WO2008018517A1

WO2008018517A1 - Therapeutic and/or preventive agent for disease accompanied by cell overgrowth, and polynucleotide useful as the active ingredient

Info

Publication number: WO2008018517A1
Application number: PCT/JP2007/065553
Authority: WO
Inventors: Koichi Seto; Yuji Matsuda
Original assignee: Zeria Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2007-08-08
Publication date: 2008-02-14

Abstract

The invention provides a therapeutic and/or preventive agent for a disease accompanied by cell overgrowth, particularly a therapeutic and/or preventive agent for the disease with reduced side effects. More particularly, the invention provides a therapeutic and/or preventive agent for a disease accompanied by cell overgrowth, containing a TAK1-specific inhibitor; an siRNA against TAK1 gene; an siRNA expression vector containing a polynucleotide encoding the siRNA; a pharmaceutical containing the siRNA or the siRNA expression vector; a cell with reduced proliferative capacity, in which the expression of TAK1 has been specifically suppressed, or a tissue containing the cell; and the like.

Description

明細書 Specification

細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防剤、及びその有効成分として有用なポリヌクレオチド Polynucleotides useful as therapeutic and / or prophylactic agents for diseases associated with cell hyperproliferation, and active ingredients thereof

技術分野 Technical field

[0001] 本発明は、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防剤、及びその有効成分として有用なポリヌクレオチドなどを提供する。 [0001] The present invention provides a therapeutic and / or prophylactic agent for diseases associated with cell hyperproliferation, and a polynucleotide useful as an effective component thereof.

背景技術 Background art

[0002] TGF- β -activated kinase 1 (TAK 1 )は、 tumor necrosis factor- a (TNF— a )などの炎症性サイト力インによって活性化されることが知られているストレス応答キナーゼである。各サイト力イン受容体からのシグナルは、 TNF- a receptor-associating facto r 2 (TRAF2)または TRAF6を介して、 TAK 1結合タンパク質 TAKl-binding protein 2 (TAB2)および TAB3に伝えられる。その結果、これらの TRAF分子により TAB2 /3がュビキチン化（Ub)され、 TAK1活性化の弓 Iき金が弓 Iかれる。 [0002] TGF-β-activated kinase 1 (TAK 1) is a stress response kinase that is known to be activated by inflammatory site forces such as tumor necrosis factor-a (TNF—a). Signals from each site force-in receptor are transmitted to TAK1-binding protein 2 (TAB2) and TAB3 via TNF-a receptor-associating factor 2 (TRAF2) or TRAF6. As a result, TAB2 / 3 is ubiquitinated (Ub) by these TRAF molecules, and the TAK1-activated bow I metal is bow I.

[0003] 活性化された TAK1は mitogen-activated protein kinase (MAPK)である JNKおよび p38を介して転写因子 AP— lを活性化する MAPKKKとして知られている。また、 I κ B kinase (IKK)を介して転写因子 NF— κ Βを活性化する重要なプロテインキナーゼであることも知られている（非特許文献 1 )。 [0003] Activated TAK1 is known as MAPKKK, which activates transcription factor AP-1 through JNK and p38, which are mitogen-activated protein kinases (MAPK). It is also known to be an important protein kinase that activates the transcription factor NF-κΒ through IκB kinase (IKK) (Non-patent Document 1).

[0004] また、 TAK 1を阻害することで NF— κ Βの活性化を抑制し、耳浮腫の発生を抑制すること（非特許文献 2)、 TAK1のドミナントネガティブ変異体力 STGF— βによって誘導されるコラーゲンなどの線維化メディエーター分子の産生を抑制すること（非特許文献 3)なども知られている。このような背景から、 TAK1は、炎症や組織線維化に関わる上述のシグナル伝達系を構成するキナーゼであり、炎症を伴う疾患、特にリウマチ、炎症性腸疾患の薬剤ターゲットとして考えられてきた。 [0004] Inhibition of TAK1 suppresses activation of NF-κΒ and suppresses the occurrence of ear edema (Non-patent Document 2). TAK1 is induced by the dominant negative mutant strength STGF-β. It is also known to suppress the production of fibrotic mediator molecules such as collagen (Non-Patent Document 3). Against this background, TAK1 is a kinase that constitutes the aforementioned signal transduction system related to inflammation and tissue fibrosis, and has been considered as a drug target for diseases accompanied by inflammation, particularly rheumatism and inflammatory bowel disease.

[0005] TAK1を介するシグナルはアポトーシス誘導に関わっていることが知られている（非特許文献 3〜5)。一方、 TAK1のノックアウトマウス由来の細胞ではアポトーシスが誘導されるといった一見相反する報告（非特許文献 6)もされており、 TAK 1がアポトーシス誘導にどのように関与しているかは必ずしも明らかになっていない。一般に癌細胞はアポトーシスに耐性であると考えられている。また、癌細胞でアポトーシスを引き起こそうとする場合、正常細胞へも影響し副作用が強く起こる可能性もあり、望ましくないと考えられる。 [0005] It is known that signals via TAK1 are involved in apoptosis induction (Non-patent Documents 3 to 5). On the other hand, there is a seemingly contradictory report (Non-patent Document 6) that apoptosis is induced in cells derived from knockout mice of TAK1, and it is not always clear how TAK 1 is involved in apoptosis induction. is not. Generally cancerous The vesicles are thought to be resistant to apoptosis. In addition, when trying to cause apoptosis in cancer cells, it may affect normal cells and cause strong side effects, which is undesirable.

[0006] TAK1阻害剤としては、ゼァラレノン類が知られている（特許文献 1)。しかしながら、特許文献 1の背景技術にも記載されるように、ゼァラレノン類は、他のキナーゼ（例、チロシンキナーゼ、 MEK1キナーゼ）の阻害作用等の種々の作用を併有することから、 TAK1を特異的に阻害することはできない。 [0006] Zaralenones are known as TAK1 inhibitors (Patent Document 1). However, as described in the background art of Patent Document 1, zearalenones have various actions such as the inhibitory action of other kinases (eg, tyrosine kinase, MEK1 kinase), and therefore TAK1 is specifically It cannot be inhibited.

[0007] ところで、近年、特定の遺伝子の発現を特異的に抑制する手法のひとつとして RN Ai (RNA interference)法が開発されている（非特許文献 7)。 RNAiは、もともと 2本鎖 RNAの導入により、それと相同な RNAの発現が強力に抑制されるという生命現象として 1998年に発見されたものであり、この現象を利用して 2本鎖 RNA(dsRNA)の導入により標的とする特定の遺伝子の発現の抑制が試みられている。例えば、細胞に導入された長レ、（数百塩基対） dsRNAは、 Dicerと!/、う 2本鎖 RNA (dsRNA)を特異的に切断する RNaselll様の酵素により分解されて、短い dsRNA (これを、 small in terfering RNA(siRNA)と呼ぶ。）を生成する。この siRNAが解離して 1本鎖 RNA(ss RNA)となり、 ssRNAが複合体 RISC (RNA-induced silencing complex)として標的の mRNAを特異的に認識して切断することにより、当該 mRNAの発現が抑制される。 RNAi法としては、 dsRNAの導入に代えて、 siRNAを導入することも行われている (非特許文献 8)。また、 siRNAを用いて、特定遺伝子の発現を抑制することによる疾患の治療方法も検討されて!/、る（非特許文献 9)。 By the way, in recent years, RNAi (RNA interference) method has been developed as one of the techniques for specifically suppressing the expression of a specific gene (Non-patent Document 7). RNAi was originally discovered in 1998 as a life phenomenon in which the expression of homologous RNA is strongly suppressed by the introduction of double-stranded RNA. Attempts have been made to suppress the expression of specific genes targeted by the introduction of (dsRNA). For example, a long (several hundred base pairs) dsRNA introduced into a cell is degraded by an RNaselll-like enzyme that specifically cleaves Dicer! /, Double-stranded RNA (dsRNA), resulting in a short dsRNA. (This is called small in terfering RNA (siRNA)). This siRNA dissociates into single-stranded RNA (ssRNA), and the ssRNA specifically recognizes and cleaves the target mRNA as a complex RISC (RNA-induced silencing complex), thereby suppressing the expression of the mRNA. Is done. As an RNAi method, siRNA is introduced instead of dsRNA (Non-patent Document 8). In addition, a method for treating a disease by suppressing the expression of a specific gene using siRNA has been studied! (Non-patent Document 9).

[0008] しかしながら、 siRNA等の TAK1特異的阻害物質が細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防に使用し得ること、特に TAK1特異的阻害物質がアポトーシスの誘導とは異なる機序にて細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防に使用し得ることにつ!/、ては報告されて!/、なレ、。 [0008] However, TAK1-specific inhibitors such as siRNA can be used for the treatment and / or prevention of diseases associated with cell hyperproliferation, and in particular, TAK1-specific inhibitors have a mechanism different from the induction of apoptosis. It has been reported that it can be used for the treatment and / or prevention of diseases associated with cell hyperproliferation! /.

非特許文献 1 : Sakurai et al., The Journal of Biological Chemistry 274(15): 10641-10 648 (1999) Non-Patent Document 1: Sakurai et al., The Journal of Biological Chemistry 274 (15): 10641-10 648 (1999)

非特許文献 2 : Tsuji et al., The Journal of Biological Chemistry 278(20): 18485-1849 0 (2003) 非特許文献 3 : Ono et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 30 7: 332-337 (2003) Non-Patent Document 2: Tsuji et al., The Journal of Biological Chemistry 278 (20): 18485-1849 0 (2003) Non-Patent Document 3: Ono et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 30 7: 332-337 (2003)

非特許文献 4 : Kimura et al. , The Journal of Biological Chemistry 275(23): 17647-17 652 (2000) Non-Patent Document 4: Kimura et al., The Journal of Biological Chemistry 275 (23): 17647-17 652 (2000)

非特許文献 5 : Edlund et al., Molecular Biology of the Cell 14: 529-544 (2003) 非特許文献 6 : Sayama et al., The Journal of Biological Chemistry (原稿 M601065200 として 2006年 6月 5日付でインターネットにて公開） Non-Patent Document 5: Edlund et al., Molecular Biology of the Cell 14: 529-544 (2003) Non-Patent Document 6: Sayama et al., The Journal of Biological Chemistry (manuscript M601065200 as the Internet on June 5, 2006) (Published on)

非特許文献 7： Hammond, FEBS Letters 579: 5822-5829 (2005) Non-Patent Document 7: Hammond, FEBS Letters 579: 5822-5829 (2005)

非特許文献 8： Hutvagner, FEBS Letters 579: 5850-5857 (2005) Non-Patent Document 8: Hutvagner, FEBS Letters 579: 5850-5857 (2005)

非特許文献 9： Manfredsson et al. , Gene Therapy 13: 517-524 (2006) Non-Patent Document 9: Manfredsson et al., Gene Therapy 13: 517-524 (2006)

特許文献 1：国際公開第 WO02/48135号パンフレット Patent Document 1: Pamphlet of International Publication No. WO02 / 48135

発明の開示 Disclosure of the invention

発明が解決しょうとする課題 Problems to be solved by the invention

[0009] 本発明は、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防剤、及びその有効成分として有用なポリヌクレオチドなどを提供するものである。 [0009] The present invention provides a therapeutic and / or prophylactic agent for diseases associated with cell hyperproliferation, and a polynucleotide useful as an effective component thereof.

