WO2009063722A1 - ヒトチトクロームp450遺伝子（クラスター）を含む哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物 - Google Patents

ヒトチトクロームp450遺伝子（クラスター）を含む哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒト哺乳動物 Download PDF

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Mitsuo Oshimura
Yasuhiro Kazuki
Takashi Matsuoka
Kazuma Tomizuka
Takeshi Oshima
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    • C12N2800/208—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of mammalian origin, e.g. minichromosome

Definitions

  • the present invention relates to a mammalian artificial chromosome vector that retains the human chromosome 7 fragment containing the cytochrome P450 light gene and is capable of transmitting offspring.
  • the present invention also relates to a non-human mammal carrying the above vector, such as a mouse, its cell, organ or tissue.
  • the present invention further relates to a method for producing cytochrome P450, or a method for testing the pharmacological action and / or metabolism of a drug or food using the non-human mammal, its cells, organs or tissues.
  • P450J cytochrome P450
  • P450J cytochrome P450
  • P450s with homology of more than 40% are classified as the same family, and those that show 55% or more amino acid homology within the same family are classified as sub-family (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 1 when human and rat P450s are compared, there are differences in properties, and there may be differences in the substances and metabolites that serve as the substrate. This information cannot be applied to humans as it is, and the development of a test system that accurately predicts drug price in humans is desired (Non-patent Document 2).
  • Non-Patent Document 3 an in vitro system has been established in order to examine the effects of drugs metabolized and activated by P450 on the living body. This is to examine the effects of metabolites metabolized extracellularly on the cells by adding liver microsomes and drugs to the cell culture medium. In this case, the activated substance adsorbs to the cell membrane and reaches only a part of the cell.
  • Non-patent Document 4 it is considered that the effects of metabolites on cells cannot be accurately grasped.
  • the cell itself expresses P450, it is thought that the invading drug is activated inside the cell without adsorbing to the cell membrane, and the effects of metabolites such as toxicity can be appropriately reproduced. From this point of view, it is desirable to use cells into which the human P450 gene has been introduced for the toxicity evaluation of metabolites (Non-patent Document 4).
  • Non-Patent Document 7 a system using insect cells and baculovirus (for example, Non-Patent Document 7) has a high expression level and does not require modification of the N-terminal amino acid, but requires a few thousand skills in the operation for expression.
  • Systems that use HepG2 cells derived from human liver cancer and vaccinia virus eg, Non-patent Document 8
  • Systems that use human B lymphocytes may use human cells, and P450 is closer to the in vivo environment. Although it is considered to be expressed in a state, safety considerations are necessary when using the vaccinia virus or when using the HepG2 cell Mikuguchisome (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 9 The biological role and control of drug-metabolizing enzymes has not yet been fully elucidated. Experimental systems using these animal cells, yeast, insects, and bacteria can be models for studying the role of P450 in drug metabolism and chemical carcinogenesis in vitro. It must be used based on the fact that it does not adequately reflect the in-vivo state due to other parameters such as the above parameters (Non-patent Document 9). However, if the human P450 gene is introduced and experimental animals that produce the same metabolites as humans in the body can be produced, even those metabolites that are specifically produced in humans are not only toxic but also toxic. The major advantage is that it can be verified using animals (Non-patent Document 10). For this reason, research has been conducted on transgenic mice introduced with the P450 gene.
  • Non-patent Document 11 Ramsden et al. (Non-patent Document 11) created a transgenic mouse into which the rat Cyp2B2 gene was introduced. It is known that the expression of rat Cyp2B2 gene is regulated in a tissue-specific and development-specific manner, and its expression is induced by funnobarbital. It was shown that the 800 bp promoter sequence alone is insufficient for the induction of transgene expression by phenovalpital in transgenic mice, and that further upstream gene sequences are required. In addition, the control of transgene expression requires a sequence several tens of kilobases upstream of the transcription start point, indicating that it is possible to reproduce the expression level and tissue specificity. 11).
  • Loefgren et al. also produced a transgenic mouse with a bacterial artificial chromosome (BAC) containing CYP2C18 and CYP2C19, and reported that there was a sex difference in expression.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • the introduced site of the introduced gene was mouse chromosome 2 C1, and the copy number was 11-13.
  • the human gene copy number is 2, suggesting that it is insufficient as a model for physiologically expressing human CYP2C (Non-patent Document 12).
  • Non-patent Document 13 produced a transgenic mouse having a bacterial artificial chromosome (BAC) containing CYP3A4 that is specifically expressed in adult humans.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • the expression of the introduced CYP3A4 gene was only at 2 and 4 weeks of age, but expression was also observed at 8 weeks of age when the expression inducer was administered.
  • mammary gland development was poor and offspring survival was poor.
  • the introduction site and copy number of the introduced gene are not tested. Therefore, it was considered necessary to take reproducibility in several strains with different copy numbers and insertion sites to determine whether it was due to the CYP3A4 gene.
  • Non-Patent Document 14 produced a transgenic mouse having CYP3A7 that is specifically expressed in human fetuses.
  • the metamouthonein promoter was used and no tissue-specific induced expression of the P450 gene was observed.
  • Non-patent Document 4 Campbel l et al. (Non-patent Document 15) created a transgenic mouse into which a gene in which the promoter of the rat CyplAl gene and its upstream sequence were linked to the lacZ gene was introduced, and thereby gene expression by the CyplAl promoter was performed. We proceeded with the analysis to control the above.
  • Non-patent Document 16 Non-patent Document 16
  • endogenous Cypla2 knockout mice were created by two research groups. Pineau et al.
  • Cypla2 knockout mouse produced by 17 was normal in hetero, but died soon after birth if homozygous.
  • Cypla2 knockout mice produced by Liang et al. (Non-patent Document 18) had no abnormal phenotypes in homozygous individuals. This difference is thought to be due to the difference in the sequence of the gene to be deleted.
  • Non-Patent Document 19 The effects of P450 gene deficiency and metabolic abnormalities using Cypla2 knockout mice have also been reported (eg, Non-Patent Document 19).
  • the role of Cypla2 in the metabolic system using such knockout mice is also reported. It has been elucidated.
  • Cyp2el which is known as the main enzyme that metabolizes ethanol (Non-patent Document 20). Cyp2el is known to be involved in the metabolism of acetoaminophenyaaceton and arachidonic acid in addition to ethanol.
  • Patent Document 1 a partial fragment of chromosome 7 derived from normal human fibroblasts is introduced into mouse ES cells (embryonic stem cells) by the microcell method, It is described that a chimeric mouse that retains the human chromosome fragment in normal tissue and expresses the human CYP3A4 gene in the liver and small intestine by induction of the drug is described.
  • Patent Document 1 discloses that the human chromosome 7 fragment (about 5 Mb) containing the CYP3A gene group (hereinafter also referred to as “CYP3A gene cluster”) is the SC20-HAC vector (FERM BP-7583; patent).
  • Patent Document 1 describes the production of a mouse having a human P450 gene (CYP3A family) and further disrupting the mouse endogenous P450 gene (Cyp3a family).
  • a mouse that retains a partial fragment of chromosome 7 containing the human CYP3A gene group or an approximately 5 Mb region of chromosome 7 containing the human CYP3A gene group is stable within the mouse individual.
  • a mouse that carries the human artificial chromosome vector (SC20) which is known to be known, was produced, it was impossible to stably transmit offspring from the chimeric mouse. If no offspring can be obtained, mice will be produced using chimeric mice, and embryo manipulation will be required each time, mice with a uniform genetic background will not be obtained.
  • Offspring with the introduction of human P450 genes and disruption of endogenous drug-metabolizing enzymes Means that a mouse cannot be obtained.
  • human artificial chromosome vectors (hereinafter also referred to as “HAC vectors”) have the following advantages: 1) Since they are not inserted into the host chromosome and are maintained independently, 2) — Because it is stably maintained at a fixed copy number and is subject to physiological expression control of host cells, overexpression or loss of expression of inserted genes does not occur.3) There is no restriction on the size of DNA that can be introduced. Genes containing multiple expression regulatory regions and multiple genes
  • human artificial chromosome vectors have advantages not found in conventional vector systems (viruses, YACs, BACs, PACs, cosmids, and plasmids). It is expected as a production system for human vectors and human model animals (for example, Non-Patent Document 25-26).
  • Patent Document 1 International Publication No. W001 / 011951 Pamphlet
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2005-230020
  • Non-Patent Document 1 Nelson, Pharmacogenetics, 6: 1, 1996
  • Non-Patent Document 2 Sabae et al., Bioscience and Industry, 55: 81, 1997
  • Non-Patent Document 3 Kamataki, Journal of the National Research Institute for Public Health, 7: 27, 1997
  • Non-Patent Document 4 Kamataki et al., Toxicology Letters, 82-83: 879, 1995
  • Non-patent literature 5 Kovaleva et al., Biochem. Biophys. Res. Coramun., 221: 129, 1996
  • Non-patent literature 6 Gilam et al., Arch. Biochem. Biophys., 305: 123, 1993
  • Patent Document 7 Asseffa et al., Arch. Biochem. Biophys., 274: 481, 1989
  • Non-Patent Document 8 Shou et al., Mol. Carcinog., 10: 159, 1994
  • Non-Patent Document 9 Wolf et al., J. Pharm. Pharmacol., 50: 567, 1998
  • Non-Patent Document 1 0 Kamataki et al., Pharmacokinetics, 13: 280, 1998
  • Non-Patent Document 1 Ramsden et al., J. Biol. Chem., 268: 21722, 1993
  • Non-Patent Document 1 Li et al., Archs. Biochem. Biophys., 329: 235, 1996
  • Non-Patent Document 1 5 Campbel l, J. Cell Sci., 109: 2619, 1996
  • Non-patent literature 1 6 McKinnon et al. 'Cl in. Exp. Pharmacol. Physiol., 25: 783, 1998
  • Non-patent literature 1 7 Pineau 3 ⁇ 4, Proc. Natl Acad. Sci. USA., 92: 5134, 1995
  • Non-patent literature 1 8 Liang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA., 93: 1671, 1996
  • Non-Patent Document 2 0 Lee et al., J. Biol. Chem., 271: 12063, 1996
  • Non-patent document 2 1 Herwaarden et al., J. Cl in. Invest., 117: 3583-3592, 2007
  • Non-patent document 2 2 Okita et al., Genomics., 81 (6): 556, 2003
  • Non-Patent Document 2 3 Sun FL, Dean WL, Kelsey G, Allen ND, Reik W .: Transact i vaton of Igf 2 in a mouse model of Beckwith-Wiedemann syndrome. Nature. 1997 Oct 23; 389 (6653): 785, 787.
  • Non-patent literature 2 4 Puech et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 97: 10090, 2000
  • Non-patent literature 2 5 Kuroiwa et al., Nature Biotech., 18: 1086, 2000
  • Non-Patent Document 2 6 Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722, 2000 Disclosure of the Invention
  • the purpose of the present invention is to develop a human artificial chromosome vector by identifying a specific gene region including the human P450 (CYP3A) gene group, excluding genes considered to be important for developmental stage / germ cell differentiation on human chromosome 7.
  • the aim is to create a transchromosomic animal that can be transmitted to offspring by cloning it and introducing it into non-human mammals.
  • a human artificial chromosome vector capable of transmitting offspring carrying a human chromosome 7 fragment containing the cytochrome P450 gene and a non-human mammal (eg, rodents, ungulates) containing the vector. Etc.).
  • Another object of the present invention is to provide a method for testing a pharmacological action or metabolism of a drug or food using the above-mentioned non-human mammal or a tissue, organ or cell thereof.
  • the present inventors have deleted the human CYP3A gene cluster in the human CYP3A gene cluster.
  • the gene region of specific human chromosome 7 including the human P450 (CYP3A) gene cluster excluding genes that are thought to be important for developmental stage germ cell differentiation (about lMb ⁇ 0.
  • the present invention has the following features.
  • a mammalian artificial chromosome vector that retains the human chromosome 7 fragment containing the human cytochrome P450 gene and can be transmitted to offspring, and the human chromosome 7 fragment is located between chromosome markers AC004922 and AC073842.
  • the above-mentioned mammalian artificial chromosome vector characterized in that it retains a region of about lMb ⁇ 500 Kb size including at least one human CYP3A gene cluster.
  • the above human artificial chromosome vector is a vector obtained by translocating the human chromosome 7 fragment to the SC20 vector derived from human chromosome 14 (FERM BP-7583) ( The mammalian artificial chromosome vector according to 2).
  • the human artificial chromosome vector is CYP3A-HAC ⁇ retained in the chicken DT40 cell line DT40 (CYP3A-HAC ⁇ ) 214 of the accession number FERM BP-10928, as described in (2) above A mammalian artificial chromosome vector.
  • a non-human mammal characterized by retaining the mammalian artificial chromosome vector described in any of (1) to (4) above and enabling expression of a human cytochrome P450 gene Derived pluripotent cells.
  • a non-human mammal characterized by retaining the mammalian artificial chromosome vector according to any one of (1) to (4) above and enabling expression of a human cytochrome P450 gene .
  • the non-human mammal according to (7) above which is a chimeric animal or a progeny animal thereof.
  • the non-human mammal according to (8), wherein the offspring animal is an animal obtained by crossing the chimeric animal with a wild-type animal of the same species.
  • the cytochrome P450 gene unique to the non-human mammal which is a homologue of the human CYP3A gene cluster, is disrupted, and the expression of the unique gene is reduced or eliminated.
  • the non-human mammal according to any one of the above (7) to (9).
  • a non-human mammal-specific cytochrome P450 gene was destroyed and
  • mammalian artificial chromosome vector in the present specification means an artificial chromosome produced based on a mammalian chromosome.
  • an artificial chromosome created based on a human chromosome is called a human artificial chromosome.
  • human CYP3A gene cluster means a group of CYP3A genes located on human chromosome 7.
  • the CYP3A gene group includes, for example, CYP3A4, CYP3A7, CYP3A5, and CYP3A43.
  • cytocytochrome P450 gene in the present specification means a general term for the human CYP gene group, and includes, for example, CYP3A4 and CYP2E CYP2D6.
  • mouse Cy P 3a gene cluster in the present specification means a group of Cyp3a genes located on mouse No. 5 chromosome.
  • the Cyp3a gene group includes, for example, Cyp3al 1, Cyp3a25, Cyp3al3.
  • homolog means a homologous gene of another animal species corresponding to an arbitrary gene.
  • the mouse homologue of the human CYP3A4 gene is Cyp3all.
  • the numbers after the alphabet are often inconsistent with each animal species.
  • nES cell in the present specification means an ES (uclear transfer ES) cell produced by nuclear transfer from a donor cell nucleus to a recipient egg previously enucleated.
  • non-human mammal refers to primates such as monkeys and chimpanzees, rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, tussels, pigs, hidges, and goats. Including but not limited to hoofs.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for producing # 7-HAC, CYP3A-HAC, and CYP3A-HAC ⁇ .
  • FIG. 2 shows a summary of the # 7-HAC and CYP3A-HAC and CYP3A-HAC ⁇ retention regions and chimera rates, retention rates, and progeny transmission rates.
  • Figure 3 is a photograph showing the results of FISH analysis showing that recombination, cell fusion, and chromosomal transfer were performed at each step.
  • Figure 3a is DT40 (# 7) clone
  • Figure 3b is DT40 (DF141) clone
  • Figure 3c is DT40 (NP25) clone
  • Figure 3d is R clone
  • Figure 3e is RP13 clone
  • Figure 3f is RPC13F2 clone
  • Figure 3g is CH0
  • the clone, and Figure 3h is a TT2F clone.
  • Figure 4 is a schematic diagram (a) for introducing ⁇ into AC004922 on human chromosome 7, and a diagram (b) showing the results of Southern analysis showing the result of the introduction.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing site-specific cleavage at AC073842 on human chromosome 7. cen is the centromere side, and tel is the telomere side.
  • FIG. 6 shows the results of genome analysis of the CYP3A gene cluster in TC (CYP3A-HAC A) mice.
  • FIG. 7 shows FISH analysis in TC (CYP3A-HAC A) mice.
  • the graph on the left shows the retention rate (vertical axis) of CYP3A-HAC A in each tissue (horizontal axis) by FISH analysis.
  • the right graph is a photograph showing the FISH result of the tail fibroblasts of TC (CYP3A- ⁇ ⁇ ) mice.
  • FIG. 8 shows the results of expression analysis of the CYP3A gene cluster in TC (CYP3A-HAC A) mice.
  • GAPDH is glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase glycera ⁇ dehyde 3-phospnate denydrogenase) 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 :! 0
  • FIG. 9 shows the results of time-specific gene expression analysis of the CYP3A gene cluster in TC (CYP3A-HAC ⁇ ) mouse liver.
  • FIG. 10 shows the results of gene expression analysis in drug-induced TC (CYP3A-HAC A) mouse liver.
  • ! f represents Rifampicin.
  • FIG. 11 shows the structure of the pBlueLAB (2975bp) multicloning site.
  • FIG. 12 shows the structure of pBACcyp3al3 (# 39).
  • Figure 13 shows the structure of the pBlueLAB (SAAX) multicloning site.
  • Figure 14 shows the structure of the pBlueLAB (NAPF) multicloning site.
  • Figure 15 shows the structure of pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A (R) (7602 base pairs).
  • Figure 16 shows the structure of P cyp3al3- K0 (approximately 15.8 kb).
  • FIG. 17 is a diagram showing an outline of genomic Southern analysis of a homologous recombinant (HR body) ES cell line using the cyp3al 3 -K0 vector.
  • Figure 1 8 is a diagram showing an outline of genotyping cy P 3al3- K0 individual mouse.
  • FIG. 19 is a diagram showing an outline of genotype analysis of cyp3a44 / ll / 25-K0 mouse individuals.
  • FIG. 20 shows the results of gene expression analysis in TC (CYP3A-HAC ⁇ ) / ⁇ cyp mouse liver.
  • FIG. 21 shows the results of CYP3A gene expression analysis by Western butting in TC (CYP3A-HAC ⁇ ) / ⁇ cyp mice after expression induction.
  • FIG. 22 shows the results of metabolic analysis in TC (CYP3A-HAC ⁇ ) / ⁇ cyp mice after expression induction.
  • FIG. 23 shows the results of LC-MS / MS measurement of human-specific metabolites in TC (CYP3A-HAC ⁇ ) / ⁇ cyp mice.
  • FIG. 23A shows measurement results in human
  • FIG. 23B shows measurement results in mice (wild type)
  • FIG. 23C shows measurement results in ⁇ cyp mice
  • FIG. 23D shows measurement results in TC (CYP3A-HAC ⁇ ) / ⁇ cyp mice.
  • the present invention in one embodiment, retains the human chromosome 7 fragment containing the human cytochrome P 45 0 gene, and mammals capable progeny transmission animal artificial chromosome vector derconnection, ⁇ Hi preparative chromosome 7
  • the above-mentioned mammalian artificial chromosome vector is characterized in that the fragment retains a region of about 1 Mb ⁇ 500 Kb size including at least the human CYP3A gene cluster existing between the chromosome markers AC004922 and AC073842.
  • cytochrome P450 is a general term for hydroxylase family and is an enzyme having an action (biological activity) of hydroxylating various substrates. In animals, it is mainly present in the liver and is involved in detoxification of substances, fatty acid metabolism, and steroid hormone biosynthesis. In the present specification, cytochrome P450 is sometimes simply referred to as “P450”.
  • the gene group of the CYP3A molecular species of human cytochrome P450 gene exists in the CYP3A gene cluster of human chromosome 7 long arm 7q21-q22 (for example, BA Brooks et al., Am. J. Hum. Genet., 43: 280, 1988).
  • a particularly useful region containing the CYP3A gene cluster is a small number existing between chromosome markers AC004922 and AC073842 of human chromosome 7 long arm.
  • a human chromosome 7 fragment comprising a region of about 1 Mb ⁇ 500 Kb, preferably about 1 Mb ⁇ 300 Kb, more preferably about 1 Mb ⁇ 200 Kb, containing the human CYP3A gene cluster.
  • the region from AC004922 to AC073842 eg, JE Sulston et al., Genome Res., 8 : 109 7 , 199 8
  • the neighboring region including this region is embryonic lethal and development It does not contain genomic imprinting gene clusters that are thought to cause abnormalities, malformations, etc., nor does it contain genes that are important for germ cell differentiation that cause infertility.
  • the mammalian artificial chromosome vector of the present invention When the mammalian artificial chromosome vector of the present invention is introduced into a non-human mammal, it can exist independently of the original chromosome of the animal.
  • the transchromosomic animal obtained at this time possesses a human P450 gene, so that it is possible to express this heterologous gene and to allow transmission of the vector to offspring by mating.
  • the mammalian artificial chromosome vector of the present invention is superior in both the chimera rate and the chromosome retention rate compared to the human artificial chromosome vector (# 7-HAC) described in International Publication No. 001/011951.
  • an excellent feature is the ability to transmit offspring.
  • the known # 7-HAC vector was unable to transmit offspring.
  • the mammalian artificial chromosome vector of the present invention can contain a centromere and a telomere 'subtelomeric region derived from any mammalian chromosome.
  • mammals are human, sa Primates such as leopards and chimpanzees, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, and ungulates such as lions, pigs, hidges and goats, but are not limited to these.
  • the centromere is a centromere derived from a mammalian chromosome, preferably from any human chromosome, more preferably from human chromosome 14.
  • the telomere-subtelomer region is derived from a mammalian chromosome, preferably from a human chromosome, more preferably from a human chromosome 7 or 14, and more preferably from a repetitive sequence of an artificially synthesized TTAGGG sequence.
  • the vector of the present invention may further contain an MDR1 gene cluster derived from a mammalian chromosome, preferably from a human chromosome, more preferably from human chromosome 7.
  • a preferred example of the mammalian artificial chromosome vector of the present invention is a human artificial chromosome vector.
  • a human artificial chromosome vector comprises the human chromosome 7 fragment, an SC20 vector derived from human chromosome 14 (international deposit number FERM BP-7583; -Vector obtained by translocation to No. 230020.
  • a translocation is the movement of a part of one chromosome to another chromosome.
  • the human artificial chromosome vector is CYP3A-HAC A maintained in the avian DT40 cell line DT40 (CYP3A-HAC ⁇ ) 214 with accession number FERM BP-10928 .
  • This cell line was established on October 30, 2007 in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (1st, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Ibaraki, Japan) And was given the accession number FERM BP-10928.
  • examples of production of the mammalian artificial chromosome vector of the present invention and non-human mammals holding the same, and examples of their use will be described.
  • CYP3A-HAC or CYP3A-HACHA a human artificial chromosome carrying a human chromosome 7 fragment
  • the human CYP3A gene cluster is located on chromosome 7 at 7q21.3-q22.1 (B.A.
  • the human CYP3A family includes at least CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43 is included, and the genomic sequence of CYP3A is registered as GenBank Accession No. NG_000004.
  • the human P450 of the present invention covers all P450 enzymes belonging to the CYP3A family, for example, CYP 3 A4, GYPSA 5 and CYP3A7, CYP3A43 enzymes.
  • a fragment containing the CYP3A gene cluster on human chromosome 7 is translocated to a chromosome fragment derived from human chromosome 14 (SC20-HAC vector), and a cloned human artificial chromosome is constructed. It can be used for transmission of offspring in mice and production of transchromosomic non-human mammals (eg, mammals such as rodents and ungulates) that retain the human artificial chromosome.
  • transchromosomic non-human mammals eg, mammals such as rodents and ungulates
  • a mammalian artificial chromosome is an artificial artificial chromosome produced by translocating a desired region on a mammalian chromosome into a stable chromosome fragment (chromosomal vector) derived from the same or different species of mammal.
  • Transchromosomic non-human mammals refer to mammals other than humans in which heterologous chromosome fragments have been transmitted to the offspring via the germ line.
  • the present inventors In the production of mammalian artificial chromosomes, the present inventors have determined, as much as possible, the chromosomal region that is presumed to have an adverse effect on the chromosome insert so as not to adversely affect the development of a chromosome-introduced animal such as a mouse. It has been considered desirable to remove.
  • the ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sequence or the human telomeric sequence could be inserted near the target gene. It was sometimes difficult.
  • CYP3A gene cluster Based on information on the structure of human chromosome 7 where the CYP3A gene cluster is present, the present inventors have introduced a CYP3A gene cluster-containing chromosome insert within a specific size range. We have now found that both chromosome retention and offspring transmission efficiency are significantly increased. By removing the surplus gene from the human artificial chromosome in this way, the identified CYP3A gene cluster It has become possible to create a new human artificial chromosome that retains the periphery of the raster region as an insert.
  • surplus gene refers to a harmful gene that adversely affects the development of a chromosomally introduced animal or differentiation of a reproductive cell.
  • an imprinting gene a gene expression level-dependent genetic disease-causing region, reproduction
  • genes that are expressed in cells For example, genes that are expressed in cells.
  • the centromeric end of the chromatin insert to be translocated is preferably the AC004922 locus, while the telomeric end is preferably the AC073842 locus. There was found.
  • the recognition sequence of the recombination enzyme Cre is homologous.
  • a homologous pair of human telomeric sequences is inserted into the chromosomal site (eg, AC073842; NCBI database) that is inserted by recombination and excludes the gene expressed in germ cells existing in 7q22, and located at the extreme side of the CYP3A gene cluster.
  • Insert by replacement, depending on the position AC004922-CYP3A gene cluster-AC073842 fragment was prepared by site-specific cleavage (telomere truncation) (for example, Kuroiwa et al., Nucleic Acid Research 26: 3447, 1998). It can be used for manufacturing.
  • the human artificial chromosome inserts the ⁇ sequence and the human telomere sequence in the vicinity of the target gene region on the human chromosome by homologous recombination, and separates only the region around the target gene region sandwiched between both sequences.
  • the size of the chromosomal insert to be translocated is smaller than 5Mb for # 7-HAC, usually about 4Mb, as described above.
  • To about 0.5 Mb preferably from about 3 Mb to about 0.5 Mb, more preferably from about 2 Mb to about 0.5 Mb, most preferably from about 1 Mb to about 0.5 Mb.
  • the centromeric end of the chromosomal insert to be translocated is preferably the AC004922 locus, and the telomeric end is preferably the AC073842 locus (J. E. Sulston et al., Supra).
  • the production of the human artificial chromosome of the present invention will be described more specifically.
  • a human chromosome 7 containing a human CYP3A gene cluster or a fragment thereof can be obtained by a well-known method.
  • human chromosomes or fragments thereof can be made into a library of mouse A9 cells by the microcell method (Koi et al., Jpn. J. cancer Res., 80: 413-418, 1989).
  • a clone carrying human chromosome 7 or a fragment thereof can be selected.
  • Human chromosome 7 or a fragment thereof is preferably transferred to a chicken DT-40 cell (RIKEN Cell Bank (Japan): RCB1464; ATCC CRL-2111) by the microcell method for the convenience of subsequent modification. be able to.
  • the human CYP3A gene cluster is located at 7q22 on chromosome 7 (BA Brooks et al., Supra).
  • # 7-HAC the 5 Mb region from the AC004082 locus to the AF006752 locus was translocated and cloned as chromosome enhancer 1.
  • This 5 Mb insert contains an extra 2 Mb chromosomal region on the telomere side and 2 Mb on the centomial side of the CYP3A gene cluster region.
  • the centromeric 2Mb contains imprinting gene clusters.
  • 2Mb on the telomer side has multiple genes that are expressed in germ cells. Therefore, in order to remove the 2 Mb region on the centromere side, the chromosome 7 fragment (fragment telomerized at the AF006752 locus) was placed in the vicinity of the CYP3A gene cluster region and the centromere side (about 300 Kb centromere).
  • the 0049 ⁇ ⁇ ⁇ sequence is inserted by homologous recombination at the AC004922 locus (JE Sul ston et al., Supra) present on the side.
  • AC004922-CYP3A gene cluster-AF006752 fragment about 3 Mb
  • the resulting artificial chromosome vector is CYP3A-HAC (Figs. 1 and 2).
  • this chromosomal vector is telomeric (eg, Kuroiwa et al., Above) in the AC073842 region (JE Sul ston et al. (1998)), translocation cloning into the SC20-HAC vector using only the AC004922-CYP3A gene cluster-AC073842 fragment (about 1 Mb) as a chromosome insert is possible.
  • the resulting human chromosome vector is CYP3A-HAC A (Figs. 1 and 2).
  • CYP3A-HAC ⁇ is cleaved at position 124455 in AC073842, so the genomic region present is positions 124456 to 132764 in AC073842, and positions 1 to 124455 are not present, Because it is translocated at position 32340 in AC004922, the genomic region present is positions 1 to 32340 of AC004922 and positions 32341 to 82359 are not present.
  • telomere truncation in chicken DT40 cells and interchromosomal translocation by Cre-loxP system can be used.
  • DT40 cells holding the modified human chromosome 7 fragment and the modified SC20-HAC betater (Kuroiwa et al., (2000)) obtained as described above are prepared.
  • the DT40 cells carrying the respective modified human chromosome fragments are fused.
  • a DO cell hybrid carrying two modified human chromosome fragments is prepared.
  • Cre recombinase is expressed and translocated in this DT40 cell hybrid, but it has been reported that the frequency of recombination (translocation) between two heterologous chromosomes is very low.
  • the translocation is not between endogenous chromosomes but between exogenous human chromosomes.
  • the exchange efficiency will be low. Therefore, it is preferable to consider a positive selection system that can select cells that have undergone recombination between ⁇ as expected. Therefore, a system is used in which the GFP gene is expressed in cells in which chromosomal translocation occurs between ⁇ , and the target cells are cloned by sorting with FACS.
  • Cre recombinase is expressed stably rather than transiently.
  • any size human chromosome fragment (exceeding the cloning size of the YAC vector) can be cloned into the SC ⁇ site on the stable SC20-HAC vector.
  • CYP3A-HAC or CYP3A-HAC A produced by the human artificial chromosome construction system should be introduced into Chinese hamster CH0 cells before being introduced into mouse ES cells.
  • Dieken b (Nature Genet., 12: 174, 1996) transferred a modified human chromosome from a chicken DT40 cell to a mouse MEL cell (a type of cancer cell), but it was transferred mostly fragmented. .
  • human chromosomes can be transferred intact by transferring them into Chinese hamster CH0 cells.
  • CH0 cells are known to form microcells as efficiently as mouse A9 cells (Kuroiwa et al., Supra (2000)), which allows the modified human chromosomes to be differentiated from non-human mammals.
  • CYP3A-HAC or CYP3A-HAC A-bearing chimeric animals can be produced by transferring to competent cells (eg, ES cells).
  • the present invention further provides a pluripotent cell derived from a non-human mammal, characterized in that it retains the above-described mammalian artificial chromosome vector and enables expression of a cytochrome P450 gene. To do.
  • the differentiated pluripotent cells include, for example, embryonic carcinoma cells (EC cells, Hanaoka et al., Differentiation, 48:83, 1991), embryonic stem cells (ES cells, Evans et al., Nature, 292).
  • Non-human mammals such as pluripotent stem cells (mGS cells, Kanatsu-Shinohara et al., Cell, 119: 1001, 2004), induced pluripotent stem cells (iPS cells, Takahashi et al., Cell, 126: 663, 2006) Includes the above-mentioned cells that are differentiated into undifferentiated cells and transformed into somatic cells with various forms or functions by being injected into or co-cultured with early embryos of animals. .
  • ES cells, ntES cells, iPS cells, and the like have particularly high abilities, and in many cases also contribute to germ cells and can produce progeny derived from these cells.
  • EC cells are mainly germ cell carcinomas
  • ES cells are from the inner cell mass of blastocysts
  • EG cells are from primitive germ cells that appear early in development
  • ntES cells are the nucleus of donor nuclei in enucleated unfertilized eggs Transplanted from the inner cell mass of the blastocyst
  • mGS cells from testis-derived stem cells
  • iPS cells from mammals such as mice
  • somatic cells such as fibroblasts 2, 3 or It is obtained by introducing DNA that encodes four factors (klf4, oct4; klf-4, oct4, sox2; klf-4, oct4, c-rayc, sox2, etc.).
  • mouse ES cells are well known, and mouse ES cells can be preferably used in the present invention.
  • the establishment of ES cells or pluripotent cells in animal species other than mice is described in rat (Iannaccone et al., Dev. Biol., 163: 288, 1994), butterfly (Wheeler et al., Reprod. Fertil. Dev. , 6: 563, 1994).
  • the use of iPS cells known as ES-like cells is also preferred.
  • ES cells, iPS cells or other pluripotent cells are used as recipient cells and human artificial chromosomes are transferred, the human artificial chromosomes or fragments thereof are retained, as in the case of mice.
  • Non-human animals that express genes on human artificial chromosomes can be produced.
  • the gene corresponding to the homologous gene of the human P450 gene is destroyed in the pluripotent cell derived from the non-human animal,
  • the human artificial chromosome it is possible to obtain a pluripotent cell that is deficient in the endogenous P450 gene derived from a non-human animal and can express the human CYP3A gene cluster.
  • the pluripotent cell line as described above can be used as a recipient cell for transferring a chromosome fragment containing the human P450 gene in the present invention.
  • a chromosome donor cell that holds a chromosome fragment containing a labeled human P450 gene
  • 1) a human chromosome labeled with a selectable marker in a recipient cell 1) a human chromosome labeled with a selectable marker in a recipient cell
  • SV40 Enhansa and a simple herpesvirus thymidine kinase promoter linked together can be used.
  • a DNA fragment containing the above marker gene and a marker gene linked to a promoter if necessary.
  • Transform human cells by electroporation Ishida et al., Introduction to Cell Engineering Experiments, Kodansha, 1992), etc.
  • a library of human cell transformants in which the introduced genes are randomly inserted on 23 types and 46 human chromosomes can be obtained. Can do. With regard to 3), since many human normal cells have very low microcell-forming ability, the above transformants can be transformed into cells having high microcell-forming ability, such as mouse A9 cells (Koi et al., Jpn. J. Cancer Res. , 80: 413-418, 1989), and the ability to form microcells can be imparted.
  • Materials for transferring human chromosome fragments into recipient cells include human P450 gene-containing humans.
  • Microcells prepared from chromosome 7 donor cells or gamma-irradiated microcells can be used. Transfer to the recipient cell is performed by fusing the recipient cell and the microcell by the method described in (Seiseki, Cell Engineering Handbook, Yodosha, 1992).
  • the chromosome or fragment thereof containing the human P450 gene carries a selectable marker in recipient cells.
  • human P450 gene or human P450 gene is included by PCR, Southern plot analysis, FISH analysis, etc. using primers based on specific genetic markers and polymorphic markers or fluorescently labeled probes. If you select a strain that holds a chromosomal fragment,
  • chromosomal fragment containing the P450 gene it is possible to introduce a chromosomal fragment containing the P450 gene.
  • chromosomal fragments containing a plurality of human P450 genes that hold different selection forces, it is possible to obtain recipient cells that simultaneously hold these.
  • the fact that the recipient cell selected by a marker on the chromosome containing the human P450 gene (such as G418 resistance) has the chromosome fragment containing the human P450 gene held by the donor cell is selected, for example.
  • human-specific repeat sequences Ll, Alu et al., Korenberg, Cell, 53: 391, 1988
  • human chromosome specific Chromosome analysis such as fluorescens in situ hybridization (FISH) using probes (Lichter et al., Human Genetics, 80: 224, 1988)
  • FISH fluorescens in situ hybridization
  • PCR method using human P450 gene-specific primers
  • the GFP (Green Fluorescent Protein) gene derived from jellyfish is known as a reporter gene for gene transfer into animal cells (for example, Prasher, DC et al., Gene, 111: 229). , 1992).
  • a substrate is not required for luminescence of GFP, and it can be detected by fluorescence, so that it can be monitored in a short period of time in a living cell.
  • the GFP gene can be used. Specifically, a GFP gene without a promoter is inserted into one end of the SC20-HAC vector, and a promoter necessary for GFP expression is inserted into one end of the CYP3A gene cluster on chromosome 7 on the centromere side.
  • the present invention further provides a non-human mammal characterized by holding the above-mentioned human artificial chromosome vector and enabling expression of a human cytochrome P450 gene.
  • chimeric animals from non-human mammalian ES cell lines or pluripotent cells such as mouse cell ES lines and ntES cell lines is described in Shinichi Aizawa, Biomanual Series 8 Gene Targeting, Yodosha, 1995, Etc. can be carried out by the method described in the above. It is desirable to use the conditions already examined for each ES cell line for the selection of the development time and strain of the host embryo for efficient production of chimeric animals.
  • TT2 cells wild color, Yagi et al., Analytical Biochemistry, 214: 70, 1993
  • mouse ES cell line CBA X C57BL / 6 F1 Balb / c (white, Claire Japan) or It is desirable to use 8-cell stage embryos derived from ICR (Claire Japan) as host embryos That's right.
  • the artificial chromosome vector of the present invention produced by the above method is retained.
  • ES cells or ntES cells Purify microcells from CH0 cells and fuse microcells with ES cells or ntES cells in DMEM medium in the presence of polyethylene glycol (eg PEG 1000).
  • the obtained ES cells or ntES cell clones are injected into 8-cell embryos obtained by male-male mating (above), and the injected embryos are transplanted into temporary parents to give birth to chimeric animals.
  • Preferred pluripotent cells are ES cells or ntES cells derived from non-human mammals. Further preferred ES cells or ntES cells are mouse ES cells or mouse ntES cells.
  • non-human mammal endogenous CYP3A is used to efficiently express the human P450 gene and to make drug metabolism by the CYP3A gene group on human chromosome 7 more human.
  • the gene cluster can be destroyed.
  • the endogenous CYP3A gene is disrupted to the animal into which the human gene has been introduced, or conversely, the human gene is introduced into an animal that has disrupted the endogenous CYP3A gene group. It is also possible.
  • the non-human mammal thus obtained is a chimeric animal or a progeny animal that retains the artificial chromosome vector of the present invention and enables expression of the human P450 gene.
  • the progeny animal may be an animal obtained by crossing the chimeric animal with a wild animal of the same species, or an animal in which the corresponding gene of the chimeric animal and the animal of the same species is destroyed. It may be an animal obtained by mating with.
  • the cytochrome P450 gene unique to the non-human mammal which is a homologue of the human CYP3A gene cluster, is disrupted, and the expression of the unique gene is Reduced or disappeared.
  • the non-human mammal of the present invention is a mouse, and includes both a chimeric mouse and its progeny mouse.
  • a chimeric non-human mammal is produced from ES cells (the Cyp3a gene cluster is heterogeneously deleted), and mated with a wild-type animal to obtain an F1 animal in which the Cyp3a gene cluster is deleted heterogeneously.
  • the F1 animals are crossed to obtain F2 animals in which the Cyp3a gene cluster is homozygously deleted.
  • a chimeric non-human animal carrying a human artificial chromosome containing the human CYP3A gene cluster 1 is bred with a wild-type animal to obtain an F1 animal carrying the human artificial chromosome.
  • This F1 animal is crossed with the above F2 animal in which the Cyp3a gene cluster is homozygously deleted to obtain an F2 animal in which the Cyp3a gene cluster is heterozygously deleted and the human artificial chromosome is retained.
  • V Maintenance of artificial chromosomes including human P450 gene (CYP3A gene cluster) and confirmation of human gene expression in chimeric non-human mammals or their progeny
  • the contribution rate of ES cells in non-human mammals born from embryos injected with ES cells can be roughly determined by their coat color. However, just because there is no contribution to hair color, it cannot be judged that there is no contribution from other organizations. More detailed retention of human chromosomes in each chimeric animal tissue can be confirmed by Southern analysis, PCR, FISH, etc. using genomic DNA extracted from each tissue. The expression of the human P450 gene on the introduced chromosome is confirmed as follows. Expression of mRNA derived from chromosomes containing the human P450 gene was determined by RT-PCR using RNA from each tissue (Kawasaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • an artificial chromosome containing the human P450 gene group is retained.
  • ES cells differentiate into germ cells of the chimeric animal a chromosome fragment containing the human P450 gene group also introduced into its progeny is found, and the gene on that chromosome fragment is expressed.
  • genomic DNA extracted from the tissues, organs or cells of the progeny animals was used to determine whether the human chromosome containing the human P450 gene group was transmitted to the offspring by crossing the chimeric animal with a normal animal. The same can be confirmed by Southern analysis, PCR, FISH, etc.
  • confirmation of time-specific and tissue-specific gene expression such as the ontogenetic stage in offspring can also be performed in the same manner as described above.
  • gene expression is induced by Rifarapicin or PCN (see Example 6 below).
  • the knockout vector and the knockout ES cell are prepared by the method described in Example 7 described later, or P. Hasty et al., Nature, 1991, 350: 243-246, M. Zijlstra et al., Nature, 1989, 342: 435-438, etc.
  • the knockout animal can be produced in the same manner as in the above method (iv).
  • one of the methods commonly used to inactivate the function of an endogenous gene of interest is gene targeting.
  • a recombinant DNA in which a foreign gene such as the nee gene is inserted into one exon of about several kb of genomic DNA containing a plurality of exons of the gene is inserted into an appropriate vector. Allows you to create a knockout vector.
  • Vector DNA is introduced into ES cells, G418-resistant cells are selected, cells that have undergone homologous recombination are selected, for example, by Southern plot analysis, and then injected into blastocysts. Transplant it into the uterus of a temporary parent non-human mammal to give birth to a chimeric animal.
  • a homozygous knockout animal can be obtained by crossing between chimeric animals or between chimeric animals and wild-type animals.
  • the Cy P 3a gene cluster containing the endogenous (or “inherent”) P450 gene contains P450 genes such as Cyp3all, Cyp3al3, Cyp3a25, and Cyp3a41.
  • P450 genes such as Cyp3all, Cyp3al3, Cyp3a25, and Cyp3a41.
  • CypSall Mau Chr5. 78.0 cM
  • Cyp3al3 are present in mouse Chr5. 73.7 cM, respectively).
  • a human P450-bearing animal that retains the human chromosome containing the human P450 gene group and lacks the non-human mammal endogenous P450 gene group contains the human P450 gene group produced by the method described above. It is obtained by crossing a chimeric animal or its progeny that retains the human chromosome with a chimeric animal or its progeny that lacks the endogenous P450 gene in its entire cluster. Both “human chromosome retention” and “endogenous P450 gene deficiency” are thought to be related to the transmission of both genetic elements according to Mendel's law. There are various patterns of animal mating methods. Specifically, it can be implemented as follows.
  • a chimeric animal with a heterozygous deletion of the Cyp3a gene cluster is mated with a wild-type animal to obtain an F1 animal with a heterozygous deletion of the Cyp3a gene cluster (F1 animal A).
  • the F1 animals A are crossed to obtain F2 animals in which the Cyp3a gene cluster is deleted in the home (F2 animals B).
  • a chimeric animal carrying a human artificial chromosome containing the human CYP3A gene cluster and a wild type animal are mated to obtain an F1 animal carrying the human artificial chromosome (F1 animal C).
  • F2 animal B and F1 animal C are crossed to obtain an F2 animal in which the Cyp3a gene cluster is heterogeneously deleted and retains the human artificial chromosome (F2 animal D).
  • F2 animal D By crossing this F2 animal D and F2 animal B, the final animal (the animal Cyp3a gene cluster is homozygously deleted and the human artificial chromosome is retained) is obtained.
  • the endogenous P4 5 0 genes is defective has been and non human mammal human P450 gene has been introduced, to hold the above-mentioned human artificial chromosome vector Pluripotent cells derived from non-human mammals, and the non-human mammal-specific cytochrome P450 gene, which is a homologue of the human CYP3A gene cluster, is disrupted and the expression of the unique gene is reduced or It is also possible to produce pluripotent cells derived from non-human mammals, which are characterized by disappearance.
  • pluripotent cells are, as described above, embryonic carcinoma cells (EC cells, Hanaoka Differentiation, 48: 83, 1991), embryonic stem cells (ES cells, Evans et al., Nature, 292: 154, 1981). Embryonic germ cells (EG cells, Matsui et al., Cell, 70: 841, 1992), induced pluripotent stem cells (iPS cells, Takahashi et al., Cell, 126: 663, 2006) Sex stem cells (ntES cells, Wakayama et al., Science, 292: 740, 2001), such as mouse-derived ntES cells. Specifically, this is described in Examples 13 to 16 below.
  • the present invention further includes a cell derived from the above non-human mammal or the above mouse or a progeny thereof, and capable of expressing the cytochrome P450 gene, or a cell comprising the cell Provide an organ or tissue.
  • the present invention also provides biological activity by expressing the cytochrome P450 gene retained by the non-human mammal, the mouse or the progeny thereof, or the cell, organ or tissue described above.
  • a method for producing a cytochrome P450 having biological activity which comprises producing a cytochrome P450 having the above and recovering the cytochrome P450.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence of human P450 are registered as, for example, GenBank Accession Nos. Yes.
  • Biologically active humans using the chimeric animals obtained as described above are registered as, for example, GenBank Accession Nos. Yes.
  • P450 protein can be obtained from its organs, tissues and cells.
  • a human P450 protein can be extracted by extracting and purifying a fraction containing human P450 from the liver micosome of the chimeric animal or its progeny.
  • the human P450 protein can be recovered from the culture by establishing and culturing a cell line from the tissue of a chimeric animal or a progeny thereof having a chromosome containing the human P450 gene. Protein purification can be performed by a combination of known techniques.
  • purification methods include gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, HPLC, FPLC and other matrix chromatography, electrophoresis, isoelectric focusing, ultrafiltration, and ammonium sulfate. Drawing, dialysis, etc.
  • Human P450 can be identified using a commercially available Atsy kit.
  • accessory kits are the P450-Glo TM CYP3A4 Assay and the P450-Glo TM CYP3A7 Assay (both Promega).
  • This Atsey method consists of measuring the P450 enzyme activity based on the amount of luminescence produced by the noreluciferase reaction after converting the luciferin derivative, which is a substrate of P450, to luciferin by the P450 enzyme.
  • the present invention further includes administering a drug or food to the above non-human mammal, the above mouse or its offspring, or the above cell, organ or tissue, and determining the pharmacological action and / or metabolism of the drug or food.
  • a human P450-introduced animal produced by mating a chimeric animal of the present invention or its progeny, or a knockout animal deficient in the animal's endogenous P450 gene group, is originally expressed in the human body. It is thought that human P450 is expressed in the same pattern as that of humans, so administration of a specific drug can cause pharmacological effects, toxicity, carcinogenicity, teratogenicity, and pharmacokinetics at the individual level. Useful as an experimental animal for research. Furthermore, it is possible to know the metabolic mechanism of drugs in humans and the toxicity of each tissue without administering the drugs to humans.
  • the metabolic activity of drugs metabolized by human CYP3A can be detected by measuring triazolam hydroxylation activity using liver mico-mouthsomes or measuring testosterone 63 hydroxylation activity. Specific examples of this test method are described in Example 12, FIG. 22 and FIG. 23 described later.
  • human artificial chromosomes obtained by translocation and cloning of about 3 Mb and about 1 Mb region including CYP3A gene cluster region on human chromosome 7 into SC20-HAC vector (each CYP3A- HAC and CYP3A-HAC A), and then each of CYP3A-HAC and CYP 3 A-HAC A was introduced into a mouse individual, and a chimeric mouse Compared with # 7- HAC (Kuroia et al., Gene Ther., 9: 708, 2002), we confirmed improvement in chimera rate and chromosome retention rate and efficient progeny transmission of human artificial chromosomes did.
