【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＴＡＫ１阻害剤、およびＴＡＫ１活性化阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内のシグナル伝達に関与する一連の系として、マイトジェン−活性化プロテインキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ； ＭＡＰＫ）系が知られている。ＭＡＰＫ系は受容体のシグナルを種々の作用に転換する保存された真核細胞性シグナル伝達系である。ＭＡＰＫ系は３種類のプロテインキナーゼ、すなわちＭＡＰＫＫＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ）、ＭＡＰＫＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｋｉｎａｓｅ）、ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ ）を含む。ＭＡＰＫはＭＡＰＫＫによるリン酸化で活性化される。ＭＡＰＫＫはＭＡＰＫＫＫによるリン酸化で活性化される（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． （１９９３） １８， １２８；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． （１９９３） １９， ２３６；Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． （１９９３） １９， ４７０；Ｃｅｌｌ （１９９５） ８０， １７９）。
【０００３】
細胞内のシグナル伝達系において機能するＭＡＰＫＫＫファミリーの一つであるＴＡＫ１（ＴＧＦ−β−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ １）はＹａｍａｇｕｃｈｉ， Ｋ．らにより同定された蛋白質であり（Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５）２７０， ２００８）、ＴＧＦ−βのシグナル伝達に関与しＴＧＦ−βにより活性化されることが明らかになっている。また、ＴＡＫ１に結合し、ＴＡＫ１を活性化するＴＧＦ−βのシグナル伝達系に関与する蛋白質であるＴＡＢ１（ＴＡＫ１ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）がＳｈｉｂｕｙａ， Ｈ．らにより同定された（Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９６） ２７２， １１７９−１１８２）。ＴＡＢ１はＴＡＫ１に結合してＴＡＫ１のキナーゼ活性を活性化し、ＭＡＰＫＫであるＭＫＫ４やＭＫＫ３／６の活性化を通じ、ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ（ＪＮＫ）やｐ３８ ＭＡＰＫの活性化を誘導し、ＴＧＦ−β等のシグナルを伝達する（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， （１９９６） ２７１， １３６７５−１３６７９；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， （１９９７） ２７２， ８１４１−８１４４）。さらに、活性化ＴＡＫ１の発現により心肥大、さらには心不全を誘導することが明らかとなった（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．， （２０００） ６， ５５６−５６３）。
また最近になり、ＴＡＫ１がインターロイキン−１（ＩＬ−１）と腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の刺激等の各種ストレスによっても活性化されることが明らかになり（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９７） ２７２， ８１４１−８１４４；Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， （１９９９） ２７４， １０６４１−１０６４８）、ＴＡＫ１はＩＬ−１のシグナル伝達系においてＭＡＰＫカスケードを介したＪＮＫの活性化、ならびにｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ−κＢ （ＮＦ−κＢ）−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ （ＮＩＫ）、ＩκＢ ｋｉｎａｓｅｓ （ＩＫＫ）の活性化を通じたＮＦ−κＢの活性化に関与することが明らかになった（Ｎａｔｕｒｅ （１９９９） ３９８， ２５２−２５６；Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ， （２０００） ５， ６４９−６５８）。さらに、ＬＰＳ刺激によりＴＡＫ１が活性化され、ＮＦ−κＢの活性化を誘導し、ＬＰＳのシグナル伝達への関与が明らかになった（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， （２０００） ４６７， １６０−１６４）。
