KR100965480B1

KR100965480B1 - 재조합 융합단백질, 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를이용한 목적물질의 면역검출법

Info

Publication number: KR100965480B1
Application number: KR1020070124593A
Authority: KR
Inventors: 고성호; 박태정; 조용진
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2007-12-03
Filing date: 2007-12-03
Publication date: 2010-06-24
Also published as: KR20090057835A

Abstract

본 발명은 재조합 융합단백질과 이를 이용한 바이오센서, 및 면역 검출법에 관한 것으로서, 본 발명에서는 골드결합단백질을 코딩하는 유전자와 protein A(G)를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물에 의해 발현된 재조합 융합단백질, 상기 융합단백질을 골드-고체상에 고정하는 것을 특징으로 하는 면역바이오센서의 제작 방법, 상기 방법으로 제작된 면역바이오센서의 목적물질의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 모든 종류의 항체를 칩 표면에 간단히 고정화 할 뿐만 아니라 고정화된 항체의 적절한 배향성(orientation)을 부여하여 면역바이오센서 제작 시 생산성과 경제성이 향상될 뿐만 아니라 민감도와 선택성을 증가시키는 효과를 기대할 수 있다.

골드결합단백질(GBP), protein A, protein G, 융합단백질, 면역바이오센서

Description

재조합 융합단백질, 및 이를 이용한 바이오센서 및 이를 이용한 목적물질의 면역검출법{Recombinant fusion protein, Biosensor using the same, and Immuno-detecting method for target material with the same}

본 발명은 서열번호 10의 염기서열로 암호화된 재조합 융합 단백질 또는 서열번호 11의 염기서열로 암호화된 재조합 융합단백질, 이를 이용한 면역 검출용 바이오센서 및 면역 검출법에 관한 것이다.

항체를 기본으로 하는 면역분석법은 목표항원에 대한 높은 선택성과 친화성 때문에 바이오물질들을 분석하는데 매우 중요한 기술 중의 하나이다(Fung et al., Curr. Opin. Biotechnol., 12:65, 2001; Zhu and Snyder, Curr. Opin. Chem. Biol., 5:40, 2001). 이러한 면역분석법 분야에서, 골드 콜로이드 입자, 나노-골드 입자, 골드-코팅 입자, 혹은 골드가 도포된 기판과 같은 골드-함유 고체상(solid phase)에 항체의 효과적인 고정화는 바이오센서는 필수적인 단계이다.

일반적으로, 항체나 다른 단백질들은 생물학적 활성을 유지한 채 골드에 쉽 게 흡착되지 않는다. 항체를 골드에 물리적으로 흡착시키는 현재의 대부분의 방법은 실험 중 용액상태에서 떨어져 나갈 수 있어 지속적인 실험 결과를 얻지 못하여 불안정하기 때문에 골드 표면에 항체를 견고히 고정화 시키는 것은 중요하다. 또한 항체가 골드 표면에 임의로 흡착이 일어날 수 있어 항원이 결합하는 활성화 부위가 항원이 있는 용액의 방향으로 향하는 적절한 배향성(orientation)을 유지 하지 못 할 수 있고 항체의 변성도 야기 시킬 수 있다. 이러한 결과는, 항체-골드 반응을 응용하는 분야에서 민감성(sensitivity)과 재현성(reproducibility)을 떨어뜨려 이 방법의 유용성을 감소시킬 수 있다. 그래서 좀 더 견고한 공유결합으로 골드 칩 위에 항체를 고정화 하는 방법이 시도 되어져 왔다. 단백질-단백질, DNA-RNA, 탄수화물-단백질 상호작용에 관한 기술은 친화성 태그(Ni-NTA, Streptavidin, GST 등) 또는 골드 칩 표면에 화학적인 방법, 예를 들면 아민(amine), 리간드 티올(ligand thiol), 알데히드(aldehyde)를 수식화하거나, 기능기가 부착된 리간드를 자기조립 단일층 (self-assembly monolayers)을 형성하여 목적단백질을 고정화 하는 방법들이 연구 되어 왔다 (Hentz et al., Anal. Chem., 68:3939, 1996; Kukar et al., Anal. Biochem., 306:50, 2002; Hall, Anal. Biochem., 288:109, 2001; Canziani et al., Methods, 19:253, 1999; Brockman et al., J. Am. Chem. Soc., 121:8044, 1999; Nelson et al., Anal. Chem., 73:1, 2001; Jordan et al., Anal. Chem., 69:4939, 1997; Goodrich et al., J. Am. Chem. Soc., 126:4086, 2004). 그러나 이 방법들 또한 항체의 적절한 배향성(orientation)을 부여하지는 못하여 생물학적 활성을 소실케 함과 동시에, 복잡하고 시간이 오래 걸릴 뿐만 아니라 알칸티 올(Alkanethiol) 단일층이 시스테인(cysteine)을 가진 단백질을 포함한 황(sulfur)을 가진 혼합물을 처리했을 때 황-골드 결합 자체가 불안정하게 될 수 있는 화학적 처리 방법을 사용하고 있었다.