課題を解決するための手段 Means for solving the problem

[0010] 本発明者らは、鋭意検討した結果、 TAK1特異的阻害物質として好適であり得る si RNAを開発することに成功した。本発明者らはまた、力、かる siRNAが細胞増殖の抑制作用を有すること、従って TAK1特異的阻害物質が細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防に有効であり得ることを見出した。本発明者らはさらに、その作用機序として細胞増殖関連の遺伝子が関与していることを明らかにし、副作用の原因となり得るアポトーシスの誘発とは異なる機序にて、細胞の過増殖を伴う疾患を治療及び/又は予防し得ること、従ってアポトーシスの誘発が所望されない被験体における当該疾患の治療及び/又は予防に有用であり得ることを見出した。以上の知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies, the present inventors have succeeded in developing siRNA that can be suitable as a TAK1-specific inhibitor. The inventors have also found that siRNAs have the potential to inhibit cell proliferation, and therefore that TAK1-specific inhibitors may be effective in the treatment and / or prevention of diseases involving cell overgrowth. I found it. The present inventors further elucidated that cell growth-related genes are involved as the mechanism of action, and accompanied by cell overgrowth by a mechanism different from the induction of apoptosis that may cause side effects. It has been found that a disease can be treated and / or prevented, and thus can be useful for the treatment and / or prevention of the disease in a subject in which induction of apoptosis is not desired. Based on the above findings, the present inventors have completed the present invention.

即ち、本発明は、以下の通りである： That is, the present invention is as follows:

〔1〕TAK1特異的阻害物質を含む、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防剤。〔2〕アポトーシスを原因とする副作用を示さない、又は該副作用が低減された、上記〔 1〕の剤。 [1] A therapeutic and / or prophylactic agent for a disease associated with cell hyperproliferation, comprising a TAK1-specific inhibitor. [2] The agent according to [1], wherein the agent does not show side effects caused by apoptosis or has reduced side effects.

〔3〕TAK1特異的阻害物質が、 RNAi誘導性核酸、アンチセンス核酸、ドミナントネガティブ変異体、又はそれらの発現ベクターである、上記〔1〕の剤。 [3] The agent according to [1] above, wherein the TAK1-specific inhibitor is an RNAi-inducible nucleic acid, an antisense nucleic acid, a dominant negative mutant, or an expression vector thereof.

〔4〕 RNAi誘導性核酸が siRN Aである、上記〔3〕の剤。 [4] The agent according to [3] above, wherein the RNAi-inducing nucleic acid is siRNA.

〔5〕 siRNAが以下（a)又は（b)の!/、ずれかである、上記〔3〕又は〔4〕の剤： [5] The agent according to [3] or [4] above, wherein the siRNA is the following (a) or (b)! /:

(a)配列番号 8〜； 13のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5 '末端及び/又は 3'末端にオーバーハングを有していてもよぐかつ TAK1の発現抑制活性を有する二重鎖 RNA；又は (a) a sense strand comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 8 to 13 and an antisense strand comprising the complementary sequence thereof, the sense strand and / or the 5 ′ end of the antisense strand and / Or a double-stranded RNA that may have an overhang at the 3 ′ end and has an activity of suppressing the expression of TAK1; or

(b)配列番号 8〜； 13の!/、ずれかで表される塩基配列の 5，末端及び/又は 3，末端において、 1〜数個の塩基が付加及び/又は欠失された塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5 '末端及び/又は 3'末端にオーバーハングを有していてもよぐかつ T AK1の発現抑制活性を有する二重鎖 RNA。 (b) SEQ ID NOS: 8 to 13:! /, 5 to and / or 3 of the nucleotide sequence represented by the deviation, and 1 to several bases were added and / or deleted at the end It consists of a sense strand containing a base sequence and an antisense strand containing a complementary sequence thereof, and may have an overhang at the 5 'end and / or 3' end of the sense strand and / or antisense strand. And a double-stranded RNA having an activity of suppressing the expression of TAK1.

〔6〕 siRNAが以下（a)〜（f)の!/、ずれかである、上記〔3〕又は〔4〕の剤： [6] The agent according to [3] or [4] above, wherein the siRNA is any of the following (a) to (f):

(a)配列番号 1で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 8で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (a) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8;

(b)配列番号 2で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 9で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (b) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;

(c)配列番号 3で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 10で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (c) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10;

(d)配列番号 4で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 11で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (d) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11;

(e)配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 12で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA;又は (e) a double-stranded RNA comprising a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12; or

(f)配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 14で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA。〔7〕細胞の過増殖を伴う疾患が、悪性腫瘍、良性腫瘍、又は癌への進展が懸念される炎症性疾患である、上記〔1〕の剤。 (f) A double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14. [7] The agent according to [1] above, wherein the disease associated with cell hyperproliferation is an inflammatory disease in which progression to malignant tumor, benign tumor, or cancer is a concern.

〔8〕悪性腫瘍が消化器系の癌である、上記〔7〕の剤。 [8] The agent according to [7] above, wherein the malignant tumor is a gastrointestinal cancer.

〔9〕消化器系の癌が大腸癌である、上記〔8〕の剤。 [9] The agent according to [8] above, wherein the digestive system cancer is colon cancer.

〔10〕癌への進展が懸念される炎症性疾患が、炎症性腸疾患、リウマチ、線維症又は肝炎である、上記〔7〕の剤。 [10] The agent according to [7] above, wherein the inflammatory disease for which progression to cancer is concerned is inflammatory bowel disease, rheumatism, fibrosis or hepatitis.

〔11〕炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、上記〔10〕の剤。 [11] The agent according to [10] above, wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.

〔12〕TAK1特異的阻害物質を含む、炎症性疾患から癌への進展の抑制剤。 [12] A suppressant of progression from inflammatory diseases to cancer, comprising a TAK1-specific inhibitor.

〔13〕炎症性疾患が、炎症性腸疾患、リウマチ、線維症又は肝炎である、上記〔12〕の剤。 [13] The agent according to [12] above, wherein the inflammatory disease is inflammatory bowel disease, rheumatism, fibrosis or hepatitis.

〔14〕炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、上記〔13〕の剤。 [14] The agent according to [13] above, wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.

〔15〕投与される被験体が、免疫抑制薬による処置を受けている患者、感染症に罹患して!/、る患者又は臓器移植を受けた患者である、上記〔1〕又は〔12〕の剤。 (15) The above (1) or (12), wherein the subject to be administered is a patient who has been treated with an immunosuppressive drug, a patient who has an infection! /, Or a patient who has undergone an organ transplant Agent.

〔16〕細胞への TAK1特異的阻害物質の導入を促進する物質をさらに含む、上記〔1 [16] The above [1] further comprising a substance that promotes the introduction of a TAK1-specific inhibitor into the cell.

〕〜〔15〕のいずれかの剤。 ]-[15] any agent.

〔17〕以下（a)又は（b)の!/、ずれかである、 siRNA: [17] siRNA which is any of the following (a) or (b)! /:

〔18〕以下（a)〜（f)のいずれかである、 siRNA: [18] siRNA which is any of the following (a) to (f):

(a)配列番号 1で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 8で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (b)配列番号 2で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 9で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (a) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8; (b) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;

(f)配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 14で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA (f) Double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14

〔19〕上記〔17〕又は〔18〕の siRNAをコードするポリヌクレオチドを含む、 siRNA発現ベクター。 [19] A siRNA expression vector comprising a polynucleotide encoding the siRNA of [17] or [18].

〔20〕上記〔17〕又は〔18〕の siRNAある!/、は上記〔19〕の siRNA発現ベクターを含む、医薬。 [20] A medicament comprising the siRNA of [17] or [18]! /, Comprising the siRNA expression vector of [19] above.

〔21〕TAK1の発現が特異的に抑制された、増殖性が抑制された細胞、又はその細胞を含む組織。 [21] A cell in which the expression of TAK1 is specifically suppressed, the proliferation is suppressed, or a tissue containing the cell.

図面の簡単な説明 Brief Description of Drawings

[図 1]配列番号 1で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 HeLa細胞における TAK1 mRNAの発現抑制を示す図である。 non-silencing [図 2]配列番号 2で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 HeLa細胞における TAK1 mRNAの発現抑制を示す図である。 non-silencing [図 3]配列番号 3で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 HeLa細胞における TAK1 mRNAの発現抑制を示す図である。 non-silencing [図 4]配列番号 4で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 HeLa細胞における TAK1 mRNAの発現抑制を示す図である。 non-silencing [図 5]配列番号 5で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 HeLa細胞における TAK1 mRNAの発現抑制を示す図である。 non-silencing [図 6]配列番号 1で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 HT— 29細胞における TAK1 mRNAの発現抑制を示す図である。一： non-silenci ng₀ FIG. 1 is a view showing suppression of TAK1 mRNA expression in HeLa cells by siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a sense strand. non-silencing [FIG. 2] A view showing suppression of expression of TAK1 mRNA in HeLa cells by siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a sense strand. non-silencing [FIG. 3] A diagram showing suppression of expression of TAK1 mRNA in HeLa cells by siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 as a sense strand. non-silencing [FIG. 4] A diagram showing suppression of expression of TAK1 mRNA in HeLa cells by siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 as a sense strand. non-silencing [FIG. 5] A view showing suppression of expression of TAK1 mRNA in HeLa cells by siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 as a sense strand. non-silencing [FIG. 6] By siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 as the sense strand, It is a figure which shows the expression suppression of TAK1 mRNA in HT-29 cell. One: non-silenci ng ₀

[図 7]配列番号 1で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 HT— 29細胞の増殖抑制を示す図である。一： non-silencing。 FIG. 7 is a view showing inhibition of growth of HT-29 cells by siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a sense strand. One: non-silencing.

