WO2008099968A1 - 酸化亜鉛結合性抗体及びその用途 - Google Patents

酸化亜鉛結合性抗体及びその用途 Download PDF

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WO2008099968A1
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zinc oxide
antibody
binding
peptide
cdr
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PCT/JP2008/052917
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Mitsuo Umetsu
Izumi Kumagai
Ryutaro Asano
Takeshi Nakanishi
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Tohoku University
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
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    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10—Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes

Definitions

  • Zinc oxide-binding antibodies and their uses
  • the present invention relates to a zinc oxide-binding camel antibody capable of specifically binding to zinc oxide, the antibody expression vector, and a solid phase support (biosensor, protein chip, etc.) comprising a zinc oxide layer on which the antibody is immobilized.
  • a solid phase support biosensor, protein chip, etc.
  • zinc oxide is transparent and can be used as both an insulator and a semiconductor, so it can be said that it can be used for various biosensing applications. If zinc oxide can easily and directly immobilize biomolecules (proteins), it is extremely useful for developing high-throughput sensing technologies.
  • the inventors screened the phage display library to obtain a peptide that is specific to oxidized suboxide and has high binding activity (Non-patent Document 1), and succeeded in patterning zinc oxide particles using this ( Patent Document 3).
  • the inventors used the CDR grafting method used for antibody humanization technology to convert the above-mentioned material recognition peptides (gold-binding proteins and zinc oxide-binding peptides) into anti-hen egg white lysozyme (HEL).
  • HEL anti-hen egg white lysozyme
  • the zinc oxide-binding antibody fused to the HEL antibody is unstable and unsuitable for practical use such as biosensors and protein chips.
  • the camel antibody was thought to be unsuitable for peptide CDR grafting because it does not have a force-null structure or has a disulfide bond in the complementarity determining region (CDR).
  • Non-Patent Document 4 a camel antibody suitable for CDR transplantation was developed by Saerens et al.
  • camel antibody is expected to be used in the pharmaceutical field such as targeting to cancer cells.
  • An object of the present invention is to provide a zinc oxide-binding antibody having high stability and binding activity, and by using this to stably bind the antibody to zinc oxide, high-throughput sensing such as an immunobiosensor It is to enable the development of technology.
  • the inventors have intensively studied to achieve the above object, and have found that a stable zinc oxide-binding antibody can be prepared by using a camel antibody. Furthermore, we have succeeded in producing a zinc oxide-binding antibody with high stability and binding activity suitable for practical use by further increasing the affinity of this antibody using in vitro affinity maturing.
  • the present invention provides an amino acid containing EAHVMHK in the CDR H-1 region of a camel antibody.
  • a peptide-grafted antibody containing a zinc oxide-recognizing peptide consisting of a sequence, or a mutation having a further mutation in the CDR H-3 region of the peptide-grafted antibody and having a higher zinc oxide affinity than the peptide-grafted antibody It relates to a zinc oxide-binding antibody consisting of the body.
  • mutants include a peptide comprising HXXHXXHXXH or HXXHXXHXR force (where X is G, L, R, or V) in the CDR H-3 region, for example, HLGHGGHRLH, HLGHGGHGLH in the CDR H-3 region. , HVGHGLHGVR, or HLGHGLHRVH.
  • Zinc oxide-binding antibody of the present invention is preferably a dissociation equilibrium constant K d for the zinc oxide 1. smaller than 7xl0- 7 [M], more preferably 9. smaller than 5xlO_ 9 [M].
  • the zinc oxide recognition peptide is preferably a peptide consisting of 7 to 20 amino acids including EAHVMHK, particularly a peptide of about 7 to 12 amino acids, such as EAHVMHKVAPRP.
  • the camel antibody CDR H-1 region contains a zinc oxide recognition peptide consisting of EAHVMHKVAPRP, and the CDR H-3 region contains a peptide consisting of HLGHGLHRVH. Things can be mentioned.
  • the camel antibody is preferably one having no disulfide bond between CDRs.
  • the present invention also provides an expression vector comprising a gene encoding the aforementioned zinc oxide-binding antibody.
  • an expression vector containing a gene encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 can be mentioned.
  • the present invention also provides a method for producing a zinc oxide-binding antibody, comprising culturing a host cell into which the expression vector has been introduced, and obtaining a zinc oxide-binding antibody from the culture.
  • the present invention provides a solid support (for example, a substrate such as a particle or a protein chip) comprising a zinc oxide layer on which the zinc oxide-binding antibody is immobilized.
  • a solid support for example, a substrate such as a particle or a protein chip
  • a zinc oxide layer on which the zinc oxide-binding antibody is immobilized.
  • the present invention also provides a biosensor having a solid phase support including a zinc oxide layer on which the zinc oxide-binding antibody is immobilized, and means for detecting an intermolecular interaction via the antibody.
  • the present invention also provides a protein obtained by fusing a second protein having a material recognition sequence to the zinc oxide-binding antibody.
  • the second protein having the material recognition sequence is a sequence that specifically recognizes and binds to a certain material (for example, metal or metal oxide) like the zinc oxide recognition peptide of the present invention.
  • a gold recognition peptide having the sequence LKAHLPPSRLPS Examples include metal-binding antibodies (Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 5-3 1 2 4 4 6, Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 6-2 2 5 2 94 4).
  • an antibody necessary for detection of a target substance can be easily immobilized on zinc oxide. This makes it possible to develop high-throughput sensing technologies such as immune biosensors.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of a VHH1 or 2 or 3 expression vector
  • FIG. 1B is a schematic diagram of pTZ-VHH
  • FIG. 1C is a schematic diagram of pRA 4F2-AuVHHl.
  • Fig. 2A shows the protein purification method
  • Fig. 2B shows the results of confirming the expression of VHH1, VHH2, and VHH3 in E. coli.
  • Fig. 3 is a graph showing the results of gel filtration chromatography of the peptide-grafted antibody (VHH 2 (yellowish green), VHH3 (blue), WT VHH1 (black), VHH1 (red)).
  • Fig. 4 is a graph showing the results of circular dichroism spectrum measurements (from the top of the graph, WT VHH1 (black), VHH3 (blue), VHH1 (red), VHH2 (yellowish green)).
  • Figure 5 shows the process for assessing binding between zinc oxide particles and peptide-grafted antibodies.
  • Figure 6A shows the results of SDS-PAGE analysis of the supernatant, Wash, and Elute fractions shown in Figure 5 (1: Total, 2: Supernatant fraction, 3-5: Wash fraction, 6:
  • Figure 6B shows the results of material identification evaluation tests by SDS-PAGE.
  • Fig. 7 shows the results of evaluating the binding activity of VHH3 to zinc oxide (lmM phosphate buffer).
  • Figure 8 shows adsorption hot springs (A) and Langmuir plots (B) for the adsorption of VHH1 on acid-zinc.
  • FIG. 9 is a schematic diagram showing a production protocol for a peptide library in which CDR H-3 is mutated.
  • Figure 10 shows the results of material identification evaluation by SDS-PAGE.
  • Fig. 11 is a graph showing the results of 4F2 gel filtration chromatography (WT VHH1 ( ⁇ ), VHH1 (blue), F2 (orange)).
  • Figure 12 shows the 4F2 circular dichroism spectra (WT VHH1 (black), VHH1 (blue), 4F2 (orange)).
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of evaluation of dispersibility of oxidized dumbbell particles (A: antibody 3 ⁇ , ⁇ : antibody 0.5 3 ⁇ 41).
  • FIG. 14 shows the results of the desorption test of zinc oxide-binding antibody immobilized on zinc oxide particles.
  • FIG. 15 is a schematic diagram of a co-expression vector of Fv (H-2), (H-3), (L-2), and (L-3).
  • FIG. 16 shows the results of CDR grafting of zinc oxide recognition peptide to mouse-derived anti-hen egg white lysozyme antibody HyHEL-10 Fv.
  • A shows the three-dimensional structure of HyHEL-10 Fv.
  • B shows the gel filtration production process of antibody grafted with heavy chain CDR-2.
  • C shows the result of circular dichroism spectrum of VH alone (VH2sd) with peptide grafted on heavy chain CDR-2.
  • FIG. 17 shows the results of A: Zinc oxide binding evaluation with Fv alone (Fv (H-2): V-chain CDR-2, Fv (H-3): V-chain Transplanted to CDR-3, Fv (H-2): transplanted to CDR-2 of L chain, Fv (L-3): transplanted to CDR-3 of L chain), B: purified peptide transplantation oxidation of VH chain
  • A Zinc oxide binding evaluation with Fv alone (Fv (H-2): V-chain CDR-2
  • Fv (H-3) V-chain Transplanted to CDR-3
  • Fv (H-2) transplanted to CDR-2 of L chain
  • Fv (L-3) transplanted to CDR-3 of L chain
  • B purified peptide transplantation oxidation of VH chain
  • Fig. 18 shows the results of evaluating the binding of zinc oxide-recognizing peptide fragments to zinc oxide.
  • FIG. 19 shows a conceptual diagram of a biosensor using the zinc oxide-binding antibody of the present invention.
  • Figure 21 shows the immobilization of zinc oxide-binding camel antibody 4F2 on the flow system (saturated binding: 130 nmol / m 2 ).
  • Figure 22 shows the immobilization of anti-GFP camel antibody 4F2 in the flow system (camel antibody 4F2 (bottom): 134 nmol / m 2 , anti-GFP camel antibody 4F2 (top): 134 nmol I m 2 , Immobilization amount of GFP: 110 nmol / m 2 ).
  • This specification includes the contents described in the specification of Japanese Patent Application No. 2 073 _3 5 073 which is the basis of the priority of the present application.
  • the zinc oxide recognition peptide used in the present invention is a peptide that specifically recognizes zinc oxide and can bind to zinc oxide with high affinity.
  • the inventors have so far conducted a screening using the fuzzy presentation method, and peptides having binding properties to five kinds of acid zinc: EAHVMHKVAPRP (ZnOl: SEQ ID NO: 1), QNTATAVSRLSP (Zn02: SEQ ID NO: 2), ATHTNQTHALYR (Zn03: SEQ ID NO: 3), VSNHKALDYPTR (Zn04: SEQ ID NO: 4), DSGRYSMTNHYS (Zn05: SEQ ID NO: 5) have been obtained (Japanese Patent Laid-Open No.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 is 10_ 7 M against zinc oxide It has a high binding activity.
  • the inventors further analyzed the sequence of this peptide and identified that the 7 peptide of EAHVMHK (SEQ ID NO: 6) is important for zinc oxide recognition. See Reference Example 1).
  • histidine which is a basic amino acid, has a large effect on the binding constant, and the HVMH region between two histidines is considered to be highly likely to be important as a binding motif.
  • the above peptide comprising an amino acid sequence containing the 7 peptides of EAHVMHK is used as an acid zinc recognition peptide.
  • the zinc oxide recognition peptide preferably has a size of about 7 to 20 amino acids, particularly about 7 to 12 amino acids.
  • each amino acid constituting the peptide may be appropriately modified or derivatized, and such a modified or derivatized peptide is also used in the present invention. Included in zinc oxide recognition peptides.
  • the antibody used in the present invention is a camel-derived antibody molecule (latada antibody).
  • the variable region of an antibody has a heterodimeric structure consisting of a heavy chain and a light chain.
  • FIG. 16A shows a three-dimensional structure of mouse-derived anti-hen egg white lysozyme antibody HyHEL-IOFv, which is a dimer composed of heavy chain (VH) and light chain (VL) subunits.
  • HSHEL-IOFv mouse-derived anti-hen egg white lysozyme antibody
  • VH heavy chain
  • VL light chain
  • force Latada antibody does not have a light chain and shows antigen-binding ability in a VH single domain. Therefore, it has a smaller molecular weight than conventional antibodies, has a simple structure, and can be easily mass-produced using yeast or the like.
  • camel antibodies have many antibodies that do not have a canonical structure and have CDR H-1-H-3 disulfide bonds to stabilize the complementarity-determining region (CDR) loop. It was thought that it was not suitable for peptide transplantation into the CDR region.
  • an anti-lactamase camel antibody cAb BCII-10 suitable for CDR-grafting has been isolated and named "Universal VHH framework" (J. Mol. Biol. 352 (2005) 597).
  • This cAb BCII-10 has no disulfide bond between CDRs, and the expression amount of the recombinant antibody after CDR grafting is large, so it is extremely useful as a truncated antibody for peptide grafting.
  • a mouse-derived anti-chicken egg white lysozyme antibody having a heterodimer structure that has been used in the past is used, the fusion protein in which the acid-zinc recognition peptide is transplanted to the CDR portion (CDR H-2) is oxidized. Although it exhibits zinc binding activity, the phenomenon that VH and VL dissociate during the purification process could not be avoided (Fig. 16B).
  • camel antibodies originally have a single domain, so domain dissociation does not occur, and a fusion protein in which a zinc oxide-recognizing peptide is grafted onto its CDR portion maintains the antibody structure stably.
  • a fusion protein in which a zinc oxide-recognizing peptide is grafted onto its CDR portion maintains the antibody structure stably.
  • camel antibodies are monomers, so their molecular weight is small, and all molecules are linked by covalent bonds, so there is no phenomenon of dissociation, so it is easy to create fusion proteins with other domains.
  • camel antibodies are monomers, so their molecular weight is small, and all molecules are linked by covalent bonds, so there is no phenomenon of dissociation, so it is easy to create fusion proteins with other domains.
  • the stability of the antibody structure is extremely important, but the camel antibody, which is a monomer, is extremely stable compared to conventional antibodies having a dimer structure and is actually used.
  • Zinc oxide-binding antibodies suitable for the above can be provided.
  • the entire amino acid sequence of the camel antibody is known, and the sequence of cAb BCII-10 is described in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2807-2812 (2001).
  • the entire amino acid sequence of camel antibody cAb BCII-10 having no disulfide bond in the CDR region is shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
  • residues 26-38 correspond to the CDR H-1 region
  • residues 53-69 correspond to the CDR H-2 region
  • residues 102-117 correspond to the CDR H-3 region.
  • Zinc oxide-binding antibody (latada antibody dumbbell recognition peptide fusion protein)
  • the above-mentioned zinc oxide recognition peptide is added to the CDR region of a camel antibody (in particular,
  • a zinc oxide-binding antibody (camel antibody, zinc monoxide-recognizing peptide fusion protein) is prepared by transplanting to CDR H-1 region.
  • an antigen binding site is called a complementary determining region (CDR) or a hypervariable region.
  • CDR complementary determining region
  • a hypervariable region In the production of antibody drugs CDR grafting, in which only this CDR is replaced with a heterologous (mouse) -derived one, is used for the production of human-type antibodies.
  • an acid zinc-recognizing peptide is grafted to the Latada antibody.
  • the inventors have exposed the CDR from the wild-type conformation, Regions that were not directly linked (residues 29-35, 53-69, 102-117) were determined and a zinc oxide recognition peptide was transplanted.
  • the zinc oxide-binding antibody of the present invention must maintain the original antibody structure even by CDR grafting, and should have a zinc oxide-binding property equivalent to or higher than that of the grafted zinc oxide-recognizing peptide.
  • the three-dimensional structure of the above-mentioned camel antibody zinc monoxide recognition peptide fusion protein can be determined by measuring X-ray crystal structure analysis, nuclear magnetic resonance spectrum, fluorescence spectrum, circular dichroism spectrum, etc. You can investigate. As a result, when completely different results were obtained between the wild-type camel antibody and the fusion protein, it can be seen that transplantation at the site 8 changes the antibody structure and impairs the antibody activity.
  • the zinc oxide binding activity of the camel antibody zinc monoxide recognition peptide fusion protein can be evaluated by measuring the binding rate, dissociation rate, dissociation equilibrium constant, and amount of saturated binding.
  • the dissociation equilibrium constant can be calculated by adding acid 0
  • transplantation to the H-2 region changes the structure unique to the camel antibody, and its activity is reduced. It was confirmed that it could be lost.