따라서, 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 protein A 혹은 protein G의 성질을 (Boyle and Reis, Biotech. 5:697, 1987; Hoffman and O'Shannessay, J. Immunol. Methods, 112:113, 1988) 이용하여 항체의 배향성을 증가시키고자 하는 시도가 있어왔으나, 여전히 protein A 또는 protein G를 골드에 결합시킬 때 복잡하고 시간이 많이 걸리는 화학적 방법을 사용하고 있는바 적절한 배향성을 가지며 간단하고 짧은 시간에 항체를 선택적이고 안정적으로 골드에 고정화 시키는 방법이 절실히 필요하다.

결과적으로 항원 결합 부위인 항체의 Fab 부위가 분석용액 방향으로 향하는 적절한 배향성을 유지하면서도, 간단하고 경제적으로 골드-함유 고체상에 고정화 될 수 있는 연결자(linker)가 절실히 필요하였다.

본 발명의 목적은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 항체 Fab 부위가 분석용액 방향으로 향하는 적절한 배향성을 유지하면서도, 간단하고 경제적으로 골드함유 고체상에 항체를 고정화시킬 수 있는 생체 연결자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 연결자를 이용하여, 면역분석법에 손쉽게 이용될 수 있는 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 생체 연결자 또는 바이오센서를 이용하여 간단하게 특정 물질을 검출할 수 있는 면역분석법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

서열번호 10의 염기 서열로 암호화된 재조합 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명은,

서열번호 11의 염기 서열로 암호화된 재조합 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여 서열번호 10의 염기서열 또는 서열번호 11의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여 서열번호 10의 염기서열 또는 서열번호 11의 염기서열을 갖는 폴리 뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여 본 발명에 따른 발현벡터로 형질전환된 형질 전환체를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 서열번호 8의 염기서열로 암호화된 펩타이드가 재조합되어 이루어지는 재조합 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 서열번호 8의 염기서열로 암호화된 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 결합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 서열번호 9의 염기서열로 암호화된 펩타이드가 재조합되어 이루어지는 재조합 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 서열번호 9의 염기서열로 암호화된 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 결합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여, 본 발명에 따른 재조합 융합단백질과 골드-함유 고체상으로 이루어진 바이오센서를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 골드-함유 고체상이 골드 콜로이드 입 자, 나노-골드 입자, 골드-코팅 입자 및 골드가 도포된 기판으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 위하여 다음의 단계를 포함하는 바이오센서의 제작방법을 제공한다:

(a) GBP(Gold binding protein)를 코딩하는 유전자와 protein A 혹은 protein G를 코딩하는 서열번호 10 또는 11의 유전자를 함유하고, 상기 두 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 구성된 재조합벡터를 박테리아로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계;

(b) 상기 형질전환 미생물을 배양하여 서열번호 10 또는 11의 염기서열로 암호화된 재조합 융합단백질을 발현시키는 단계;

(c) 상기 융합단백질이 발현된 미생물을 회수한 다음, 파쇄하여 상기 융합단백질을 함유하는 분획을 수득하는 단계; 및

(d) 상기 융합단백질을 함유하는 분획을 골드-함유 고체상에 특이적으로 고정시키는 단계.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 바이오센서를 이용한 면역검출법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역검출법이 상기 바이오센서의 재조 합 융합단백질에 항체를 특이적으로 결합시키는 단계; 및

상기 항체에 특이적인 항원을 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시에에 따르면, 상기 항체는 어느 것이나 가능하며, 예를 들어 anti-AFB1(항 아플라톡신 B1)과 같은 항체일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 anti-AFB1 항체의 농도는 100㎍/㎖일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 면역검출법이 가시적(visually), 광학적(Optically) 또는 전기화학적(electrochemically) 방법을 통해 수행될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 광학적 검출법이 SPR(surface plasmon resonance: 표면플라즈몬공명) 방법을 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 염기 서열 10 또는 11로 암호화된 융합단백질을 제공한다.

상기 융합단백질을 골드 고체상과 항체를 연결시키는 연결자로 사용할 수 있다.

상기 재조합 융합단백질은 서열번호 10 또는 11의 염기서열로 암호화된 유전자를 사용하여, 종래 알려진 재조합기술을 이용하여 발현시킬 수 있다. 우선 통상적인 방법에 따라 서열번호 10 또는 11의 DNA 서열을 제작한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR을 증폭함으로서 제작할 수 있다. 다른 방법으로는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 시판)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은, 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(예, 프로모터, 인헨서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 생성된 형질 전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 암호화된 “실질적으로 순수한 융합 단백질”을 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 크로마토그래피 등)을 이용하여 회수될 수 있다. 상기에서 “실질적으로 순수한 융합 단백질”이란 본 발명에 따른 융합단백질이 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질들도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 단백질 발현을 위한 재조합 기술은 다음 문헌을 참조할 수 있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 뉴욕, 미국, 1989).

