WO2009043393A1

WO2009043393A1 - Fertilitätstest

Info

Publication number: WO2009043393A1
Application number: PCT/EP2008/004170
Authority: WO
Inventors: Gunther Wennemuth; Helmut Stauber
Original assignee: Nanorepro Gmbh
Priority date: 2007-09-25
Filing date: 2008-05-26
Publication date: 2009-04-09
Also published as: DE102007045935A1; DE102007045935B4

Abstract

Die Erfindung betrifft die Variante des auf Spermien vorhandenen Oberflächenantigens ABCG2, sowie Antikörper, die gegen ein Oberflächenantigen auf Spermien, d.h. gegen ein Antigen, das sich auf der auβeren Membran Oder einer von auβen zugänglichen Membran des Spermiums befindet, richten. Von auβen zugänglich ist eine Spermienmembran nur, wenn hierfür das Spermium seinen Akrosomenteil nicht durch Beschädigung verliert, das Spermium also weitestgehend unversehrt bleibt. Weiterer Bestandteil der Erfindung ist ein Fertilitätstest (1) und ein Verfahren zu dessen Verwendung. Der Fertilitätstest (1) besteht aus einer Reagenzienschicht (2) mit einer Testzone (10) aus in ihrer Gröβe angepaβten Teilflächen A, B, und C, sowie einem in jeder dieser Flächen in vorgegebener Menge immobilisierten Mittel. Bei ihm handelt es sich um einen erfindungsgemäβen Antikörper oder um gröβenreduzierte Poren. Ferner umfasst der Fertilitätstest in einer weitergeleiteten Bauform einen Trägerkörper (4), in einer weiteren erfindungsgemaβen Ausgestaltung eine Filterschicht (8) mit reduzierter Porengröβe und in einer zusatzlichen Weiterleitung besteht er aus wenigstens zwei Streifen, von denen einer die Reagenzienschicht (2) ist. Das Verfahren zur Betätigung des Fertilitätstests (1) umfasst die lnkubation einer Messprobe, Auftragen eines Aliquots davon auf den Fertilitätstest (1), eine weitere lnkubation während einer vorgebbaren Zeit und anschlieβendes Ablesen.

Description

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26.05.2008 0979WO1441

Anmelder: NanoRepro GmbH, 35043 Marburg

Fertilitätstest

Die Erfindung betrifft ein spermienspezifisches Oberflächenantigen nach Anspruch 1 , einen gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen gerichteten Antikörper nach Anspruch 4 und einen spermienspezifischen Antikörper enthaltenden Fertilitätstest gemäß Anspruch 10. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der männlichen Fertilität gemäß Anspruch 45 mit dem Fertilitätstest sowie dessen Verwendung.

Im Zuge der fortschreitenden Industrialisierung und den hierdurch ständig steigenden Belastungen für Mensch und Umwelt, insbesondere aufgrund von Streß und eingeschränkter Bewegung nimmt die maskuline Infertilität in den Industrienationen zu. Heute sind bereits 20 bis 40 % der Männer in diesen Ländern unfruchtbar, d.h., sie haben zu wenig Spermien, sprich eine Oligozoospermie mit einer Spermien- konzentration < 10⁶ Spermien pro Milliliter im Ejakulat. Einige männliche Individuen produzieren überhaupt keine Spermien mehr und leiden an einer Azoospermie. Auch in der Veterinärmedizin werden Tests zur Bestimmung der Fertilität von Hengsten, Zuchtbullen und anderen Nutz- und Haustieren benötigt. Mithin besteht und wächst der Bedarf nach einfachen, preiswerten und zuverlässigen Fertilitätstests für den Mann und für männliche Tiere.

In der WO 96 13225 A2 wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Trennen von beweglichen und unbeweglichen Spermien beschrieben. Eine Ejakulatprobe wird hierzu mit einer Flüssigkeit in Kontakt gebracht, die nur von beweglichen Spermien durchschwömmen wird. Letztere untersucht man dann auf ihre Fähigkeit, eine Schwangerschaft auszulösen. Hierzu bestimmt man die Menge und somit Aktivität des Enzyms Sperma Superoxid Dismutase (SOD) mit einem gegen dieses Enzym gerichteten Antikörper. Detektiert man auf diese Weise 20 bis 40 Spermien/nl Probenflüssigkeit, bedeutet dies ein unklares Ergebnis, während Proben mit mehr als 40 Spermien pro nl eine Schwangerschaft mit hoher Wahrscheinlichkeit auslösen.

Als weitere Indikatoren für fertile Spermien werden genannt: Glutathion-Peroxidase, die Menge an Oxo-8-deoxyguanosin, das Verhältnis zwischen gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, die Kreatinkinase Aktivität, Antikörper gegen Spermalipide, die Menge an Spermaphospholipiden und des Spermaproteins α-Tubulin, die Menge an Lactat-Dehydrogenase, an Protamin, an Acrosin oder an Proteinen aus dem Akrosomenbereich und der Spermiumgeißel. Weiter werden genannt ein glykolytisches Enzym, ein Protein aus dem Zellkern, ein Mitochondrien-Protein, das Verhältnis von PE/PC oder gesättigten zu ungesättigten Lipiden.

All diesen Indikatoren ist jedoch gemein, daß sie sich im Spermium befinden und nicht an dessen Oberfläche. Zudem sind sie darin an unterschiedlichsten Orten lokalisiert und finden sich deshalb in intakten wie beschädigten Spermatozoen. D.h. jedes Spermium, ob integer oder verletzt, fertil oder infertil wird für einen Nachweis herangezogen. Dies ist auch nicht weiter von Belang, weil vor der eigentlichen Indikatorbestimmung bereits motile und wahrscheinlich fertile Spermien von unbeweglichen abgetrennt werden. Dieser zusätzliche Schritt macht den beschriebenen Test aber zeitaufwendig und unsicher in seiner Testaussage.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, die Nachteile des Standes der Technik zu umgehen und Substanzen, eine preiswerte Vorrichtung sowie ein Verfahren zur einfachen, kostengünstigen, schnellen und aussagekräftigen Bestimmung der männlichen Fertilität bereitzustellen. Ziel ist ferner, eine hohe Präzision bei gleichzeitig geringer Störanfälligkeit durch äußere Einflüsse zu erreichen und einen Anwender in die Lage zu versetzen, mit einer Messung eine semiquantitative Aussage über die Menge an im Ejakulat vorhandenen Spermien zu erhalten. Schließlich sollen weitere am Messvorgang beteiligte oder in der Messprobe enthaltene Verbindungen die Messung unbeeinflusst lassen.

Hauptmerkmale der Erfindung sind im kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 , 4 und

10 angegeben. Ausgestaltungen sind Gegenstand der Ansprüche 2 und 3, 5 bis 9 und

11 bis 53. Ein Oberflächenantigen nach der Erfindung ist die auf Spermien vorhandene Variante des Proteins ABCG2. Diese Variante wurde bis dato noch nicht bekannt und sie eignet sich besonders gut als Marker zum Nachweis der Menge intakter Spermien. Sie ist ein auf bzw. in der äußeren Spermienmembran vorhandenes Oberflächenantigen und wird deshalb mit deutlich geringerer Wahrscheinlichkeit oder überhaupt nicht auf verletzten und damit unfruchtbaren Spermien ohne bzw. mit beschädigter Oberflächenmembran anzutreffen sein. Auf intakten fertilen Spermatozoen ist sie jedoch vorhanden. Von besonderer Relevanz ist die auf Humanspermatozoen vorhandene Variante von ABCG2, denn Sie kann Aussagen über die Zeugungsfähigkeit männlicher Spermien liefern.

ABCG2, dass eine Gruppe trägt, die farbig ist oder ein Substrat in eine optisch erkennbare Substanz umsetzt, ist ebenfalls wesentlich für die Erfindung, denn es kann in einer kompetitiven Variante des Fertilitätstests eingesetzt werden.

Wesentlicher Bestandteil der Erfindung ist ferner ein spermienspezifischer Antikörper, der gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen insbesondere gegen spermales ABCG2 gerichtet ist. Unter dem Begriff spermienspezifisches Oberflächenantigen sind alle diejenigen Antigene zu fassen, die sich auf bzw. in der Plasmamembran des Spermiums, also auf bzw. in seiner äußeren Membran oder auf einer Membran befinden, die beim intakten Spermium von außen zugänglich ist.

Besonders fortgestaltet ist die Erfindung dadurch, daß der Antikörper gegen ein im akrosomalen Bereich des Spermiums vorhandenes Oberflächenantigen gerichtet ist. Der akrosomale Bereich ist der recht fragile Kopfbereich des Spermiums und geht durch mechanische oder chemische Einflüsse bedingt schnell verloren. Wenn er abgesprengt ist, sind Spermien infertil, weil keine Fusion mit der Eizelle mehr möglich ist, denn die hierzu benötigten Enzyme sind im Akrosomenbereich, sprich in der vor dem Zellkern des Spermiums liegenden eine Eizelle zuerst berührenden Spitze angeordnet und fehlen dann. Oberflächenantigene im Akrosomenbereich zeigen ein intaktes funktionales Spermium an. Deshalb sind gegen sie gerichtete Antikörper für die Erfindung besonders wertvoll.

In einer Ausgestaltung ist der Antikörper gegen das Oberflächenantigen ABCG2 gerichtet. Dieses kommt im akrosomalen Bereich des Spermiums an der Oberfläche vor. Dabei kommt die auf Humanspermien gefundenen ABCG2 Variante als Oberflächenantigen besonders in Betracht.

Der Antikörper ist zur optischen Erkennung mit farbigen oder farbgebenden Teilchen und in einer direkt mit dem Auge wahrnehmbaren bevorzugten Variante mit Goldpartikeln konjugiert. Diese besitzen einen Durchmesser von 40 bis 60 nm und vereinen dadurch gute Fließeigenschaften im Fertilitätstest mit einer ausreichend guten optischen Erkennbarkeit.

Eine weitere essentielle Komponente der Erfindung ist ein Fertitlitätstest nach dem Flow-Through Prinzip oder nach dem Lateral-Flow Prinzip, der wenigstens einen spermienspezifischen erfinderischen Antikörper enthält. Dieser Antikörper ist gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen gerichtet und liefert mithin ein recht genaues Bild über auf intakten Spermien vorhandene detektierte Antigene. Dieses Bild wird noch verbessert, wenn der im Fertilitätstest vorhandene Antikörper gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen im akrosomalen Bereich, also gegen die fragile Kappe des Spermiums gerichtet ist. Besonders gute Ergebnisse gelingen mit einem im Fertilitätstest vorgesehenen Antikörper, der gegen die auf Spermien vorhandene Variante des Oberflächenantigens ABCG2 gerichtet ist, wobei die humane ABCG2-Variante heraus sticht.

Die im Fertilitätstest vorhandenen Antikörper sind mit farbigen oder farbgebenden Teilchen zur optischen Erkennung konjugiert, wobei diese Teilchen wegen des besseren Fließverhaltens unter Wahrung der guten optischen Erkennbarkeit einen Durchmesser von 40 bis 60 nm besitzen.

Ferner besteht der Fertilitätstest aus wenigstens einem Trägerkörper und wenigstens einer Reagenzienschicht aus einem durchströmbaren Material, wobei die Reagenzienschicht wenigstens einen Antikörper und/oder wenigstens ein Oberflächenantigen aufweist. Diese Merkmale erlauben es, ein auf einem Spermium vorhadenes Oberflächenantigen festzuhalten und nachzuweisen.

Die in einer Weiterführung auf dem Fertilitätstest am stromaufwärtigen Ende der Reagenzienschicht oder unmittelbar unterhalb des stromaufwärtigen Endes der Reagenzeinschicht vorgesehene Verteilerschicht gestattet eine dosierte und gleichmäßig feine Verteilung der Probenlösung und trägt zu einer schnellen und präzisen Testdurchführung bei. Gleiches gilt für den bzw. einen weiteren in ihr vorgesehenen Antikörper bzw. für das (optisch) markierte Oberflächenantigen. Diese Teilchen binden an das auf die Verteilerschicht mit einer Messprobe aufgegebene Oberflächenantigen oder konkurrieren mit ihm um eine Bindungsstelle stromabwärts im Fertilitätstest. Ein Erstkontakt bzw. eine Vermischung zwischen Messprobe und in der Verteilerschicht vorhandenem markierten Oberflächenantigen oder Antikörper findet in dieser Ausführung der Erfindung bereits in der Verteilerschicht und nicht erst in der Reagenzienschicht statt und bedeutet eine homogenere und dadurch präzisere Testdurchführung.