  • the chimera rate indicates the contribution rate of ES cells to the tissue (hair) in the chimeric animal, and can be determined by visually evaluating the proportion of hair color derived from ES cells on the body surface of the chimeric animal.
  • the retention rate indicates the contribution rate of the introduced chromosome to the tissue.
  • the stability mentioned here can be affected by the centromeric function of individual chromosomes and the genes (eg, factors that suppress cell growth) present on individual chromosomes.
  • a chimeric mouse with a high chimerism rate that retains human chromosome 7 fragment or # 7-HAC has been produced so far, but human chromosome 7 fragment or # 7-HAC can be stably transmitted to offspring.
  • International Publication No. W001 / 011951; Kuroiwa et al., Gene Ther., 9: 708, 2002 In the chimeric mice with high chimera rate carrying human chromosome 7 fragment or # 7-HAC, no transmission of foreign chromosomes to the offspring was observed, suggesting that the contribution rate of the introduced chromosome to the tissue may be low. Is done.
  • transchromosomic non-human animal for example, a mammal such as a mouse
  • CYP3A-HAC or CYP3A-HAC ⁇ This is considered to be useful as a non-human animal for the functionality and safety of foods that are toxic screening agents for drugs that have become drug candidates.
  • CYP3A-HAC or CYP3A-HAC A transchromosomic mice can transmit offspring of heterologous chromosomal fragments, it will be possible to mass-produce transchromosomic mice with uniform traits by mating. Report of Yu et al.
  • CYP3A4 bacterial human chromosome
  • the CYP3A4 gene expressed in the mouse strain is a gene expressed in the adult stage, and does not include CYP3A7 expressed in the fetal stage and other CYP3A gene clusters such as CYP3A5 and CYP3A43. Therefore, it is assumed that CYP3A expressed in the mouse strain is limited to CYP3A4. Furthermore, the number of BAC copies introduced and the site of introduction have not been identified, and it is difficult to say that they are under the same physiological expression control as humans.
  • Herwaarden et al. created Cyp3a knockout mice and expressed human CYP3A4 gene in the liver or small intestine. Mice were made. However, in these mice, the human CYP3A4 gene is forcibly expressed downstream of the liver or small intestine-specific promoter, and it is difficult to say that the mice are under the same physiological expression control as humans.
  • the mouse strain expressing the human CYP3A gene cluster disclosed in this specification is more faithful to the time-specific expression, tissue-specific expression, expression inducing ability, etc. of the CYP3A gene cluster as in humans. It is reproduced. For example, since CYP3A4 and CYP3A7 are included, CYP3A expression in the adult stage can be detected in the same manner as humans. Examples of inducers are Rifampiciri and PCN (Pregnenolone 16-carbonitrile). By inducing the expression of these human CYP3A gene cluster-expressing transchromosomic mice with an appropriate inducer, a mixture site 'S9 having a higher activity than the liver can be obtained.
  • transchromosomal non-human animal cell obtained as described above to express a gene on a foreign chromosome or a fragment thereof, and recovering the product, Chemically active substances can be produced.
  • transchromosomic non-human animals can be bred under conditions that allow the expression of genes on foreign chromosomes or fragments thereof, and then the expression product can be recovered from the animal's liver, small intestine, etc. .
  • tissue or cells of transchromosomic non-human animals or immortalized cells are cultured under conditions that allow expression of genes on foreign chromosomes or fragments thereof. Then recover the expression product from the culture. Can do.
  • foreign chromosomes or fragments thereof extracted from tissues, cells, or immortalized tissues of these transchromosomic non-human animals, DNA constituting the foreign chromosomes or fragments thereof, or transchromosomics CDNA derived from a non-human tissue, cell, or a foreign chromosome or fragment thereof retained in an immortalized animal, animal cell, yeast cell or insect cell (e.g., CH0 cell, BHK cell, liver) Cancer cells, myeloma cells, baker's yeast cells, SF9 cells, HEPG2 cells, etc.) and culturing the cells under conditions capable of expressing genes on foreign chromosomes or fragments thereof, and then expressing the expression product from the culture. It can be recovered.
  • Biologically active substances include all substances encoded on foreign chromosomes, such as P450, especially human CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43 and the like.
  • Example 1 to Example 16 human artificial chromosome CYP3A-HAC or CYP3A- that translocates 3 Mb or 1 Mb of human CYP3A gene cluster peripheral region on human chromosome 7 into the SC20-HAC vector.
  • the production of HAC A is described (Fig. 1).
  • the introduction of each HAC produced into individual mice and the transmission of HAC to the offspring of chimeric mice will be described.
  • the recognition sequence for Cre recombinase ⁇ is inserted in the AC004922 region located in the vicinity of the CYP3A locus on human chromosome 7 and on the centromere side (approximately 300 Kb centromere side).
  • a targeting vector pNPloxPHyg for insertion was prepared as follows. First, the AC004922 genomic region was amplified by PCR using the following primers. p4501oxP7L; 5 -ggcctagagcctggactcattcattcaa-3 ( ⁇ ⁇ ⁇ (J number 1)
  • V901 (Lexicon genetics) was used as the basic plasmid for inserting ⁇ sequences.
  • Gene Amp 9600 manufactured by Perkin-Elmer as the thermal cycler, LATaq (Takara Shuzo) for Taq polymerase, and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) according to the recommended conditions. It was. The temperature and cycle conditions were 94 ° C for 1 minute after heat denaturation, followed by 35 cycles of 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 7 minutes. The PCR product was treated with proteinase K (Gibco) and then gel filtered with CHR0MASPIN-TE400 (Clontech).
  • the targeting vector pNPloxPHyg was the one with the same orientation as the cloned AC004922 genomic fragment.
  • the final size of the ⁇ insertion construct is 14. lkb.
  • the targeting vector, target sequence and chromosomal allele resulting from homologous recombination are shown in Figure 4a.
  • the chicken DT-40 cells (clone DF141) carrying the chromosome 7 fragment (site-specifically cleaved at AF006752 locus) prepared by the method described in W001 / 011951, the above (A. 1)
  • the targeting vector pNPloxPHyg produced in step 1 was transfected and an attempt was made to insert a ⁇ sequence into the AC004922 genomic region.
  • DT-40 cells Culture of DT-40 cells is 10% Ushi fetal serum (Gibco, hereinafter referred to as FBS), 1%
  • RPMI 1640 medium Performed in RPMI 1640 medium (Gibco). Approximately 10 7 cells were washed once with no-addition RPMI1640 medium, suspended in 0.5 ml of no-addition RPMI1640 medium, and restriction enzyme Notll (Takara Shuzo). 25 to 30 mu beta Karoe the linearized targeting base Kuta one PNPloxPHyg, transferred to a queue Beck preparative for Elek Toropo Reshiyon (Bio-Rad) and left at room temperature for 10 minutes. The cuvette was set on Gene Panorosa (Bio-Rad), and voltage was applied under the conditions of 550V and 25. After standing at room temperature for 10 minutes, the cells were cultured for 24 hours.
  • Homologous recombinants were identified by PCR using the following two sets of primers. p4501oxP14L; 5 '-agttcttttgagggcctagagcctggac-3' (Tokimi U number 3)
  • thermorecycler For PCR, use Gene Amp 9600 manufactured by Perkin-Elmer as the thermorecycler, LATaq (Takara Shuzo) for Taq polymerase, and the recommended buffer and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) attached. Used according to Temperature and cycle conditions were 94 ° C for 1 minute after heat denaturation, 98 ° C for 10 seconds, 68. C 4 minutes 35 cycles. As a result of screening 96 clones, 36 clones were identified as homologous recombinants (recombination frequency 37.5%).
  • Southern clone analysis was performed on the 6 clones confirmed to be recombined by the PCR analysis as follows. This genomic DNA was treated with the restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo), electrophoresed in 0.8% agarose genome, and then subjected to hairscreening by GeneScreen Plus TM hybridization transfer membrane (NEN TM Life Science Products, Inc.). The gene sequence in AC004922 was amplified by PCR for this filter. The homologous recombinants were identified by Southern hybridization using the NPp probe (Fig. 4).
  • the NPp probe was prepared using the following primers and PCR was performed using the DF141 genomic DNA as a saddle type, and the PCR product was used as a saddle type to produce a 32 P-labeled DNA probe by random priming (Amersham, in the attached protocol).
  • PCR uses GeneAmp9600 manufactured by Perkin-Elmer as the thermal cycler, EX Taq (Takara Shuzo) for Taq polymerase, and nofers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ) was used according to the recommended conditions.
  • the temperature and cycle conditions were 35 cycles at 93 ° C for 1 minute, 93 ° C for 1 minute, 54 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute after heat denaturation at 93 ° C for 5 minutes.
  • Southern hybridization was predicted to detect a band of about 10.9 kb for non-homologous recombinants and about 8. Ikb for homologous recombinants ( Figure 4b). As a result of Southern High Prediction, all clones in the 6 clones were the desired homologous recombinants (referred to as NP clones).
  • FISH analysis was performed according to Matsubara et al. (FISH experimental protocol, Shujunsha, 1994).
  • FISH analysis was performed using 6 human clones and hygromycin as probes, 6 clones confirmed to be recombined in A.3.2 above, human chromosome 7 was all clones.
  • a signal derived from hygromycin was detected in the vicinity of 7q22 without translocation to the host chromosome, confirming that site-specific recombination occurred.
  • Figure 3a-c Figure 3a shows the DT40 (# 7)
  • Figure 3b shows the DT40 (DF141)
  • Figure 3c shows the DT40 (NP25) clone.
  • RPMI1640 medium 1 ml of serum-free RPMI1640 medium was slowly added over 1 minute, followed by addition of 9 ml of serum-free RPMI1640 medium over about 3 minutes, and left at 37 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and cultured in RPMI1640 medium containing serum for 24-48 hours. Thereafter, the medium was replaced with RPMI1640 medium containing plastosidine S (10 mg / ml) ⁇ hygromycin B (1.5 mg / ml), dispensed into five 24-well culture plates, and cultured for 3 to 4 weeks. A total of 8 resistant colonies obtained by 5 cell fusions were isolated and expanded for subsequent analysis (clone name: DT40 (RP)).
  • D14S577-F 5 'ATTTTGGGACTTCCTGGC3' (SEQ ID NO: 15)
  • D14S577-R 5 'AATCTGTTTGCAGTCTTCACC3' (SEQ ID NO: 16)
  • D14S272- F 5 'GAGTTCAAGGTTACAGTAAGTNATG3' (SEQ ID NO: 17)
  • D14S272-R 5 'CTCTTGTCTCATAGTGCAAAGG3' (SEQ ID NO: 18)
  • D14S293-F 5 'GAAACTCTAGCATGTAACACTCCAA3' (SEQ ID NO: 19)
  • D14S293-R 5 'GAGCCACTGCACCTGG3' (SEQ ID NO: 20)
  • D14S1227- R 5 'ACTCTCACACCCACCCAGAC3' (SEQ ID NO: 22)
  • D14S543-F 5 'ATGTGGGAAACAGACTCAG3' (SEQ ID NO: 23)
  • D14S543-R 5 'ATTTGGATTATTTAGAATTCCC3' (SEQ ID NO: 24)
  • 1GHMC-F 5 'GCATCCTGACCGTGTCCGAA3' (SEQ ID NO: 25)
  • IGHMC-R 5 'GGGTCAGTAGCAGGTGCCAG3' (SEQ ID NO: 26)
  • D14S1007-F 5 'AGCTCCTATATGTCTTCACACAG3' (SEQ ID NO: 2)
  • D14S 1007-R 5 'CTCCATTCCCATACGTCC3' (SEQ ID NO: 28)
  • D14S 1419- F 5 'TAGGGACAGGCAGTTGATTA3' (SEQ ID NO: 29)
  • D14S1420-R 5 'CCCACTCCATGTCTTCTGTT3' (SEQ ID NO: 32)
  • IGHV3- F 5
  • AGTGAGATAAGC AGTGGATG3 '(SEQ ID NO: 33)
  • IGHV3-R 5 'CTTGTGCTACTCCCATCACT3' (Tatsumi Tsuji U number 34)
  • CYP3A7F 5 'ACCCTGAAATGAAGACGGGC3' (SEQ ID NO: 37)
  • CYP3A5F 5 'ATAGAAGGGTCTGTCTGGCTGG3' (SEQ ID NO: 39)
  • CYP3A5R 5, TCAGCTGTGTGCTGTTGTTTGC3 '(SEQ ID NO: 40)
  • GeneAmp9600 manufactured by Perk in-Elmer is used as the thermal cycler, and EX Taq (Takara Shuzo) is used as the Taq polymerase. Buffers and dNTPs
  • dATP, dCTP, DGTP, dTTP were used according to the recommended conditions. Temperature and cycle conditions were 94 ° C for 1 minute after heat denaturation, followed by 35 cycles of 98 ° C for 10 seconds, 56 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. As a result of PCR, 6 out of 8 clones were positive with all primers. I got it.
  • these 6 hybrid clones are human chromosome 14 fragments.
  • a Cre recombinant enzyme stable expression vector pBS185hisD (Kuroiwa et al., Nature Biotech. 18: 1086, 2000) linearized with the restriction enzyme Kpnl (Boehringer) was transferred to the RP13 hybrid clone, The solution was dispensed into 24-well plates and selectively cultured for about 2 weeks in the presence of histidinol (lmg / ml). Genomes were extracted from each well and nested PCR using the following two sets of primers was performed to examine whether translocation occurred between the SC20-HAC vector and human chromosome 7 fragment.
  • GFP-2 5 '-TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG-3, (SEQ ID NO: 44)
  • PCR uses GeneAmp 9600 manufactured by Perkin-Elmer as the thermal cycler, and EX Taq (Takara Shuzo) as the Taq polymerase. Buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions.
  • the first PCR is, 9 4 ° C 1 minute after thermal denaturation, 98 ° C 10 sec, 61 ° C30 seconds, was performed by 35 cycles of 1 minute 72 ° C the PGK-1 and GFP-1 as primers .
  • CYP3A gene cluster region AC004922-CYP 3 A gene cluster 'AF006752
  • 3Mb SC20-HAC vector in clone RPC13F2 could be constructed by translocating cloned human artificial chromosome CYP3A-HAC. It was.
  • DT-40 hybrid clone RPC13F2 was cultured in 8 T225 flasks (Sumilon). When confluent, 20% FBS, 1% chicken serum, 1 ( ⁇ 4 ⁇ 2-mercaptoethanol, 0.05 ⁇ Replace with RPMI 1640 medium supplemented with / ⁇ 1 colcemid. The cells were further cultured for 24 hours to form microcells. Suspend the cells in 24 ml of serum RPMI1640 medium and dispense 2 ml each into 12 centrifuge 25 cm 2 flasks (coining) coated with lOO / g / ml poly-L-lysine at 37 ° Incubate for 1 hour at C to allow cells to attach to the bottom of the flask.
  • the culture solution was removed, and the cytochalasin B (10 / zg / ml, sigma) solution previously incubated at 37 ° C was filled into a centrifuge flask and centrifuged at 34 ° C, 8000 rpm for 1 hour.
  • the microcell was suspended in serum-free DMEM medium and purified with 8 ⁇ , 5 ⁇ m, and 3 m finoleta. After purification, it was centrifuged at 1700 rpm for 10 minutes and suspended in 5 ml of serum-free DMEM medium. On the other hand, about 10 7 CH0 cells were detached by trypsin treatment, washed twice with serum-free DMEM medium, and suspended in 5 ml of serum-free DMEM medium.
  • the microcell was centrifuged at 1700 rpm for 10 minutes, and 5 ml of the previous CH0 suspension was gently layered without removing the supernatant. After centrifugation, the culture solution was removed, 0.5 ml of PEG1500 solution (Boehringer) was added, and the mixture was vigorously stirred by pipetting for about 2 minutes. Thereafter, 10 ml of serum-free DMEM medium was slowly added over about 3 minutes and allowed to stand at 37 ° C for 10 minutes. After centrifugation, the cells were suspended in F12 medium (Gibco) supplemented with 10% FBS, dispensed into 5 to 6 24-well culture plates, and cultured at 37 ° C for 24 hours. Then, replace the G418 800 ⁇ ⁇ / ⁇ 1 containing F12 medium, and 3 to 4 weeks of selection culture.
  • F12 medium Gibco
  • Genomic DNA was extracted from G418 resistant clones and PCR was performed under the same conditions as described above using the CYP3A gene cluster detection primer and human chromosome 14 detection primer PGK-2 and GFP-2 primers. And CH0 clones that retain CYP3A-HAC were identified (eg, CH0 / C YP3A-HAC4, 25). Furthermore, a clone positive for the above PCR was subjected to FISH analysis using human C0T1 DNA as a probe. As a result, the presence of CYP3A-HAC was visually confirmed. From these results, it was concluded that a CH0 cell clone carrying CYP3A-HAC was obtained (Fig. 3g).
  • a chimeric mouse was prepared by the method of Tomizuka et al. (Nature Genet. 16: 133, 1997).
  • an 8-cell embryo obtained by male-male mating of MCH (ICR) (white, purchased from CLEA Japan) was used. It is possible to determine whether the offspring mouse born as a result of transplanting the injected embryo into a temporary parent is chimeric or not.
  • Genomic DNA was prepared from the tail of a mela mouse (chimera rate about 80%) by the method described by Tomizuka et al. (Nature Genet. 16: 133, 1997), and primers and human 14 for detection of CYP3A gene cluster.
  • PCR using primers for chromosome detection was performed in the same manner as described above to examine the retention of CYP3A-HAC. As a result, both types of primers were positive, confirming the retention of CYP3A-HAC in chimeric mouse somatic cells.
  • FISH FISH was performed using human C0T1 DNA as a probe by the method described in Shinohara et al., Human Molecular Genetics,: 10, 1163-1175, 2001).
  • the presence of CYP3A-HAC was visually confirmed, and the retention rate of CYP3A-HAC was 70% in both individuals, which almost coincided with the chimera rate.
  • the rate of melanoma indicates the contribution rate of ES cells to the tissue (hair), and the retention rate indicates the contribution rate of the introduced chromosome to the tissue.
  • CYP3A-HAC is expected to increase the offspring transmission efficiency in mice of human chromosome fragments containing the CYP3A gene.
  • mice Four female chimeric mice (chimera rate: about 100%) prepared in (F) above were mated with MCH (ICR) (white, purchased from CLEA Japan) male mouse. Of the 40 pups born from the chimeric mice, 29 were dark brown, indicating that they possessed dominant inheritance derived from ES cells. That is, it was shown that the ES cell line carrying CYP3A-HAC differentiated into functional egg cells in female chimeric mice. A portion of the tail of 29 dark brown offspring mice was cut out and genomic DNA was prepared from the sample.
  • MCH MCH
  • the obtained DNA was subjected to PCR using the CYP3A gene cluster detection primer and human chromosome 14 detection primer in the same manner as described above, and as a result of examining the retention of CYP3A-HAC, both of the two primers were negative.
  • the retention of CYP3A-HAC in the offspring of chimeric mice was not confirmed.
  • the fact that no offspring transmission was observed in chimera individuals with a high chimera rate and retention rate suggests that there are human genes on CYP3A-HAC that have an adverse effect on development or germ cell differentiation.
  • CYP3A-HAC was transferred from CH0 cells to DT40 cells with high homologous recombination frequency.
  • microcells were purified from CH0 cells (CH0 / CYP3A-HAC32, described in Example 1) containing approximately 10 8 CYP3A-HACs. Suspended in 5 ml of DMEM.
  • DMEMlOml centrifuge at 15 OOrpm for 10 minutes, 10% urine fetal serum (Gibco, hereinafter referred to as FBS), 1% chicken serum (Gibco), 1 ( ⁇ 4 ⁇ 2-
  • FBS urine fetal serum
  • Gibco 1% chicken serum
  • 1 ⁇ 4 ⁇ 2-
  • the cells were cultured in RPMI1640 medium (Gibco) supplemented with mercaptoethanol (Shida) 24 hours later, the medium was replaced with a medium containing lmg / ml G418 and cultured for about 3 weeks. DNA was extracted and PCR was performed using the CYP3A gene cluster detection primer and the human chromosome 14 detection primer.
  • DT40 (abbreviated as CYP3A-HAC) was cloned.
  • B Site-specific cleavage of human chromosome 7 region AC073842 on CYP3A-HAC (B. 1) Construction of targeting vector pTELhisD-PT
  • the targeting vector pTELhisD-PT for insertion of the human telomeric sequence into the AC073842 region located in the vicinity of the CYP3A locus on human chromosome 7 and on the telomere side is as follows. Produced. First, the AC073842 genomic region was amplified by PCR using the following primers.
  • PCR For PCR, use Perkin—Elmer Gene Amp 9600 as the thermal cycler, Taq polymerase using LATaq (Takara Shuzo), and buffers and dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) according to the recommended conditions. It was. Temperature and cycle conditions were heat denaturation at 94 ° C for 1 minute, followed by 35 cycles of 98 ° C for 20 seconds and 68 ° C for 8 minutes. The PCR product was treated with proteinase K (Gibco) and then gel filtered with CHROMASPIN-TE400 (Clontech).
  • FIG. 5 shows the targeting vector, the target sequence, and the chromosome array resulting from homologous recombination.
  • AP4M1-1L cctaacatcgtgtcccagctca (SEQ ID NO: 47)
  • AP4M1-1R tcctttcagacccccttcatcttag (Lee column number 48)
  • STAG3-1L gggcctccaataagtgtcccata (Self column number 51)
  • STAG3-1R ttgctgacttagttgcagcagga (SEQ ID NO: 52)
  • PILRB-2L cccattggcaagatacatggaga ( ⁇ Self column number 53)
  • PILRB-2R agtgtggatgctcctggatgaag (SEQ ID NO: 54)
  • hisD3 TGTGACCAAAGATTTAGCGCAGTGCGT (SEQ ID NO: 56)
  • FISH analysis was performed according to Matsubara et al. (FISH experimental protocol, Shujunsha, 1994). Of the clones confirmed to recombine in the above B.3.1, FISH analysis was performed using 7 human clones as the probes for human cot-1 DNA and histidinol, and CYP3A-HAC ⁇ was the host in all clones. A signal derived from histidinol was detected at the CYP3A-HAC ⁇ end without translocation to the chromosome, confirming that site-specific recombination occurred.
  • the DT40 (CYP3A-HAC ⁇ ) 214 that holds CYP3A-HAC A was established by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st, 1st, Tsukuba, East Ibaraki, Japan). The deposit was made internationally on October 30 of the year (2007) and was given the deposit number FERM BP-10928.
  • DT-40 hybrid clone DT40 (CYP3A-HAC ⁇ ) 214 was cultured in 8 T225 flasks (Sumilon), and when confluent, 20% FBS, 1 ° /. Chicken serum,
  • the microcell was centrifuged at 1700 rpm for 10 minutes, and 5 ml of the previous CH0 suspension was gently layered without removing the supernatant. After centrifugation, the culture solution was removed, 0.5 ml of PEG 1500 solution (Boehringer) was added, and the mixture was vigorously stirred with a pipette for about 2 minutes. Thereafter, 10 ml of serum-free DMEM medium was slowly added over about 3 minutes and allowed to stand at 37 ° C for 10 minutes. 10 ° / after centrifugation. Cells were suspended in FBS-added F12 medium (Gibco), dispensed into 5 to 6 24-well culture plates, and cultured at 37 ° C for 24 hours. Thereafter, the medium was replaced with F12 medium containing G418 800/1 g / ml, and selective culture was performed for 3 to 4 weeks.
  • FBS-added F12 medium Gibco
  • Genomic DNA was extracted from G418-resistant clones and PCR was performed using the CYP3A gene cluster detection primer and human chromosome 14 detection primer and PGK-2 and GFP-2 primers under the same conditions as described above.
  • a CH0 clone carrying CYP3A-HAC A was identified (eg, CH0 / CYP3A-HAC ⁇ 4, 6).
  • clones that were positive by the above PCR were visually confirmed to have CYP3A-HACA. From these results, it was concluded that a CH0 cell clone carrying CYP3A-HAC ⁇ was obtained.
  • the cells were transferred from CH0 cells retaining CYP3A-HAC ⁇ to mouse ES cells (wild type TT2F) by the microcell method.
  • the cells were transferred from CH0 cells retaining CYP3A-HAC ⁇ to mouse ES cells (wild type TT2F) by the microcell method.
  • Microcells were purified from CH0 cells (CH0 / CYP3A-HAC ⁇ 4, 6, 7, 10, etc.) carrying 8 CYP3A-HAC ⁇ and suspended in 5 ml of DMEM. About 10 7 mouse ES cells TT2F were detached by trypsin treatment, washed 3 times with DMEM, suspended in 5 ml of DMEM, added to the centrifuged microcell, and centrifuged at 1250 rpm for 10 minutes to completely remove the supernatant.
  • a chimeric mouse was prepared by the method of Tomizuka et al. (Nature Genet., 16: 133, 1997).
  • an 8-cell embryo obtained by male-male mating of MCH (ICR) (white, purchased from CLEA Japan) was used. Note: It is possible to determine whether a mouse born as a result of transplanting an implanted embryo into a temporary parent is a chimera by its coat color.
  • mice As a result of transplanting 800 embryos injected with wild-type TT2F / CYP3A-HAC ⁇ clones (for example, F8 / CYP3A-HAC ⁇ -7 and 11, obtained in (D) above), 92 chimeric mice ( A dark brown part was recognized in the fur color). Of these, 10 were individuals with a chimera rate of about 100%, in which almost no white part could be observed. That is, it was shown that the ES cell line (TT2F) carrying the human artificial chromosome CYP3A-HAC A has the ability to form chimeras, that is, the ability to differentiate into normal tissues of mouse individuals.
  • T2F ES cell line
  • genomic DNA was prepared, and PCR was performed using the CYP3A gene cluster detection primer and human chromosome 14 detection primer as described above. We considered maintaining HAC A. As a result, both of the two primers were positive, confirming the retention of CYP3A- ⁇ in the chimeric mouse somatic cells. It was.
  • mice having a high chimera rate and a high retention rate is thought to lead to higher efficiency of transchromosome-retaining ES cell differentiation into germ cells and transmission of progeny of the introduced chromosome.
  • the use of CYP3A-YP ⁇ is expected to increase the efficiency of offspring transmission of mouse chromosome fragments containing the CYP3A gene in mice.
  • mice Four female chimeric mice (chimera rate: approximately 100%) prepared in ( ⁇ ) above were mated with MCH (ICR) (white, purchased from CLEA Japan) male mouse. Of the 80 pups born from the chimeric mice, 75 were dark brown, indicating that they retain the dominant inheritance derived from ES cells. That is, it was shown that the ES cell line carrying CYP3A-HAC A differentiated into functional egg cells in female chimeric mice. A portion of the tail of 75 dark brown offspring mice was cut out and genomic DNA was prepared from the sample.
  • MCH ICR
  • the resulting DNA was subjected to PCR using the CYP3A gene cluster detection primer and human chromosome 14 detection primer in the same manner as described above, and as a result of examining the retention of CYP3A-HAC A, two primers were used in 24 mice. Both were positive, and CYP3A-HAC A retention was confirmed in the chimeric mouse offspring.
  • a mouse strain in which CYP3A-HAC ⁇ is transmitted is called TC (CYP3A-HAC A).
  • TC mice One male (165) and one female (155) of the TC (CYP3A-HAC A) mice obtained above CYP3A gene cluster detection primer and human chromosome 14 detection primer using the genome from brain, thymus, heart, lung, liver, kidney, spleen, small intestine, muscle, testis (or pupa) PCR was performed under the same conditions as described above, and CYP3A-HAC A was detected in all organs.
  • a representative result of the female (155) is shown in FIG.
  • TC CYP3A-HAC A mice were placed in the brain, thymus, heart, lung, liver, kidney, spleen, small intestine, muscle, testis (or uterus). Then, after extracting total RNA according to a commercially available protocol (QIAGEN), cDNA synthesis was performed according to a commercially available protocol (invitrogen), PCR was performed using this as a trapezoid, and human CYP3A gene cluster and mouse Cyp3a gene cluster Expression was detected. The primer sequences are shown below.
  • 3A7-2L ctctcagaattcaaaagact (SEQ ID NO: 65)
  • 3A7-2R agaagaagtcctccaaagcg (SEQ ID NO: 66)
  • 3A43-2L tatgacacaactagcaccac (Self column number 67)
  • 3A43-2R agtgtctagtgttctgggat (SEQ ID NO: 68)
  • 3al3- -1L agaaacatgaggcagggatt (SEQ ID NO: 73)
  • 3al3- -2R agataactgactgagccaca (SEQ ID NO: 76)
  • GAPDH-F 5, -CCATCTTCCAGGAGCGAGA-3 '(SEQ ID NO: 85)
  • GAPDH-R 5 '-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3' (SEQ ID NO: 86)
  • PCR GeneAmp9600 manufactured by Perkin-Elmer was used as the thermal cycler, EX Taq (Takara Shuzo) was used for Taq polymerase, and the attached buffers and dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) were used according to the recommended conditions. Temperature and cycle conditions are 93 ° C for 1 minute, 56 ° C after heat denaturation at 93 ° C for 5 minutes. C 1 minute, 72 ° C 1 minute 1 cycle, 35 cycles.
  • dNTP dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  • CYP3A-HAC A mice carrying TC (CYP3A-HAC A)
  • CYP3A4 is only in the liver and small intestine
  • CYP3A5 is only in the liver, small intestine and lung
  • CYP3A7 is only in the liver, small intestine, kidney and lung
  • CYP3A43 is in the liver and small intestine.
  • Cyp3al was detected only in the liver and small intestine
  • Cyp3al3 was detected only in the liver and small intestine
  • Cyp3a25 was detected only in the liver and small intestine
  • Cyp3a44 was detected only in the liver and small intestine.
  • Control GAPDH was detected in all tissues.
  • a representative result of the female (155) is shown in FIG. In this way, tissue-specific expression was observed as seen in humans, indicating that it was humanized.
  • mice Male and female TC (CYP3A-HAC A) mice 14.5 days old, 16.5 days old, 18.5 days old, 0 days old, 2 weeks old, 4 weeks old, 6 weeks old, 8 weeks old PCR was performed under the same conditions as described above using the CYP3A gene cluster detection primer and human chromosome 14 detection primer using the liver genome at 24 weeks of age as a saddle type. CYP3A-HAC ⁇ was detected at age.
  • cDNA synthesis is performed according to the commercially available protocol (invitrogen), PCR is performed using this as a cage, and the above-mentioned human CYP3A gene Expression was detected using primers that detect cluster expression and mouse Cyp3a gene cluster expression.
  • adult-expressing human CYP3A4, human CYP3A5, mouse cyp3all, and mouse Cyp3al3 were strongly expressed in the adult stage, and fetal CYP3A7 was strongly expressed in the fetus.
  • Control GAPDH was detected at the same level at all gestational and weekly ages.
  • Figure 9 shows the typical results. Thus, time-specific expression as seen in humans was observed, indicating that it became human-shaped.
  • LinkAl 5 '-TCGAGTCGCGACACCGGCGGGCGCGCCC-3' (SEQ ID NO: 87)
  • LinkA2 5 '-TCGAGGGCGCGCCCGCCGGTGTCGCGAC-3, (SEQ ID NO: 88)
  • LinkBl 5 '-GGCCGCTTAATTAAGGCCGGCCGTCGACG-3' (SEQ ID NO: 89)
  • LinkB2 5 '-AATTCGTCGACGGCCGGCCTTAATTAAGC-3' (SEQ ID NO: 90)
  • reaction solution of pBluescript II SK (-) treated with the restriction enzymes Sail and Xhol was separated with 0.8% gel, and the gel containing the vector DNA fragment was recovered. From recovered gel
  • Vector DNA fragments were purified using QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • QIAquick Gel Extraction Kit Germany QIAGEN
  • two kinds of oligo DNA LinkAl and LinkA2 were added to each 20 ⁇ 1 reaction solution, and 70 ° C15 Minutes ⁇ 37 ° C 15 minutes ⁇ room temperature 15 minutes in order
  • the DNA fragment obtained by incubation for 45 minutes was treated with the restriction enzyme. It was inserted into pBluescript II SK (-) plasmid and introduced into E. coli DH5 o; DNA was prepared from the obtained transformant, and plasmid pBlueLA was obtained.
  • the reaction solution obtained by treating pBlueLA with restriction enzymes Notl and EcoRI was separated with 0.8% gel, and the gel containing the vector DNA fragment was recovered.
  • the vector DNA fragment was purified from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • BAC clone RP 2 3-425N17 (purchased from Dienotex) was treated with Hindlll, separated with 0.8% gel, and gel containing DNA fragment (10319bp) containing mouse Cy P 3al3 gene peripheral region was isolated. It was collected. The DNA fragment was purified from the collected gel using QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert. This fragment was inserted into the Hindlll site of pBlueLAB to obtain P BACcyp3al3 (# 39) (FIG. 12). (7.2) Construction of pBlueLAB (SAAX)
  • the reaction solution obtained by treating pBlueLAB with the restriction enzyme PvuII was separated with 0.8% gel, and the gel containing the vector DNA fragment was recovered.
  • the vector DNA fragment was purified from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • the purified vector DNA was treated with Alikariphosphatase (Calf intestine derived, Takara), extracted with phenol / chloroform, and ethanol precipitated.
  • the following oligo DNA was synthesized in order to prepare DNA containing a part of the Cyp3al3 (exon 1 to intron 1) region.
  • a reaction solution obtained by treating pBlueLAB (SAAX) with restriction enzymes Ascl and Accl was separated on a 0.8% gel, and a gel containing a vector DNA fragment was recovered.
  • the vector DNA fragment was purified from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • the DNA fragment prepared above (including part of the Cyp3al3 exon 1 to intron 1 region) was inserted into the purified vector and introduced into E. coli DH5a.
  • DNA was prepared from the obtained transformant, and plasmid pBlueLAB (SAAX) cyp3al3 (209 bp) was obtained.
  • the reaction solution obtained by treating pBlueLAB (NAPF) with restriction enzymes PvuII and Fsel was separated on a 0.8% gel, and the gel containing the vector DNA fragment was recovered.
  • the vector DNA fragment was purified from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • each of the above two oligo DNAs 20 ⁇ ⁇ was added to 20 reaction solutions and incubated for 45 minutes in the order of 70 ° C 15 minutes ⁇ 37 ° C 15 minutes ⁇ room temperature 15 minutes.
  • the lObp DNA fragment was inserted into the Pvull / Fsel-treated plasmid and introduced into E. coli DH5a.
  • DNA was prepared from the obtained transformant, and plasmid pBlueLAB (NAPF) cyp3al3 (llObp) was obtained.
  • the reaction solution obtained by treating pBlueLAB (SAAX) cyp3al3 (209 bp) prepared in 7.4 with the restriction enzyme Accl was separated with 0.8% gel, and the gel containing the vector DNA fragment was recovered.
  • the vector DNA fragment was purified from the collected gel using QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert. Purified vector DNA was treated with Arica phosphatase (Calf intestine, Takara), extracted with phenol / chloroform and ethanol precipitated.
  • the reaction solution of pBACcyp3al3 (# 39) treated with restriction enzyme Accl was separated with 0.8% gel, and a gel containing about 2.8 kb DNA fragment containing part of Cyp3al3 gene Etason 1 and exon 2 was recovered. did.
  • the DNA fragment (2.8 kb) was purified from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert. The obtained DNA fragment (2.8 kb) was inserted into the above Accl-treated plasmid and introduced into E. coli DH5. DNA was prepared from the obtained transformant, and plasmid pBlueLAB (SAAX) cyp3al3 (2.8 kb) was obtained.
  • the reaction solution obtained by treating pBlueLAB (NAPF) cyp3al3 (llObp) prepared in 7.5 above with restriction enzymes Aatll and PvuII was separated on a 0.8% gel, and the gel containing the vector DNA fragment was recovered.
  • the vector DNA fragment was purified from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert. Meanwhile pBACcyp3al3
  • the pLoxP-STneo plasmid described in the W00 / 00383 pamphlet was digested with Xhol to obtain a Neo resistance gene (LoxP-Neo) having LoxP sequences at both ends. LoxP-Neo Both ends were blunted using T4 DNA polymerase to obtain a LoxP-Neo-B fragment. After digesting pBlueLAB with EcoRV, the reaction solution was extracted with phenol / chloroform, ethanol precipitated, and the LoxP-Neo-B fragment was inserted into E. coli DH5.
  • DNA was prepared for the clone so that a promoter that drives the Neo resistance gene was placed on the Clal site side of the vector, and the plasmid pBlueLAB-LoxP-Neo (R) was obtained. did.
  • pMClDT-A (Lifetech Oriental Co., Ltd.) was applied to 0.8% agarose gel after digestion with Xhol and Sail, and about lkb band was separated and recovered, and DT was prepared using QIAquick Gel Extraction Kit (Do QIAGEN) according to the package insert.
  • -Collected A fragment pBlueLAB- LoxP-Neo after Xhol digestion of (R), the reaction was phenol / chloroform extracted, ethanol precipitated, DT- after ⁇ the A fragment, was introduced into E. coli DH5 alpha. DNA was prepared from the obtained transformant, and the ⁇ 0 basic vector pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A (R) (FIG. 15) was obtained.
  • Okb were purified from the collected gels using the QIAquick Gel Extraction Kit (Do QIAGEN) according to the package inserts, and pBlueLAB (NAPF) cyp3al3 (5 lkb) was treated with restriction enzymes NotI and Fsel, separated by 0.8% gel, and a gel containing about 5.2 kb of DNA fragment containing 5 'region of Cyp3al3 gene and part of exon 1 was prepared.
  • the Notl-Fsel DNA fragment (5.2 kb) was purified from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert.
  • the reaction solution treated with Xhol was separated with 0.8% gel, and the gel containing the vector DNA fragment was recovered.
  • the vector DNA fragment was purified from the recovered gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the package insert. Ascl-Xhol obtained above
  • the DNA fragment (3. Okb) was inserted into the plasmid treated with AsclZXhoI and E. coli DH5 ⁇ was introduced. DNA was prepared from the obtained transformant, and plasmid pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A (R) +3, genome was obtained.
  • the reaction solution obtained by treating the above pBlueLAB-LoxP-Neo-DT-A (R) +3 ′ genome plasmid with restriction enzymes Notl and Fsel was separated with 0.8% gel, and the gel containing the vector DNA fragment was recovered.
  • the vector DNA fragment was purified from the collected gel using the QIAquick Gel Extraction Kit (Germany QIAGEN) according to the V ⁇ attachment.
  • the Not I-Fsel DNA fragment (5.2 kb) obtained above was inserted into the plasmid treated with NotlZFsel and introduced into E. coli DH5. DNA was prepared from the resulting transformant, and plasmid pcyp3al3-K0
  • Mouse ES cells can usually be established by the method described below. 2.5 days after fertilization obtained by mating male and female mice were collected and cultured in vitro in an ES cell culture medium, and embryos that had developed to blastocysts were separated from the cultured embryos. The embryo is seeded and cultured in a feeder cell medium, and the cell mass of the embryo grown in ES-like form is dispersed using an ES cell medium containing trypsin, and Cultivate using feeder cell culture medium, and further subculture using ES cell culture medium to isolate proliferating cells.
  • the mouse ES cell TT2 (Yagi et al.) was obtained by linearizing P cyp3al3-K0 with the restriction enzyme Notl (Takara Shuzo) and following an established method (Shinichi Aizawa, BioManual Series 8, Gene Targeting, Yodosha, 1995). Analytical Biochem., 214: 70, 1993).
  • ⁇ 2 cells were cultured according to the method described (Shinichi Aizawa, supra), and vegetative cells were G418-resistant primary cultured cells (purchased from Invitrogen) treated with mitomycin C (Sigma, USA). First, the proliferated ⁇ 2 cells were trypsinized and suspended in HBS so that 3 ⁇ 10 7 Zml.
  • 0.5 ml of the cell suspension was mixed with 10 ⁇ g of vector DNA, and then electroporation was performed with a gene pulser cuvette (electrode distance: 0.4 cm, Biorad, USA) ( Capacity: 960 F, voltage: 240V, room temperature).
  • the cells that were subjected to the electroporation were suspended in 10 ml of ES medium, and then seeded on one 100 mm tissue culture plastic petri dish (Falcon, Dettanson, USA) in which feeder cells were seeded in advance. After 24 hours, the medium was replaced with ES medium containing 200 g / ml neomycin (Sigma, USA).
  • neomycin resistant TT2 cell genomic DNA was digested with the restriction enzyme Sacl (Takara Shuzo) and separated by 0.8% agarose gel electrophoresis. Subsequently, Southern plots were used to detect homologous recombinants using a DNA fragment (3 'KO-prob Fig. 17) located downstream of the 3' homology region of the targeting vector as a probe. In wild-type TT2F cells, one band (approximately 8.3 kb) was detected by digestion with Sacl.
  • G418-resistant mouse ES cell lines (# 4, # 16, # 25, # 36, # 42) obtained in 7.11 above were launched from the frozen stock, and they were transferred to MCH (ICR) mice (CLEA Japan). 8-10 embryos obtained by male-male mating were injected for each embryo.
  • mice derived from the pcy P 3al3-K0 ES cell line (# 4, # 42) prepared in 7.12
  • the 100% chimeric chimera and males (# 4: 9 mice, # 42 : 1) was bred with C57BL / 6N female mice (CLEA Japan) to determine if ES cell-derived P cyp3al3- K0 alleles were born.
  • PCR analysis was performed on the genomic DNA prepared from the tail of the pupal mouse obtained by this crossing using the following primers.
  • neo3-1 5'-TTCCACACCTGGTTGCTGAC-3, (SEQ ID NO: 104)
  • LA - Taq reaction according to the attached document using (Takara Bio) (30 mu 1) were prepared, the 3 as primers 'g enome2 and 5' do dishes (Fig. 18, (1) X (2 )), or 3.
  • a combination of genome2 and neo3-1 (Fig. 18, (1) X (3)), and the pup mouse genomic DNA was added as a saddle type, and kept at 94 C C5 minutes, then 94 ° C 30 seconds ⁇ 60.
  • Amplification was performed 35 cycles, with C30 seconds ⁇ 72 ° C 3 minutes as one cycle.
  • the reaction solution was 0.8 ° /.
  • the amplification product was detected by electrophoresis on a gel.
  • Cyp3a44 A method for producing a cyp3a44 / ll / 25-K0 mouse in which Cyp3a44, Cyp3all, and Cyp3a25 are deleted at the same time in one mouse Cyp3a family gene is disclosed in W001Z011951.
  • Cyp3a4, Cyp3al l and Cyp3a25 genes form a cluster on mouse chromosome 5 with the other two Cyp3a family genes (3al6, 3a4l). The distance between this Cyp3a family gene cluster and Cy P 3al3 gene Is about 10Mb.
  • PCR analysis described in the above 7 ⁇ 13 was performed. Based on the results, cyp3al3-K0 heterozygotes (Fig. 18) that were positive for both (1) X (2) and (1) X (3) primer combinations were selected, and Cyp3a44 / ll / 25
  • the following PCR analysis was performed to determine the gene type of the locus.
  • both K0 alleles obtained above were heterozygous for the double heterozygote (same chromosome) by male and female mating, and homozygotes for both cyp3a44 / ll / 25- K0 and cy P 3al3- ⁇ 0 alleles.
  • males were mated with wild-type C57BL / 6N female mice (CLEA Japan), and genomic DNA was prepared from the tails of the resulting pups.
  • cyp3a44 / ll / 25-K0 and cyp3al3-K0 genotype analyzes shown above in 7.12 and above were performed (FIGS. 18 and 19).
  • cyp3al3-K0 (1) X (2) primer set negative, (1) X (3) primer set positive, and cyp3a44 / ll / 25-K0 (4) X
  • Individuals that were homozygous for both K0 alleles that were negative in the primer set of 5) and positive in the primer set of (6) X (7) were obtained (Figs. 18 and 19). Write down).
  • the genotype of Cyp3a cluster is shown in Table 1 below corresponding to the above primers.
  • Priraerl is SEQ ID NO: 103
  • Priraer2 is SEQ ID NO: 105
  • Primer3 is SEQ ID NO: 104
  • 3a25Fw represents the sequence of SEQ ID NO: 106
  • 3a25Rv represents the sequence of SEQ ID NO: 107
  • PGK2 represents the sequence of SEQ ID NO: 43
  • GFP2 represents the sequence of SEQ ID NO: 44.
  • the reproductive function of the obtained double homomouse male and female individuals was normal, and this line was maintained by mating between the double homozygous male and female individuals.
  • the TC (CYP3A-HAC ⁇ ) produced in Example 2 was backcrossed to the ⁇ cyp line produced in Example 7, and the obtained mouse individuals were subjected to genotype analysis using the PCR method. (See Examples 4 and 7). Part of the tail of 109 pups obtained by mating was cut out, and genomic DNA was prepared from the sample. The obtained DNA was subjected to PCR using the CYP3A gene cluster detection primer Optohito chromosome 14 detection primer and the primers listed in Table 1 in the same manner as described above to maintain CYP3A-HAC ⁇ .
  • mice Of the TC (CYP3A-HAC ⁇ ) / ⁇ cyp mice obtained above, one male ( 3 01) and one female ( 29 8) mice were collected from the brain, thymus, heart, lung, liver, kidney, spleen, small intestine, PCR is performed under the same conditions as described above, using the genome from muscle and testis (or eclampsia) as a pupa and using the primer for detecting CYP3A gene cluster detection primer 14 chromosome. And CYP3A_HAC A was detected in all organs.
  • TC CYP3A-HAC ⁇
  • ⁇ cyp mice one male (301) and one female ( 298 ), brain, thymus, heart, lung, liver, kidney, spleen, small intestine, muscle, testis
  • FISH analysis was performed using human cot-1 DNA as a probe by the method described in a report by Shinohara et al. (Human Molecular Genetics, 10: 1163-1175, 2001)
  • CYP3A-HAC ⁇ was retained in 49-95%.
  • a high chromosomal retention rate of over 84% was confirmed in the liver and small intestine where CYP3A is mainly expressed.
  • the total RNA of male (301) and female (298) livers at 10 weeks of age in cyp mice was extracted according to a commercially available protocol (QIAGEN) and then synthesized according to a commercially available protocol (invitrogen). PCR was carried out using the above as a type, and the expression was detected using primers for detecting the expression of the human CYP3A gene cluster and the expression of the mouse Cyp3a gene cluster described above.
  • the mouse Cyp3a gene cluster is not expressed in TC (CYP3A-HAC A) / A cyp mice, the human CYP3A gene cluster is expressed, and the mouse Cyp3a gene cluster and the human CYP3A gene cluster are expressed in ⁇ cyp mice.
  • the human CYP3A gene cluster 1 was not expressed in B6 normal mice, and the mouse Cyp3a gene cluster 1 was expressed (FIG. 20).
  • PCN Pregnenolone 16
  • CYP3A-HAC ⁇ CYP3A-HAC ⁇
  • ⁇ cy mice B6 normal mice to investigate the effect on CYP3A / Cyp3a gene expression, a single dose of 100 mg / kg and administered intraperitoneally for 4 days.
  • the dosing solution was prepared by suspending PCN in corn oil (Sigma).
  • TC CYP3A-HAC A
  • Acyp mice as well as human-specific metabolites.
  • TC (CYP3A-HAC ⁇ ) / ⁇ cyp mice, A cyp mice, B6 normal mice, human liver microsomes and midazolam were reacted, and LC-MS / MS was performed as follows. Mass spectrometry.
  • reaction mixture (10 ⁇ midazolam, 87.5 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4), 0.5 mg / mL liver microsome
  • the NADPH production system (3.3 mM ⁇ -NADP +, 80 mM glucose-6-phosphate, 10 units / mL glucose-6-phosphate dehydrogenase) was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes.
  • the mixture centrifugal separation (3, 000r P m, 5 min) the supernatant.
  • Example 7 The ⁇ cyp mouse tail fibroblasts obtained in Example 7 were treated with the method of Wakayama et al.
  • the cells were resuspended in 10 ml of DMEM for ES, seeded on gelatin-coated 100-awake dish, and cultured for about 1 hour. Thereafter, the medium was gently collected and centrifuged for 10 minutes. After centrifuging, the supernatant was aspirated, the cell mass was tapped and loosened, and seeded so that dozens of well-separated colonies appeared in a 60 mm dish pre-seeded with feeder cells. One week later, 12 colonies were picked up in 24 wells pre-seeded with feeder cells, and a few days later, they were seeded in two 24 wells pre-seeded with feeder cells, and medium containing G418 on one side. On one side
  • a master plate of a clone killed with G418 was grown, and cells in one well of a 24-well plate were seeded in 2 wells of a 4-well plate. One well of the 4-well plate was stored frozen at -80 ° C. The remaining 1 well was seeded and cultured in a 3.5 cm gelatin-coated dish for genomic DNA acquisition.
  • Primer / 2 and Primerl / 3 primers described in Example 7 are prepared by preparing genomic DNA from the above cells and deleting the neo gene. And confirmed by PCR. The clone from which the Neo resistance gene was removed was predicted to have the same pattern as normal mice in Table 1.
  • 480-1 is 5 clones out of 12 clones
  • 480-2 is 7 clones out of 12 clones
  • 480-4 is 8 clones out of 12 clones
  • 596-1 is 9 clones out of 12 clones
  • 596 2 is 8 clones out of 12 clones
  • G418 was non-resistant in all of these clones.
  • ⁇ cyp-ntES (G-) cells were confirmed.
  • CYP3A-HAC or CYP3A-HAC A retaining ⁇ cyp-ntES To produce a chimeric mouse retaining cells, CYP3A-HAC or CYP3A-HAC ⁇ retaining CH0 obtained in Example 2 The cells were introduced into the ⁇ cyp-ntES (G-) cells obtained in Example 14 by the microcell method. According to the method of Tomizuka et al. (Nature Genet. 16: 133, 1997), approximately 10 8 CYP3A-HAC or CYP3A-HAC ⁇ -retaining CH0 cells
  • Microcells were purified from (CH0 / CYP3A-HAC4, 25, 32, 33, etc., or CH0 / CYP3A-HAC ⁇ 4, 6, 7, 10, etc.) and suspended in 5 ml of DMEM. Approximately 10 7 ⁇ cyp-ntES (G-) cells
  • ⁇ cyp- ntES (G-) cells ( ⁇ cyp- ntES (G-) / CYP3A-HAC) are 21 clones, CYP3A- HAC
  • ⁇ cyp- ntES (G-) cells ( ⁇ cyp- ntES (G-) / CYP3A-HAC ⁇ ) that retain ⁇ are 57 clones with CYP3A gene cluster detection primer and human chromosome 14 detection probe. It was positive by PCR using Limer. Furthermore, ⁇ cyp-ntES (G-) obtained above
  • the clones with normal mouse karyotype were 5 clones for ⁇ cyp-ntES (G-) / CYP3A- HAC and 9 clones for A cyp-ntES (G-) / CYP3A-HAC ⁇ . From the above, we concluded that at least 5 clones of A cyp-ntES (G-) / CYP3A-HAC cells and 9 clones of ⁇ cyp-ntES (G-) / CYP3A-HAC ⁇ were obtained.
  • a chimeric mouse was prepared by the method of Wakayama et al. (Science, 292: 740, 2001).
  • a blastocyst stage embryo obtained by male-male mating of MCH (ICR) (white, purchased from CLEA Japan) was used. Note: It is possible to determine whether a mouse born as a result of transplanting an implanted embryo into a temporary parent is a chimera by its coat color.
  • a cyp-ntES (G-) / CYP3A- HAC or ⁇ cyp- ntES (G-) / CYP3A- HAC ⁇ eg ⁇ cyp-ntES (G-) / CYP3A-HAC5, 6, 7 and 11, ⁇ cyp- About 500 embryos injected with ntES (G-) / CYP3A-HAC ⁇ 25,63,67, obtained in Example 15) were transplanted into temporary parents.
  • ⁇ cyp-ntES (G-) / CYP3A-HAC There were 26 chimeric mice, and 29 chimeric mice (with a black part in the coat) were born from ⁇ cyp-ntES (G-) / CYP3A-HAC ⁇ .
  • the ntES cell line carrying the human artificial chromosome CYP3A-HAC or CYP3A-HAC A retains the ability to form chimeras, that is, retains the ability to differentiate into normal tissues of mouse individuals. It was.
  • Example 16 ⁇ cyp-ntES (G-) / CYP3A-HAC clone ( ⁇ cyp-ntES (G-)
  • tail fibroblasts prepared from chimeric mice derived from A cyp-ntES (G _) / CYP3A-HAC or ⁇ cyp-ntES (G-) / CYP3A-HAC ⁇ (chimera rate: about 50%).
  • G _ A cyp-ntES
  • G- ⁇ cyp-ntES
  • G- ⁇ cyp-ntES
  • a mammalian artificial chromosome vector having a specific region containing the human P450 gene (CYP3A gene cluster) on human chromosome 7 is introduced into a non-human mammal such as a mouse
  • a non-human mammal such as a mouse
  • the present invention has the following utility.
  • a human artificial chromosome that retains the human P450 gene region, can be transmitted to the next generation with high efficiency, and is stably maintained within the individual is provided.
  • ES cells derived from non-human animals that retain the human artificial chromosome are provided.
  • the present invention also provides a non-human animal and its progeny that stably maintain the human artificial chromosome within an individual and transmit the progeny to the next generation with high efficiency.
  • Non-human mammal endogenous P450 gene which is a homologous gene to this, is completely deduced with respect to a specific P450 molecular species in offspring produced by mating with knockout non-human mammals or their descendants. It is considered that the Therefore, not only the tissue specificity of expression, drug induction and the ratio of expression, but also the function of metabolites is provided for human P450-introduced non-human mammals that are completely humanized with respect to specific P450 molecular species. It is considered possible.
  • metabolism, drug toxicity, and malformation can be evaluated by whole fetal culture of human P450-introduced non-human mammals that are completely humanized for this specific P450 molecular species.
  • human P450 protein when a tissue or cell derived from the non-human mammal is immortalized and used in a culture system, human P450 protein can be stably supplied. Furthermore, it can be used as a research material in a culture system for drug metabolism in humans.