본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명은 서열번호 10 또는 11의 DNA 절편, 상기 DNA 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질 전환 체를 포함한다.

발현벡터는 숙주 세포 내로 삽입된 핵산을 발현시킬 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상의 발현벡터에 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 DNA가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 발현 벡터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열, 선별 마커 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결되는 본 발명의 DNA를 포함할 수 있다. 형질 전환체는 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다. 바람직하게 형질 전환체는 본 발명의 DNA를 포함하는 발현 벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposem-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기 침공법(electroporation) 등의 공지 방법으로 숙주세포에 도입하여 수득될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 면역분석법에 이용되는 본 발명에 따른 재조합 융합단백질을 포함하는 바이오센서를 제공한다.

본 발명에 따른 융합단백질은 골드결합 단백질(Gold Binding Protein, 이하 ‘GBP’라 함)과 단백질 A 또는 단백질 G가 결합된 형태로서, 여기서 본 발명에 따른 상기 GBP는 42개의 아미노산으로 이루어져 있으며 골드에 선택적으로 결합할 수 있다.

상기 융합단백질의 단백질 A 또는 G는 다른 단백질과 달리 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합한다(Boyle and Reis, Biotech. 5:697, 1987).

따라서 본 발명에 따른 융합단백질에 GBP 부분은 골드-고체상에 선택적으로 결합하고, 단백질 A 또는 단백질 G 부분은 항체 Fc 부분에 특이적으로 결합함으로, 이를 이용하는 경우, 골드-고체에 선택적으로 결합하면서, 항체 Fc에 특이적으로 결합할 수 있는 바이오센서를 제공할 수 있게 된다.

이로서 상기 바이오센서는, 상기융합단백질이 골드-고체상에 결합되며, 또한 항체의 Fc에 결합하여 항원이 결합하는 활성화 부분인 Fab 부분이 용액의 방향으로 향하는 적절한 배향성을 유지할 수 있게 됨으로써, 항체-골드 반응을 응용하는 면역분석 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

즉, 상기 바이오센서는 골드 고체 등에 화학적 처리 방법 등을 이용한 것이 아니라 그 융합 단백질 자체 내의 GBP의 특이성에 의해 결합된 것으로, 복잡하고 시간이 오래 걸리는 self-assembled monolayers(SAMs) 과정을 거치지 않고, 그 공정이 단순하면서도, 다른 생물학적 활성 등에 영향을 주지 않으면서도 짧은 시간안에 항체를 선택적이고 안정적으로 골드에 고정화시킬 수 있게 된다.

상기 골드-고체는 골드 콜로이드 입자, 나노-골드 입자, 골드-코팅 입자, 또는 골드가 도포된 기판과 같은 골드-함유 고체 등, 골드 성분을 포함하는 고체이면 어느 것이나 모두 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 바이오센서에 의하면, 모든 종류의 항체가 화학적 또는 물리적 전처리 없이 적절한 배향성을 가지면 고정화될 수 있다. 이는 상기 융합 단백질의 단백질 A 또는 단백질 G 부분이 항체의 Fc 부분에 특이적으로 결합함으로서 항체의 Fab 부분이 좀 더 자유롭게 목표 검출 물질과 반응할 수 있기 때문이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드와 서열번호 8 또는 서열번호 9의 염기서열로 암호화된 펩타이드가 재조합된 융합단백질을 제공한다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 유전자 조적을 통해 서열번호 8 또는 서열번호 9의 펩타이드의 N 말단 또는 C 말단에 삽입될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면 본 발명의 바이오센서를 이용한 면역분석법을 제공한다. 항원-항체의 특이적 결합을 확인하는 것을 특징으로 하는 면역검출법은 가시적(visually), 광학적(optically), 전기화학적(electrochemically) 방법을 통해 수행할 수 있는데, 특히, 광학적 방법의 한 예로 표면플라즈몬공명(SPR) 기술을 들 수 있다.

SPR 기술은 유리 칩에 얇은 골드 박막을 코팅한 칩을 이용하여 칩 표면에서 일어나는 반응을 형광표지 없이 굴절율(refractive index)의 변화를 CCD 카메라를 이용하여 민감하게 분석할 수 있는 기술이다. 바이오센서 시스템에 흔한 분석 방법으로서 현재 상용화되어 있고 단백질-단백질, 단백질-DNA, DNA-DNA 상호작용 검사에 사용되고 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 대장균으로부터 발현된 서열번호 10 또는 11의 염기서열로 암호화된 융합단백질을 골드 표면에 특이적으로 고정하여 SPR 검출을 위한 면역바이오센서를 제작하였다. 상기 SPR 센서를 이용한 결과, anti-AFB1 항체와 AFB1 항원과의 특이적 상호반응을 쉽게 표지체 없이도(label free) 검색할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 발현된 융합단백질들은 다양한 pH 조건에서도 그 활성을 잃지 않고 골드 칩 표면에 고정됨으로서, 실제 여러 외부 환경에서 단백질을 고정시키기 위해 본 방법을 적용할 수 있을 것이다.