Eine wesentliche Erweiterung erfährt der Fertilitätstest dadurch, daß auf bzw. oberhalb oder unterhalb der Reagenzienschicht stromabwärts und beabstandet von ihrem stromaufwärtigen Ende, und bevorzugt ebenfalls stromabwärts und beabstandet von der Verteilerschicht sofern letztere vorhanden ist, eine Filterschicht vorgesehen ist. Durch diese Maßnahme können selbst bei großen Mengen an farbmarkiertem Antikörper neben niedrigen Oberflächenantigenmengen noch gute Ergebnisse erhalten werden, denn der Überschuß an farbmarkiertem Antikörper wird in Teilen von der Filterschicht aufgenommen. Um allerdings zu verhindern, daß auch Spermien in die Filterschicht eindringen und somit der Messung verloren gehen, ist die Filterschicht in einer logischen Fortführung mit Poren versehen, welche kleiner sind als jene der Reagenzienschicht. Und zwar sind sie so klein, daß sie für Spermien und mit Antikörpern markierte Spermien nicht durchlässig sind.

Besonders wichtig für eine semiquantitative Aussage ist, daß der Fertilitätstest auf bzw. in der Reagenzienschicht stromabwärts von ihrem stromaufwärtigen Ende und bevorzugt ebenfalls stromabwärts der Filterschicht sofern letztere vorgesehen ist, eine Testzone mit Mitteln aufweist, die anzeigen, ob das Oberflächenantigen in wenigstens einem der Konzentrationsbereiche I, Il oder III in einer Messprobe vorliegt. Konzentrationsbereich I umfasst eine Menge des Oberflächenantigens in der Messprobe, die einer Zellenanzahl von weniger als 2 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht und Konzentrationsbereich Il eine Menge, die einer Zellenzahl von 2 Zellen bis 20 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht, vorzugsweise von 2 Zellen bis 10 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit und ganz bevorzugt von 2 bis 5 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit. Konzentrationsbereich III schließlich umfaßt eine Menge des Oberflächenantigens in der Meßprobe, die einer Zellenzahl von mehr als 20 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht, vorzugsweise von mehr als 10 Zellen pro Nanoliter Probeflüssigkeit und besonders bevorzugt von mehr als 5 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit. Die Mittel zum Anzeigen von wenigstens einem der Konzentrationsbereiche 1, 11 oder IM sind auf wenigstens einer Teilfläche A, B oder C der Testzone des Fertilitätstests derart angeordnet, daß jedem Konzentrationsbereich I, II, III respektive eine der Teilflächen A, B, C zugeordnet ist. Nur so ist mit dem Fertilitätstest eine semiquantitative Aussage über die Menge an Spermien in der Messprobe in einfacher Weise in der Art eines Strichbildes zu erhalten.

Zur Steigerung der Performance und für genauere Messergebnisse sieht eine Ausgestaltung des Fertilitätstests vor, die Teilfläche A dem Konzentrationsbereich 1 zuzuordnen und von allen Teilflächen A, B, C am weitesten stromaufwärts anzuordnen. Hierzu dient auch die Maßnahme, die Teilflächen A, B, C unterschiedlich breit zu dimensionieren und ferner die Ausgestaltung, die Teilfläche A schmaler auszuführen, als jene, die dem Konzentrationsbereich Il und/oder dem Konzentrationsbereich III zugeordnet ist. Weil in Teilfläche A am wenigsten Oberflächenantigen nachgewiesen wird, ist es sinnvoll, dort aufgebrachte Mittel auf möglichst engem Raum zu konzentrieren, um auch bei geringen Spermienmengen noch ein sichtbares Farbsignal zu erhalten.

Die auf der Teilfläche A vorgesehenen Mittel sind dort in einer Menge angeordnet, die ausreicht, eine Menge des Oberflächenantigens nachzuweisen, die einer Zellenzahl von kleiner 2 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht. Jene Mittel in Teilfläche B sind in einer Menge vorgesehen, die ausreicht, eine Menge des Oberflächenantigens nachzuweisen, die einer Zellenzahl von 2 Zellen bis 18 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit, vorzugsweise von 2 Zellen bis 10 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit und in einer besonders bevorzugten Bauform von 2 Zellen bis 5 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht. Schließlich sind auf der dem Konzentrationsbereich III zugeordneten Teilfläche C Mittel in einer Menge angeordnet, die ausreicht, eine Menge des Oberflächenantigens nachzuweisen, die einer Zellenzahl von mehr als 18 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit, vorzugsweise von mehr als 10 Zellen pro Nanoliter Probeflüssigkeit und besonders bevorzugt von mehr als 5 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht. Nur anhand dieser Abstufung der Messbereiche in den drei Teilflächen kann auch ein Laie recht schnell feststellen, ob er noch zeugungsfähig ist oder nicht.

Um eine markante Linien- oder Signalbildung in jeder der Teilflächen A, B oder C zu bewirken, sind die Mittel auf wenigstens einer von ihnen immobilisiert. Besonders gute Ergebnisse werden erhalten, sofern die Mittel in allen Teilflächen unbeweglich sind, weil es so zu einer genauen Trennung der Konzentrationsbereiche I bis IM kommt.

Gewöhnlich bestehen die Mittel aus einer ein spermienspezifisches Oberflächen- antigen bindenden Substanz, vorzugsweise aus einer ein im akrosomalen Bereich vorhandenes, spermienspezifisches Oberflächenantigen bindenden Substanz und ganz besonders bevorzugt aus einer das Oberflächenantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bindenden Substanz bestehen.

Ist diese jedoch teuer oder umständlich zu erhalten, können Kosten eingespart werden, wenn die Mittel in einer erfindungswesentlichen Ausgestaltung aus größenreduzierten Poren der Teilfläche C der Reagenzienschicht bestehen.

In einer ebenfalls erfindungswichtigen Weiterführung besteht der Fertilitätstest aus wenigstens zwei Streifen, die in einem Überlappungsbereich aufeinander liegen, wobei wenigstens einer der Streifen aus der Reagenzienschicht oder aus einer Kombination von Reagenzienschicht und Trägerkörper oder aus einer Kombination von Reagenzienschicht, Trägerkörper und Verteilerschicht oder aus einer Kombination von Reagenzienschicht, Trägerkörper, Verteilerschicht und Filterschicht besteht. Mittels dieser Bauvariante des Fertilitätstests ist eine äußerst exakte Bestimmung von in der Meßprobe vorhandenem Oberflächenantigen in allen drei Teilflächen A, B und C möglich, denn in jede dieser Teilflächen der Testzone treten mit der Probenlösung ausschließlich unmarkierte Spermien mit freiem Oberflächenantigen ein. Wechselwirkungen mit beweglichen Antikörpern oder markierten beweglichen Antikörpern haben vor dem Eintritt nicht stattgefunden, weil letztere erst vom zweiten oder einem weiteren Streifen aus in die Testzone strömen.

Voraussetzung hierfür ist jedoch, daß zwischen den Streifen zumindest in einem Überlappungsbereich eine Fließverbindung besteht, um markierte Antiköper aus Streifen zwei auf die Testzone bzw. in die jeweilige Teilfläche von Streifen 1 zu bringen. Deshalb sind die Streifen im Überlappungsbereich so durchlässig, dass dort die flüssige Meßprobe vom ersten Streifen auf den zweiten Streifen und/oder jeden weiteren Streifen strömt. Decken sich Überlappungsbereich und Teilfläche(n), jedoch wenigstens teilweise, so werden Oberflächenantigene d.h. intakte Spermien aus der Meßprobe zumindest teilweise in der/den jeweiligen Teilfläche(n) festgehalten und die an intakten Spermien verarmte Messprobe strömt in Streifen zwei. Andererseits ist ein Einstrom von markierten Antikörpern aus Streifen zwei in Streifen eins ungehindert möglich. Dieser Effekt wird noch verstärkt, wenn einer der Streifen im Überlappungsbereich vom Trägerkörper befreit ist.

In einer Weiterführung der Erfindung sind an den stromaufwärtigen Seiten der Streifen Auftragszonen derart angeordnet, dass sich bei gleichzeitigem oder nahezu zeitgleichem Auftrag einer Flüssigkeit auf jede der Auftragszonen Flüssigkeitsströme bilden, die sich im Überlappungsbereich treffen. Bringt man beispielsweise Probenlösung auf den als Reagenzeinschicht anzusehenden Streifen auf und eine Flüssigkeit auf den oder einen weiteren Streifen, so treffen sich beide Flüssigkeiten etwa im Überlappungsbereich beider Streifen und es kann deshalb nicht zu Verfälschungen kommen, die auftreten würden, wenn die Flüssigkeit aus Streifen 2 antikörperbeladen den Überlappungsbereich durchströmen würde, bevor das Antigen aus der Messlösung in einer unmittelbar unter dem Überlappungsbereich angeordneten Teilfläche vorliegt.

Um auch in der Zwei- oder Mehrstreifenanordnung in Teilfläche C teuren Antikörper zum Einfangen von Spermien einzusparen und ferner keine Spermien während der Messung zu verlieren, besitzt wenigstens einer der Streifen zumindest im Überlappungsbereich eine gegenüber dem anderen und jedem weiteren Streifen unterschiedliche Porenweite. Diese ist durchlässig für Antikörper und für markierte Antikörper, hält intakte Spermien und mit Antikörpern belegte intakte Spermien jedoch zurück. So können Antikörper und markierte Antikörper ungehindert von einem Streifen in den nächsten strömen, Spermien bleiben jedoch auf der Reagenzienschicht als erstem Streifen zurück und treten im Überlappungsbereich nicht in den zweiten Streifen über. Sie stehen deshalb weiterhin für die Messung in der Testzone zur Verfügung, so daß ein genaueres Messergebnis erhalten wird.

Hierzu trägt auch bei, dass im Überlappungsbereich eine ein spermienspezifisches Oberflächenantigen bindende Substanz, vorzugsweise eine ein im akrosomalen Bereich vorhandenes, spermienspezifisches Oberflächenantigen bindende Substanz und ganz besonders bevorzugt eine das Oberflächenantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bindende Substanz auf wenigstens einem Streifen immobilisiert und im feuchten Zustand nicht beweglich ist.

Zur exakten Probenabgabe, sprich zur Steigerung der Genauigkeit des Fertilitätstests besitzt dieser in einer erweiterten Bauform eine Dosiervorrichtung. Ferner ist ein Fertilitätstest besonders schnell durchgeführt, wenn er am stromabwärtigen Ende der Reagenzienschicht oder am stromabwärtigen Ende jedes Streifens ein Saugkissen aufweist. Dann nämlich wird die ohnehin in der Reagenzienschicht vorhandene Kapillarwirkung noch durch eine zusätzliche Sogwirkung unterstützt. Ein derartiges Saugkissen besteht aus einem Material mit großer Oberfläche und großen Poren, d.h. aus einem Polymerschaum oder einem großporigen Faservlies.

Ein weiterer wesentlicher Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Fertilität eines männlichen Lebewesens mit einem Fertilitätstest, der sich erfindungsgemäß dadurch auszeichnet, daß eine Ejakulatprobe während einer bestimmten Verweilzeit inkubiert wird, ein Teil dieser Probe auf die Verteilerschicht oder auf die Reagenzienschicht des Fertilitätstests aufgebracht wird, der Fertilitätstest während einer vorgebbaren Zeit inkubiert wird und durch Abzählen der sich auf dem Fertilitätstest ausbildenden Anzahl von Farbbanden die Menge an in der Ejakulatprobe vorhandenen Spermien bestimmt wird. Hierdurch wird der Anwender in die Lage versetzt, sehr genau festzustellen, ob er zeugungsfähig ist oder nicht und das Ganze ohne ärztliche Hilfe.

Ihm kommt es auch entgegen, seine Ejakulatprobe bei Raumtemperatur zu inkubieren. Dies geschieht gewöhnlich während einer Verweilzeit von 2 bis 30 Minuten, vorzugsweise von 10 bis 25 Minuten, in einer ausgewählten Ausführungsform von 13 bis 22 Minuten und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform von 15 bis 20 Minuten. Die Zeit ist vorteilhafterweise so gewählt, daß es einerseits zu einer Spermaverflüssigung kommt, andererseits jedoch Abbauprozesse an den Spermien, insbesondere das Absprengen der Akrosomenkappe noch nicht stattfinden.

Der zu vermessende Teil der Probe beträgt 5 bis 500 μl, vorzugsweise 25 bis 250 μl und besonders bevorzugt 50 bis 100 μl. Diese Mengen bewirken, daß der Fertilitätstest schnell abläuft, ohne jedoch infolge zu geringer Mengen ein unsicheres Testergebnis zu erhalten.

Der Fertilitätstest wird während einer vorgebbaren Zeit durch Einstellen in ein Fließmittel oder durch Aufbringen eines Fließmittels inkubiert, welche 2 bis 15 Minuten beträgt, vorzugsweise 4 bis 12 Minuten und besonders bevorzugt 6 bis 10 Minuten. Dabei ist das Fließmittel entweder die Probenlösung selbst oder aber eine weitere Flüssigkeit, die in der Lage ist, den Fertilitätstest zu durchströmen. Jedenfalls braucht es die beanspruchte Zeit, um einen Durchritt der Messprobe durch den Fertilitätstest zu erreichen.