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Abstract

　この発明は、ヒトチトクロームP450遺伝子を含むヒト7番染色体断片を保持し、かつ、子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒト７番染色体断片が、染色体マーカーAC004922とAC073842との間に存在する少なくともヒトCYP3A遺伝子クラスターを含む約1Mb±500Kbサイズの領域を保持することを特徴とする、上記哺乳動物人工染色体ベクター、並びに、該ベクターを含む非ヒト哺乳動物に関する。

Description

ヒトチトクローム P450遺伝子（クラスター） を含む哺乳動物人工染色体ベクター 及び
それを保持する非ヒ ト哺乳動物 技術分野
本発明は、ヒ トチトクローム P450明遺伝子を含むヒ ト 7番染色体断片を保持しか つ子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベ糸クターに関する。
本発明はまた、 上記ベクターを保持する非ヒト哺乳動物、 例えばマウス、 その 細胞、 器官又は組織に関する。
本発明はさらに、 上記非ヒ ト哺乳動物、 その細胞、 器官又は組織を用いて、 ヒ トチトクローム P450を製造する方法、或いは薬物又は食品の薬理作用及び/又は 代謝を試験する方法に関する。 背景技術
薬物の体内での代謝は、 主に肝臓に存在するチトクローム P450 (以下、 「P450J ともいう。 ）によって行われる。 P450 は、 多くの遺伝子からなるスーパーフアミ リーを形成しており、アミノ酸配列に関して相同性が 40%を超える P450を同じフ アミリーとし、 同じファミリー内でも 55%以上のアミノ酸相同性を示すものにつ いてはサブフアミリーに分類する（非特許文献 1)。 同じサブフアミリーに属して いても、 ヒ トとラッ.トの P450を比較した場合では性質の違いが認められ、基質と なる物質や代謝産物に違いが認められることがある。 ゆえに、 ある薬物の代謝に ついてラッ トでの情報をそのままヒ トに適用することはできず、 ヒ トでの薬物代 謝を正確に予測する試験系の開発が望まれている （非特許文献 2)。
又、 ヒ トでの薬物代謝を検討するのであれば、 ヒト肝ミクロソームを用いるの がーつの手段であるが、 ヒ トの肝ミクロソームは入手が困難である。 一方、 遺伝 子工学的な手法でヒ トの酵素を比較的容易に作ることが可能になってきており、 これによると安定して同一の規格のものを供給できることから、 その利用が考え られる （非特許文献 3)。 他方、 P450により代謝されて活性化された薬物の生体へ の影響を調べるために、 in vitroの系が構築されている。 これは、 肝ミクロソー ムと薬物を細胞の培養液中に添加することにより、 細胞外で代謝された代謝産物 の前記細胞への影響をみるものである。 この場合、 活性化された物質は細胞膜と 吸着し、 一部分しか細胞内に到達しない。 したがって、 細胞に対する代謝産物の 影響を正確に把握することができないと考えられる。細胞そのものが P450を発現 する場合、 細胞膜に吸着することなく侵入した薬物が細胞内で活性化すると考え られ、毒性をはじめとする代謝産物による影響を適切に再現できると考えられる。 このような観点から、ヒ ト P450遺伝子を導入した細胞を代謝産物の毒性評価に用 いることが望ましいとされている（非特許文献 4)。
しかし、 上記の in vitroでの発現系を用いた方法は、 いずれも何らかの問題点 を抱えているのが現状である。ヒ ト P450を導入した酵母を用いた発現系（例えば、 非特許文献 5)では、 P450の発現量はある程度得られ、 P450 cDNAを改変せずに発 現できることなどの利点はあるものの、系に酵母自身の P450が含まれる問題があ る。 大腸菌を用いる発現系（例えば、 非特許文献 6)は取扱いが容易で大量に酵素 を得ることができるものの、 安定して発現させるためには発現させる P450の N- 末端アミノ酸を改変する必要がある。 また、 この改変が酵素活性に影響を与える 可能性が示唆されたり、大腸菌が P450活性を発揮するのに必要な還元酵素を持つ ていないため還元酵素を別に添加したりする必要があるなどの問題もある。また、 昆虫細胞とバキュロウィルスを用いる系 （例えば、 非特許文献 7)では発現量も多 く N -末端アミノ酸の改変も必要ないが、発現のための操作に若千の熟練を要する。 ヒト肝癌由来の HepG2細胞とワクシニアウィルスを用いる系 （例えば、 非特許文 献 8)ゃヒ ト Bリンパ球を用いる系はヒ トの細胞を用いることもあり、 P450がより in vivo の環境に近い状態で発現していると考えられるが、 ワクシニアウィルス の使用を伴なう場合や HepG2細胞ミク口ソームを用いる場合は、 安全性に対する 配慮が必要である （非特許文献 2)。
薬物代謝酵素の生物学的役割と制御については、 未だに完全には解明されてい ない。 これらの動物細胞、 酵母、 昆虫、 細菌を用いる実験系は、 in vitroでの薬 物代謝と化学発癌における P450の役割を検討するモデルとなり うるが、薬物動態 のパラメーターなど他の要素のために、 in .vivo における状態を充分には反映し ていないことを踏まえて使用しなくてはならない（非特許文献 9)。 しかし、 ヒ ト の P450遺伝子が導入され、体内でヒトと同じ代謝産物を生成する実験動物ができ れば、 ヒ トで特異的に生成する代謝産物であっても、 その薬理作用はもとより毒 性に関して動物を用いて検証できるなどの大きな利点があげられる （非特許文献 10)。 そのため、 P450 遺伝子を導入したトランスジエニックマウスについての研 究も行われている。 例えば Ramsdenら （非特許文献 11) は、 ラット Cyp2B2遺伝 子を導入したトランスジエニックマウスを作製した。ラット Cyp2B2遺伝子の発現 は、 組織特異的、 発生特異的に制御されると共に、 フヱノバルビタールによって 発現が誘導されることが知られている。 トランスジエニックマウスにおける、 フ エノバルピタールによる トランスジーンの発現誘導には 800bpのプロモーター配 列だけでは不充分であり、さらに上流の遺伝子配列が必要であることが示された。 また、 トランスジーンの発現のコントロールには、 転写開始点の数十キロベース 上流の配列が必要であり、 これによつて発現量や組織特異性も再現できる可能性 が示された （非特許文献 11)。
また、 Loefgrenらは CYP2C18および CYP2C19を含む細菌人工染色体（BAC)をも つトランスジエニックマウスを作製し、 発現に性差があることが報告された。 こ の系では導入された遺伝子の導入部位はマウス 2番染色体 C1であり、コピー数は 11-13であった。 通常ヒトの遺伝子コピー数は 2であることからヒトの CYP2Cを 生理的に発現させるモデルとしては不十分であることが示唆された （非特許文献 12)。
また、 Yuら （非特許文献 13) はヒ ト成体に特異的に発現する CYP3A4を含む細 菌人工染色体 (BAC)をもつトランスジエニックマウスを作製した。この例では導入 した CYP3A4の遺伝子の発現は 2週齢および 4週齢でのみであつたが、発現誘導剤 を投与すると、 8 週齢においても発現が観察された。 この トランスジエニックマ ウスでは乳腺の発達が悪く、 子孫の生存が悪かった。 この系では導入された遺伝 子の導入部位やコピー数は検定されていない。 従って、 CYP3A4遺伝子によるもの かどうかは、 いくつかのコピー数、 挿入部位の異なる系統での再現性を取る必要 があると考えられた。 さらにまた、 Li ら （非特許文献 14) は、 ヒ ト胎児に特異的に発現する CYP3A7 をもつトランスジエニックマウスを作製した。 この例ではメタ口チォネインプロ モーターが使用され、 P450 遺伝子の組織特異的な誘導発現は観察されなかった。 すなわち、 作製された 6系統のトランスジエニックマウスのうち 1系統のみで、 導入した CYP3A7遺伝子の肝臓での発現が認められたが、他の系統ではさまざまな 臓器において発現が認められ、 本来の組織特異性が認められなかった。 したがつ て、肝臓特異的に P450遺伝子を発現させるためにはメタロチォネィンプロモータ —では不充分であると考えられる。
CYP3A に関しては、 胎児期の毒性研究のためのツールとしての応用についての 研究も行われている （非特許文献 4)。 また、 Campbel l ら （非特許文献 15) は、 ラット CyplAl遺伝子のプロモーターとその上流配列を lacZ遺伝子と結合した遺 伝子を導入したトランスジエニックマウスを作製し、それにより CyplAlプロモー ターによる遺伝子発現の制御につレ、て解析を進めた。
トランスジエニックマウスに限らず、 P450遺伝子のノックァゥトマウスも開発 されてきており、 発生や細胞レベルのホメォスタシスへの影響や in vivoでの薬 物あるいは化学物質を介した毒性に関する P450 の役割について解明する重要な ツールとして期待されている（非特許文献 16)。 例えば、 内因性 Cypla2のノック ァゥトマウスは 2つの研究グループによって作製された。 Pineauら （非特許文献
17)によって作製された Cypla2ノックァゥトマウスは、ヘテロでは正常であるが、 ホモであると生後すぐに死亡した。 一方、 Liangら （非特許文献 18) によって作 製された Cypla2ノックアウトマウスは、ホモ個体の表現型に異常はなかった。 こ の違いは、 欠損させる遺伝子の配列が異なることに起因しているものと考えられ る。 また、 Cypla2ノックアウトマウスを用いた P450遺伝子の欠損の影響や代謝 の異常についても報告 （例えば、 非特許文献 19)されており、 このようなノック アウトマウスを用いた Cypla2の代謝系での役割が解明されてきている。エタノー ルを代謝する主要な酵素として知られる Cyp2el についてもノックアウトマウス が作製された （非特許文献 20)。 Cyp2elはエタノール以外にも、 ァセトアミノフ ヱンゃァセトン、 ァラキドン酸の代謝に関与していることが知られているが、
Cyp2el が完全に欠損したホモ個体であっても外見上はワイルドタイプのマウス と変わらなかったが、 ァセトァミノフェンに対する耐性が上がり、 また、 病理所 見の結果などからァセトァミノフェンによる肝毒性に CyP2el による代謝が大き く関与していることが示唆された。これらの P450遺伝子ノックアウトマウスのい ずれも、 遺伝子ノックァゥトによる当該遺伝子の機能解明を目的として作製され たものであり、導入される外来の P450遺伝子の発現レベルの上昇を目的としたも のではない。
他方、 Herwaardenらは Cyp3a遺伝子ノックァゥトマウスを作製し、 さらにヒ ト の CYP3A4遺伝子を肝臓または小腸に発現させたマウスを作製し、ドセタキセルの 代謝に関する研究が報告されている。 しかしながら、 これらのマウスでは肝臓ま たは小腸特異的なプロモーター下流にヒ ト CYP3A4遺伝子を繋いで強制的に発現 させており、 ヒ トの発現量を生理的に再現するものではない （非特許文献 21)。 このような事情に鑑み、 例えば、 特許文献 1では、 ヒ ト正常線維芽細胞由来 7 番染色体の部分断片をミクロセル法によりマウス ES細胞（胚性幹細胞）に導入し、 この ES細胞を用レ、て正常組織においてヒ ト染色体断片を保持し、薬剤の誘導によ つて肝臓、小腸においてヒト CYP3A4遺伝子を発現するキメラマウスが得られたこ とが記載されている。これに関連して、特許文献 1は、 CYP3A遺伝子群（以下、「CYP3A 遺伝子クラスター」 ともいう。） を含むヒ ト 7番染色体断片 （約 5Mb) を SC20 - HAC ベクター（FERM BP-7583 ;特許文献 2)に転座して得られた #7_HACベクターを開示し ているが、 このベクターは子孫伝達能を欠くものであった。 さらに、 特許文献 1 には、 ヒ ト P450遺伝子（CYP3Aファミリー） を有し、 さらにマウス内在性の P450 遺伝子（Cyp3aフアミ リー）が破壊されたマウスの作製が記載されている。
特許文献 1に記載のごとく、 ヒ ト CYP3A遺伝子群を含む 7番染色体の部分断片 を保持するマウスまたは、 ヒ ト CYP3A遺伝子群を含む 7番染色体の約 5Mbの領域 をマウス個体内で安定であることがわかっているヒト人工染色体ベクター（SC20) に搭載し、 そのヒ ト人工染色体ベクターを保持するマウスが作製されたが、 キメ ラマウスからの安定的な子孫伝達が不可能であつた。 子孫伝達個体が得られない 場合、 キメラマウスによるマウスの生産となり、 その都度胚操作を必要とするこ とや均一な遺伝的背景を持つマウスが得られないこと、 さらには、 目的とする複 数のヒ ト P450遺伝子群が導入され、かつ内在性の薬物代謝酵素が破壊された子孫 マウスが得られないことを意味する。 特許文献 1記載のヒ ト CYP3A遺伝子群を保 持するキメラマウスから子孫伝達しない原因の 1つとしてこれまでにゲノムイン プリンティングに関与する遺伝子や発生 ·生殖細胞分化に重要とされる遺伝子の 過剰発現は胎生致死になることが報告されている （非特許文献 22-24)。
しかし一方で、 ヒ ト人工染色体ベクター（以下、 「HACベクター」 ともいう。 ）の 利点は、 1)宿主染色体に挿入されず独立して維持されることから、 宿主遺伝子を 破壊しない、 2)—定のコピー数で安定に保持され、 宿主細胞の生理的発現制御を 受けることから、 挿入された遺伝子の過剰発現や発現消失が起きない、 3)導入可 能な DNAサイズに制約がないことから、 発現調節領域を含む遺伝子や複数遺伝子
/アイソフォームの導入が可能となることが挙げられる。 このように、 ヒ ト人工 染色体ベクターは、 従来のベクター系 （ウィルス、 YAC、 BAC、 PAC、 コスミ ド、 プ ラスミ ド） にはない利点を有していることから、 新たな遺伝子の機能解析のため のベクターやヒ ト型モデル動物の作製系として期待されている （例えば、 非特許 文献 25-26)。
特許文献 1 国際公開第 W001/011951号パンフレツト
特許文献 2 特開 2005-230020号公報
非特許文献 1 Nelsonり， Pharmacogenetics, 6 : 1， 1996
非特許文献 2 舱江ら， バイオサイエンスとインダストリ一， 55 : 81， 1997 非特許文献 3 鎌滝， （財） 安評センター研究所報， 7 : 27, 1997
非特許文献 4 Kamataki ら， Toxicology Letters, 82-83： 879, 1995
非特許文献 5 Kovalevaら， Biochem. Biophys. Res. Coramun.， 221： 129， 1996 非特許文献 6 Gi l lamら， Arch. Biochem. Biophys.， 305： 123， 1993
特許文献 7 Asseffaら， Arch. Biochem. Biophys.， 274 : 481， 1989
非特許文献 8 Shouら， Mol. Carcinog. , 10 : 159， 1994
非特許文献 9 Wolf ら， J. Pharm. Pharmacol. , 50 : 567， 1998
非特許文献 1 0 鎌滝ら， 薬物動態， 13 : 280, 1998
非特許文献 1 1 Ramsdenら， J. Biol . Chem.， 268 : 21722， 1993
特午文献 1 2 Loeigren ら， American Soc iety ror Pharmacology and
Experimental Therapeut ics, 36 : 955-962, 2008 非特許文献 1 3 Yuら， Endocrinology, 146 : 2911, 2005
非特許文献 1 4 Li ら , Archs. Biochem. Biophys. , 329： 235， 1996
非特許文献 1 5 Campbel l , J. Cell Sci.， 109 : 2619， 1996
非特許文献 1 6 McKinnonら' Cl in. Exp. Pharmacol . Physiol.， 25 : 783， 1998 非特許文献 1 7 Pineau ¾ , Proc. Natl Acad. Sci. USA. , 92 : 5134, 1995 非特許文献 1 8 Liangら， Proc. Natl Acad. Sci . USA. , 93： 1671, 1996 非特許文献 1 9 Genterら， Biochem. Pharmacol .， 55 : 1819， 1998
非特許文献 2 0 Leeら， J. Biol. Chem.， 271： 12063, 1996
非特許文献 2 1 Herwaardenら， J. Cl in. Invest.， 117 : 3583-3592, 2007 非特許文献 2 2 Okitaら， Genomics.， 81 (6) : 556， 2003
非特許文献 2 3 Sun FL， Dean WL， Kelsey G， Al len ND, Reik W. ： Transact i vat ion of Igf 2 in a mouse model of Beckwith - Wiedemann syndrome. Nature. 1997 Oct 23 ; 389 (6653) : 785， 787.
非特許文献 2 4 Puechら， Pro Natl . Acad. Sc i . USA, 97 : 10090， 2000 非特許文献 2 5 Kuroiwaら、 Nature Biotech. , 18： 1086, 2000
非特許文献 2 6 Tomizukaら， Proc. Natl . Acad. Sc i. USA, 97 : 722, 2000 発明の開示
本発明の目的は、 ヒ ト 7番染色体上の発生段階 ·生殖細胞分化に重要であると 思われる遺伝子を除き、 かつヒト P450 (CYP3A)遺伝子群を含む特定の遺伝子領域 を、 ヒト人工染色体ベクター上にクローニングし、 非ヒ ト哺乳動物へ導入するこ とで子孫伝達可能なトランスクロモソミック動物を作製することにある。 これに よって、ヒ トチトクローム P450遺伝子を含むヒ ト 7番染色体断片を保持する子孫 伝達可能なヒト人工染色体ベクター、 及び該ベクターを含む非ヒ ト哺乳動物 （例 えばげつ歯類、 有蹄類など） を得ることができる。
本発明の別の目的は、 上記の非ヒト哺乳動物、 或いはその組織、 器官又は細胞 を用いて、薬物や食品の薬理作用又は代謝を試験する方法を提供することにある。 本発明者らは、 鋭意研究の結果、 ヒ ト 7番染色体において、 ヒ ト CYP3A遺伝子 クラスターのテ口メァ側 AC073842において削除し、ヒ ト CYP3A遺伝子クラスター のセントロメァ側 AC004922において ΙοχΡ配列を挿入することにより、発生段階' 生殖細胞分化に重要であると思われる遺伝子を除いたヒ ト P450 (CYP3A)遺伝子群 を含む特定のヒ ト 7番染色体の遺伝子領域 （約 lMb± 0. 5Kb) をヒ ト人工染色体べ クタ一上にクローニングし、 そのヒ ト人工染色体ベクターを、 非ヒ ト哺乳動物で あるマウスに導入することによって、 子孫伝達可能なトランスクロモソミックマ ウスが得られることを見出し、 本発明を完成するに至つた。
発明の概要
したがって、 本発明は、 要約すると、 以下の特徴を有する。
(1) ヒトチトクローム P450遺伝子を含むヒト 7番染色体断片を保持し、 かつ、 子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒ ト 7番染色体断片が、 染色体マーカー AC004922 と AC073842 との間に存在する少なく ともヒ ト CYP3A遺 伝子クラスタ一を含む約 lMb± 500Kbサイズの領域を保持することを特徴とする、 上記哺乳動物人工染色体べクタ一。
(2) ヒト人工染色体ベクターである、上記（1)に記載の哺乳動物人工染色体べク タ ' ~
(3) 前記ヒト人工染色体ベクターが、前記ヒト 7番染色体断片を、 ヒ ト 14番染 色体由来の SC20ベクター（FERM BP- 7583)に転座して得られたベクターである、上 記（2)に記載の哺乳動物人工染色体ベクター。
(4) 前記ヒ ト人工染色体ベクターが、 受託番号 FERM BP- 10928のニヮ トリ DT40 細胞株 DT40 (CYP3A-HAC Δ ) 214に保持された CYP3A- HAC Δである、 上記（2)に記載 の哺乳動物人工染色体べクタ一。
(5) 上記（1)〜（4)のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体べクターを保持し、 かつ、 ヒトチトクローム P450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、非ヒ ト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
(6) マウス ES細胞である、 上記（5)に記載の分化多能性細胞。
(7) 上記（1)〜（4)のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体べクタ一を保持し、 かつ、ヒトチトクローム P450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非ヒ ト 哺乳動物。
(8) キメラ動物又はその子孫動物である、 上記（7)に記載の非ヒ ト哺乳動物。 (9) 前記子孫動物が、 前記キメラ動物と、 それと同種の野生型動物との交配に より得られる動物である、 上記（8)に記載の非ヒ ト哺乳動物。
(10) 前記非ヒ ト哺乳動物において、前記ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターのホモ口 グである前記非ヒ ト哺乳動物固有のチトクローム P450遺伝子が破壌され、その固 有の遺伝子の発現が低下又は消失している、 上記（7)〜（9)のいずれかに記載の非 ヒ ト哺乳動物。
(11) マウスである、 上記（7)〜（10)のいずれか一項に記載の非ヒ ト哺乳動物。
(12) マウスが子孫マウスである、 上記（11)に記載の非ヒ ト哺乳動物。
(13) 上記（11)又は（12)に記載のマゥス又はその子孫マウスを、 マウス Cyp3a 遺伝子クラスターを欠損したマウスと交配させることにより作製されたマウス又 はその子孫であって、 上記（1)〜（4)のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体 ベクターを保持すること、 マウス Cyp3a遺伝子クラスターを欠損していること、 及びヒ トチトクローム P450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、上記マ ウス又はその子孫。
(14) 上記（7)〜（12)のいずれかに記載の非ヒ ト哺乳動物或いは上記（13)に記載 のマウス又はその子孫に由来する、かつ、 ヒ トチトクローム P450遺伝子の発現が 可能であることを特徴とする、 細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織。
(15) . 上記（7)〜（12)のいずれかに記載の非ヒ ト哺乳動物、 上記（I3)に記載のマ ウス又はその子孫、 或いは上記（14)に記載の細胞、 器官又は組織において、 これ らが保持するヒ トチトクローム P450 遺伝子を発現させて生物学的活性を有する ヒ トチトクローム P450を産生させ、 該ヒ トチトクローム P450を回収することを 含む、 生物学的活性を有するヒ トチトクローム P450の製造方法。
(16) 上記（7)〜（12)のいずれかに記載の非ヒ ト哺乳動物、 上記（13)に記載のマ ウス又はその子孫、 或いは上記（14)に記載の細胞、 器官又は組織に薬物又は食品 を投与し、 該薬物又は食品の薬理作用及び Z又は代謝を測定することを含む、 薬 物又は食品の薬理作用及び 又は代謝の試験方法。
(17) 上記（1)〜（4)のいずれかに記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持す る非ヒ ト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスター のホモログである非ヒ ト哺乳動物固有のチトクローム P450遺伝子が破壊され、そ の固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、 非ヒ ト哺乳動 物由来の分化多能性細胞。
(18) ntES細胞である、 上記（17)に記載の分化多能性細胞。
(19) マウス由来 ntES細胞である、上記（17)又は (18)に記載の分化多能性細胞。 本明細書中で使用する用語の定義は以下の意味を含む。
本明細書中の 「哺乳動物人工染色体ベクター」 という用語は、 哺乳動物染色体 に基づいて作製された人工染色体を意味する。 例えば、 ヒ ト染色体に基づいて作 製された人工染色体は、 ヒ ト人工染色体と称される。
本明細書中の 「ヒ ト CYP3A遺伝子クラスター」 という用語は、 ヒ ト 7番染色体 上に位置する CYP3A遺伝子群を意味する。 CYP3A遺伝子群は、 例えば、 CYP3A4, CYP3A7, CYP3A5, CYP3A43を含む。
本明細書中の 「ヒ トチトクローム P450遺伝子」 という用語は、 ヒ ト CYP遺伝子 群の総称を意味し、 例えば、 CYP3A4、 CYP2E CYP2D6を含む。
本明細書中の 「マウス CyP3a遺伝子クラスター」 という用語は、 マウス 5番染 色体上に位置する Cyp3a遺伝子群を意味する。 Cyp3a遺伝子群は、例えば、 Cyp3al 1， Cyp3a25, Cyp3al3を含む。
本明細書中の 「ホモログ」 という用語は、 任意の遺伝子に対応する他の動物種 の相同遺伝子を意味する。例えばヒ ト CYP3A4遺伝子のマウスホモログは Cyp3al l である。 なお、 CYP 遺伝子群においては、 アルファベッ トのあとの数字は各動物 種によって一致しないことが多い。
本明細書中の 「ntES細胞」 という用語は、 ドナー細胞核からあらかじめ除核し たレシピエント卵へ核移植を行うことにより作製された ES ( uclear transfer ES)細胞を意味する。
本明細書中の 「非ヒト哺乳動物」 という用語は、 サル、 チンパンジーなどの霊 長類、 マウス、 ラット、 ハムスター、 モルモットなどのげつ歯類、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギなどの有蹄類などを含むが、 これらに限定されない。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2007-295993号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 #7-HACおよび CYP3A- HACおよび CYP3A- HAC Δの作製方法の概略を示し た図である。
図 2は、 #7 - HACおよび CYP3A- HACおよび CYP3A- HAC Δの保持領域とキメラ率、 保持率および子孫伝達率のまとめを示した図である。
図 3は、 各ステップでの組換えや細胞融合や染色体導入が行われたことを示す FISH 解析の結果を示す写真である。 図 3a は DT40 (#7)クローン、 図 3b は DT40 (DF141)クローン、 図 3cは DT40 (NP25)クローン、 図 3dは Rクローン、 図 3e は RP13 クローン、 図 3f は RPC13F2クローン、 図 3gは CH0クローン、 及び図 3h は TT2Fクローンである。
図 4は、 ヒ ト 7番染色体上の AC004922へ ΙοχΡ を導入する概略図（a)と、 導入 の結果を示すサザン解析の結果を示した図（b)である。
図 5は、ヒ ト 7番染色体上の AC073842において部位特異的切断を行う概略図で ある。 cenはセントロメァ側、 telはテロメァ側を表す。
図 6は、 TC (CYP3A - HAC A )マウスにおける CYP3A遺伝子クラスターのゲノム解析 の結果を示した図である。
図 7は、 TC (CYP3A- HAC A )マウスにおける FISH解析を示す図である。 左のグラ フは FISH解析による各組織 （横軸） における CYP3A-HAC Aの保持率 （縦軸） を示 す。右のグラフは TC (CYP3A- ΗΑΟ Δ )マウスの尻尾繊維芽細胞の FISHの結果を示す 写真である。
図 8は、 TC (CYP3A- HAC A )マウスにおける CYP3A遺伝子クラスターの発現解析の 結果を示した図である。 GAPDHはグリセルアルデヒ ド 3-リン酸デヒ ドロゲナーゼ glycera丄 dehyde 3-phospnate denydrogenase) ¾■¾:! 0
図 9は、 TC (CYP3A-HAC Δ )マウス肝臓における CYP3A遺伝子クラスターの時期特 異的遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図 1 0は、 薬物誘導による TC (CYP3A-HAC A )マウス肝臓における遺伝子発現解 析の結果を示した図である。 ！ f はリファンピシン（Rifampicin)を表す。
図 1 1は、 pBlueLAB (2975bp)マルチクローニング部位の構造を示した図である 図 1 2は、 pBACcyp3al3 (#39) の構造を示した図である。
図 1 3は、 pBlueLAB (SAAX)マルチクローニング部位の構造を示した図である。 図 1 4は、 pBlueLAB (NAPF)マルチクローニング部位の構造を示した図である。 図 1 5は、 pBlueLAB- LoxP-Neo-DT- A (R) の構造 （7602 塩基対） を示した図で ある。
図 1 6は、 Pcyp3al3- K0の構造 （約 15. 8kb) を示した図である。
図 1 7は、 cyp3al3- K0ベクターによる相同組換え体 （HR体） ES細胞株のゲノ ムサザン解析の概略を示した図である。
図 1 8は、 cyP3al3- K0マウス個体の遺伝子型解析の概略を示した図である。 図 1 9は、 cyp3a44/ll/25- K0マウス個体の遺伝子型解析の概略を示した図であ る。
図 2 0は、 TC (CYP3A- HAC Δ ) / Δ cyp マウス肝臓における遺伝子発現解析の結果 を示した図である。
図 2 1は、 発現誘導後の TC (CYP3A- HAC Δ ) / Δ cypマウスにおけるウェスタンブ 口ッティングによる CYP3A遺伝子発現解析の結果を示した図である。
図 2 2は、 発現誘導後の TC (CYP3A-HAC Δ ) / Δ cypマウスにおける代謝解析の結 果を示した図である。
図 2 3は、 TC (CYP3A- HAC Δ ) / Δ cyp マウスにおけるヒ ト特異的代謝物を LC-MS/MSにて測定した結果を示した図である。図 23Aはヒ ト、図 23Bはマウス（野 生型）、 図 23Cは Δ cypマウス、 図 23Dは TC (CYP3A - HAC Δ ) / Δ cypマウスにおける 測定結果を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、 その一の態様において、 ヒ トチトクローム P450遺伝子を含むヒ ト 7 番染色体断片を保持し、 かつ、 子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであ つて、 該ヒ ト 7番染色体断片が、 染色体マーカー AC004922 と AC073842 との間に 存在する少なくともヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを含む約 lMb± 500Kbサイズの領 域を保持することを特徴とする、 上記哺乳動物人工染色体ベクターを提供する。 本明細書中において 「チトクローム P450」 は、 水酸化酵素ファミ リーの総称で あり、 種々の基質を水酸化する作用 （生物学的活性） をもつ酵素である。 動物で は、 主に肝臓に存在し、 物質の解毒、 脂肪酸の代謝、 ステロイ ドホルモンの生合 成などに関与している。 本明細書中では、 チトクローム P450を単に 「P450」 とい うことがある。
ヒ トチトク口一ム P450遺伝子の CYP3A分子種の遺伝子群は、ヒ ト 7番染色体長 腕 7q21〜q22の CYP3A遺伝子クラスターに存在する（例えば B. A. Brooksら， Am. J. Hum. Genet.，43 : 280， 1988)。 本発明の子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体べクタ 一の作製において、 上記 CYP3A遺伝子クラスターを含む特に有用な領域は、 ヒ ト 7番染色体長腕の染色体マーカー AC004922と AC073842との間に存在する少なくと もヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを含む、約 1Mb ± 500Kb、好ましくは約 1Mb ± 300Kb、 より好ましくは約 lMb ± 200Kbサイズの領域からなるヒ ト 7番染色体断片である。 特に、 AC004922 から AC073842 までの領域 （例えば、 J. E. Sulston ら， Genome Res.，8 : 1097， 1998)は、約 1Mbのサイズであり、 この領域を含む近傍の領域は、胎 生致死、 発生異常、 奇形などをもたらすと考えられるゲノムインプリンティング 遺伝子クラスターを含まないし、 また、 不妊の原因となる生殖細胞分化に重要と される遺伝子も含まない。
本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、 これを非ヒ ト哺乳動物に導入したと き、 該動物本来の染色体とは独立して存在し得る。 このとき得られたトランスク ロモソミック動物は、 ヒ ト P450遺伝子を保有するため、 この異種遺伝子を発現す ることを可能にするし、 また、 交配によって子孫への上記ベクターの伝達を可能 にする。 この点で、 本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、 国際公開第 001/011951 号に記載されたヒ ト人工染色体ベクター（#7 - HAC)と比べて、 キメラ 率及び染色体保持率のいずれも優れているし、 さらに優れた特徴として子孫伝達 可能であることが挙げられる。 一方、 公知の #7 - HACベクターは子孫伝達不能であ つた。
本発明の哺乳動物人工染色体ベクターは、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを含む 特定の領域の他に、 哺乳動物の任意の染色体由来のセントロメァおよぴテロメ ァ 'サブテロメァ領域を含むことができる。 ここで、 哺乳動物の例は、 ヒ.ト、 サ ル、 チンパンジーなどの霊長類、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター、 モルモッ トなど のげつ歯類、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギなどの有蹄類などを含むが、 これらに限 定されない。 該セントロメァは哺乳動物染色体由来、 好ましくはヒ トの任意の染 色体由来、 より好ましくはヒ ト 14番染色体由来のセントロメァである。該テロメ ァ -サブテロメァ領域は哺乳動物染色体由来、 好ましくはヒ ト染色体由来、 より 好ましくはヒ ト 7番又は 14番染色体由来、 より好ましくは人工的に合成された TTAGGG配列の繰り返し配列由来である。 本発明のベクターはさらに、 哺乳動物染 色体由来、 好ましくはヒ ト染色体由来、 より好ましくはヒ ト 7番染色体由来の MDR1遺伝子クラスターを含むことも可能である。本発明の哺乳動物人工染色体べ クタ一の好ましい例は、 ヒト人工染色体ベクターである。
本発明の一実施形態によれば、 ヒ ト人工染色体ベクターは、 上記ヒ ト 7番染色 体断片を、 ヒ ト 14 番染色体由来の SC20 ベクター（国際寄託の受託番号 FERM BP - 7583；特開 2005 - 230020号公報）に転座して得られたベクターである。 転座と は、 ある染色体の一部が別の染色体に移動することをいう。
本発明の別の実施形態によれば、 ヒ ト人工染色体ベクターは、 受託番号 FERM BP - 10928 の-ヮ トリ DT40 細胞株 DT40 (CYP3A-HAC Δ ) 214 内に保持された CYP3A - HAC Aである。 この細胞株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄 託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 )に平成 19 年 (2007年） 10月 30日付で国際^託され、 受託番号 FERM BP - 10928が付与された。 以下では、 本発明の哺乳動物人工染色体ベクター及びそれを保持する非ヒ ト哺 乳動物の作製例、 並びにそれらの使用例を説明する。
具体的には、 ヒ ト 7番染色体上の CYP3A遺伝子群をマウスなどの非ヒ ト哺乳動 物中で安定かつ効率良く発現させるために、 ヒ ト 7番染色体断片を保持するヒ ト 人工染色体（以下、 「CYP3A-HACまたは CYP3A-HAC厶」 と呼ぶ）の構築を開示する。 この CYP3A-HACまたは CYP3A- HAC Aの構築及び構造は、 後述の実施例、 図 1及ぴ 図 2に記載されている。
(i) ヒ ト 7番染色体の改変
ヒ ト CYP3A遺伝子クラスタ一は、 7番染色体上の 7q21. 3 - q22. 1に存在する（B. A.
Brooksら、上記）。ヒ ト CYP3Aファミリーには、少なくとも CYP3A4、 CYP3A5、 CYP3A7、 CYP3A43が含まれ、 CYP3Aのゲノム配列は、 GenBank Access ion No. NG_000004と して登録されている。 本発明のヒ ト P450は、 CYP3Aファミリーに属する P450酵 素、 例えば CYP3A4、 GYPSA5及び CYP3A7、 CYP3A43の酵素の全てを対象とする。 ヒ ト 7番染色体上の CYP3A遺伝子クラスターを含む断片は、ヒ ト 14番染色体に 由来する染色体断片（SC20-HACベクター）に転座、 クローニングした新規ヒト人工 染色体の構築、 該ヒ ト人工染色体のマウスでの子孫伝達、 並びに、 該ヒ ト人工染 色体を保持するトランスクロモソミック非ヒ ト哺乳動物 （例えば、 げっ歯類、 有 蹄類などの哺乳動物） の作製に使用することができる。
本明細書中において、 哺乳動物人工染色体とは、 哺乳動物染色体上の所望の領 域を、 同種又は異種の哺乳動物由来の安定な染色体断片 （染色体ベクター） に転 座させて作製された、 人工染色体をいう。 また、 トランスクロモソミック非ヒ ト 哺乳動物とは、 異種染色体断片が生殖系列を経由して子孫伝達された、 ヒ ト以外 の哺乳動物をいう。
本発明者らは、 哺乳動物人工染色体の作製において、 マウスなどの被染色体導 入動物の発生に悪影響を与えないように、 悪影響を及ぼすと推定される染色体領 域を染色体ィンサート上から可能な限り除去することが望ましいと考えてきた。 しかし、 従来は、 ヒ ト染色体の詳細な配列等の構造に関する情報がないか、 また は不足していたため、 目的遺伝子の近傍に、 例えば、 ΙοχΡ配列おょぴヒ トテロメ ァ配列を挿入することが困難な場合があった。 この場合、 両配列に挟まれた領域 には目的遺伝子以外にも、 その他多くの遺伝子が含まれるので、 これら余剰遺伝 子がマウスなどの非ヒ ト哺乳動物に導入された場合に、 個体発生または生殖細胞 分化に悪影響を及ぼすことが危惧された。 さらにまた、 目的遺伝子を含む染色体 インサートのサイズと、 被染色体導入動物のキメラ率および導入染色体保持率お よぴ子孫伝達効率との関係が不明であった。
本発明者らは、 CYP3A遺伝子クラスターが存在するヒ ト 7番染色体の構造に関 する情報に基づき、 ある特定サイズ範囲の、 CYP3A遺伝子クラスター含有染色体 インサートについて、.被染色体導入動物のキメラ率および導入染色体保持率およ び子孫伝達効率がいずれも有意に上昇することを今回見出した。 このように余剰 遺伝子をヒ ト人工染色体から取り除くことによって、 特定された CYP3A遺伝子ク ラスター領域周辺をィンサートとして保持する新規ヒ ト人工染色体を作製するこ とが可能となった。 本明細書中、 余剰遺伝子とは、 被染色体導入動物の発生や生 殖細胞分化に悪影響を与える有害遺伝子を指し、 例えば、 インプリンティング遺 伝子や遺伝子発現量依存性の遺伝病原因領域、 生殖細胞で発現する遺伝子群など である。
ゲノムィンプリンティングに関与する遺伝子の過剰発現は胎生致死、発生異常、 奇形などに導くことが知られているが、 CYP3A遺伝子クラスターの存在するヒ ト 7番染色体上の 7q22 (CYP3A遺伝子クラスターよりセントロメァ側） にはゲノム ィンプリンティング遗伝子クラスターが存在するため、 これを削除することが望 ましいと考えられる。 また、 精巣や卵巣の生殖細胞で発現する遺伝子群の過剰発 現は生殖細胞分化に悪影響を及ぼすことが知られているが、 CYP3A 遺伝子クラス ターの存在するヒト 7番染色体上の 7q22 (CYP3A遺伝子クラスターよりテロメァ 側） には生殖細胞で発現する遺伝子が複数存在するため、 これを削除することが 望ましいと考えられる。 その結果、 CYP3A遺伝子クラスター領域全体の大きさを 縮小し、 これによつて高い子孫伝達効率を達成しうる。