본 발명의 일 실시예에 따라, 도 1을 참조하여 융합단백질이 고정화된 바이오센서를 이용하여 SPR 바이오센서 분석법을 살펴본다.

즉, 도 1은 SPR 골드-고체에 재조합 융합 단백질(A 또는 G)을 먼저 고정화시키고 융합 단백질(A 또는 G)에는 항체(immunoglobulin G)가 특이적으로 결합되므로 먼저 anti-AFB1 항체를 융합단백질(A 또는 G) 위에 특이적으로 결합시키고 이에 항원인 AFB1을 검출하는 모식도이다. SPR 분석에서 편광(polarized light)은 골드 표면 위 용액의 굴절율(refractive index)값의 변화에 따라 반사각이 변하게 되고 그 정도는 목표 검출물질의 농도와 비례하게 되며 이를 수치화하여 결합의 정도를 알 수 있게 된다.

이하, 하기 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 결론적으로 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 anti-AFB1 항체와 AFB1 항원의 특이적 결합을 검출하기위해 단지 골드 기판 상에 본 발명에 따른 재조합 융합단백질이 고정화 된 바이오센서를 사용한 것만 기술하였으나, 다른 골드-함유 고체상 물질의 도입도 특별히 제한되지 않으며, 모든 항원과 항체간의 상호작용의 검출에 적용할 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 골드 기판 상에 anti-AFB1 항체의 적절한 배향성을 유지한 채 고정 시키기 위해 단지 GBP-단백질 A의 융합단백질을 사용한 것만 기술하였으나, 단백질 G가 단백질 A와 같이 항체의 Fc에 특이적으로 결합하는 성질이 있으며, 본 발명은 이러한 성질을 이용한 것이므로, GBP-단백질 G의 융합단백질을 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다.

하기 실시예에서는 숙주 미생물로서 대장균만을 사용하였으나 이에 한정되지 않음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다 할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 protein A(또는 protein G)의 N-말단에 GBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하였으나, 본 발명의 요지상 C-말단에 GBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서는 자명하다 할 것이다.

실시예 1: 융합단백질 발현시스템 구축

서열번호 10의 염기서열로 암호화되는 재조합 융합단백질 발현시스템 구축

도 2에 나타낸 바와 같이, 융합단백질을 제조하기 위해 overlap PCR 방법을 이용하여 유전자를 확보하였다(서열번호 10). 한편, 증폭된 유전자는 pET-22b(+) (Novagen, San Diego, CA, 미국)에 클로닝하여 대장균에서 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG) induction에 의해 생산되었고, 각 융합단백질의 N-말단에는 6-histidine이 있어서 Ni-NTA column을 이용해 정제할 수 있었다. 사용된 PCR 프라이머의 염기서열은 아래에 나타낸 바와 같다.

서열번호 2:

5'-ACCAAGACATATGCATCACCATCACCATCACCATGGTAAGACGCAAGCCACGAG-3’ (프라이머 1)

서열번호 3:

5'-TGAATTCGCTTTGGATCGTGCCAGAGGTGGCCTGCGTCTTGCCATGCATGCTTT -3' (프라이머 2)

서열번호 4:

5'-GGAATTCGCGCAACACGATGAAGCTCAA-3' (프라이머 3)

서열번호 5:

5'-AGGGATCCTTATAGTTCGCGACGACGTCC-3' (프라이머 4)

서열번호 6:

5'-GGAATTCTTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTG-3' (프라이머 5)

서열번호 7:

5'-GAGGATCCTTATTCAGTTACCGTAAAG-3' (프라이머 6)

플라스미드 pTGE(Park et al., Anal. Chem., 78:7197, 2006)를 주형으로 하고, 상기 서열번호 2와 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 이와는 별개로 스타필로코커스 마우레우스(Staphylococcus aureus) Mu50(ATCC 700699D, American Type Culture Collection, Manassas, VA, 미국)의 genomic DNA를 코딩하는 유전자(서열번호 8)를 주형으로 하고, 상기 서열번호 4와 5의 프라이머를 이용 하여 PCR을 수행하였다. 상기 증폭된 PCR 산물을 주형 DNA로 사용하고, 최종적으로 서열번호 2와 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 최종적으로 6His-GBP와 protein A가 융합된 융합단백질의 유전자를 수득하였다.

PCR 조건으로 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡(annealing)은 56℃에서 1분 20초간, 연장(extension)은 72℃에서 1분 20초간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한번 더 수행하였다.

