WO2009076869A1

WO2009076869A1 - 高纯度丹酚酸、制备方法及应用

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Publication number: WO2009076869A1
Application number: PCT/CN2008/073365
Authority: WO
Inventors: Lichao Yuan
Original assignee: Lichao Yuan
Priority date: 2007-12-07
Filing date: 2008-12-05
Publication date: 2009-06-25

Description

说明书高纯度丹酚酸、制备方法及应用

技术领域

[1] 本发明涉及一种从中药材丹参中提取并分离丹酚酸 B的方法及丹酚酸 B的药物组合物。

背景技术

[2] 唇形科植物丹参（Salvia miltiorrWza

Bge) ，为多年生草本植物，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦的功效。现代临床中，广泛将其用于预防和治疗心脑血管疾病，肾病，肝病等中药药物组合物。因提取物中成分复杂，难于向世界推广。

[3] 丹酚酸 B是从丹参中分离得到的一种水溶性的酚酸类物质，其分子式为

C36H30O16, 分子量为 718.614。结构式见附图 1。

[4] 现有技术中的丹酚酸 B的提取和分离方法，是将药材粉碎成末或微波破壁或浸提或煎提，进一步通过大孔吸附树脂、聚酰胺层析等方法获得。现有技术的不足是得到的丹酚酸 B纯度都氐于 92%，获得 92%以上丹酚酸 B的步骤非常多，成本非常高，无法用于工业化生产，并且其中的有效成分以外的部分成分不明确，容易产生副作用。

对发明的公开

技术问题

[5] 本发明的目的是提供一种

丹酚酸 B的新制备方法，得到的丹酚酸 B，纯度高，成本氐适合工业化生产。技术解决方案

[6] 高纯度丹酚酸 B的制备方法，其组成包括：提取、

聚酰胺层析、收集，制成药用制剂，所述的提取是将中药材丹参粉碎，在 PH1 -7.0的条件下用水提取，所述的聚酰胺层析是，先用水和 PH1-4.8氐级醇分别除杂,再以 PH1-4.8的低级醇解吸，收集大于 98%丹酚酸 B的组分，减压浓缩，调 PH 值 3.5-6.5，提取液立刻过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集含丹酚酸 B的组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于 98%的丹酚酸8。

[7] 所述的高纯度丹酚酸 B的制备方法：

[8] a

. 所述的提取：第一次在去离子水 100度的条件下加入粉碎的丹参在 PH1-7.0的条件下提取 1小吋，用丹参重量 6倍量的水，然后再提取 2---4次，每次吋间 60分钟，用丹参重量 8倍量的水；提取液调 PH1-4.8;

[9] b.

所述的聚酰胺层析是提取液过滤后上聚酰胺柱，先用水除杂，再以氐浓度 PH1- 4.8的 C1—C5的低级醇除杂，以高浓度的 PH1-4.8的 C1—C5的低级醇解吸，分段收集纯度大于 98%丹酚酸 B的组分，减压浓缩，调 PH值 3.5-6.5;

[10] c所述的收集是将 b的提取液在立刻过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集含丹酚 B的组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于 98%的丹酚酸 B;

[11] 所述的步骤 b和 c的聚酰胺层析的过程中,通过薄层层析或 HPLC检测方法,检测解吸液中丹酚酸 B的含量。

[12] 所述的高纯度丹酚酸 B的制备方法，

所述的 C1-C5的低级醇为乙醇，所述的低浓度的 C1-C5的低级醇浓度为 10-80% ，所述的高浓度的 C1-C5的低级醇的浓度为 80-99.99%，所述的 PH值调节物质为无机酸或有机酸或酸性氨基酸或其混合物，或氢氧化钠或碳酸钠或碳酸氢钠

[13] —种

以上方法得到的高纯度丹酚酸 B制成的丹酚酸 B注射剂，其组成包括：丹酚酸 B 、药理作用的 pH调节物质、稳定剂，赋形剂，所述的丹酚酸 B的浓度：冻干粉针剂丹酚酸 B含量为每支 2mg-400mg，以干物质计为每支 3mg-1300mg,所述的 pH 调节物质为 pH值调节为 2.5到 6.5吋的加入量，赋形剂加入量为每支 0.05-0.7_g ，所述的稳定剂加入量为每支 10-800 mg。

[14] 所述的丹酚酸 B注射剂，所述的 pH调节物质是无机酸或酸性氨基酸或一种无机酸和一种酸性氨基酸的混合物。

[15] 所述的丹酚酸 B注射剂，所述的 pH调节物质无机酸为盐酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、马来酸、酸性缓冲盐；酸性氨基酸为 L-赖氨酸、 L-亮氨酸、 L-谷胱甘肽