Erfindungswesentlich ist zudem, die Ejakulatprobe niedrigviskos zu machen, beispielsweise durch Zugabe von Dithiothreitol, sofern eine sehr liquide Probe benötigt wird.

En weiterer Aspekt der Erfindung beansprucht die Verwendung eines Fertilitätstest zur Diagnose der Fruchtbarkeit männlicher Lebewesen, vorzugsweise männlicher Säuger und besonders bevorzugt von Männern bzw. die Verwendung zur Diagnose von Fehlbildungen in Spermien und deren Bestandteilen.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung. Es zeigt:

Fig. 1 Eine Draufsicht auf einen Fertilitätstest

Ein Fertilitätstest 1 nach der Erfindung dient dazu, die Anzahl an Spermien in einer Ejakulatprobe zu bestimmen und somit vorherzusagen, ob mit der Befruchtung einer Eizelle zu rechnen ist. Er besteht in einer ersten Basisvariante aus einer Reagenzienschicht 2 und einem Trägerkörper 4. Letzterer stützt und stabilisiert die Reagenzienschicht 2, indem er sie in ihrer Dicke verstärkt oder aber umfangsseitig umgibt. Am stromaufwärtigen Ende der Reagenzienschicht 2 sind gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen, vorzugsweise gegen die auf Spermien vorhandene Variante des Proteins ABCG2 gerichtete Antikörper auf die Reagenzienschicht 2 aufgebracht. Diese sind im trockenen Zustand ortsfixiert, beim Auftragen von Flüssigkeit jedoch entlang der Reagenzienschicht 2 beweglich. Sie sind mit Teilchen konjugiert, die farbig sind oder aber in der Lage sind, ein Farbsignal zu erzeugen. Stromabwärts besitzt die Reagenzienschicht 2 eine Testzone 10 mit Teilflächen A, B und C. Jede dieser Teilflächen A, B, C enthält ein ortsfixiertes Mittel, mit dem ein Komplex aus Oberflächenantigen und Antikörper innerhalb der Teilfläche festgehalten wird. Die einzelnen Teiifiächen A, B, C enthalten unterschiedliche Mengen des Mittels, so dass in jeder Teilfläche nur eine bestimmte Menge des Komplexes aus Oberflächenantigen und Antikörper gebunden wird. Diese Menge ist umso größer, je weiter die Teilfläche stromabwärts angeordnet ist. Zum Betätigen des erfindungsgemäßen Fertilitätstests 1 bringt man eine ausreichend flüssige Ejakulatprobe als Probenflüssigkeit am stromaufwärtigen Ende des Tests 1 auf die Reagenzienschicht 2 auf. Diese (Probe) strömt in Folge Kapillarwirkung oder durch die Gravitationskraft getrieben in die auch als Reaktionsschicht bezeichnete Schicht 2 bzw. auf ihr entlang. Spermien einer Probenlösung binden mit ihrem Oberflächen- antigen an die mit farbigen oder farbgebenden Teilchen versehenen Antikörper und bilden den Komplex. Dieser strömt weiter stromabwärts in die Teilfläche A. Sind in der Ejakulatprobe wenigstens so viele Spermien enthalten, dass eine Zellenzahl von kleiner 2 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit vorliegt, entsteht in der Teilfläche A ein Sandwich aus Komplex und ortsfixiertem Mittel. Dieses Sandwich ist in einer Grundausführung optisch erkennbar und zeigt an, daß die Ejakulatprobe weniger als zwei Zellen pro nl enthält.

Sofern die Spermienkonzentration in der zu vermessenden Ejakulatprobe bei oder oberhalb von 2 Zellen/nl liegt, kann das in Teilfläche A immobilisierte Mittel die Komplexe aus Oberflächenantigen (vorzugsweise spermienspezifisches ABCG2) und Antikörper nicht mehr vollständig einfangen, weil die Mittelmenge in Teilfläche A dazu nicht ausreicht.

Die nicht eingefangene oder überschüssige Menge an Komplex strömt auf der Reagenzienschicht 2 stromabwärts in die Teilfläche B. Diese enthält ebenfalls unlösbar gebundene Mittel, jedoch in einer Menge, die soviel spermienspezifisches Oberflächenantigen bindet, wie es in einer Ejakulatprobe vorhanden ist, die 2 bis 18 Spermienzellen pro nl Probenflüssigkeit enthält. In einer verfeinerten Ausführung entspricht die Menge an Mittel einem Konzentrationsbereich von 2 bis 10 Zellen pro nl Ejakulat und in einer noch feiner abgestimmten Variante von 2 bis 5 Zellen pro Nanoliter Meßprobe. In Teilfläche B bleiben in der Grundbauform Spermien bis zu einer Konzentration von 18 Zellen/nl zurück und an deren Zelloberfläche haftende, vorzugsweise an deren Oberflächenantigen ABCG2 gebundene Antikörper werden somit an einem Ort aufkonzentriert. Hierdurch entsteht eine zweite Linie auf oder im Fertilitätstest 1 , die in einer Basisausführung unmittelbar sichtbar ist.

Zwei Linien auf dem Fertilitätstest geben an, daß die Ejakulatprobe wenigstens soviel oberflächenspezifisches Antigen enthält, wie es in einer Probe mit wenigstens 2 Spermienzellen/nl enthalten ist und mit höchstens 20 Zellen pro Nanoliter. Das auf weniger als zwei Spermienzellen/nl enthaltene Antigen erzeugt ein Signal in Teilfläche A und das auf bis zu 18 weiteren Spermatozoen pro Nanoliter vorhandene Oberflächenantigen erkennt man in Teilfläche B.

Enthält die Meßprobe mehr als 20 Spermien pro Nanoliter, können diese nicht vollständig in den Teilflächen A und B gebunden werden. Der überschüssige Anteil strömt auf der Reaktionsschicht 2 weiter stromabwärts in Teilfläche C, in der ein Überschuß an Mitteln vorhanden ist. Diese Mittel binden alle überschüssigen Komplexe aus Spermium, sprich spermienspezifischem Oberflächenantigen und Antikörper. Weil letzterer in einer Grundausführung farbmarkiert ist, entsteht auch in Teilfläche C der Testzone eine gefärbte Linie.

Ein Fertilitätstest 1 mit drei Linien zeigt dem Anwender mithin an, daß seine untersuchte Ejakulatprobe mehr als 20 Spermienzellen/nl Messprobe enthält. Diese Spermien verfügen auch über eine hinreichende Fähigkeit zur Befruchtung einer Eizelle, denn sie besitzen eine hierfür erforderliche ausreichende Mobilität. Wäre letztere nicht vorhanden, hätte die Spermien sich nicht bis in Teilfläche C des Fertilitätstests aktiv fortbewegt und es wäre keine oder eine schwächere Farblinie nachgewiesen worden.

Eine zweite Basisvariante des Fertilitätstests 1 ist nahezu baugleich zu der ersten. Jedoch befinden sich auf der Reagenzienschicht 2 - anstelle der gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen gerichteten Antikörper - stromaufwärts der Testzone 10 Oberflächenantigene nach der Erfindung, die eine Gruppe tragen, welche farbig ist oder ein Substrat in eine optisch erkennbare Substanz umsetzt.

Beim Auftragen einer flüssigen Ejakulatprobe auf einen derartigen Fertilitätstest 1 bewegt diese sich auf der Reagenzienschicht 2 stromabwärts und reißt auf ihrem Weg in Richtung Testzone 10 die aufgetrockneten und in feuchtem Zustand beweglichen Oberflächenantigene mit. Diese gefärbten oder zur Anfärbung geeigneten, sprich markierten Oberflächenantigene (vorzugsweise bestehend aus spermienspezifischem markiertem ABCG2) mischen sich mit den Spermatozoen. Somit liegt eine Mischung von auf Spermien vorhandenem also nicht markiertem Oberflächenantigen und freiem markierten Oberflächenantigen vor.

Diese Mischung strömt zunächst in die Teilfläche A der Testzone 10. Die dort fixierten und in feuchtem Zustand nicht beweglichen Mittel binden sowohl freies markiertes Oberflächenantigen als auch das auf Spermien vorhandene unmarkierte Oberflächen- antigen. Handelt es sich bei der Markierung wie in der nachfolgend beschriebenen Grundbauform um eine farbige Markierung des Oberflächeantigens, so zeigt ein sich bildendes Farbsignal in Teilfläche A der Testzone 10 an, daß die Meßprobe eine Menge an Oberflächenantigen enthält, die einer Spermienkonzentration von weniger als zwei Zellen pro nl Probenflüssigkeit entspricht. Dann nämlich werden alle Bindungsstellen des Mittels ausschließlich mit farbmarkiertem Oberflächenantigen besetzt und Spermien mit unmarkiertem Oberflächenantigen binden in zu geringer Zahl, um diesen Farbeindruck in Teilfläche A kompetitiv zu verhindern.

Enthält die Meßprobe eine Menge an Oberflächenantigen, die einer Konzentration von 2 bis 18 Spermatozoen/nl Probenflüssigkeit entspricht, konkurrieren die Oberflächen- antigene der Spermien mit den auf der Reagenzienschicht 2 aufgetrockneten markierten Oberflächenantigenen um die an den Mitteln in der Teilfläche A der Testzone 10 vorhandenen Bindungsstellen. Nicht markierte Oberflächenantigene der Spermien erzeugen in Teilfläche A allerdings keinen Farbeindruck, so daß ein Ausbleiben des Signals in Teilfläche A dem Anwender anzeigt, daß seine Meßprobe Spermien in einer Konzentration von 2 bis 18 Zellen pro nl enthält.

Sofern die zu vermessende Probe mehr als 2 Spermatozoen pro Nanoliter Probenflüssigkeit enthält, konkurrieren Oberflächenantigene der Spermien mit markierten Oberflächenantigenen sowohl in Teilfläche A als auch in Teilfläche B um die Bindungsstellen der dort jeweils fixierten Mittel. Enthält die zu vermessende Probe mehr als 20 Spermien pro Nanoliter Messflüssigkeit, werden die in den Teilflächen A und B vorhandenen Mittel vollständig mit nicht markiertem Oberflächenantigen dieser Spermien abgesättigt und in beiden Teilflächen kommt es zu keinem Farbsignal. Somit zeigt das Ausbleiben eines Farbsignals in den Teilflächen A und B der Testzone 10 des Fertilitätstests 1 eine Meßprobe an, deren Spermiengehalt größer gleich 20 Zellen pro nl ist.

Mithin bedeuten drei Farblinien auf dem Fertilitätstest 1 , daß die untersuchte Ejakulatprobe weniger als zwei mit Oberflächenantigen versehene Spermien pro nl Probenlösung enthält, zwei Linien zeigen an, daß die Ejakulatprobe von 2 bis weniger als 20 Zellen pro nl Messprobe aufweist und 1 Linie in Teilfläche C gibt an, daß 20 Spermatozoen und mehr in einem Nanoliter Probenflüssigkeit vorhanden sind.

Die vorab genannten Testergebnisse werden besonders gut dann erzielt, wenn bei einer Konkurrenzreaktion zwischen markiertem Oberflächenantigen und unmarkiertem Spermienoberflächenantigen letzteres sich in jedem Fall kompetitiv gegen das markierte Oberflächenantigen durchsetzt. Dies ist besonders dann der Fall, wenn die Spermatozoen der Meßprobe die Teilflächen A₁ B und C der Testzone 10 vor dem markierten Oberflächenantigen erreichen und bereits an die dort vorgesehenen Mittel binden. Dann bleiben für die Bindung des markierten Oberflächenantigens nur noch Mittel, die nicht bereits mit dem auf den Spermienzellen vorhandenen Oberflächenantigen abgesättigt sind.

Deshalb sieht eine Erweiterung der zweiten Basisvariante des Fertilitätstests 1 vor, das markierte Oberflächenantigen als Suspension bzw. Lösung in einem Fläschchen oder aber in einer Verteilerschicht 6 aufgetrocknet vorzuhalten. Diese befindet sich am stromaufwärtigen Ende der Reagenzienschicht 2 oder aber stromabwärts des stromaufwärtigen Endes jedoch stromaufwärts der Testzone 10. In einer Ausgestaltung ist die Verteilerschicht 6 ein abgeschlossenes Kompartiment, das erst nach Öffnung mit einem in der Verteilerschicht 6 vorgesehenen Dorn oder durch von außen aufgebrachten mechanischen Druck mit der Reagenzienschicht 2 in Fließkontakt tritt und das markierte Oberflächenantigen an die Reagenzienschicht 2 abgibt.