[図 8]Asiatic acidによる、 HT— 29細胞におけるアポトーシスの誘導を示す図である。 FIG. 8 shows the induction of apoptosis in HT-29 cells by Asiatic acid.

[図 9]配列番号 1で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 HT— 29細胞におけるアポトーシスの非誘導を示す図である。一： non-silencing。 FIG. 9 is a diagram showing non-induction of apoptosis in HT-29 cells by siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a sense strand. One: non-silencing.

[図 10]配列番号 7で表されるヌクレオチド配列をセンス鎖として有する siRNAによる、 C2C12細胞における TAK1 mRNAの発現抑制を示す図である。一： non-silencin 発明を実施するための最良の形態 FIG. 10 is a view showing suppression of TAK1 mRNA expression in C2C12 cells by siRNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 as a sense strand. One: best mode for carrying out the non-silencin invention

[0012] 本発明は、 TAK1特異的阻害物質を含む、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び /又は予防剤を提供する。 [0012] The present invention provides a therapeutic and / or prophylactic agent for diseases associated with cell hyperproliferation, comprising a TAK1-specific inhibitor.

[0013] TAK1特異的阻害物質は、 TAK1の発現又は機能を特異的に抑制し得る物質である限り特に限定されないが、このような阻害物質としては、例えば、 RNAi誘導性核酸、アンチセンス核酸、ドミナントネガティブ変異体が挙げられる。本発明はまた、このような阻害物質も提供する。 [0013] The TAK1-specific inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that can specifically suppress the expression or function of TAK1, and examples of such an inhibitor include RNAi-inducible nucleic acid, antisense nucleic acid. , Dominant negative mutants. The present invention also provides such inhibitors.

[0014] TAK1に対する RNAi誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、 RNA干渉を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくは RNAもしくは RNAと DNAのキメラ分子である。 RNAi効果とは、 mRNAと同一のヌクレオチド配列ほたはその部分酉己列）を含む 2本鎖構造の RNAが、当該 mRNAの発現を抑制する現象をいう。 RNAi効果を得るには、例えば、少なくとも 20以上の連続する標的 mRNAと同一のヌクレオチド配列ほたはその部分配歹 IJ)を有する 2本鎖構造の RNAを用いることが好ましレ、。ただし、 TAK1の発現抑制作用を有して!/、れば数塩基置換されて!/、るものであってもよい。 2本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つの RNAのステムループ構造によって与えられる 2本鎖であってもよ!/、。 RNAi誘導性核酸としては、例えば siRNA、 miRNAなどが挙げられる。 [0014] The RNAi-inducible nucleic acid for TAK1 refers to a polynucleotide that can induce RNA interference when introduced into a cell, and is preferably a RNA or RNA-DNA chimeric molecule. The RNAi effect is a phenomenon in which RNA having a double-stranded structure containing the same nucleotide sequence as mRNA or a partial sequence thereof suppresses the expression of the mRNA. In order to obtain the RNAi effect, for example, it is preferable to use a double-stranded RNA having at least 20 consecutive nucleotide sequences identical to the target mRNA or its partial partition (IJ). However, it may have a TAK1 expression-suppressing effect! /, If it has several base substitutions! /. The double-stranded structure may be composed of different strands, or it may be a double strand given by a single RNA stem loop structure! /. Examples of RNAi-inducible nucleic acids include siRNA and miRNA.

[0015] 好ましくは、 RNAi誘導性核酸は siRNAであり得る。 TAK1に対する siRNAは、 T AK1の任意の部分を標的とするものであり得る。 TAK1に対する siRNA分子は、 R NAiを誘導できる限り特に制限されないが、例えば 2；!〜 27塩基長、好ましくは 2；!〜 25塩基長であり得る。 TAK1に対する siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖を含む二重鎖であり得る。 TAK1に対する siRNAは、センス鎖、アンチセンス鎖の一方又は双方の 5'末端及び/又は 3'末端においてオーバーハング（overhang)を有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5，末端及び/ 又は 3'末端における 1〜数個（例、 1、 2又は 3個）の塩基の付加により形成されたものであり得る。 [0015] Preferably, the RNAi-inducing nucleic acid may be siRNA. SiRNA against TAK1 is T It can target any part of AK1. The siRNA molecule against TAK1 is not particularly limited as long as RNAi can be induced, but may be, for example, 2;! -27 bases long, preferably 2;!-25 bases long. The siRNA against TAK1 can be a duplex comprising a sense strand and an antisense strand. The siRNA against TAK1 may have an overhang at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of one or both of the sense strand and the antisense strand. The overhang can be formed by the addition of 1 to several (eg, 1, 2 or 3) bases at the 5, and / or 3 ′ end of the sense and / or antisense strand.

[0016] 一実施形態では、 TAK1に対する siRNAは、配列番号 8〜； 13のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成される二重鎖 RNAであり得る。二重鎖 RNAは、そのセンス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び/又は 3'末端に上述のオーバーハングを有していてもよい。 [0016] In one embodiment, the siRNA against TAK1 is a double-stranded RNA composed of a sense strand containing a base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 8 to 13 and an antisense strand containing a complementary sequence thereof It can be. The double-stranded RNA may have the above-described overhang at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the sense strand and / or the antisense strand.

[0017] 詳細には、このような siRNAは、以下（a)〜（f)のいずれかであり得る： [0017] Specifically, such siRNA can be any of the following (a) to (f):

(a)配列番号 8で表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、当該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び/ 又は 3'末端にオーバーハングを有していてもよい、二重鎖 RNA; (a) It is composed of a sense strand comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 and an antisense strand comprising the complementary sequence thereof, and at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the sense strand and / or antisense strand. Double-stranded RNA, which may have an overhang;

(b)配列番号 9で表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、当該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び/ 又は 3'末端にオーバーハングを有していてもよい、二重鎖 RNA; (b) Consists of a sense strand comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 and an antisense strand comprising the complementary sequence thereof, at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the sense strand and / or antisense strand. Double-stranded RNA, which may have an overhang;

(c)配列番号 10で表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、当該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び/ 又は 3'末端にオーバーハングを有していてもよい、二重鎖 RNA; (c) Consists of a sense strand comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 10 and an antisense strand comprising the complementary sequence thereof, at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the sense strand and / or antisense strand Double-stranded RNA, which may have an overhang;

(d)配列番号 11で表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、当該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び/ 又は 3'末端にオーバーハングを有していてもよい、二重鎖 RNA; (d) It is composed of a sense strand containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 11 and an antisense strand containing the complementary sequence, and is located at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the sense strand and / or antisense strand. Double-stranded RNA, which may have an overhang;

(e)配列番号 12で表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、当該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び/ 又は 3'末端にオーバーハングを有して!/、てもよ!/、、二重鎖 RNA;又は (f)配列番号 13で表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、当該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び/ 又は 3'末端にオーバーハングを有して!/、てもよ!/、、二重鎖 RNA。 (e) composed of a sense strand comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 12 and an antisense strand comprising the complementary sequence thereof, at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the sense strand and / or antisense strand With overhang! /, May! /, Double stranded RNA; or (f) Consists of a sense strand comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and an antisense strand comprising the complementary sequence thereof, at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the sense strand and / or antisense strand Has an overhang! /, Even! /, Double stranded RNA.

オーバーハングは、上述したものと同様であり得る。 The overhang can be similar to that described above.

[0018] 上記（f)における siRNAとしては、例えば、以下（fl)、（f2)が挙げられる： [0018] Examples of the siRNA in the above (f) include the following (fl) and (f2):

(fl)配列番号 14で表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むァンチセンス鎖から構成され、当該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び /又は 3'末端にオーバーハングを有して!/、てもよ!/、、二重鎖 RNA;又は (fl) Consists of a sense strand comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 and an antisense strand comprising the complementary sequence thereof, at the 5 'end and / or 3' end of the sense strand and / or antisense strand With overhang! /, May! /, Double stranded RNA; or

(f2)配列番号 15で表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むァンチセンス鎖から構成され、当該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び /又は 3'末端にオーバーハングを有して!/、てもよ!/、、二重鎖 RNA。 (f2) It is composed of a sense strand containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 15 and an antisense strand containing its complementary sequence, and is located at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the sense strand and / or antisense strand. Has an overhang! /, Even! /, Double stranded RNA.

[0019] 上記（a)〜（f)において、オーバーハングを有している siRNAとしては、例えば、以下（a ' )〜（f ' )の!/ヽずれかが挙げられる： [0019] In the above (a) to (f), examples of siRNA having an overhang include the following (a ') to (f')!

(a' )配列番号 1で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 8で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (a ′) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8;

(b' )配列番号 2で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 9で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (b ′) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 9;

( ）配列番号 3で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 10で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; () Double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 10;

(d' )配列番号 4で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 11で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; (d ′) a double-stranded RNA comprising a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 11;

(e ' )配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 12で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA;あるいは (e ′) a double-stranded RNA comprising a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 12; or

(f ' ) (fl ' )配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 14で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA; 又は（f 2' )配列番号 7で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 15で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA。 [0020] 別の実施形態では、 siRNAは、配列番号 8〜； 13のいずれかで表される塩基配列の 5'末端及び/又は 3'末端において、 1〜数個（例えば 1〜5個、好ましくは 1〜3 個、より好ましくは 1又は 2個）の塩基が付加及び/又は欠失された塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成される二重鎖 RNAであり得る。二重鎖 RNAは、そのセンス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5'末端及び/又は 3'末端に上述のオーバーハングを有していてもよい。配列番号 8〜； 13のいずれかで表される塩基配列の 5'末端及び/又は 3'末端における 1〜数個の塩基の付加及び/又は欠失は、 TAK1の発現抑制活性の保持という観点から、 TAK1遺伝子をコードするセンス鎖及びそのアンチセンス鎖の部分塩基配列との同一性を確保するように達成され得る。例えば、 TAK1遺伝子のヌクレオチド配列が GenBankァクセッション番号 NM— 003188により公開されているので、このような情報を参考にして、上記同一性を確保するように、 1〜数個の塩基が付加及び/又は欠失され得る。 (f ′) (fl ′) a double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14; Or (f 2 ′) a double-stranded RNA comprising a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 15. [0020] In another embodiment, 1 to several siRNAs (for example, 1 to 5) are present at the 5 'end and / or 3' end of the base sequence represented by any of SEQ ID NOs: 8 to 13; A double-stranded RNA composed of a sense strand containing a base sequence to which 1 to 3, more preferably 1 or 2 bases are added and / or deleted, and an antisense strand containing its complementary sequence It can be. The double-stranded RNA may have the above-described overhang at the 5 ′ end and / or the 3 ′ end of the sense strand and / or the antisense strand. Addition and / or deletion of one to several bases at the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 8 to 13 is referred to as retaining TAK1 expression suppression activity. From the viewpoint, it can be achieved so as to ensure the identity of the sense strand encoding the TAK1 gene and the partial base sequence of the antisense strand. For example, since the nucleotide sequence of the TAK1 gene is published by GenBank Accession No. NM-003188, 1 to several bases are added and / or so as to ensure the above identity with reference to such information. Or it can be deleted.