  • Kd dissociation equilibrium constant
  • a zinc oxide-binding protein having a high binding activity can be obtained by transplanting a zinc oxide recognition peptide into the CDR H-1 region, particularly the antibody surface exposed region.
  • a zinc oxide recognition peptide an antibody in which a zinc oxide-recognizing peptide is grafted on the latada antibody CDR H-1 region is referred to as “VHH1J”.
  • In vitro affinity maturing consists of two steps: the creation of a mutation library by mutagenesis and the screening of high-affinity antibodies from the library.
  • the mutagenesis method a method well known in the art such as chain shuffling method, random mutagenesis method, and CDR walking can be used.
  • a selection method from the mutation library thus prepared a method of selecting a high affinity antibody using a low concentration of antigen, or a method of recovering only antibodies that are strongly bound to the antigen under strict washing conditions. And a method of selecting only high-affinity antibodies using an antagonistic reaction. Since the zinc oxide-binding antibody of the present invention is a low molecular weight single chain antibody, mass production is easy, and the above-described affinity process can be easily performed.
  • HXXH H may be R: SEQ ID NO: 8
  • HXXHXHXXH H may be R, X is G (glycine), L (leucine), R (arginine: SEQ ID NO: 9), or V (valine)), in which HXXH is repeated 3 times, Introduced into the aforementioned VHH1 and evaluated its zinc oxide bond 1 "life.
  • amino acid X in the motif histidine, tryptophan, arginine, Considering the importance of lysine and glycine residues for binding to inorganic materials, the theoretically calculated library size from the codons encoding amino acids, and the library size that can be prepared, histidine, glycine, arginine, and leucine Limited to valine residues.
  • HLGHGGHRLH Self sequence number 10
  • HLGHGGHGLH SEQ ID NO: 1 1
  • HVGHGLHGVR SEQ ID NO: 12
  • HLGHGLHRVH SEQ ID NO: 1 3
  • the present invention also provides a vector containing the gene encoding the zinc oxide-binding antibody and capable of expressing the zinc oxide-binding antibody.
  • the expression vector of the present invention can be obtained by linking (inserting) a gene encoding the zinc oxide-binding antibody of the present invention to a known vector such as a plasmid.
  • the base sequence may be appropriately optimized according to the host cell to be introduced.
  • the vector is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and for example, plasmid DNA, phage DNA, etc. can be used.
  • plasmid DNA As the plasmid DNA, plasmid from E.coli (e.g. P BR322, pBR325, pUC18, pUC119 , pTrcHis, pBlueBacHis , etc.), plasmids derived from Bacillus subtilis (e.g. pUB110, pTP5, etc.), plasmid derived from yeast (e.g. Upushiron'ipushironro13, ⁇ 24, YCp50, pYE52, etc.) and phage DNA include fly phage.
  • E.coli e.g. P BR322, pBR325, pUC18, pUC119 , pTrcHis, pBlueBacHis , etc.
  • Bacillus subtilis e.g. pUB110, pTP5, etc.
  • yeast e.g. Upushiron'ipushironro13, ⁇ 24, YC
  • a method is employed in which the purified DNA is cleaved with a suitable restriction enzyme, inserted into a suitable restriction enzyme site or a multicloning site of the vector DNA, and ligated to the vector.
  • the promoter is not particularly limited, and any promoter known to function in the host can be used. The promoters will be described in detail for each host in the next section. If necessary, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a ribosome binding sequence (SD sequence), a terminator sequence, etc. may be arranged.
  • the vector may contain genes for other enzymes that function in the host cell.
  • the zinc oxide-binding antibody of the present invention can be expressed as a fusion protein with another material recognition peptide. In that case, a gene encoding a fusion protein may be introduced into the vector.
  • the zinc oxide-binding '1 ⁇ live antibody of the present invention can be produced in a suitable manner by introducing the expression vector described in the previous section into an appropriate host so that the gene can be expressed and culturing.
  • a zinc oxide-binding antibody using the Latada antibody of the present invention is a low-molecular monomer antibody and does not have a disulfide bond, so that it can be efficiently produced recombinantly, and cAb BCII-10 is highly produced by yeast. Production has been confirmed (see above).
  • host cells include prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • a host cell is transformed with a plasmid vector containing a replicon derived from a species compatible with the host, ie, an origin of replication, and regulatory sequences.
  • the vector preferably has a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells.
  • the K12 strain is often used, and the vector is generally a PBR322 or pUC-type plasmid, but is not limited thereto, and various known strains and vectors can be used.
  • promoters used in E. coli include tryptophan (trp) promoter, ratatose (lac) promoter, tryptophan-lactose (tac) promoter, lipoprotein (lpp) promoter, polypeptide chain elongation factor Tu (tufB) promoter, etc. Any of these can be preferably used.
  • strain 207-25 is preferable, and pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93) is used as the vector, but it is not limited to this. Is not to be done.
  • pTUB228 Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95, 87-93
  • secretion expression outside the cell can also be achieved.
  • eukaryotic host cells include cells of vertebrates, insects and yeasts.
  • Vertebrate cells include, for example, monkey COS cells (Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182, ATCC CRL-1650) and Chinese 'hamster ovary cells (CH0 cells, ATCC CCL-61)
  • a dihydrofolate reductase-deficient strain (Urlaub, G. and Chasin, LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) is often used, but is not limited thereto.
  • an expression vector for a vertebrate cell a vector having a promoter located upstream of a gene to be normally expressed, an RNA splice site, a polyaduration site, a transcription termination sequence, and the like can be used. In addition, it may have a replication origin if necessary.
  • expression vectors include pCR3.1 (Invitrogen) having the cytomegalovirus early promoter, pSV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol having the SV40 early promoter. 1, 854-864), etc., but is not limited to these.
  • the expression vector when using COS cells as host cells, the expression vector has an SV40 origin of replication, and can grow independently in COS cells.
  • a transcription promoter, transcription termination signal, and RNA splice Those provided with a part can be preferably used.
  • the expression vector is: Jetylaminoethyl (DEAE) -tex lan run method (Luthman, H. and Magnus son, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308), calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL and van der W
  • a vector capable of expressing a neo gene functioning as an antibiotic G418 resistance marker together with an expression vector, such as pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and SV2neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) etc.
  • an expression vector such as pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989): Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY) and SV2neo (Southern, PJ and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341) etc.
  • baculovirus transfer vector is pVL1392 /, which utilizes the promoter of the polygraphin protein of autographer nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). 1393 is often used (Kidd, 1. M. and V. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors.
  • vectors using the promoter of baculovirus P10 or the basic protein can also be used.
  • a thread-replaceable protein as a secreted protein (Zhemei Wang, et al. ( 1998) Biol. Chem., 379, 167-174).
  • yeast As an expression system using a eukaryotic microorganism as a host cell, yeast is generally well known. Among them, yeast of the genus Saccharomyces, such as baker's yeast Saccharomyces cerevisiae and petroleum yeast Pichia pastoris are preferable. Examples of expression vectors for eukaryotic microorganisms such as yeast include, for example, the alcohol dehydrogenase gene promoter (Bennetzen, JL and Hall, BD (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025) and the acid phosphatase gene. (Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a secreted protein when expressed as a secreted protein, it can also be expressed as a recombinant having a secretory signal sequence and the endogenous protease possessed by the host cell or a known protease cleavage site at the N-terminal side.
  • a secretory signal sequence for example, in a system in which human mast cell tryptase, a trypsin-type serine mouth therase, is expressed in petroleum yeast, the secretory signal sequence of yeast hypoactor and the KEX 2 protein possessed by petroleum yeast are located on the N-terminal side.
  • the transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the target zinc oxide-binding antibody is produced intracellularly or extracellularly by the culture.
  • a medium used for the culture various media commonly used according to the employed host cells can be appropriately selected.
  • a medium such as RPMI1640 medium or Dulbecco's modified Eagle medium (hereinafter referred to as “DMEM”) supplemented with serum components such as fetal bovine serum as necessary can be used.
  • Recombinant protein produced inside or outside the transformed host cell by the above culture should be separated and purified by a known separation method utilizing the physical and chemical properties of the protein.
  • a known separation method utilizing the physical and chemical properties of the protein.
  • the method include treatment with a protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography.
  • Various liquid chromatography such as (HPLC) and dialysis methods can be used alone or in combination.
  • histidine consisting of 6 residues is linked to the recombinant protein to be expressed, it can be efficiently purified with nickel affinity ram.
  • the target zinc oxide-binding antibody protein can be easily produced in high yield and high purity by appropriately combining the methods described above.
  • camel antibodies are monomeric antibodies, so their molecular weight is small, and each molecule is all covalently linked, so there is no phenomenon of dissociation. Therefore, a recombinant protein in which the zinc oxide-binding antibody of the present invention is fused with another protein can be easily prepared.
  • the present invention also provides such a fusion protein.
  • second protein having a material recognition sequence specifically refers to a specific material such as a metal oxide or a metal oxide such as a zinc oxide recognition peptide of the present invention. Contain sequences that bind automatically Means protein.
  • proteins include, for example, W02004 / 031381, TO2005 / 010031, W02006 / 064639, W02006 / 068250, TO2006 / 126595, Brown et al., J. Mol. Biol. (2000), 299, 725-735, Naik et al., Nature materials, (2002), Vol.
  • fusion proteins can be used for nanoparticle array technology and nanoparticle bonding technology.
  • LKAHLPPSRLPS SEQ ID NO: 20
  • a gold-binding antibody JP 2 0 0 5-3 1 2 4 4 6 and JP 2 0 0 6-2 2 5 2 9 4
  • the zinc oxide-binding antibody of the present invention can be used to immobilize zinc oxide particles on the surface of the gold material, and to bind the zinc oxide particles to the gold nanoparticles.
  • the zinc oxide-binding antibody of the present invention can be used for protein purification by fusing a His tag peptide, a GST protein, and various binding proteins.
  • the present invention provides a solid support including a zinc oxide layer on which a zinc oxide-binding antibody is immobilized.
  • the shape of the support is not particularly limited as long as it includes an acid zinc layer, and may be a substrate (such as a protein chip) or a particle (such as a nanoparticle).
  • the acid semiconductor is a semiconductor Substrates with various structures can be manufactured by using processing technology (microfabrication technology). Furthermore, as already reported, the patterning technology has been established (Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 06-2 2 5 2 94), which can be said to be useful for the production of solid phase substrates such as protein chips.
  • the material of the solid phase substrate is not particularly limited as long as the zinc oxide layer can be formed, and a substrate generally used in the field such as metal, glass, silicon, etc. can be used as appropriate.
  • Particles having a zinc oxide layer on which the zinc oxide-binding antibody of the present invention is immobilized can be applied to various analyzes such as protein purification.
  • nanoparticles are useful for high-sensitivity analysis in microchannels by taking advantage of their surface area.
  • zinc oxide particles with immobilized zinc oxide-binding antibodies are well-dispersed in aqueous solutions because they are modified with proteins, and react efficiently with active substances. When complete dispersion is achieved, the particles aggregate when protein-protein interactions occur, making it easy to analyze protein-protein binding. Such good dispersibility is also important when patterning nanoparticles using the inkjet method or spray method.
  • the present invention also provides a pyosensor (immunobiosensor) having a solid phase support including a zinc oxide layer on which a zinc oxide-binding antibody is immobilized, and means for detecting an intermolecular interaction via the antibody.
  • the intermolecular interaction through the antibody is not limited to the interaction between the antibody and the antigen, but the binding between the antibody and the analyte through the second antibody, etc. ⁇ Includes all of the dissociation.
  • the detection means may be any of well-known detection means such as an electrical detection means such as an FET and an optical detection such as surface plasmon resonance.
  • Fig. 19 shows a conceptual diagram of a biosensor using the zinc oxide-binding antibody of the present invention.
  • FETs Field-effect transistors
  • the principle is that if the current flowing from the source electrode to the drain electrode is controlled by the third electrode, the gate electrode, and the protein-protein interaction occurs on the surface of the gate electrode, the charge of the gate electrode changes. The current response is changed (Anal. Chira. Acta 136, 93 (1982)).
  • zinc oxide for this gate electrode, protein-protein interaction using FET technology is achieved. The effect can be measured. That is, it can be used as a biosensor.
  • a surface plasmon resonance sensor is a biosensor that uses surface plasmon resonance to analyze intermolecular interactions in real time on a sensor chip.
  • surface plasmon resonance sensors for example, BIAcore's SPR measurement gold film sensor chip Sensor Chip Au
  • a zinc oxide layer is formed on the sensor chip, the zinc oxide-binding antibody of the present invention is stably adsorbed with high binding properties.
  • a microchannel is provided on a sensor chip to which an acid-zinc binding antibody is bound, and a sample containing an analyte (antigen) is fed at a constant flow rate.
  • the surface plasmon resonance sensor has the advantage that it can detect a very small amount of sample with high sensitivity and can analyze the kinetics of interaction in real time. Therefore, the surface plasmon resonance sensor to which the zinc oxide-binding antibody of the present invention is bound is useful as a biosensor for antigen-antibody interaction analysis.
  • the zinc oxide-binding antibody of the present invention can be applied to fine processing of zinc oxide and two-dimensional surface plasmon resonance (SPR) using zinc oxide dots (about several hundreds / m). Formation of a zinc oxide film on a microfabricated inorganic material such as zinc (semiconductor material) can be easily performed using semiconductor fabrication technology. For example, patterning at the ⁇ ⁇ level can be performed by the lift-off method or sputtering method using masking, and patterning at room temperature using a Pd catalyst (Adv. Mater. 14, 418-421 (2002 )) Is also possible.
  • SPR surface plasmon resonance
  • Reflectometry is a technique for measuring the amount of protein adsorbed on the surface of a sample plate by reflecting the laser beam onto the sample plate and measuring the reflected light.
  • This reflectometry principle and a microfluidic chip combined with a reflectometry meter biosensor are readily available (Fluidware Technologies' Reflectmet V-Biosensor Array System Fluid— RIfS, etc.) ).
  • the zinc oxide-binding antibody of the present invention has a high V, binding. Compatible and stable adsorption.
  • a microchannel is provided on a sensor chip to which a zinc oxide-binding antibody is bound, and a sample containing an analyte (antigen) is fed at a constant flow rate.
  • the reflectometry biosensor has the advantage of being able to detect minute samples with high sensitivity and to analyze the kinetics of interactions in real time. Therefore, the reflectometry biosensor to which the oxidized sub-binding antibody of the present invention is bound is useful as a biosensor for antigen-antibody interaction analysis.
  • the zinc oxide-binding antibody of the present invention can also be applied to a biosensor using transmitted light, reflected light, near-field light, quartz crystal microbalance of an electromagnetic wave such as infrared rays.
  • other well-known techniques used for immunodetection For example, development of biosensors using solid-phase immunization methods such as immunoprecipitation, Western blotting, dot plotting, slot blotting, ELISA, and RIA Is also possible.
  • the zinc oxide-binding antibody of the present invention immobilized on a zinc oxide substrate can be easily detached by setting appropriate conditions. That is, by changing the conditions, the immobilized zinc oxide-binding antibody can be recovered and analyzed.
  • the solution used for desorption may be an ordinary protein preparation aqueous solution (phosphate buffer solution, etc.), and the protein can be desorbed while maintaining its active structure without denaturation. It is.
  • the camel antibody originally has a disulfide bond between CDR H-1-H-3 that stabilizes the complementarity-determining region (CDR) loop. In this example, it does not have a disulfide bond between CDRs.
  • “Universal VHH Anti- / 3-lactamase camel antibody cAb BCII-10 (J. Mol. Biol. 352 (2005) 597) named “framework” was used as a peptide-type antibody to be used for peptide transplantation.
  • cAb BCII-10 was prepared according to the sequence described previously (Antimicrobial Agents and Chemotheraphy, 2807-2812 (2001)).