[16] 所述的丹酚酸 B注射剂，所述的稳定剂为乙二胺四乙酸二钠、依地酸钙钠、亚硫酸氢钠、维生素 C、 D-异抗坏血酸、 L-半胱氨盐酸盐或氮气。

[17] 所述的丹酚酸 B注射剂，所述赋形剂为学 L糖或甘露醇或右旋糖酐。

[18] —种用所述的丹酚酸 B制备冻干粉针剂的方法

，取 pH调节物质，溶解于 5-40mr注射用水中，再将 10支量的

丹酚酸 B溶于上述溶液中，加入赋形剂 0.5-7克

，加入稳定剂 10m_g到 800m_g,然后再搅拌，用酸性物质调 pH至 2.5-6.5，用 0.01%-

0.5%针剂活性炭 60。c搅拌 20分钟，之后过滤，再补足注射用水至 10-60ml，并过 0.22 m m的膜制成 10支，灌装于西林瓶中，按冻干工艺冻干即可。

[19] 一种本方法制备的高纯度丹酚酸 B在制备治疗心脑血管疾病、肝病方面的药用固体制剂，片剂、胶囊、颗粒状药品方面的应用。

有益效果

[20] 在现有的技术中,含有丹酚酸 B的药品在中药组合物存在,一般的粗品丹酚酸 B的含量都在 80%以下,剩余的 20%的成分都说不清楚,也导致了临床应用吋产品的质量不稳定,副作用大,容易导致不良反应。

[21] 经临床医学证明，是其中的丹酚酸 B具有保护心脏、心血管等功能。

[22] 而本发明从植物中提取到丹酚酸 B单体纯度高,明确了有效药物成分，减少了毒副作用，为丹酚酸 B西药化生产提供了可行之路。

[23] 本发明釆用的溶剂价格氐廉,基本无毒，降氐了药品成本。工艺简单,设备投资少，得到的丹酚酸 B的纯度高,并且确定的工艺路线适合工业化生产。

[24] 本发明制成的药物制剂，成分清楚，质量可控，稳定性好，副作用小，适合临床广泛使用。

[25] 本发明的最终产品为丹酚酸 B单体制成的化学药品注射剂，具有高纯度、高药理活性、杂质少，副作用氐的特点，在临床使用方面比相应的中药复方制剂更有优势。

[26] 本发明与市场原有的中药复方制剂丹参注射液 (丹酚 B的含量氐于 50%) 相比较，其稳定性良好，质量可控,具体的比较内容见附表 0。

[27] 从表 0数据可以看出本发明的注射用丹酚酸 B在高温、光照条件下稳定性较好，含量没有变化；而市售丹参注射液小水针经高温和光照后含量下降明显。表明本品质量稳定性优于市售丹参注射液。因本品含量稳定，杂质氐，同吋也降氐了毒副作用。

[28] 本发明注射用丹酚酸 B的安全性试验：结果证实本品兔血管刺激性试验表明本品无刺激性；溶血凝集试验表明本品无凝血或溶血性，豚鼠过敏性试验表明：本品无过敏性，以上试验证明本品临床使用安全可靠。将本品于凉暗处放置 2年，进行各项指标的检测，结果均未见明显改变，本品在此工艺条件下稳定性良好，本品供动物肌内注射 lml经 1、 5、 24、 72小吋及 5-7天，观察刺激性和溶血性见表 1、表 2。

[29] 丹酚酸 B粉针剂对心肌缺血和梗塞的影响

[30] 试验所用丹酚酸 B粉针剂试样的主要成分为丹酚酸 B:

L-赖氨酸：依地酸钙钠:亚硫酸氢钠：甘露醇为 50: 25:1： 1： 200。

[31] 取健康杂种犬 36条，随机分为 6组，每组 6条，体重为 10至 12公斤，雌雄兼用。

[32] 参考临床使用的丹酚酸 B镁盐的临床使用剂量，丹酚酸 B的临床剂量为每次静脉注射 lOOmg, 按 70公斤体重计算，为每公斤 1.43m_g,按以上粉针剂中丹酚酸 B 的比率折算，故取氐剂量为每公斤 15m_g,中高剂量分别为每公斤 45和 150m_g。阳性对照品注射用丹参粉针 (哈药集团中药二厂生产)，临床推荐剂量为每天 400m_g ，相应的剂量为每公斤 5.7m_g,折算为狗的剂量为每公斤 10m_g,阳性对照药剂量相当于受试药的中剂量，所以是每公斤 30m_g;另外的阳性对照药物注射用盐酸地尔硫卓粉针（哈尔滨圣泰制药股份有限公司生产）的剂量为每公斤 0.5m_g。