[0021] TAK1に対するアンチセンス核酸は、 TAK1の転写産物（mRNA又は初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該転写産物とハイブリダィズし得る塩基配列力、らなり、且つハイブリダィズした状態で該転写産物にコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得るポリヌクレオチドを!/、う。アンチセンス核酸の種類は DNAであっても R NAであってもよいし、あるいは DNA/RNAキメラであってもよい。アンチセンス核酸は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチォリン酸型（リン酸結合の P = Oを P = Sに置換）や 2 ' -0-メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性および細胞膜透過性を高めること等が挙げられる力これらはリボソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス核酸の長さは、 TA K1の転写産物と特異的にハイブリダィズし得る限り特に制限はなぐ短いもので約 1 5塩基程度、長!/、もので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であつてもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約 15塩基以上、好ましくは約 15〜約 30塩基、より好ましくは約 18塩基〜約 30塩基からなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス核酸は、 TAK1の転写産物とハイブリダィズして翻訳を阻害するだけでなぐ二本鎖 DNAと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、 mRNAへの転写を阻害し得るものであってもよい。アンチセンス核酸は、好ましくは、配列番号;!〜 15の!/、ずれかで表される塩基配列（アンチセンス核酸が DNAの場合、 Uは Tである）を含むものであり得る。 [0021] The antisense nucleic acid against TAK1 is composed of a nucleotide sequence capable of hybridizing with the transcription product under the physiological conditions of cells expressing the transcription product (mRNA or initial transcription product) of TAK1, and is in a hybridized state. A polynucleotide capable of inhibiting the translation of the polypeptide encoded by the transcript! The type of the antisense nucleic acid may be DNA, RNA, or a DNA / RNA chimera. Antisense nucleic acids, even those that have a natural phosphodiester bond, are stable phosphonates (replace P = O in the phosphate bond with P = S) or 2 '-0- It may be a modified nucleotide such as a methyl type. Other factors important for antisense nucleic acid design include the ability to increase water solubility and cell membrane permeability. These can also be overcome by devising dosage forms such as the use of ribosomes and microspheres. The length of the antisense nucleic acid is not particularly limited as long as it can specifically hybridize with the TA K1 transcript. It is about 15 bases long and is complementary to the entire transcript sequence. The sequence may contain From the viewpoint of ease of synthesis, antigenicity problems, etc., for example, oligonucleotides comprising about 15 bases or more, preferably about 15 to about 30 bases, more preferably about 18 bases to about 30 bases are exemplified. In addition, antisense nucleic acids hybridize with TAK1 transcripts to inhibit translation and bind to double-stranded DNA to form a triplex. It may be capable of inhibiting transcription to mRNA. The antisense nucleic acid may preferably include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs:! To 15! /, A deviation (U is T when the antisense nucleic acid is DNA).

[0022] TAK1タンパク質のドミナントネガティブ変異体は、 TAK1タンパク質に対する変異の導入によりその機能が低減したものをいう。ドミナントネガティブ変異体は、天然の TAK1と競合することで間接的にその機能を阻害することができる。ドミナントネガテイブ変異体は、 TAK1をコードする核酸に変異を導入することによって作製すること力できる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異 (例、 1以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。ドミナントネガティブ変異体としては、例えば、既報（例、 Biochemical and Bioph ysical Research Communication 307: 332-337 (2003)参照）のものを用いることができ [0022] The dominant negative mutant of TAK1 protein refers to one whose function has been reduced by introducing a mutation into TAK1 protein. The dominant negative mutant can indirectly inhibit its function by competing with natural TAK1. Dominant negative mutants can be generated by introducing mutations into the nucleic acid encoding TAK1. Examples of the mutation include an amino acid mutation (eg, deletion, substitution or addition of one or more amino acids) that causes a decrease in the function of the functional site. As the dominant negative mutant, for example, those already reported (eg, see Biochemical and Biophysical Research Communication 307: 332-337 (2003)) can be used.

[0023] TAK1特異的阻害物質は、発現ベクターとしても提供され得る。本発明はまた、このような発現ベクターも提供する。本発明の発現ベクターは、 TAK1特異的阻害物質をコードするポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。 [0023] The TAK1-specific inhibitor can also be provided as an expression vector. The present invention also provides such an expression vector. The expression vector of the present invention may comprise a polynucleotide encoding a TAK1-specific inhibitor and a promoter operably linked to the polynucleotide.

[0024] 本発明の発現ベクターが含み得るプロモーターは、その制御下にある因子の発現を可能とする限り特に限定されず、因子の種類により適宜選択され得るが、例えば、 p olIIIプロモーター（例、 tRNAプロモーター、 U6プロモーター、 HIプロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、 CMVプロモーター、 CAGプロモーター、 SV40プロモーター）が挙げられる。 [0024] The promoter that can be included in the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it allows the expression of the factor under its control, and may be appropriately selected depending on the type of factor. For example, the polIII promoter (eg, tRNA promoter, U6 promoter, HI promoter) and mammalian promoter (eg, CMV promoter, CAG promoter, SV40 promoter).

[0025] 本発明の発現ベクターはさらに、選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含んでいてもよい。 [0025] The expression vector of the present invention further includes a selection marker gene (a gene that imparts resistance to drugs such as tetracycline, ampicillin, kanamycin, hygromycin, phosphinothricin, a gene that complements an auxotrophic mutation, etc.) ) May further be included.

[0026] 本発明の発現ベクターのバックボーン（backbone)としては、ヒト等の哺乳動物細胞中で TAK1特異的阻害物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウィルスベクターが挙げられる。発現ベクターを医薬として用いる場合、哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウィルス、アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスウィルス、ポリオウィルス、シンドビスウィルス、センダイウィルス等のウィルスベクターが挙げられる [0026] The backbone of the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it can produce a TAK1-specific inhibitor in mammalian cells such as humans. Examples thereof include plasmid vectors and virus vectors. It is done. When an expression vector is used as a medicine, vectors suitable for administration to mammals include adenovirus and retrovirus. Virus vectors such as virus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus, polio virus, Sindbis virus, Sendai virus, etc.

[0027] 本発明の剤は、薬学的に許容される担体を含み得る。薬学的に許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セル口ース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウムーグリコールースターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クェン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシゥム、エア口ジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クェン酸、メントール、グリシルリシン'アンモニゥム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クェン酸、クェン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビュルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられる力 S、それらに限定されるものではない。 [0027] The agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier. Examples of pharmaceutically acceptable carriers include sucrose, starch, mannitol, sorbit, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate and other excipients, cellulose, methyl cellulose, Binders such as hydroxypropylcellulose, polypropylpyrrolidone, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch, starch, carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, sodium glycol glycol starch, sodium hydrogen carbonate, calcium phosphate, citrate Disintegrants such as calcium, lubricants such as magnesium stearate, air mouth gill, talc, sodium lauryl sulfate, fragrances such as citrate, menthol, glycyllysine ammonium salt, glycine, orange powder, benzoate Preservatives such as sodium, sodium hydrogen sulfite, methyl paraben, propyl paraben, stabilizers such as citrate, sodium citrate, acetic acid, suspensions such as methyl cellulose, polybutylpyrrolidone, aluminum stearate, surfactants, etc. Dispersants, water, saline, diluents such as orange juice, strength S, including but not limited to base waxes such as cocoa butter, polyethylene glycol and white kerosene.

[0028] 経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の TAK1特異的阻害物質を溶解させた液剤、有効量の TAK1特異的阻害物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。 [0028] A formulation suitable for oral administration is a solution obtained by dissolving an effective amount of a TAK1-specific inhibitor in a diluent such as water or physiological saline, and an effective amount of the TAK1-specific inhibitor as a solid or granule. Contains capsules, granules, powders or tablets, suspensions in which an effective amount of the active ingredient is suspended in an appropriate dispersion medium, and solutions in which an effective amount of the active ingredient is dissolved in an appropriate dispersion medium An emulsion or the like dispersed and emulsified.

[0029] 非経口的な投与 (例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。 [0029] Suitable formulations for parenteral administration (eg, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, local injection, intraperitoneal administration, etc.) include aqueous and non-aqueous isotonic sterile injection solutions. This may contain antioxidants, buffers, antibacterial agents, tonicity agents and the like. Aqueous and non-aqueous sterile suspensions are also included, which may contain suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives and the like. The preparation can be sealed in a unit dose or multiple doses like ampoules and vials. Also, The active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier can be lyophilized and stored in a state that may be dissolved or suspended in a suitable sterile vehicle immediately before use.

[0030] 本発明の剤の投与量は、有効成分の種類 '活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人 1日あたり有効成分量として約 0. 001〜約 1000mg/kgであり得る。 [0030] The dosage of the agent of the present invention varies depending on the type of active ingredient 'activity, the severity of the disease, the animal species to be administered, the drug acceptability of the administration target, body weight, age, etc. The amount of active ingredient per day can be from about 0.001 to about 1000 mg / kg.

[0031] 本発明の剤は、細胞への TAK1特異的阻害物質の導入を促進する物質をさらに含み得る。このような物質としては、例えば、ポリカチオン性試薬（Lipofectamine, Lipo fectamine2000, HiPerFect, FuGENE, DharmaFECT, TransIT)、ポリエチレングリコーノレ、ポリリジン、コラーゲンなどの高分子重合体が挙げられる。 [0031] The agent of the present invention may further contain a substance that promotes the introduction of a TAK1-specific inhibitor into cells. Examples of such substances include high molecular weight polymers such as polycationic reagents (Lipofectamine, Lipofectamine 2000, HiPerFect, FuGENE, DharmaFECT, TransIT), polyethylene glycol, polylysine, and collagen.