  • CDR of anti-] 3-Lactamase antibody cAbBCII-10 A gene encoding the antibody VHH3 in which the zinc oxide recognition peptide (SEQ ID NO: 1) consisting of EAHVMHKVAPRP was grafted at the 103-114 site in the H-3 region was completely synthesized. Subsequently, wild-type cAb BCII-10 (WT VHH) was prepared using a primer that replaces CDRH-3, which is a ZnO-recognizing peptide sequence, with a wild-type CDR. Similarly, zinc oxide-recognizing peptides were transplanted into CDR H-1 and H-2 to produce peptide-grafted ratada antibodies VHH1 and VHH2.
  • 12 amino acid residues (29-35 residues, 53-69 residues, 102-117 residues) exposed on the surface of CDR are determined from the three-dimensional structure of wild-type camel antibody. Selected. A schematic diagram of the prepared expression vector is shown in FIG. 1A.
  • the PCR reaction solution composition and reaction conditions (Table 1), and the PCR primers used and amino acid sequences of peptide-grafted camel antibodies (Table 2) are shown below.
  • VHH3-NcoI (Reverse) 5 -NN CCATGGCCCAGGTTCAGCTGGTTGAAAG-3, (SEQ ID NO: 2 1)
  • VHH3-1 (Reverse) 5 '-CAGGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGCGGCGGCAGCGTGCAGGCGGGCGGCA
  • VHH3-2 (Forward) 5, -AATTGCTGCCACTGCTTCGCGTTCCTGGCCCGGCGCCTGGCGAAACCAG
  • VHH3-3 (Reverse) 5 '-GCGAAGCAGTGGCAGCAATTGCGAGCATGGGCGGCCTGACCTATTATGC
  • VHH3-4 (Forward) 5, -GCTTCCACTGCTGCGCAATAATAAATCGCGGTATCTTCCGGTTTCAGGT
  • VHH3-5 (Reverse) 5 '-TATTGCGCAGCAGTGGAAGCGCATGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGCC
  • VHH3- sacll (Forward) 5 '-NNNCCGCGGATGAAACGGTAACCTGGG-3' (SEQ ID NO: 2 7)
  • VHH-1 (Forward) 5 '-GCGCCACTTTATGCATCACATGCGCTTCGCTACCACCGCTCGCGGTGCAGC TCAG-3' (SEQ ID NO: 30)
  • VHH-1 (Reverse) 5, -TGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGAGCCTGGGCTGGTTTCGCCAG-3 '(SEQ ID NO: 3 1)
  • VHH-2 (Forward) 5 '-GCGCCACTTTATGCATCACATGCGCTTCCGCAATTGCTGCCACTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 3 2)
  • VHH-2 (Reverse) 5 '-TGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTT-3' (SEQ ID NO: 3 3)
  • ZnOtag-VHH (B) 5 '-NNNCCATGGCCGAAGCGCATGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGCAGGT TCAGCTGGTTGAAAG-3, (SEQ ID NO: 3 4)
  • VHH1, VHH2, and VHH3 expression vectors prepared in the previous section E. coli BL21 (DE3) was transformed to express the protein.
  • the protein purification method is shown in Figure 2A.
  • VHH1, VHH2, and VHH3 could all be prepared as soluble fractions ( Figure 2B).
  • the prepared protein was purified using Genore filtration chromatography (Superdex75; 50 mM Tris-HC1 (pH 8.0) / 200 mM NaCl) and circular dichroism (AVIV circular dichroism spectrometer (Proterion Co., New jersey, USA).
  • VHH1 and VHH3 are single components of the monomer (red and blue lines in Fig. 3) ) And the circular dichroism peculiar to the camel antibody (red and blue lines in Fig. 4), VHH2 does not show a uniform gel filtration chromatogram, and the circular dichroism is also easy. It was not unique to the antibody (yellow-green line in Figs. 3 and 4).
  • the activity of the prepared VHH1, VHH2, and VHH3 with zinc oxide particles was evaluated. Specifically, it was mixed with zinc oxide with a particle size of 100 nm in 10 phosphate buffer (containing a surfactant), and separated into a supernatant and a precipitate (zinc oxide) after centrifugation (Fig. 5). The precipitate was washed several times with the above phosphate buffer, and finally the adsorbed protein was solubilized with 6M aqueous guanidine hydrochloride (GdnHCl) solution and evaluated by SDS-PAGE (Figure 6). . SDS-PAGE results showed that VHH1 bound to zinc oxide (Figure 6A) and retained material specificity (Figure 6A).
  • VHH3 binding properties were not observed when 10 mM phosphate buffer was used, but it was bound to ZnO when 1 mM phosphate buffer was used (Fig. 7). This shows that VHH3 also has a binding function to ZnO, but its binding activity is weaker than VHH1.
  • VHH1 was evaluated for binding using Langmuir plots (Fig. 8).
  • the dissociation equilibrium constant of VHH1 for zinc oxide there 176 nM, which fused zinc oxide recognition downy peptide to the N-terminus of WT VHH (3. 30 X 10- 7 M) and evaluation the same level of activity It was done. From this, it was confirmed that even when a peptide was transplanted into the CDR H-1 region, the three-dimensional structure of the Latada antibody itself was retained and the activity of the peptide was not reduced.
  • Example 2 Production of high-affinity camel antibodies by in vitro affinity chromatography
  • VHH1 prepared in Example 1 as a base material, an attempt was made to further improve the activity. Specifically, we focused on the CDR H-3 region to which no zinc oxide-recognizing peptide was transplanted, and constructed a library by randomizing the amino acid sequence. The CDR H-2 region was not used for modification because the results of Example 1 showed that the structure of the camel antibody was denatured and lost activity when the sequence of this part was changed.
  • the library 1 was prepared by library-forming the 105 to 114 residues of the CDR-H3 region with the sequence shown in FIG.
  • the gene in the H (R) part in the figure is designed so that the DNA base sequence is “(C or A or G) (T or C or A)”, and the His or Arg residue I tried to become.
  • VHH1 library in which the antibody fragment library was presented on the M13 phage, was prepared by introducing the gene library into the phage media vector ⁇ , that is, the peptide-grafted antibody VHH1 was used as a cage to form CDR by Overlap extension PCR. After amplifying the gene fragment with randomized H-3, it was introduced into the phage media vector pTZ (Fig. 1B)
  • the PCR reaction solution composition and reaction conditions were the same as in Table 1 of Example 1, and the mutation-introducing primers The sequence is as follows.
  • VHH3-sacII (Forward) 5, -NNNCCGCGGATGAAACGGTAACCTGGG-3 '(SEQ ID NO: 3 8)
  • the phage midvector pTZ used in this study has the lac promoter arranged in the opposite direction to the target gene, and transcription of mRNA Is initiated from the gVI promoter derived from the fuji located at the g3p end.
  • the production of a fusion protein with g3p is moderately suppressed, and more types of clones can be presented without causing a gene defect.
  • coli DH12S strain was transformed by electroporation method using the prepared phagemid vector, transferred to a 20 ml LB medium, cultured at 37 ° C, 0 / N, and extracted with plasmid. It was used for the operation of the phage display method as a phage mid library.
  • the scale of the prepared library was 6.5 ⁇ 10 4
  • the transformant was 1.2 ⁇ 10 5 .
  • phage antibody library binds to the surface of zinc oxide and has been confirmed in previous experiments to prevent protein adsorption, so a phage antibody library does not bind to zinc oxide or is weak after mixing a solution with zinc oxide particles.
  • the antibody-displayed phage that binds is phosphoric acid (10-50raM) and detergent (0.05% It was removed with an aqueous solution containing Tween-20) (washing operation). The strongly bound phage was removed using a high-concentration phosphoric acid aqueous solution (200), and the removed phage was reamplified.
  • 840 ⁇ of the prepared phage antibody library was added to ZnO powder (0.2 mg ) and mixed for 1 hr.
  • Nonspecifically adsorbed molecules for ZnO were washed with 10 mM phosphate (pH 7.4) I 200 mM NaCl I 0.05% Tween20 solution, and the bound phage antibody was eluted with 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4, 200 mM NaCl).
  • a re-fuzzy antibody was prepared and repeatedly subjected to a banning operation.
  • the phosphate concentration in the wash was increased for each round. The above operation was repeated 4 rounds to concentrate the antibody capable of binding to ZnO.
  • Table 3 shows the various conditions.
  • camel antibodies having the amino acid sequences shown in Table 4 in CDR-H3 were selected.
  • the affinity to zinc oxide was evaluated by Langmuir plot for each camel antibody, the results in Table 5 were obtained, and it was confirmed that 4F2 had the highest affinity.
  • Example 5 Preparation of a zinc oxide-gold linked protein in which 4F2 and a gold recognition antibody are fused Bispecificity is achieved by fusing a 4F2 antibody that exhibits high affinity to ZnO and Au VHHl that binds to Au with a hinge linker. An antibody is produced.
  • T7 promoter 5 5-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3, (SEQ ID NO: 40)
  • VHH- Eagl-Hinge (Forward) 5, -TTGCGGTTGTGGTTGCGGTTGCGGTTTCGGCTGCGGCTGCG GAATTTTCGGTTCGGCCGATGAAACGGTAACCTGGGTG-3 '(SEQ ID NO: 4 1)
  • Hinge-Bam-VHH (Reverse) 5 '-CAACCGCAACCACAACCGCAACCGCAGCCGAAACCGCAGCCG AAACCGGAACCGGGATCCCAGGTTCAGCTGGTTGAAAGC-3' (SEQ ID NO: 4 2)
  • Example 6 Evaluation of binding activity using surface plasmon resonance
  • a zinc oxide film is prepared on the sensor chip Au of BIAcore's SPR measurement gold sensor chip, and the affinity of the antibody for the zinc oxide film is measured using BIAcore (registered trademark) 2000. Specifically, a few nn zinc oxide films are deposited on the gold surface of the Sensor Chip Au by sputtering. Fabricate with a film thickness of ⁇ 50nm. Then, the plate is set in BIAcore (registered trademark) 2000, and an antibody aqueous solution is allowed to flow to measure the adsorption of the zinc oxide film of the antibody.
  • the crystal structure of the zinc oxide film can be changed by changing the preparation conditions, the adsorption characteristics of the antibody due to the difference in crystallinity of the oxide film (the following binding rate (ka), dissociation rate ( kd), dissociation constant (KD) and saturation bond amount).
  • the quantitative evaluation is performed by determining the binding rate (ka), dissociation rate (kd), and dissociation constant (KD) of the antibody to zinc oxide from the binding curve obtained according to the analysis software attached to the apparatus.
  • a microchannel is provided on the sensor chip (substrate) having the zinc oxide film adsorbed with the zinc oxide-binding antibody in the previous section, and a sample containing the analyte (antigen) is fed at a constant speed to the antibody and sample.
  • the interaction of antigens in the medium is monitored in real time by surface plasmon phenomenon.
  • the sensor chip to which the zinc oxide-binding antibody of the present invention is adsorbed can be used as a sensor chip for analyzing the kinetics of antigen-antibody interaction.
  • Example 7 Adsorption of zinc oxide-binding antibody to zinc oxide using reflectometry and application to protein chip flow sensor
  • Reflectometry is a technique for measuring the amount of protein adsorbed on the surface of a sample plate by reflecting the laser beam onto the sample plate and measuring the reflected light.
  • a reflectometry method biosensor array system Fluid—RIfS manufactured by Firmware Technologies Co., Ltd.
  • RIfS manufactured by Firmware Technologies Co., Ltd.
  • Example 1 instead of the camel antibody, the anti-hen egg white lysozyme antibody HyHEL-10 Fv (Protein Data Bank: 1C08, J. Biol. Chem. 274 27623-27631 (1999), three-dimensional structure: FIG. 16A) The six CDR regions were each implanted with a zinc oxide recognition peptide.
  • a PCR primer was designed based on the sequence of the ZnO-binding peptide (EAHVMHKVAPRP), and the vector pRA-WT VH (or VL) containing the HyHEL-10 VH (or VL) gene existing in our laboratory was selected.
  • overlap extension PCR was performed using the following primers, and a peptide sequence was transplanted to each CDR.
  • VH-2 (CDRH-2), VH-3 (CDRH-3) primer
  • VH-NcoI 5 '-NNNCCATGGCCGATATCCAGCTGCAG-3' (SEQ ID NO: 4 4)
  • VL-2 (CDR L-2), VL-3 (CDR L-3) primer
  • VL-NcoI 5 '-NNNCCATGGCCGATATCGTCCTGACCC-3' (SEQ ID NO: 50)
  • VL-SacII 5 -Image CCGCGGCCTTGATCTCCAGCTTGG-3, (SEQ ID NO: 5 1)
  • PCR-amplified DNA fragments and our existing expression vector pRA-scFv (HyHEL-10 scFv expression vector) were digested with I and Ssc ⁇ , ligated, and VH-2, VH- 3, VL-2 and VL-3 single expression vectors were prepared.
  • antibody molecules can be bound to zinc oxide in a stable and specific orientation.