상기 PCR에 의해 수득된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 약 1.4 kb 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두 가지의 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단한 다음, 상기 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pET-22b(+)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-6HGBP-spa(Mu50)을 제조하였다(도 3).

서열번호 11의 염기서열로 암호화되는 융합단백질 발현시스템 구축

Streptococcus G148의 Protein G 유전자(Goward et al., Biochem. J., 1990, 서열번호 9)를 인공적으로 합성(Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA, 미국)하였으며 이를 주형 DNA로 사용하고, 서열번호 6와 7의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 최종적으로 6His-GBP와 protein G가 융합된 형태의 유전자 산물을 수득하였다. PCR 조건으로 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡(annealing)은 56℃에서 1분 30초간, 연장(extension)은 72 ℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃ 에서 5분간 마지막 연장을 한번 더 수행하였다.

상기 PCR에 의해 수득된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 약 700 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두 가지의 제한효소 NdeI과 BamHI으로 절단한 다음, 상기 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pET-22b(+)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-6HGBP-spg를 제작하였다(도 4).

미생물 유래의 protein A와 protein G는 척추동물의 항체인 immunoglobulin G (IgG)에 특이적으로 결합하는 특성이 매우 유사하기 때문에 GBP-protein A와 GBP-protein G가 동일한 결과를 나타낼 것이라는 것은 이 분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서는 자명한 사실이다.

재조합 플라스미드를 도입한 재조합 대장균 제조

상기 제작된 pET-6HGBP-spa(Mu50) 및 pET-6HGBP-spg을 각각 열충격(heat shock)방법을 이용하여 대장균 BL21(DE3) (F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3), Novagen, San Diego, CA, 미국)에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 100 ㎎/l)과 박토-아가(bacto-agar, 15 g/l)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5 g/l; 트립톤, 10 g/l; NaCl, 10 g/l)에서 선별하여 재조합 대장균 BL21(DE3)/pET-6HGBP-spa(Mu50) 및 BL21(DE3)/pET-6HGBP-spg을 각각 제조하였다.

재조합 단백질의 발현

GBP-protein A와 GBP-protein G 융합단백질은 강력하고 유도 가능한 T7 프로 모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pET-6HGBP-spa(Mu50) 및 pET-6HGBP-spg로 형질 전환된 대장균 BL21(DE3)에서 각각 발현하였다. T7 프로모터는 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)에 의해서 유전자 발현이 유도되며 pET-6HGBP-spa(Mu50) 및 pET-6HGBP-spg로 형질 전환된 대장균 BL21(DE3)의 경우 다음과 같이 GBP-protein A 와 GBP-protein G의 융합단백질을 제조하였다. 형질 전환된 재조합 대장균을 LB 액체 배지 200 ml가 담긴 500 ml 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. IPTG에 의한 유전자 발현 유도(induction)는 분광광도계로 600 nm의 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.4 일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 수행하였다. 유도 발현 후 4시간이 지난 후에 배양액 전체 배양액을 4℃에서 6,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 ml TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 세척한 후에 다시 4℃에서 6,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 ml 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기(Branson Ultrasonics Corp., Danbury, Conn., 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 용액을 4℃에서 6,000 rpm으로 30분간 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 μm 여과기로 여과하였다. 여과한 용액은 Ni-NTA column을 이용하여 정제하였고 브래드포드 단백정량법(Bradford, M. et al., Anal. Biochem. 72;248-254, 1976)을 이용하여 정량 후 고정버퍼용액(PBS, pH 7.4)으로 1 mg/ml 농도로 희석하여 준비한다.

재조합 융합단백질을 고정한 바이오센서의 제작

위에서 수득된 GBP-protein A의 재조합 융합단백질을 함유하는 수용성단백질 분획을 PBS 버퍼(pH 7.4)로 1 mg/ml 농도로 희석하였다. 골드 칩(Biacore Internation AB, Uppsala, 스웨덴)을 normalization 용액(70% glycerol, v/v)으로 6분 처리하여 표면의 유기물을 완전히 제거하고 골드 칩 사이의 미세채널을 이용하여 SPR 장치내 시린지펌프(Syringe pump)로 5 μl/min 유속으로 PBS 버퍼를 흘리면서 골드 칩의 표면을 안정화시켜서 상기 융합단백질을 고정화시킬 수 있는 바이오-골드 칩을 제작하였다.