[0032] 本発明の剤は、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防に有用であり得る。細胞の過増殖を伴う疾患としては、正常の細胞増殖の範囲を超えて過増殖し、悪性化するものである限り特に限定されないが、例えば、悪性腫瘍 (即ち、癌)、良性腫瘍の一部又は癌への進展が懸念される炎症性疾患などが挙げられる。悪性腫瘍としては、例えば、任意の組織 (例、消化器系、呼吸器系、生殖器系、皮膚）における癌が挙げられるが、消化器系の癌 (例、大腸癌、小腸癌、直腸癌、十二指腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌）が好ましい。良性腫瘍としては、上皮性細胞から発生するもの (例、乳頭腫、腺腫、ポリープ、嚢腺腫）、非上皮性細胞から発生するもの (例、線維腫、粘液腫、脂肪腫、軟骨腫、骨腫、横紋筋腫、平滑筋腫、血管腫)が挙げられるが、線腫、ポリープが好ましい。癌への進展が懸念される炎症性疾患としては、例えば、炎症性腸疾患 (例、潰瘍性大腸炎、クローン病）、リウマチ、線維症、肝炎などが挙げられるが、炎症性腸疾患が好ましい。 [0032] The agent of the present invention may be useful for the treatment and / or prevention of diseases associated with cell hyperproliferation. The disease associated with cell overgrowth is not particularly limited as long as it proliferates beyond the range of normal cell growth and becomes aggravated.For example, malignant tumors (i.e. cancer), benign tumors, etc. Examples thereof include inflammatory diseases that are partly or that are concerned about progress to cancer. Examples of malignant tumors include cancer in any tissue (eg, digestive system, respiratory system, genital system, skin), but digestive cancer (eg, colon cancer, small intestine cancer, rectal cancer). , Duodenal cancer, gastric cancer, esophageal cancer, liver cancer) are preferred. Benign tumors include those that originate from epithelial cells (eg, papilloma, adenoma, polyp, cystadenoma), those that originate from non-epithelial cells (eg, fibroma, myxoma, lipoma, chondroma, Osteoma, rhabdomyosarcoma, leiomyoma, hemangioma), and nematodes and polyps are preferred. Examples of inflammatory diseases that are concerned about progress to cancer include inflammatory bowel diseases (eg, ulcerative colitis, Crohn's disease), rheumatism, fibrosis, hepatitis, and the like. preferable.

[0033] 本発明の剤はまた、炎症性疾患から癌への進展の抑制に有用であり得る。炎症性疾患及び癌は、上述と同様であり得る。癌への進展の抑制は、例えば、癌化の予防、あるいは病状の進行の抑制又は遅延であり得る。 [0033] The agent of the present invention may also be useful for suppressing the progression from inflammatory diseases to cancer. Inflammatory diseases and cancer can be the same as described above. Suppression of progression to cancer can be, for example, prevention of canceration, or suppression or delay of progression of disease state.

[0034] 本発明の剤はまた、 TAK1を特異的に阻害することにより、副作用の原因となり得るアポトーシスを誘発せずに細胞増殖を抑制できるという特徴を有し得る。従って、本発明の剤は、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防が必要であり、かつァポトーシスの誘発が所望されな!/、被験体を投与対象とすることもまた好ましレ、。アポト一シスの誘発が所望されない被験体としては、例えば、免疫抑制薬 (例、シクロスファミド、ァザチォプリン、シクロスポリン）による処置を受けている患者、アポトーシスの誘発が所望されない疾患（例、ウィルス、細菌等の病原体による感染症）に罹患している患者、臓器移植を受けた患者が挙げられる。 [0034] The agent of the present invention may also have a feature that by inhibiting TAK1 specifically, cell proliferation can be suppressed without inducing apoptosis that may cause side effects. Therefore, the agent of the present invention is required to treat and / or prevent a disease associated with cell hyperproliferation, and induction of apoptosis is not desirable! / It is also preferable that the subject is the subject of administration. Les. Apoto Subjects who are not desired to induce cis include, for example, patients receiving treatment with immunosuppressive drugs (eg, cyclosphamide, azathioprine, cyclosporine), diseases that are not desired to induce apoptosis (eg, viruses, bacteria, etc.) Patients suffering from infections caused by various pathogens) and patients who have undergone organ transplantation.

[0035] 本発明はまた、 TAK1の発現が特異的に抑制された細胞又はそれを含む組織を提供する。 [0035] The present invention also provides a cell in which TAK1 expression is specifically suppressed or a tissue containing the same.

[0036] 本発明の細胞又は組織は、増殖性が抑制された細胞又は組織であり得る。本発明の細胞又は組織は、上述の腫瘍及び/又は組織 (例、消化器系）由来の細胞又は組織であり得る。本発明の細胞又は組織は、 TAK1の発現が一過的に抑制された細胞、又は TAK1の発現が恒常的に抑制された細胞（例、 TAK1を含むゲノムの改変細胞）、あるいはそのような細胞を含む組織であり得る。本発明の細胞又は組織は、初代培養細胞又は細胞株、あるいはそれらを含む組織 (例、それらの細胞が移入された組織）であり得る。 [0036] The cell or tissue of the present invention may be a cell or tissue with suppressed proliferation. The cell or tissue of the present invention may be a cell or tissue derived from the aforementioned tumor and / or tissue (eg, digestive system). The cell or tissue of the present invention is a cell in which TAK1 expression is transiently suppressed, or a cell in which TAK1 expression is permanently suppressed (eg, a modified cell of a genome containing TAK1), or such It can be a tissue containing cells. The cell or tissue of the present invention may be a primary cultured cell or cell line, or a tissue containing them (eg, a tissue into which those cells have been transferred).

[0037] 本発明の細胞又は組織は、例えば、上述の TAK1特異的阻害物質で過増殖を伴う細胞又は組織を処理することにより作製できる。本発明の細胞又は組織はまた、 T AK1ノックアウト動物（例えば、 Sayama et al.， The Journal of Biological Chemistry ( 原稿 M601065200として 2006年 6月 5日付でインターネットにて公開）参照）から単離すること力 Sできる。 TAK1ノックアウト動物は、細胞の過増殖を伴い得るものであってもよい。例えば、 TAK1ノックアウト動物は、細胞の過増殖を伴う疾患に罹患していてもよい。このような TAK1ノックアウト動物の疾患への罹患は、発癌物質等の薬物の処理などの自体公知の方法により行われ得る。本発明はまた、細胞の過増殖を伴い得るこのような TAK1ノックアウト動物を提供する。 [0037] The cell or tissue of the present invention can be prepared, for example, by treating a cell or tissue accompanied by hyperproliferation with the above-mentioned TAK1-specific inhibitor. The cells or tissues of the present invention may also be isolated from TAK1 knockout animals (see, eg, Sayama et al., The Journal of Biological Chemistry (published on the Internet on June 5, 2006 as manuscript M601065200)). S can. A TAK1 knockout animal may be one that may involve cell overgrowth. For example, a TAK1 knockout animal may suffer from a disease involving cell overgrowth. Such disease of TAK1 knockout animals can be carried out by a method known per se such as treatment of drugs such as carcinogens. The present invention also provides such a TAK1 knockout animal that may involve cell overgrowth.

[0038] 本発明の細胞又は組織は、例えば、細胞の過増殖を伴う疾患、特に、副作用が低減された当該疾患の治療及び/又は予防薬の開発、細胞の増殖機構の解析、細胞増殖調節遺伝子の探索などに有用であり得る。 [0038] The cell or tissue of the present invention can be used, for example, for the development of a therapeutic and / or preventive drug for a disease associated with cell hyperproliferation, in particular, for the disease with reduced side effects, analysis of the cell growth mechanism, cell proliferation It may be useful for searching for regulatory genes.

[0039] 本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。 [0040] 以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではなレ、。 [0039] The contents of all publications, including patents and patent application specifications cited in this specification, are hereby incorporated by reference herein to the same extent as if all were expressly cited. It is built in. [0040] Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

実施例 Example

[0041] 実施例 1： RNAiによる HeLa細朐での TAK1の発現抑制 [0041] Example 1: Inhibition of TAK1 expression in HeLa cells by RNAi

HeLa細胞（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団）を 10%FBS含有 DMEM培地（インビトロジェン）を用いて 37°C、 5%CO環境下にて 50%コンフルェントになるように 1日間培養した。培養した細胞に、 siRNA導入試薬として Lipofect讓 ine2000 (インビトロジェン）を用い、導入試薬と siRNA (10 M)の比率を 1.5： 1 (V/V)にて TAK1に対する si RNA (final 10 nM)を導入し、さらに培養した。導入試薬のみ添加した細胞をコント口ールとした。 siRNA導入 72時間後の細胞を RNA抽出用キット/ RNeasy mini kit (QIAG EN)に含まれる溶解液を用いて回収し、 Total RNAを抽出した。用いた siRNAのヌクレォチド配列は以下の通りであった。 HeLa cells (Human Science Promotion Foundation) were cultured for 1 day in a DMEM medium containing 10% FBS (Invitrogen) at 37 ° C in a 5% CO environment at 50% confluence. Use Lipofectine 2000 (Invitrogen) as the siRNA transfer reagent for the cultured cells, and the ratio of the transfer reagent to siRNA (10 M) at 1.5: 1 (V / V) siRNA against TAK1 (final 10 nM) Was further cultured. Cells to which only the introduction reagent was added were used as control containers. Cells 72 hours after siRNA introduction were collected using a lysate contained in an RNA extraction kit / RNeasy mini kit (QIAG EN), and total RNA was extracted. The nucleotide sequence of the siRNA used was as follows.

5' - GCAACAGAGUGAAUCUGGACGUUUA (AG) - 3' (酉己歹 IJ番号 1) 5 '-GCAACAGAGUGAAUCUGGACGUUUA (AG)-3' (IJ number 1)

5， - UCCUCAACUUUGAAGAGAUCGACUA (AG) - 3' (配列番号 2) 5,-UCCUCAACUUUGAAGAGAUCGACUA (AG)-3 '(SEQ ID NO: 2)

5' - AGACUUGACUGUAACUGGAACAGAA (AG) - 3' (酉己歹 IJ番号 3) 5 '-AGACUUGACUGUAACUGGAACAGAA (AG)-3' (IJ number 3)

5' - AGCUAAGUGGAGAGCAAAAGAUGUU (AG) - 3' (酉己歹 IJ番号 4) 5 '-AGCUAAGUGGAGAGCAAAAGAUGUU (AG)-3' (IJ number 4)

5' - GACAUUGCUUCUACAAAUACGAGUA (AG) - 3' (酉己歹 IJ番号 5) 5 '-GACAUUGCUUCUACAAAUACGAGUA (AG)-3' (IJ number 5)

(AG)はオーバーハングの 2塩基を示す。なお、配列番号 1〜5におけるオーバーハングの 2塩基を削除した配列をそれぞれ、配列番号 8〜； 12として示す。 (AG) indicates 2 bases of overhang. The sequences from which the two overhanging bases in SEQ ID NOs: 1 to 5 are deleted are shown as SEQ ID NOs: 8 to 12 respectively.