下記の（i i)で、 CYP3A遺伝子クラスターを含むヒ ト 7番染色体断片を SC20-HAC ベクター上へ転座させる場合、 転座させる染色体インサート （ヒ ト 7番染色体上 の CYP3A 遺伝子クラスター領域を含む） の大きさは、 #7 - HAC (国際公開第
W001/011951号） の場合の 5Mbよりも小さいサイズ、 通常約 4Mb〜約 0, 5Mb、 好ま しくは約 3Mb〜約 0. 5Mb、 さらに好ましくは約 2Mb〜約 0. 5Mb、 最も好ましくは約 b〜約 0. 5Mbとしうる。 また、余剰遺伝子を削除する実験の結果、転座させる染 色体ィンサートのセントロメァ側の端は、好ましくは AC004922座であり、一方テ ロメァ側の端は、好ましくは AC073842座であるのが好ましいことが判明した。す なわち、 7q22ゲノムィンプリンティング遺伝子クラスターを除き、 かつ CYP3A遺 伝子クラスターのセントロメァ側に位置する染色体部位（例えば、 AC004922； NCBI データベース）に組換え酵素 Creの認識配列である ΙοχΡ配列を相同組換えにより 挿入し、 さらに 7q22 に存在する生殖細胞で発現する遺伝子を除き、 かつ CYP3A 遺伝子クラスターの極テ口メァ側に位置する染色体部位（例えば、 AC073842； NCBI データベース）にヒ トテロメァ配列を相同組換えにより挿入し、その位置により部 位特異的に切断（テロメアトランケーシヨン）（例えば、 Kuroiwaら、 Nucleic Acid Research 26： 3447, 1998)することで、 AC004922- CYP3A 遺伝子クラスター - AC073842 断片を作製し、 これを本発明の人工染色体ベクターの作製に用いるこ とができる。
(i i) Cre- ΙοχΡシステムによる CYP3A遺伝子クラスターを含むヒ ト 7番染色体断 片の SC20 - HACベクター上への転座
ヒ ト人工染色体（HAC)は、 例えば、 ΙοχΡ 配列及びヒ トテロメァ配列をヒ ト染色 体上の目的遺伝子領域の近傍に相同組換えにより挿入し、 両配列に挟まれた目的 遺伝子領域周辺のみを別の染色体断片 （安定でかつ子孫伝達可能な染色体断片で あることが望ましい；例えばヒ ト 14番染色体由来 SC20染色体ベクター： SC20-HAC ベクター）上の対応 ΙοχΡ配列挿入部位に特異的に転座させることによって、 目的 遺伝子領域周辺のみをインサート （染色体インサート） として保持するヒ ト人工 染色体として作製されうる （Kuroiwaら， Nature Biotech. , 18： 1086， 2000)。
この場合、 転座させる染色体インサート （ヒ ト 7番染色体上の CYP3A遺伝子ク ラスター領域を含む） の大きさは、 上記のとおり、 #7-HACの場合の 5Mbよりも小 さいサイズ、 通常約 4Mb〜約 0. 5Mb、 好ましくは約 3Mb〜約 0. 5Mb、 さらに好まし くは約 2Mb〜約 0. 5Mb、 最も好ましくは約 1Mb〜約 0. 5Mbとしうる。 前記転座させ る染色体ィンサートのセントロメァ側の端は、好ましくは AC004922座であり、一 方テロメァ側の端は、 好ましくは AC073842座である（J. E. Sulstonら、 上記）。 本発明のヒ ト人工染色体の作製をさらに具体的に説明する。
ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを含むヒ ト 7番染色体あるいはその断片は、 周知 の方法で取得しうる。 すなわち、 ミクロセル法によりヒ ト染色体あるいはその断 片をマウス A9 細胞にライブラリ化することができる (Koi ら， Jpn. J. cancer Res. , 80 : 413 - 418， 1989)。 得られたライブラリから、 PCR等によりヒ ト CYP3A遺伝 子クラスター特異的な配列を検出することにより、 ヒ ト 7番染色体あるいはその 断片を保持するクローンを選抜することができる。 ヒ ト 7番染色体あるいはその 断片は、 その後の改変の便宜のため、 さらにミクロセル法により好ましくはニヮ トリ DT- 40細胞 （理研セルバンク （日本国） ： RCB1464; ATCC CRL- 2111) に移入す ることができる。 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスタ一は 7番染色体上の 7q22 に存在する（B. A. Brooks ら，上記）。 前述の #7- HACにおいては、 AC004082座から AF006752座までの 5Mb領 域が染色体ィンサー 1、として転座クローニングされていた。 この 5Mbィンサート において、 CYP3A遺伝子クラスター領域よりもテロメァ側には 2Mbの、 セント口 メァ側には 2Mbの余分な染色体領域が含まれている。 さらにはセントロメァ側の 2Mb にはィンプリンティング遺伝子クラスターが含まれている。 さらには、 テロ メァ側の 2Mbには生殖細胞で発現する遺伝子が複数存在する。 そこで、 まずセン トロメァ側 2Mb領域を取り除くために、 7番染色体断片 （AF006752座でテロメァ トランケ一ションされている断片) を CYP3A遣伝子クラスタ一領域の極く近傍か つセントロメァ側（約 300Kbセントロメァ側）に存在する AC004922座（J. E. Sul ston ら、 上記）で ΙοχΡ 配列を相同組換えにより揷入する。 これらの改変により、 AC004922-CYP3A遺伝子クラスタ一- AF006752断片 （約 3Mb) のみを染色体インサ 一卜として SC20-HACベクタ一へ転座クローニングできる。その結果得られた人工 染色体ベクターは、 CYP3A-HACである （図 1及び図 2)。
次に、 この染色体ベクターを CYP3A遺伝子クラスター領域の極く近傍かつテロ メァ側 （約 200Kbテロメァ側） に位置する AC073842領域（J. E. Sul stonら、 上記） においてテロメアトランケーシヨン (例えば、 Kuroiwa ら、 上記（1998) ) するこ とで切断すれば、 AC004922-CYP3A遗伝子クラスタ一- AC073842断片 (約 1Mb) の みを染色体ィンサ一トとして SC20-HACべクターへ転座クローニングできる。その 結果得られたヒ ト染色体ベクターが CYP3A-HAC Aである （図 1及び図 2)。 もっと 具体的に言えば、 CYP3A-HAC Δでは、 AC073842中の位置 124455で切断されるため、 存在するゲノム領域は AC073842の位置 124456〜132764であり、 位置 1〜124455 は存在していないし、 また、 AC004922の中の位置 32340で転座されるため、 存在 するゲノム領域は AC004922の位置 1〜32340であり、位置 32341〜82359は存在し ていない。
本発明では、 しかしながら、 ゲノムインプリンティング遺伝子クラスター、 生 殖細胞分化に重要とされる遺伝子などの有害な領域を含まないで、 かつ、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを含む限り、 上記の特定の領域からなるヒ ト 7番染色体 断片に限定される必要はない。 これら CYP3A- HAC及び CYP3A - HAC Aの作製において、ニヮトリ DT40細胞中での テロメアトランケーシヨンと Cre-loxP システムによる染色体間転座を利用する ことができる。
先ず、上記のようにして得られた改変ヒ ト 7番染色体断片と改変 SC20-HACベタ ター（Kuroiwaら，上記（2000) )のそれぞれを保持する DT40細胞を作製する。次に、 Cre-loxPシステムを用いて CYP3A遺伝子クラスターを含むヒ ト 7番染色体断片を SC20-HACベクタ一上へ転座させるために、それぞれの改変ヒ ト染色体断片を保持 する DT40細胞を融合させることによって、 2本の改変ヒ ト染色体断片を保持する D O細胞ハイプリッ ドを作製する。次に、 Cre組換え酵素をこの DT40細胞ハイブ リッド中で発現させて転座させるが、 2 本の非相同染色体間での組換え（転座）頻 度は非常に低いこ とが報告されており （例えば、 J. Smith ら、 Nature Genet.，9 : 376， 1995)、 さらに本発明の場合は、 内在性染色体間ではなく、 外来性 のヒト染色体間での転座であるため、 さらに組換え効率が低くなる可能性も考え られる。そこで、期待通り ΙοχΡ間で組換えが起こった細胞を選択できるポジティ ブセレクション系を考えることが好ましい。 そこで、 ΙοχΡ間で染色体の転座が起 こった細胞において、 GFP遺伝子が発現し、 FACSでソーティングすることによつ て目的の細胞をクローニングするシステムを用いる。 さらに、 組換え頻度を上げ るために、 Cre組換え酵素を一過性ではなく、安定発現させる。 2本の染色体間で の転座は相互的に起こるので、 Cre組換え酵素を安定発現させると、 せっかく転 座を起こした染色体が、 頻度こそは低いが、 再び組換え（転座）を起こして元に戻 つてしまう可能性があるので、 通常このような実験においては、 Cre組換え酵素 を一過性に発現させたり、 Cre 組換え酵素の発現を厳密にコントロールしたりす る。 しかし、 本発明においては、 DT40ハイブリッド中で転座させた直後に目的の 転座したヒ ト人工染色体をミクロセル融合法によりチャイニーズハムスター CH0 細胞へ移入させるため、 CH0細胞においては、 Cre組換え酵素の影響は受けずに済 む。 そのため、 単純に Cre組換え酵素を安定発現させることが可能となる。
上記の手法を用いることによって、如何なるサイズのヒ ト染色体断片（YACベタ ターのクローニングサイズを超える）をも安定な SC20 - HACベクタ一上の ΙοχΡ部位 にクローニングすることができる。 上記のヒ ト人工染色体構築システムによ り作製された CYP3A- HAC 又は CYP3A - HAC Aは、 マウス ES 細胞に導入される前に、 チャイニーズハムスター CH0 細胞に導入されるべきである。 Dieken b (Nature Genet.， 12： 174， 1996)は、 改変 ヒ ト染色体をニヮトリ DT40細胞からマウス MEL細胞（癌細胞の一種）へ移入したが、 大部分が断片化された状態で移入された。 これを回避するために、 チャイニーズ ハムスター CH0 細胞へ移入することによって、 無傷の状態でヒ ト染色体を移入す ることができる。 CH0細胞はマウス A9細胞と同様に効率良くミクロセルを形成す ることが知られており（Kuroiwa ら、 上記（2000) )、 これにより改変ヒ ト染色体を CH0 細胞から非ヒ ト哺乳動物の分化多能性細胞 （例えば、 ES 細胞） へ移入し、 CYP3A-HACまは CYP3A - HAC A保持キメラ動物を作製することができる。
(ii i) 分化多能性細胞へのヒ ト P450遺伝子 （CYP3A遺伝子クラスター） を含む人 ェ染色体の移入
本発明はさらに、 上記の哺乳動物人工染色体ベクターを保持し、 かつ、 ヒ トチ トクローム P450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、非ヒ ト哺乳動物由 来の分化多能性細胞を提供する。
本明細書において、分化多能性細胞には、例えば胚性癌腫細胞（EC細胞、 Hanaoka ら ， Differentiation, 48 : 83， 1991) 、 胚 性 幹 細 胞 （ES 細 胞 、 Evans ら， Nature, 292： 154, 1981)、 生生殖細胞（EG細胞、 Matsui ら， Cell, 70： 841, 1992)、 核移植由来胚性幹細胞（ntES細胞、 Wakayamaら， Science, 292： 740, 2001)、 精巣由 来多能性幹細胞（mGS細胞、 Kanatsu-Shinoharaら， Cel l, 119： 1001, 2004)、 誘導多 能性幹細胞（iPS細胞、 Takahashi ら， Cell, 126： 663， 2006)などの、非ヒ ト哺乳動物 の初期胚に注入するか或いは該初期胚と共培養することにより、 未分化な状態の 細胞が分化して様々な形態あるいは機能を有する体細胞に変化（分化）する上記細 胞が含まれる。 とりわけ、 ES細胞、 ntES細胞、 iPS細胞などはその能力が特に高 く、 多くの場合生殖細胞にも寄与し、 その細胞由来の子孫を作ることができる。
EC細胞は主に生殖細胞癌から、 ES細胞は胚盤胞の内部細胞塊から、 EG細胞は発 生初期に出現する原始生殖細胞から、 ntES細胞は除核した未受精卵にドナー核を 核移植して、 その胚盤胞の内部細胞塊から、 mGS細胞は精巣由来幹細胞から、 iPS 細胞はマウスなどの哺乳動物由来の、繊維芽細胞などの体細胞に特定の 2、 3又は 4因子（klf4， oct4 ; klf-4, oct4, sox2 ; klf-4, oct4, c-rayc, sox2など）をコー ドする DNAを導入することで、 得られる。
分化多能性細胞の中でも特に ES細胞はマウス ES細胞がよく知られているため、 本発明では、 マウス ES細胞を好ましく使用することができる。 また、 マウス以外 の動物種における ES 細胞又は分化多能性細胞の樹立は、 ラッ ト （Iannaccone ら ，Dev. Biol .， 163 : 288， 1994 ) 、 ブ タ （ Wheeler ら ， Reprod. Fertil. Dev. , 6 : 563, 1994) において報告されている。 あるいは、 ES 様細胞として知られ る iPS細胞の使用も好ましい。 したがって、 これらの ES細胞、 iPS細胞あるいは 他の分化多能性細胞を受容細胞として、 ヒ ト人工染色体を移入すれば、 マウスの 場合と同様に、 ヒ ト人工染色体あるいはその断片を保持し、 該ヒ ト人工染色体上 の遺伝子を発現する非ヒ ト動物が作製可能である。 さらに、 これらの非ヒ ト哺乳 動物を利用して、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを発現することも可能である。 上 記非ヒ ト動物において該ヒ ト人工染色体が子孫伝達不可能な場合でも、 非ヒ ト動 物由来の分化多能性細胞においてヒ ト P450 遺伝子の相同遺伝子に対応する遺伝 子を破壊し、該ヒ ト人工染色体を導入すれば、非ヒ ト動物由来の内在の P450遺伝 子が欠損し、 かつヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを発現することができる分化多能 性細胞が得られる。
本発明におけるヒ ト P450 遺伝子を含む染色体断片を移入するための受容細胞 としては、 上記のような分化多能性細胞株を用いることができる。
また、標識されたヒト P450遺伝子を含む染色体断片を保持する染色体供与細胞 としては、 1)受容細胞で選択可能なマーカーで標識されたヒ ト染色体を保持し、
2)それ以外のヒト染色体を含まない、 3)ミクロセル形成能が高い細胞が望ましい。 ヒ ト染色体提供の材料としては、 ヒ ト由来のあらゆる細胞株、 癌細胞、 初代培養 細胞を用いることができるが、 染色体の欠失、 増幅等の異常の可能性が低く、 ま た培養が容易な点を考慮すると正常線維芽細胞が適している。 まず、 1)について は、 ヒ ト細胞は、 薬剤（例えば G418、 ピューロマイシン、 ハイグロマイシン、 ブ ラストサイジンなど）耐性等のマーカー遺伝子を発現するベクターにより形質転 換することができる。 ここで用いるマーカー発現制御のためのプロモーターとし ては、 ヒト細胞においてのみならず、マウス ES細胞のような受容細胞で効率よく 働くものが望ましレ、。 この目的には、 SV40ェンハンサ一と単純へルぺスウィルス チ ミ ジン キナーゼプロ モー タ ー を連結 した も の （Katoh ら， Cell Struct. Funct.， 12 : 575， 1987) 、 マ ウ ス PGK - 1 プ ロ モ ー タ ー (Soriano ら， Cell, 64 : 693， 1991)等を用いることができる。 上記マーカー遺伝子、 必要に応 じてプロモーターを連結したマーカー遺伝子を含む DNA断片で、 エレク トロポー レーシヨン（石田ら，細胞工学実験操作入門、講談社、 1992)等により ヒ ト細胞を形 質転換し、 マーカー遺伝子が発現する細胞を選択することにより、 導入されたマ 一力一遺伝子が、 23種 46本あるヒ ト染色体上にランダムに揷入されたようなヒ ト細胞形質転換体のライブラリを得ることができる。 3)については、 多くのヒト 正常細胞はミクロセル形成能が非常に低いので、 上記の形質転換体をミクロセル 形成能の高い細胞、 例えば、 マ ウス A9 細胞 （Koi ら， Jpn. J. Cancer Res. , 80 : 413-418, 1989) と全細胞融合することにより、 ミクロセル形成能を付与 することができる。
受容細胞へのヒ ト染色体断片移入の材料としては、ヒ ト P450遺伝子を含むヒ ト
7 番染色体供与細胞から調製されるミクロセル、 或いは、 ガンマ線照射したミク ロセルを用いることができる。 受容細胞への移入は、 （清水素行，細胞工学ハンド ブック，羊土社， 1992)等に記載された方法で受容細胞とミクロセルを融合するこ とにより行う。 ミクロセル供与細胞においては、 ヒ ト P450遺伝子を含む染色体ま たはその断片が受容細胞において選別可能なマーカーを保持している。 この中か ら、 特異的な遺伝子マーカーや多型マーカーに基づくプライマー又は蛍光標識プ ローブを使用した、 PCR、 サザンプロット解析、 FISH解析等により、 ヒ ト P450遺 伝子あるいはヒ ト P450遺伝子を含む染色体断片を保持する株を選択すれば、ヒ ト
P450遺伝子を含む染色体断片を導入することが可能である。 また、 異なる選択マ 一力一を保持する複数のヒト P450 遺伝子を含む染色体断片を逐次導入すること により、 これらを同時に保持する受容細胞を得ることもできる。 ヒ ト P450遺伝子 を含む染色体上のマーカー（G418耐性等）により選抜された受容細胞が、供与細胞 の保持していたヒ ト P450遺伝子を含む染色体断片を保持していることは、例えば、 選抜された受容細胞から抽出したゲノム DNAを用い、 プロープとしてヒ ト特異的 繰り返し配列（Ll、 Alu等、 Korenberg ，Cell，53 : 391，1988)、 ヒ ト染色体特異的 プローブ（Lichter ら， Human Genetics, 80： 224， 1988)を用いたフルォレツセン ス · ィンサイチュ · ハイブリダイゼーショ ン（FISH)等の染色体解析、 ヒ ト P450 遺伝子特異的プライマーによる PCR法、ヒ ト P450遺伝子特異的配列プローブを用 いたサザン解析により検出される。
また、 これに関連して、 動物細胞への遺伝子導入におけるレポーター遺伝子と してォワンクラゲ由来の GFP (Green Fluorescent Protein)遺伝子が知られて いる（例えば、 Prasher, D. Cら， Gene, 111 : 229， 1992)。 GFPの発光には基質は必要で なく、 蛍光で検出することが可能であるので、 生細胞のまま、 しかも短時間でモ 二ターすることができる。 ΙοχΡ組換え体のポジティブセレクションマーカーとし て、 GFP遺伝子を用いることができる。 具体的には、 プロモーターを含まない GFP 遺伝子を SC20-HACベクターの一端に挿入し、 7番染色体上の CYP3A遺伝子クラス ターのセントロメァ側の一端には GFPの発現に必要なプロモーターを挿入する。 Creによる ΙοχΡ配列間での組換えが起こると、プロモーターと GFP遺伝子とが連 結され、 GFPが発現するようになる。この組換え DT40細胞は蛍光を発光するので、 SC20-HACベクターに CYP3A遺伝子クラスターをクローニングするためのセレクシ ョンおよび該 HACベクターの受容細胞でのセレクションが可能になる。
(iv) ヒ ト P450遺伝子 （CYP3A遺伝子クラスター） を含む人工染色体を導入した 非ヒ ト哺乳動物由来 ES細胞又は分化多能性細胞からのキメラ動物の作製
本発明はさらに、 上記のヒ ト人工染色体ベクターを保持し、 かつ、 ヒ トチトク ローム P450 遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非ヒ ト哺乳動物を提供 する。
非ヒ ト哺乳動物 ES細胞株又は分化多能性細胞、例えばマウス細胞 ES株や ntES 細胞株からのキメラ動物の作製は、 相澤慎一，バイオマニュアルシリーズ 8ジ-ン ターゲティング，羊土社， 1995、 等に記載された方法で行うことができる。 効率的 なキメラ動物の作製を行うための宿主胚の発生時期、 系統等の選択については、 それぞれの ES細胞株についてすでに検討された条件を用いることが望ましい。例 えば、 マウス ES 細胞株である CBA X C57BL/6 F1 由来の TT2細胞（野生色、 Yagi ら， Analytical Biochemistry, 214 : 70, 1993)については、 Balb/c (白色、 日本クレ ァ社）又は ICR (日本クレア社）由来の 8細胞期胚を宿主胚として用いることが望ま しい。
具体的には、 上記の方法で作製した本発明の人工染色体ベクターを保持する
CH0細胞からミクロセルを精製し、 DMEM培地中、 ポリエチレングリコール （例え ば PEG 1000)の存在下で、ミクロセルと ES細胞または ntES細胞との融合を行う。 得られた ES細胞または ntES細胞クローンを、 雌雄交配により得られた 8細胞期 胚 （上記） に注入し、 注入胚を仮親に移植し、 キメラ動物を誕生させる。 好まし い分化多能性細胞は非ヒ ト哺乳動物由来の ES細胞または ntES細胞である。 さら に好ましい ES細胞または ntES細胞は、 マウス ES細胞またはマウス ntES細胞で ある。
好ましい実施形態においては、 ヒ ト P450遺伝子を効率良く発現させるために、 かつヒ ト 7番染色体上の CYP3A遺伝子群による薬物代謝をよりヒ ト型にするため に、非ヒト哺乳動物内在性の CYP3A遺伝子群を破壊することができる。すなわち、 ヒ ト遺伝子の導入を行った動物に対して、 内在性 CYP3A遺伝子の破壌を行うか、 或いはこの逆に、 内在性の CYP3A遺伝子群を破壌した動物にヒ ト遺伝子の導入を 行うことも可能である。
本発明においては、 このようにして得られる非ヒト哺乳動物は、 本発明の人工 染色体ベクターを保持し、 ヒ ト P450遺伝子の発現を可能にする、キメラ動物或い はその子孫動物である。 また、 子孫動物は、 上記キメラ動物と、 それと同種の野 生型動物との交配により得られる動物であってもよいし、 或いは上記キメラ動物 と、 それと同種の動物の対応遺伝子の破壊された動物との交配により得られる動 物であってもよい。
好ましい実施形態によれば、 本発明の非ヒ ト哺乳動物においては、 上記ヒ ト CYP3A 遺伝子クラスターのホモログである非ヒ ト哺乳動物固有のチトクローム P450遺伝子が破壌され、 その固有の遺伝子の発現が低下又は消失している。
さらに、 好ましい実施形態によれば、 本発明の非ヒ ト哺乳動物は、 マウスであ り、 キメラマウス及ぴその子孫マウスの両方を含む。 このようなマウス又はその 子孫は、 本発明の人工染色体ベクターを保持すること、 マウス Cyp3a遺伝子クラ スターを欠損していること、及びヒ トチトクローム P450遺伝子の発現を可能にす ることを特徴とする。 本発明によれば、 ES細胞（Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失）からキメラ 非ヒ ト哺乳動物を作製し、 野生型動物と交配させ、 Cyp3a 遺伝子クラスターがへ テロに欠失した F1動物を得る。 この F1動物どうしを交配させ、 Cyp3a遺伝子ク ラスターがホモに欠失した F2動物を得る。 一方、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスタ一を 含むヒ ト人工染色体を保持するキメラ非ヒ ト動物と野生型動物を交配させ、 該ヒ ト人工染色体を保持する F1動物を得る。 この F1動物と Cyp3a遺伝子クラスター がホモに欠失した上記 F2動物とを交配させ、 Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに 欠失し、 かつ該ヒ ト人工染色体を保持する F2動物を得る。 この F2動物と Cyp3a 遺伝子クラスターがへテ口に欠失した F2動物とを交配させることによつて、最終 的に目的の非ヒ ト哺乳動物（マウス CyP3a遺伝子クラスターがホモに欠失し、かつ 該ヒ ト人工染色体を保持）が得られる。
(V) キメラ非ヒ ト哺乳動物又はその子孫におけるヒ ト P450遺伝子（CYP3A遺伝子 クラスター） を含む人工染色体の保持およびヒ ト遺伝子発現の確認
ES細胞を注入した胚から誕生した非ヒ ト哺乳動物における ES細胞の貢献率は、 その毛色によりおおまかな判定ができる。 しかし、 毛色に貢献がみられないから といって他の組織で貢献がないと判断はできない。 より詳細なキメラ動物各組織 におけるヒ ト染色体の保持は、 各組織より抽出されたゲノム DNAを用いたサザン 解析、 PCR、 FISH 等によって確認することができる。 導入された染色体上のヒ ト P450遺伝子の発現は以下のようにして確認される。 ヒ ト P450遺伝子を含む染色 体由来の mRNA の発現は、 各組織由来の RNA を用いた RT- PCR 法（Kawasaki ら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85： 5698， 1988) 、 ノーザンブロ ッ ト法（Ausubel り， Current Protocols in Molecular Biology, Johen Wi lly & Sons, 1994)により 検出される。 タンパク質レベルの発現はウェスタンプロッ ト法（Ausubel ら，前記） あるいは、 キメラ動物肝ミクロソームを用いたテス トステロン 6 /3水酸化活性測 定等により検出される。 さらに、 キメラ動物細胞中でのヒ ト P450遺伝子群を含む 染色体の保持および該染色体上の遺伝子の発現が、 キメラ動物由来初代培養細胞 での薬剤耐性マ一力一遺伝子又はレポータ一遺伝子発現による耐性細胞の出現に より確認できる。
本発明の非ヒ ト哺乳動物において、ヒ ト P450遺伝子群を含む人工染色体を保持 する ES細胞が、そのキメラ動物の生殖細胞に分化した場合、その子孫にも導入し たヒ ト P450遺伝子群を含む染色体断片が認められ、その染色体断片上の遺伝子を 発現する。
さらにまた、上記キメラ動物と正常動物の交配により、 ヒ ト P450遺伝子群を含 むヒ ト染色体が子孫伝達したかどうかは、 子孫動物の組織、 器官又は細胞より抽 出されたゲノム DNAを用いたサザン解析、 PCR、 FISH等によって同様に確認する ことができる。 また、 子孫伝達動物における個体発生段階などの時期特異的、 組 織特異的遺伝子発現の確認もまた上記と同様に行うことができる。
(vi) 子孫伝達非ヒ ト哺乳動物における遺伝子発現誘導の確認
遺伝子発現の確認については、上記（V)の方法と同様である。例えば遺伝子発現 の誘導は Rifarapicinや PCNで誘導される （後述の実施例 6参照）。
(vi i) 非ヒ ト哺乳動物内在性 P450遺伝子群のノックアウト動物の作製
ノックァゥトベクターおよびノックアウト ES細胞は、 後述の実施例 7、 或いは P. Hastyら， Nature, 1991， 350： 243 - 246、 M. Zijlstraら， Nature, 1989， 342： 435 - 438 などに記載の方法により作製可能であり、 また、 ノックアウト動物の作製につい ては上記（iv)の方法と同様である。
簡単に説明すると、 内在性の目的遺伝子の機能を不活性化するために通常使用 される方法の 1つが、 ジーンターゲッティング法である。 該遺伝子の複数のェク ソンを含む約数 kbのゲノム DNAの 1つのェクソンの内部に例えば nee 遺伝子な どの外来遺伝子を挿入した組換え DNAを作製し、 これを適当なベクターに挿入す ることによってノックァゥトベクターを作ることができる。ベクター DNAを ES細 胞に導入し、 G418耐性細胞を選別し、 相同組換えを起こした細胞を例えばサザン プロッ ト解析によって選抜したのち、 胚盤胞に注入し、 得られた胚を、 同種の仮 親非ヒ ト哺乳動物の子宮に移植し、 キメラ動物を誕生させる。 キメラ動物同士、 又はキメラ動物と野生型動物間、 の交配によってホモ接合体であるノックァゥト 動物を得ることができる。
なお、 マウスの場合、 内在性 （又は 「固有の」） P450遺伝子を含む CyP3a遺伝 子クラスタ一は、 Cyp3all、 Cyp3al3, Cyp3a25、 Cyp3a41などの P450遺伝子を含 み、 該クラスタ一はマウス 5番染色体上に存在する （例えば、 CypSallは、 マウ フ、 Chr5. 78. 0cM、 Cyp3al3は、 マウス Chr5. 73. 7cMにそれぞれ存在する）。
(viii) ノックアウト非ヒ ト哺乳動物における内在性 P450遺伝子群の欠損の確認 作製されたノックァゥト動物における ES細胞の貢献率は、ヒ ト染色体導入キメ ラ動物と同様にその毛色によっておおよその判断ができる。 さらに、 ノックァゥ ト動物より抽出したゲノム DNAを用いたサザン解析、 PCR等により内在性遺伝子 の欠損を確認することが望ましい。 また、 ターグティング部分に GFPを揷入した 場合は、 動物個体においても発現が認められるため、 ES細胞におけるセレクショ ンと同様に、 蛍光によって、 容易にノックアウト動物の選別が可能となる。
(ix) 内在性 P450遺伝子群が欠損されたかつヒ ト P450遺伝子が導入された非ヒ ト 哺乳動物の作製
ヒ ト P450遺伝子群を含むヒ ト染色体を保持し、 非ヒ ト哺乳動物内在性 P450遺 伝子群を欠くヒ ト P450保持動物は、 上記の方法によって作製された、 ヒ ト P450 遺伝子群を含むヒ ト染色体を保持するキメラ動物あるいはその子孫と、 内在性 P450遺伝子をクラスターごと欠損させたキメラ動物あるいはその子孫を交配す ることにより得られる。 「ヒ ト染色体の保持」、 「内在性 P450遺伝子の欠損」 は共 に、基本的にメンデルの法則に従って両者の遺伝的要素が伝達すると考えられる。 動物の交配方法には種々のパターンが考えられるが、 具体的には以下のように 実施可能である。 まず、 Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失したキメラ動物 を野生型動物と交配させ、 Cyp3a遺伝子クラスターがヘテロに欠失した F1動物を 得る（F1動物 A)。 この F1動物 Aどうしを交配させ、 Cyp3a遺伝子クラスターがホ モに欠失した F2動物を得る（F2動物 B)。一方、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを含 むヒト人工染色体を保持するキメラ動物と野生型動物を交配させ、 該ヒ ト人工染 色体を保持する F1動物を得る（F1動物 C)。F2動物 Bと F1動物 Cを交配させ、 Cyp3a 遺伝子クラスターがヘテロに欠失し、かつ該ヒト人工染色体を保持する F2動物を 得る（F2動物 D)。 この F2動物 Dと F2動物 Bとを交配させることによって、 最終 的な動物（動物 Cyp3a遺伝子クラスターがホモに欠失し、かつ該ヒ ト人工染色体を 保持）が得られる。
さらに、 本発明によって、 内在性 P450遺伝子群が欠損されたかつヒ ト P450遺 伝子が導入された非ヒ ト哺乳動物から、 上記のヒ ト人工染色体ベクターを保持す る非ヒ ト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスター のホモログである非ヒ ト哺乳動物固有のチトクローム P450遺伝子が破壊され、そ の固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、 非ヒ ト哺乳動 物由来の分化多能性細胞を作製することも可能である。 分化多能性細胞の例は、 上記のように、胚性癌腫細胞（EC細胞、 Hanaoka Differentiation, 48： 83, 1991)、 胚性幹細胞 (ES細胞、 Evans ら， Nature, 292： 154， 1981)、 胚性生殖細胞 (EG細胞、 Matsui ら， Cell, 70 : 841， 1992) 、 誘導多能性幹細胞（iPS 細胞、 Takahashi ら， Cell, 126 : 663, 2006)など、 と りわけ核移植由来胚性幹細胞（ntES 細胞、 Wakayama ら， Science, 292： 740， 2001)、 例えばマウス由来 ntES細胞である。 具体 的には、 後述の実施例 13〜： 16に説明されている。
(X) ヒ ト P450タンパク質の製造方法
本発明はさらに、 上記の非ヒ ト哺乳動物或いは上記のマウス又はその子孫に由 来する、 かつ、 ヒ トチトクローム P450遺伝子の発現が可能であることを特徴とす る、 細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織を提供する。
本発明はまた、 上記の非ヒ ト哺乳動物、 上記のマウス又はその子孫、 或いは上 記の細胞、器官又は組織において、 これらが保持するヒ トチトクローム P450遺伝 子を発現させて生物学的に活性を有するヒ トチトクローム P450を産生させ、該ヒ トチトクローム P450を回収することを含む、生物学的活性を有するヒ トチトク口 ーム P450の製造方法を提供する。
なお、 ヒ ト P450 のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、 例えば、 GenBank Accession Nos. NM_017460 (CYP3A4 遺伝子）、 醒— 000777 (CYP3A5 遺伝子）、 NM— 000765 (CYP3A7遺伝子）、 NM_0022820 (CYP3A43遺伝子）として登録されている。 上記のようにして得られるキメラ動物を利用して生物学的に活性のあるヒ ト
P450タンパクをその器官、 組織、 細胞から得ることができる。 例えば、 キメラ動 物あるいはその子孫の肝ミク口ソームからヒ ト P450を含む分画を抽出し、精製す ることでヒ トの P450タンパクを抽出できる。 あるいは、 ヒ ト P450遺伝子を含む 染色体を保持するキメラ動物あるいはその子孫の組織から細胞株を樹立し、 培養 することでその培養物からヒ ト P450タンパクを回収することが可能である。 タンパク質の精製は、 公知の技術を組み合わせて行うことができる。 そのよう な精製法には、 例えばゲルろ過クロマトグラフィ一、 イオン交換クロマトグラフ ィー、ァフィ二ティクロマトグラフィー、 HPLC、FPLCなどのク口マトグラフィ一、 電気泳動、 等電点電気泳動、 限外ろ過、 硫安分画、 透析などが含まれる。
ヒ ト P450の同定は、市販のアツセィキットを用いて行うことができる。そのよ うなアツセィキットの例は、 P450- Glo™CYP3A4 Assay、P450- Glo™CYP3A7 Assay (い ずれも Promega)である。 このアツセィ法は、 P450の基質であるルシフエリン誘導 体を P450酵素によりルシフエリンに変換したのち、ノレシフェラーゼ反応により生 じた発光量に基づいて P450酵素活性を測定する方法からなる。
(xi) 薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝の試験方法
本発明は更に、 上記の非ヒ ト哺乳動物、 上記のマウス又はその子孫、 或いは上 記の細胞、 器官又は組織に薬物又は食品を投与し、 該薬物又は食品の薬理作用及 び/又は代謝を測定することを含む、 薬物又は食品の薬理作用及び Z又は代謝の 試験方法を提供する。
本発明のキメラ動物あるいはその子孫、或いは、それらと動物内在性 P450遺伝 子群を欠損させたノックァゥト動物とを交配させてできたヒ ト P450導入動物は、 その体内で本来ヒトの生体内で発現しているのと同じパターンでヒ ト P450 を発 現していると考えられるため、 特定の薬物を投与することで個体レベルでの薬理 効果、 毒性、 がん原性、 催奇形性、 薬物動態を研究するための実験動物としての 利用価値が高い。 さらに、 ヒ トにおける薬物の代謝メカニズムや組織ごとの毒性 について、 薬物をヒトに投与することなく知ることができる。 動物における代謝 解析では、肝ミク口ソームを用いたトリァゾラム（triazolam)水酸化活性測定ゃテ ストステロン 63水酸化活性測定等によりヒト CYP3Aで代謝される薬物の代謝活 性が検出されうる。 この試験方法の具体例は、 後述の実施例 12、 図 22及ぴ図 23 に記載されている。
(xi i) キメラ率及び保持率
上述したように、 本発明により、 ヒ ト 7番染色体上の CYP3A遺伝子クラスター 領域を含む約 3Mb及ぴ約 1Mb領域を SC20-HACベクターに転座、クローニングして 得られたヒ ト人工染色体 （それぞれ CYP3A- HAC及ぴ CYP3A - HAC A ) を作製し、 次 いで CYP3A- HACおよび CYP3A-HAC Aの各々をマウス個体へ導入し、 キメラマウス におけるキメラ率について #7- HAC (Kuroi a ら， Gene Ther. , 9： 708, 2002) と比 較し、 キメラ率および染色体保持率の向上とヒト人工染色体の効率的な子孫伝達 の達成を確認した。
キメラ率はキメラ動物における ES細胞の組織 （体毛） への寄与率を示し、通常 キメラ動物の体表面における ES 細胞に由来する体毛色の占める割合を視覚的に 評価することにより決定されうる。 一方で保持率は導入染色体の組織への寄与率 を示す。 ヒ ト染色体としての安定性があり、 かつ発生に悪影響を及ぼす因子がそ の染色体上に存在する場合、 高いキメラ率のマウスは発生障害を引き起こし致死 につながることから、 生まれてこない。 しかし、 ヒ ト染色体上に発生に悪影響を 及ぼす因子があっても安定性がなければ、 高キメラマウスが生まれてくる可能性 があり、 その場合ヒ ト染色体は高頻度で維持されない。
ここで言う安定性は、 個々の染色体のセントロメァ機能や個々の染色体上に存 在する遺伝子 （例えば細胞増殖を抑制する因子） に影響されうる。
したがって、 安定的な子孫伝達個体を得るためには高キメラマウス （体細胞に おける ES細胞の寄与率の高いキメラマウス個体）に高い保持率で外来染色体が維 持されている必要がある。
ヒト 7番染色体断片又は #7- HACを保持する高いキメラ率のキメラマウスはこれ までに作製されているが、安定的にヒ ト 7番染色体断片もしくは #7- HACが子孫に 伝達することはなかった （国際公開第 W001/011951 号； Kuroiwa ら， Gene Ther. , 9：708, 2002)。 ヒ ト 7番染色体断片もしくは #7- HACを保持する高いキメラ 率のキメラマウスにおいて、 外来染色体の子孫伝達が観察されなかったことは導 入染色体の組織への寄与率が低かった可能性が示唆される。
本発明により、 CYP3A- HACあるいは CYP3A- HAC Δによる CYP3A遺伝子クラスター を保持するトランスクロモソミック非ヒ ト動物（例えば、マウスなどの哺乳動物） の効率のよい作出が可能になる。 これは、 医薬品の候補となった薬剤の毒性スク リーニングゃ食品の機能性や安全性のための非ヒ ト動物として有用であると考え られる。 CYP3A- HACあるいは CYP3A- HAC A トランスクロモソミックマウスは異種染 色体断片の子孫伝達が可能であるので、 交配により均一な形質を持ったトランス クロモソミックマウスの大量生産が可能になるだろう。 Yuらの報告 （Endocology 146 : 2911-2919)では、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターの一部（CYP3A4)を含む細菌人 ェ染色体 （BAC) を導入したトランスジエニックマウスが構築された。 し力 し、 当 該マウス系統にて発現する CYP3A4遺伝子は成体期に発現する遺伝子であり、胎児 期に発現する CYP3A7や他の CYP3A遺伝子クラスターである CYP3A5や CYP3A43な どを含まない。従って、該マウス系統で発現する CYP3Aは CYP3A4に限定的である と想像される。 さらに導入されている BACコピー数や導入部位は同定されておら ず、 ヒ トと同じ生理的発現制御を受けているとは言い難い。 また、 Herwaardenら の報告 （Herwaardenら， J. Clin. Invest.， 117 : 3583— 3592, 2007) では Cyp3a遺伝子 ノックァゥトマウスを作製し、さらにヒ トの CYP3A4遺伝子を肝臓または小腸に発 現させたマウスを作製した。 しかし、 これらのマウスでは肝臓または小腸特異的 なプロモーター下流にヒ ト CYP3A4遺伝子を繋いで強制的に発現させており、ヒ ト と同じ生理的発現制御を受けているとは言い難い。