  • This technology can be used to develop high-throughput sensing technologies such as biosensors and protein chips. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 5 Zinc oxide recognition peptide ( ⁇ 05)
  • SEQ ID NO: 6 Zinc oxide recognition region sequence
  • SEQ ID NO: 8 Zinc oxide binding motif
  • SEQ ID NO: 10 High affinity mutant H-3 region introduction sequence (3D2)
  • SEQ ID NO: 1 1 High affinity mutant H-3 region introduction sequence (3E2)
  • SEQ ID NO: 12 High affinity mutant H-3 region introduction sequence (4D4)
  • SEQ ID NO: 13 High affinity mutant H-3 region introduction sequence (4F2)
  • SEQ ID NO: 14 All amino acid sequences of 4F2
  • SEQ ID NO: 15 All amino acid sequences of VHH1
  • SEQ ID NO: 16 Full amino acid sequence of VHH2
  • SEQ ID NO: 17 Complete amino acid sequence of VHH3
  • SEQ ID NO: 20 Gold recognition, recognition peptide
  • SEQ ID NO: 39 Linker sequence (Llama IgG2 upper hinge)

Abstract

　本発明は、高い安定性と結合活性を有する酸化亜鉛結合性抗体と、これを利用したバイオセンサ等のハイスループットなセンシング技術に関する。具体的には、本発明は、ラクダ抗体のCDR H-1領域に酸化亜鉛認識ペプチドを含むペプチド移植抗体、及び前記抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体（バイオセンサ、プロテインチップ等）に関する。

Description

酸化亜鉛結合性抗体及びその用途 技術分 野
本発明は酸化亜鉛と特異的に結合可能な酸化亜鉛結合性ラクダ抗体と、 前記 抗体発現ベクター、 及び前記抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体 （バ ィォセンサ、 プロテインチップ等） 等に関する。 背 景技術
酵素と基質、 抗原と抗体など、 生明体分子には極めて特異性の高い分子認識機 構が存在する。 こうした生体分子の機能は、 極めて温和な条件下で、 しかも高 田
い安全性と正確性をもって発揮されることから、 医療、 食品、 環境分野などさ まざまな分野でその利用が期待されている。
生体分子の認識機構を利用した材料開発では、 タンパク質などの生体分子を 無機材料に安定して固定化することが重要なポイントとなる。 これまで、 コー ティングされた金表面に関しては、 カツプリング剤を用いたタンパク質の固定 化方法が知られているが、 この方法は固定化反応率が悪く、 また、 タンパク質 の活性低下を招いた。 これに対し、 発明者らはヒ ト末梢血細胞 Fab遺伝子ライ ブラリーをスクリーニングして金結合性タンパク質（金結合性 VLあるいは VH) を取得し、当該タンパク質の金基板への固相化に成功した（特許文献 1及び 2 ) 金属酸化物は多くの光 ·電子デバイスに使われる重要な材料である。 なかで も、 酸化亜鉛は、 透明で絶縁体としても半導体としても活用するできることか ら、 バイオセンシングの様々な用途に使用可能な材料といえる。 酸化亜鉛を簡 便かつダイレクトに生体分子 （タンパク質） を固定化できれば、 それはハイス ループットなセンシング技術開発に極めて有用である。 発明者らは、 ファージ 提示ライブラリーをスクリーニングすることで、 酸化亜 に特異的で高い結合 活性を有するペプチドを取得し（非特許文献 1 )、 これを利用した酸化亜鉛粒子 のパターニングに成功した （特許文献 3 )。
さらに、発明者らは、抗体のヒト型化技術に用いられる CDR移植法を用いて、 前記したマテリアル認識ぺプチド （金結合性タンパク質や酸化亜鉛結合性ぺプ チド） を抗ニヮトリ卵白リゾチーム （HEL) 抗体に融合させることで、 マテリア ル特異的抗体の開発を試みた （非特許文献 2及び 3 )。 し力 しながら、 HEL抗体 に融合された酸化亜鉛結合性抗体は不安定で、 バイオセンサやプロティンチッ プ等の実使用には適さないという問題があつた。 ラクダ抗体は、力ノ二カル構造を持たないことや、相補性決定領域 (CDR)にジ スルフィ ド結合を有することから、 ペプチドの CDR移植には適していないと考 えられていた。 最近、 Saerens らにより CDR移植に適したラクダ抗体が開発さ れ (非特許文献 4 )、 癌細胞へのターゲッティングなど医薬分野でのラクダ抗体 の利用が期待されるようになってきた。 しかしながら、 ラクダ抗体をバイオセ ンサ等の材料開発に利用しようという報告はこれまでなされていない。
[特許文献 1]
特開 2 0 0 5— 3 1 4 4 1 1号公報
[特許文献 2 ]
特開 2 0 0 5— 3 1 2 44 6号公報
[特許文献 3]
特開 2 0 0 6— 2 2 5 2 94号公報
[非特許文献 1 ]
Umetsu et al. , Advanced Materials, 17, p2571-2575, (2005)
[非特許文献 2]
第 3回東北大学バイオサイエンスシンポジウム （2006) 講演要旨集 p240 PS- 189 「工学材料を標的とした多機能性抗体に関する研究」
[非特許文献 3]
第 3回東北大学バイオサイエンスシンポジウム （2006) 講演要旨集 p241 PS- 190 「機能性ぺプチドの移植による無機材料結合抗体の創製」
[非特許文献 4]
Saerens et al.， J. Mol. Biol. , 352, p597 - 607， (2005) 発 明 の 開 示
発明が解決しようとする課題
本発明の課題は、 高い安定性と結合活性を有する酸化亜鉛結合性抗体を提供 し、 これを利用して抗体を酸化亜鉛に安定的に結合させることで、 免疫バイオ センサ等のハイスループットなセンシング技術の開発を可能にすることにある。
課題を解決するための手段
発明者らは前記課題を達成するために鋭意検討し、 ラクダ抗体を利用するこ とで安定な酸化亜鉛結合性抗体が作製できることを見出した。 さらに in vitro ァフィ二ティマチュレーションを用いてこの抗体の親和性をより高め、 実使用 に適した、 高い安定性と結合活性を有する酸化亜鉛結合性抗体の作製に成功し た。
すなわち、 本発明は、 ラクダ抗体の CDR H-1領域に EAHVMHKを含むァミノ酸 配列からなる酸化亜鉛認識べプチドを含むぺプチド移植抗体、 あるいは前記べ プチド移植抗体の CDR H-3領域にさらに変異を有し、 かつ前記べプチド移植抗 体より高い酸化亜鉛親和性を有する変異体からなる、 酸化亜鉛結合性抗体に関 する。
前記変異体としては、 CDR H-3領域に HXXHXXHXXHあるいは HXXHXXHXXR力 ら なるペプチド （但し、 Xは G、 L、 R、 又は Vである） を含むもの、 たとえば、 CDR H - 3領域に HLGHGGHRLH、 HLGHGGHGLH、 HVGHGLHGVR,又は HLGHGLHRVHからなるぺ プチドを含むものを挙げることができる。
本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、酸化亜鉛との解離平衡定数 Kdが 1. 7xl0-7 [M] より小さいことが好ましく、 9. 5xlO_9 [M]より小さいことがより好ましい。
前記酸化亜鉛認識ぺプチドとしては、 EAHVMHK を含む 7〜 2 0アミノ酸から なるペプチド、 特に 7〜1 2アミノ酸程度のペプチドが好ましく、 たとえば EAHVMHKVAPRPを挙げることができる。
本発明の酸化亜鉛結合性抗体の 1つの実施形態として、ラクダ抗体の CDR H-1 領域に EAHVMHKVAPRPからなる酸化亜鉛認識ペプチドを含み、 かつ、 CDR H- 3領 域に HLGHGLHRVHからなるぺプチドを含むものを挙げることができる。
なお、 前記ラクダ抗体としては、 CDR間にジスルフィド結合を有しないもの が好ましい。
本発明はまた、 前記した酸化亜鉛結合性抗体をコードする遺伝子を含む発現 ベクターを提供する。 そのようなベクターの一例としては、 たとえば、 配列番 号 1 4に示されるァミノ酸配列をコードする遺伝子を含む発現べクタ一を挙げ ることができる。
本発明はまた、 前記発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、 その培養物 から酸化亜鉛結合性抗体を取得することを特徴とする、 酸化亜鉛結合性抗体の 製造方法も提供する。
さらに本発明は、 前記酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相 支持体 （たとえば、 粒子やプロテインチップ等の基板） を提供する。
さらに本発明は、 前記酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相 支持体と、 前記抗体を介した分子間相互作用を検出する手段を有するバイオセ ンサも提供する。
さらにまた本発明は、 前記酸化亜鉛結合性抗体に、 材料認識配列を有する第 2 のタンパク質を融合させたタンパク質も提供する。 前記材料認識配列を有す る第 2のタンパク質とは、 本発明の酸化亜鉛認識ペプチドのように、 ある材料 (たとえば、 金属や金属酸化物） を特異的に認識して特異的に結合する配列を 含むタンパク質を意味し、たとえば LKAHLPPSRLPSの配列を有する金認識べプチ ドゃ金結合性抗体 （特開 2 0 0 5— 3 1 2 4 4 6号公報、 特開 2 0 0 6— 2 2 5 2 9 4号公報） を挙げることができる。
発明の効果
本発明によれば、 酸化亜鉛に簡便に標的物質検出に必要な抗体を固定化でき る。 これにより、 免疫バイオセンサ等のハイスループッ卜なセンシング技術の 開発が可能となる。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 VHH1 or 2 or 3発現ベクター、 図 1 Bは pTZ - VHH、 図 1 Cは pRA 4F2- AuVHHlの模式図である。
図 2 Aは、 タンパク質の精製方法、 図 2 Bは VHH1, VHH2, VHH3の大腸菌にお ける発現確認結果を示す。
図 3は、 ぺプチド移植抗体のゲルろ過クロマトグラフィ一の結果を示すグラ フである （グラフ上から VHH2 (黄緑）、 VHH3 (青）、 WT VHH1 (黒）、 VHH1 (赤））。 図 4は、 円偏光二色性スペク トル測定の結果を示すグラフである （グラフ上 から、 WT VHH1 (黒）、 VHH3 (青）、 VHH1 (赤）、 VHH2 (黄緑））。
図 5は、 酸化亜鉛粒子とぺプチド移植抗体との結合評価のプロセスを示す。 図 6 Aは、 図 5に示される上清、 Wash, Elute画分をそれぞれ SDS- PAGEで解 析した結果 （1： Total、 2：上清画分、 3〜5： Wash画分、 6： Elute画分） を、 図 6 Bは SDS- PAGEによる材料識別評価試験の結果を示す。
図 7は、 VHH3の酸化亜鉛に対する結合活性評価結果 （lmM リン酸緩衝液） を 示す。
図 8は、 VHH1 の酸ィ匕亜鉛への吸着に対する吸着等温泉 (A) とラングミュア プロット （B) を示す。
図 9は、 CDR H- 3 に変異導入を行ったぺプチドライブラリ一の作製プロトコ ルを示す模式図である。
図 1 0は、 SDS-PAGEによる材料識別評価結果を示す。
図 1 1は、 4F2のゲルろ過クロマトグラフィ一の結果を示すグラフである（WT VHH1 (黑）、 VHH1 (青）、 F2 (橙））。
図 1 2は、 4F2の円偏光二色性スぺク トルを示すグラフである（WT VHH1 (黒）、 VHH1 (青）、 4F2 (橙)）。
図 1 3は、 酸化亜鈴粒子の分散性評価結果を示す写真である （A:抗体 3 μ Μ、 Β :抗体 0. 5 ¾1)。
図 1 4は、 酸化亜鉛粒子に固定した酸化亜鉛結合性抗体の脱離試験結果を示 す。 図 1 5は、 Fv (H-2) , (H-3) , (L- 2) , (L- 3)の共発現ベクターの模式図である。 図 1 6は、 マウス由来抗ニヮトリ卵白リゾチーム抗体 HyHEL- 10 Fvへの酸化 亜鉛認識べプチド CDR移植結果を示す。 Aは HyHEL- 10 Fvの立体構造を示す。 B は重鎖 CDR- 2にペプチド移植した抗体のゲルろ過生成過程を示す。 Cは、 重鎖 CDR- 2にペプチド移植した VH単独 （VH2sd) の円偏光二色性スペク トルの結果 を示す。
図 1 7は、 A:マウス由来抗ニヮトリ卵白リゾチーム抗体 Fv単独での酸化亜鉛 結合評価結果 (Fv (H-2) ： V鎖の CDR - 2に移植、 Fv (H- 3) ： V鎖の CDR— 3に移植、 Fv (H-2) ： L鎖の CDR- 2に移植、 Fv (L- 3) ： L鎖の CDR- 3に移植）、 B :精製したぺ プチド移植 VH鎖の酸化亜鉛結合評価結果を示す。
図 1 8は、 酸化亜鉛認識ペプチド断片の酸化亜鉛に対する結合評価結果を示 す。
図 1 9は、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体を利用したバイオセンサの概念図を 示す。
図 2 0は、 RlfS検出によるフロー系での GFP固定化評価を示す（展開蛋白質 濃度： 10 raM、 展開溶媒： 10 or 30 raM P04 3" (pH 7. 5)， 150 mM NaCl、 展開速度： 10 ml /min、 飽和結合量： 89 nmol I m2)。
図 2 1は、 フロ一系システムへの酸化亜鉛結合性ラクダ抗体 4F2の固定化評 価を示す （飽和結合量： 130 nmol / m2)。
図 2 2は、 フロー系システムへの抗 GFPラクダ抗体 4F2の固定化評価を示す (ラクダ抗体 4F2 (下） ： 134 nmol / m2、 抗 GFPラクダ抗体 4F2 (上） ： 134 nmol I m2、 GFPの固定化量： 110 nmol / m2)。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 7 _ 3 5 0 7 3号の明細 書に記載された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
1 . 酸化亜鉛認識ペプチド
本発明で用いられる酸化亜鉛認識べプチドは、 酸化亜鉛を特異的に認識し、 高い親和性で酸化亜鉛に結合可能なペプチドである。 発明者らは、 これまでフ ァージ提示法を用いたスクリ一ユングにより、 5種の酸ィヒ亜鉛に結合性を有す るペプチド： EAHVMHKVAPRP (ZnOl：配列番号 1 )、 QNTATAVSRLSP (Zn02 :配列番号 2 )、 ATHTNQTHALYR (Zn03 :配列番号 3 )、 VSNHKALDYPTR (Zn04:配列番号 4 )、 DSGRYSMTNHYS (Zn05 :配列番号 5 ) を取得している （特開 2 0 0 6— 2 2 5 2 9 4号公報参照） 1S このうち配列番号 1のぺプチドは、酸化亜鉛に対して 10_7M という高い結合活性を有するものだった。 発明者らは、 さらにこのペプチドの 配列を解析し、 EAHVMHK (配列番号 6 ) の 7ペプチドが酸化亜鉛の認識に重要で あることを特定した （化学工学会代 71年会 研究発表講演要旨集 B206、 参考 例 1参照)。特に、塩基性アミノ酸であるヒスチジンは結合定数に対する影響が 大きく、 2つのヒスチジンにはさまれた HVMH領域が結合モチーフとして重要で ある可能性が高いと考えられた。
本発明では、 前記した EAHVMHKの 7ぺプチドを含むァミノ酸配列からなるぺ プチドを酸ィヒ亜鉛認識ペプチドとして利用する。 限定するものではないが、 前 記酸化亜鉛認識ぺプチドは、 7〜 2 0アミノ酸、 特に 7〜 1 2アミノ酸程度の 大きさであることが好ましい。
なお、 所望の酸化亜鉛に対する結合性を維持する限り、 ペプチドを構成する 各アミノ酸は適宜修飾あるいは誘導体化されていてもよく、 そのような修飾あ るいは誘導体化されたぺプチドもまた本発明の酸化亜鉛認識ぺプチドに含まれ る。
2 . ラクダ抗体
2 . 1 ラクダ抗体の特徵
本発明で用いられる抗体は、 ラクダ由来の抗体分子 （ラタダ抗体） である。 通常、抗体の可変領域は、重鎖と軽鎖からなるヘテロダイマー構造をしている。 図 16Aは、 マウス由来の抗ニヮトリ卵白リゾチーム抗体 HyHEL- lO Fvの立体構 造であるが、 重鎖 (VH)と軽鎖 (VL)サブユニットからなる二量体である。 ところ 力 ラタダ抗体は軽鎖を持たず VH単独ドメインで抗原結合力を示す。そのため、 従来の抗体より分子量が小さく、 構造が単純で、 酵母等を用いて容易に大量生 産できる。