Total RNAの抽出は、 RNeasy mini kit (QIAGEN)を用い、キットに添付されている方法に従い行った。得られた total RNA溶液は濃度を測定し、 cDNA作製のための铸型として用いた。 cDNAの作製は、 50 1の反応系で铸型 RNAを 10 g用い、 72°Cで 5分変性後、逆転写酵素（M-MLV)を用いて 42°Cで 60分反応することにより行った。得られた cDNAを用いて Rea卜 time RT-PCRを行い、 TAK1の mRNA量を定量した。 R eal-time RT-PCRは、鍀型 cDNA (4.0 μ 1)、 TaqManプローブ（1·5 μ 1)、 Master Mix (l 5 1)、精製水（9.511 1)を混合し、 PRISM7900にて行い、 Δ Ct法にて比較定量解析を行った。 Total RNA was extracted using RNeasy mini kit (QIAGEN) according to the method attached to the kit. The obtained total RNA solution was measured for concentration and used as a cage for cDNA preparation. cDNA was prepared by using 10 g of vertical RNA in a 50 1 reaction system, denatured at 72 ° C for 5 minutes, and then reacted at 42 ° C for 60 minutes using reverse transcriptase (M-MLV). It was. Using the obtained cDNA, Real time RT-PCR was performed to quantify the amount of TAK1 mRNA. Real-time RT-PCR is performed with PRISM7900 by mixing vertical cDNA (4.0 μ 1), TaqMan probe (1 · 5 μ 1), Master Mix (l 5 1), and purified water (9.511 1). Comparative quantitative analysis was performed by the ΔCt method.

その結果、配列番号 1〜配列番号 5で表される TAK1の siRNAを用いることにより、 H eLa細胞において TAK1の発現が抑制されることが確認された（図 1〜5)。 As a result, by using siRNA of TAK1 represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5, It was confirmed that TAK1 expression was suppressed in eLa cells (FIGS. 1 to 5).

[0042] 実施例 2： RNAiによる HT-29細胞での TAK1の発現抑制 [0042] Example 2: Inhibition of TAK1 expression in HT-29 cells by RNAi

ヒト結腸癌細胞株である HT-29細胞（大日本製薬）を 10%FBS含有 DMEM培地（ィンビトロジェン）を用いて 37°C、 5%CO環境下にて 50%コンフルェントになるように 1日間培養した。培養した細胞に、 siRNA導入試薬として DharmaFECT4 (Dharmacon)を用い、導入試薬と siRNA dO M)の比率を 3 : 1 (V/V)にて配列番号 1の TAK1に対する siRNA(final 10 nM)を導入し、さらに培養した。 siRNA導入 72時間後の細胞を RNA 抽出用キット/ RNeasy mini kit (QIAGEN)に含まれる溶解液を用いて回収し、 Total RNAを抽出した。 Make human colon cancer cell line HT-29 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 50% confluent at 37 ° C, 5% CO using DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FBS for 1 day. Intercultured. Use DharmaFECT4 (Dharmacon) as a siRNA transfer reagent in the cultured cells, and a ratio of transfer reagent to siRNA dOM) of 3: 1 (V / V) to siRNA against TAK1 of SEQ ID NO: 1 (final 10 nM) Was further cultured. Cells 72 hours after siRNA introduction were collected using a lysate contained in an RNA extraction kit / RNeasy mini kit (QIAGEN), and total RNA was extracted.

その結果、配列番号 1に示した TAK1に対する siRNAを用いることにより、 HT-29細胞において TAK1の発現が抑制されることが確認された（図 6)。 As a result, it was confirmed that the expression of TAK1 was suppressed in HT-29 cells by using the siRNA against TAK1 shown in SEQ ID NO: 1 (FIG. 6).

[0043] 実施例 3： siRNAを用いて TAK1をノックダウンした HT-29細胞での遺伝子発現量の変動（DNAマイクロアレイ） [0043] Example 3: Change in gene expression level in HT-29 cells knocked down with TAK1 using siRNA (DNA microarray)

HT-29細胞（大日本製薬）を 10%FBS含有 DMEM培地（インビトロジェン）を用いて 3 7°C、 5%CO環境下にて 50%コンフルェントになるように 1日間培養した。培養した細胞に、 siRNA導入試薬として DharmaFECT4(Dharmacon)を用い、導入試薬と siRNA (10 a M)の比率を 3： 1 (V/V)にて配列番号 1の TAK1に対する siRNA(final 10 nM)を導入し、さらに培養した。導入 72時間後の細胞を RNA抽出用キット/ RNeasy mini kit (Q IAGEN)に含まれる溶解液を用いて回収し、 Total RNAを抽出した。 HT-29 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were cultured in a DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FBS for 1 day at 37 ° C in a 5% CO environment to become 50% confluent. For the cultured cells, use DharmaFECT4 (Dharmacon) as the siRNA introduction reagent, and the ratio of introduction reagent to siRNA (10 a M) is 3: 1 (V / V). SiRNA against TAK1 of SEQ ID NO: 1 (final 10 nM) Was introduced and further cultured. Cells 72 hours after introduction were collected using a lysate contained in an RNA extraction kit / RNeasy mini kit (QIAGEN), and total RNA was extracted.

Total RNAの抽出は、 RNeasy mini kit (QIAGEN)を用い、キットに添付されている方法に従い行った。 For extraction of total RNA, use the RNeasy mini kit (QIAGEN) and the one attached to the kit. I went according to the law.

得られた Total RNAを鎵型にし、 One- Cycle Target Labeling and Control Reagents (ァフィメトリタス社)を用い添付されて!/、る方法に従!/、リボプローブを作製した。作製したリボプローブを GeneChip (登録商標）アレイ（human Genome U133 Plus 2.0 Array )中でハイブリダィゼーシヨン（45 °C、 16 hr)後、アレイを GeneChip (登録商標） Fluidic s Station 450にて洗浄し、発色反応させた。得られたアレイを GeneChip (登録商標） S canner 3000にてスキャンユングし、その蛍光強度を測定した。統計比較解析は、専用の Workstationを用いて fiつた。 The obtained total RNA was converted into a saddle shape, and a riboprobe was prepared according to the attached method using One-Cycle Target Labeling and Control Reagents (Affymetritas)! The prepared riboprobe was hybridized (45 ° C, 16 hr) in a GeneChip (registered trademark) array (human Genome U133 Plus 2.0 Array), and then the array was washed with GeneChip (registered trademark) Fluidics Station 450 Then, a color reaction was carried out. The obtained array was scanned with a GeneChip (registered trademark) Scanner 3000, and the fluorescence intensity was measured. Statistical comparison analysis was performed using a dedicated Workstation.

上記の網羅的遺伝子発現の解析の結果、変動が見られた主な遺伝子は、以下の表 1に示すものであった。 As a result of the above comprehensive gene expression analysis, the main genes that showed fluctuations are shown in Table 1 below.

[表 1] [table 1]

上記の表 1に示すように、 0RC1L CDC7 MCM2-7など染色体 DNAの複製開始の際にコンプレックスを形成する遺伝子をはじめとする細胞周期 'DNA複製に関わる遺伝子、転写因子など細胞増殖を促進する遺伝子については発現量が低下した。一方、細胞周期を抑制する遺伝子など、細胞増殖を抑制する遺伝子については発現量が増加した。

As shown in Table 1 above, 0RC1L CDC7 MCM2-7 and other cell cycles including genes that form complexes at the start of chromosomal DNA replication Expression levels of genes that promote cell growth such as genes and transcription factors decreased. On the other hand, the expression level of genes that suppress cell growth, such as genes that suppress the cell cycle, increased.

[0046] [表 2] 炎症性メデイエ[0046] [Table 2] Inflammatory media

[0047] また、上記の表 2に示すように、炎症性メディエーターの遺伝子については発現量が低下した。 [0047] In addition, as shown in Table 2 above, the expression level of the inflammatory mediator gene decreased.

[0048] 実施例 4 : TAK1抑制の影響 [0048] Example 4: Effect of TAK1 suppression

以下は、 TAK1をノックアウトした HT- 29細胞での DNAマイクロアレイ解析の結果と、潰瘍性大腸炎から前癌状態、また大腸癌へと病気が進行した患者由来病変組織を用いた DNAマイクロアレイ解析の結果を比較したものである。先行文献 (Colliver et al ·， Exp. Mol. Path. 80: 1-10 (²006))では潰瘍性大腸炎から前癌状態、もしくは癌へと病気が進行する場合に発現が変動する遺伝子が報告されてレ、る。これら発現変動遺伝子のうち、 HT-29細胞での実験においても変動（1.5倍以上もしくは 0.66倍以下）した遺伝子を選別したところ、これらには細胞周期に関連する遺伝子、また炎症性サイトカインの誘導に関わると考えられる遺伝子が含まれる事がわ力つた（下表 3、 ⁴参照) The following are the results of DNA microarray analysis of HT-29 cells knocked out of TAK1, and the results of DNA microarray analysis using a diseased tissue derived from a patient who has progressed from ulcerative colitis to a precancerous condition or colorectal cancer. Is a comparison. In the previous literature (Colliver et al · Exp. Mol. Path. 80: 1-10 ( ² 006)), there are genes whose expression changes when the disease progresses from ulcerative colitis to a precancerous state or cancer. It is reported. Among these gene expression variation genes, even in experiments with HT-29 cells, they varied (1.5 times or more or 0.66 times or less). As a result, it was found that these genes included genes related to the cell cycle and genes thought to be involved in the induction of inflammatory cytokines (see Tables 3 and ⁴ below).