Bei einer solchen Erweiterung gibt man zunächst die Messprobe auf die Reagenzienschicht 2 auf und wartet ab, bis sie diese in Richtung Testzone 10 durchströmt hat. Als nächstes bringt man auf die Verteilerschicht 6 eine Pufferlösung auf und eluiert die dort eingetrockneten markierten Oberflächenantigene, die in Richtung Testzone 10 strömen. Alternativ hierzu gibt man auf die oberflächen- antigenfreie Verteilerschicht 6 gelöstes bzw. suspendiertes Oberflächenantigen auf, das ebenfalls in Richtung Testzone 10 strömt. In einer weiteren Alternative ist vorgesehen, das mit markiertem Oberflächenantigen versehene abgeschlossene Kompartiment der Verteilerschicht 6 mechanisch zu perforieren und hierdurch besagtes Antigen in die Testzone 10 zu befördern.

In jedem der vorab beschriebenen Fälle gelangt das markierte Oberflächenantigen erst nach den Spermien in die Testzone 10, was dazu beiträgt, beim kompetitiven Betrieb des erfindungsgemäßen Fertilitätstests 1 eine vergleichsweise hohe Präzision bei der Bestimmung eines spermienspezifischen Oberflächenantigens und insbesondere des spermienspezifischen ABCG2 zu erreichen. Dies ist auch dann der Fall, wenn die zu untersuchende Probe 2 oder 20 Spermien pro nl enthält. Bei den Mitteln, die in den Teilflächen A, B und C vorhanden oder immobilisiert sind, handelt es sich um Effektorteilchen oder im Fall der Teilfläche C um größenreduzierte Poren bzw. Schmalporen innerhalb der Reagenzienschicht 2.

Unter dem Begriff Effektorteilchen sind alle Entitäten zu fassen, die in der Lage sind, an ein spermienspezifisches Oberflächenantigen zu binden. Bevorzugt fallen hierunter Antikörper, die sich an ein Oberflächenantigen im akrosomalen Bereich der Spermien anlagern. Weil dieser Bereich eine labile Spermienregion darstellt und bei vielen nicht mehr fertilen Spermien bereits beschädigt oder abgesprengt ist, zeigt ein im Akrosomenbereich sich anlagernder Antikörper intakte und daher mit hoher Wahrscheinlichkeit fertile Spermien an. Davon ist jedenfalls dann auszugehen, wenn der Antikörper gegen das auf Spermien insbesondere Humanspermien im akrosomalen Bereich vorhandene Oberflächenantigen ABCG2 gerichtet ist.

Unter den Begriff Effektorteilchen fallen sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper, solange sie ein Oberflächenantigen wie vorab definiert als Target haben. Ferner sind darunter gegen das Oberflächenantigen gerichtete Antikörperfragmente wie das F_c-Fragment oder eines oder beide F(ab)-Fragmente zu verstehen. Schließlich lassen sich auch eine oder mehrere der leichten oder schweren Ketten eines gegen das Oberflächenantigen gerichteten Antikörpers, beispielsweise die variablen leichten Ketten oder die variablen schweren Ketten oder aber einzelkettige Antikörper unter den Begriff Effektorteilchen fassen.

Unter den Begriff Effektorteilchen fallen auch Proteine, Enzyme, die keine Peptidbindungen von Oberflächenantigenen spalten, Liganden wie Biotin und Streptavidin, Lectine, Aptamere sowie Polymere, sofern sie in der Lage sind, gezielt an ein spermienspezifisches Oberflächenantigen vorzugsweise im Akrosomenbereich und insbesondere an ABCG2 zu binden.

Schmalporen sind all diejenigen Poren auf der Reagenzienschicht 2, die Spermien mit Oberflächenantigen zurückhalten. Ferner fangen sie auch den Komplex aus Spermium mit Oberflächenantigen und konjugiertem Antikörper, sprich Antikörper, an den ein farbiges oder Farbe erzeugendes Teilchen gebunden ist, ein und hindern ihn am weiteren Durchströmen der Reagenzienschicht 2. Freie konjugierte Antikörper halten die Schmalporen jedoch nicht zurück. Schmalporen bzw. größenreduzierte Poren befinden sich auf der Reagenzienschicht 2 ausschließlich in Teilfläche C.

Liegen in einer Meßprobe Spermien mit Oberflächenantigen in einer Menge vor, die einer Spermienkonzentration von mehr als 20 Zellen pro nl entspricht, so werden sie nur teilweise in den Teilflächen A und B des Fertilitätstests 1 am Weiterströmen gehindert. Ein Teil gelangt entweder in freier Form oder an konjugierte Antikörper gebunden in die Teilfläche C. Diese Teilfläche besitzt Schmalporen oder immobilisierte spermienspezische, vorzugsweise gegen akrosomale Oberflächenantigene gerichtete Effektorteilchen, die die weitere Fortbewegung von Spermien oder eines Komplexes aus Spermium und an sein Oberflächenantigen gebundenem farbmarkiertem Antikörper unterbinden. Mithin konzentrieren sich alle Komplexe, die die Teilfläche A und die Teilfläche B passiert haben, in Teilfäche C, um dort eine optisch wahrnehmbare Linie zu erzeugen. Nicht an Spermien gebundene konjugierte Antikörper fließen weiter stromabwärts und können das Messergebnis in Teilfläche C deshalb nicht verfälschen.

Oberflächenantigene nach der Erfindung sind all diejenigen Antigene, die sich auf der Oberfläche eines Spermiums sprich auf oder in seiner Plasmamembran befinden. Sie können auch auf bzw. in der äußeren akrosomalen Membran angeordnet sein, sofern die Plasmamembran des Spermiums beschädigt, der Akrosomenbereich jedoch noch nicht abgesprengt oder zerstört ist.

Bevorzugt ist das Oberflächenantigen nach der Erfindung nur im akrosomalen Bereich des Spermiums vorhanden. Intakte fertile Spermien verfügen noch über ein Akrosom oder eine Akrosomenkappe, die infolge von pH-Änderungen oder lytischen Ereignissen leicht verloren gehen kann. Weil das Akrosom jedoch Enzyme enthält, die ein Eindringen des Spermiums in die Eizelle erst ermöglichen, beim Fehlen dieses Organells die Befruchtung der Eizelle mithin nicht mehr stattfindet, ist die Wahrscheinlichkeit, fertile intakte Spermien nachzuweisen, recht hoch, sofern ein lediglich im akrosomalen Bereich vorhandenes Oberflächenantigen als zu detektierende Spezies herangezogen wird.

In einer besonders günstigen Ausgestaltung umfasst das Oberflächenantigen die auf Spermien vorhandene Variante des Proteins ABCG2. Sie besitzt nach SDS-PAGE ein Molekulargewicht von 51 KD. Dieses Protein befindet sich im akrosomalen Bereich des Spermiums und bildet sich erst zu einem späten Zeitpunkt der Spermatogenese. Es ist mithin ein guter Zeiger für ein vollständig ausgebildetes und funktionales Spermium. Unter das spermienspezifische Oberflächenantigen ABCG2 fallen neben der auf Humanspermien vorhandenen Spezies auch jene, die auf Hengstspermien, auf Bullenspermien, auf Eberspermien, auf Schaf- und Ziegenbockspermien, auf Rüdenspermien, auf Katerspermien sowie auf Kaninchen, Hasen, Maus- und Rattenspermien vorhanden sind.

In der ersten Basisvariante sind die auf der Reagenzienschicht 2 aufgetrockneten Antikörper an farbige oder farbgebende Teilchen konjugiert. Auch die in der zweiten Basisvariante verwendeten markierten Oberflächenantigene enthalten eine Gruppe, die farbig ist oder ein Substrat in eine optisch erkennbare Substanz umsetzt.

Allen Teilchen oder Gruppen ist gemein, daß sie eine Größe besitzen, die unterhalb der Porengröße der Reagenzienschicht 2 liegt. Nur so ist es möglich, eine ausreichende Durchströmung der Reagenzienschicht 2 mit Komplexen aus Oberflächenantigen und mit an Teilchen konjugierten Effektormolekülen, vorzugsweise Antikörpern zu erreichen. Effektormoleküle sind alle Moleküle, die einerseits auf der Reagenzienschicht 2 frei beweglich sind und andererseits ein Oberflächenantigen nach der Erfindung binden. Auch die markierten Oberflächenantigene, sprich die Oberflächenantigene, welche eine Gruppe tragen, die farbig ist oder ein Substrat in eine optisch erkennbare Substanz umsetzt, besitzen eine Größe, die geringer ist als jene der Poren der Reagenzienschicht 2.

Unter den farbigen bzw. farbgebenden Teilchen bzw. unter der farbigen bzw. farbgebenden Gruppe sind folgende Verbindungs- bzw. Stofffamilien zu verstehen:

Metallsole, also kolloidale Lösungen von feindispers, vorzugsweise monodispers gelösten Metallteilchen. Diese umfassen Gold- genauso wie Silber-, Platin- oder Kupferteilchen, binden bereitwillig an Antikörper und stellen mithin farbgebende Teilchen oder farbgebende Gruppen dar. Gleiches gilt für Kohlepartikel. Alle Partikel haben bevorzugt eine Größe von 40 bis 60 nm.

Farbteilchen oder -partikel wenigstens eines der nachfolgenden Farbstoffe; Coomassie Brillant-Blau, Kongorot, Malachitgrün, Fuchsin, Kristallviolett, Benzaurin, Phenolphthalein, Fluorescein und weitere Fluoreszenzfarbstoffe, wie Rhodamine, beispielsweise Rhodamin 123, Allophycocyanin, Phycoerythin, Erythrosin, Europian, Luminol, Luciferin und Cumarine, Phosphoreszenzfarbstoffe, Eosin, Propidiumiodid, Methylorange, Alizaringelb, Hematoxylin, verschiedene Toluidine, Azur B, auch bekannt unter dem Namen Methylenazur oder N.N.N'-Trimethylthionin, Methylgrün oder Parisgrün auch Heptamethyl-p-Rosanilinchlorid, bzw. Ethylgrün, Basic Blue 20, Doppelgrün SF, Double Green SF, Hoffmann's Grün, Grünpulver, Vert Lumiere, Vert de Paris, Vert Etincelle, Methyl Green-Zinkchlorid Salz, Foron Blau SRP, Resolin Blau BBLS, Anthrachinon, Palanil Violett 6R₁ Palanil Gelb 3G, Palanil Leuchtgelb G, Palanil Leuchtrot G₁ Terasil Brilliant Flavin 8GFF, Terasil Brilliant Pink 4BN, Cibacet Violett 2R, Foron Brilliant Flavin S8 GF, Resolin Brilliant Blau RRL, Procinyl Blau R, Samaron Brilliant Rot H6GF, Samaron Brilliant Gelb MOGF, Samaron Brilliant Orange HFR, Samaron Violett HFRL, Tetrabromophenol, Thiazinblau, Acridinorange und Chlortetrazykline.

Auch erfindungsgemäße Enzyme sind farbgebende Teilchen bzw. Gruppen, die ein Substrat in eine optisch erkennbare Substanz, meist in einen Farbstoff umsetzen, also in der Lage sind, ein Farbsignal zu erzeugen. Sie sind entweder kovalent mit dem Effektorteilchen vorzugsweise dem Antikörper verbunden oder aber an ein Polymer adsorbiert, das mit dem Antikörper chemisch verbunden ist. Zu den Enzymen zählen Dehydrogenasen, Ureasen, Peroxidasen, Phosphatasen oder Galactosidasen. Beispiele sind Meerretichperoxidase, alkalische Phosphatase oder ß-Galactosidase. ß- Galactosidase hydrolisiert das Substrat X-GaI (5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-ß-D- galactopyranosid) in Galactose und einen blauen wasserlöslichen Indigofarbstoff. Alkalische Phosphatase wandelt das Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP, X-Phos) in Gegenwart von Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) ebenfalls in einen blauen Indigofarbstoff um. Ein weiteres Enzymsubstrat ist 2,2-Azino-Di-(3- Ethylbenzthiazolene sulphonsäure), ABTS.

Ferner fallen unter die farbgebenden Teilchen farbmarkiertes Protein A, farbmarkiertes Biotin, Histidin oder farbmarkiertes Streptavidin.

Alle diese Farbstoffe oder farbgebenden Teilchen lagern sich entweder direkt als Solpartikel an die Antikörper an oder aber sie werden an Trägerpartikel adsorbiert, die ein SoI bilden und mit dem Antikörper eine Bindung eingehen.