本明細書で開示されるヒ ト CYP3A遺伝子クラスターを発現するマウス系統にお いては、 ヒ トと同様に CYP3A遺伝子クラスターの時期特異性発現や組織特異性発 現、 発現誘導能等がより忠実に再現される。 例えば、 CYP3A4や CYP3A7が含まれ るため成体期おょぴ胎児期の CYP3A発現をヒ トと同様に検出することができる。 誘導剤の例は、 Rifampiciriや PCN (Pregnenolone 16ひ - carbonitrile)である。 これらのヒ ト CYP3A遺伝子クラスター発現トランスクロモソミ ックマウスを適 当な誘導剤により発現誘導することにより、 その肝臓より活性の高いミク口ゾー ム ' S9が得られる。これらの S9は薬品や化学品や食品の代謝研究に利用できる。 さらにまた、 上記のようにして得られるトランスクロモソミ ック非ヒ ト動物細 胞ゃ動物を利用して、 外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、 その産 物を回収することにより、 生物学的に活性な物質を製造することができる。 具体 的には、 トランスクロモソミック非ヒ ト動物個体を外来染色体またはその断片上 の遺伝子を発現しうる条件下で飼育し、 その後、 発現産物を動物の肝臓、 小腸な どから回収することができる。
また、 トランスクロモソミック非ヒ ト動物の組織、 細胞あるいはそれを不死化 したもの （例えば、 肝臓由来幹細胞） などを、 外来染色体またはその断片上の遺 伝子が発現しうる条件下で培養し、 その後、 発現産物を培養物から回収すること ができる。
あるいはまた、 これら トランスクロモソミック非ヒ ト動物の組織、 細胞、 また はそれを不死化したものから抽出した外来染色体もしくはその断片、 この外来染 色体もしくはその断片を構成する DNA、 またはトランスクロモソミック非ヒ ト動 物の組織、 細胞、 またはそれを不死化したものに保持された外来染色体もしくは その断片に由来する cDNAを、動物細胞、酵母細胞あるいは昆虫細胞 (例えば、 CH0 細胞、 BHK細胞、 肝ガン細胞、 ミエローマ細胞、 パン酵母細胞、 SF9細胞、 HEPG2 細胞等） に導入し、 該細胞を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる 条件下で培養し、 その後、 発現産物を培養物から回収することができる。 生物学 的に活性な物質は、 外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、 例え ば、 P450、 特にヒ ト CYP3A4、 CYP3A5、 CYP3A7、 CYP3A43などを挙げることができ る。
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、 本発明の範囲はこれらの 実施例に限定されるものではない。 実施例
以下の実施例 1〜実施例 16において、 ヒ ト 7番染色体上のヒ ト CYP3A遺伝子ク ラスター周辺領域 3Mb又は 1Mbを SC20- HACベクタ一へ転座クローユングしたヒ ト 人工染色体 CYP3A-HAC又は CYP3A- HAC Aの作製について説明する（図 1)。さらには、 作製された各 HACのマウス個体への導入及び HACのキメラマウス子孫への伝達に ついて説明する。
実施例 1
ヒ ト CYP3A遺伝子クラスター領域周辺 （AC004922 -ヒ ト CYP3A遺伝子クラスター -AF006752) 3Mb を SC20- HAC ベクターへ転座クローニングしたヒ ト人工染色体 CYP3A-HACの構築
(A) ヒ ト 7番染色体の AC004922への ΙοχΡ配列の部位特異的揷入
(A. 1) ターグティングベクター pNPloxPHygの作製
ヒ ト 7染色体上の CYP3A遺伝子座のごく近傍かつセントロメァ側 （約 300Kbセ ントロメァ側） に位置する AC004922領域に Cre組換え酵素の認識配列 ΙοχΡを挿 入するためのターゲティングベクター pNPloxPHyg を以下のようにして作製した。 まず、 AC004922ゲノム領域を以下のプライマーを用いて PCRにより増幅した。 p4501oxP7L ; 5 -ggcctagagcctggactcattcattcaa-3 (酉己歹 (J番号 1)
p4501oxP7R ; 5' -gacagatgtcatgccccaggtaggtatg-3' (酉己歹 l|番号 2)
ΙοχΡ配列を揷入するための基本プラスミ ドには V901 (Lexicon genetics)を用い た。 PCRは、 サーマルサイクラーとして Perkin- Elmer社製の Gene Amp 9600を、 Taqポリメラーゼは LATaq (宝酒造）を用い、バッファーや dNTPs (dATP， dCTP, dGTP, dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は 94°C 1分の熱変性後、 98°C 20秒、 68°C 7分を 35サイクル行った。 PCR産物をプロテ ネース K (ギブコ） 処理した後、 CHR0MASPIN-TE400 (クローンテック） でゲル濾 過した。 その後、 制限酵素 BamHI (ベーリンガー） および EcoRI (二ツボンジーン） および Bglll (二ツボンジーン) で切断し CHR0MASPIN- TE1000 (クローンテック） でゲル濾過した。 この PCR断片（3. 7kbおよび 3. Okb)を V901プラスミ ドの EcoRI と BamHI 又は Bglllサイ トにクローニングした （V901- NP21)。 次に、 V901 - NP21 を制限酵素 Ascl (NEB) で切断し脱リン酸化後、 カセッ トベクター ploxPhyg (Kuroiwa ら， Nature Biotech. 18： 1086, 2000) から制限酵素 Asclで ΙοχΡを含む DNA断片を切り出し、 ライゲーシヨンした。 ΙοχΡ配列の方向がクローニングした AC004922 ゲノム断片と同方向のものをターゲテイングベクター pNPloxPHyg とし. た。 最終的な ΙοχΡ挿入コンストラク トのサイズは 14. lkbである。 ターゲティン グベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図 4aに示す。
(A. 2) トランスフエクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離
W001/011951に記載された方法で作製されたヒ ト 7番染色体断片 （AF006752座 で部位特異的に切断されている）を保持するニヮトリ DT-40細胞（クローン DF141) に上記 （A. 1)で作製したタ一ゲティングべクタ一 pNPloxPHygをトランスフエクシ ヨンし、 AC004922ゲノム領域への ΙοχΡ配列の揷入を試みた。
ュヮ トリ DT- 40細胞の培養は 10%ゥシ胎児血清 （ギブコ、 以下 FBSで記す）、 1%
-ヮ トリ血清 (ギブコ）、 10—4M 2-メルカプトエタノール (シグマ) を添加した
RPMI1640培地 （ギブコ） 中で行った。 約 107個の細胞を無添加 RPMI1640培地で一 回洗浄し、 0. 5mlの無添加 RPMI1640培地に懸濁し、 制限酵素 Notll (宝酒造） で 線状化したターゲティングべクタ一 pNPloxPHygを 25〜30 μ βカロえ、エレク トロポ レーシヨン用のキュべッ ト （バイオラッド） に移し、 室温で 10分間静置した。 キ ュベットをジーンパノレサ一 (バイオラッド) にセットし、 550V、 25 の条件で 電圧印加した。 室温で 10分間静置後、 24時間培養した。 24時間後、 ハイグロマ イシン B (1. 5 mg/ml) を含む培地に交換し、 96穴培養プレート 3枚に分注して約 2週間の選択培養を行った。 5回のトランスフエクションで得た合計 96個の耐性 コロニーを単離し増殖させ、 以後の解析を行った （クローン名 ： DT40 (NP) ) 0
(A. 3) 相同組換え体の選別
(A. 3. 1) PCR解析
ノヽィク、、ロマイシン B 而ォ个生クローンカ ら Puregene DNA Isolat ion Kit (Gentra System社） を用いてゲノム DNAを抽出して、 以下の 2組のプライマーを用いた PCRにより相同組換え体の同定を行った。
以下の 2組のプライマーを用いた PCRにより相同組換え体の同定を行った。 p4501oxP14L ; 5' -agttcttttgagggcctagagcctggac-3' (酉己歹 U番号 3)
p4501oxP14R ; 5 -aaaggacagaaggagggagcaacaggat-3 (酉己列番号 4)
p4501oxP16L ; b -tctgggcatcagtgtcctctccagtaaa-3' (酉 S列番号 b)
p4501oxP16R ; 5' -ttggcgacatccaatgctagtgctattc-3' (酉己歹幡号 6)
PCRは、 サーマノレサイクラ一として Perkin- Elmer社製の Gene Amp 9600を、 Taq ポリメラーゼは LATaq (宝酒造） を用い、 バッファーや dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は 94°C 1分の熱変性後、 98°C 10秒、 68。C 4分を 35サイクル行った。 96クローンをス クリーニングした結果、 36クローンが相同組換え体として同定された （組換え頻 度 37. 5%)。
(A. 3. 2) サザンブロッ ト解析
上記 PCR解析にて組換えを確認した 6クローンについて以下のようにサザンブ 口ット解析を行った。 このゲノム DNAを制限酵素 EcoRI (宝酒造）で処理し、 0. 8% ァガロースゲノレ中で電気泳動し、 GeneScreen Plus™ハイブリダイゼーショントラ ンスフアーメンブレン（NEN™ Life Science Products, Inc. )ヘアノレ力リブロッテ イングした。このフィルターに対して AC004922中の遺伝子配列を PCRにより増幅 した NPpプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い相同組換え体の 同定を行った（図 4)。NPpプローブの作製は以下のプライマーを用い DF141のゲノ ム DNAを铸型として PCRを行い、 その PCR産物を铸型としてランダムプライミン グによる 32 P標識 DNAプローブを作製した（アマシャム、 添付のプロトコールに従 つた）。
NPpプローブ作製用プライマー：
NPp6L ; 5' -tggagacgttgtttagcctctcctcctc-3' (酉己歹 U番号 7)
NPp6R ; D -cacagcttagaggccattcccatagtcc-3 (酉己列番"" 8)
PCRは、 サーマルサイクラ一として Perkin- Elmer社製の GeneAmp9600を、 Taq ポ リ メ ラ ー ゼ は EX Taq ( 宝 酒 造 ） を 用 い 、 ノ ッ フ ァ ー や dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)は添付のものを推奨条件に従って用いた。 温度、 サ ィクル条件は、 93°C 5分の熱変性後、 93°C 1分、 54°C 1分、 72°C 1分を 1サイ クルとして 35サイクルで行った。 サザンハイブリダイゼーションにより、非相同 組換え体では約 10. 9kb、相同組換え体では約 8. Ikbのバンドが検出されると予測 された（図 4b)。 サザンハイプリダイゼーシヨンの結果、 6クローン中すベてのク ローンが目的の相同組換え体であった（NPクローンと呼ぶ）。
(A. 3. 3) 蛍光 in situハイプリダイゼーシヨン （FISH) 解析
FISH解析は松原ら（FISH実験プロ トコール、 秀潤社、 1994) に従い行った。 上 記 A. 3. 2で組換えを確認、したクローンのうち 6クローンをヒ ト cot- 1 DNAおよび ハイグロマイシンをプローブにして FISH解析を行ったところ、ヒ ト 7番染色体は 全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、 7q22付近にハイグロマイシン 由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こつたことが確か められた。 結果を図 3a- c示す。 図 3aは DT40 (#7)、 図 3bは DT40 (DF141)、 図 3c は DT40 (NP25)クローンを示す。
(B)ヒ ト 7番染色体断片と SC20-HACベクターの両者を保持する DT - 40ハイブリッ ドの作製
まず、 最初に上記 A. 3. 2で得られたクローン NP25を SC20 - HACベクターを保持 する DT - 40細胞 Rクローン (Kuroiwaら， Nature Biotech. 18： 1086， 2000)と細胞融 合することによって、 ヒ ト 7番染色体断片と 14番染色体断片 SC20断片の両者を 保持する DT-40ハイプリッドを作製した。
(B. 1) 細胞融合およびダブル薬剤耐性クローンの単離
Rクローンはブラストサイジン S (lO ^ g/ml) 含有 RPMI1640培地で、 NP25クロ ーンはハイグロマイシン B (1. 5mg/ral) 含有 RPMI1640培地で培養した。 1〜2 X 107 個の両クローンを混合し遠心後、無血清 RPMI1640培地で 2回洗浄した。残量培地 を完全に取り除いた後に、 予め 37°C で保温しておいた 50°/。PEG1500 (ベーリンガ 一） 0. 5ml を静かに加え、 約 2分間ピペットで激しく混合した。 その後、 無血清 RPMI1640培地 lmlを 1分間かけてゆつく り加え、続いて無血清 RPMI1640培地 9ml を約 3分間かけて加え、 37°Cで 10分間静置した。 その後、 1， 200 rpmで 5分間遠 心し、 血清を含む RPMI1640培地で 24〜48時間培養した。 その後、 プラストサイ ジン S (10 M g/ml) ·ハイグロマイシン B (1. 5 mg/ml) 含有 RPMI1640培地に交換 し、 24穴培養プレート 5枚に分注し、 3〜4週間培養した。 5回の細胞融合で得た 合計 8個の耐性コロニーを単離し増殖させ、 以後の解析を行った （クローン名 ： DT40 (RP) )。
(B. 2) 相同組換え体の選別
(B. 2. 1) PCR解析
ダブル薬剤耐性クローンからゲノム DMAを抽出して、 以下のプライマーを用い て PCRを行い、 ヒ ト 14番染色体断片 （SC20-HACベクター）、 7番染色体断片の 2 本が保持されていることを確認した。
ヒ ト 14番染色体（SC20染色体ベクター）検出用プライマー ：
AL157858-F： 5' CCTTCATTACGTCCTTTCGC3' (配列番号 9)
AL157858-R： 5， AGTCATCACTGCATCCTGGG3' (配列番号 10)
AL121612 - F : 5' TAGGTCCTTTAGGCCATGGG3' (配列番号 11)
AL121612- R : 5， GCATTTTGGCCTCAAGTAGC3' (配列番号 12)
AL137299- F : 5' TGCTTGTTC ATCTGTCAGTGG3 ' (配列番号 13)
AL137299-R： 5' ATCACAAGGTCAAGCGATCG3' (配列番号 14)
D14S577 - F : 5' ATTTTGGGACTTCCTGGC3 ' (配列番号 15)
D14S577-R : 5' AATCTGTTTGCAGTCTTCACC3' (配列番号 16)
D14S272- F: 5' GAGTTCAAGGTTACAGTAAGTNATG3' (配列番号 17) D14S272 - R : 5' CTCTTGTCTCATAGTGCAAAGG3 ' (配列番号 18)
D14S293-F： 5' GAAACTCTAGCATGTAACACTCCAA3' (配列番号 19)
D14S293-R： 5' GAGCCACTGCACCTGG3' (配列番号 20)
D14S1227-F： 5， GCACTACATTAAAGATGTGCAACC3 ' (配列番号 21)
D14S1227- R : 5' ACTCTCACACCCACCCAGAC3' (配列番号 22)
D14S543-F： 5' ATGTGGGAAACAGACTCAG3' (配列番号 23)
D14S543-R： 5' ATTTGGATTATTTAGAATTCCC3' (配列番号 24)
1GHMC-F： 5' GCATCCTGACCGTGTCCGAA3' (配列番号 25)
IGHMC-R： 5' GGGTCAGTAGCAGGTGCCAG3 ' (配列番号 26)
D14S1007-F： 5' AGCTCCTATATGTCTTCACACAG3' (配列番号 2ァ）
D14S 1007-R： 5' CTCCATTCCCATACGTCC3' (配列番号 28)
D14S 1419- F : 5' TAGGGACAGGCAGTTGATTA3 ' (配列番号 29)
D14S1419— R : 5， CAATTAATGTAAAAATTAGCCA3 ' (配列番号 30)
D14S1420- F : 5， TGTTTGAAGAAGGGAGTCGT3' (配列番号 31 )
D14S1420-R： 5' CCCACTCCATGTCTTCTGTT3' (配列番号 32)
IGHV3- F : 5， AGTGAGATAAGC AGTGGATG3 ' (配列番号 33)
IGHV3-R : 5' CTTGTGCTACTCCCATCACT3' (酉己歹 U番号 34)
ヒ ト 7番染色体（CYP3A遺伝子クラスター）検出用プライマー ：
CYP3A4F7： 5， GCAAGACTGTGAGCCAGTGA3' (配列番号 35)
CYP3A4R7： 5， GGCTGCATCAGCATCATCTA3' (配列番号 36)
CYP3A7F： 5' ACCCTGAAATGAAGACGGGC3 ' (配列番号 37)
CYP3A7R： 5， GAGTTAATGGTGCTAACTGGGG3' (配列番号 38)
CYP3A5F： 5' ATAGAAGGGTCTGTCTGGCTGG3' (配列番号 39)
CYP3A5R： 5， TCAGCTGTGTGCTGTTGTTTGC3' (配列番号 40)
PCRは、 サーマルサイクラ一として Perk in-Elmer社製の GeneAmp9600を、 Taq ポ リ メ ラ ーゼは EX Taq (宝酒造） を用 い、 バ ッ フ ァ ーや dNTPs
(dATP, dCTP, DGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 温度、 サイクル条件は 94°C 1分の熱変性後、 98°C 10秒、 56°C30秒、 72°C30秒を 35サイ クル行った。 PCRの結果、 8クローン中 6クローンが全てのプライマーで陽性であ つた。
(B. 2. 2) 蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH) 解析
FISH解析方法は Kuroiwa ら (Nature Biotech. 18： 1086， 2000) に従った。 上記 B. 2. 1で組換えを確認したクローンのうち 6クローンをヒ ト 14番染色体特異的プ ローブ （ローダミン標識） とヒ ト 7番染色体特異的プローブ （FITC標識） を用い た FISH解析を行ったところ、 SC20-HACベクターとヒ ト 7番染色体断片は全ての クローンで宿主染色体に転座することなく、 独立に 1本ずつシグナルが検出され たことから細胞融合が起こったことが確かめられた。 結果を図 3d - e に示す。 図 3dは Rクローン、 図 3eは RP13クローンを示す。
以上の結果から、 これらの 6 ハイブリ ッ ドクローンはヒ ト 14 番染色体断片
(SC20-HACベクター）、 7番染色体断片の 2本を保持していると判断できた。 (C ) DT-40 ハイブリ ッ ドクローン （RP13 ) におけるヒ ト 7 番染色体領域
(AC004922- CYP3A遺伝子クラスタ AF006752) 3Mbの SC20- HACベクターへの部 位特異的転座
Kuroiwa ら （上記， 2000) の方法に従って、 ヒ ト染色体間の部位特異的転座は Cre-loxPシステムを用いることによって行った。
上記と同様にして、 制限酵素 Kpnl (ベーリンガー） で線状化した Cre組換え酵 素安定発現ベクター pBS185hisD (Kuroiwa ら， Nature Biotech. 18： 1086， 2000) を RP13ハイプリッドクローンにトランスフエタシヨンし、 24穴プレートへ分注し、 ヒスチヂノール（lmg/ml)存在下で約 2週間選択培養した。 それぞれのゥエルから ゲノムを抽出し、 以下の 2組のプライマーを用いたネステッド （nested) PCRを 行い、 SC20 - HACベクターとヒ ト 7番染色体断片間で転座が起こったか否かを検討 した。
PGK-1； 5' -ATAGCAGCTTTGCTCCTTCG-3' (配列番号 41)
GFP-1； 5' -TTCTCTCCTGCACATAGCCC-3' (配列番号 42)
PGK-2； 5' - TGTTCTCCTCTTCCTCATCTCC- 3' (配列番号 43)
GFP-2； 5' - TGAAGGTAGTGACCAGTGTTGG- 3， （配列番号 44)
PCRは、 サーマルサイクラ一として Perkin- Elmer社製の GeneAmp 9600を、 Taq ポ リ メ ラ ーゼは EX Taq (宝酒造） を用 い、 バ ッ フ ァ ーや dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 まず、 第一の PCRは、 94°C 1分の熱変性後、 98°C 10秒、 61°C30秒、 72°C 1分を PGK- 1と GFP-1をプライマーとして 35サイクル行った。 この反応液の一部を鎵型として、 98°C 10秒、 59°C 30秒、 72°C 0秒を PGK - 2と GFP - 2をプライマーとして 35サイ クル行った。 PCR陽性で転座が確認できたゥエル中の細胞プールを 107細胞数にな るまで増やし、 プールを 5% FBSと 1 μ /mlのプロビディアムアイオダィ ド （PI) を添加した PBS (リン酸緩衝溶液） 4mlに懸濁し、 FACSVantage (ベタトン ·ディ ッキンソン） により解析した。 Kuroiwaら （前出） の報告にあるように、 ΙοχΡ間 での組換え転座が起こると GFP遺伝子が再構築され発現するので転座を起こした 細胞を FACSで検出できる。 GFP陽性と思われる細胞画分のソーテイングを 2回繰 り返した。 毎回のソーティング後の培養はハイグロマイシン B (l. 5 mg/ral) 含有 RPMI1640培地で行った。 その結果、 GFP陽性細胞を 98〜99%の純度で濃縮するこ とができた。
次に、 FACSでクローニングされた GFP陽性クローン （RPC13F2) において、 期 待通り ΙοχΡ間で組換えが起こっていることを前記 PGK- 2と GFP- 2をプライマーと して用いた PCRによって確認した。 さらに、 クローン RPC13F2に対して、 ヒ ト 14 番染色体特異的プローブ （ローダミン標識） とヒ ト 7 番染色体特異的プローブ (FITC標識） を用いた FISH解析 （黒岩ら、 上記） を行った結果、 確かにヒ ト 7 番染色体領域が SC20 - HACベクター （ヒ ト 14番染色体断片） に転座した人工染色 体の存在が確認された （図 3f)。
以上の結果から、 クローン RPC13F2において、 CYP3A遺伝子クラスター領域周 辺 （AC004922-CYP3A遺伝子クラスタ ' AF006752) 3Mb SC20-HACベクタ · ■転 座クローニングしたヒ ト人工染色体 CYP3A- HACが構築できたと結論付けた。
(D) CYP3A-HAC含有 DT- 40ハイブリッド細胞の CH0細胞への CYP3A- HACの導入
Kuroiwaら （上記） の報告にあるように、 構築された HACをマウス ES細胞へ導 入するために、 まず CH0細胞への導入を試みた。
DT- 40ハイブリ ッ ドクローン RPC13F2を T225フラスコ （スミロン） 8本で培養 し、 コンフルェントになった時点で 20% FBS、 1% ニヮトリ血清、 1(Γ4Μ 2-メルカ プトエタノール、 0. 05 μ §/πι1 コルセミ ドを添加した RPMI 1640培地に交換し、 さ らに 24時間培養してミクロセルを形成させた。 細胞を 24 mlの血清 RPMI1640培 地に懸濁し、 予め lOO / g/mlのポリ L-リジンでコートした遠心用 25cm2フラスコ 12本 （コ一二ング） に 2 mlずつ分注し、 37°Cで 1時間培養し、 細胞をフラスコ の底に付着させた。 培養液を除去し、 予め 37°Cで保温したサイ トカラシン B (10 /z g/ml，シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 34°C、 8000rpm、 1 時間の遠心 を行った。 ミクロセルを無血清 DMEM培地に懸濁し、 8 μ ιη， 5 μ m, 3 mフィノレタ 一にて精製した。 精製後、 1700rpm， 10分間遠心し、 無血清 DMEM培地 5mlに懸濁 した。 一方、 約 107個の CH0細胞をトリプシン処理によりはがし、 無血清 DMEM培 地で 2回洗浄し、無血清 DMEM培地 5 mlに懸濁した。再度、ミクロセルを 1700rpm、 10分間遠心し、 上清を除かずに先の CH0懸濁液 5ml を静かに重層した。 遠心後、 培養液を除去し、 PEG1500溶液 （ベーリンガー） 0. 5 mlを加え、 約 2分間ピぺッ トで激しく攪拌した。 その後、 無血清 DMEM培地 10 mlを約 3分間かけてゆつく り 加え、 37°Cで 10分間静置した。 遠心後、 10% FBS添加 F12培地 （ギブコ） に細胞 を懸濁し、 24穴培養プレート 5〜6枚に分注し、 37°Cで 24時間培養した。その後、 G418 800 μ §/ηι1含有 F12培地に交換し、 3〜4週間選択培養した。
G418耐性クローンからゲノム DNAを抽出して CYP3A遺伝子クラスター検出用プ ライマーおよびヒ ト 14番染色体検出用プライマーおょぴ PGK - 2、 GFP - 2プライマ 一を用いて、 前述と同様の条件で PCRを行い、 CYP3A- HACを保持する CH0 クロー ンを同定した （例えば、 CH0/C YP3A- HAC4， 25)。 さらに、 上記 PCRで陽性だつたク ローンに対して、 ヒ ト C0T1DNAをプローブに用いて FISH解析を行った結果、視覚 的に CYP3A- HACの存在を確認した。 これらの結果から、 CYP3A - HACを保持する CH0 細胞クローンが得られたと結論付けた （図 3g)。
(E) CH0細胞からの CYP3A - HACのマウス ES細胞への移入
CYP3A-HAC を保持するキメラマウスを作製するために、 上記（D)で得られた CYP3A-HACを保持する CH0細胞からマウス ES細胞 （野性型 TT2F) へミクロセル法 により導入した。
Toraizukaら (Nature Genet. 16 : 133， 1997) の方法に従い、 約 108個の CYP3A - HAC を保持する CH0細胞 （CH0/CYP3A- HAC4, 25, 32， 33など） からミクロセルを精製 し、 DMEM 5mlに懸濁した。 約 107個のマウス ES細胞 TT2Fをトリプシン処理によ り剥がし、 DMEMで 3回洗浄後 DMEM 5 mlに懸濁し、 遠心したミクロセルに加え、 1250rpmで 10分間遠心し、 上清を完全に取り除いた。 沈殿をタッピングにより十 分ほぐし、 1 : 1. 4 PEG溶液 [5g PEG1000 (和光純薬）、 lral DMSO (シグマ） を DMEM 6ml に溶解] 0. 5mlを加え、 約 1分 30秒間、 十分攪拌した。 その後、 DMEM 10mlをゆつ く り加え、 1250rpmで 10分間遠心し、 30ml の ES培地に懸濁し、 予めフィーダ一 細胞をまいた直径 100腿シャーレ （コーユング） 3枚に分注し、 培養した。 24時 間後、 300 i g/mlの G418を含む培地に交換し、約 1週間選択培養した。その結果、 CH0/CYP3A-HAC4 からは 25 クローン、 CH0/CYP3A - HAC25 からは 13 クローン、 CH0/CYP3A - HAC32からは 28 クローンが CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマー およびヒ ト 14番染色体検出用プライマーを用いた PCRで陽性であった。 さらに、 ヒ ト C0T1DNA プ ロ ー ブ を用 い て FISH 解析 （ Tomizuka ら ， Nature Genet. 16： 133, 1997) を行った結果、 C0T1 プローブにより特異的に検出される CYP3A-HACの存在が 66クローン中、 52クローンで確認された。 このうちマウスの 核型が正常なクローンは 28クローンであった。 以上のことから、 CYP3A-HAC保持 TT2F細胞が 28クローン得られたと結論付けた （図 3h)。
(F)ヒ ト人工染色体 CYP3A - HACを保持するキメラマウスの作製
上記（E)で得られた ES 細胞ク ローンを用いて Tomizuka らの方法 （Nature Genet. 16 : 133, 1997)でキメラマウスを作製した。宿主としては MCH (ICR) (白色、 日本クレア社より購入） の雌雄交配により得られる 8細胞期胚を用いた。 注入胚 を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうかを判 定できる。 野性型 TT2F/CYP3A- HAC クローン （例えば F8/CYP3A- HAC- 1および 18、 上記（E)で取得） を注入した 9410個の胚を仮親に移植した結果、 484匹のキメラ マウス （毛色に濃茶色の部分の認められる） が誕生した。 うち 29匹は白色の部分 がほとんど観察できないキメラ率約 100%の個体であった。 すなわち、 ヒ ト人工 染色体 CYP3A - HACを保持する ES細胞株 （TT2F) はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示された。
(G)ヒ ト人工染色体 CYP3A- HACを保持する ES細胞より作製されたキメラマウス体 細胞における人工染色体の保持
上記（F)で TT2F/CYP3Aクローン （F8/CYP3A - HAC - 1および 18) より作製されたキ メ ラマウス （キメ ラ率約 80% ) の尻尾から Tomizuka らの報告 （Nature Genet. 16： 133, 1997) に記された方法でゲノム DNAを調製し、 CYP3A遺伝子クラス ター検出用プライマーおよびヒ ト 14番染色体検出用プライマーを用いた PCRを前 記と同様に行い、 CYP3A- HACの保持を検討した。 その結果、 2種のプライマー共に 陽性であり、キメラマウス体細胞における CYP3A-HACの保持が確認された。また、 キメラ率約 80%のキメラマウス 2 匹の肝臓組織を用いて Shinohara らの報告 Human Molecular Genetics ,： 10， 1163 - 1175， 2001) に記された方法でヒ ト C0T1DNA をプローブに用いて FISH解析を行った結果、視覚的に CYP3A-HACの存在を確認し、 その CYP3A - HACの保持率は両個体とも 70%であり、 キメラ率とほぼ一致した。 キ メラ率は ES細胞の組織 （体毛） への寄与率を示し、 保持率は導入染色体の組織へ の寄与率を示す。 キメラ率が高く、 保持率も高いキメラマウスの使用はより高い 効率の導入染色体保持 ES 細胞の生殖細胞への分化と該導入染色体の子孫伝達を もたらすと考えられる。 すなわち CYP3A- HACの使用により、 CYP3A遺伝子を含む ヒ ト染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まることが期待される。
上記（F)で作製された雌キメラマウス （キメラ率約 100 %) 4匹を MCH (ICR) (白 色、 日本クレア社より購入） 雄マウスと交配した。 キメラマウスより誕生した 40 匹の仔マウスのうち、 29匹が ES細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示す 濃茶色であった。すなわち CYP3A- HACを保持する ES細胞株は雌キメラマウスにお いて機能的な卵細胞に分化したことが示された。濃茶色仔マウス 29匹中の尻尾を 一部切り取り、その試料よりゲノム DNAを調製した。得られた DNAについて CYP3A 遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒ ト 14 番染色体検出用プライマーを 用いた PCRを前記と同様に行い、 CYP3A-HACの保持を検討した結果、 全てにおい て 2種のプライマー共に陰性であり、 キメラマウス子孫における CYP3A- HACの保 持は確認されなかった。 すなわち、 キメラ率、 保持率が高いキメラ個体において 子孫伝達が観察されなかったことは CYP3A - HAC上に発生あるいは生殖細胞分化に 悪影響を及ぼすヒ ト遺伝子が存在することが示唆された。
実施例 2
ヒ ト CYP3A遺伝子クラスター領域周辺 （AC004922 -ヒ ト CYP3A遺伝子クラスター
-AC073842) 1Mb を SC20- HAC ベクターへ転座クロ一ニングしたヒ ト人工染色体 CYP3A- HAC Aの構築
上記 CYP3A- HACにおいては、 CYP3A遺伝子クラスタ1 AF006752間に約 2Mbの余 分な領域がまだ残存している。そこで、厳密に余分な染色体領域を取り除き、 CYP3A 遺伝子クラスター領域周辺のみを転座クローユングする目的で、 AC00492 -ヒ ト CYP3A遺伝子クラスタ^ AC073842領域約 1Mbを SC20-HACベクターへ転座クロー ニングしたヒ ト人工染色体 CYP3A- HAC Aを構築することを試みた。
(A) CYP3A-HACの DT40細胞への移入
染色体改変を効率的に行うために、 CYP3A- HACを CH0細胞から相同組換え頻度 の高い DT40細胞へ移入した。 Tomizukaら (Nature Genet.， 16 : 133 - 143， 1997)の方 法に従い、約 108個の CYP3A - HACを保持する CH0細胞（CH0/CYP3A- HAC32、実施例 1 記載）からミクロセルを精製し、 DMEM 5mlに懸濁した。 1〜2 X 107個の-ヮトリ DT40 細胞を匪 EMで 2回洗浄後、 DMEM 5mlに懸濁し、遠心したミクロセルに加え、 1500rpm で 10分間遠心し、上清を完全に取り除いた。沈殿をタツビングにより十分ほぐし、 PEG1500溶液（ベーリンガー） 0. 5ml を加え、 約 2分間、 十分攪拌した。 その後、 DMEMlOmlをゆっく り加え、 15 OOrpmで 10分間遠心し、 10%ゥシ胎児血清（ギブコ、 以下 F BSで記す）、 1%ニヮ トリ血清（ギブコ）、 1(Γ4Μ 2 -メルカプトエタノール（シ ダマ）を添加した RPMI1640培地（ギブコ）中で培養した。 24時間後、培地を lmg/ml の G418を含む培地に交換し、約 3週間選択培養した。薬剤耐性コロェ一からゲノ ム DNAを抽出して CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒ ト 14番染色 体検出用プライマーを用いて PCRを行った。
PCRは、 サーマルサイクラ一として Perkin-Elmer社製の GeneAmp9600を、 Taq ポリメラーゼは Ex Taq (宝酒造）を用い、バッファーや dNTP (dATP， dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨条件に従って用いた。 温度、 サイクル条件は 94°C 1分の熱変 性後、 98°C 10秒、 56°C30秒、 72°C30秒を 1サイクルとして 35サイクル行った。 その結果、 約 5クローン中、 2 クローンが CYP3A遺伝子クラスター検出用プライ マーおょぴヒ ト 14番染色体検出用プライマー陽性であった。さらに、ヒ ト C0T1DNA プローブを用いて FISHを行った結果、 CYP3A-HACが独立して存在していることが 分かった。 以上の結果から、 CYP3A- HAC を保持するニヮ トリ DT40 細胞（以下、
DT40 (CYP3A-HAC)と略記）がクローニングできた。 (B) CYP3A-HAC上のヒ ト 7番染色体領域 AC073842での部位特異的切断 (B. 1) ターグティングベクター pTELhisD-PTの作製
ヒ ト 7染色体上の CYP3A遺伝子座のごく近傍かつテ口メァ側 （約 150Kbテロメ ァ側）に位置する AC073842領域にヒ トテロメァ配列を挿入するためのターゲティ ングベクター pTELhisD - PTを以下のようにして作製した。 まず、 AC073842ゲノム 領域を以下のプライマーを用いて PCRにより増幅した。
PT1L ; 5 -tgcggtgaaggtccaaggagatagattt-3' (酉己列番号 45)
PT2R; 5' -tctagcagagagatggtggcaggattca-3' (酉 S列番号 46)
PCRは、 サーマルサイクラ一として Perkin— Elmer社製の Gene Amp9600を、 Taq ポリメラーゼは LATaq (宝酒造） を用い、 バッファーや dNTP (dATP, dCTP , dGTP , dTTP)は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は 94°C 1分の熱変性後、 98°C20秒、 68°C8分を 35サイクル行った。 PCR産物をプロテネ —ス K (ギブコ） 処理した後、 CHROMASPIN - TE400 (クローンテック） でゲル濾過 した。 その後、 制限酵素 BamHI (ベーリンガー） および Bglll (二ツボンジーン） で切断し、 CHR0MASPIN-TE 1000 (クローンテック） でゲル濾過した。 この PCR 断片をプラスミ ド pTELhisD (Kuroiwa ら， Nature Biotech.， 20： 88, 2002) の BamHI 部位にクローニングした。 AC073842ゲノムシ一クエンスの方向はテ口メァ→セン トロメァなので、クロ一ニングされた AC073842ゲノム断片がヒ トテロメァ配歹 Uと 同方向のものを目的のターゲティングベクター pTELhi sD - PTとした （図 5)。
最終的な長腕近位部位特異的切断用コンストラク トのサイズは 14. 4kbである。 ターゲテイングベクター、 標的配列、 および相同組換えにより生じる染色体ァレ ノレを図 5に示した。
(B. 2) トランスフエクションおよびハイグロマイシン耐性クローンの単離 上記と同様に、 上記で作製したターゲティングベクター pTELhisD - PT を制限酵 素 Srfl (東洋紡） で線状化後、 上記で作製したクローン DT40 (CYP3A- HAC) - 4にト ランスフエクシヨンし、 ヒスチジノール (0. 5mg/ml) を含む培地に交換し、 96穴 培養プレート 10枚に分注して約 2週間の選択培養を行った。 5回のトランスフエ クションで得た合計 433個の耐性コロニーを単離し増殖させ、 以後の解析を行つ た （クローン名 ： DT40 (CYP3A ΗΑ〇Δ ) )。 (B. 3) 相同組換え体の選別
(B. 3. 1) PCR解析
ヒスチジノール耐性株のゲノム DNAを铸型として組換え体を選別するため一次 スクリ一ユングとして切断部位よりテロメァ側に位置する以下のプライマーを用 いて PCRを行い、 部位特異的切断が起こっているかを確認した。 そのプライマー 配列を以下に示す。
AP4M1-1L： cctaacatcgtgtcccagctca (配列番号 47)
AP4M1-1R： tcctttcagaccccttcatcttag (酉己列番号 48)
LRCH4-2L： ttcagccccaaccaaagacacta (酉己列番号 49)
LRCH4-1R： gccccgaacccctacaaatataga (酉己列畨号 50)
STAG3-1L： gggcctccaataagtgtcccata (酉己列番号 51)
STAG3-1R： ttgctgacttagttgcagcagga (配列番号 52)
PILRB-2L： cccattggcaagatacatggaga (酉己列番号 53)
PILRB-2R： agtgtggatgctcctggatgaag (配列番号 54)