これまで、 ラクダ抗体は、 カノ二カル構造を持たないことや、 相補性決定領 域（CDR)ループを安定化させるための CDR H-1-H-3間ジスルフィド結合を持つ抗 体が多く、 CDR領域へのペプチド移植には適していないと考えられていた。 し かし、 近年、 CDR- grafting に適した抗 -lactamase ラクダ抗体 cAb BCII - 10 が単離され、 "Universal VHH framework" と名づけられた（J. Mol. Biol. 352 (2005) 597)。 この cAb BCII- 10 は、 CDRs 間にジスルフィ ド結合がなく、 CDR 移植後の組換え抗体の発現量も多く、 ぺプチド移植の鎵型抗体として極めて有 用である。本発明では、 このような CDRs間にジスルフィド結合を有しないラタ ダ抗体を用いることが好ましく、 前記した cAb BCII- 10をその好適な一例とし て記載する。
発明者らは、前記したラタダ抗体 CDR部位に酸化亜鉛認識ぺプチドを移植し、 その抗体構造が壊れないことを見出した。 従来使用されている、 ヘテロダイマ 一構造を持つ、 マウス由来の抗ニヮトリ卵白リゾチーム抗体を用いた場合、 そ の CDR部分 （CDR H- 2) に酸ィ匕亜鉛認識ペプチドを移植した融合タンパク質は、 酸化亜鉛結合活性を示すものの、 その精製過程において VHと VLが解離してし まう現象を回避できなかった（図 16B)。解離したぺプチド移植 VH単独では、抗 体特有の構造をとることはできず （ランダム構造を示す：図 16C)、 抗体の機能 を失ってしまう。
これに対し、 ラクダ抗体は、 もともと各ドメインが単独であるため、 ドメイ ンの解離の現象は起きず、 その CDR部分に酸化亜鉛認識べプチドを移植した融 合タンパク質は、 抗体構造を安定に維持しつつ、 酸化亜鈴に対し高い結合活性 を示すことが確認された。
また、 ラクダ抗体は、 一量体であるため、 分子量が小さく、 すべての分子が 共有結合で結ばれているため解離という現象がなく、 そのため他のドメインと の融合タンパク質の作製が容易であるという利点を有する。 この利点を利用す ることで、 後述するよう、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体を他の材料認識べプチ ド等との融合により、 異種材料結合タンパク質を作製することも可能である。 さらに、 後述するプロテインチップやバイオセンサでは、 抗体構造の安定性 極めて重要であるが、 一量体であるラクダ抗体は、 ダイマー構造を有する従来 の抗体に比較して極めて安定性が高く、 実使用に適した酸化亜鉛結合性抗体を 提供できる。
2 . 2 ラクダ抗体の一次構造
ラクダ抗体の全アミ ノ酸配列は公知であり、 cAb BCII-10 の配列は Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2807-2812 (2001)に記載されている。 CDR領域にジスルフィド結合を有しないラクダ抗体 cAb BCII-10の全アミノ酸 配列を配列表の配列番号 7に示す。 この配列中、 26-38残基が CDR H- 1領域に 該当し 53-69残基が CDR H-2領域に該当し、 102-117残基が CDR H-3領域に該 当する。
3 .酸化亜鉛結合性抗体（ラタダ抗体一酸化亜鈴認識ペプチド融合タンパク質） 本発明では、前記した酸化亜鉛認識ぺプチドをラクダ抗体の CDR領域 (特に、
CDR H- 1領域） に移植することで、 酸化亜鉛結合性抗体 （ラクダ抗体一酸化亜 鉛認識ペプチド融合タンパク） を作製する。
3 . 1 CDR移植
抗体分子のうち、 抗原結合性部位は、 相補性決定領域 （Complementary determining region, CDR) あるいは超可変領域と呼ばれる。 抗体医薬の作製で は、 この CDRだけを異種 （マウス） 由来のものに置換する CDR移植が、 ヒト型 抗体の作製に利用されている。
本発明では、 この CDR移植を利用して、 ラタダ抗体に酸ィ匕亜鉛認識ぺプチド を移植する。 発明者らは、 ラクダ抗体に存在する 3つの CDR領域 （H - 1、 H - 2、 H-3) のそれぞれについて、 野生型の立体構造から、 CDR表面に露出しており、 フレームワーク領域と直接連結していない領域 （29-35 残基， 53 - 69 残基， 102- 117残基） を決定し、 酸化亜鉛認識ペプチドの移植を行った。
3 . 2 CDR移植による構造変化と酸化亜鉛結合活性
本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、 CDR移植によっても本来の抗体構造が維持 され、 かつ移植した酸化亜鉛認識ペプチドと同等あるいはそれ以上の酸化亜鉛 結合性を有するものでなければならない。
前記したラクダ抗体一酸化亜鉛認識べプチド融合タンパク質の立体構造は、 X 線結晶構造解析、 核磁気共鳴スぺク トル、 蛍光スぺクトル、 円偏光二色性スぺ クトル等を測定することにより、 調べることができる。 その結果、 野生型ラク ダ抗体と融合タンパク質で全く異なる結果が得られた場合、 当該部位八の移植 は抗体構造を変化させ、 抗体活性を損なわせることがわかる。
ラクダ抗体一酸化亜鉛認識べプチド融合タンパク質の酸化亜鉛結合活性は、 結合速度、 解離速度、 解離平衡定数、 飽和結合量の測定等により評価すること ができる。 たとえば、 解離平衡定数は、 融合タンパク質を含む緩衝液に、 酸ィ匕 亜 |0粒子を加えて上清を回収し、 未吸着の酸化亜鉛量から、 融合タンパク質へ の結合量を求め、 ラングミュアプロットを行なって決定することができる。 結 合特性の簡便かつ詳細な評価には、 表面プラズモン共鳴を用いた方法が好適で あり、 その方法の詳細は当該分野で周知である。
発明者らが行なった' 3つの CDR領域 （H- 1、 H- 2、 H- 3) への移植では、 H- 2領 域への移植はラクダ抗体特有の構造を変化させ、 その活性を失わせることが確 認された。 さらに、 H-1領域に移植した抗体は移植前の酸化亜鉛認識ペプチド と同等の結合活性 （解離平衡定数 (Kd) = 1. 76x10— 7M) を維持していた。 H- 3領域 に移植した抗体は酸化亜鉛結合活性を示すものの、 H- 1 領域に移植した抗体と 比較するとその結合活性は弱かった。
この結果から、 CDR H-1 領域、 特にその抗体表面露出領域に酸化亜鉛認識べ プチドを移植することにより、 結合活性の高い酸化亜鉛結合タンパク質が取得 できることがわかつた。 以下、 このラタダ抗体 CDR H-1領域に酸化亜鉛認識べ プチドを移植した抗体を 「VHH1J と呼ぶ。
4 . 融合タンパク質のァフィ-ティマチユレーシヨン （高親和性変異体) 発明者らは、前項で作製した VHH1を母体として、 さらにその結合活性を高め た高親和性変異体の取得を試みた。 3つの CDR領域への移植結果から、 H- 2領 域は抗体構造の安定的維持に必要な領域と判断されたため、 H - 3領域を変異体 作製のターゲットとした。
4 . 1 in vitroァフィ二ティマチユレーシヨン
in vitroァフィ二ティマチュレーションは、 変異導入による変異ライブラリ 一の作製とライブラリ一からの高親和性抗体のスクリーエングの 2つの工程か らなる。 変異導入法としては、 当該分野周知の方法、 例えば chain shuffling 法、 ランダム変異導入法、 CDR walking を用いて実施することができる。 こう して作製された変異ライブラリーからの選択方法としては、 低濃度の抗原を用 いて高親和性抗体を選択する方法、 洗浄条件を厳しく設定し抗原に強く結合し ている抗体のみ回収する方法、 拮抗反応を利用して高親和性抗体のみ選択する 方法等が挙げられる。 本発明の酸化亜鉛結合性抗体は低分子一本鎖抗体である ため、 大量生産が容易で、 上記したァフィ-ティマチユレーシヨンの工程も容 易に実施できる。
4 . 2 高親和性酸化亜鉛結合性抗体変異体の取得
以前の検討から、 酸化亜鉛への結合には HXXH (Hは Rでもよい：配列番号 8 ) という塩基性アミノ酸に挟まれたモチーフが重要であることが予測された。 そ こで、 HXXHを 3回繰り返した 12ぺプチド HXXHXXHXXH (Hは Rでもよく、 Xは G (グリシン）、 L (ロイシン）、 R (アルギニン：配列番号 9 )、 又は V (バリン）） を、前述の VHH1に導入し、 その酸化亜鉛結合 1"生を評価した。 なお、モチーフ内 のアミノ酸 Xについては、 これまで報告されている無機材料結合べプチドの配 列情報よりヒスチジン、 トリプトファン、 アルギニン、 リジン、 グリシン残基 が無機材料結合に重要であること、 またアミノ酸をコードするコドンから理論 上の計算されるライブラリー規模と、 調製可能なライブラリー規模を考慮し、 ヒスチジン、 グリシン、 アルギニン、 ロイシン、 バリン残基に限定した。
その結果、 VHH1 よりも優れた酸化亜鉛親和性を有する 4 つのクローン ： HLGHGGHRLH (酉己列番号 1 0 )、 HLGHGGHGLH (配列番号 1 1 )、 HVGHGLHGVR (配列 番号 1 2 )、 又は HLGHGLHRVH (配列番号 1 3 ) が選択された。 これらは、 いず れも、 VHH1と同等の飽和結合量で、解離平衡定数 (Kd)は VHH1の値（1. 76xlO"7M) をはるかに下回る。なかでも、 4F2は酸化亜鉛に対する親和性が極めて高く （解 離平衡定数 (Kd) =9. 39x10— 9 M)、 しかも他の材料に対してほとんど親和性を示 'さなレ、優れた選択性を有し、 抗体の立体構造も適切に保持されていることが確 認された。 4F2の全ァミノ酸配列を配列表の配列番号 1 4に示す。 5 . 酸化亜鉛結合性抗体発現べクタ一
本発明は、 前記酸化亜鉛結合性抗体コードする遺伝子を含み、 当該酸化亜鉛 結合性抗体を発現しうるベクターも提供する。
本発明の発現ベクターは、 プラスミド等の公知のベクターに本発明の酸化亜 鉛結合性抗体をコードする遺伝子を連結 （挿入） して得ることができる。 塩基 配列は、 導入する宿主細胞に合わせて適宜最適化してもよい。 ベクターは宿主 中で複製可能なものであれば特に限定されず、 例えばプラスミド DNA、 ファー ジ DNA等を利用することができる。
前記プラスミド DNA としては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例えば PBR322， pBR325, pUC18, pUC119, pTrcHis, pBlueBacHis 等）、 枯草菌由来のプラスミド (例えば pUB110， pTP5 等）、 酵母由来のプラスミ ド （例えば ΥΕρ13， ΥΕρ24, YCp50, pYE52 等）などが、ファージ DNAとしてはえファージ等が挙げられる。 前記ベクターへの遺伝子の挿入は、 まず、 精製された DNAを適当な制限酵素 で切断し、 ベクター DNA の適当な制限酵素部位又はマルチクローニングサイト に挿入してベクターに連結する方法が採用される。
宿主内で外来遺伝子を発現させるためには、 構造遺伝子の前に、 適当なプロ モーターを配置させる必要がある。 前記プロモーターは特に限定されず、 宿主 内で機能することが知られている任意のものを用いることができる。 なおプロ モーターについては、 次項において、 宿主ごとに詳述する。 また、 必要であれ ばェンハンサ一等のシスエレメント、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シ グナル、 リボソーム結合配列 （SD配列）、 ターミネーター配列等を配置させて よい。
前記ベクターは、 宿主細胞で機能する他の酵素ゃタンパク質の遺伝子を含ん でいてもよい。 後述するよう、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体は他の材料認識べ プチドとの融合タンパク質として発現させることもできる。 その場合、 前記べ クタ一には、 融合タンパク質をコードする遺伝子を導入すればよい。
6 . 酸化亜鉛結合性抗体の組換え生産
本発明の酸化亜鉛結合' 1·生抗体は、 適当な宿主に前項で記載した発現ベクター を当該遺伝子が発現しうるように導入し、 培養することによって、 糸且換え生産 することができる。特に、本発明のラタダ抗体を用いた酸化亜鉛結合性抗体は、 低分子一量体抗体でジスルフィド結合も有しないため、 効率よく組換え生産可 能であり、 cAb BCII-10に関しては酵母による高生産が確認されている（前掲）。 宿主細胞としては、 原核細胞であれば、 例えば、 大腸菌 （Escherichia coli) や枯草菌 （Bacillus subtilis) 等が挙げられる。 目的の遺伝子をこれらの宿主 細胞内で形質転換させるには、 宿主と適合し得る種由来のレブリコンすなわち 複製起点と、 調節配列を含んでいるプラスミ ドベクターで宿主細胞を形質転換 させる。 該ベクターとしては、 形質転換細胞に表現形質 （表現型） の選択性を 付与しうる配列を有するものが好ましい。
例えば、 大腸菌であれば、 K12株等がよく用いられ、 ベクターとしては、 一 般に PBR322や pUC系のプラスミドが用いられるが、これらに限定されず、公知 の各種菌株ゃベクターを使用できる。 また、 大腸菌で用いられるプロモーター としては、 例えば、 トリプトファン （trp) プロモーター、 ラタトース （lac) プロモーター、 トリプトファン ·ラクトース （tac) プロモーター、 リポプロテ イン （lpp) プロモーター、 ポリペプチド鎖伸張因子 Tu (tufB) プロモーター 等を挙げることができ、 いずれも好適に用いることができる。
また、 枯草菌であれば、 207-25 株が好ましく、 ベクターとしては pTUB228 (Ohmura, K. et al. (1984) J. Biochem. 95， 87-93) 等が用いられるが、 こ れに限定されるものではない。 なお、 ベクターに枯草菌の α—アミラーゼのシ グナルぺプチド配列をコ一ドする DNA配列を連結することにより、 菌体外での 分泌発現も可能となる。
真核細胞の宿主細胞としては、脊椎動物、昆虫、酵母等の細胞が挙げられる。 脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞である COS細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23， 175 - 182、 ATCC CRL- 1650) やチャイニーズ 'ハムスター卵巣細胞 （CH0 細胞、 ATCC CCL-61) のジヒ ドロ葉酸還元酵素欠損株 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4126-4220) 等がよく用いられ ているが、 これらに限定されない。
脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、 通常発現させようとする遺伝子の上 流に位置するプロモーター、 RNA のスプライス部位、 ポリアデュル化部位、 及 び転写終結配列等を有するものを使用できる。 さらに、 これは必要により複製 起点を有してもよい。 該発現べクタ一の例としては、 サイトメガロウィルス初 期プロモーターを有する pCR3. 1 (Invitrogen社製）、 SV40の初期プロモーター を有する pSV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1， 854-864) 等が挙げられるが、 これらに限定されない。
宿主細胞として、 COS 細胞を用いる場合を例に挙げると、 発現ベクターとし ては、 SV40複製起点を有し、 COS細胞において自立増殖が可能であり、さらに、 転写プロモーター、 転写終結シグナル、 及び RNAスプライス部位を備えたもの を好適に用いることができる。該発現べクタ一は、ジェチルアミノエチル (DEAE) —テキス卜ラン法 (Luthman, H. and Magnus son, G. (1983) Nucleic Acids Res, 11, 1295-1308)、 リン酸カルシウム一 DNA共沈殿法 （Graham, F. L. and van der W
Eb, A. J. (1973) Virology 52, 456-457)、 及ぴ電気パルス穿孔法 (Neumann, E. et al. (1982) EMBO J. 1, 841-845) 等により COS細胞に取り込ませることが でき、 かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。
また、 宿主細胞として CH0細胞を用いる場合には、 発現ベクターと共に、 抗 生物質 G418耐性マーカーとして機能する neo遺伝子を発現し得るベクター、例 pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989) ： Molecular Cloning A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, NY) や SV2neo (Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1， 327-341) 等をコ · トランスフ ヱタトし、 G418耐性のコロニーを選択することにより、 目的のポリペプチドを 安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。
昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、 鱗翅類ャガ科の Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞由来株化細胞 （Sf- 9又は Sf- 21) や Trichoplusia niの 卵細胞由来 High Five細胞 (Wickham, T. J. et al, (1992) Biotechnol. Prog, i ： 391-396) 等が宿主細胞としてよく用いられ、バキュロウィルス トランスフ ァーベクターとしてはオートグラファ核多角体ウィルス (AcNPV)のポリへドリ ンタンパクのプロモーターを利用した p VL1392/1393がよく用いられる （Kidd， 1 . M. and V.し. Emery (1993) The use of baculoviruses as expression vectors. Applied Biochemistry and Biotechnology 420, 137 - 159)。 この他にも、 バキ ュロウィルスの P10や同塩基性タンパク質のプロモーターを利用したベクター も使用できる。 さらに、 AcNPVのエンベロープ表面タンパク質 GP67の分泌シグ ナル配列を目的タンパク質の N末端側に繋げることにより、 糸且換えタンパク質 を分泌タンパク質として発現させることも可能である （Zhe- mei Wang, et al. (1998) Biol. Chem. , 379, 167-174)。
真核微生物を宿主細胞とした発現系としては、 酵母が一般によく知られてお り、 その中でもサッカロミセス属酵母、 例えば、 パン酵母 Saccharomyces cerevisiaeや石油酵母 Pichia pastorisが好ましい。 該酵母等の真核微生物の 発現ベクターとしては、 例えば、 アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモータ一 (Bennetzen, J. L. and Hall, B. D. (1982) J. Biol. Chem. 257, 3018 - 3025) や酸性フォスファターゼ遺伝子のプロモーター （Miyanohara, A. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1-5) 等を好ましく利用できる。 また、 分泌 型タンパク質として発現させる場合には、 分泌シグナル配列と宿主細胞の持つ 内在性プ口テアーゼあるいは既知のプロテァーゼの切断部位を N末端側に持つ 組換え体として発現させることも可能である。 例えば、 トリプシン型セリンブ 口テア一ゼのヒトマスト細胞トリプターゼを石油酵母で発現させた系では、 N 末端側に酵母のひプアクターの分泌シグナル配列と石油酵母の持つ K E X 2プ 口テアーゼの切断部位をつなぎ発現させることにより、 活性型トリプターゼが 培地中に分泌されることが知られている （Andrew, L. Niles, et al. (1998) Biotechnol. Appl. Biochem. 28， 125 - 131)。
上記のようにして得られた形質転換体は、 常法にしたがい培養することがで き、 該培養により細胞内、 又は細胞外に目的の酸化亜鉛結合性抗体が産生され る。 該培養に用いられる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される 各種の培地を適宜選択できる。 例えば、 上記 COS細胞であれば、 RPMI1640培地 やダルベッコ変法イーグル培地 （以下 「DMEM」 という） 等の培地に、 必要に応 じゥシ胎児血清等の血清成分を添加したものを使用できる。
上記培養により、 形質転換された宿主細胞内又は細胞外に産生される組換え タンパク質は、 該タンパク質の物理的性質や化学的性質等を利用した公知の分 離操作法により、 分離 ·精製することができる。 該方法としては、 例えば、 タ ンパク沈殿剤による処理、 限外濾過、 分子ふるいク口マトグラフィー (ゲル濾 過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二ティ 一クロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー （HPLC) 等の各種液体ク 口マトグラフィー、 透析法、 を単独あるいは組合せて利用できる。 また、 発現 させる組換えタンパク質に 6残基からなるヒスチジンを繋げれば、 ニッケルァ フィニティー力ラムで効率的に精製することができる。 目的とする酸化亜鉛結 合性抗体タンパクは、 以上に記載した方法を適宜組み合わせることにより、 容 易に髙収率、 高純度で製造できる。
7 . 酸化亜鉛結合性抗体と第 2のタンパク質との融合
前述のとおり、 ラクダ抗体は一量体抗体であるため、 分子量が小さく、 各分 子がすべて共有結合で結ばれているため解離という現象が起こらなレ、。 そのた め、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体を他のタンパク質と融合させた組換えタンパ ク質を容易に調製することができる。 本発明はそのような融合タンパク質も提 供する。
融合タンパク質の作製は、 既報 （Nature Biotech. 23， 1126- 1136. / Cancer Immunol. Immunother. , 53, 497-509 (2004)、 Biochem. Biophys. Res. Commun.， 328， 98-105 (2005) ) を参照して実施することができる。
融合させるタンパク質として、 他の材料認識ペプチドを含むタンパク質 （材 料認識配列を有する第 2のタンパク質） を用いれば、 この融合タンパク質は、 異なる 2つの材料間を連結する役目を果たす。なお、「材料認識配列を有する第 2のタンパク質」 とは、本発明の酸化亜鉛認識ペプチドのように、ある材料（た とえば、 金属や金属酸ィ匕物） を特異的に認識して特異的に結合する配列を含む タンパク質を意味する。 そのようなタンパク質は、 例えば、 W02004/031381、 TO2005/010031、 W02006/064639, W02006/068250、 TO2006/126595、 Brown et al. , J. Mol. Biol. (2000) , 299, 725-735、 Naik et al. , Nature materials, (2002) , Vol. 1, November, 169— 172、 Naik et al.， J. Nanosci. Nanotech. , (2002) , Vol. 2: No. 1, 95-100、 Mao et al. , PNAS, (2003)， Vol. 100, No. 12. 6946-6951、 Mao et al. , Science, (2004) , Vol. 303, 213- 217等に記載のものなど、 当該分野で多 数知られており、 それらを適宜利用することができる。 こうした融合タンパク 質は、ナノ粒子の配列技術とナノ粒子間の接合技術等に利用することができる。 たとえば、 金材料認識ペプチド （LKAHLPPSRLPS：配列番号 2 0 ) や金結合性 抗体 （特開 2 0 0 5— 3 1 2 4 4 6号公報、 特開 2 0 0 6— 2 2 5 2 9 4号公 報） と本発明の酸化亜鉛結合性抗体を融合させたタンパク質は、 金材料表面に 酸化亜鉛粒子を固定化することができ、 また、 酸化亜鉛粒子と金ナノ粒子を接 合させることができる。
上記のほか、本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、 Hisタグペプチド， GSTタンパ ク質， 各種結合性タンパク質を融合させることによって、 タンパク質精製の用 途にも用いることができる。
8 . 酸化亜鉛結合性抗体による抗体固定化支持体 （プロテインチップ、 ナノ粒 子）
本発明は、 酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体を提 供する。 支持体の形状は酸ィ匕亜鉛層を含む限り特に限定されず、 基板状 （プロ ティンチップ等） であっても、 粒子状 （ナノ粒子等） であってもよい。
8 . 1 プロテインチップ
「安定」 ·「簡便」 ·「迅速」 な測定が可能なプロテインチップの作製には、 （1) タンパク質が吸着しにくい、 （2)選択的にタンパク質を固定化できる、 （3)基板 のパターニングが容易、 という条件の達成が望まれる。
従来基板へのタンパク質の固定化法として一般的なものは、（a)金基板への金 一硫黄結合を利用した固定化法、 (b)シランカップリング剤によるシリ力膜への 結合を利用した固定化法、（c)前記 (a) (b)の方法により結合された有機膜に提示 された官能基を利用した化学的結合による固定化法、 がある。 し力 し、 これら の手法は、 タンパク質固定化によりタンパク質の活性が低下する、 基板加工が 複雑、 タンパク質固定化法が多段階にわたる等の問題があった。
これに対し、酸化亜鉛はセラミックスであるためタンパク質が吸着しにくく、 本発明にかかる酸ィヒ亜鉛結合性抗体 (ラクダ抗体)を用いることにより、簡便 · 迅速に酸化亜鉛表面にタンパク質を固定化できる。 また、 酸ィ匕亜铅は、 半導体 加工技術 (微細加工技術）を用いることで、様々な構造の基板を作製可能である。 さらに、 既報のとおり、 そのパターニング技術が確立しており （特開 2 0 0 6 - 2 2 5 2 9 4号公報）、プロテインチップ等の固相基板の作製に有用といえる。 なお、固相基板の材質は酸化亜鉛層が形成可能である限り、特に限定されず、 金属、 ガラス、 シリコン等、 当該分野で汎用されている基板を適宜用いること ができる。
8 . 2 ナノ粒子/マイクロ粒子
本発明の酸化亜鉛結合性抗体を固定化した酸化亜鉛層を有する粒子 （ナノサ ィズ， マイクロサイズ） はタンパク質精製等の様々な分析に応用できる。 特に ナノ粒子はその表面積を生かしてマイクロ流路内における高感度分析に有用で ある。
また、 酸化亜鉛結合性抗体を固定化した酸化亜鉛粒子はタンパク質で粒子が 修飾されるため水溶液中での分散性がよく、 作用物質と効率よく反応する。 完 全分散が達成されると、 タンパク質間相互作用がおきたとき粒子が凝集するた め、簡便にタンパク質間の結合が解析できる。なお、こうした分散性の良さは、 インクジェット手法ゃスプレー手法でナノ粒子をパターニングする場合にも重 要である。
9 . バイオセンサ
本発明はまた、 酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸化亜鉛層を含む固相支持体 と、前記抗体を介した分子間相互作用を検出する手段を有するパイォセンサ (免 疫バイオセンサ） を提供する。 ここで、 抗体を介した分子間相互作用とは、 抗 体一抗原の相互作用に限定されず、 抗体と第 2抗体を介した抗原との相互作用 など、 抗体を介したアナライトとの結合 ·解離のすべてを含む。 検出手段は、 FET のような電気的検出手段、 表面プラズモン共鳴のような光学的検出など、 周知の検出手段のいずれであってもよい。 以下、 代表的な実施態様について記 載する。 また、 図 1 9に本発明の酸化亜鉛結合性抗体を利用したバイオセンサ の概念図を示す。
9 . 1 FET技術を利用したバイオセンサ
電解効果トランジスタ（Field- Effect Transistor, FET)は、 電気的検出を利 用したバイオセンサに汎用されている技術である。 原理は、 ソース電極からド レイン電極へ流れる電流を、 第三の電極であるゲート電極で制御し、 そのゲー ト電極表面でタンパク質間相互作用を起こさせるとゲート電極の電荷が変化す るため、 電流的応答が変化する（Anal. Chira. Acta 136, 93 (1982) )。 このゲー ト電極に酸化亜鉛を用いることによって、 FET技術を用いたタンパク質間相互 作用が測定できる。 すなわち、 バイオセンサとして利用できる。
タンパク質間相互作用を FETによって検出するためには、 その反応ができる だけグート電極表面に近い場所で起こる必要がある。 ラクダ抗体 4F2を接合ュ ニットとしたタンパク質固定化は、 ゲート電極に極めて近くに目的タンパク質 を固定ィヒできるため、 従来よりも高感度な FET、 これを利用したバイオセンサ に有用である。
9 . 2 表面プラズモン共鳴法を利用したバイオセンサ
表面プラズモン共鳴センサは、 表面プラズモン共鳴を利用し、 センサーチッ プ上で分子間相互作用をリアルタイムで解析できるバイォセンサである。既に、 市販の表面プラズモン共鳴センサ （例えば、 BIAcore社の S P R測定用金膜セ ンサーチップ Sensor Chip Au等） は容易に入手可能である。 センサーチップ上 ， に酸ィヒ亜鉛層を形成させれば、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体は高い結合性で安 定に吸着される。 こうして、 酸ィヒ亜鉛結合性抗体を結合させたセンサーチップ 上にマイクロ流路を設け、 ここにアナライト (抗原) を含むサンプルを一定の 流速で送液する。 抗体とサンプル中の抗原が相互作用をすれば、 表面ブラズモ ン現象により、 結合と解離が光学的に検出され、 センサグラムとしてリアルタ ィムでモニターできる。 表面プラズモン共鳴センサは、 微量サンプルを高感度 に検出できるとともに、 相互作用のキネテイクスをリアルタイムで解析できる という利点がある。 したがって、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体を結合させた表 面プラズモン共鳴センサは、 抗原抗体間相互作用解析のバイオセンサとして有 用である。
さらに、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体を酸化亜鉛の微細加工や、 酸化亜鉛の ドット （数百 / m程度） を用いた 2次元表面プラズモン共鳴 （SPR) に応用する ことも可能である。 微細加工した亜鉛などの無機材料 （半導体材料） 上への酸 化亜鉛膜形成は、 半導体作製技術を使って容易に実施することができる。 たと えば、 μ ιη レベルのパターニングであれば、 リフトオフ法やマスキングを利用 したスパッタ法で実施可能なほか、 Pd触媒を使った室温でのパター-ング (Adv. Mater. 14, 418-421 (2002) )も可能である。
9 . 3 リフレク トメ トリーを利用したバイオセンサ
リフレクトメ トリーとは、 レーザーを試料板に反射させ、 反射光を測定する ことによって、 試料版表面への蛋白質吸着量を測定する手法である。 このリフ レクトメ トリーの原理とマイクロ流体チップを組み合わせたリフレタトメ トリ 一バイオセンサは容易に入手可能である （フルイドウヱァテクノロジーズ (株） のリフレクトメ ト V一バイォセンサァレイシステム Fluid— RIfS等）。センサー チップ上に酸化亜鉛層を形成させれば、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体は高 V、結 合性で安定に吸着される。 こうして、 酸化亜鉛結合性抗体を結合させたセンサ 一チップ上にマイクロ流路を設け、 ここにアナライト （抗原） を含むサンプル を一定の流速で送液する。 抗体とサンプル中の抗原が相互作用をすれば、 吸着 タンパク質量がセンサグラムとしてリアルタイムでモニターできる。 リフレタ トメトリーバイオセンサは、 微量サンプルを高感度に検出できるとともに、 相 互作用のキネテイクスをリアルタイムで解析できるという利点がある。 したが つて、 本発明の酸化亜 結合性抗体を結合させたリフレタトメトリーバイオセ ンサは、 抗原抗体間相互作用解析のバイオセンサとして有用である。
上記の事例に限定されず、 本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、 赤外線などの電 磁波の透過光 ·反射光 ·近接場光 ·水晶発振子マイクロバランスを利用したバ ィォセンサにも応用可能である。また、他の免疫検出に用いられる周知の技術： たとえば、 免疫沈降、 ウェスタンブロット法、 ドットプロット法、 スロットブ ロット法、 ELISA法、 及び RIA法等の固相免疫法を適宜応用したバイオセンサ の開発も可能である。
1 0 . その他
酸化亜鉛基板上に固定化した本発明の酸化亜鉛結合性抗体は、 適当な条件を 設定することで容易に脱離させることができる。 すなわち、 条件を変えること で、 固定した酸化亜鉛結合性抗体を回収して分析することができる。 この際特 筆すべきは、脱離に使う溶液は通常のタンパク質調製水溶液（リン酸緩衝液等） でよく、 タンパク質は変性することなく、 活性構造を維持した状態で脱離させ ることができることである。 実施例
実施例 1 ：酸化亜鉛結合性ラクダ抗体の作製
1 . ZnO認識べプチドのラタダ抗体への移植
( 1 ) ラタダ抗体 cAb BCII-10
ラクダ抗体は、 本来相補性決定領域 (CDR)ループを安定化させる CDR H-1-H-3 間ジスルフィ ド結合を有するが、本実施例では、 CDRs間にジスルフィド結合を 有さない "Universal VHH framework" と名づけられた抗 /3 -lactamase ラクダ 抗体 cAb BCII-10 (J. Mol. Biol. 352 (2005) 597) をぺプチド移植する錶型 抗体と して用いた。 cAb BCII-10 は既報（Antimicrobial Agents and Chemotheraphy, 2807-2812 (2001) )の配列に従い作製した。