시험예 1: GBP -protein A 융합단백질의 골드 표면과의 결합성 및 항체와의 특이적 반응성

유전공학적으로 생성된 재조합 융합 단백질인 GBP-protein A가 GBP에 의해 바이오-골드 칩에 성공적으로 결합이 일어나는지를 확인하기 위해서, GBP-protein A 융합 단백질(1 mg/ml)을 SPR 골드 칩에 10분 동안 흘리고 반면에 대조군으로 GBP가 없는 protein A(1 mg/ml)를 SAMs 처리된 골드 칩에 10분 동안 흘린 후 PBS 버퍼로 세척하였다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, GBP-protein A를 흘린 결과 점진적으로 RU값이 증가하여 최종적으로 1,211 RU 값까지 증가했다. 결합 후 버퍼로 세척을 하여도 RU값에 감소가 없는 것은 이 융합단백질이 버퍼에 의해서 골드 표면으로부터 전혀 떨어져 나가지 않음을 보여주고 있다. 이는 융합단백질이 GBP에 의해 골드 표면에 점진적이고 규칙적으로 비교적 강하게 결합했음을 나타내고 있다. 또한 1,211 RU값은 골드 칩의 1 mm2 당 약 1,2 ng 정도의 융합단백질이 결합했음을 보여준다. 그리고 대조군인 protein A를 흘린 경우 GBP-protein A 보다 높은 1,780 RU값 정도의 증가를 보였으나 버퍼를 흘린 후 RU값이 757로 약 58%정도 감소했는데, 이는 골드 표면 위에 결합해 있던 protein A 단백질이 버퍼에 의해서 상당량이 분리되어 떨어져 나갔음을 보여준다.

그 이유는 protein A가 골드 표면에 결합할 때 초기의 결합이 거의 수직으로 가파르게 증가하였는데 이는 아마도 SAMs 처리에 의해 형성된 화학물질과 protein A 단백질에 있는 아민기의 펩타이드 공유결합 외에도 그들 간의 정전기적 결합이 일정 부분을 기여했다고 여겨진다. 이러한 정전기적 결합이 불규칙적이고 급격한 protein A의 결합을 야기 시켰고 이는 GBP가 골드표면과 결합하는 능력보다 약한 결합력으로 여겨진다 (Katherine et al., Anal. Chem., 67:735, 1995; Schmitt et al., Langmuir, 15:3256, 1999).

다음 단계로, 항체(anti-AFB1)의 Fc 부분이 고정화된 protein A에 특이적으로 결합하는 능력도 protein A(1843 RU값 증가) 보다 융합단백질의 protein A부분에 결합정도(1889 RU값 증가)가 약간 높았다.

이러한 결과들은 바이오-골드 칩 위에 바이오물질 고정화시 이 새로운 바이오센서를 사용하면 기존의 대표적인 고정화 방법인 SAMs 보다 훨씬 간편하고 짧은 시간에 모든 종류의 항체를 규칙적이고 강한 결합을 가지면서 적절한 배향성을 가지게 결합시킬 수가 있어 다양한 바이오물질을 검출하는데 용이하게 사용될 수 있음을 보여준다.

시험예 2: anti- AFB1 항체의 최적 고정화 농도

고정화되는 anti-AFB1 항체가 항원 AFB1을 검출하는데 높은 민감도를 갖기 위해 골드 칩 상에 GBP-단백질 A가 고정화된 층 위에 anti-AFB1의 최적 농도를 구할 필요가 있다.

도 6은 가장 높은 AFB1 검출 능력을 보여주는 anti-AFB1의 농도를 조사하기위해 다양한 농도(50, 100, 150, 200 μg/ml)의 anti-AFB1을 골드 칩 위에 10 분 동안 주입한 후 10 μg/ml의 AFB1을 각각의 채널에 10분 동안 흘려주었을 때 증가하는 RU값을 보여주고 있다. GBP-protein A 표면 위에 고정화 된 anti-AFB1의 농도가 50 μg/ml에서 100 μg/ml까지 증가했을 때 AFB1에 대한 RU값은 398에서 643으로 비례적으로 증가하여 정점을 이룬 후, 150 μg/ml과 200 μg/ml에서는 오히려 비례적으로 528과 430 RU값으로 감소하는 경향을 보였다.

이 결과는, 고정화되는 항체의 농도가 너무 낮으면 검출하고자 하는 목적 항원 AFB1과 충분히 반응할 기회를 얻지 못하는 반면, 농도가 너무 높으면 고정화된 anti-AFB1 항체간의 공간장애가 일어나기 때문에 자유로운 유동을 저해 받아 항원 AFB1들과 원활히 반응 하는데 방해요인이 되는 것으로 여겨진다 (Ko and Grant, Biosens. Bioelectron., 21:1283, 2006).

그러므로, 골드 표면에 결합되어있는 GBP-protein A 층 위에 고정화되는 anti-AFB1 항체의 최적 농도는 100 μg/ml라고 할 수 있고, 또한 항체의 고정화는 GBP-protein A 융합단백질의 protein A 부분에 의존적으로 결합되고 있음을 알 수 있다.