Als Trägerpartikel eignen sich alle Teilchen, die so klein sind, daß sie die Poren der Reagenzienschicht 2 mühelos passieren können. Besonders bevorzugt sind Latexpartikel verschiedener Korngröße, die mit einer der Farbstoffe angefärbt sind. Weiterhin finden dispergierfähige, vorzugsweise monodisperse Teilchen wie Kügelchen, Liposomen und Mikropartikel Anwendung. Zu ihnen zählen Zelluloseperlen, Kieselsäureteilchen, Glaskügelchen mit definierter Teilchengröße, magnetische oder magnetisierbare Sepharose oder Sephadex-Teilchen, Stärke- und Kollagenaggregate oder PVC-Biobeads. Schließlich lassen sich auch um ein Antigen aggregierte polyklonale Antikörper als Trägerpartikel für Farbstoffe oder farbgebende Teilchen verwenden. Diese sind einerseits mit dem Antikörper, andererseits mit dem Farbstoff oder farbgebenden Teilchen in Kontakt.

Der Fertilitätstest 1 besteht aus einer Reagenzienschicht 2 und einem Trägerkörper 4. Seine Funktionalität wird durch die Verteilerschicht 6, eine Filterschicht 8 und ein Saugkissen erweitert bzw. vergrößert.

Die auch als Reaktionsschicht bezeichnete Reagenzienschicht 2 ist aus einem durchströmbaren Material gebildet, auf dem oder durch welches die auf den Fertilitätstest 1 aufgegebene Meßprobe in Richtung Teilfläche A, Teilfläche B und dann Teilfläche C fließt. Es besitzt zumindest in weiten Bereichen eine Porenweite, die ein uneingeschränktes Durchströmen von Spermienzellen und von Komplexen aus Spermienzellen und konjugiertem Antikörper gestattet. Gleichsam sind Oberflächen- antigene nach der Erfindung, die eine Gruppe tragen, welche farbig ist oder ein Substrat in eine optisch erkennbare Substanz umsetzt, sprich markierte Oberflächen- antigene, in der Lage, die Reagenzienschicht 2 ungehindert zu durchströmen und nicht zuletzt markierungsfreie Oberflächenantigene.

Die Schicht 2 besteht aus einem Fließmaterial, nämlich einem Flächenmaterial oder Raummaterial aus Nitrocellulose, Celluloseacetat, Polyvinylidenfluorid (PVDF), hochdichtem Polyethylen (HDPE), Polypropylen, aus Glasfasern, Mikroglasfasem, aus Polyvinylchlorid, einem Polyamid, wie beispielsweise Nylon oder anderen porösen Polymeren, die die vorab genannten Permeationsbedingungen erfüllen. Bewährt haben sich auch Kombinantionsprodukte wie das Multifunktionspapier Fusion 5™ von Whatman.

Bei der Reagenzienschicht 2 handelt es sich nicht nur um ein Flächenmaterial niedriger Dicke, vergleichbar mit einem Bogen Papier, sondern auch um ein Raumgebilde bestehend aus einem dreidimensionalen Netzwerk einer Porensubstanz. Dieser netzwerkartigen dreidimensionalen Porensubstanz gehören neben den oben bereits genannten, nicht nur flächig sondern auch in sphärischer oder Teilchenform vorliegenden Verbindungen auch Schichtmaterialien wie Sephadex und Sepharose, Agarose, SM-Biobeads, retikuliertes Polyacrylamid, verschiedene Arten von Kieselsäure oder pyrrolysierter Kieselsäure sowie Aluminiumhydroxid in unterschiedlicher Dichte und Korngröße an. Ferner lassen sich unter diese Porensubstanz auch Schäume, wie Polystyrolschaum, Polyurethanschaum, EIM-Schaum, Polyamidschaum, Polyacrylnitrilschaum, Polyethylenterephthalat- sowie Polybutylenterephthalatschaum und PVC-Schaum fassen.

Unterteilen läßt sich die Reaktionsschicht 2 in einen Bereich für den Probenauftrag, in einen sich daran stromabwärts anschließenden Fließbereich, in die Testzone 10 mit den Teilflächen A, B und C und in einen Auslauf bereich. Die Teilflächen A, B, C sind in der Testzone 10 voneinander beabstandet.

Jede Teilfläche A, B, C enthält immobilisierte Mittel, mit denen eine definierte Menge an erfindungsgemäßem Oberflächenantigen festgehalten wird. Teilfläche A enthält immobilisiertes Mittel in einer Menge, die soviel Oberflächenantigen bindet, wie es auf weniger als 2 Spermienzellen/nl Probenflüssigkeit vorhanden ist. Teilfläche B enthält soviel Mittel, wie nötig ist, um Oberflächenantigen in einer Messprobe mit 2 bis 18 Zellen pro nl Probenflüssigkeit nachzuweisen. Teilfläche C schließlich enthält so viel Mittel, daß Oberflächenantigen in einer Menge nachgewiesen wird, die mehr als 20 Spermatozoen pro nl Probenlösung entspricht. Weil das erfindungsgemäße Oberflächenantigen direkt oder indirekt mit einem farbigen oder Farbe gebenden Teilchen verbunden ist, läßt sich anhand eines Linienprofils aus eins bis drei farbigen Linien schnell und recht sicher erkennen, ob eine Spermienprobe infertil, vielleicht fertil oder sehr wahrscheinlich in der Lage ist, eine Eizelle zu befruchten.

Enthält eine Messprobe soviel Oberflächenantigen (vorzugsweise ABCG2), wie auf weniger als zwei Spermien pro Nanoliter Probenlösung vorhanden ist, so bildet sich nur in Teilfläche A eine Linie aus, sofern der Fertilitätstest nach dem Sandwichprinzip aufgebaut ist, bei dem das Oberflächenantigen von einem ersten Antikörper mit Farbmarkierung oder Farbanzeiger und von einem Effektorteilchen gebunden wird. Funktioniert der Fertilitätstest nach dem kompetitiven Prinzip, konkurrieren Oberflächenantigene der Spermien mit auf der Reagenzienschicht aufgetrockneten farbmarkierten Oberflächenantigenen und es kommt ebenfalls zu einem Farbsignal in Teilfläche A und zusätzlich in Teilfläche B und Teilfläche C. In beiden Fällen muß der Farbeindruck nicht unmittelbar entstehen, sondern man kann ihn auch dadurch erreichen, daß im Anschluß an die Probenlösung eine Lösung mit einem der oben genannten Substrate aufgegeben wird. Dieses strömt an den an das Oberflächen- antigen gebundenen Antikörper, der mit einem der genannten Enzyme konjugiert ist und wird von letzterem in einen Farbstoff umgewandelt.

Bei einer Konzentration von fertilen Spermien in der Messprobe, die einer Zellenzahl von 2 bis 20 Spermien pro nl Meßprobe entspricht, entsteht mit dem Sandwichverfahren in Teilfläche A und in Teilfläche B eine farbige Linie, nicht jedoch in Teilfläche C. Nach dem kompetitiven Prinzip erscheint eine Linie in Teilfläche B und Teilfläche C, nicht aber in Teilfläche A.

Enthält die flüssige bzw. verflüssigte Ejakulatprobe als Probenlösung soviel oberflächenspezifisches Spermienantigen (das sich vorzugsweise im Akrosomen- bereich befindet und besonders bevorzugt ABCG2 ist), daß es einer Menge von mehr als 20 Spermien pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht, erkennt man drei Linien auf dem Fertilitätstest nach dem Sandwichprinzip, d.h., eine in jeder der Teilflächen A₁ B und C. Bei der zweiten Variante des Fertilitätstests 1 , die nach dem kompetitiven Prinzip funktioniert, verdrängen Oberflächenantigene, die sich auf mehr als 20 Spermienzellen pro Nanoliter Probenlösung befinden, markierte Oberflächenantigene in den Teilflächen A und B und teilweise auch in C, so daß fehlende Linien in den Teilflächen A und B eine fertile Spermienprobe anzeigen.

Auf der Reagenzienschicht drei Teilflächen A, B, C mit einer angepassten Menge an Mittel zum Nachweis von Antigen zu immobilisieren, ist wesentlich für einen schnell ablesbaren und aussagekräftigen Fertilitätstest nach der Erfindung. Ferner ist es wesentlich, daß die Menge an immobilisiertem Mittel zunimmt, je weiter sich eine Teilfläche stromabwärts auf der Reagenzienschicht 2 des Fertilitätstests 1 befindet. Dessen Präzision ist nochmals erhöht, wenn die Teilfläche A, in der erfindungsgemäß die kleinste Menge an Oberflächenantigen nachzuweisen ist, deutlich schmaler ausgebildet ist, als die stromabwärts zu ihr angeordneten Teilflächen B und C.

Sind die in der Teilfläche C zu immobilisierenden Effektorteilchen kostspielig, besteht eine preiswerte Ausführungsform des Fertilitätstests 1 darin, auf der Reagenzienschicht 2 Bereiche unterschiedlicher Porengröße vorzusehen. Dabei ist die Reaktionsschicht 2 entweder einstückig oder aber aus wenigstens zwei Schichtteilen gefertigt. In der Testzone 10 besteht die Teilfläche C der Reagenzienschicht 10 aus einem der oben genannten Materialien mit größenreduzierten Poren, auch Schmalporen genannt. Diese Schmalporen sind ein Mittel, Spermien und mit Antikörpern komplexierte Spermien zurückzuhalten, nicht an Spermien gebundene Antikörper oder markierte Antigene jedoch weiter stromabwärts strömen zu lassen. Mithin erreicht man ohne die Verwendung von Effektorteilchen, daß Spermien und mit farbmarkierten Antikörpern versehene Spermien in der Teilfläche C der Testzone 10 zurückgehalten werden und letztere dort eine farbige Linie bilden.

In einer Erweiterung der Erfindung sind die Schmalporen oder größenreduzierten Poren so dimensioniert, daß sie mit farbmarkierten Antikörpern versehene Spermien zurückhalten. Ferner halten sie solche Spermien zurück, die an einen Antikörper gebunden sind, der Teilchen trägt, die in der Lage sind ein Farbsignal zu erzeugen. Nicht markierte Spermien, d.h. Spermien, denen das antikörperspezifische Oberflächenantigen, vorzugsweise ein Oberflächenantigen aus dem akrosomalen Bereich und ganz besonders bevorzugt das Oberflächenantigen ABCG2 fehlt, durchströmen die Schmalporen jedoch, ohne zurückgehalten zu werden. Mithin gestattet es diese Erfindungserweiterung, in der die meisten Spermien nachweisenden Teilfläche C nur markierte, d.h. in der Regel intakte Spermien zu detektieren. Dies erhöht die Präzision und Aussagekraft des Fertilitätstests 1.

Man erreicht dies durch die aufeinander abgestimmte Dimensionierung von größenreduzierten Poren und Trägerpartikeln bzw. Farbteilchen. Die Poren sind so groß, daß unmarkierte Spermien durch sie hindurchströmen, an mit Trägerpartikeln oder Farbteilchen versehene Antikörper gebundene Spermien diese aber nicht mehr passieren. Anders ausgedrückt passiert ein nicht komplexiertes Spermium die größenreduzierten Poren der Teilfläche C, ein Komplex aus Spermium und markiertem Antikörper, sprich aus Spermium und mit Trägerpartikel oder Farbteilchen versehenem Antikörper jedoch nicht. Sind die Trägerpartikel oder die Farbteilchen deutlich größer als Spermium und Antikörper, so haben die größenreduzierten Poren eine Größe, die kleiner ist als die der Trägerpartikel oder der Farbteilchen.

Die in einer weitergeführten Ausführung des Fertilitätstests 1 am stromaufwärtigen Ende der Reagenzienschicht 2 vorgesehene Dosiervorrichtung besteht aus einer punktförmig aufgezeichneten Fläche, auf die eine vorher definierte Anzahl von Tropfen an Messprobe aufzugeben ist.

Um den Messkomfort des Fertilitätstests weiter zu erhöhen, besitzt die Reagenzienschicht 2 in einer Erweiterung eine Kontrollzone, die sich stromabwärts der Teilfläche C befindet. In einer Weiterleitung befindet sie sich zudem im Auslaufbereich der Reaktionsschicht 2. Die Kontrollzone enthält eine immobilisierte Substanz, die anzeigt, ob der durch die Probenflüssigkeit erzeugte Flüssigkeitsstrom die Kontrollzone erreicht. Hierbei handelt es sich um eine auf Feuchtigkeit mit Farbänderung reagierende Substanz wie beispielsweise Kupfersulfat oder Silikagel. Die gleiche Funktion erfüllen immobilisierte Speziesantikörper, die überschüssige konjugierte Antikörper oder markierte Oberflächenantigene binden.

Weiterhin läßt sich eine Messung mit dem Fertilitätstest nach der Erfindung in einer weiteren Ausgestaltung beschleunigen, indem die Reagenzienschicht 2 an ihrem stromabwärtigen Ende ein Saugkissen besitzt. Dieses Kissen besteht aus einem schwammartigen Material vorzugsweise aus einem Vlies oder aus einem stark adsorbierenden Medium und fördert den stromabwärts gerichteten Fluß der Messprobe.