( 2 ) cAb BCII- 10及びペプチド移植ラクダ抗体の発現ベクターの構築
Overlap extension PCR法を用いて、 抗] 3 - lactamase抗体 cAbBCII- 10の CDR H-3領域の 103-114部位に EAHVMHKVAPRPからなる酸化亜鉛認識べプチド（配列 番号 1 ) を移植した抗体 VHH3をコードする遺伝子を全合成した。 その後、 ZnO 認識べプチド配列となっている CDR H-3を野生型の CDRに置換する primerを用 いて野生型 cAb BCII-10 (WT VHH)を作製した。 同様にして CDR H- 1、 H- 2に酸 化亜鉛認識べプチドを移植し、ぺプチド移植ラタダ抗体 VHH1， VHH2を作製した。 CDRへの移植箇所については、野生型ラクダ抗体の立体構造から、 CDR中の表面 に露出している 12アミノ酸残基（29- 35残基， 53-69残基， 102-117残基）を選 択した。 作製した発現ベクターの模式図を図 1Aに示す。 また、 PCR反応溶液組 成と反応条件 （表 1)、 使用した PCRプライマーとぺプチド移植ラクダ抗体のァ ミノ酸配列 （表 2 ) を以下に示す。
[表 1 ]
<PCR反応溶液の組成》 <PCR反応条件》
Template 1ml denaturation 94 ^ 30 sec primer (10pmol/ml) 各 5ml annealing 52 ^ 1 min 30 cycle
10xPCR buffer for LA Taq 5ml extension 72 °C 2 min dNTP 2mM each 8ml
25mM MgCI2 5ml
LA Taq polymerase 0.5ml
ddH20 20.5ml
Total 50ml
VHH3 全合成用 primer
VHH3-NcoI (Reverse) 5， -NN CCATGGCCCAGGTTCAGCTGGTTGAAAG- 3， （配列番号 2 1 )
VHH3-1 (Reverse) 5 ' -CAGGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGCGGCGGCAGCGTGCAGGCGGGCGGCA
GCCTGCGCCTGAGCTGCACCGCGAGCGGCGGCAGCGAATATAGCTAT-3 ' (配列番号 2 2 )
VHH3-2 (Forward) 5， -AATTGCTGCCACTGCTTCGCGTTCCTGGCCCGGCGCCTGGCGAAACCAG
CCCAGGCTAAAGGTGCTATAGCTATATTCGCTGCCGCC-3 ' (配列番号 2 3 )
VHH3-3 (Reverse) 5 ' -GCGAAGCAGTGGCAGCAATTGCGAGCATGGGCGGCCTGACCTATTATGC
GGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATTAGCCGCGATAACGCGAAAAAC-3' (配列番号 2 4 )
VHH3-4 (Forward) 5， -GCTTCCACTGCTGCGCAATAATAAATCGCGGTATCTTCCGGTTTCAGGT
TGTTCATCTGCAGGGTCACGGTGTTTTTCGCGTTATCGCGGC-3' (配列番号 2 5 )
VHH3-5 (Reverse) 5 ' -TATTGCGCAGCAGTGGAAGCGCATGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGCC
CGTTTCGCTATTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTGAGCAGC-3' (配列番号 2 6 )
VHH3- sacll (Forward) 5' -NNNCCGCGGATGAAACGGTAACCTGGG-3 ' (配列番号 2 7 )
WTVHH合成用 p—rimer WTVHH (Forward) 5， -GCTCGGCAGGCGCATAAAATAGCCGCGCACTGCTGCGCAATAATAAATCG - 3 ' (配列番号 2 8 )
WTVHH (Reverse) 5， -TATTTTATGCGCCTGCCGAGCAGCCATAACTTTCGCTATTGGGGCCAGGG - 3 ' (配列番号 2 9 )
VHH1, VHH2, ZnOtaR-WTVHH作製用 primer
VHH-1 (Forward) 5' - GCGCCACTTTATGCATCACATGCGCTTCGCTACCACCGCTCGCGGTGCAGC TCAG-3' (配列番号 3 0 )
VHH-1 (Reverse) 5， -TGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGAGCCTGGGCTGGTTTCGCCAG- 3 ' (配列番号 3 1 )
VHH-2 (Forward) 5 ' - GCGCCACTTTATGCATCACATGCGCTTCCGCAATTGCTGCCACTGCTTC - 3 ' (配列番号 3 2 )
VHH-2 (Reverse) 5' -TGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTT- 3 ' (配列番号 3 3 )
ZnOtag-VHH (B) 5 ' -NNNCCATGGCCGAAGCGCATGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGCAGGT TCAGCTGGTTGAAAG-3， (配列番号 3 4 )
[表 2 ]
Figure imgf000021_0001
CDFHH1 CDR-H2 ① QVQLVESGGG SVQAGGSLRL SCTASGGSEY SYSTFSLGWF RQAPGQEREA VAAIASMGGL
1 10 20 30 40 50 60
② QVQLVESGGG SVQAGGSLRL SCTASGGSEAHVMHKVAPRPISLGWF RQAPGQEREA VAAIASMGGL 1 10 20 30 40 50 60
③ QVQLVESGGG SVQAGGSLRL SCTASGGSEY SYSTFSLGWF RQAPGQEREA VAAlAfeAHViyj 1 10 20 30 40 50 60
©QVQLVESGGG SVQAGGSLRL SCTASGGSEY SYSTFSLGWF RQAPGQEREA VAAIASMGGL
1 10 20 30 40 50 60
⑤ QVQLVESGGG SVQAGGSLRL SCTASGGSEAHVMHKVAPRRSLGWF RQAPGQEREA VAAIASMGGL
1 10 20 30 40 50 60
CDR-H3
① TYYADSVKGR FTISRD瞧 N TVTLQMNNLK PEDTAIYYCA AVRGYFMRLP SSHNFRYWGQ
70 80 90 100 110 120 ② TYYADSVKGR FTISRDNAKN TVTLQMNNLK PEDTAIYYCA AVRGYFMRLP SSHNFRYWGQ
70 80 90 100 110 120
③ IHKVAPRPIDSVKGR FTISRDNAKN TVTLQMNNLK PEDTAIYYCA AVRGYFMRLP SSHNFRYWGQ
70 80 90 100 110 120
④ TYYADSVKGR ISRD AK TVTLQMNNLK PEDTAIYYCA AN EAHVMHKV APRPFRYWGQ
70 80 90 100 110 120 ⑤ TYYADSVKGR FTISRDNA N TVTLQMNNLK PEDTAIYYCA AVRQHLGHGL HRVHFRYWGQ
70 80 90 100 110 120 φ GTQVTVS
② GTQVTVS
③ GTQVTVS
④ GTQVTVS
⑤ GTQVTVS 2 . 酸化亜鉛認識ぺプチド移植ラクダ抗体 VHH1、 VHH2、 VHH3の大腸菌発現と構 造 ·機能評価
前項で作製した VHH1、 VHH2、 VHH3発現ベクターを用いて、 大腸菌 BL21 (DE3) を形質転換し、タンパク質を発現させた。タンパク質の精製方法を図 2Aに示す。 VHH1、 VHH2、 VHH3のいずれも、 可溶性画分として調製できた（図 2B)。 その調製 タンパク質を、 ゲノレろ過クロマ トグラフィー（Superdex75 ; 50mM Tris- HC1 (pH8. 0) /200 mM NaCl)と円偏光二色性（AVIV 円二色性分光計（Proterion Co.， New jersey, USA) ； path length, 1. 0 mm; resolution, 0. 2 nm; average time, 4 s)により評価したところ、 VHH1と VHH3は単量体の単一成分で（図 3中の赤線， 青線）、かつ、 ラクダ抗体特有の円偏光二色性を示したのに対し（図 4中の赤線， 青線）、 VHH2 は均一なゲルろ過クロマトグラムを示さず、 円偏光二色性もラク ダ抗体特有のものではなかった（図 3, 4中の黄緑線）。
次に、 調製された VHH1、 VHH2、 VHH3の酸化亜鉛粒子との活性評価を行った。 具体的には、 粒径 100 nmの酸化亜鉛と 10 リン酸緩衝液（界面活性剤含）中 で混合し、 遠心後上清と沈殿物 (酸化亜鉛）に分離した（図 5)。 沈殿物に関して は、 数回上記リン酸緩衝液で洗浄し、 最後に 6M グァニジン塩酸塩 (GdnHCl)水 溶液を用いて吸着しているタンパク質を可溶化させ、 SDS- PAGEにより評価した (図 6)。 SDS- PAGEの結果は、 VHH1は酸化亜鉛に対して結合し（図 6A)、 材料特異 性も保持していることが分かった （図 6A)。 VHH3に関しては、 10 mM リン酸緩 衝液を使用した際には結合特性は見られなかったが、 1 mMリン酸緩衝液を使用 した際は、 ZnOに結合した（図 7)。 これより、 VHH3 も ZnOに対して結合機能が あるが、 VHH1と比較すると、 その結合活性は弱いことがわかった。
さらに、 VHH1 に対して、 ラングミュアプロットによる結合評価を行った（図 8)。 その場合、 酸化亜鉛に対する VHH1の解離平衡定数は、 176 nMあり、 WT VHH の N末端に酸化亜鉛認識べプチドを融合したもの（3. 30 X 10— 7 M)と同程度の活 性と評価された。 これより、 CDR H-1 領域にペプチドを移植しても、 ラタダ抗 体自身の立体構造は保持され、ぺプチドの活性も低下しないことが確認された。 実施例 2 ： In vitroァフィ二ティマチユレーションによる高親和性ラクダ抗体 の作製
実施例 1で作製された VHH1を母体として、より活性を向上させることを試み た。 具体的には、 酸化亜鉛認識ペプチドを移植していない CDR H-3領域に注目 し、 そのアミノ酸配列をランダム化しライブラリーを構築した。 CDR H-2 領域 は、 実施例 1の結果より、 この部分の配列を変えるとラクダ抗体の構造が変性 し活性を失うことがわかったため改変には利用しなかった。 ライブラリ一は、 CDR-H3領域の 105残基から 114残基部分を図 9に示した配 列でライプラリー化して作製した。 図中の H (R)部分の遺伝子は、 DNAの塩基配 列が、 「（Cもしくは Aもしくは G) (Tもしくは Cもしくは A)」 となるようし設 計し、 His残基もしくは Arg残基になるようにした。そして、 Xに関しては、 「（C もしくは G) (Tもしくは G) (Aもしくは Tもしくは Gもしくは 0」 とし、 Gly 残基もしくは Leu残基もしくは Arg残基もしくは Val残基となるようにした。 作製した遺伝子ライブラリーをファージミ ドベクター ρΤΖへ導入し、 M13ファー ジに抗体断片ライブラリーが提示した、 VHH1ライブラリーを調製した。 すなわ ち、ぺプチド移植抗体 VHH1を鎵型として Overlap extension PCRにより CDR H - 3 をランダム化させた遺伝子断片を増幅した後、 ファージミ ドベクター pTZ (図 1B)へ導入した。 PCR反応溶液組成と反応条件は実施例 1の表 1 と同様であり、 変異導入プライマーの配列は以下のとおりである。
CDRH- 3ランダムィ匕 primer
VHH3- Ncol (Reverse) 5 ' - NNNCCATGGCCCAGGTTCAGCTGGTTGAAAG- 3， （配列番号 3 5 )
H3-random (Reverse) 5， - ATTGCGCAGCAGTGCGCGGTCRCSKTSKTCRCSKTSKTCRCSKTSK TCRCTTTCGCTATTGGGGCCAGGG-3 ' (配列番号 3 6 )
H3- random (Forward) 5 ' -CCCTGGCCCCAATAGCGAAAGYGAMSAMSGYGAMSAMSGYGAMSAM SGYGACCGCGCACTGCTGCGCAAT-3 ' (配列番号 3 7 )
VHH3-sacII (Forward) 5， -NNNCCGCGGATGAAACGGTAACCTGGG- 3 ' (配列番号 3 8 ) 本研究において使用したファージミ ドベクター pTZは、 lacプロモーターが目 的遺伝子とは逆の方向に配置してあり、 mRNAの転写が g3p末端に位置するフ了 ージ由来の gVIプロモーターから開始される。 これにより g3pとの融合タンパ ク質の産生が適度に抑制され、 遺伝子欠損を生じることなく、 より多種類のク ローンを提示させることが可能となる。 作製したファージミ ドベクターを用い てエレクトロポレーシヨン法により大腸菌 DH12S株を形質転換し、 20 ml LB培 地に植え継ぎ 37°C， 0/Nで培養後、 プラスミ ドの抽出を行い、 これをファージ ミ ドライブラリーとしてファージ提示法の操作に用いた。 作製したライブラリ 一の規模は 6. 5 X 104, 形質転換体は 1. 2 X 105であった。
次に、 作製したファージ抗体ライブラリーからより親和性の高い酸化亜鉛特 異的ラクダ抗体を選択した。 リン酸は酸化亜鉛表面と結合し、 タンパク質の吸 着を防ぐことが以前の実験より確認されていたため、 ファージ抗体ライブラリ 一溶液を酸化亜鉛粒子と混合した後、 酸化亜鉛に結合しない、 もしくは、 弱く 結合する抗体提示ファージは、 リ ン酸（10〜50raM) と界面活性剤（0. 05% Tween-20)を含む水溶液で取り除いた（洗浄操作)。強く結合したファージは、高 濃度なリン酸水溶液 (200 ）を用いて取り除き、 取り除いたファージを再増幅 させた。
具体的には、調製したファージ抗体ライブラリー 840 μ ΐを ZnO粉末 (0. 2 mg) に添加し、 1 hr混合した。 ZnOに対する非特異吸着分子を 10mM phosphate (pH7. 4) I 200mM NaCl I 0. 05% Tween20溶液にて洗浄後、 0. 2M phosphate buffer (pH7. 4, 200mM NaCl)にて結合ファージ抗体を溶出した。 回収したファージ抗体を 0. D. 600nm = 0. 5まで培養した大腸菌 JM109株に再感染させ増幅し、 菌体をプレ ートにまいた。 プレート上のファージ遺伝子を含んだ大腸菌を回収後、 再ぴフ ァージ抗体を調製し、 繰り返しバニング操作を行った。 ZnO に強固に結合する ファージ抗体を取得するために、 ラウンド毎に洗浄における phosphate濃度を 上げた。 以上の操作を 4ラウンド繰り返し、 ZnOに対する結合能を有する抗体 の濃縮を行った。 各種条件を表 3に示す。
[表 3 ]
Figure imgf000024_0002
その結果、 CDR- H3 に表 4のアミノ酸配列を持つラクダ抗体が選択された。 各々のラクダ抗体に対して、 ラングミュアプロットにより酸化亜鉛に対する親 和性を評価したところ、 表 5の結果が得られ、 4F2 が最も親和性が高いことが 確認された。
[表 4 ]
Figure imgf000024_0001
[表 5 ]
各クローンの飽和結合 ^ ： (Ws) , 解離平衡定数 (Kd )
1,52 rn^
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4F2に対しては、 材料選択性についても評価した（図 10)。 すなわち、 酸化亜 鉛と同様の方法で、 酸化鉄、 酸化チタンへの結合性を調べたところ、 若干結合 するものの、 酸ィ匕亜鉛に対してのみ強い選択性があることがわかった。 また、 作製した 4F2を、 ゲルろ過クロマトグラフィーと円偏光二色性測定により評価 したところ、単量体の単一成分で（図 11中の橙線）、 かつ、抗体特有の 構造の 円偏光二色性を示し（図 12中の橙線)、野生型と同様の抗体分子構造を保持して いることが確認された。表 6に 4F2の全ァミノ酸配列（配列番号 1 4 )を示す。
[表 6 ]
CDR-H1
QVQLA ESGGGSVQAQGSLRLSOTASGGaEAHVMHKVAP nSLG FRQAPGQEREAVAAIAS
GGLTYYADSVRGRFTiSRDNAKNTVTLQMNNLKPEDTAIYYCiAAV lLGHGLH riHT G
CD -H3
QGTQVTVS 実施例 3 ：ラクダ抗体 4F2を用いた酸化亜鉛粒子の分散性向上
抗体断片（WT VHH,もしくは VHH1もしくは 4F2)水溶液（10mM リン酸緩衝液） 1 mlに対して、 0. 5 mgの酸化亜鉛微粒子（粒径 15〜35 nm)を加え、 10秒間超音 波処理をし、その後の粒子分散性を評価した。抗体断片濃度が 3 1\1の時は、 VHH1 もしくは 4F2使用で酸化亜鉛粒子の分散性は 1日経過後も保持されていた（図 12)。 し力 し、 抗体濃度が 0. 5 Mの時は、 4F2のみ酸化亜鉛微粒子の分散性が 維持された（図 13)。 実施例 4 ：固定した酸化亜鉛結合抗体の脱離