ＴＧＦ−βは多くの細胞機能を制御する多機能因子であり、その一つとしてＴＧＦ−βは様々な傷害に伴う組織の修復および再生を司る（ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， （１９９４） ３３１， １２８６−１２９２）。しかしながら、慢性化した傷害においてはＴＧＦ−βの異常産生により、組織の修復、再生のバランスが崩れ病的な線維化を生ずることがある。ＴＧＦ−βは細胞外マトリックス蛋白質の産生を亢進させ、細胞外マトリックス分解酵素の合成の阻害、ならびに細胞外マトリックス分解酵素の阻害因子を誘導する事により、種々の臓器、例えば肝臓、腎臓等の線維症の主要な原因因子として作用することが明らかになっている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， （１９９４） ３３１， １２８６−１２９２）。また、その他の作用としては、細胞増殖阻害活性（Ｃｅｌｌ （１９９０） ６３， ２４５−２４７）、単球遊走活性（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， （１９８７） ８４， ５７８８−５７９２）、生理活性物質誘導活性（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， （１９８７） ８４， ５７８８−５７９２）、βアミロイド蛋白質沈着作用（Ｎａｔｕｒｅ， （１９９７） ３８９， ６０３−６０６）が知られている。肝線維症、肺線維症、糸球体腎炎、糖尿病性腎症、腎硬化症、血管再狭窄、ケロイド症、強皮症、眼科手術後の瘢痕化、増殖性網膜症、自己免疫疾患およびアルツハイマー症などの疾病とＴＧＦ−βの異常産生の関連が報告されている。
ＩＬ−１やＴＮＦ等の炎症性サイトカインは、異物の侵入による炎症などの生体防御因子として重要な役割を果たしているが、この反応が過剰に発現すると、逆に様々な病態を引き起こす事が知られている。ＩＬ−１は免疫及び炎症反応において重要なメディエーターであると考えられ、様々な細胞に働いて、それぞれの細胞機能を亢進する。その結果、 Ｔ、Ｂリンパ球の分化及び増殖、ＩＬ−２やコロニー刺激因子、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦ等の炎症性サイトカインの産生、発熱・睡眠・食欲低下・低血圧の誘導、脳下垂体からのホルモン分泌亢進、コラゲナーゼの産生亢進による関節軟骨の破壊、プロスタグランジン産生亢進による痛覚閾値の低下をそれぞれ誘導し、さらにランゲルハンス島のβ細胞の破壊、骨髄性白血病細胞の増殖、関節炎、腸炎等の炎症への関与、動脈硬化プラークの形成など多彩な生理反応への関与が明らかになっている。また、ＩＬ−１の過剰産生が原因と考えられている疾病として慢性関節リウマチ、骨粗鬆症、敗血症、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、動脈硬化症、乾癬、喘息、アルコール性肝炎等が知られている（ ＴＩＰＳ， （１９８８） ９， １７１−１７７；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， （１９９３） ３２８， １０６−１１３； Ｂｌｏｏｄ， （１９９６） ８７， ２０９５−２１４７）。
また、ＴＮＦαは生体内に侵入した異物抗原との接触により活性化されたマクロファージ等の細胞より放出され、マクロファージの走化性、貪食能を亢進させるばかりでなく、Ｔリンパ球のＨＬＡ抗原の発現を増強し、またＩＬ−２受容体の発現の増加を通じてＴ細胞の機能を賦活化、さらに好中球の走化性の亢進、活性化を誘導し、異物の除去に働く。また、炎症局所の線維芽細胞に対しては増殖促進に働き、その組織修復を行っている。さらに、ＴＮＦαはこれらの細胞より種々のサイトカインの発現を亢進させ、ＩＬ−１と同様にサイトカインネットワークの形成に関与している。しかし、これらの反応が過剰に発現すると増悪因子として働くことがあり、ＴＮＦαの過剰産生が知られている疾患として、敗血症、慢性関節性リウマチ、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＳＬＥ、川崎病等が報告されている（日本臨床、（１９９９） ５７、Ｓｕｐｐｌ：７９４−７９７）。
従って、ＴＡＫ１キナーゼ活性もしくはＴＡＫ１の活性化を抑制する物質が見出されれば、ＴＡＫ１がシグナル伝達に関与する事が知られているＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＬＰＳ、ＴＮＦ等が原因因子として知られている各種疾病、並びに心肥大、心不全の治療および予防薬の開発につながると考えられる。しかしながら、現在までにＴＡＫ１キナーゼ阻害剤、もしくはＴＡＫ１活性化阻害剤は知られていない。
ところで、ゼアラレノン類は、これまでに種々の化合物が報告されており、また、種々の作用、例えば、サイトカイン、特にＩＬ−１の産生抑制（特開平８−４０８９３号公報、欧州第６０６０４４Ａ号公報など）、チロシンキナーゼ阻害（ＷＯ９６／１３２５９号公報）、ＭＥＫ１キナーゼ阻害に基づくＴ細胞の活性化及び活性化に伴う増殖阻害（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７； ９５７９−９５８５， １９９８）、ＪＮＫ／ｐ３８活性化の阻害（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２５７；１９−２３， １９９９）、ＭＥＫ阻害（Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， ５２；１０８６−１０９４， １９９９）、ＬＰＳ刺激後のサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）産生阻害（Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ２１；７９９−８１４， １９９９）、 ＬＰＳ、ＩＦＮ−γ刺激後のサイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α）産生抑制（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ８；７５１−７６１， １９９６）など、についても報告されている。