[33] 动物称重后以 3%戍巴比妥钠静脉注射每公斤 30m_g麻醉。分离气管并***气管插管，接入麻醉呼吸机，等待开胸后进行机械通气，潮气量为 360到 500ml，呼吸频率为每分钟 14到 17次。然后沿胸骨左缘第 4肋间开胸,暴露心脏,剪开心包并做心包吊床。在左冠状动脉前降支第二至第三分支间游离冠状动脉,并在其下穿二根丝线,备用于两根结扎。在心脏表面放置 30点心外膜电极并把电极四角用心血管无损伤连线缝合针缝合于心脏表面,四肢经针形电极链接 30点心外膜电极经多导转换开关连至生理记录仪记录 30点外膜心电图,心外膜电图定标为每 mv为 1 mm,记录速度每秒 lk。釆用 Harris两步结扎法:首次结扎前 2分钟,从股静脉注射利多卡因每公斤 5m_g预防心率失常。在结扎吋将一段直径 lmm的钢丝***第一松结内,将钢丝与冠状动脉一起结扎，而后抽出钢丝。 30分钟后完全结扎第二结。记录完全结扎后 lOm i的心外膜电图作为用药前对照值,而后从股静脉注射药物,注射吋间为 1分钟,阴性对照组注射同体积生理盐水。分别在给药后 10min,30min,60 min,90min,120min,180min记录心外膜电图的变化。心外膜电图观察指示:以 ST 段升高 2mV以上的导联数 (N-ST)和 ST段升高值得总和为指标观察给药前后的变化,并计算心肌缺血程度和范围。以用药后不同吋间实测值与用药前进行比较,以用药后不同吋间变化百分率 (用药前为 100%)进行组间比较。结扎 3小吋后取心脏，称取全心的重量;切去心房及右心室,称出左心室的重量,并在冠脉结扎线下,平行于***将左心室切成等厚的 5片,用生理盐水洗净,置 0.05%氯化硝基四氮唑蓝液 37度染色 30分钟。染色过程中不吋摇动染色液使之与心肌充分接触。染色后立即用水冲去多余的染料,梗死区不着色,非梗死区着暗蓝色,剪去着色的部分,将未着色的梗死区称重,计算出梗塞区重量占全心及左心室的百分比。

[34] 冠脉结扎前及给药后 3小吋各取右心室血 3ml,3000rpm离心 20分钟,取血清检测 L DH.LDH的测定釆用学 L酸脱氢酶测试盒的方法,在分光光度计上进行，吸收波长 44 Onm。

[35] 观察犬心外膜心电图,定量组织学和 LDH测定。观察吋间为给药后 0到 3小吋。

[36] 分析：

[37] 1. 丹酚酸 B粉针剂对心肌缺血程度的影响:冠脉结扎后 lOmhi,各组心外膜电图 ST段总和明显升高。生理盐水组 120min吋 ST段总和升高达 27.5±11.1 %;静脉给药后,该粉针剂可剂量依赖性地减轻心肌缺血程度, ST段总和显著下降 (P<0.01),作用从给药 lOmin持续至 180min,各吋间与生理盐水组比较均有显著差异 (P<0.01),其中 120min吋,丹酚酸 B每公斤

15、 30、 150mg组分别比 Ornin降低 27.4±6.3%

、 46.5±36.7%和 41.0±20.0%。阳性对照组注射用丹参和注射用盐酸地尔硫卓在给药后 lOmin直至 180min,ST段总和均下降，与生理盐水组同吋间点比较差异显著（P<0.01) 。

[38] 实验结果表明，丹酚酸 B粉针剂静脉注射对狗冠脉结扎引起的急性心肌缺血程度有显著的治疗作用。

[39] 1. 2.丹酚酸 B粉针剂对心肌缺血范围的影响。

[40] 丹酚酸 B粉针剂可剂量依赖性的缩小心肌缺血范围，降低 N-ST值，作用可以持续 180min。低剂量组每公斤 15mg各吋间 N-ST值降低率与生理盐水组同吋点比较，无显著差异；中剂量组每公斤 45m_g在 10、 30、 60min吋差异非常显著（P<0 .05) ，在 90、 120、 180、 min吋差异非常显著;高剂量组 (150mg/kg) 各吋间点降氐心肌缺血范围与生理盐水组比较，均有显著差异（P<0.01) 。阳性对照组注射用丹参和注射用盐酸地尔硫卓组在给药后 lOmin心肌缺血范围与生理盐水组同吋间点比较显著下降 (P<0.05)。

[41] 实验结果表明，丹酚酸 B粉针剂在 15-150mg/k_g静脉注射能显著降氐心肌缺血范围。

[42] 1. 1.