Eine schnelle Fertilitätsbestimmung erreicht man zudem in einer Weiterführung der Erfindung, bei der am stromabwärtigen Ende der Reagenzienschicht 2 (beispielsweise in der Kontrollzone und/oder im Saugkissen) ein spermienattraktives Reagenz fixiert ist. In der Regel ist dies ein Geschmacksstoff und in einer fortentwickelten Ausführung ein Geschmacksstoff, der auch in der weiblichen Eizelle vorkommt.

In einer weiteren Fortführung des Fertilitätstest 1 ist die Reagenzienschicht 2 hydrophob, d.h., auf sie aufgebrachte Flüssigkeiten dringen nur beschränkt oder nicht in sie ein und bewegen sich stattdessen auf deren Oberfläche fort. Man versetzt sie hierzu mit Alkylierungsreagenzien oder Silylierungsreagenzien. Ein flüssigkeitsabweisender hydrophober Charakter wird auch erreicht, wenn die Reaktionsschicht 2 mit Proteinen abgesättigt wird und somit keine freien Bindungsstellen mehr für polare Spezies zur Verfügung stellt. In einer besonderen Ausgestaltung dieser Fortführung nimmt der hydrophobe Charakter in stromabwärtiger Richtung auf der Reagenzienschicht 2 ab. Dies bewirkt ein noch schnelleres Durchströmen der Schicht 2 in Richtung Testzone 10.

Die Verteilerschicht 6 als Erfindungserweiterung ist am stromaufwärtigen Ende der Reagenzienschicht 2 oder unweit davon haftend und unlösbar befestigt. Sie besteht aus wenigstens einem der Materialien, die für die Reagenzienschicht 2 Verwendung finden, ist jedoch dicker ausgeführt, als die plane Form der Reaktionsschicht 2. Ihr kommen sowohl Filter- als auch Saugeigenschaften zu. Deshalb ist sie in einer Erweiterung aus einem Vlies oder einem fasrigen Gewebe aufgebaut. In einer Abwandlung ist die Verteilerschicht 6 oberhalb der in diesem Fall dreidimensionalen vom Trägerkörper 4 umgebenen Reagenzienschicht 2 angeordnet- Die Schicht 6 besteht aus einem Adsorptionsmaterial ebenfalls ausgewählt aus den Stoffen, die für die Reagenzienschicht 2 vorgesehen sind.

In beiden Varianten besitzt die Verteilerschicht 6 eine Porengröße, die es Spermien ohne Probleme ermöglicht, durch sie hindurchzutreten. Größere Teilchen, wie beispielsweise verklumpte Spermien oder andere Zell- bzw. Proteinaggregate hindert die Verteilerschicht 6 jedoch am Durchtritt und übernimmt insoweit die Funktion eines Filters, der nur noch Spezies kleiner gleich einer testspezifischen Größe bis zur Reagenzienschicht 2 durchströmen läßt.

Zum leichteren und schnelleren Auftragen einer Meßprobe auf die Reagenzienschicht 2 bzw. auf die Verteilerschicht 6 verfügt wenigstens eine von ihnen über eine am stromaufwärtigen Ende ausgezeichnete Probenauftragszone. Diese besteht aus einem farblich markierten Feld oder aber aus einem freiliegenden d.h. nicht abgedeckten Teil der Reagenzienschicht 2 oder der Verteilerschicht 4.

Der Fertilitätstest 1 besitzt für bestimmte Ausgestaltungen einen Trägerkörper 4 als wichtiges Bauteil. Er ist rückseitig oder umfangsseitig der Reagenzienschicht 2 angebracht und unterstützt und stabilisiert die Reagenzienschicht 2.

Eine flächig sich erstreckende Reaktionsschicht 2 gewinnt durch den ebenfalls flächig ausgebildeten Trägerkörper 4, der in einer Ausgestaltung an der Unterseite der Reagenzienschicht 2 angebracht ist, erheblich an Stabilität. Der Trägerkörper 4 ist neben den oben bereits für die Reagenzienschicht 2 angegebenen Materialien auch aus einem Polyamid wie Nylon, aus Nitrocellulose, Celluloseazetat, Glasfasern oder anderen porösen Polymeren gebildet. Zu ihnen gehören auch Membranen aus Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylidenedifluorid sowie Glasfaser- und Glasfaser- Zellulosemischpapiere bzw. Platten.

In einer weiteren Ausgestaltung des Fertilitätstests 1 ist die Reagenzienschicht 2 vom Trägerkörper 4 nahezu vollflächig umgeben oder umhüllt. Dann nämlich hat letzterer die Form eines Röhrchens, Sticks oder Tauchstäbchens, eines Hohlquaders oder eines Hohlprismas, in den die Reagenzienschicht 2 eingestellt oder eingefüllt ist. Alle Formen des Trägerkörpers 4 nach dieser Ausgestaltung sind endseitig offen und bestehen aus einem transparenten Material wie Glas oder einem transparentem Kunststoff. Es sind u.a. Glas- und Plastikkapillaren, Strohhalme oder Pipetten. Um zu verhindern, dass mit Oberflächenantigen versehene Spermien der Probelösung oder aber Antikörper bzw. mit farbgebenden Teilchen versehene Antikörper am Trägerkörper 4 adsorbiert werden, ist dieser in einer Weiterführung der Erfindung mit wenigstens einem Stoff beschichtet, der dem Trägerkörper 4 eine hydrophobe Oberfläche verleiht. Dieser Stoff umfasst eine Verbindung, die hervorgegangen ist aus einem Reagenz ausgewählt aus der Gruppe der Alkylierungsreagenzien, Silylierungs- reagenzien, Alkylfuorierungsreagenzien oder der zumindest teilweise hydrophoben Peptide bzw. Proteine.

Der Trägerkörper 4 besitzt, sofern er aus einem nicht transparenten und die Reagenzienschicht 2 umhüllenden oder in ihrer Länge umschließenden Kunststoff gefertigt ist, mehrere Öffnungen oder transparente Fenster, durch die die Testzone 10 und die Kontrollzone sichtbar sind. Die Probenauftragszone der Reagenzienschicht 2 ist ebenfalls durch eine Öffnung im die Reagenzienschicht 2 vollständig umgebenden Trägerkörper 4 sichtbar und zugänglich.

In einer Weiterführung der Erfindung ist der Trägerkörper 4 ein luftdicht verschließbares Gehäuse in der Art eines Bechers mit Deckel. Dieser Becher besitzt einen Boden und einen Zwischenboden, ist also in die Räume A und B unterteilt. Zwischen Boden und Zwischenboden ist in Raum B eine zylindrische Röhre eingebracht, die an einer Seite offen ist. In diese zylindrische Röhre ist ein zylinderförmiger drehbarer Stopfen mit einer kleinen Öffnung eingepasst. In einer ausgewählten Stellung des Stopfens besteht eine Fließverbindung zwischen Raum A und Raum B, in allen anderen Stellungen des Stopfens sind beide Räume nicht miteinander in Fließkontakt. Der Bereich zwischen Boden und Zwischenboden, sprich Raum B steht mit der Reagenzienschicht 2 in Fließverbindung. Letztere steht auf dem Boden von Raum B auf.

Mit einem solchen Gehäuse lassen sich Messproben genau dosieren. Hierzu gibt man die vorzugsweise verdünnte Messprobe in Raum A des Bechers, so daß sie auf dem Zwischenboden aufliegt. Dann verschließt man den Deckel des Gehäuses luftdicht und dreht so lange an dem Stopfen, bis eine Fließverbindung zwischen Raum A und Raum B entsteht. Es fließt so lange Messprobe von Raum A nach Raum B, bis im luftdicht verschlossenen Raum A durch den Flüssigkeitsabfluß ein Unterdruck entsteht. Mithin gelangt mit dieser Vorrichtung eine definierte Probenlösungsmenge in Raum B und somit an den stromaufwärtigen Teil der Reagenzienschicht. Ein Fertilitätstest 1 mit einem derartigen Trägerkörper 4 ist ein Fertilitätstest mit einer Dosiervorrichtung.

In einer die Präzision des Fertilitätstests 1 weiter steigernden Ausgestaltung der Erfindung ist die Reagenzienschicht 2 mit einer Filterschicht 8 versehen. Diese befindet sich in einer ersten Variante auf der flächig ausgeführten Reagenzienschicht 2 zwischen dem stromaufwärtigem Ende und der Testzone 10. Die Schicht 8 besteht aus einem der oben für die Reagenzienschicht 2 genannten Materialien und besitzt eine gegenüber der Reagenzienschicht 2 unterschiedliche d.h. kleinere Porengröße. Durch die Poren dieser Schicht 8 können freie Antikörper genauso wie mit einem farb- gebenden oder farbigen Teilchen versehene Antikörper ungehindert hindurchströmen, nicht jedoch Spermatozoen bzw. Spermatozoen mit gebundenem Antikörper. Die Schicht 8 verfügt in einer Abwandlung zudem über Bindungssubstanzen, die in der Lage sind, bewegliche sowie bewegliche an ein farbiges oder farbgebendes Teilchen konjugierte Antikörper zu binden, sofern diese Antikörper nicht an ein auf Spermien vorhandenes Oberflächenantigen nach der Erfindung gebunden sind.

Bei einem nach dem Sandwichprinzip arbeitenden Fertilitätstest 1 strömt Probenlösung von der Probenauftragszone stromabwärts und reißt mobile mit einem Farbstoff oder einem farbgebenden Teilchen versehene und auf der Reagenzienschicht 2 aufgetrocknete Antikörper mit sich. Diese sind in einem zwei- bis zehnfachen Überschuß auf der Reagenzienschicht 2 aufgebracht, um auch bei großen Mengen an Spermien mit Oberflächenantigen in jedem Fall eine Bindung an alle vorhandenen Spermatozoen zu garantieren. Bei kleinen Mengen beweglicher Spermien liegt dementsprechend viel überschüssiger beweglicher Antikörper vor, der ein Messergebnis gerade in Teilfläche A beeinflussen kann. Auf dem Weg in die Testzone 10 strömen alle Teilchen an der Filterschicht 8 vorbei. Überschüssiger nicht an Spermatozoen gebundener Antikörper strömt entweder auf der Reagenzienschicht 2 weiter stromabwärts in die Testzone 10 oder aber in die Filterschicht 8. Hierdurch verdünnt sich die Menge an freiem beweglichen Antikörper, der in die Testzone 10 strömt und das in Teilfläche A erhaltene Messergebnis ist infolge dieser Verdünnung noch genauer. An Spermien gebundene Antikörper sind für die Poren der Filterschicht 8 zu groß und können von ihr deshalb nicht aufgenommen werden.

In einer zweiten Variante ist die Filterschicht 8 Teil eines röhrenförmigen Fertilitätstests 1. Sie besteht aus einem der Raummaterialien, die bereits für die Reaktionsschicht 2 oben angegeben sind. Sie ist beispielsweise in einem als Trägerkörper 4 dienenden Röhrchen oberhalb, d. h. stromaufwärts der Reagenzienschicht 2 und stromabwärts der Probenauftragszone angeordnet bzw. als Schicht eingebracht. Die Filterschicht 8 besitzt bei dieser Ausführungsform Poren, die für freie bzw. für mit einem Farbstoff oder mit farbgebenden Teilchen markierte Antikörper genauso wie für Spermien und mit Antikörpern versehene Spermien passierbar sind, größere Teilchen jedoch zurückhält.

Auf die Probenauftragszone dieser Form des Fertilitätstests 1 aufgetragene Meßprobe strömt in die Filterschicht 8. Alle Teilchen der Probe, die größer als mit farbmarkierten Antikörpern versehene Spermien sind, hält die Filterschicht 8 zurück und arbeitet somit als Teilchensieb für unreine Proben. Kleinere Teilchen, u.a. Spermien, Antikörper etc. strömen wie bereits beschrieben ungehindert weiter in die Testzone 10.

In einer Ausgestaltung der zweiten Variante hat der Trägerkörper 4 des Fertilitätstests 1 die Form eines T-Stücks mit einem langen Röhrenteil und einem seitlich an den langen Röhrenteil strömungsverbunden angebrachten Teilstück. Der lange Röhrenteil enthält die Reagenzienschicht 2 und ist von oben nach unten d.h. in Richtung der Gravitationskraft von der Probenflüssigkeit durchströmbar. Das Teilstück besteht aus einem der für den Trägerkörper 4 vorgesehenen Materialien und ist mit der Filterschicht 8, d.h. mit einem der für die Reagenzienschicht 2 verwendeten Raummaterialien vollumfänglich ausgefüllt. Diese Materialien besitzen eine Porengröße, die den Durchtritt von Spermien und mit Antikörpern markierten Spermien nicht gestattet, kleinere Teilchen jedoch ungehindert in das Teilstück eindringen läßt. Filterschicht 8 und Reagenzienschicht 2 grenzen unmittelbar aneinander an. In einer materialsparenden Fortführung der Erfindung besteht das Teilstück lediglich aus der Filterschicht 8, die durch eine Öffnung im Trägerkörper 4 in die Reagenzienschicht 2 eingeschoben ist.

