖や脂質の代謝改善剤として、生活週間病全般の予防や治療に利用することもできる。
＜骨形成促進剤＞
　以下の処方で歯磨を製造した。
不溶性メタリン酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　２６．０質量％
グリセリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５．０質量％
第２リン酸カルシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．０質量％
ラウリル硫酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　１．５質量％
トラガントガム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．４質量％
香料　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０質量％
実験１で製造した２－アミノフェノキサジン－　　　　　　　０．１質量％
　３－オン又は２－アミノフェノール
　（和光純薬工業株式会社販売）
サッカリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１質量％
銅クロロフィリンナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　１．０質量％
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２８．９質量％
　本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。
＜骨形成促進剤＞
　植物油２０ｇと２－アミノフェノキサジン－３－オン又は２－アミノフェノール０．５ｇとを加温下に混合して混和した。この混和した溶液に、精製卵黄レシチン０．６ｇ、及びグリセリン５．５ｇを添加し、加温しながら激しく撹拌して溶解した後、適量の蒸留水を加えポリトロンホモジナイザーで撹拌し乳化液を調製した。この乳化液をさらにマイクロフルイダイザーにより乳化した後、乳化液に蒸留水を加えて１００ｍｌとし、ポワサイズが０．４５μｍのフィルターで濾過することにより、２－アミノフェノキサジン－３－オン又は２－アミノフェノールを約４００μｇ／ｍｌ含む脂肪粒子が分散した注射剤を調製した。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。
＜骨形成促進剤＞
　２－アミノフェノキサジン－３－オン又は２－アミノフェノールを１５μｇ／ｍｌ、α，α－トレハロース（株式会社林原生物化学研究所製造、パイロジェンフリー）を１４０ｍｇ／ｍｌ、ツイーン２０を２ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩水に溶解して、常法により、精密濾過して滅菌して、１００ｍｌずつ分注し、パイロジェンフリーの液剤を得た。本品は、点滴液とし使用することができる。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。また、本品は、ＣＯＸ阻害活性及び一酸化窒素合成阻害活性を有していることから、リューマチなどの各種炎症性疾患、癌、アルツハイマー病の治療又は予防剤、鎮痛剤や解熱剤としても利用できる。
　叙述のとおり、２－アミノフェノール又はその誘導体は、前骨芽細胞を骨芽細胞に分化させて、該細胞へのカルシウム沈着を促進する。しかも、２－アミノフェノール又はその誘導体は、ＮＯ合成阻害作用、ＩＬ－６産生抑制及びＰＧＥ２合成阻害作用により、破骨細胞の活性を抑制して骨吸収を抑制する作用を有している。さらに、２－アミノフェノール又はその誘導体は経口或いは非経口的に摂取しても毒性が低く、長期間連用しても、安全なので、骨形成促進剤として有用である。

Claims (5)

  1. 　２－アミノフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する骨形成促進剤。
  2. 　骨芽細胞へのカルシウム沈着を増強する作用を有する請求の範囲第１項記載の骨形成促進剤。
  3. 　さらに、マクロファージ－コロニー刺激因子及びＬｉｇａｎｄ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｏｆ　ＮＦ－κＢ共存下で、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制する作用を有する請求の範囲第１項又は第２項記載の骨形成促進剤。
  4. 　２－アミノフェノール誘導体が２－アミノフェノキサジン－３－オン又はその誘導体であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の骨形成促進剤。
  5. 　請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の骨形成促進剤の破骨抑制剤、骨代謝改善剤、又は、骨代謝異常疾患治療剤としての使用。
     
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