丹酚酸 B粉针剂对心肌梗塞范围的定量组织学检测的影响：用定量组织学检测心肌梗塞范围即用 NBT染色显示丹酚酸 B对心肌梗塞范围的影响与心外膜电图测的结果一致。丹酚酸 B粉针剂在静脉注射每公斤 15-150m g可剂量依赖性的减少心肌梗塞范围。丹酚酸 B粉针氐剂量组（每公斤 15 mg) 梗塞区与全心得比值和梗塞区与左心室的比值同生理盐水组相比较下降显著（P<0.05) ，中高剂量组（每公斤 45、 150mg) 的比值下降非常显著（P<0.01) 。阳性对照组注射用丹参和注射用盐酸地尔硫卓均能非常显著地缩小心肌梗塞范围（P<0.01) 。

[43] 丹酚酸 B粉针剂对冠脉结扎后血清 LDH的影响：冠脉动脉结扎后各组血清 LDH 均升高。丹酚酸 B粉针氐、高剂量组（每公斤 15、 150mg) 血清 LDH给药后与给药前的比值与生理盐水组相比显著的下降（P<0.05) ，中剂量组（每公斤 45m_g) 血清 LDH给药后与给药前的比值与生理盐水组相比下降非常显著（P<0.01) 。阳性对照组注射用丹参和注射用盐酸地尔硫卓均能显著降氐血清 LDH比值（P< 0.05) 。 [44] 结论：我们釆用麻醉犬的冠脉前降支结扎，造成急性心肌缺血模型。经静脉注射不同剂量的丹酚酸 B粉针剂容液，釆用心外膜电图检测心肌缺血程度及范围，用定量组织学指标测定心肌梗塞范围。结果显示：丹酚酸 B粉针剂静脉注射可显著降氐冠脉结扎犬的心肌缺血程度，缩小心肌缺血的范围，作用的强度与应用剂量有一定的关系，用定量组织学检测与用心外膜电图检测的结果一致，与生理盐水对照组比较，心肌梗塞区范围显著的缩小，证明丹酚酸 B粉针剂静脉注射对犬冠状动脉结扎引起的心肌梗死有明显的治疗作用。本实验结果还表明，丹酚酸 B粉针剂能显著降低血清 LDH的比值，减少急性缺血心肌细胞 LDH的溢出，表明该粉针剂对心肌细胞有保护作用。

[45] 丹酚酸 B粉针剂对大鼠脑缺血的影响：

[46] 试验所用丹酚酸 B粉针剂试样的主要成分为丹酚酸 B:L-赖氨酸：依地酸钙钠:亚硫酸氢钠：甘露醇为 50: 25:1： 1： 200。

[47] 丹酚酸 B粉针剂对大鼠局灶性脑缺血的影响：

[48] 取雄性大鼠 63只，体重 240-280_g，随机分为 7组，分别为：假手术对照组；脑缺血模型组；丹酚酸 B粉针剂小剂量组 6mg/k_g; 丹酚酸 B粉针剂中剂量组 12mg/k g; 丹酚酸 B粉针剂大剂量组 24mg/k_g (以上 3组均为静脉给药）；丹酚酸 B粉针剂灌胃给药对照组：灌胃给药 12mg/k_g; 金纳多注射液阳性对照组 18mg/k_g，相当于人临床用药等效剂量 2倍量（成人用药量为 lOOmg/日，按体表面积比值折算，大鼠用药的等效剂量为 100x0.018x5 = 9mg/k_g) 。灌胃组灌胃给药，每日 1次，连续 3天；其余各组静脉注射给药，假手术对照组及脑缺血模型组给予生理盐水。末次给药后 30分钟，参照 Longa等人的方法釆用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO) 模型。大鼠用 10%水合三氯乙醛（300mg/kg) ίρ麻醉，仰卧恒温手术台上颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，向外牵引二腹肌及胸锁学 L突肌，由颈总动脉分叉处向头端依次游离，结扎并剪短颈外动脉的分支：枕骨下动脉和甲状腺上动脉，在颈外动脉远端结扎，切断颈外动脉使其主干游离备用，然后分离颈内动脉，用丝线在颈外动脉根部打一松扣，夹闭颈总动脉和颈内动脉。将尼龙线经颈外动脉主干切口，缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进 20mm左右吋感到阻力，即达到了较细的大脑前动脉内，阻断了 MCA的所有血供来源，扎紧颈外动脉根部松扣。 1小吋后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端。缝合皮肤，完成 MCAO导致局灶性脑缺血-再灌模型。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞 MCA。

[49] 术后 24小吋后按 Bederson的方法对动物的行为缺陷进行分级评分，标准

[50] 如下： 0级：未观察到神经症状。 1级：提尾悬空吋，动物的手术对侧前肢表现为腕肘屈曲，肩内旋，肘外展，紧贴胸壁。 2级：将动物置于平滑平面上，推手术侧向对侧移动吋，阻力降氐。 3级动物自由行走吋向手术对侧环转或转圏。