PCR ίま、 サーマノレサイクラ一として Perkin-Elmer社製の GeneArap9600を、 Taq ポリメラーゼは EX Taq (宝酒造）を用い、バッファーや dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨条件に従って用いた。 温度、 サイクル条件は、 93°C5 分の熱 変性後、 93°C1分、 56°C1分、 72°C1分を 1サイクルとして 35サイクルで行った。 次に上言己プライマーで検出されなかった 433クローンのうちの 11クローンについ て以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを PCRにて 確認した。 そのプライマーの位置を図 5に示す。 配列は以下のとおりである。 hisD2： GTAAACGCCCTCAAGGAGCAAGCATGA (配列番号 55)
hisD3： TGTGACCAAAGATTTAGCGCAGTGCGT (配列番号 56)
上記プライマー及ぴ上記 B. 1 のプライマーの組み合わせ （PT2R- hisD2、
PT2R- hisD3)により PCRは LATaq (宝酒造）を用い、バッファーや dNTPs (dATP, dCTP, dGTP , dTTP) は添付のものを推奨される条件に従って用いた。 温度、 サイクル条 件は 94°C 1分の熱変性後、 98°C20秒、 68°C8分を 35サイクル行った。 11クロー ンのうち部位特異的に組換えが起こった 9クローンでのみ約 8kbのバンドが検出 された。 ネガティブコントロールの DT40、 DT40 (CYP3A-HAC) ではバンドは検出 されなかった。
(B. 3. 2) 蛍光 in situハイブリダイゼーション （FISH) 解析
FISH解析は松原ら （FISH実験プロトコール、 秀潤社、 1994) に従い行った。 上 記 B. 3. 1で組換えを確認したクローンのうち 7クローンをヒ ト cot- 1 DNAおよぴ ヒスチジノールをプローブにして FISH解析を行ったところ、 CYP3A - HAC Δは全て のクローンで宿主染色体に転座することなく、 CYP3A - HAC Δ末端にヒスチジノール 由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確か められた。
以上の結果から、 クローン DT40 (CYP3A-HAC A ) 214において、 CYP3A遺伝子クラ スター領域周辺 AC004922 -ヒ ト CYP3A 遺伝子クラスタ^ AC073842) 1Mb , SC20-HACベクタ一へ転座クローユングしたヒ ト人工染色体 CYP3A - HAC Δが構築で きたと結論付けた。
CYP3A- HAC Aを保持するニヮトリ DT40 (CYP3A- HAC Δ ) 214は、 独立行政法人産業 技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 )に平成 19年（2007年） 10月 30 日付けで国際寄託され、 受託番号 FERM BP-10928が与えられた。
(Q CYP3A-HAC Δ含有 DT- 40ハイブリッド細胞の CH0細胞への CYP3A- HAC Δの導入
Kuroiwaら （前出） の報告にあるように、 構築された HACをマウス ES細胞へ導 入するために、 まず CH0細胞への導入を試みた。
DT-40ハイプリッドクローン DT40 (CYP3A-HAC Δ ) 214を T225 フラスコ (スミロ ン） 8本で培養し、 コンフルェントになった時点で 20% FBS、 1°/。 ニヮトリ血清、
10一4 M 2-メルカプトエタノール、 0. 05 i g/ml コルセミ ドを添加した RPMI1640培地 に交換し、 さらに 24時間培養してミクロセルを形成させた。 細胞を 24ml の血清
RPMI1640培地に懸濁し、予め ΙΟΟ μ /mlのポリ L-リジンでコートした遠心用 25cm2 フラスコ 12本 （コ一二ング） に 2mlずつ分注し、 37°Cで 1時間培養し、 細胞をフ ラスコの底に付着させた。 培養液を除去し、 予め 37°Cで保温したサイ トカラシン
B (lO ^ g/ml,シグマ） 溶液を遠心用フラスコに満たし、 34° ( 、 8000rpm, 1時間の 遠心を行った。 ミクロセルを無血清 DMEM培地に懸濁し、 δ ^ πι, 5 μ ηι, 3 /i m フィ ルターにて精製した。 精製後、 1700rpra, 10分間遠心し、 無血清 DMEM培地 5mlに 懸濁した。一方、約 107個の CH0細胞をトリプシン処理によりはがし、無血清 DMEM 培地で 2回洗浄し、無血清 DMEM培地 5mlに懸濁した。再度、ミクロセルを 1700rpm、 10分間遠心し、 上清を除かずに先の CH0懸濁液 5ml を静かに重層した。 遠心後、 培養液を除去し、 PEG1500溶液 （ベーリンガー） 0. 5mlを加え、 約 2分間ピぺット で激しく攪拌した。 その後、 無血清 DMEM培地 10mlを約 3分間かけてゆっくり加 え、 37°Cで 10分間静置した。 遠心後、 10°/。FBS添加 F12培地 （ギブコ） に細胞を 懸濁し、 24穴培養プレート 5〜6枚に分注し、 37°Cで 24時間培養した。 その後、 G418 800 /1 g/ml含有 F12培地に交換し、 3〜4週間選択培養した。
G418耐性クローンからゲノム DNAを抽出して CYP3A遺伝子クラスター検出用プ ライマーおよびヒ ト 14番染色体検出用プライマーおよび PGK- 2、 GFP-2プライマ 一を用いて、前述と同様の条件で PCRを行い、 CYP3A- HAC Aを保持する CH0クロー ンを同定した （例えば、 CH0/CYP3A-HAC Δ 4, 6)。 さらに、 上記 PCRで陽性だった クローンに対して、 ヒ ト C0T1DNAをプローブに用いて FISH解析を行った結果、視 覚的に CYP3A - HAC Aの存在を確認した。 これらの結果から、 CYP3A- HAC Δを保持す る CH0細胞クローンが得られたと結論できた。
(D) CHO細胞からの CYP3A- HAC Aのマウス ES細胞への移入
CYP3A-HAC Δを保持するキメラマウスを作製するために、 上記（C)で得られた
CYP3A-HAC Δを保持する CH0細胞からマウス ES細胞 （野性型 TT2F) へミクロセル 法により導入した。 Tomizukaら （Nature Genet. 16： 133， 1997) の方法に従い、 約
108個の CYP3A-HAC Δを保持する CH0細胞 (CH0/CYP3A - HAC Δ 4, 6， 7， 10など） から ミクロセルを精製し、 DMEM 5mlに懸濁した。 約 107個のマウス ES細胞 TT2Fをト リプシン処理により剥がし、 DMEMで 3回洗浄後 DMEM 5mlに懸濁し、 遠心したミ クロセルに加え、 1250rpmで 10分間遠心し、 上清を完全に取り除いた。 沈殿をタ ッビングにより十分ほぐし、 l : 1. 4 PEG溶液[5g PEG1000 (和光純薬）、 lral DMS0 (シ ダマ） を DMEM 6mlに溶解] 0. 5mlを加え、約 1分 30秒間、十分攪拌した。その後、
DMEM 10 mlをゆつく り加え、 1250rpmで 10分間遠心し、 30ml 'の ES培地に懸濁し、 予めフィーダ一細胞をまいた直径 100mmシャーレ （コ一二ング） 3枚に分注し、 培養した。 24時間後、 300 /_^ 1の G418を含む培地に交換し、約 1週間選択培養 した。 その結果、 CH0/CYP3A-HAC Δ 4からは 4クローン、 CH0/CYP3A-HAC Δ 6力 らは 4クローン、 CH0/CYP3A - HAC Δ 7からは 3 クローン、 CH0/CYP3A— HAC Δ 10からは 4 クローンが CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒ ト 14番染色体検出 用プライマーを用いた PCRで陽性であった。 さらに、 ヒ ト C0T1 DNAプローブを用 いて FISH 解析 （Tomizuka ら， Nature Genet. 16： 133, 1997) を行った結果、 C0T1 プローブにより特異的に検出される CYP3A- HAC Aの存在が 15クローン中、 15ク口 ーンで確認された。 このうちマウスの核型が正常なクローンは 3クローンであつ た。 以上のことから、 CYP3A - HAC A保持 TT2F細胞が 3クローン得られたと結論付 けた。
(E)ヒ ト人工染色体 CYP3A - HAC Aを保持するキメラマウスの作製
上記（D)で得られた ES 細胞クローンを用いて Tomizuka らの方法 （Nature Genet. , 16： 133, 1997) でキメラマウスを作製した。 宿主としては MCH (ICR) (白 色、 日本クレア社より購入） の雌雄交配により得られる 8細胞期胚を用いた。 注 入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうか を判定できる。 野性型 TT2F/CYP3A-HAC Δクローン （例えば F8/CYP3A- HAC Δ -7お よび 11、 上記（D)で取得） を注入した 800個の胚を仮親に移植した結果、 92匹の キメラマウス （毛色に濃茶色の部分の認められる） が誕生した。 うち 10匹は白色 の部分がほとんど観察できないキメラ率約 100% の個体であった。 すなわち、 ヒ ト人工染色体 CYP3A- HAC Aを保持する ES細胞株 （TT2F) はキメラ形成能を保持し ている、 すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが示 された。
(F) ヒ ト人工染色体 CYP3A - HAC Aを保持する ES細胞より作製されたキメラマウス 体細胞における人工染色体の保持
(F. 1) ゲノム PCR解析
上記（E)で TT2F/CYP3A-HAC Δクローン （F8/CYP3A- HAC Δ - 7および 11) より作製 されたキメラマウス （キメラ率約 80%) の尻尾から Tomizuka らの報告 （Nature
Genet.， 16 : 133， 1997) に記された方法でゲノム DNAを調製し、 CYP3A遺伝子クラ スター検出用プライマーおよびヒ ト 14 番染色体検出用プライマーを用いた PCR を前記と同様に行い、 CYP3A - HAC Aの保持を検討した。 その結果、 2種のプライマ 一共に陽性であり、 キメラマウス体細胞における CYP3A - ΗΑ〇Δの保持が確認され た。
(F. 2) 蛍光 in situハイブリダイゼーシヨン (FISH) 解析
また、 キメラ率約 80%のキメラマウス 2匹の肝臓組織を用いて Shinohara らの 報告（Human Molecular Genetics, 10： 1163— 1175, 2001 ) に記された方法でヒ ト C0T1DNAをプローブに用いて FISH解析を行った結果、 視覚的に CYP3A- HAC Aの存 在を確認し、 その CYP3A - HAC Aの保持率は両個体とも 70%であり、 キメラ率とほ ぼ一致した。 キメラ率は ES細胞の組織 （体毛） への寄与率を示し、 保持率は導入 染色体の組織への寄与率を示す。 キメラ率が高く、 保持率も高いのキメラマウス の使用はより高い効率の導入染色体保持 ES 細胞の生殖細胞への分化と該導入染 色体の子孫伝達をもたらすと考えられる。 すなわち CYP3A- ΗΑ〇Δの使用により、 CYP3A 遺伝子を含むヒ ト染色体断片のマウスにおける子孫伝達効率が高まること が期待される。
(G)ヒ ト人工染色体 CYP3A - HAC Aを保持するキメラマウスからの人工染色体子孫 伝達
上記（Ε)で作製された雌キメラマウス （キメラ率約 100%) 4匹を MCH (ICR) (白 色、 日本クレア社より購入） 雄マウスと交配した。 キメラマウスより誕生した 80匹の仔マウスのうち、 75匹が ES細胞由来の優性遺伝形質を保持することを示 す濃茶色であった。すなわち CYP3A- HAC Aを保持する ES細胞株は雌キメラマウス において機能的な卵細胞に分化したことが示された。濃茶色仔マウス 75匹中の尻 尾を一部切り取り、 その試料よりゲノム DNAを調製した。 得られた DNAについて CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒ ト 14番染色体検出用プライマ 一を用いた PCRを前記と同様に行い、 CYP3A- HAC Aの保持を検討した結果、 24匹 において 2 種のプライマーで共に陽性であり、 キメラマウス子孫における CYP3A - HAC Aの保持が確認された。 CYP3A-HAC Δが子孫伝達されたマウス系統を TC (CYP3A- HAC A )と呼ぶ。
実施例 3
TC (CYP3A-HAC Δ )マウス系統の体細胞における CYP3A- HAC Δの保持
(3. 1) ゲノム PCR解析
上記で得られた TC (CYP3A- HAC A )マウスのうち雄（165)および雌（155) 1 匹ずつ について脳、 胸腺、 心臓、 肺、 肝臓、 腎臓、 脾臓、 小腸、 筋肉、 精巣 （または子 宫） からのゲノムを鐯型として、 CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよ びヒ ト 14番染色体検出用プライマーを用いて、 前述と同様の条件で PCRを行い、 全ての臓器で CYP3A- HAC Aを検出した。その雌（155)の代表的な結果を図 6に示す。
(3. 2) 蛍光 in situハイブリダイゼーショ ン (FISH) 解析
また上記と同様の個体や組織において、 Shinohara らの報告（Human Molecular Genetics, 10： 1163-1175, 2001) に記された方法でヒ ト cot- 1 DNAをプローブにし て FISH解析を行ったところ、 55〜95%で CYP3A - HAC Aを保持することが確かめら れた（図 7)。特に CYP3Aが主に発現する肝臓および小腸では 85%以上の高い染色 体保持率であることが確かめられた。 TC (CYP3A-HAC Δ )から調製した尻尾繊維芽細 胞を用いて同様に FI SH解析を行った結果、視覚的に CYP3A- HAC Δの存在を確認し、 マウス染色体とは独立に CYP3A- HAC Aが存在していることが確かめられた（図 7)。 実施例 4
TC (CYP3A_HAC A )マウス系統における組織特異的 CYP3A遺伝子クラスターの遺伝 子発現
上記で TC (CYP3A-HAC A )マウスのうち雄（165)および雌（155) 1匹ずつについて、 脳、 胸腺、 心臓、 肺、 肝臓、 腎臓、 脾臓、 小腸、 筋肉、 精巣 （または子宮） にお いて、 トータル R N Aを市販のプロトコール (QIAGEN) に従い抽出後、 市販のプ 口トコール（invitrogen)に従い、 cDNA合成を行い、それを铸型として PCRを行い、 ヒト CYP3A遺伝子クラスターおよびマウス Cyp3a遺伝子クラスターの発現を検出 した。 そのプライマー配列を以下に示す。
ヒト CYP3A遺伝子クラスター発現検出用プライマー：
3A4- -1L gtatggaaaagtgtggggct (配列番号 57)
3A4- -1R atacttcaagaattgggatg (配列番号 58)
3A4- -2L ccaagctatgctcttcaccg (配列番号 59)
3A4- -2R tgaagaagtcctcctaagct (配列番号 60)
3A5- -1L ctctgtttccaaaagatacc (配列番号 61)
3A5- -1R tcaacatctttcttgcaagt (配列番号 62)
3A7- -1L agcttttaagatttaatcca (配列番号 63) 3A7-1R： gagctttgtgggtctcagag (配列番号 64)
3A7-2L： ctctcagaattcaaaagact (配列番号 65)
3A7-2R： agaagaagtcctccaaagcg (配列番号 66)
3A43-2L： tatgacacaactagcaccac (酉己列番号 67)
3A43-2R： agtgtctagtgttctgggat (配列番号 68)
マウス Cyp3a遺伝子クラスター発現検出用プライマー：
3all- - 1L ： tcaaacgcctctccttgctg (配列番号 69)
3all- -1R ： gcttgcctttctttgccttc (配列番号 70)
3all- -2L ： ggtaaagtacttgaggcaga (配列番号 71)
3all- -2R ： agaaagggctttatgagaga (配列番号 72)
3al3- -1L ： agaaacatgaggcagggatt (配列番号 73)
3&丄 <¾- -1R ： acaaggagacatttagtgca (配列番号 74)
3al3- -2L ： taccccagtatttgatgcac (配列番号 75)
3al3- -2R ： agataactgactgagccaca (配列番号 76)
3a25- - 1L : cttctacatatatgggacct (配列番号 77)
3a25- -1R : accgacggtttgtgaagact (配列番号 78)
3a25- -2L : agaaagaacgccttgcttca (配列番号 79)
3a25- -2R : ttgggcagagttctgtca (配列番号 80)
3a44- -1L : cactggatacattggtcctg (配列番号 81)
3a44- -1R : cgtgatgacaaggagaggtg (配列番号 82)
3a44- -2L : agaggatccttttgtggagg (配列番号 83)
3a44- -2R : ctttggaattattatgagaa (配列番号 84)
コント口ール遺伝子発現検出用プライマー：
GAPDH-F : 5， -CCATCTTCCAGGAGCGAGA-3 ' (配列番号 85)
GAPDH-R : 5 ' -TGTCATACCAGGAAATGAGC-3 ' (配列番号 86)
PCRは、 サーマルサイクラ一として Perkin- Elmer社製の GeneAmp9600を、 Taq ポリメラーゼは EX Taq (宝酒造）を用い、バッファーや dNTP (dATP， dCTP, dGTP, dTTP) は添付のものを推奨条件に従って用いた。 温度、 サイクル条件は、 93°C5 分の熱 変性後、 93°C 1分、 56。C 1分、 72°C 1分を 1サイクルとして 35サイクルで行った。 その結果 TC (CYP3A- HAC A )を保持するマウスにおいて、 CYP3A4は肝臓と小腸で のみ、 CYP3A5は肝臓と小腸と肺でのみ、 CYP3A7は肝臓と小腸と腎臓と肺でのみ、 CYP3A43は肝臓と小腸と腎臓でのみ、 Cyp3al lは肝臓と小腸でのみ、 Cyp3al3は肝 臓と小腸でのみ、 Cyp3a25は肝臓と小腸でのみ、 Cyp3a44は肝臓と小腸でのみ発現 を検出できた。 また、 コントロールの GAPDHは全ての組織で検出された。 その雌 (155)の代表的な結果を図 8に示す。このようにヒ トでみられるよう組織特異的発 現が認められ、 ヒト型化になったことが示された。
実施例 5
TC (CYP3A- HAC A )マウス系統における時期特異的 CYP3A遺伝子クラスターの遺伝 子発現
(5. 1) ゲノム PCR解析
TC (CYP3A- HAC A )マウスの雄および雌の胎齢 14. 5 日、 胎齢 16. 5 日、 胎齢 18· 5 日、 生後 0日、 2週齢、 4週齢、 6週齢、 8週齢、 24週齢における肝臓からのゲノ ムを錶型として、 CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおよびヒ ト 14番染色 体検出用プライマーを用いて、 前述と同様の条件で PCRを行い、 全ての胎齢、 週 齢で CYP3A-HAC Δを検出した。
(5. 2) RT-PCR解析
また上記と同じ個体の肝臓のトータル RNAを市販のプロトコール （QIAGEN) に 従い抽出後、 市販のプロトコール（invitrogen)に従い、 cDNA合成を行い、 それを 鎵型として PCR を行い、 上述のヒ ト CYP3A遺伝子クラスター発現およびマウス Cyp3a遺伝子クラスター発現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。 その結果、 成体型発現のヒ ト CYP3A4、 ヒ ト CYP3A5、 マウス cyp3all、 マウス Cyp3al3は成体期において、胎児型の CYP3A7は胎児において強く発現しているこ とが確かめられた。 また、 コントロールの GAPDHは全ての胎齢、 週齢で同程度の 発現量が検出された。 その代表的な結果を図 9に示す。 このようにヒ トでみられ るような時期特異的発現が認められ、 ヒ ト型化になったことが示された。
実施例 6
TC (CYP3A-HAC Δ )マウス系統における CYP3A遺伝子クラスターの遺伝子発現誘導 ヒ ト CYP3A4 の発現を誘導する物質として知られる Rifampicin (シグマ）が TC (CYP3A-HAC Δ )マウスにおける CYP3A4遺伝子の発現に及ぼす影響について検討 するため、 一回の投与量は 100mg/kgとし、 4日間腹腔内投与した。 なお、 投与液 は R ampicin (「R 」） をコーンオイル（シグマ）に懸濁して調製した。 5日目に各 マウス肝臓を摘出し、 トータル RNAを市販のプロトコール （QIAGEN) に従い抽出 後、 市販のプロトコール（invitrogen)に従い、 cDNA合成を行い、 それを鍚型とし て PCRを行い、 上述のヒ ト CYP3A遺伝子の発現を検出するプライマーを用いて発 現を検出した。 その結果、 1^ ( ¥?3 - じ ）にぉぃて溶媒（00^ 0；11)投与群に比ぺ て Rifampicin投与群においてヒ ト CYP3A4遺伝子の発現が強く発現していること が確かめられた。 また、 コントロールの GAPDHは両群ともに同程度の発現量が検 出された。 その雄 3匹ずつ （Rif投与および oil投与） の代表的な結果を図 10に 示す。
以上のことから TC (CYP3A- HAC A )におけるヒ ト CYP3A遺伝子の発現誘導がヒ ト 型化されていることが確かめられた。
実施例 7
内因性 Cyp3al3遺伝子の両ァレルが共に破壊されたマウス系統の構築
(7. 1) Cyp3al3遺伝子ェクソン 1領域を含む DNA断片のクローニング
pBluescript II SK (-) (日本国東洋紡） に新たな制限酵素サイ トを付加するた め以下の DNAを合成した。
LinkAl： 5 ' - TCGAGTCGCGACACCGGCGGGCGCGCCC- 3 ' (配列番号 87)
LinkA2： 5 ' - TCGAGGGCGCGCCCGCCGGTGTCGCGAC - 3， （配列番号 88)
LinkBl： 5 ' - GGCCGCTTAATTAAGGCCGGCCGTCGACG- 3 ' (配列番号 89)
LinkB2 : 5 ' -AATTCGTCGACGGCCGGCCTTAATTAAGC-3 ' (配列番号 90)
pBluescript II SK (-)を制限酵素 Sailおよび Xholで処理した反応液を 0. 8%ゲ ルで分離し、 ベクター DNA 断片を含むゲルを回収した。 回収されたゲルから
QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがってべ クタ一 DNA断片を精製した。一方プラスミ ドに新たな制限酵素サイ ト Nrul、 SgrAI および Asclを付加するため、 20 μ 1反応液中に 2種のオリゴ DNA (LinkAlおよ び LinkA2) 各 lOO i raolを添加し、 70°C15分→37°C15分→室温 15分の順序で計
45 分インキュベーショ ンして得られた DNA 断片を、 前記制限酵素処理した pBluescript II SK (-)プラスミ ドに挿入し、 大腸菌 DH5 o;に導入した。 得られた 形質転換体より DNAを調製し、 プラスミ ド pBlueLAを取得した。
続いて、 pBlueLAを制限酵素 Notlおよび EcoRIで処理した反応液を 0. 8%ゲルで 分離し、 ベクター DNA断片を含むゲルを回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがってベクター DNA 断片を精製した。 プラスミ ドに新たな制限酵素サイ ト Pacl、 Fselおよび Sai lを 付加するため、 20 1反応液中に 2種のオリゴ DNA (LinkBlおよび LinkB2)各 100 μ ηιοΐを添加し、 70°C 15分→37°C15分→室温 15分の順序で計 45分インキュベー シヨンして得られた DNA断片を、 前記制限酵素処理した pBlueLAプラスミ ドに揷 入し、 大腸菌 DH5 aに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 プラス ミ ド pBlueLAB (図 11) を取得した。
BACクローン、 RP23- 425N17 (ジエノテックス社より購入） を Hindlllで処理し た反応液を 0. 8%ゲルで分離し、 マウス CyP3al3遺伝子周辺領域を含む DNA断片 (10319bp)を含むゲルを回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって同 DNA断片を精製した。 この 断片を pBlueLABの Hindlll部位に揷入し PBACcyp3al3 (#39) (図 12)を取得した。 (7. 2) pBlueLAB (SAAX) の構築
上記 7. 1で作製された pBlueLABの制限酵素サイ トを改変するために以下のオリ ゴ DNAを合成した。
3' Sacl-Xhol linker S： 5， - CGGCGCGCCGTATACC- 3 ' (配列番号 91)
3' Sacl-Xhol linker A： 5， - TCGAGGTATACGGCGCGCCGAGCT- 3， （配列番号 92) pBlueLABを制限酵素 Saclおよび Xholで処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、 ベクター DNA 断片を含むゲルを回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがってベクター DNA断片 を精製した。 一方 20 l反応液中に上記 2種のオリゴ DNA各 ΙΟΟ μ ηιοΙを添加し、 70°C15分→37°C 15分→室温 15分の順序で計 45分ィンキュベーションして得られ た DNA断片を、 上記 Sacl/Xhol処理したベクターに挿入し、 大腸菌 DH5ひに導入 した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 プラスミ ド pBlueLAB (SAAX) (図 13) を取得した。 (7. 3) pBlueLAB (NAPF) の構築
上記 7. 1で作製された pBlueLABの制限酵素サイ トを改変するために以下のォリ ゴ DNAを合成した。
5' NotIAscI l inker36 S (5， リン酸付加） ：
5' -GCGGCCGCGACGTCCAGCTGGGCCGGCCGGCGCGCC-3 ' (配列番号 93)
5' NotlAscI l inker36 A (5， リン酸付加） ：
5' -GGCGCGCCGGCCGGCCCAGCTGGACGTCGCGGCCGC-3 ' (配列番号 94)
pBlueLABを制限酵素 PvuIIで処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、ベクタ一 DNA 断片を含むゲルを回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extract ion Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがってベクター DNA断片を精製した。 精 製されたベクター DNAをァリカリフォスファタ一ゼ (Calf intestine由来、 タカ ラ） 処理後、 フエノール/クロ口ホルム抽出、 エタノール沈殿した。 一方 20 反応液中に上記 2種のオリゴ DNA各 ΙΟΟ μ ηιοΙを添加し、 70°C 15分→37。C 15分→ 室温 15分の順序で計 45分ィンキュベーションして得られた DNA断片を、 上記 PvuII制限酵素処理したプラスミ ドに揷入し、大腸菌 DH5 aに導入した。得られた 形質転換体より DNAを調製し、プラスミド pBlueLAB (NAPF) (図 14) を取得した。
(7. 4) Cyp3al3 (ェクソン 1〜ィントロン 1) 領域 DNA断片の調製及び pBlueLAB (SAAX) への揷入
Cyp3al3 (ェクソン 1〜イントロン 1)領域の一部を含む DNA調製するために以 下のオリゴ DNAを合成した。
3al3 3' (AscI) Fwl.： 5， - GGCGCGCCCTCCTGGCTACCAGCCTGGTCCTTCTC- 3， （配列番号 95) 3al3 3' (AccI) Rwl ： 5， - GTATACTTACTTACCCCATAGGAGGGATTTGCATAGGACC-3 ' (配列番 号 96)
KOD-plus- (日本国東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 μ ΐ 反応液中に上記 2種のプライマー （lO i mol) を各 1. 5 ;z l、 铸型として上記 7. 1 で作製された pBACcyp3al 3 (#39)を添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C 15秒→60°C
1分→68°C 1分を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、 得られた 209bpの増幅断 片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit
(ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片を回収した。 回収された PCR増幅断片を Asclおよび Acclで酵素消化し、 0. 8%ァガロースゲルで分離回収 した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Extraction Kit (ドイツQIAGEN) を用い添付文書にしたがって DNA断片を回収した。
pBlueLAB (SAAX) を制限酵素 Asclおよび Acclで処理した反応液を 0. 8%ゲルで 分離し、 ベクター DNA断片を含むゲルを回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがってベクター DNA 断片を精製した。 精製されたベクターに上記で調製した DNA断片 （Cyp3al3ェク ソン 1〜ィントロン 1領域の一部を含む） を挿入し、 大腸菌 DH5 aに導入した。 得 られた形質転換体より DNAを調製し、プラスミ ド pBlueLAB (SAAX) cyp3al3 (209bp) を取得した。
(7. 5) Cyp3al3- 5'ゲノム領域を含む DNA断片 （llObp) <D pBlueLAB (NAPF) への 挿入
Cyp3al3-5' ゲノム領域 を含む DNA 断片 （llObp) を得るために下記のオリゴ DNAを作製した。
3al3 PvuII-exl S：
TGGAGAGAGACTTGTTTAAAGAAAACAGCAGGCCGG-3 ' (配列番号 97)
3al3 PvuII-exl A：
GCTGAGCCTGCTGAGCTCCCTTCCCTGCCCAG-3 ' (配列番号 98)
pBlueLAB (NAPF) を制限酵素 PvuIIおよび Fselで処理した反応液を 0. 8%ゲル で分離し、ベクタ一 DNA断片を含むゲルを回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがってベクター DNA 断片を精製した。一方 20 反応液中に上記 2種のオリゴ DNA各 ΙΟΟ μ ηιοΙを添加 し、 70°C15分→37°C 15分→室温 15分の順序で計 45分ィンキュベーションして得 られた l lObpDNA断片を、上記 Pvull/Fsel処理したプラスミ ドに揷入し、大腸菌 DH5 aに導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 プラスミ ド pBlueLAB (NAPF) cyp3al3 (llObp) を取得した。
(7. 6) pBACcyp3a!3 (#39) 由来 3 ' ゲノム断片 （約 2. 8kb) の pBlueLAB (SAAX) Cyp3al3 (209bp) への挿入
上記 7. 4にて作製した pBlueLAB (SAAX) cyp3al3 (209bp) を制限酵素 Acclで 処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、 ベクター DNA断片を含むゲルを回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Ki t (ドイツ QIAGEN) を用い添付 文書にしたがってベクター DNA断片を精製した。精製されたべクタ一 DNAをアリカ リフォスファターゼ （Calf intestine由来、 タカラ） 処理後、 フエノール/クロ 口ホルム抽出、 エタノール沈殿した。 一方 pBACcyp3al3 (#39) を制限酵素 Accl で処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、 Cyp3al3遺伝子エタソン 1の一部及び、 ェクソン 2を含む約 2. 8kbの DNA断片を含むゲルを回収した。 回収されたゲルか ら QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって DNA断片 （2. 8kb) を精製した。 得られた DNA断片 （2. 8kb) を、 上記 Accl処理し たプラスミ ドに挿入し、 大腸菌 DH5ひに導入した。 得られた形質転換体より DNA を調製し、 プラスミ ド pBlueLAB (SAAX) cyp3al3 (2. 8kb) を取得した。
(7. 7) pBACcyp3a!3 (#39) 由来 5 ' ゲノム断片 （約 5. lkb) の pBlueLAB (NAPF) cyp3a!3 (l lObp) への挿入
上記 7. 5にて作製した pBlueLAB (NAPF) cyp3al3 (l lObp) を制限酵素 Aatll及 び PvuIIで処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、 ベクター DNA断片を含むゲルを 回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extract ion Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがってベクター DNA 断片を精製した。 一方 pBACcyp3al3
(#39) を制限酵素 Aatll 及ぴ PvuII で処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、 Cyp3al3遺伝子 5，領域及びェクソン 1の一部を含む約 5. lkbの DNA断片を含むゲ ノレを回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって DNA断片 （約 5. lkb) を精製した。 得られた DNA断 片 (約 5· lkb) を、 上記 Aatll/PvuII処理したプラスミ ドに揷入し、 大腸菌 DH5 ひに導入した。得られた形質転換体より DNAを調製し、プラスミ ド pBlueLAB (NAPF) Cyp3al3 (5. lkb) を取得した。
(7. 8) K0基本ベクターの構築
W0 00/10383号パンフレツトに記載された pLoxP- STneoプラスミ ドを Xhol消化 し、 両端に LoxP配列を持つ Neo耐性遺伝子 （LoxP- Neo) を取得した。 LoxP-Neo の両末端を T4 DNAポリメラーゼを用いて平滑化し、 LoxP - Neo-B断片を取得した。 pBlueLABを EcoRV消化後、 反応液をフヱノール/クロ口ホルム抽出、 エタノー ル沈殿し、 LoxP - Neo-B断片を挿入した後、 大腸菌 DH5 に導入した。 得られた形 質転換体のうち、ベクター上 Clal部位側に Neo耐性遺伝子をドライブするプロモ 一ターが配置されているようクローンについて DNA を調製し、 プラスミ ド pBlueLAB-LoxP-Neo (R) を取得した。
pMClDT-A (ライフテックオリエンタル株式会社) を Xholおよび Sail消化後、 0. 8%ァガロースゲルにアプライし、 約 lkbのバンドを分離回収し、 QIAquick Gel Extraction Kit (ドィッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって DT- Aフラグメン トを回収した。 pBlueLAB- LoxP-Neo (R) を Xhol消化後、 反応液をフエノール/ク ロロホルム抽出、エタノール沈殿し、 DT- Aフラグメントを揷入した後、大腸菌 DH5 αに導入した。 得られた形質転換体よ り DNA を調製し、 Κ0 基本ベクター pBlueLAB- LoxP- Neo- DT- A (R) (図 15) を取得した。
(7. 9) pBlueLAB - LoxP- Neo - DT - A (R) への Cyp3al3- 3， ゲノム断片 （約 3. Okb： Ascl-Xhol) 及び Cyp3al3_3， ゲノム断片 （約 5. 2kb： Notl- Fsel) の挿入
pBlueLAB (SAAX) cyp3al3 (2. 8kb) を制限酵素 Ascl、 Xholで処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、 Cyp3al3遺伝子ェクソン 1の一部及び 「ェクソン 2を含む約 3. Okb の DNA 断片を含むゲノレを回収した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドィッ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって Ascl - Xhol DNA断 片 （3. Okb) を精製した。 さらに pBlueLAB (NAPF) cyp3al3 (5. lkb) を制限酵素 NotI、 Fselで処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、 Cyp3al3遺伝子 5'領域及ぴェ クソン 1の一部を含む約 5. 2kbの DNA断片を含むゲルを回収した。 回収されたゲ ルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたが つて Notl- Fsel DNA断片 (5. 2kb) を精製した。
K0基本ベクター pBlueLAB - LoxP- Neo-DT- A (R) プラスミ ドを制限酵素 Ascl及ぴ
Xholで処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、ベクター DNA断片を含むゲルを回収 した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用 い添付文書にしたがってベクタ一 DNA断片を精製した。上記で得られた Ascl-Xhol
DNA断片 （3. Okb) を、 上記 AsclZXhoI処理したプラスミ ドに揷入し、 大腸菌 DH5 αに導入した。 得られた形質転換体よ り DNA を調製し、 プラス ミ ド pBlueLAB- LoxP - Neo- DT - A (R) +3， genomeを取得した。
上記 pBlueLAB- LoxP- Neo- DT- A (R) +3' genomeプラスミ ドを制限酵素 Notl及び Fselで処理した反応液を 0. 8%ゲルで分離し、ベクター DNA断片を含むゲルを回収 した。 回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用 Vヽ添付文書にしたがってベクタ一 DNA断片を精製した。上記で得られた Not I - Fs el DNA断片 （5. 2kb) を、 上記 NotlZFsel処理したプラスミ ドに揷入し、 大腸菌 DH5 に導入した。 得られた形質転換体より DNAを調製し、 プラスミ ド pcyp3al3 - K0
(図 16) を取得した。
(7. 10) ゲノムサザン解析用プローブの調製
BACクローン、 RP23 - 425N17 (Genbankァクセッション番号： AC125063) の塩基 配列情報を基に、 Cyp3al3-5' ゲノム領域を含む DNA断片 （約 1. 2kb) を取得する ため以下の DNAを合成した。
3al3 5' probe6 Fw： 5' - CCCTCCTTGTCACTGATGCT- 3 ' (配列番号 99)
3al3 5' probe6 Rv： 5' - TCTGGGAGGACAGAATGCTT- 3， （配列番号 100)