시험예 3: 항체 검출 민감도(sensitivity)와 선택성(selectivity)

상기 시험예 2에서 구해진 anti-AFB1 융합단백질의 최적 고정화농도(100 μg/ml)로 각각 골드 칩 위에 미리 형성된 GBP-protein A 층위에 10 분 동안 고정화 시킨 후, 비특이적 반응을 막아 주기 위해서 500 μg/ml의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 7 분 동안 흘려주었다. 다음, 이 AFB1 항원에 대한 검출 한계를 조사하기 위해 10000, 5000, 1000, 100, 10 ng/ml의 AFB1을 10분 동안 반응 시킨 후 PBS 버퍼로 세척하였다.

그 결과 도 7에 나타난 것과 같이 비례적으로 RU값이 각각 655, 449, 228, 167, 101 로 감소했다. 결론적으로, GBP-protein A를 기반으로 anti-AFB1 항체가 고정화된 바이오칩의 AFB1에 대한 검출한계는 10 ng/ml의 민감성을 보였다.

도 8에 보면, 이 칩의 선택성 정도를 확인하기위해, GBP-protein A 융합단백질 위에 anti-AFB1 항체가 고정화 된 또 다른 바이오칩에 10 μg/ml의 AFB1를 흘려주고 대조군으로 같은 농도의 다른 곰팡이 독소 종류인 ochratoxin A(OTA), zearalenone(ZEA) 각각과 OTA, ZEA, AFB1이 함께 섞여 있는 샘플을 10분간 흘려 준 후 버퍼로 세척했을 때 그들의 RU값을 비교했다.

예상대로 OTA와 ZEA가 단독으로 반응한 채널에는 RU값이 0과 5O 정도로 아주 미비 하였다. 그러나 목적 항원인 AFB1의 경우는 RU값이 571로 대조군 보다 훨씬 높았다. 그리고 OTA, ZEA, AFB1이 혼합된 샘플을 반응시킨 경우도 RU값 525로 AFB1 단독일 때의 경우와 별 차이가 없었다.

이는 상기 면역검출용 칩이 목적 항원인 AFB1 외에 다른 물질과는 거의 반응하지 않는다는 결과로서 목적 항원에 대한 아주 높은 선택성(selectivity)도 가지고 있는 시스템임을 확인할 수 있게 해준다.

시험예 4: SPR 이미징 분석을 이용한 항체 검출

상기 시험예 2에서 나타낸 바와 같이, 골드 표면에 고정화시키는 1 mg/ml의 GBP-protein A 융합단백질 층 위에 다시 100 μg/ml의 anti-AFB1 항체를 순차적으로 반응시켜서 SPR의 또 다른 분석방법인 SPR 이미징(SPR imaging, K-MAC, 대전, 한국)을 실시하였다. 도 9에서 나타낸 바와 같이, 골드 표면만을 나타낸 1번 샘플보다 GBP-protein A 융합단백질을 골드 표면에 고정화시킨 경우의 이미지 세기가 더 세게 나타났으며, 이에 대해 다시 anti-AFB1 항체를 반응시키고 난 후의 이미지 세기가 더욱 강하게 나타난 것으로 보아 GBP-protein A 융합단백질이 원형의 골드표면에 선택적으로 고정화되었고, 원형 골드표면에 GBP-protein A 융합단백질이 고정화된 위치에 다시 anti-AFB1 항체가 선택적으로 결합하였다는 것을 확인할 수 있었다. 도 9(a)에서 나타낸 바와 같이, 50-?m 원형의 골드 패턴위에 고정화된 샘플의 2D 및 3D 이미지와 도 9(b)에서 나타낸 바와 같이, 원형을 스캔하여 각 원형에서 나타나는 이미지 세기를 나타낸 그래프를 통해 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 GBP-protein A 또는 protein G 융합단백질에 의해 anti-aflatoxin B1 항체가 고정화되고 따라서 aflatoxin B1이 검출되는 SPR 바이오센서 칩의 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 융합단백질의 모식도이다. (a) GBP-protein A 융합단백질, (b) GBP-protein G 융합단백질.

도 3은 본 발명에 따라 제조된 재조합 플라스미드 pET-6HGBP-spa(Mu50)의 유전자 지도이다.

도 4는 본 발명에 따라 제조된 재조합 플라스미드 pET-6HGBP-spg의 유전자 지도이다.

도 5는 GBP-protein A 융합단백질과 protein A의 골드 칩 표면과의 결합력과 항체와의 결합력을 나타내는 표면플라즈몬공명(surface plasmon resonance, SPR) 분석결과를 나타낸다. 굵은 선은 GBP-protein A를 나타내며, 가는 선은 protein A를 나타낸다.

도 6은 골드 표면에 고정화된 GBP-protein A 융합단백질에 결합된 anti-aflatoxin B1 항체의 최적 농도를 확인하는 그래프이다.

도 7은 골드 표면에 고정화된 GBP-protein A 융합단백질에 결합된 anti-aflatoxin 항체의 목표물질인 AFB1 검출에 대한 민감도(sensitivity)를 확인하는 그래프이다.