4级：软瘫，肢体无自发活动。

[51] 动物评分后，腹主动脉取血，断头取出大脑，称重，手术显微镜下确认中 [52] 动脉已阻断后，平均分成 5个脑片，置 TTC染液中 37。c避光温孵， 10%甲醛固定 24h后，根据重量法计算出梗塞部重量占脑组织重量的百分比，作为脑梗塞范围大小的指标。测定血清 SOD活性及 MDA含量（比色法），第二脑片组织常规脱水，石蜡包埋制片， HE染色，光学显微镜下观察病理组织学。

[53] 结论：通过以上实验数据和附表中的数据可以证明：丹酚酸 B粉针剂能降氐局灶性脑缺血模型大鼠梗塞范围，改善大鼠由于脑缺血所致的神经行为障碍。能升高血清 SOD活性及降氐 MDA含量。能减轻脑缺血大鼠脑组织的病理损伤。说明对大鼠脑缺血缺氧有一定的保护作用。

附图说明

[54] 附图 1是本发明的丹芬酸 B的结构式。

[55] 附图 2和附图 3是说明发明效果的表格。

本发明的最佳实施方式

[56] 取丹参药材 1000g粉碎,加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用丹参重量 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用丹参重量 3倍的水。提取液滤过，调 PH至 3，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质,，再用 10、 20 、 50%的 PH4乙醇除杂,用 95%的 PH4乙醇解吸，得到含丹酚酸 B的成分，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，调 PH至 4.8。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到高纯度的丹酚本发明的实施方式

[57] 实施例 2:

[58] 取丹参药材 1500g粉碎，

加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 3次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤,调 PH至 2使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质,再用 30、 60%的 PH4.8乙醇除杂,用 90%的 PH4.8乙醇解吸，得到含丹酚酸 B的成分，分段收集纯度大于 98%的部分，减压浓缩，调 PH至 5。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到高纯度的丹酚酸 B。

[59] 实施例 3

[60] 取丹参药材 2000g粉碎，

加去离子水在 100。c微沸的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤,调 PH至 4，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质，再用 50、 60%的 PH3乙醇除杂，用 95%的 PH3乙醇解吸，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，调 PH至 4.8。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到高纯度的丹酚酸 B。

[61] 实施例 4:

[62] 取丹参药材 1500g粉碎，

加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 3.5，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质,再用 10、 60%的 PH3.6乙醇除杂，用 95%的 PH3.6乙醇解吸，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，调 PH至 4.0。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到纯度为 99.2%的丹酚酸8。

[63] 实施例 5:

[64] 取丹参药材 lOOOg粉碎，

加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 4次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 4.5，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质，再用 40%的 PH4乙醇除杂，用 90%的 PH4.5乙醇解吸，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，调 PH至 5.0。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到纯度为 99%的丹酚酸8。

[65] 实施例 6:

[66] 取丹参药材 lOOOg粉碎，加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 4.8，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质,再用 20%的 PH3乙醇除杂，用 PH3无水乙醇解吸，分段收集纯度大于 98%的部分，减压浓缩，调 PH至 5.5。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到纯度为 98.7%的丹酚酸8。

[67] 实施例 7:

[68] 取丹参药材 1000g粉碎，加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 2，使用聚酰胺柱层析,以水洗脱去杂质，再用 30%的 PH2.5乙醇除杂，用 PH2.5无水乙醇解吸，分段收集纯度大于 98%的部分，减压浓缩，调 PH至 6.0。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到纯度为 99%的丹酚酸8。

[69] 实施例 8:

[70] 取丹参药材 1000g粉碎，加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 3，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质，再用 20%的 PH4乙醇除杂，用 95%PH4乙醇解吸，分段收集纯度大于 98%的部分，减压浓缩,得到的溶液用 2% 的 NaOH调 PH为 6。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，立即冷冻干燥，得到纯度为 98.3%的丹酚酸8。

[71] 实施例 9:

[72] 取丹参药材 1000g粉碎，加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 3，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质，再用 50%的 PH3乙醇除杂，用 95%PH3.5乙醇解吸，分段收集纯度大于 98%的部分，减压浓缩,得到的溶液用 2 %的 ₃011调 PH为 6。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，立即冷冻干燥，得到纯度为 98.6%的丹酚酸8。

[73] 实施例 10:

[74] 取丹参药材 lOOOg粉碎，加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 3.1，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质,再用 10、 20%的 PH2乙醇除杂，用 95%PH2乙醇解吸，分段收集纯度大于 99%的部分，减压浓缩,得到的溶液用 2%的 NaOH调 PH为 6。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5 %的部分，减压浓缩，立即冷冻干燥，得到纯度为 99.3%的丹酚酸8。