K0D - plus- (東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 / 1反応液 中に上記 2種のプライマー （lO ^a mol) を各 1 · 5 ;ζ 1、 鐯型として上記 7. 1で作製 された pBACcyp3al3 (#39) を添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C15 秒→60°C30 秒→68°C2分を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた約 1. 2kbの増幅断 片を 0. 8%ゲノレで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit (ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片 （5 ' 側ゲノムサザン用 プローブ、 5 ' K0-probs 図 17) を回収した。
BACクローン、 RP23 - 425N17 (Genbankァクセッション番号： AC125063) の塩基 配列情報を基に、 Cyp3al3 - 3， ゲノム領域を含む DNA断片 （約 1. 2kb) を取得する ため以下の DNAを合成した。
3al3 3' probe3 Fw： 5 ' - TCACACATCTCTAGATGACTACGG-3， （配列番号 101)
3al3 3' probe3 Rv2： 5 ' -ATAGACTGCCATGGAGGAAC- 3， （配列番号 102)
K0D - plus -（東洋紡）を用い添付文書にしたがって反応液を調製し、 50 ^ 1反応液 中に上記 2種のプライマー （ΙΟ μ ηιοΙ) を各 1. 5 1、 铸型として上記 7. 1で作製 された pBACcyp3al3 (#39) を添加し、 94°C 2分保温した後、 94°C15 秒→60°C30 秒→68°C2分を 1サイクルとして 30サイクル増幅し、得られた約 1. 2kbの増幅断 片を 0. 8%ゲルで分離回収した。回収されたゲルから QIAquick Gel Extraction Kit
(ドイツ QIAGEN) を用い添付文書にしたがって増幅断片 （3 ' 側ゲノムサザン用 プローブ、 3 ' K0 - prob、 図 17) を回収した。
(7. 11) Cyp3al3-K0ベクターを用いたジーンターゲティング
マウス ES細胞は通常以下に記すような方法で樹立することができる。雌雄マウ スを交配することにより得られる受精後 2. 5 日の S丕を採取し、 ES細胞用培地中で インビト口培養し、 該培養胚のうち胚盤胞まで発生が進んだ胚を分離し、 そして 該胚を、 フィーダ一細胞培地中に播種して培養し、該培養胚から ES様形態で生育 しているものの細胞塊をトリプシンを含有する ES細胞用培地を用いて分散処理、 及び、 フィーダ一細胞培地を用いて培養し、更には ES細胞用培地を用いて継代培 養し増殖する細胞を単離する。
相同組換えによる pcyP3al3遺伝子ノックアウト 'マウス ES細胞の取得のため、
Pcyp3al3 - K0を制限酵素 Notl (宝酒造） で線状化し、 確立されている方法 （相沢 慎一、 バイオマニュアルシリ一ズ 8、 ジーンターゲティング、 羊土社、 1995) に 従ってマウス ES細胞 TT2 (Yagi ら、 Analytical Biochem. , 214 : 70， 1993) へ導 入した。 ΤΤ2 細胞の培養法は、 記載の方法 （相沢慎一、 前記） に従い、 栄養細胞 はマイ トマイシン C (米国シグマ） 処理した G418耐性初代培養細胞 （ィンビトロ ジェン社より購入） を用いた。 まず、 増殖させた ΤΤ2細胞をトリプシン処理し、 3 x lO7個 Zml となるように HBSに懸濁した。 その後、 0. 5mlの細胞懸濁液を 10 ^ g のベクター DNAと混和し、 ジーンパルサーキュべット （電極距離： 0. 4cm、 米国バ ィォラッド） にてエレク ト口ポレーションを行った （容量： 960 F、 電圧： 240V、 室温）。 エレク ト口ポレーシヨンした細胞を 10mlの E S培地に懸濁し、 あらかじ めフィーダー細胞を播種した 100mm組織培養用プラスチックシャーレ （フアルコ ン、 米国べタ トン. ディッキンソン） 1枚に播種した。 24時間後に 200 g/mlの ネオマイシン （米国シグマ） を含む E S培地と置き換えた。 7日後に生じたコロ ニーをピックアップし、それぞれを 24穴プレートでコンフルーェントになるまで 増殖させ、 その 2/3を 0. 2mlの保存用培地 （FBS + 10%DMS0、 米国シグマ) に懸濁 し、 - 80°Cにて保存した。 残りの 1/3は 12穴ゼラチンコートプレートに播種し、 2日間培養して 106〜107個の細胞からゲノム DNAを Puregene DNA Isolation Kits (米国 Gentra System社） により調製した。
得られたネオマイシン耐性 TT2細胞ゲノム DNAを制限酵素 Sacl (宝酒造） で消 化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続いてサザンプロットを行い、 ターゲティングベクター 3 ' 相同領域の下流に位置する DNA断片 （3 ' KO-prob 図 17) をプローブとして相同組換え体を検出した。 野生型 TT2F細胞では Sacl消化 により、 1 本のバンド （約 8. 3 kb) が検出された。 相同組換え体においては、 2 本のバンド (約 8. 3kb と約 11. 9kb) が検出されることが予想されたが、 ネオマイ シン耐性株において約 11. 9kbの新たなバンドが確認された （図 17)。 更に、 5 ' KO-probによるサザン解析で相同組換えが確認されたクローンのゲノム DNAを制 限酵素 Sphl (宝酒造） で消化し、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動で分離した。 続 いてサザンブロットを行い、 ターゲティングベクター 5'相同領域の上流に位置す る DNA断片 （5 ' KO-prob) をプローブとして相同組換え体を検出した。 野生型 TT2 細胞では Sphl消化により、 1本のバンド （約 11. 6kb) が検出された。 相同組換え 体においては、 2本のバンド （約 11. 6kbと約 13. 3kb) が検出されることが予想さ れたが、ネオマイシン耐性株において約 13. 3kbの新たなバンドが確認された （図 17)。すなわち、 これらのクローンはマウス Cyp3al3遺伝子エタソン 1の開始コド ン周辺領域を領域を欠失し、 代わりにネオマイシン耐性遺伝子 （両端にはターゲ ティングベクター由来の制限酵素サィ ト部位を含む）が挿入されたものである。 3 ' および 5， KO-probによるサザン解析の結果、 pcyp3al3- K0を制限酵素 Notlで線 状化したベクターを用いた場合には 60株中 5株が相同組換え体であるという結果 を得た。
(7. 12) pcyp3al3-K0 ES細胞株を用いたキメラマウスの作製
上記 7. 11で得られた G418耐性マウス ES細胞株 （#4、 #16、 #25、 #36、 #42) を 凍結ス トックより立ち上げ、 それらを、 MCH (ICR) マウス （日本クレア社） の雌 雄交配により得られた 8細胞期胚に、 それぞれ胚 1つあたり 8〜10個注入した。
ES培地 （相沢慎一、 バイオマニュアルシリーズ 8、 ジーンターゲティング、 羊土 社、 1995) で一晩培養して胚盤胞まで発生させた後、 偽妊娠処理後 2. 5 日の仮親 MCH (ICR) マウス (日本国日本クレア社) の子宮に、 片側の子宫あたりそれぞれ 約 10個のインジェクション胚を移植した。 キメラ個体は、 毛色において、宿主胚 由来の白色の中に ES細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかによつて判 定される。 移植実験の結果、 5種の ES細胞株から計 37匹のキメラマウスが誕生 した。
(7. 13) cyp3al3-K0 ES細胞株由来キメラマウスからの Pcyp3al3_K0ァレルの子孫 伝達
上記 7. 12で作製された pcyP3al3 - K0 ES細胞株 （#4、 #42) 由来キメラマウスの うち、 100%のキメラ率を示しかつ雄である個体（#4 : 9匹、 #42： 1匹）について、 C57BL/6N 系統雌マウス （日本クレア社） と交配し、 ES 細胞由来の Pcyp3al3- K0 ァレルを有する子孫が誕生するかを検討した。 この交配によつて得られた仔マゥ スの尻尾より調製したゲノム DNAについて、 以下のプライマーを用いて PCR解析 を実施した。
3' genome2 ： 5， - AGTTCCAGAGGGACACCTTC- 3， （配列番号 103)
neo3- 1 ： 5 ' -TTCCACACCTGGTTGCTGAC- 3， （配列番号 104)
5， down : 5 ' - AGATTCAAGTGGGCACACCC - 3， （配列番号 105)
LA - Taq (タカラバイオ）を用い添付文書にしたがって反応液 （30 μ 1) を調製し、 プライマーとして上記 3' genome2と 5' do皿（図 18、（1) X (2) )、あるいは 3， genome2 と neo3- 1 (図 18、 (1) X (3) ) の組み合わせ、 铸型として前記仔マウスゲノム DNA を添加し、 94CC5分保温した後、 94°C30秒→60。C30秒→72°C3分を 1サイクルと して 35サイクル増幅した。 反応液を 0. 8° /。ゲルにて電気泳動し増幅産物の検出を 行った。 野生型 Cyp3al3アレルについては（1) X (2)のプライマーの組み合わせに よって 3. 5kbの特異的産物が、 K0型 Cyp3al 3ァレルについては（1) X (3)のプライ マーの組み合わせによって 3. 2kb の特異的産物が検出される （図 18)。 #4、 #42, それぞれの ES 細胞株に由来するキメラマウスより誕生した仔マウスの尻尾 DNA について解析を行った結果、 （1) X (2)、 および（1) X (3)のプライマーの組み合わ せの両方で陽性となる cyp3al3- K0ヘテロ接合体 （図 18) が存在することが確認 された。
(7. 14) cyp3a!3-K0 マ ウ ス と cyp3a44/ll/25- K0 マ ウ ス の交配に よ る cyp3al3/44/ll/25- K0マウスの作製
マウス Cyp3aファミリ一遺伝子のうち、 Cyp3a44と Cyp3all と Cyp3a25を同時 に欠失する cyp3a44/ll/25- K0マウスの作製法は W001Z011951に開示されている。 Cyp3a4 と Cyp3al lと Cyp3a25遺伝子は他の 2種の Cyp3aファミリ一遺伝子（3al6、 3a4l) と共にマウス 5番染色体上でクラスターを形成しているが、 この Cyp3aフ アミリー遺伝子クラスターと CyP3al3遺伝子の距離は約 10Mbである。
上記 7. 12 にて作製された cyp3al3 - K0 ヘテロ接合体マウス個体と上記 cyp3a44/l l/25-K0 マウスへテロ接合体マウス個体の交配によって得られた仔マ ウスの尻尾より調製したゲノム DNAについて、 まず Cyp3al3遺伝子座の遺伝子型 を決定するため上記 7· 13 (図 18) に記載された PCR解析を実施した。 その結果よ り (1) X (2)、 および（1) X ( 3 )のプライマーの組み合わせの両方で陽性となる cyp3al3 - K0ヘテロ接合体 （図 18) を選抜し、 さらに Cyp3a44/l l/25遺伝子座の遺 伝子型を決定するため以下の PCR解析を実施した。
3a25 Fw： 5 ' - CATTGTTCTGGCTTTAGCGTC- 3， （配列番号 106)
3a25 Rv： 5 ' - CTGCAACCCTGAGGCTTTAG- 3， （配列番号 107)
Ex- Taq (タカラバイオ）を用い添付文書にしたがって反応液 （3(^ 1) を調製し、 プライマーとして上記 3a25 Fwと 3a25 Rv (図 19、 （4) X (5) )、 あるいは前記 PGK2 と GFP2 (図 19、 (6) X (7) ) の組み合わせ、 铸型として前記仔マウスゲノム DNA を添加し、 85°C3分、 94°C1分保温した後、 94°C10秒→59°C30秒→72°C30秒を 1 サイクルとして 35サイクル増幅した。 反応液を 2%ゲルにて電気泳動し増幅産物 の検出を行った。 野生型 Cyp3a44/l l/25アレルについては（4) X (5)のプライマー の組み合わせによって 0. 3kbの特異的産物が、 K0型 Cyp3a44/ll/25ァレルについ ては（6) X (7)のプライマーの組み合わせによって 0. 4kbの特異的産物が検出され る （図 19)。 以上の解析を実施した結果、 Cyp3al3遺伝子ノックァゥトについてへ テロ接合体かつ、 (4) X (5)、 および（6) X (7)のプライマーの組み合わせの両方で 陽性となる cyp3a44/ll/25 - K0ヘテロ接合体 （図 19) を得た。
ここで得られた Cyp3a44/ll/25 - K0、cyp3al3-K0の両者についてヘテロ接合体で あるダブルへテロ個体の体細胞においては、 2種の K0アレルは同一染色体上には 存在しない。 しかし***あるいは卵子を形成する減数***過程においては相同染 色体間の組換えが起こり、 2種の K0ァレルを同一染色体上に有する配偶子がある 確率で生じる。 この現象を利用して、 cyp3a44/ll/25- K0アレルと cyp3al3- K0ァ レルを同一の染色体上に有するマウス個体の取得を試みた。 上記で得られた cyp3al3- K0ん yp3a44/ll/25- K0 ついてヘテロ接合体であるダブルへテロ個体のう ち雄について、 野生型 C57BL/6N系統雌マウス （日本クレア社） と交配を実施し、 得られた仔マウスの尻尾よりゲノム DNAを調製し、 上記 7. 12及び上記に示した cyp3a44/l l/25-K0, cyp3al3- K0遺伝子型解析を実施した。 両 K0 アレルについて へテ口接合体である個体の体細胞においては 2種の遺伝子 K0ァレルが同一染色体 上にあると考えられるが、本解析の結果、両 K0了レルについてヘテロ接合体であ る個体を得た。
さらに上記で取得された両 K0 ァレルについてヘテロ接合体であるダブルへテ 口 （同一染色体） 個体の雌雄交配により、 cyp3a44/ll/25- K0、 cyP3al3- Κ0の両 Κ0 アレルについてホモ接合体であり、 これら 3種の Cyp3aフアミリ一遺伝子を欠損 するダブルホモ個体の取得を試みた。上記で得られたダブルへテロ （同一染色体） 個体のうち雄について、野生型 C57BL/6N系統雌マウス （日本クレア社） と交配を 実施し、得られた仔マウスの尻尾よりゲノム DNAを調製し、上記 7. 12及び上記に 示した cyp3a44/ll/25 - K0、 cyp3al3-K0遺伝子型解析を実施した （図 18、 19)。 そ の結果、 cyp3al3 - K0について（1) X (2)のプライマーセッ トで陰性、 (1) X (3)のプ ライマーセットで陽性、かつ cyp3a44/l l/25-K0について（4) X (5)のプライマーセ ッ トで陰性、（6) X (7)のプライマーセッ トで陽性となる両 K0アレルについてホモ 接合体である個体を得た （図 18、 19) (以下、 A cyp と記す）。 Cyp3aクラスター の遺伝子型は上記プライマーに対応して以下の表 1のようになる。
表 1
Figure imgf000066_0001
表中、 Priraerlは配列番号 103、 Priraer2は配列番号 105、 Primer3は配列番号 104、 3a25Fwは配列番号 106、 3a25Rvは配列番号 107、 PGK2は配列番号 43、 GFP2 は配列番号 44の配列を表す。
得られたダブルホモマウス雌雄個体の生殖機能は正常であり、 以後、 ダブルホ モマウス雌雄個体同士の交配により本系統を維持した。
実施例 8
CYP3A-HAC Δを保持し、かつ内因性 Cyp3a遺伝子群の両アレルが共に破壊されたマ ウス系統の構築
実施例 2で作製された TC (CYP3A-HAC Δ )を、実施例 7で作製された Δ cyp系統に 戻し交配し、 得られたマウス個体について、 PCR 法を用いて遺伝子型の解析を行 つた （実施例 4および 7参照）。交配して得られた仔マウス 109匹中の尻尾を一部 切り取り、 その試料よりゲノム DNAを調製した。 得られた DNAについて CYP3A遺 伝子クラスター検出用プライマーおょぴヒ ト 14 番染色体検出用プライマーおよ び上記表 1記載のプライマーを用いた PCRを前記と同様に行い、 CYP3A-HAC Δの保 持および Cyp3a遺伝子クラスターの K0を検討した結果、 24匹において CYP3A- HAC 厶を保持し、かつ内因性 CyP3a遺伝子群の片方のアレルが破壊された（ヘテロ K0) マウス系統であることが確認された。 さらにこのへテロに Cyp3a遺伝子群が破壌 され、かつ CYP3A - HAC Δを保持するマウスと実施例 7で作製された Δ cyp系統に戻 し交配し、 得られた仔マウス 178匹中の尻尾を一部切り取り、 その試料よりゲノ ム DNAを調製し、 上記と同様の PCR法を用いて遺伝子型の解析を行った。 その結 果 28匹において CYP3A- HAC Aを保持し、かつ内因性 Cyp3a遺伝子群の両方のァレ ルが破壊された （ホモ K0) マウス系統であることが確認された。 （以下、 TC (CYP3A-HAC Δ ) / Δ cypと記す）。
実施例 9
TC (CYP3A- HAC A ) / A cypマウス系統の体細胞における CYP3A- HAC Δの保持
(9. 1) ゲノム PCR解析
上記で得られた TC (CYP3A- HAC Δ ) / Δ cyp マウスのうち雄（301)および雌（298) 1 匹ずつについて、 脳、 胸腺、 心臓、 肺、 肝臓、 腎臓、 脾臓、 小腸、 筋肉、 精巣 （ま たは子宫） からのゲノムを铸型として、 CYP3A 遺伝子クラスター検出用プライマ 一おょぴヒ ト 14 番染色体検出用プライマーを用いて、 前述と同様の条件で PCR を行い、 全ての臓器で CYP3A_HAC Aを検出した。
(9. 2) 蛍光 in situハイブリダイゼーシヨン (FISH) 解析
得られた TC (CYP3A-HAC Δ ) / Δ cypマウスのうち雄（301)および雌（298) 1匹ずつ について、 脳、 胸腺、 心臓、 肺、 肝臓、 腎臓、 脾臓、 小腸、 筋肉、 精巣 （または 子 宫 ） に お レヽ て 、 Shinohara ら の 報 告 (Human Molecular Genetics, 10： 1163-1175, 2001) に記された方法でヒ ト cot- 1 DNAをプローブにし て FISH解析を行ったところ、 49〜95%で CYP3A - HAC Δを保持することが確かめら れた。 特に CYP3Aが主に発現する肝臓および小腸では 84%以上の高い染色体保持 率であることが確かめられた。
実施例 1 0
TC (CYP3A-HAC A ) / A cypマウス系統における CYP3A/Cyp3a遺伝子クラスターの遺 伝子発現
B6雄マウスの 3週齢 （B6- 6)および 10週齢（B6- 1)の肝臓、 B6雌マウスの 3週齢 (B6-8)および 10週齢（B6-4)の肝臓、 Δ cyp雄マウスの 3週齢 （PT482)および 10 週齢（PT449)の肝臓、 Δ cyp雌マウスの 3週齢（PT485)および 10週齢（PT300)の肝 臓、 TC (CYP3A-HAC A ) / A cypマウスの 10週齢における雄（301)および雌（298)の肝 臓、 のトータル RNAを市販のプロ トコール （QIAGEN) に従い抽出後、 市販のプロ トコール（invitrogen)に従い、 cDNA合成を行い、 それを铸型として PCRを行い、 上述のヒ ト CYP3A遺伝子クラスター発現およびマウス Cyp3a遺伝子クラスタ一発 現を検出するプライマーを用いて発現を検出した。
その結果、 TC (CYP3A- HAC A ) / A cypマウスではマウス Cyp3a遺伝子クラスター は発現せず、ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターは発現し、 Δ cypマウスではマゥス Cyp3a 遺伝子クラスター、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターともに発現せず、 B6正常マウス ではヒ ト CYP3A遺伝子クラスタ一は発現せず、 マウス Cyp3a遺伝子クラスタ一は 発現していることが確かめられた （図 20)。
実施例 1 1
TC (CYP3A- HAC A ) / A cypマウス系統における CYP3A遺伝子クラスターの遺伝子発 現誘導
CYP3A/Cyp3a の発現を誘導する物質として知られる PCN (Pregnenolone 16ひ -carbonitrile) (シグマ）力 S TC (CYP3A-HAC Δ ) / Δ cy マウス、 Δ cypマウス、 B6正 常マウスにおける CYP3A/Cyp3a遺伝子の発現に及ぼす影響について検討するため、 一回の投与量は 100mg/kgとし、 4日間腹腔内投与した。 なお、 投与液は PCNをコ ーンオイル（シグマ）に懸濁して調製した。 5 日目に各マウス肝臓を摘出し、 肝臓 ミクロソーム画分よりタンパク質を抽出し、 岡田雅人 '宫崎香 （タンパク質実験 ノート、 羊土社、 1996) に従い、 anti - CYP3A抗体 （第一化学薬品 ；カタログ番号 242496) およぴ anti- j3 - actin抗体 （Sigma Aldrich； カタログ番号 A5441) によ るウェスタンプロッティング解析を行った。
その結果、 PCNを投与した TC (CYP3A- HAC A ) / A cypマウスおよび B6正常マウス での発現はコーンオイルのみ投与した同系統のマウスよりも CYP3A発現は上昇し ており、 その発現量はヒ トミクロソーム画分より抽出したタンパク質の発現と同 程度であった。 また、 A cypマウスにおいては PCNを投与した個体においても発 現は観察されなかった。 一方で、 コントロールとして用いた 3 - actinの発現は全 ての個体で同程度であった。 以上のことから、 TC (CYP3A - HAC Δ ) / Δ cyp マウス系 統において CYP3A- HAC A上のヒ ト CYP3A遺伝子が CYP3A/Cyp3a誘導剤によって発 現誘導されることが確かめられた （図 21)。
実施例 1 2
TC (CYP3A-HAC Δ ) / Δ cypマウス系統における代謝解析
上記で PCNまたはコーンオイルを投与した TC (CYP3A- HAC Δ ) / Δ cypマウス、 Δ cypマウス個体の肝臓ミクロソームを Omuraら （J. Biol. Chem. , 239， 2370, 1964) に従い、 CYP3A4で代謝されることがわかっている トリァゾラム（Triazolam) (200
^ M) と混合し、 その代謝物であるひ - OH- triazolamおよび 4 - 0H - triazolamを測 定した。 その結果、 PCNを投与した TC (CYP3A- HAC A ) / A cypマウスにおいて、 コ ーンオイルのみ投与した同系統のマウスの 10倍の代謝活性が得られ、それはヒ ト
(HLM : human l iver microsome)の約半分の活性であることが確かめられた。一方で、
PCN投与した Δ cypマウスでは活性がほとんど認められなかった。ヒ トでは相同遺 伝子が 2本あり、 この TC (CYP3A-HAC Δ ) / Δ cypマウスでは CYP3A遺伝子クラスタ 一が染色体 1本分であると考えられる。 ヒ トの約半分の活性を TC (CYP3A - HAC厶） / 厶 cypマウスで示したことは、 ヒ トと同様の代謝能を示していることが示された。 一方で、 PCN投与した Δ cypマウスでは活性がほとんど認められなかった。以上の こと力、ら、 TC (CYP3A- HAC A ) / A cyp マウス系統において CYP3A - HAC Δ上のヒ ト CYP3A遺伝子が機能的でかつヒトと同等であることが確かめられた （図 22)。 実施例 1 3
TC (CYP3A-HAC Δ ) / Δ cypマウス系統におけるヒ ト特異的代謝物の測定
CYP3A/Cyp3aで代謝されることが知られている midazolamのヒ ト特異的代謝物 が TC (CYP3A- HAC A ) / A cypマウスにおいて、 ヒ トと同様にヒ ト特異的な代謝物が 観察されるかを検討するため、 TC (CYP3A - HAC Δ ) / Δ cypマウス、 A cypマウス、 B6 正常マウス、 ヒ トの各肝臓由来ミクロソームと midazolamを反応させて、 以下の ように LC- MS/MSにて質量分析した。 反応混液 （10 μΜ midazolam, 87. 5 mM リン 酸カリウム緩衝液（pH7. 4)， 0. 5 mg/ mL 肝ミクロソーム） を 37 °Cで 5分間プレイ ンキュベーシヨン後、 NADPH生成システム（3. 3mM β -NADP+, 80 mM グルコース - 6- リン酸、 10 units/mL グルコース- 6-リン酸脱水素酵素）を添加し 37° Cで 30分間 インキュベーションした。 ァセトニトリルの添加により反応を停止後、 混液を遠 心分離 （3， 000rPm， 5分間） し上清を分取した。 これを窒素気流下 40 °Cで溶媒留 去し、乾固した抽出物をァセトエトリルに再溶解し、 LC-MS/MSにて質量分析した。 その結果、ヒ トと TC (CYP3A- HAC Δ ) / Δ cypマウスのミク口ソームにおいて 10. 22 に特異的な代謝物を検出することができた。 一方で、 主代謝物である 10. 62には 全てのミクロソーム群で代謝物を検出することができた。 以上のことから、 TC (CYP3A-HAC Δ ) / Δ cypマウス系統において CYP3A- HAC Δ上のヒ ト CYP3A遺伝子が 機能的でかつヒ トと同等であることが確かめられた （図 23)。
実施例 1 4
(14. 1) A cypマウス由来 ntES細胞の作製
実施例 7 で得られた Δ cyp マウスの尻尾繊維芽細胞を Wakayama らの方法
(Science, 292： 740, 2001)従い培養し、あらかじめ除核した未受精卵に上記 Δ cyp マウス由来の尻尾繊維芽細胞由来の核を注入した。 雄の Δ cyp マウス 1匹 （個体
No. 596) およぴ雌 A cypマウス 1匹 （個体 No. 480) からそれぞれ、 3ラインずつ ntESを樹立した （596- 1， 2, 3および 480- 1, 2， 4)。
(14. 2) 厶 cypマウス由来 ntES細胞の neo耐性遺伝子除去 Δ cyp-ntESへ CYP3A-HACおよび CYP3A- HAC Δを導入するために Δ cyp-ntESに存 在する neo耐性遺伝子を除去する必要があるため、 以下のように CyP3al3遺伝子 の K0に用いた neo耐性遺伝子 （2つの ΙοχΡで挟まれている、 図 17参照） の除去 を行った。 上記で得られた A cyp- ntES細胞株 6クローンに対して、 Cre組換え酵 素発現ベクター PBS185 (ギブコ) をトランスフエクシヨンした。 これによつて、 マウス内在性 Cyp3al3遺伝子領域に存在する ΙοχΡ配列間で部位特異的組換えが起 こり、結果的に neo遺伝子が欠失すると期待できた。 A cyp- ntES細胞をトリプシ ン処理し、 1. OxlO7個/ ml となるように HBSに懸濁してから、 30 i gの pBS185 (ィ ンビトロジェン） ベクターを加え、 ジーンパルサーを用いて 250V、 960 μ Fの条件 でエレク ト口ポレーションを行った。エレク ト口ポレーションを行った。その後、
100mmシャーレ 1枚に播種した。期待通りの ΙοχΡ間組換えが起こっている場合に はベクター中の neo遺伝子が発現しなくなり、 G418の耐性の有無によって検出可 能と考えられた。 Cre発現ベクター pBS185導入から 72時間培養後、 トリプシン処 理により細胞をディッシュから剥離し、 ES用丽 EMで懸濁後、 15mlチューブに移 して 1 OOOrpm, 5分間遠心した後、上清を吸引した。チューブをタッピングした後、
ES用 DMEM 10mlで細胞を再懸濁し、 ゼラチンコートした 100醒デイツシュに播種 し約一時間培養した。 その後培地を静かに回収し、 lOOOrpnu 5分間遠心した。 遠 心後、 上清を吸引し、 細胞塊をタッピングしてほぐし、 フィーダ一細胞があらか じめ播種された 60mmディッシュに十分分離した数十のコロニーが出現するよう に播種した。一週間後、 フィーダ一細胞があらかじめ播種された 24wellにコロニ 一を各クローンにっき 12個ずつピックアップし、 さらに数日後、フィーダ一細胞 があらかじめ播種された 24well2枚に播種し、 片方に G418を含む培地、 片方に
G418を含まない培地を加えた （マスタープレート）。 G418を加えた培地で死滅し たクローンが neo 耐性遗伝子が除去されたクローンであると考えられたので、
G418で死滅したクローンのマスタープレートを増殖させ、 24穴プレート 1穴分の 細胞を 4穴プレート 2穴に播種した。 4穴プレート 1穴分を- 80°Cにて凍結保存し た。 残りの 1穴分はゲノム DNA取得用として 3. 5cmゼラチンコートしたディッシ ュに播種し培養した。 上記細胞からゲノム DNAを調製し、 neo遺伝子が欠失した 細胞株であることを、 実施例 7記載の Primerl/2および Primerl/3のプライマー を用いて PCRにて確認した。 Neo耐性遺伝子が除去されたクローンは表 1の正常 マウスと同じパターンになることが予測された。 480-1では 12クローン中 5クロ ーン、 480- 2では 12クローン中 7クローン、 480- 4では 12クローン中 8クローン、 596-1では 12クローン中 9クローン、 596 2では 12クローン中 8クローン、596-3 では 12クローン中 10クローン、 で neo遺伝子が欠損している PCRパターンであ り、それらのクローンではすべて G418は非耐性であったこと力ゝら、上記クローン はすべて neo遺伝子が除去された Δ cyp-ntES (G- )細胞であることが確認された。 実施例 1 5
厶 cyp - ntES (G -） 細胞への CYP3A- HACまたは CYP3A- HAC Δの導入
CYP3A- HACまたは CYP3A- HAC Aを保持する Δ cyp- ntES (G- )細胞を保持するキメ ラマウスを作製するために、 実施例 2で得られた CYP3A- HACまたは CYP3A - HAC Δ を保持する CH0細胞から実施例 14で得られた Δ cyp- ntES (G- )細胞へミクロセル 法により導入した。 Tomizuka ら （Nature Genet. 16： 133, 1997) の方法に従い、 約 108 個 の CYP3A- HAC ま た は CYP3A - HAC Δ を保持す る CH0 細胞
(CH0/CYP3A-HAC4, 25， 32, 33など、 または CH0/CYP3A- HAC Δ 4， 6, 7， 10など） から ミクロセルを精製し、 DMEM 5ml に懸濁した。 約 107個の Δ cyp- ntES (G- ) 細胞
(596-1-2、 596-2-9など） をトリプシン処理により剥がし、 DMEMで 3回洗浄後 丽 EM 5mlに懸濁し、 遠心したミクロセルに加え、 1250rpmで 10分間遠心し、 上清 を完全に取り除いた。 沈殿をタッピングにより十分ほぐし、 1 : 1. 4 PEG 溶液 [5g
PEG1000 (和光純薬）、 lml DMS0 (シグマ） を DMEM 6mlに溶解] 0. 5 mlを加え、 約
1分 30秒間、 十分攪拌した。 その後、 DMEM 10mlをゆっく り加え、 1250rpmで 10 分間遠心し、 30ml の ES培地に懸濁し、 予めフィーダ一細胞をまいた直径 100mm シャーレ （コーユング） 3枚に分注し、 培養した。 24時間後、 300 μ β/πι1の G418 を含む培地に交換し、 約 1週間選択培養した。 その結果、 CYP3A-HAC を保持する
Δ cyp- ntES (G -) 細胞 (厶 cyp— ntES (G- ) /CYP3A - HAC) は 21クローン、 CYP3A- HAC
Δを保持する Δ cyp- ntES (G- ) 細胞 （ Δ cyp- ntES (G-) /CYP3A-HAC Δ ) は 57クロ ーンが CYP3A遺伝子クラスター検出用プライマーおょぴヒト 14番染色体検出用プ ライマーを用いた PCRで陽性であった。 さらに、上記で得られた Δ cyp - ntES (G- )
/CYP3A- HAC細胞および A cyp - ntES (G- ) /CYP3A- HAC Δ細胞の 12クローンずつに ついて、 ヒ ト C0T1DNA プローブを用いて FISH 解析 （Tomizuka ら， Nature Genet. 16： 133, 1997) を行った結果、 C0T1 プローブにより特異的に検出される CYP3A-HACの存在が 12クローン中、 11クローンで、 CYP3A- HAC Δの存在が 12クロ ーン中、 12クローンで確認された。 このうちマウスの核型が正常なク口一ンは Δ cyp-ntES (G -） /CYP3A- HAC では 5クローンで、 A cyp- ntES (G -） /CYP3A - HAC Δで は 9クローンあった。 以上のことから、 少なく とも A cyp-ntES (G- ) /CYP3A - HAC 細胞が 5クローン、 Δ cyp-ntES (G -） /CYP3A-HAC Δが 9クローン、 得られたと結 論付けた。
実施例 1 6
A cyp-ntES (G- ) /CYP3A- HACまたは Δ cyp-ntES (G -） /CYP3A- HAC Δからのキメラ マウス作製
実施例 15 で得られた ntES 細胞クローンを用いて Wakayama らの方法 (Sc i ence, 292 : 740, 2001 )でキメラマウスを作製した。宿主としては MCH (ICR) (白 色、 日本クレア社より購入） の雌雄交配により得られる胚盤胞期胚を用いた。 注 入胚を仮親に移植した結果生まれる仔マウスは毛色によりキメラであるかどうか を判定できる。 A cyp - ntES (G- ) /CYP3A- HACまたは Δ cyp- ntES (G- ) /CYP3A- HAC Δ (例えば Δ cyp-ntES (G- ) /CYP3A - HAC5， 6， 7および 11、 Δ cyp-ntES (G -） /CYP3A - HAC Δ 25，63，67、 実施例 15で取得） を注入した約 500個の胚を仮親に移植した結果、 Δ cyp-ntES (G -) /CYP3A-HAC からは 26 匹のキメラマウス、 Δ cyp-ntES (G- ) /CYP3A-HAC Δからは 29匹のキメラマウス （毛色に黒色の部分の認められる） が誕 生した。すなわち、ヒ ト人工染色体 CYP3A- HACまたは CYP3A- HAC Aを保持する ntES 細胞株はキメラ形成能を保持している、 すなわちマウス個体の正常組織に分化す る能力を保持していることが示された。
実施例 1 Ί
CYP3A-HACまたは CYP3A- HAC Δを保持する Δ cyp-ntES (G- )細胞より作製されたキ メラマウス体細胞における人工染色体の保持
(17. 1 ) ゲノム PCR解析
実施例 16 で Δ cyp- ntES ( G -） /CYP3A - HAC クローン （ Δ cyp- ntES ( G -）
/CYP3A-HAC5, 6， 7および 11) または Δ cyp-ntES (G- ) /CYP3 A - HAC Δ ( Δ cyp-ntES (G -) /CYP3A-HAC Δ 25, 63, 67) より作製されたキメラマウス (キメラ率約 50%) の尻尾から富塚らの報告 （Nature Genet. 16 : 133, 1997) に記された方法でゲノム DNAを調製し、 CYP3A遣伝子クラスター検出用プライマーおよびヒ ト 14番染色体 検出用プライマーを用いた PCRを前記と同様に行い、 CYP3A-HACまたは CYP3A- HAC Δの保持を検討した。その結果、調べた 10匹すべてで 2種のプライマー共に陽性 であり、 キメラマウス体細胞における CYP3A - HACまたは CYP3A - HAC Δの保持が確 認された。
(17. 2) 蛍光 in s ituハイブリダイゼーシヨン (FISH) 解析
また A cyp- ntES (G_) /CYP3A-HACまたは Δ cyp-ntES (G- ) /CYP3A- HAC Δ由来の キメラマウス（キメラ率約 50%)から調製した尻尾繊維芽細胞を用いて、 Shinohara らの幸 β告 （Human Molecular Genetics, 10： 1163- 1175， 2001) に記された方法でヒ ト cot - 1 DNAをプローブにして FISH解析を行ったところ、 視覚的に CYP3A - HAC または CYP3A- HAC Δの存在を確認し、マウス染色体とは独立に CYP3A- HAC Δが存在 していることが確かめられた。 約 50%の割合で CYP3A- HACまたは CYP3A-HAC Δが 保持されていたことから、 キメラ率と一致して CYP3A- HACまたは CYP3A-HAC Aが 効率に保持されていることが確かめられた。
以上のことから、 内在のマウス Cyp3a 遺伝子クラスターを欠損し、 かつヒ ト CYP3A 遺伝子クラスターを保持している A cyp - ntES (G- ) /CYP3A - HAC または Δ cyp-ntES (G -) /CYP3A - HAC Δは各種細胞に in vitroまたは in vivoで分化誘導を させることで、 マウス Cyp3a遺伝子クラスターを発現しない、 かつヒ ト CYP3A遺 伝子クラスターを発現する細胞を提供できることが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明により、ヒ ト 7番染色体上のヒ ト P450遺伝子（CYP3A遺伝子クラスター） を含む特定領域を保持する哺乳動物人工染色体ベクターは、 それを非ヒ ト哺乳動 物、例えばマウス、に導入するとき、良好なキメラ率及ぴ染色体保持率に加えて、 従来不可能であった安定的な子孫伝達が可能でかつ該動物組織中で安定に保持さ れる、非ヒ ト哺乳動物を提供することが可能となる。 このことは、 ヒ ト P450遺伝 子の発現を可能にする子孫動物の提供を可能にすることを意味する。 本発明は、 以下の有用性を有する。
(1) ヒ ト P450遺伝子領域を保持し、かつ次世代へ高効率で子孫伝達可能で個体 内で安定に維持されるヒ ト人工染色体が提供される。
(2) また、 該ヒト人工染色体を保持する非ヒト動物由来 ES細胞が提供される。
(3) また、 本発明により、 該ヒ ト人工染色体を個体内で安定に維持し、 高効率 で次世代に子孫伝達する非ヒ ト動物およびその子孫が提供される。
(3) これと相同遺伝子となる非ヒ ト哺乳動物内在性 P450 遺伝子が破壊された ノックァゥト非ヒト哺乳動物あるいはその子孫と交配させてできた産仔では、 特 定の P450分子種に関して完全にヒ ト型化していると考えられる。 よって、発現の 組織特異性や薬物誘導また発現の割合だけでなく、 代謝産物の機能についても特 定の P450分子種に関して完全にヒ ト型化したヒ ト P450導入非ヒ ト哺乳動物を提 供できると考えられる。
(4) この特定の P450分子種に関して完全にヒ ト型化したヒ ト P450導入非ヒ ト 哺乳動物を用いれば、 薬理効果や薬物代謝あるいは毒性といった薬物のヒトへの 影響を実際にヒ トに投与することなく研究あるいは予測することが可能である。
(5) さらに、 この特定の P450分子種に関して完全にヒ ト型化したヒト P450導 入非ヒ ト哺乳動物の全胎児培養によって、 その代謝と薬物毒性や奇形などの評価 も可能である。
(6) 完全にヒ ト型化したヒ ト P450 導入非ヒ ト哺乳動物の個体や、 その組織、 細胞から生物学的活性のあるヒ ト P450タンパクを得ることが可能である。このよ うなタンパクは、従来入手の困難なヒ ト P450タンパクを容易に提供できるばかり か、 大腸菌に代表される細菌を用いた発現系では解決し得なかったリン酸化や糖 鎖による修飾などに代表されるタンパクの修飾の面でもよりヒ トの体内で生産さ れる P450に近いものを提供できる。
(7) また、 上記非ヒ ト哺乳動物由来の組織や細胞を不死化して培養系で用いる 場合、安定してヒ ト P450タンパクを供給できる。 さらに、 ヒ トにおける薬物代謝 の培養系における研究材料として利用が可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。 配列表フリ一テキス ト
配列番号 1〜86、 99〜107：プライマー 配列番号 87〜98：オリゴ DNA