Bringt man auf den Fertilitätstest 1 mit seitlich angeordneter Filterschicht 8 - d.h. auf den Fertilitätstest 1 in Form eines T-Stücks - Probenflüssigkeit auf, strömt sie in Richtung Testzone 10 und reißt auf ihrem Weg aufgetrocknete farbmarkierte Antikörper mit sich. Diese meist in einem zwei- bis zehnfachen Überschuß vorhandenen Antikörper können wegen ihrer hohen Konzentration bei sehr geringen Spermien- mengen im Ejakulat das Messergebnis insbesondere in Teilfläche A der Testzone 10 beeinflussen. Sind sie nicht an ein Spermium gebunden, strömt ein Teil von ihnen in die seitlich angeordnete Filterschicht 8 und dringt nicht mehr in die Testzone 10, also auch nicht in Teilfläche A. Diese seitlich zur Flußrichtung der Meßprobe angeordnete Filterschicht 8 bewirkt eine Verdünnung der farbmarkierten Antikörper und so lassen sich auch bei niedrigen Spermienkonzentrationen in Gegenwart von viel farbmarkierten Antikörpern unverfälschte präzise Messergebnisse erhalten.

In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung besteht der Fertilitätstest 1 aus wenigstens zwei Streifen, wobei einer der beiden Streifen der Reagenzienschicht 2 mit ihren Teilflächen A, B, C entspricht. Die Streifen überlappen in einem gemeinsamen Bereich, so daß der Fertilitätstest 1 die Form eines Kreuzes, eines T oder eine kreisförmig bzw. halbkreisförmig fächrig eingeschnittene Anordnung besitzt. Jeder nicht der Reagenzienschicht 2 entsprechende Streifen besitzt zumindest im Überlappungsbereich Poren, die kleiner als die der Reagenzienschicht 2 sind und den Durchfluß von Spermien nicht ermöglichen. Ferner besitzt er farbmarkierte Oberflächenantigene oder Antikörper mit konjugierten farbgebenden oder farbigen Teilchen. Sowohl Antigene als auch Antikörper sind stromabwärts des Überlappungsbereichs auf dem oder den Streifen aufgetrocknet, die auf dem als Reaktionsschicht 2 fungierenden Streifen aufliegen.

In einer erfindungswesentlichen Ausgestaltung überlappt jeder Teilbereich A, B, C der Testzone 10 des ersten Streifens mit einem weiteren Streifen, so daß im Ganzen vier Streifen den Fertilitätstest 1 bilden. Hierdurch ist es möglich, in jede Teilfläche A, B, C quantitativ und qualitativ unterschiedliche Mengen von markierten oder mit farbgebenden Teilchen versehene Antikörpern zu verbringen und somit die Intensität des farblichen Messergebnisses zu beeinflussen. Darüber hinaus läßt sich bei dieser Anordnung auf jeden nicht der Reagenzienschicht 2 entsprechenden Streifen ein anderer Antikörper oder ein farblich anders markierter Antikörper für das spermienspezifische Oberflächenantigen aufbringen. Dies erhöht die Ablesegenauigkeit des Fertilitätstests 1. Schließlich lassen sich in jedem Streifen gegen unterschiedliche spermienspezifische vorzugsweise aus dem Akrosomenbereich stammende Oberflächenantigene gerichtete markierte Antikörper einbringen, was ebenfalls die Genauigkeit des Fertilitätstests erhöht.

Im Überlappungsbereich sind auf der Reagenzienschicht 2 Mittel vorgesehen und immobilisiert, die ein Oberflächenantigen nach der Erfindung binden oder festhalten. Dabei handelt es sich entweder um gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen gerichtete Effektormoleküle oder um eine reduzierte Porengröße in Teilfläche C. Wenigstens einer der Streifen ist auf den Trägerkörper 4 aufgebracht oder von ihm umgeben. Im Überlappungsbereich der Streifen ist der Trägerkörper 4 des Streifens, der auf dem als Reagenzienschicht 2 fungierenden Streifen aufliegt, durchlässig für markierte oder konjugierte Antikörper. In einer weiteren Ausführung besitzt der auf dem als Reagenzienschicht 2 ausgebildeten Streifen aufliegende Streifen im Überlappungsbereich keinen Trägerkörper 4.

Im Übrigen besitzen die einzelnen Streifen des Fertilitätstestsi in unterschiedlicher Kombination die bereits für die Reaktionsschicht 2 erwähnten bzw. die sie umgebenden oder mit ihr verbundenen Teile.

Um einen aus wenigstens zwei Streifen bestehenden Fertilitätstest 1 mit einer Testzone 10 bestehend aus 3 Teilflächen A, B, C zu bedienen, gibt man zunächst Probenflüssigkeit auf die Probenauftragszone der Reaktionsschicht 2 auf. Diese strömt infolge Kapillarwirkung stromabwärts in die Testzone 10. Enthält sie Spermien mit spermienspezifischem Oberflächenantigen wie oben beschrieben, werden Spermien in Teilfläche A, in den Teilflächen A und B oder in den Teilflächen A, B und C durch die dort immobiliesierten Mittel zurückgehalten. Als nächstes gibt man auf den auf der Reagenzienschicht 2 aufliegenden Streifen eine Flüssigkeit, einen Puffer oder reines Wasser auf. Diese flüssige Phase reißt die auf dem Streifen aufgetrockneten markierten Antigene oder mit farbgebenden- oder aber Farbteilchen versehenen Antikörper mit sich und befördert sie in den Überlappungsbereich. Hier dringen die Antigene in die Testzone 10 der Reagenzienschicht 2 und binden in den Teilbereichen A, B und C an noch nicht durch spermienspezifische Oberflächenantigene abgesättigte immobilisierte Effektorteilchen. Sind auf dem auf der Reagenzienschicht aufliegenden Streifen anstelle von farbmarkierten Antigenen vorab genannte Antikörper aufgetrocknet, strömen auch diese in den Überlappungsbereich und von dort in die Testzone 10, um an dort bereits immobilisierte Spermien zu binden.

Probenflüssigkeit und konjugierte Antikörper bzw. an Farbteilchen oder farbgebende Teilchen gebundene Antigene auf getrennten Fließwegen und vorzugsweise nacheinander in die Testzone 10 gelangen zu lassen, hat den Vorteil, daß vorher keine Wechselwirkung zwischen Oberflächenantigen und mobilen Antikörpern bzw. Antigenen stattfindet und die Bindung in der Testzone erschwert oder verzögert. Ferner sind in den meisten Fällen Spermien bereits in der Testzone 10 gebunden und ausgerichtet und deshalb exponiert für konjugierte Antikörper bzw. für farbmarkierte Antigene. Bei einer Erweiterung bestehend aus insgesamt vier Streifen verfährt man mit der Messprobe wie vorab erwähnt. Als nächstes wird auf die die Teilflächen A₁ B, C überlappenden Streifen stromaufwärts Flüssigkeit aufgegeben. Diese löst die auf den einzelnen Streifen stromaufwärts des jeweiligen Überlappungsbereichs aufgetrockneten gegen das oder eines der Oberflächenantigene gerichteten Antikörper aus den einzelnen Streifen und befördert sie über die jeweiligen Überlappungsbereiche in die Teilflächen A, B₁ C der Testzone 10 des als Reagenzienschicht 2 fungierenden Streifens. Dort verbinden sie sich mit den bereits an die Effektorteilchen gebundenen und damit immobilisierten Spermien. Es entstehen je nach Anzahl der in der Messprobe vorhandenen Spermien eine, zwei oder drei Nachweislinien, die je nach gewähltem auf den einzelnen Streifen aufgetrockneten konjugierten Antikörper farblich unterschiedlich sind. Farblich unterschiedliche und damit besser unterscheidbare Testergebnisse lassen sich gleichsam erhalten, wenn im Rahmen eines kompetitiven Fertilitätstests 1 mit unterschiedlichen farbgebenden oder farbigen Teilchen versehene Antigene auf den nicht als Reagenzienschicht 2 fungierenden Streifen des Fertilitätstests 1 aufgetragen sind.

Ejakulat ist dickflüssig und kann nicht ohne weiteres einen Fertilitätstest 1 nach der Erfindung durchströmen. Es muß vorher in eine niedrig viskose Form gebracht werden. Hierzu ist nach der Erfindung eine Inkubation vorzugsweise zwischen 15 und 20 Minuten vorzusehen.

Alternativ läßt sich auch eine Verflüssigung durch Enzyme durchführen, solange diese Enzyme nicht die äußere Membran des Spermiums oder gar dessen Akrosomen- bereich schädigen oder verdauen. Geeignete Enzyme sind Chemotrypsin, Pronase, Trypsin, oder Amylase, die der Messprobe zugegeben oder in einer besonderen Ausführungsform auf der Probenauftragszone der Reagenzienschicht 2 aufgetrocknet sind. Neben den genannten Enzymen eignet sich auch Dithiothreitol in der vorab geschilderten Verwendungsweise zur Verflüssigung einer Ejakulatprobe.

Schließlich trägt zur Verflüssigung auch bei, daß die Reagenzienschicht 2 an der Probenauftragzone hydrophob ist, beispielsweise durch Silylierung oder Alkylierung.

In einer erweiterten Ausführung, die besonders bei dem luftdicht verschließbaren Gehäuse als Trägerkörper 4 zur Anwendung kommt, wird die Ejakulatprobe durch Zugabe von Pufferlösung nicht nur verflüssigt sondern verdünnt und damit in eine fließfähige Form überführt.

Als Inkubationsgefäße eignen sich Probenröhrchen mit Deckel, aber auch Kondome ohne Spermizide Wirkung.

Fertilitätstests nach der Erfindung lassen sich nach dem Flow-Through Prinzip und nach dem Lateral Flow Prinzip betreiben. Bei letzterem bewegt sich die inkubierte Messprobe horizontal infolge Kapillarwirkung durch die Reagenzienschicht 2. Nach dem Flow-Through Prinzip strömt Probenflüssigkeit senkrecht durch die Reagenzienschicht 2. Bei beiden Methoden ist eine Vorfiltration der Messprobe mittels der Filterschicht 8 oder der Verteilerschicht 6 nach der Erfindung durchführbar.

Als Immuno-Nachweisverfahren werden nach der Erfindung beim kompetitiven und beim Sandwichprinzip (s. o.) fluoreszierende an Antikörper gebundene Teilchen im Rahmen eines Fluoreszenzimmunoassys und oben genannte an Antikörper gebundene Enzyme stellvertretend für einen Enzymimmunoassy insbesondere einen ELISA ((enzyme linked immunosorbent assay) verwendet.

Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar. So lassen sich anstelle von 3 auch 4 oder mehr Teilfläche vorsehen, wenngleich dies die Handhabung jedoch schwieriger werden läßt.

Man erkennt, daß die Erfindung die Variante des auf Spermien vorhandenen Oberflächenantigens ABCG2 betrifft. Ferner betrifft sie Antikörper, die gegen ein Oberflächenantigen auf Spermien gerichtet sind, d.h. gegen ein Antigen, das sich auf der äußeren Membran oder einer von außen zugänglichen Membran des Spermiums befindet. Von außen zugänglich ist eine Spermienmembran nur, wenn hierfür das Spermium seinen Akrosomenteil nicht durch Beschädigung verliert, das Spermium also weitestgehend unversehrt bleibt. Weiterer Bestandteil der Erfindung ist ein Fertilitätstest 1 und ein Verfahren zu dessen Verwendung. Der Fertilitätstest 1 besteht aus einer Reagenzienschicht 2 mit einer Testzone 10 aus in ihrer Größe angepaßten Teilflächen A, B, und C, sowie einem in jeder dieser Flächen in vorgegebener Menge immobilisierten Mittel. Bei ihm handelt es sich um einen erfindungsgemäßen Antikörper oder um größenreduzierte Poren. Ferner umfasst der Fertilitätstest in einer weitergeleiteten Bauform einen Trägerkörper 4, in einer weiteren erfindungsgemäßen Ausgestaltung eine Filterschicht 8 mit reduzierter Porengröße und in einer zusätzlichen Weiterleitung besteht er aus wenigstens zwei Streifen, von denen einer die Reagenzienschicht 2 ist. Das Verfahren zur Betätigung des Fertilitätstests 1 umfasst die Inkubation einer Messprobe, Auftragen eines Aliquots davon auf den Fertilitätstest 1 , eine weitere Inkubation während einer vorgebbaren Zeit und anschließendes Ablesen.

Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.

Bezugszeichenliste

1 Fertilitätstest

2 Reagenzienschicht, Reaktionsschicht

4 Trägerkörper

6 Verteilerschicht

8 Filterschicht

10 Testzone

A Teilfläche A

B Teilfläche B

C Teilfläche C

Claims

Patentansprüche

1. Oberflächenantigen, dadurch gekennzeichnet, daß es die auf Spermien vorhandene Variante des Proteins ABCG2 ist.

2. Oberflächenantigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es auf humanen Spermien vorhanden ist.

3. Oberflächenantigen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Gruppe trägt, die farbig ist oder ein Substrat in eine optisch erkennbare Substanz umsetzt.

4. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spermienspezifisch und gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 3 gerichtet ist.

5. Antikörper nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen ein im akrosomalen Bereich des Spermiums vorhandenes Oberflächenantigen gerichtet ist.

6. Antikörper nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen das Oberflächenantigen ABCG2 gerichtet ist.

7. Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß er gegen das humane Oberflächenantigen ABCG2 gerichtet ist.

8. Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß er mit farbigen oder farbgebenden Teilchen und in einer bevorzugten Ausführungsform mit Goldpartikeln konjugiert ist.

9. Antikörper nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die farbigen oder farbgebenden Teilchen einen Durchmesser von 40 bis 60 nm besitzen.

10. Fertitlitätstest nach dem Flow-Through Prinzip oder nach dem Lateral-Flow Prinzip, dadurch gekennzeichnet, daß er wenigstens einen spermienspezifischen Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 9 enthält.

11. Fertilitätstest nach Anspruch 10, dadurch geken nzeichnet, daß der Antikörper gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen gerichtet ist.

12. Fertilitätstest nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen ein spermienspezifisches Oberflächenantigen im akrosomalen Bereich des Spermiums gerichtet ist.

13. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadu rch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen die auf Spermien vorhandene Variante des Oberflächenantigens ABCG2 gerichtet ist.

14. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen die auf Humanspermien vorhandene Variante des Oberflächenantigen ABCG2 gerichtet ist.

15. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadu rch geken nzeich net, daß der Antikörper mit farbigen oder farbgebenden Teilchen konjugiert ist.

16. Fertilitätstest nach Anspruch 15, dadurch gekennzeich net, daß die Teilchen einen Durchmesser von 40 bis 60 nm besitzen.

17. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadu rch gekennzeich net, daß er aus wenigstens einem Trägerkörper (4) und wenigstens einer Reagenzienschicht (2) aus einem durchströmbaren Material besteht.

18. Fertilitätstest nach Anspruch 17, dadurch gekennzeich net, daß die Reagenzienschicht (2) wenigstens einen Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 16 und/oder wenigstens ein Oberflächenantigen nach Anspruch 3 aufweist.

19. Fertilitätstest nach Anspruch 17 oder 18, dadurch geken nzeichnet, daß am stromaufwärtigen Ende der Reagenzienschicht (2) oder unmittelbar unterhalb des stromaufwärtigen Endes der Reagenzeinschicht (2) eine Verteilerschicht (6) vorgesehen ist.

20. Fertititätstest nach Anspruch 19, dadu rch geken nzeich net, daß die Verteilerschicht (6) den bzw. einen weiteren Antikörper nach einem der Ansprüche 4 bis 16 oder das Oberflächenantigen nach Anspruch 3 aufweist.

21. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch geken nzeich net, daß auf bzw. oberhalb oder unterhalb der Reagenzienschicht (2) stromabwärts und beabstandet von ihrem stromaufwärtigen Ende und bevorzugt ebenfalls stromabwärts und beabstandet von der Verteilerschicht (6) sofern letztere vorhanden ist, eine Filterschicht (8) vorgesehen ist.

22. Fertilitätstest nach Anspruch 21 , dadurch geken nzeichnet, daß die Filterschicht (8) Poren besitzt, welche kleiner sind als jene der Reagenzienschicht (2).

23. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 17 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß er auf bzw. in der Reagenzienschicht (2) stromabwärts von ihrem stromaufwärtigen Ende und bevorzugt ebenfalls stromabwärts der Filterschicht (8) sofern letztere vorgesehen ist, eine Testzone (10) mit Mitteln aufweist, die anzeigen, ob das Oberflächenantigen in wenigstens einem der Konzentrationsbereiche I, Il oder III in einer Messprobe vorliegt.

24. Fertilitätstest nach Anspruch 23, dadurch geken nzeichnet, daß der Konzentrationsbereich I eine Menge des Oberflächenantigens in der Messprobe umfaßt, die einer Zellenanzahl von weniger als 2 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht.

25. Fertilitätstest nach Anspruch 23 oder 24, dadu rch geken nzeichnet, daß der Konzentrationsbereich Il eine Menge des Oberflächenantigens in der Messprobe umfaßt, die einer Zellenzahl von 2 Zellen bis 20 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht, vorzugsweise von 2 Zellen bis 10 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit und ganz bevorzugt von 2 bis 5 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit.

26. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeich net, daß der Konzentrationsbereich III eine Menge des Oberflächenantigens in der Meßprobe umfaßt, die einer Zellenzahl von mehr als 20 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht, vorzugsweise von mehr als 10 Zellen pro Nanoliter Probeflüssigkeit und besonders bevorzugt von mehr als 5 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit.

27. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeich net, daß die Mittel zum Anzeigen von wenigstens einem der Konzentrationsbereiche I₁ II oder IM auf wenigstens einer Teilfläche A, B oder C der Testzone (10) des Fertilitätstests (1) derart angeordnet sind, daß jedem Konzentrationsbereich I, II, III respektive eine der Teilflächen A, B, C zugeordnet ist.

28. Fertilitätstest nach Anspruch 27, dadu rch geken nzeich net, daß die Teilfläche A dem Konzentrationsbereich 1 zugeordnet ist und von allen Teilflächen A, B, C am weitesten stromaufwärts angeordnet ist.

29. Fertilitätstest nach Anspruch 27 oder 28, dadu rch gekennzeich net, daß die Teilflächen A, B, C unterschiedlich breit sind.

30. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeich net, dass die Teilfläche A schmaler ausgeführt ist, als jene, die dem Konzentrationsbereich Il und/oder dem Konzentrationsbereich IM zugeordnet ist.

31. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadu rch geken nzeich net, daß auf der Teilfläche A Mittel in einer Menge angeordnet sind, die ausreicht, eine Menge des Oberflächenantigens nachzuweisen, die einer Zellenzahl von kleiner 2 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht.

32. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 27 bis 31 , dadu rch gekennzeichnet, daß auf der dem Konzentrationsbereich Il zugeordneten Teilfläche B Mittel in einer Menge angeordnet sind, die ausreicht, eine Menge des Oberflächenantigens nachzuweisen, die einer Zellenzahl von 2 Zellen bis 18 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit, vorzugsweise von 2 Zellen bis 10 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit und in einer besonders bevorzugten Bauform von 2 Zellen bis 5 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht.

33. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 27 bis 32, dadu rch gekennzeichnet, daß auf der dem Konzentrationsbereich III zugeordneten Teilfläche C Mittel in einer Menge angeordnet sind, die ausreicht, eine Menge des Oberflächenantigens nachzuweisen, die einer Zellenzahl von mehr als 18 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit, vorzugsweise von mehr als 10 Zellen pro Nanoliter Probeflüssigkeit und besonders bevorzugt von mehr als 5 Zellen pro Nanoliter Probenflüssigkeit entspricht.

34. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 23 bis 33, dadurch gekennzeich net, daß die Mittel auf wenigstens einer der Teilflächen A, B oder C immobilisiert sind.

35. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 23 bis 34, dadu rch gekennzeich net, daß die Mittel aus einer ein spermienspezifisches Oberflächenantigen bindenden Substanz, vorzugsweise aus einer ein im akrosomalen Bereich vorhandenes, spermienspezifisches Oberflächenantigen bindenden Substanz und ganz besonders bevorzugt aus einer das Oberflächenantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bindenden Substanz bestehen.

36. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 23 bis 35, dadu rch geken nzeichnet, daß die Mittel aus größenreduzierten Poren der Teilfläche C der Reagenzienschicht bestehen.

37. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 21 bis 36, dadurch gekennzeich net, daß er aus wenigstens zwei Streifen besteht, die in einem Überlappungsbereich aufeinander liegen, wobei wenigstens einer der Streifen aus der Reagenzienschicht (2) oder aus einer Kombination von Reagenzienschicht (2) und Trägerkörper (4) oder aus einer Kombination von Reagenzienschicht (2), Trägerkörper (4) und Verteilerschicht (6) oder aus einer Kombination von Reagenzienschicht (2), Trägerkörper (4), Verteilerschicht (6) und Filterschicht (8) besteht.

38. Fertilitätstest nach Anspruch 37, dadurch geken nzeichnet, daß die Streifen im Überlappungsbereich so durchlässig sind, dass dort die flüssige Meßprobe vom ersten Streifen auf den zweiten Streifen und/oder jeden weiteren Streifen strömt.

39. Fertilitätstest nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeich net, daß einer der Streifen im Überlappungsbereich vom Trägerkörper (4) befreit ist.

40. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 37 bis 39, dadu rch geken nzeich net, daß an den stromaufwärtigen Seiten der Streifen Auftragszonen derart angeordnet sind, dass sich bei gleichzeitigem oder nahezu zeitgleichem Auftrag einer Flüssigkeit auf jede der Auftragszonen Flüssigkeitsströme bilden, die sich im Überlappungsbereich treffen.

41. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 37 bis 40, dadurch geken nzeichnet, daß wenigstens einer der Streifen zumindest im Überlappungsbereich eine gegenüber dem anderen und jedem weiteren Streifen unterschiedliche Porenweite besitzt.

42. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 37 bis 41, dadurch geken nzeich net, daß im Überlappungsbereich eine ein spermienspezifisches Oberflächenantigen bindende Substanz, vorzugsweise eine ein im akrosomalen Bereich vorhandenes, spermienspezifisches Oberflächenantigen bindende Substanz und ganz besonders bevorzugt eine das Oberflächenantigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 bindende Substanz auf wenigstens einem Streifen immobilisiert und im feuchten Zustand nicht beweglich ist.

43. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 10 bis 42, dadu rch gekennzeichnet, daß er eine Dosiervorrichtung aufweist.

44. Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 10 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß er am stromabwärtigen Ende der Reagenzienschicht (2) oder am stromabwärtigen Ende jedes Streifens ein Saugkissen aufweist.

45. Verfahren zum Nachweis der Fertilität eines männlichen Lebewesens mit einem Fertilitätstest (1) nach einem der Ansprüche 10 bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß

- eine Ejakulatprobe während einer bestimmten Verweilzeit inkubiert wird,

- ein Teil dieser Probe auf die Verteilerschicht (6) oder auf die Reagenzienschicht (2) des Fertilitätstests (1) aufgebracht wird,

- der Fertilitätstest (1 ) während einer vorgebbaren Zeit inkubiert wird

- und durch Abzählen der sich auf dem Fertilitätstest (1) ausbildenden Anzahl von Farbbanden die Menge an in der Ejakulatprobe vorhandenen Spermien bestimmt wird.

46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch geken nzeichnet, dass die Ejakulatprobe bei Raumtemperatur inkubiert wird.

47. Verfahren nach Anspruch 45 oder 46, dadurch gekennzeich net, daß die Verweilzeit 2 bis 30 Minuten beträgt, vorzugsweise 10 bis 25 Minuten, in einer ausgewählten Ausführungsform 13 bis 22 Minuten und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform 15 bis 20 Minuten.

48. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 47, dadu rch geken nzeichnet, daß der Teil der Probe 5 bis 500 μl beträgt, vorzugsweise 25 bis 250 μl und besonders bevorzugt 50 bis 100 μl.

49. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 48, dadurch gekennzeichnet, daß der Fertilitätstest (1) während einer vorgebbaren Zeit durch Einstellen in ein Füeßmittei oder durch Aufbringen eines Fließmittels inkubiert wird.

50. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 49, dadurch gekennzeichnet, daß die vorgebbare Zeit 2 bis 15 Minuten beträgt, vorzugsweise 4 bis 12 Minuten und besonders bevorzugt 6 bis 10 Minuten.

51. Verfahren nach einem der Ansprüche 45 bis 50, dadurch gekennzeichnet, daß die Ejakulatprobe niedrigviskos gemacht wird.

52. Verwendung eines Fertilitätstest nach einem der Ansprüche 10 bis 44 zur Diagnose der Fruchtbarkeit männlicher Lebewesen, vorzugsweise männlicher Säuger und besonders bevorzugt von Männern.

53. Verwendung nach Anspruch 52 zur Diagnose von Fehlbildungen in Spermien und deren Bestandteilen.