[75] 实施例 11:

[76] 取丹参药材 1000g粉碎，

加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 3.1，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质，用 10%的 PH3乙醇除杂，再用 20%的 PH3乙醇除杂，再用 50%的 PH3乙醇除杂，用 95%PH3乙醇解吸，分段收集纯度大于 99%的部分，减压浓缩,得到的溶液用 2%的 NaOH调 PH为 6。浓缩液过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，立即冷冻干燥，得到纯度为 99.3% 的丹酚酸8。

[77] 实施例 12:

[78] 取丹参药材 1000g粉碎，加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 4，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质，再用 20%、 30% . 60%的 PH4 .8乙醇除杂，用 95%PH4乙醇解吸，分段收集纯度大于 98%的部分，减压浓缩，得到的溶液用 2%的 NaOH调 PH为 6。浓缩液过葡聚糖凝胶柱，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，立即冷冻干燥，得到纯度为 98.3%的丹酚酸8。 [79] 实施例 13:

[80] 取丹参药材 lOOOg粉碎，加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 2，使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质，再用 10%、 30% . 60%的 PH4 乙醇除杂，用 PH4无水乙醇解吸，分段收集纯度大于 98%的部分，减压浓缩，调 PH至 5.5。浓缩液过葡聚糖凝胶柱，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩,，冷冻干燥后，得到纯度为 98.7%的丹酚酸8。

[81] 实施例 14:

[82] 取丹参药材 1500g粉碎，加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 3次，每次 40分钟，用 3倍的水。提取液过滤，调 PH至 2，使用聚酰胺柱层析,以水洗脱去杂质，再用 20%、 30% . 60%的 PH2 乙醇除杂，用 90%的 PH2乙醇解吸,得到含丹酚酸 B的成分，分段收集纯度大于 9 8%的部分，减压浓缩，调 PH至 5。浓缩液过葡聚糖凝胶柱，分段收集纯度大于 9 8.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到高纯度的丹酚酸 B。

[83] 实施例 15:

[84] 取丹参药材 1000g粉碎,加去离子水在 100。c的条件下加热提取 1小吋，用丹参重量 5倍的水，然后在 PH4.8的条件下煎提 2次，每次 40分钟，用丹参重量 3倍的水。提取液滤过，调 PH至 3,使用聚酰胺柱层析，以水洗脱去杂质，再用 10%、 20 %、 70%的 PH3乙醇除杂，用 95%的 PH3乙醇解吸,得到含丹酚酸 B的成分，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，调 PH至 4.8。浓缩液过葡聚糖凝胶柱，分段收集纯度大于 98.5%的部分，减压浓缩，冷冻干燥后，得到高纯度的丹酚酸 B。

[85] 实施例 16: 所有步骤用 PH调节物质调至 ΡΗ1—6.5。

[86] 实施例 17:

[87] 注射用丹酚酸 B，

其制备工艺为：取亚硫酸氢钠 0.01_g溶解于 15ιηΓ注射用水中，加入乙二胺四乙酸二钠 10m_g、维生素 C 0.05_g溶解混匀，再将丹酚酸 B

0.05_g溶于上述溶液中，再加入甘露醇 0.5_g，并加适量稀盐酸溶液调 pH2.5，再加 0.01%针剂活性炭 60 ° c搅拌 20分钟，之后过滤，再补足注射用水至 30ml并过 0.22 m m的膜制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[88] 实施例 18:

[89] 注射用丹酚酸 B，

其制备工艺为：取亚硫酸氢钠 O.Olg溶解于 12mr注射用水中，加入乙二胺四乙酸二钠 10m_g、维生素 C 0.05_g溶解混匀，再将丹酚酸 B

O.lg溶于上述溶液中，再加入甘露醇 1.0g，并加适量稀盐酸溶液调 pH2.5，再加 0. 01%针剂活性炭 60。c搅拌 20分钟，之后过滤，再补足注射用水至 15ml并过 0.22 m m的膜制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[90] 实施例 19:

[91] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B，取亚硫酸氢钠 0.02_g，维生素 C

0.2g, 乙二胺四乙酸二钠 5m_g溶解于 15mr注射用水中，再将丹酚酸 B

0.3g溶于上述溶液中，再加入右旋糖酐 2.0g，并用适量稀磷酸调 pH3.0，再加 0.05 %针剂活性炭 60。c搅拌 20分钟，过滤补注射用水至全量 20ml，并过 0.22 m m 膜，制成 10支。灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[92] 实施例 20:

[93] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B，依地酸钙钠 20m_g， D-异抗坏血酸 0.5_g溶解于