酸化亜鉛結合生抗体水溶液を酸化亜鉛粒子と混合 ·遠心分離後、 酸化亜鉛粒 子を取り出し、 その粒子に様々なリン酸濃度のリン酸緩衝液を加え、 抗体の上 清への解離を測定した（図 14)。 すべての抗体は酸化亜鉛に結合した後、 10mM 以上 500mM以下のリン濃度のリン酸緩衝液を適切に調製す; ^ばその抗体を酸化 亜鉛表面より脱離させることができた。 実施例 5 ： 4F2と金認識抗体を融合させた酸化亜鉛一金連結タンパク質の作製 ZnOに高親和性を示す 4F2抗体と Auに結合する Au VHHlをヒンジリンカーで 融合することで、 二重特異性抗体を作製する。 Overlap extension PCR法を用 いて、既に報告されている Au結合ペプチド移植抗体 AuVHHlと ZnO結合抗体 4F2 をリンカ一： Llama IgG2 upper hinge (EPKIPQPQPKPQPQPQPQPQPKPQPKPEP (配列 番号 3 9 ) を介して結合し、 4F2-AuVHHlの遺伝子を作製する。 実施例 1にした 力 Sい、 以下のプライマーを用いて、 この遺伝子を組み込んだ発現ベクター： PRA4F2-AuVHHl (図 1 C) を作製する。
4F2-AuVHHl作製用 primer
T7 promoter 5， - GAAATTAATACGACTCACTATAGGG - 3， （配列番号 4 0 )
VHH- Eagl - Hinge (Forward) 5， -TTGCGGTTGTGGTTGCGGTTGCGGTTTCGGCTGCGGCTGCG GAATTTTCGGTTCGGCCGATGAAACGGTAACCTGGGTG-3' (配列番号 4 1 )
Hinge-Bam-VHH (Reverse) 5 ' - CAACCGCAACCACAACCGCAACCGCAGCCGAAACCGCAGCCG AAACCGGAACCGGGATCCCAGGTTCAGCTGGTTGAAAGC-3 ' (配列番号 4 2 )
T7 terminater 5' - GCTAGTTATTGCTCAGCGG -3， （配列番号 4 3 )
この融合タンパク質を介して、 金材料表面と酸化亜鉛粒子、 あるいは酸化亜 鉛粒子と金ナノ粒子を接合できる。 実施例 6 ：表面プラズモン共鳴を用いた結合活性評価
1 . 酸化亜鉛結合性抗体の酸化亜鉛結合活性評価
BIAcore社の S P R測定用金膜センサーチップ Sensor Chip Auに酸化亜鉛膜 を作製し、 BIAcore (登録商標） 2000 を用いて抗体の酸化亜鉛膜に対する親和 性を測定する。 具体的には、 Sensor Chip Auの金プレート表面にスパッタ法な どにより、酸化亜鉛膜を数 nn！〜 50nmの膜厚で作製する。そして、そのプレート を BIAcore (登録商標） 2000に設置し、 抗体水溶液を流して、 抗体の酸化亜鉛 膜 の吸着を測定する。
酸化亜鉛膜は、 作製の条件を変えることによって、 結晶構造を変化させるこ とができるので、酸ィ匕膜の結晶性の違いによる抗体の吸着特性 (下記の結合速度 (ka) , 解離速度 (kd)，解離定数 (KD)と飽和結合量）も評価する。 定量的評価は、 前記装置に添付された解析ソフトに従って得られる結合曲線から、 抗体の酸化 亜鉛に対する結合速度 (ka)， 解離速度（kd)，解離定数 (KD)を求めて行う。 2 . 酸化亜鉛結合性抗体固定化亜鉛結合基板の抗原結合活性評価
前項で酸化亜鉛結合性抗体を吸着させた酸化亜鉛膜を有するセンサーチップ (基板） 上にマイクロ流路を設け、 ここにアナライト （抗原） を含むサンプル を一定速度で送液し、 抗体とサンプル中の抗原の相互作用を表面プラズモン現 象によりリアルタイムにモニターする。
本発明の酸化亜鉛結合性抗体を吸着させたセンサーチップは、 それ自体が、 抗原抗体間相互作用のキネテイクスを解析するためのセンサーチップとして利 用できる。 実施例 7 : リフレクトメトリ一を用いた酸化亜鉛結合性抗体の酸化亜鉛への吸 着特个生とプロテインチップ'フロー系センサーへの応用
リフレク トメ トリーとは、 レーザーを試料板に反射させ、 反射光を測定する ことによって、 試料版表面への蛋白質吸着量を測定する手法である。 このリフ レクトメトリーの原理とマイクロ流体チップを組み合わせたリフレタトメトリ 一バイオセンサアレイ ステム Fluid— RIfS (フ イドウェアテクノロジーズ (株)製） を用いて、 そのシリコン基板上に酸化亜鉛薄膜と微小流路を設計し、 蛋白質水溶液を展開させることによって、 酸化亜鉛基板上への蛋白質吸着量を 測定した。
緑色蛍光蛋白質 GFPを展開してみると、 10mM， 30 mM リン酸水溶液中ではほ とんど酸ィ匕亜鉛基板へ吸着しなかった（図 2 0中の黒点線， 黒破線)。これより、 酸化亜鉛表面に GFPはほとんど物理吸着しないことがわかった。 しかし、 N末 端に酸化亜鉛結合性ぺプチド（EAHVMHKVAPRP)を融合した GFPは酸化亜鉛基板へ の明確な吸着を示し、 30 mMリン酸水溶液中で飽和結合量が約 89 nmol/m2であ つた（図 2 0 )。 しかし、 展開溶液を、 蛋白質を含まないリン酸水溶液に交換す ると（解離工程）、 ぺプチド融合 GFPは一部解離していった。
次に、 酸化亜鉛結合性ラクダ抗体 4F2を用いて同様の実験を行ったところ、 酸化亜鉛結合性ぺプチド融合 GFPと同様に酸化亜鉛基板への吸着を示したが、 その吸着量は約 130 nmol/m2とぺプチドの約 1. 5倍であり、 さらに解離工程に おいても、 ほとんど蛋白質の解離は観測されなかった（図 2 1 )。 これより、 酸 化亜鉛への結合性が強い 4F2は酸化亜鉛基板上へ、 安定的強く、 かつ、 迅速に 蛋白質を固定化できるタグとして使用できることが確認できた。
さらに、 4F2と GFPに結合性を示すラクダ抗体 (抗 GFPラクダ抗体）を融合さ せて、 GFP検出バイオリフレタトセンサーを作成し、 評価した。 その結果、 4F2 を介して、 80%の活性を保持した状態で抗 GFPラクダ抗体を酸ィヒ亜鉛表面へ固 定化させることができ、 さらに、 GFPも検出できることが確認できた（図 2 2中 の上の線) 比較例 1 ：マウス由来抗ニヮトリ卵白リゾチーム抗体を用いた酸化亜鉛結合性 抗体の作製
実施例 1にしたがい、 ラクダ抗体のかわりに、 抗ニヮトリ卵白リゾチーム抗 体 HyHEL- 10 Fv (Protein Data Bank : 1C08， J. Biol. Chem. 274 27623-27631 (1999)、 立体構造：図 16A) を用いて、 その 6つの CDR領域にそれぞれ酸化亜 鉛認識べプチドを移植した。
. すなわち、 ZnO結合性ぺプチドの配列（EAHVMHKVAPRP)をもとに PCR primerを 設計し、本研究室既存の HyHEL- 10 VH (or VL)遺伝子を含むベクター pRA- WT VH (or VL)を铸型として、 以下のプライマーを用いて、 Overlap Extension PCR を行い、 各 CDRにぺプチド配列を移植した。
VH-2 (CDRH-2) , VH-3 (CDRH-3) 作製用 primer
VH-NcoI 5 ' -NNNCCATGGCCGATATCCAGCTGCAG-3 ' (配列番号 4 4 )
VH- SacII 5 ' -顯 NCCGCGGAGACGGTGACGAGGGTGC- 3， （配列番号 4 5 )
H2— Forward 5， -GCGCCACTTTATGCATCACATGCGCTTCGCCCATGTACTCGAGGCGGT-3 ' (配 列番号 4 6 )
H2— Reverse 5 ' -TGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGCGCATCTCGATCACCCGCGA-3 ' (配 列番号 4 7 )
H3— Forward 5 ' -GCGCCACTTTATGCATCACATGCGCTTCGTTCGCGCAGTAGTAGGTGG-3 ' (配 列番号 4 8 )
H3一 Reverse 5 ' -TGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGTGGGGCCAGGGCACCCTCGT-3 ' (配 列番号 4 9 )
VL-2 (CDR L-2)， VL- 3 (CDR L- 3) 作製用 primer
Reverse primer
VL-NcoI 5' -NNNCCATGGCCGATATCGTCCTGACCC-3 ' (配列番号 5 0 )
VL- SacII 5， -画 CCGCGGCCTTGATCTCCAGCTTGG - 3， （配列番号 5 1 )
L2_For ard 5， - GCGCCACTTTATGCATCACATGCGCTTCCTTGATCAGGAGGCGCGGG- 3， （配 列番号 5 2 )
L2— Reverse 5 ' -TGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGGGGATTCCGTCGCGCTTCAG-3' (配 列番号 5 3 )
L3— Forward 5 ' -GCGCCACTTTATGCATCACATGCGCTTCGCAGAAGTACATGCCGAAGTC-3 ' (配列番号 5 4 )
L3_Reverse 5， -TGTGATGCATAAAGTGGCGCCGCGTCCGTTCGGCGGCGGCACCAAGC-3' (配 列番号 5 5 ) [表 7 ]
《PCR反応溶液の組成》 <PCR反応条件》
Template Ιμΐ denaturation 94 C 15 sec
primer (lOpmol/ml) 各 5μ1 annealing 54 C 30 sec 30 cycle extension 68 C 1 min
Figure imgf000029_0001
ΙΟΟμΙ つぎに、 PCR増幅した各 DNA断片と本研究室既存の発現ベクター pRA - scFv (HyHEL-10 scFv発現ベクター）を Iと Ssc Πで制限酵素消化した後、 連結 し、 VH - 2, VH-3, VL-2, VL - 3各単独発現ベクターを作製した。 さらに、 本研究 室既存の HyHEL- 10 Fv共発現ベクター pRA - PKTN2 VH及び PRA - pKTN2 VL を Nco l と &c IIで制限酵素消化し、 繋ぎかえることで Fv (H-2) , (H - 3)， （L - 2) , (L- 3) の共発現ベクター （図 15) を作製した。
移植した抗体について、 酸化亜鉛結合性を調べたところ、 重鎖の CDR-2にぺ プチド移植したものが、 酸化亜鉛結合活性を示したが、 精製過程において VH と VLが解離してしまう現象を回避できなかつた（図 ΙδΒ)。ぺプチド移植した VH 領域のみ単独で、 大腸菌発現させ精製し、 円偏光二色性を測定したところ、 抗 体特有のシグナルを示さず、 ランダム構造を示すシグナルが得られた（図 16C)。 上記のとおり、 マウス由来抗ニヮトリ卵白リゾチーム抗体は解離を回避する ことができなかった。 そこで、大腸菌発現の際に倍地上清に分泌されてくる Fv を精製せずにそのまま用いて酸化亜鉛に対する結合評価を行った （図 17A)。そ の結果、 V鎖の CDR- H2に移植したものが活性を示したので、 VH鎖だけの形で精 製し、 酸化亜鉛に対する結合評価を行った（図 17B)。 VH鎖は活性は示したもの の、 構造が不安定であるため、 定量的評価はできなかった。 参考例 1 ：短い酸化亜鉛認識ペプチドの結合評価
酸化亜鉛への結合に必要なぺプチドの長さを調べるために、 酸化亜鉛認識ぺ プチド （EAHVMHKVAPRP) の断片の結合評価を行った（図 1 8 )。 その結果、 前記 配列の 1-7ァミノ酸残基からなるぺプチド（EAHVMHK)が最も高い結合平衡定数 (解離平衡定数の逆数）を示すことがわかった。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考とし て本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 酸化亜鉛に抗体分子を安定かつ特定の配向で結合させるこ とができる。 この技術は、 バイオセンサ、 プロテインチップ等、 ハイスループ ットなセンシング技術の開発に利用できる。 配列表フリーテキス ト
配列番号 1 ：酸化亜鉛認識ぺプチド （ZnOl)
配列番号 2 ：酸化亜鉛認識ペプチド （Zn02)
配列番号 3 ：酸化亜鉛認識べプチド （Zn03)
配列番号 4 ：酸化亜鉛認識ペプチド （Ζη04)
配列番号 5 ：酸化亜鉛認識べプチド （Ζη05)
配列番号 6 ：酸化亜鉛認識領域の配列
配列番号 7 ： cAb BCII-10
配列番号 8 ：酸化亜鉛結合モチーフ
配列番号 9 ： H-3領域導入配列
配列番号 1 0 ：高親和性変異体 H-3領域導入配列 (3D2)
配列番号 1 1 ：高親和性変異体 H- 3領域導入配列 (3E2)
配列番号 1 2 ：高親和性変異体 H- 3領域導入配列 (4D4)
配列番号 1 3 ：高親和性変異体 H- 3領域導入配列 (4F2)
配列番号 1 4 ： 4F2の全ァミノ酸配列
配列番号 1 5 ： VHH1の全ァミノ酸配列
配列番号 1 6 ： VHH2の全アミノ酸配列
配列番号 1 7 ： VHH3の全ァミノ酸配列
配列番号 1 8 ：図 9の cAb BCII-10 CDR H-3配列 (102 - 配列番号 1 9 ：図 9の cAb BCII-10 CDR H-3移植配列
配列番号 2 0 ：金認、識ぺプチド
配列番号 2 1 ' - 3 8 :プライマ一
配列番号 3 9 ： リンカー配列（Llama IgG2 upper hinge)
配列番号 4 0 ' - 5 5 :プライマー

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ラクダ抗体の CDR H-1領域に EAHVMHKを含むァミノ酸配列からなる酸化亜 鉛認識べプチドを含むぺプチド移植抗体、 あるいは前記べプチド移植抗体の CDR H - 3領域にさらに変異を有し、 かつ前記べプチド移植抗体より高い酸化亜 鉛親和性を有する変異体からなる、 酸化亜鉛結合性抗体。
2 . 前記変異体が CDR H-3領域に HXXHXXHXXHあるいは HXXHXXHXXRからなるぺ プチド （但し、 Xは G、 L、 R、 又は Vである） を含むものである、 請求項 1に記 載の酸化亜鉛結合性抗体。
3 . 前記変異体が CDR H- 3領域に HLGHGGHRLH、 HLGHGGHGLH、 HVGHGLHGVR, 又は HLGHGLHRVH力 らなるぺプチドを含むものである、請求項 1に記載の酸化亜鉛結 合性抗体。
4 .酸化亜鉛との解離平衡定数 Kdが 1. 7x10— 7 [M]より小さいことを特徴とする、 請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
5 .酸化亜鉛との解離平衡定数 Kdが 9. 5xl0"9 [M]より小さいことを特徴とする、 請求項 4に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
6 .前記酸化亜鉛認識べプチドが EAHVMHKVAPRPである、請求項 5に記載の酸化 亜鉛結合性抗体。
7 . ラクダ抗体の CDR H-1領域に EAHVMHKVAPRPからなる酸化亜鉛認識べプチド を含み、 かつ、 CDR H-3領域に HLGHGLHRVHからなるペプチドを含む、 酸化亜鉛 結合性抗体。
8 . 前記ラクダ抗体が、 CDR 間のジスルフィド結合を有しないものである、 請 求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の酸化亜鉛結合性抗体。
9 . 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の酸化亜鉛結合性抗体をコードする遺 伝子を含み、 該遺伝子によってコードされるタンパク質を発現しうる発現べク ター
1 0 . 配列番号 1 4に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子を含み、 該ァ ミノ酸配列からなるタンパク質を発現しうる請求項 9に記載の発現ベクター。
1 1 . 請求項 9又は 1 0に記載の発現ベクターを導入した宿主細胞を培養し、 その培養物から酸化亜鉛結合性抗体を取得することを特徴とする、 酸化亜鉛結 合性抗体の製造方法。
1 2 . 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の酸化亜鉛結合性抗体を固定した酸 化亜鉛層を含む固相支持体。
1 3 . 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の酸化亜鉛結合 1"生抗体を固定した酸 化亜鉛層を含む固相支持体と、 前記抗体を介した分子間相互作用を検出する手 段を有するバイォセンサ。
1 4 . 請求項 1〜 8のいずれか 1項に記載の酸化亜鉛結合性抗体に、 第 2のタ ' ンパク質を融合させた融合タンパク質。 '
1 5 . 前記第 2のタンパク質が、 LKAHLPPSRLPSの配列を有する金認識べプチド を含むものである、 請求項 1 4に記載の融合タンパク質。
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