[表 3] [Table 3]

前がん患者との比較 Comparison with precancerous patients

*Εχρ. Mol. Path. 2006 80： 1-10 * Εχρ. Mol. Path. 2006 80 ： 1-10

[表 4] [Table 4]

癌患者との比較 Comparison with cancer patients

*Exp. Mol. Path. 2006 80 : 1-10 * Exp. Mol. Path. 2006 80: 1-10

上記のように、前癌患者および癌患者において発現量の変動が報告（Exp. Mol. Pa th. (2006) 80: 1-10)された遺伝子について、 siRNAを用いて TAK1の発現を抑制した場合と比較すると、一部の DNA修復に関わる遺伝子 (UNG2)を除き、各遺伝子の発現量の変動は逆方向であった。細胞を正常な状態に保っためには、 DNA修復に関わる遺伝子の発現量低下が起こらず、腫瘍形成に関わる遺伝子の発現量が抑えられることが望ましいと考えられる。 TAK1抑制はこれらの条件を満たすことから、 TAK1に対する siRNAは癌等の細胞増殖性疾患の予防 ·治療に使用できることが示唆された。 As described above, TAK1 expression was suppressed using siRNA for the gene whose expression level was reported to change in pre-cancer patients and cancer patients (Exp. Mol. Path. (2006) 80: 1-10). Compared to the cases, the expression level of each gene was reversed except for some DNA repair genes (UNG2). In order to maintain the cells in a normal state, it is desirable that the expression level of genes involved in tumorigenesis be suppressed without lowering the expression level of genes related to DNA repair. Since TAK1 suppression satisfies these conditions, It was suggested that siRNA can be used for the prevention and treatment of cell proliferative diseases such as cancer.

[0052] 実施例 5 : TAK1ノックダウンの BrdU敗り i入みに対する影響 [0052] Example 5: Effect of TAK1 knockdown on BrdU defeat i

HT-29細胞（大日本製薬）を 10%FBS含有 DMEM培地（インビトロジェン）を用いて 3 7°C、 5%CO環境下にて 50%コンフルェントになるように 1日間培養した。培養した細胞に、 siRNA導入試薬として DharmaFECT4(Dharmacon)を用い、導入試薬と siRNA ( 10 11 M)の比率を 3： 1 (V/V)にて TAK1に対する siRNA (配列番号 1)： (final 10 nM)を導入し、さらに培養した。 siRNA導入 48時間後、 FBSを含まない DMEM培地に交換し、さらに培養した。 24時間後、 FBSを添加し、 21時間培養後に BrdU (ブロモデォキシゥリジン)を添加し（終濃度 10 M)、 4時間後、キットに従い細胞溶解液を添加し静置した。上清を丁寧に回収し、 BrdUの定量解析に供した。 BrdUの定量解析は、 Cell Prolife ration ELISA, BrdUキット（Roche)を用いて行った。 HT-29 cells (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were cultured in a DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FBS for 1 day at 37 ° C in a 5% CO environment to become 50% confluent. For cultured cells, use DharmaFECT4 (Dharmacon) as the siRNA introduction reagent, and the ratio of introduction reagent to siRNA (10 11 M) is 3: 1 (V / V). SiRNA against TAK1 (SEQ ID NO: 1): (final 10 nM) was introduced and further cultured. 48 hours after introduction of siRNA, the medium was replaced with DMEM medium containing no FBS, and further cultured. After 24 hours, FBS was added, and after 21 hours of cultivation, BrdU (bromodeoxyridine) was added (final concentration 10 M), and after 4 hours, a cell lysate was added according to the kit and allowed to stand. The supernatant was carefully collected and subjected to quantitative analysis of BrdU. The quantitative analysis of BrdU was performed using Cell Proliferation ELISA, BrdU kit (Roche).

その結果、 siRNAを用いて TAK1の発現を抑制すると、 BrdUの取り込みが低下することが確認された（図 7)。従って、 TAK1の siRNAを用いることで、細胞増殖を抑制できることが分かった。 As a result, it was confirmed that, when siRNA was used to suppress TAK1 expression, BrdU incorporation was reduced (Fig. 7). Therefore, it was found that cell proliferation can be suppressed by using TAK1 siRNA.

[0053] 実施例 6 : TAK1をノックダウンした HT-29細朐でのアポトーシスの掄出 [0053] Example 6: Detection of apoptosis in HT-29 cells knocked down by TAK1

ヒト結腸癌細胞 HT-29 (大日本製薬）を 10%FBS含有 DMEM培地（インビトロジェン）を用いて 37°C、 5%CO環境下にて 50%コンフルェントになるように 1日間培養した。培養した細胞に、 siRNA導入試薬として DharmaFECT4(Dharmacon)を用い、導入試薬と配列番号 1の 311^八（10 \ )の比率を3 : 10 /¥)にて311^八(6 1 10 nM)を導入し、さらに培養した。 siRNA導入 72時間後の細胞をトリプシン処理により培養容器から回収し、細胞数をカウントした。 Human colon cancer cells HT-29 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were cultured in a DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FBS for 1 day at 37 ° C in a 5% CO environment to become 50% confluent. Use DharmaFECT4 (Dharmacon) as a siRNA transfer reagent to the cultured cells, and 311 ^ 8 (6 1 10 nM) at a ratio of 311 ^ 8 (10 \) of SEQ ID NO: 1 to 311 ^ 8 (10 \) ) Was introduced and further cultured. Cells 72 hours after siRNA introduction were collected from the culture vessel by trypsin treatment, and the number of cells was counted.

ヒト結腸癌細胞 HT-29 (大日本製薬）を 10%FBS含有 DMEM培地（インビトロジェン）を用いて 37°C、 5%CO環境下にて 80%コンフルェントになるように 1日間培養した。培養した細胞に、 Asiatic acid (SIGMA)を 50 μ g/mlとなるよう培養液に添加し、その 24 時間後、トリプシン処理により培養容器から細胞を回収し、細胞数をカウントした。アポトーシス細胞の特徴の一つである、細胞内のモノ、オリゴヌクレオソームの定量を、細胞死検出 ELISAキット（ロシュ'ダイァグノスティックス）を用いて行った。手順は、キットの説明書に従い、 siRNAを導入した細胞および Asiatic acid処置をした細胞は、 ELISAプレート 1ゥエルあたり 3.0 X 10³使用した。キット付属の試薬で細胞溶解液を調製してキット付属の 96ゥエルプレート（ストレプトアビジンコート済み）に入れ、さらにビォチン標識抗ヒストン抗体とペルォキシダーゼ標識抗 DNA抗体の混合液を添加して 2時間インキュベートした。 96ゥエルプレートをキット付属のバッファーで洗浄後、発色試薬を添加し、 8分後に SUNRISEプレートリーダー（TECAN)により 405 nmの吸光度（ Reference 492 nm)を測定した。 Human colon cancer cells HT-29 (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) were cultured in a DMEM medium (Invitrogen) containing 10% FBS for 1 day at 37 ° C in a 5% CO environment so as to be 80% confluent. To the cultured cells, Asiatic acid (SIGMA) was added to the culture solution at 50 μg / ml, and 24 hours later, the cells were collected from the culture vessel by trypsin treatment, and the number of cells was counted. Quantification of intracellular mono- and oligonucleosomes, which is one of the characteristics of apoptotic cells, was performed using a cell death detection ELISA kit (Roche Diagnostics). For the procedure, follow the instructions in the kit, and the cells that have been introduced with siRNA and those that have been treated with Asiatic acid 3.0 × 10 ^{3 were} used per ELISA plate. Prepare the cell lysate using the reagent supplied with the kit, place it in the 96-well plate (coated with streptavidin), and add a mixture of biotin-labeled anti-histone antibody and peroxidase-labeled anti-DNA antibody. Incubated for hours. The 96-well plate was washed with the buffer supplied with the kit, a coloring reagent was added, and after 8 minutes, the absorbance at 405 nm (Reference 492 nm) was measured with a SUNRISE plate reader (TECAN).

HT-29細胞に Asiatic acidを添加してアポトーシスを誘導すると、細胞内にモ入オリゴヌクレオソームが蓄積され、 Vehicle処置と比較して OD値 (A405-A492)の値が大きくなつた（図 8)。一方、 non-silencing siRNA又は TAK1に対する siRNAを導入した HT- 29細胞の場合、この値は両者の間で差が無ぐまた Asiatic acid処置のように大きな値とならなかった（図 9)。このこと力、ら、 HT-29細胞では TAK1を RNAiによりノックダウンしてもアポトーシスの誘導は起こらないことが示唆された。 When Asiatic acid was added to HT-29 cells to induce apoptosis, the entrapped oligonucleosomes accumulated in the cells, and the OD value (A405-A492) increased compared to vehicle treatment (Fig. 8). On the other hand, in the case of HT-29 cells into which non-silencing siRNA or siRNA against TAK1 was introduced, this value was not different between the two, and it was not as large as in the treatment with Asiatic acid (Fig. 9). This suggests that in HT-29 cells, induction of apoptosis does not occur when TAK1 is knocked down by RNAi.

実施例 7 : 1^ にょるじ2(：12細朐での丁八1 1の発現抑制 Example 7: 1 ^ Nyoji 2 (: Suppression of expression of Dingpachi 1 1 in 12 Hoso

C2C12細胞（ヒューマンサイエンス振興財団）を 5%FBS含有 DMEM培地（インビトロジェン）を用いて 37°C、 5%CO環境下にて 50%コンフルェントになるように培養した。培養した細胞に、 siRNA導入試薬として DharmaFECT4 (Dharmacon)を用い、導入試薬と siRNA (10 M)の比率を 3 : 1 (V/V)にてマウス TAK1に対する siRNA (final 10 nM)を導入し、さらに培養した。 siRNA導入 72時間後の細胞を RNA抽出用キット /RNeasy m ini kit (QIAGEN)に含まれる溶解液を用いて回収し、 Total RNAを抽出した。用いた si RNAのヌクレオチド配列は以下の通りであった。 C2C12 cells (Human Science Promotion Foundation) were cultured in DMEM medium (Invitrogen) containing 5% FBS at 37 ° C in a 5% CO environment so as to be 50% confluent. Using DharmaFECT4 (Dharmacon) as a siRNA transfer reagent to the cultured cells, introduce siRNA (final 10 nM) against mouse TAK1 at a ratio of transfer reagent to siRNA (10 M) of 3: 1 (V / V). And further cultured. Cells 72 hours after siRNA introduction were collected using a lysate contained in an RNA extraction kit / RNeasy mini kit (QIAGEN), and total RNA was extracted. The nucleotide sequence of the siRNA used was as follows.