20mr注射用水中，再将丹酚酸 B

0.5_g溶于上述溶液中，再加入学 L糖 3.0g，并用 L-半胱氨酸盐酸盐溶液及 O.lmol/ L的稀盐酸溶液调节 pH至 3.5，再加 0.2%针剂活性炭 60。c搅拌 20分钟，过滤补注射用水至全量 25ml，并过 0.22 m m

膜，制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[94] 实施例 21:

[95] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B，取亚硫酸氢钠 0.02_g，依地酸钙钠 20m_g， L- 赖氨酸 0.5_g溶解于 25mr注射用水中，再将丹酚酸 B

lg溶于上述溶液中，加入甘露醇 4.0g，并用适量枸橼酸溶液调 pH至 4.0，再加 0.3 %针剂活性炭 60。c搅拌 20分钟过滤，补注射用水至全量 30ml，并过 0.22 m m 膜，制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。 [96] 实施例 22:

[97] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B，取亚硫酸氢钠 0.04_g， D-异抗坏血酸 0.5_g， L- 谷胱甘肽 0.2_g，依地酸钙钠 20m_g，溶解于 30ιηΓ注射用水，再将丹酚酸 B lg溶于上述溶液中，加入学 L糖 5_g，并用适量枸橼酸溶液调 pH至 4.5，再加 0.4% 针剂活性炭 60。 c搅拌 20分钟，过滤，补注射用水至全量 40ml，并过 0.22 m m 膜，制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[98] 实施例 23:

[99] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B， L-亮氨酸 0.2_g，维生素 C

0.5g, 依地酸钙钠 50m_g溶解于 50ιηΓ注射用水中，再将丹酚酸 B

1.5_g溶于上述溶液中，并加入甘露醇 6g，并用适量枸橼酸溶液调 pH至 5.0，再加 0 .05%针剂活性炭 60。c搅拌 20分钟，过滤，补注射用水至全量 50ml，并过 0.22 m m膜，制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[100] 实施例 24:

[101] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B，取亚硫酸氢钠 0.05_g，依地酸钙钠 30m_g，维生素 C l_g，溶解于 30ml注射用水，再将丹酚酸 B

1.5_g溶于上述溶液中，加入右旋糖酐 5_g，并用适量酒石酸溶液调 pH至 5.5，再加 0 .1%针剂活性炭 60 ° c搅拌 20分钟， 0.22 m m

膜过滤，补注射用水至全量 50ml，制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[102] 实施例 25:

[103] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B，取亚硫酸氢钠 0.04_g，依地酸钙钠 20m_g， D- 异抗坏血酸 0.5_g溶解于 40ιηΓ注射用水中，再将丹酚酸 B

2g溶于上述溶液中，再加入学 L糖 3.0g，并用 L-半胱氨酸盐酸盐溶液及 O.lmol/ L的稀盐酸溶液调节 pH至 3.5，再加 0.2%针剂活性炭 60 ° c搅拌 20分钟， 0.22 m m 膜过滤补注射用水至全量 60ml，制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[104] 实施例 26:

[105] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B，取亚硫酸氢钠 0.08g，依地酸钙钠 40m_g， D- 异抗坏血酸 lg溶解于 8Ο111Γ注射用水中，再将丹酚酸 B

4g溶于上述溶液中，再加入学 L糖 6.0g，并用 L-半胱氨酸盐酸盐溶液及 O.lmol/ L的稀盐酸溶液调节 pH至 3.5，再加 0.2%针剂活性炭 60 ° c搅拌 20分钟， 0.22 m m 膜过滤补注射用水至全量 120ml，制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[106] 实施例 27:

[107] 实施例 17所述的注射用丹酚酸 B，取亚硫酸氢钠 0.05_g，依地酸钙钠 30m_g，维生素 C l_g，溶解于 60ml注射用水，再将丹酚酸 B

3g溶于上述溶液中，加入右旋糖酐 5_g，并用适量酒石酸溶液调 pH至 5.0，再加 0.1 %针剂活性炭 60 ° c搅拌 20分钟， 0.22 m m

膜过滤，补注射用水至全量 100ml, 制成 10支，灌装于西林瓶中按冻干工艺冻干即可。

[108] 实施例 28:

[109] 丹酚酸 B片，其制备工艺为：丹酚酸 B 500g，亚硫酸氢钠 5_g，

交联聚乙烯吡咯垸酮 20g，聚维酮 40g，淀粉 60g，加水适量混合制粒，再加硬酯酸镁 2_g，压制成 1000片，包薄膜衣，即得成品。

[110] 实施例 29:

[111] 丹酚酸 B胶囊，其制备工艺为：丹酚酸 B 400g，亚硫酸氢钠 4_g，孚 L糖

80g, 羧甲基淀粉钠 5_g，羟丙基纤维素 5_g， 5%聚乙烯吡咯垸酮

适量制粒，以 50%聚乙二醇乙醇液包衣，装胶囊制成 1000粒，即得成品。

Claims

权利要求书

[1] 1.一种高纯度丹酚酸 B的制备方法，其组成包括：提取、

聚酰胺层析、收集，制成药用制剂，其特征是：所述的提取是将中药材丹参粉碎，在 PH1-7.0

的条件下用水提取，所述的聚酰胺层析是，先用水和 PH1-4.8的氐级醇分别除杂再以 PH为 1-4.8的氐级醇解吸，收集大于 98 %丹酚酸 B的组分,减压浓缩，调 PH值 3.5-6.5，提取液立刻过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集含丹酚酸 B的组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于 98% 的丹酚酸8。

[2] 2.根据权利要求 1所述的高纯度丹酚酸 B的制备方法，其特征是：

a. 所述的提取为第一次在去离子水 100。c的条件下加入粉碎的丹参在 PH

1至 7.0的条件下提取 1小吋，用丹参重量 6倍量的水，然后再提取 2至 4 次，每次吋间 60分钟，用丹参重量 8倍量的水；提取液调 PH 1至 4.8 b.

所述的聚酰胺层析是提取液过滤后上聚酰胺柱，先用水除杂，再以低浓度的 PH

1至 4.8的 C1到 C5的低级醇除杂，以高浓度的 PH

1至 4.8的 C1到 C5的低级醇解吸，分段收集纯度大于 98%丹酚酸

B的组分，减压浓缩，调 PH值 3.5到 6.5;

c

所述的收集是将 b的提取液立刻过葡聚糖凝胶柱过滤，分段收集含丹酚 B的组分，减压浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于 98%的丹酚酸 B ; 所述的步骤 b和 c的聚酰胺层析的过程中,通过薄层层析或 HPLC检测方法,检测解吸液中丹酚酸 B的含量。

3.根据权利要求 1或 2所述的高纯度丹酚酸 B的制备方法，其特征是：所述的 C1至 C5的低级醇为乙醇，所述的低浓度的 C1至 C5的低级醇浓度为 10-80% , 所述的高浓度的 C1至 C5的低级醇的浓度为 80-99.99%，所述的 P H值调节物质为无机酸或有机酸或酸性氨基酸或其混合物，或氢氧化钠或碳酸钠或碳酸氢钠。

4.一种

以上方法得到的高纯度丹酚酸 B制成的丹酚酸 B注射剂，其组成包括：丹酚酸15、药理作用的 pH调节物质、稳定剂，赋形剂，其特征是：所述的丹酚酸 B的浓度：冻干粉针剂丹酚酸 B含量为每支 2m_g至 400m_g，以干物质计为每支 3mg-1300mg,所述的 pH调节物质为 pH值调节为 2.5到 6.5吋的加入量，赋形剂加入量为每支 0.05-0.7_g，所述的稳定剂加入量为每支 10-800 mg

5.

根据权利要求 4所述的丹酚酸 B注射剂，其特征是：所述的 pH调节物质是无机酸或酸性氨基酸或一种无机酸和一种酸性氨基酸的混合物。

6.根据权利要求 4或 5

所述的丹酚酸 B注射剂，其特征是：所述的 pH调节物质无机酸为盐酸、磷酸、枸橼酸、酒石酸、马来酸、酸性缓冲盐；酸性氨基酸为 L-赖氨酸、 L- 亮氨酸、 L-谷胱甘肽。

7.根据权利要求 4或 5

所述的丹酚酸 B注射剂，其特征是：所述的稳定剂为乙二胺四乙酸二钠、依地酸钙钠、亚硫酸氢钠、维生素 C、 D-异抗坏血酸、 L-半胱氨盐酸盐或氮气。

8.根据权利要求 4或 5

所述的丹酚酸 B注射剂，其特征是：所述赋形剂为学 L糖或甘露醇或右旋糖酐。

9 . 一种用所述的丹酚酸 B制备冻干粉针剂的方法

，其特征是：取 pH调节物质，溶解于 5至 40ml注射用水中，再将 10支量的丹酚酸 B溶于上述溶液中，加入赋形剂 0.5至 7克

，加入稳定剂 10m_g至 800mg,然后再搅拌，用酸性物质调 Ph到 2.5至 6.5，用 0.01%至 0.5%针剂活性炭 60 ° c搅拌 20分钟，之后过滤，再补足注射用水至 10到 60ml，并过 0.22 m m

的膜制成 10支，灌装于西林瓶中，按冻干工艺冻干即可。

10.

一种本方法制备的高纯度丹酚酸 B在制备治疗心脑血管疾病、肝病方面的药用固体制剂，片剂、胶囊、颗粒状药品方面的应用。