Claims

請求の範囲
1 . ヒ トチトクローム P450遺伝子を含むヒト 7番染色体断片を保持し、かつ、 子孫伝達可能な哺乳動物人工染色体ベクターであって、該ヒ ト 7番染色体断片が、 染色体マーカー AC004922 と AC073842 との間に存在する少なくともヒ ト CYP3A遺 伝子クラスターを含む約 lMb± 500Kbサイズの領域を保持することを特徴とする、 上記哺乳動物人工染色体ベクター。
2 . ヒ ト人工染色体ベクターである、 請求項 1に記載の哺乳動物人工染色体 べグタ < _
3 . 前記ヒ ト人工染色体ベクターが、 前記ヒ ト 7 番染色体断片を、 ヒ ト 14 番染色体由来の SC20ベクター（FERM BP- 7583)に転座して得られたベクターである、 請求項 2に記載の哺乳動物人工染色体べクター。
4 . 前記ヒ ト人工染色体ベクター力 S、受託番号 FERM BP- 10928のニヮトリ DT40 細胞株 DT40 (CYP3A-HAC Δ ) 214に保持された CYP3A - HAC Δである、請求項 2に記載 の哺乳動物人工染色体ベクター。
5 . 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持 し、 かつ、 ヒトチトクローム P450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、 非ヒ ト哺乳動物由来の分化多能性細胞。
6 . マウス ES細胞である、 請求項 5に記載の分化多能性細胞。
7 . 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保持 し、かつ、 ヒ トチトクローム P450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする非 ヒ ト哺乳動物。
8 . キメラ動物又はその子孫動物である、請求項 7に記載の非ヒ ト哺乳動物。
9 . 前記子孫動物が、 前記キメラ動物と、 それと同種の野生型動物との交配 により得られる動物である、 請求項 8に記載の非ヒ ト哺乳動物。
1 0 . 前記非ヒ ト哺乳動物において、 前記ヒ ト CYP3A遺伝子クラスターのホ モログである前記非ヒ ト哺乳動物固有のチトクローム P450遺伝子が破壌され、そ の固有の遺伝子の発現が低下又は消失している、請求項 7〜9のいずれか一項に記 載の非ヒ ト哺乳動物。
1 1 . マウスである、請求項？〜 10のいずれか一項に記載の非ヒ ト哺乳動物。
1 2 . マウスが子孫マウスである、 請求項 11に記載の非ヒ ト哺乳動物。
1 3 . 請求項 11又は 12に記載のマウス又はその子孫マウスを、マウス Cyp3a 遺伝子クラスターを欠損したマウスと交配させることにより作製されたマウス又 はその子孫であって、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体べ クタ一を保持すること、 マウス Cyp3a遺伝子クラスターを欠損していること、 及 びヒ トチトクローム P450遺伝子の発現を可能にすることを特徴とする、上記マウ ス又はその子孫。
1 4 . 請求項 7〜12のいずれか一項に記載の非ヒ ト哺乳動物或いは請求項 13 に記載のマウス又はその子孫に由来する、かつ、 ヒ トチトクローム P450遺伝子の 発現が可能であることを特徴とする、 細胞又は該細胞を含む器官もしくは組織。
1 5 . 請求項 7〜12のいずれか一項に記載の非ヒ ト哺乳動物、請求項 13に記 載のマウス又はその子孫、或いは請求項 14に記載の細胞、器官又は組織において、 これらが保持するヒ トチトクローム P450 遺伝子を発現させて生物学的活性を有 するヒ トチトクローム P450を産生させ、 該ヒ トチトクローム P450を回収するこ とを含む、 生物学的活性を有するヒ トチトクローム P450の製造方法。
1 6 . 請求項 7~ 12のいずれか一項に記載の非ヒ ト哺乳動物、請求項 13に記 載のマウス又はその子孫、或いは請求項 14に記載の細胞、器官又は組織に薬物又 は食品を投与し、 該薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝を測定することを含 む、 薬物又は食品の薬理作用及び/又は代謝の試験方法。
1 7 . 請求項 1〜4のいずれか一項に記載の哺乳動物人工染色体ベクターを保 持する非ヒ ト哺乳動物由来の分化多能性細胞であって、 ヒ ト CYP3A遺伝子クラス ターのホモログである非ヒ ト哺乳動物固有のチトクローム P450 遺伝子が破壊さ れ、 その固有の遺伝子の発現が低下又は消失していることを特徴とする、 非ヒ ト 哺乳動物由来の分化多能性細胞。
1 8 . ntES細胞である、 請求項 17に記載の分化多能性細胞。
1 9 . マウス由来 ntES細胞である、請求項 17又は 18に記載の分化多能性細 胞。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011083870A1 (ja) 2010-01-06 2011-07-14 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター
WO2013054949A1 (ja) 2011-10-13 2013-04-18 株式会社フェニックスバイオ ヒト肝細胞を担持するキメラ非ヒト動物
WO2019177163A1 (ja) 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター及びその使用
JP7497139B2 (ja) 2016-04-12 2024-06-10 キャリージーンズ バイオエンジニアリング 生合成経路を発現する合成染色体の作成方法及びその使用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2975526C (en) 2015-02-09 2023-11-07 Edward Perkins Compositions and methods for monitoring in real-time construction and bioengineering of mammalian synthetic chromosomes
EP3442598A4 (en) * 2016-04-12 2019-11-20 SynPloid Biotek, LLC METHOD FOR GENERATING SYNTHETIC, BIOSYNTHESIGNAL PATHS EXPRESSING CHROMOSOMES AND USES THEREOF
EP3443083B1 (en) 2016-04-12 2023-12-13 CarryGenes Bioengineering, LLC Sequential loadings of multiple delivery vectors using a single selectable marker
EP3555261A4 (en) 2016-12-15 2020-09-02 Synploid Biotek, LLC PROCEDURES FOR CELL RENEWAL
EP3678676A4 (en) 2017-09-05 2021-12-01 CarryGenes Bioengineering, LLC SYNTHETIC CHROMOSOMES INLINE TRANSMITTERS AND METHODS OF USE
US20200332315A1 (en) * 2017-11-02 2020-10-22 National University Corporation Tottori University Method for high production of protein using mammalian artificial chromosome vector
CN109837307B (zh) * 2017-11-24 2023-09-19 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 建立含外源染色体的胚胎干细胞的方法
US20210123027A1 (en) 2018-10-10 2021-04-29 National University Corporation Tottori University Method for producing human induced pluripotent stem cells containing exogenous chromosome
JP7010442B2 (ja) 2018-10-10 2022-01-26 国立大学法人鳥取大学 微小核細胞融合法による目的ｄｎａを含む動物細胞の作製方法
WO2023090372A1 (ja) 2021-11-16 2023-05-25 学校法人東京薬科大学 プロモーター活性化配列、そのプロモーター活性化配列を含む発現ベクター、及びその発現ベクターを含む哺乳動物細胞

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000010383A1 (en) 1998-08-21 2000-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for modifying chromosomes
WO2001011951A1 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Mouse having human cytochrome p450 transferred therein
WO2002083897A1 (en) * 2001-04-18 2002-10-24 Gene Stream Pty Ltd Transgenic non-human animals for pharmacological and toxicological studies
WO2002092812A1 (en) * 2001-05-11 2002-11-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha ARTIFICIAL HUMAN CHROMOSOME CONTAINING HUMAN ANTIBODY μ LIGHT CHAIN GENE
WO2006064197A2 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Iti Scotland Limited Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity
JP2007295993A (ja) 2006-04-27 2007-11-15 Konami Sports & Life Co Ltd トレーニング装置

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6645745B1 (en) * 2000-05-30 2003-11-11 Epidauros Biotechnologie Ag Identification of a new member of the cytochrome P450 3A (CYP3A) gene family: CYP3AX
CA2430013C (en) * 2000-11-30 2011-11-22 Medarex, Inc. Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
US7759541B2 (en) 2004-12-13 2010-07-20 Iti Life Sciences Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000010383A1 (en) 1998-08-21 2000-03-02 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Method for modifying chromosomes
WO2001011951A1 (en) 1999-08-13 2001-02-22 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Mouse having human cytochrome p450 transferred therein
WO2002083897A1 (en) * 2001-04-18 2002-10-24 Gene Stream Pty Ltd Transgenic non-human animals for pharmacological and toxicological studies
WO2002092812A1 (en) * 2001-05-11 2002-11-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha ARTIFICIAL HUMAN CHROMOSOME CONTAINING HUMAN ANTIBODY μ LIGHT CHAIN GENE
JP2005230020A (ja) 2001-05-11 2005-09-02 Kirin Brewery Co Ltd ヒト抗体λ軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体、および子孫伝達可能な該ヒト人工染色体を含む非ヒト動物
WO2006064197A2 (en) * 2004-12-13 2006-06-22 Iti Scotland Limited Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity
JP2007295993A (ja) 2006-04-27 2007-11-15 Konami Sports & Life Co Ltd トレーニング装置

Non-Patent Citations (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. J. SMITH ET AL., NATURE GENET., vol. 9, 1995, pages 376
ASSEFFA ET AL., ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS., vol. 274, 1989, pages 481
B. A. BROOKS ET AL., AM. J. HUM. GENET., vol. 43, 1988, pages 280
CAMPBELL ET AL., J. CELL SCI., vol. 109, 1996, pages 2619
DIEKEN ET AL., NATURE GENET., vol. 12, 1996, pages 174
EVANS ET AL., NATURE, vol. 292, 1981, pages 154
FUNAE ET AL., BIOSCIENCE & INDUSTRY, vol. 55, 1997, pages 81
GENTER ET AL., BIOCHEM. PHARMACOL., vol. 55, 1998, pages 1819
GILLAM ET AL., ARCH. BIOCHEM. BIOPHYS., vol. 305, 1993, pages 123
HANAOKA ET AL., DIFFERENTIATION, vol. 48, 1991, pages 83
HERWAARDEN ET AL., J. CLIN. INVEST., vol. 117, 2007, pages 3583 - 3592
IANNACCONE ET AL., DEV. BIOL., vol. 163, 1994, pages 288
J. E. SULSTON ET AL., GENOME RES., vol. 8, 1998, pages 1097
KAMATAKI ET AL., TOXICOLOGY LETTERS, vol. 82-83, 1995, pages 879
KAMATAKI ET AL., YAKUBUTSU DOTAI, vol. 13, 1998, pages 280
KAMATAKI, REPORT FROM THE BIOSAFETY RESEARCH CENTER, FOODS, DRUGS AND PESTICIDES (AN-PYO CENTER), vol. 7, 1997, pages 27
KANATSU-SHINOHARA ET AL., CELL, vol. 119, 2004, pages 1001
KATOH ET AL., CELL STRUCT. FUNCT., vol. 12, 1987, pages 575
KAWASAKI ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 85, 1988, pages 5698
KOI ET AL., JPN. J. CANCER RES., vol. 80, 1989, pages 413 - 418
KORENBERG ET AL., CELL, vol. 53, 1988, pages 391
KOVALEVA ET AL., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 221, 1996, pages 129
KUROIWA ET AL., GENE THER., vol. 9, 2002, pages 708
KUROIWA ET AL., NATURE BIOTECH., vol. 18, 2000, pages 1086
KUROIWA ET AL., NATURE BIOTECH., vol. 20, 2002, pages 88
KUROIWA ET AL., NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 26, 1998, pages 3447
KUROIWA Y ET AL.: "The use of chromosome-based vectors for animal transgenesis.", GENE THERAPY, vol. 9, 2002, pages 708 - 712, XP002316659 *
LEE ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 271, 1996, pages 12063
LI ET AL., ARCHS. BIOCHEM. BIOPHYS., vol. 329, 1996, pages 235
LIANG ET AL., PROC. NATL ACAD. SCI. U.S.A., vol. 93, 1996, pages 1671
LICHTER ET AL., HUMAN GENETICS, vol. 80, 1988, pages 224
M. ZIJLSTRA ET AL., NATURE, vol. 342, 1989, pages 435 - 438
MATSUI ET AL., CELL, vol. 70, 1992, pages 841
MCKINNON ET AL., CLIN. EXP. PHARMACOL. PHYSIOL., vol. 25, 1998, pages 783
NELSON ET AL., PHARMACOGENETICS, vol. 6, 1996, pages 1
OKITA ET AL., GENOMICS, vol. 81, no. 6, 2003, pages 556
OMURA ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 239, 1964, pages 2370
P. HASTY ET AL., NATURE, vol. 350, 1991, pages 243 - 246
PINEAU ET AL., PROC. NATL ACAD. SCI. U.S.A., vol. 92, 1995, pages 5134
PRASHER, D. C ET AL., GENE, vol. 111, 1992, pages 229
PUECH ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 97, 2000, pages 10090
RAMSDEN ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 268, 1993, pages 21722
See also references of EP2218786A4 *
SHINOHARA ET AL., HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 10, 2001, pages 1163 - 1175
SHOU ET AL., MOL. CARCINOG., vol. 10, 1994, pages 159
SORIANO ET AL., CELL, vol. 64, 1991, pages 693
SUN FL; DEAN WL; KELSEY Q; ALLEN ND; REIK W: "Transactivation of Igf2 in a mouse model of Beckwith-Wiedemann syndrome", NATURE, vol. 389, no. 6653, 23 October 1997 (1997-10-23), pages 785787
TAKAHASHI ET AL., CELL, vol. 126, 2006, pages 663
TOMIZUKA ET AL., NATURE GENET., vol. 16, 1997, pages 133
TOMIZUKA ET AL., NATURE GENET., vol. 16, 1997, pages 133 - 143
TOMIZUKA ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A., vol. 97, 2000, pages 722
WAKAYAMA ET AL., SCIENCE, vol. 292, 2001, pages 740
WHEELER ET AL., REPROD. FERTIL. DEV., vol. 6, 1994, pages 563
WOLF ET AL., J. PHARM. PHARMACOL., vol. 50, 1998, pages 567
YAGI ET AL., ANALYTICAL BIOCHEM., vol. 214, 1993, pages 70
YAGI ET AL., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 214, 1993, pages 70
YU ET AL., ENDOCOLOGY, vol. 146, pages 2911 - 2919
YU ET AL., ENDOCRINOLOGY, vol. 146, 2005, pages 2911

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011083870A1 (ja) 2010-01-06 2011-07-14 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター
US8940533B2 (en) 2010-01-06 2015-01-27 National University Corporation Tottori University Mouse artificial chromosome vector
US9775331B2 (en) 2010-01-06 2017-10-03 National University Corporation Tottori University Rodent comprising mouse artificial chromosome vector
WO2013054949A1 (ja) 2011-10-13 2013-04-18 株式会社フェニックスバイオ ヒト肝細胞を担持するキメラ非ヒト動物
JP2013085485A (ja) * 2011-10-13 2013-05-13 Phoenix Bio:Kk ヒト肝細胞を担持するキメラ非ヒト動物
US9420769B2 (en) 2011-10-13 2016-08-23 Phoenixbio Co., Ltd. Chimeric non-human animal carrying human hepatocyte
JP7497139B2 (ja) 2016-04-12 2024-06-10 キャリージーンズ バイオエンジニアリング 生合成経路を発現する合成染色体の作成方法及びその使用
WO2019177163A1 (ja) 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人鳥取大学 マウス人工染色体ベクター及びその使用

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