5' - CAGGAGGGACAGUUCUAAAAAUCUG (AG) - 3' (酉己歹 IJ番号 7) 5 '-CAGGAGGGACAGUUCUAAAAAUCUG (AG)-3' (IJ number 7)

(AG)はオーバーハングの 2塩基を示す。なお、配列番号 7におけるオーバーハングの 2塩基を削除した配列を、配列番号 15として示す。 (AG) indicates 2 bases of overhang. A sequence obtained by deleting two bases of the overhang in SEQ ID NO: 7 is shown as SEQ ID NO: 15.

Total RNAの抽出は、 RNeasy mini kit (QIAGEN)を用い、キットに添付されている方法に従い行った。得られた total RNA溶液は濃度を測定し、 cDNA作製のための铸型として用いた。 cDNAの作製は、 50 1の反応系で铸型 RNAを 10 g用い、 72°Cで 5分変性後、逆転写酵素（M-MLV)を用いて 42°Cで 60分反応することにより行った。 Total RNA was extracted using RNeasy mini kit (QIAGEN) according to the method attached to the kit. The obtained total RNA solution was measured for concentration and used as a cage for cDNA preparation. cDNA was prepared by using 10 g of vertical RNA in a 50 1 reaction system, denatured at 72 ° C for 5 minutes, and then reacted at 42 ° C for 60 minutes using reverse transcriptase (M-MLV). It was.

得られた cDNAを用いて Rea卜 time RT-PCRを行い、 TAK1の mRNA量を定量した。 R eal-time RT-PCRは、鍀型 cDNA (4.0 μ 1)、 TaqManプローブ（1·5 μ 1)、 Master Mix (l 5 1)、精製水（9.511 1)を混合し、 PRISM7900にて行い、 Δ Ct法にて比較定量解析を行った。 Using the obtained cDNA, Real time RT-PCR was performed to quantify the amount of TAK1 mRNA. R eal-time RT-PCR is performed with PRISM7900 by mixing vertical cDNA (4.0 μ 1), TaqMan probe (1.5 μ 1), Master Mix (l 5 1), and purified water (9.511 1). Comparative quantitative analysis was performed by the ΔCt method.

その結果、配列番号 7で表される TAK1の siRNAを用いることにより、 C2C12細胞において TAK1の発現が抑制されることが確認された（図 10)。 As a result, it was confirmed that the expression of TAK1 was suppressed in C2C12 cells by using the TAK1 siRNA represented by SEQ ID NO: 7 (FIG. 10).

産業上の利用可能性 Industrial applicability

[0055] 本発明の剤は、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防に有用であり得る。特に、本発明の剤は、副作用の原因となり得るアポトーシスを誘発し得ず、従来とは異なる作用機序を示すことから、アポトーシスの誘発が所望されない被験体における当該疾患の治療及び/又は予防に有用であり得る。 [0055] The agent of the present invention may be useful for the treatment and / or prevention of diseases associated with cell hyperproliferation. In particular, the agent of the present invention cannot induce apoptosis that may cause side effects, and exhibits a mechanism of action different from the conventional one. Therefore, the agent of the present invention is useful for treatment and / or prevention of the disease in a subject in which induction of apoptosis is not desired. Can be useful.

本発明の siRNA又はその発現ベクターは、医薬として、例えば、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防、特に、アポトーシスの誘発が所望されない当該疾患の治療及び/又は予防に有用であり得る。 The siRNA or the expression vector of the present invention is useful as a medicament, for example, for the treatment and / or prevention of a disease associated with cell overgrowth, particularly for the treatment and / or prevention of the disease in which apoptosis induction is not desired. obtain.

本発明の細胞又は組織は、例えば、細胞の過増殖を伴う疾患、特に、副作用が低減された当該疾患の治療及び/又は予防薬の開発に有用であり得る。 The cell or tissue of the present invention can be useful, for example, for the development of a therapeutic and / or prophylactic agent for a disease associated with cell hyperproliferation, in particular, the disease with reduced side effects.

[0056] 本発明を好まし!/ヽ態様を強調して説明してきたが、好まし!/、態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。 [0056] While the present invention has been described with emphasis on the preferred embodiment, it will be apparent to those skilled in the art that the preferred embodiment can be modified. The present invention contemplates that the present invention may be practiced otherwise than as specifically described herein. Accordingly, this invention includes all modifications encompassed within the spirit and scope of the appended claims.

本出願は、日本国で出願された特願 2006— 216658を基礎としており、そこに開示される内容は本明細書にすべて包含されるものである。 This application is based on Japanese Patent Application No. 2006-216658 filed in Japan, and the contents disclosed therein are incorporated in full herein.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims

[1] TAK1特異的阻害物質を含む、細胞の過増殖を伴う疾患の治療及び/又は予防剤。 [1] A therapeutic and / or prophylactic agent for a disease associated with cell hyperproliferation, comprising a TAK1-specific inhibitor.

[2] アポトーシスを原因とする副作用を示さない、又は該副作用が低減された、請求項 [2] The side effect caused by apoptosis is not shown or the side effect is reduced.

1記載の剤。 1. The agent according to 1.

[3] TAK1特異的阻害物質が、 RNAi誘導性核酸、アンチセンス核酸、ドミナントネガティブ変異体、又はそれらの発現ベクターである、請求項 1記載の剤。 [3] The agent according to claim 1, wherein the TAK1-specific inhibitor is an RNAi-inducible nucleic acid, an antisense nucleic acid, a dominant negative mutant, or an expression vector thereof.

[4] RNAi誘導性核酸が siRN Aである、請求項 3記載の剤。 [4] The agent according to claim 3, wherein the RNAi-inducible nucleic acid is siRNA.

[5] siRNAが以下（a)又は（b)の!/、ずれかである、請求項 3又は 4記載の剤： [5] The agent according to claim 3 or 4, wherein the siRNA is one of the following (a) or (b):

(a)配列番号 8〜； 13のいずれかで表される塩基配列を含むセンス鎖、及びその相補配列を含むアンチセンス鎖から構成され、該センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の 5 '末端及び/又は 3'末端にオーバーハングを有していてもよぐかつ TAK1の発現抑制活性を有する二重鎖 RNA；又は (a) a sense strand comprising the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 8 to 13 and an antisense strand comprising the complementary sequence thereof, the sense strand and / or the 5 ′ end of the antisense strand and / Or a double-stranded RNA that may have an overhang at the 3 ′ end and has TAK1 expression-suppressing activity; or

[6] siRNAが以下（a)〜（f)の!/、ずれかである、請求項 3又は 4記載の剤： [6] The agent according to claim 3 or 4, wherein the siRNA is any of the following (a) to (f):

(e)配列番号 5で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 12で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA;又は (f) 配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 14で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA。 (e) a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and represented by SEQ ID NO: 12 Double-stranded RNA composed of an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence; or (f) a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and the complement of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14 Double-stranded RNA composed of an antisense strand consisting of a sequence.

[7] 細胞の過増殖を伴う疾患が、悪性腫瘍、良性腫瘍、又は癌への進展が懸念される炎症性疾患である、請求項 1記載の剤。 [7] The agent according to claim 1, wherein the disease accompanied by cell hyperproliferation is an inflammatory disease in which progression to malignant tumor, benign tumor, or cancer is a concern.

[8] 悪性腫瘍が消化器系の癌である、請求項 7記載の剤。 [8] The agent according to claim 7, wherein the malignant tumor is a gastrointestinal cancer.

[9] 消化器系の癌が大腸癌である、請求項 8記載の剤。 [9] The agent according to claim 8, wherein the gastrointestinal cancer is colon cancer.

[10] 癌への進展が懸念される炎症性疾患が、炎症性腸疾患、リウマチ、線維症又は肝炎である、請求項 7記載の剤。 [10] The agent according to claim 7, wherein the inflammatory disease for which progression to cancer is a concern is inflammatory bowel disease, rheumatism, fibrosis or hepatitis.

[11] 炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項 10記載の剤。 [11] The agent according to claim 10, wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.

[12] TAK1特異的阻害物質を含む、炎症性疾患から癌への進展の抑制剤。 [12] A suppressant of progression from inflammatory diseases to cancer, comprising a TAK1-specific inhibitor.

[13] 炎症性疾患が、炎症性腸疾患、リウマチ、線維症又は肝炎である、請求項 12記載の剤。 [13] The agent according to claim 12, wherein the inflammatory disease is inflammatory bowel disease, rheumatism, fibrosis or hepatitis.

[14] 炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項 13記載の剤。 14. The agent according to claim 13, wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.

[15] 投与される被験体が、免疫抑制薬による処置を受けている患者、感染症に罹患してレ、る患者又は臓器移植を受けた患者である、請求項 1又は 12記載の剤。 [15] The agent according to claim 1 or 12, wherein the administered subject is a patient receiving treatment with an immunosuppressive drug, a patient suffering from an infectious disease, or a patient undergoing organ transplantation.

[16] 細胞への TAK1特異的阻害物質の導入を促進する物質をさらに含む、請求項；!〜 [16] The claim further comprising a substance that promotes the introduction of a TAK1-specific inhibitor into the cell;

15のいずれ力、 1項記載の剤。 15. Any force of 15, the agent according to 1.

[17] 以下（a)又は（b)のいずれかである、 siRNA: [17] siRNA which is either (a) or (b) below:

[18] 以下（a)〜（f)のいずれかである、 siRNA: [18] Any of the following (a) to (f): siRNA:

(f)配列番号 6で表される塩基配列からなるセンス鎖、及び配列番号 14で表される塩基配列の相補配列からなるアンチセンス鎖から構成される、二重鎖 RNA。 (f) A double-stranded RNA composed of a sense strand consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 and an antisense strand consisting of a complementary sequence of the base sequence represented by SEQ ID NO: 14.

[19] 請求項 17又は 18記載の siRNAをコードするポリヌクレオチドを含む、 siRNA発現ベクター。 [19] An siRNA expression vector comprising the polynucleotide encoding the siRNA according to claim 17 or 18.

[20] 請求項 17又は 18記載の siRNAあるいは請求項 19記載の siRNA発現ベクターを含む、医薬。 [20] A medicament comprising the siRNA according to claim 17 or 18, or the siRNA expression vector according to claim 19.

[21] TAK1の発現が特異的に抑制された、増殖性が抑制された細胞、又はその細胞を含む組織。 [21] A cell in which the expression of TAK1 is specifically suppressed and the proliferation is suppressed, or a tissue containing the cell.