도 8은 골드 표면에 고정화된 GBP-protein A 융합단백질에 결합된 anti- aflatoxin B1 항체의 목표물질인 AFB1 검출에 대한 선택성(selectivity)를 확인하는 그래프이다(여기서 a: OTA, b: ZEA, c: OTA, ZEA, AFB1, d: AFB1).

도 9는 골드칩위에 고정화된 GBP-protein A와 항체와의 상호작용을 나타내는 SPR imaging 결과 그래프이다. (a) 50-?m 원형의 골드 패턴위에 고정화된 샘플의 2D (아래 삽입된 그림) 및 3D 입체 이미지, (b) (a)의 그림에서 나타낸 원형을 스캔하여 각 원형에서 나타나는 이미지 세기를 나타낸 그래프. 1; 골드 미세패턴, 2; 골드 칩-6His-GBP-Protein A 융합단백질, 3; 골드 칩-6His-GBP-단백질 A-anti-Aflatoxin 항체. 즉 1, 2, 3은 골드 칩, 6His-GBP-단백질 A, anti-Aflatoxin 항체를 순차적으로 결합한 후의 실험결과이다.

<110> Korea Food Research Institute <120> Recombinant fusion protein, Biosensor using the same, and Immuno-detecting method for target material with the same <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trimer of gold binding protein <400> 1 Met His Gly Lys Ala Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser Met His 1 5 10 15 Gly Lys Ala Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser Met His Gly Lys 20 25 30 Ala Gln Ala Thr Ser Gly Thr Ile Gln Ser 35 40 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 2 accaagacat atgcatcacc atcaccatca ccatggtaag acgcaagcca cgag 54 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 3 tgaattcgct ttggatcgtg ccagaggtgg cctgcgtctt gccatgcatg cttt 54 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 4 ggaattcgcg caacacgatg aagctcaa 28 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 5 agggatcctt atagttcgcg 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Claims

서열번호 1 의 아미노산 서열을 암호화하는 제 1 염기서열 및 항체의 Fc(fragment crystalline)부위와 결합하여 항체의 Fab(fragment antigen binding)부위가 분석 용액 방향으로 배열되게 하는 단백질을 암호화하는 제 2 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서,

상기 제 1 염기서열의 3´말단에 제 2 염기서열의 5´말단이 직접 연결된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서,

상기 폴리뉴클레오티드가 서열번호 10 또는 11 의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서,

상기 제 2 염기서열이 서열번호 8 또는 9 의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서,

상기 단백질이 protein A 또는 protein G 인 것을 특징으로하는 폴리뉴클레오티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제6항의 발현벡터로 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 재조합 융합단백질.
제8항에 있어서,

서열번호 1 의 아미노산 서열; 및 서열번호 8 또는 9 의 염기서열로 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 융합단백질.
제9항에 있어서,

상기 서열번호 1의 아미노산 서열이 서열번호 8 또는 9의 염기서열로 암호화된 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단에 결합되는 것을 특징으로 하는 재조합 융합단백질.
제8항의 재조합 융합단백질 및 골드-함유 고체상을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
제11항에 있어서,

상기 골드-함유 고체상이 골드 콜로이드 입자, 나노-골드 입자, 골드-코팅 입자 및 골드가 도포된 기판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 바이오센서.
다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오센서의 제작방법:

(a) 서열번호 10 또는 11의 유전자를 함유하고, 상기 두 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 구성된 재조합벡터를 박테리아로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계;

(b) 상기 형질전환 미생물을 배양하여 서열번호 10 또는 11의 염기서열로 암호화된 재조합 융합단백질을 발현시키는 단계;

(c) 상기 융합단백질이 발현된 미생물을 회수한 다음, 파쇄하여 상기 재조합 단백질을 함유하는 분획을 수득하는 단계; 및

(d) 상기 융합단백질을 함유하는 분획을 골드-함유 고체상에 특이적으로 고정시키는 단계.
제13항의 바이오센서를 이용한 면역검출법.
제14항에 있어서,

상기 면역검출법이 상기 바이오센서의 재조합 융합단백질에 항체를 특이적으로 결합시키는 단계; 및

상기 항체에 특이적인 항원을 처리하여 항원-항체의 특이적 결합을 검출하는 단계를 포함하는 면역검출법.
제15항에 있어서,

상기 항체가 anti-AFB1(항 아플라톡신 B1)임을 특징으로 하는 면역검출법.
제16항에 있어서, 상기 anti-AFB1 항체의 농도는 100㎍/㎖임을 특징으로 하는 면역검출법.
제14항에 있어서,

상기 면역검출법이 가시적(visually), 광학적(Optically) 또는 전기화학적(electrochemically) 방법을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 면역검출법.
제18항에 있어서,

상기 광학적 검출법이 SPR(surface plasmon resonance: 표면플라즈몬공명) 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 면역검출법.