しかし、これまで、ゼアラレノン類がＴＡＫ１あるいはＴＡＫ１活性化を阻害する作用を有することは知られていない。また、８位および９位のいずれにも水酸基を有するゼアラレノン類が特に優れた該作用を有することも全く知られていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＴＡＫ１阻害剤、あるいは、ＴＡＫ１活性化阻害剤を提供することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ある種のゼアラレノン類が優れたＴＡＫ１キナーゼ阻害活性を持ち、また、ＴＡＫ１の活性化を介したＴＧＦ−βやＩＬ−１等のシグナル伝達を阻害することを見出し、この知見に基づき本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、８位および９位のいずれにも水酸基を有するゼアラレノン類を有効成分とする、ＴＡＫ１阻害剤またはＴＡＫ１活性化阻害剤を提供する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、８位および９位のいずれにも水酸基を有するゼアラレノン類には、ゼアラレノン（Ｚｅａｒａｌｅｎｏｎｅ：下記式（Ａ））またはゼアラレノール（Ｚｅａｒａｌｅｎｏｌ：下記式（Ｂ））
【０００８】
【化３】
【０００９】
から誘導される化合物であって、その８位および９位のいずれにも水酸基（−ＯＨ）を有する化合物が含まれる。これら化合物には、光学異性体、幾何異性体が存在し得るがそれらのいずれも、およびそれら任意の割合の混合物も本発明に含まれる。
【００１０】
８位および９位のいずれにも水酸基を有するゼアラレノン類としては、具体的には、例えば、以下に示されるような化合物が含まれる：
【００１１】
【化４】
【００１２】
【化５】
【００１３】
これら化合物（１）〜（１３）は、自体公知の化合物であり、文献（例えば、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｉｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ２１：７９９−８１４， １９９９；Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．， ４３： ２３３９−２３４３， １９７８；Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４１：３７３−３７５， １９９３；Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ， ５２：１０７７−１０８５， １９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２５７：１９−２３， １９９９；Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ８：７５１−７６１， １９９６；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ７：３０１−３０８， １９９６；日本特許公開平８−４０８９３号公報；欧州特許公開第６０６０４４Ａ号公報；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７： ９５７９−９５８５， １９９８など）に記載の方法により調製することができる。
【００１４】
８位および９位のいずれにも水酸基を有するゼアラレノン類としては、化合物（１）〜（１３）が好ましく、化合物（１）〜（３）がさらに好ましく、化合物（１）が特に好ましい。
【００１５】
本発明において、ＴＡＫ１阻害とは、ＴＡＫ１のキナーゼ活性を阻害することを意味する。ＴＡＫ１の阻害活性は、例えば、後述の実施例２に記載された方法により測定することができる。
【００１６】
ＴＡＫ１活性化阻害とは、ＴＡＫ１を介した細胞内シグナル伝達を阻害することを意味する。ＴＡＫ１阻害活性化阻害作用は、例えば、後述の実施例３に記載された方法により測定することができる。
【００１７】
疾病の原因としてＴＡＫ１の活性化が関与する疾病には、ＴＡＫ１の活性化を介した細胞内のシグナル伝達系に関与するＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＬＰＳ、ＴＮＦ等を原因因子とする各種疾病、並びに、心肥大、心不全などが含まれる。
【００１８】
本発明のＴＡＫ１キナーゼ阻害剤またはＴＡＫ１活性化阻害剤の投与経路、投与量は、患者の体型、年齢、体調、疾患の種類や度合い、発症後の経過時間等により、適宜選択することができるが、非経口投与の場合には、一般に０．０２μｇ〜２ｍｇ／体重ｋｇ／日の用量で、経口投与の場合には、一般に５μｇ〜５００ｍｇ／体重ｋｇ／日の用量で効果が期待できる。
【００１９】
本発明のＴＡＫ１阻害剤またはＴＡＫ１活性化阻害剤は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤などを含む薬学的組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。
【００２０】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００２１】
【実施例】
ＴＡＫ１ キナーゼ阻害活性の評価
（実施例１）化合物（１）〜（３）のＴＡＫ１キナーゼ阻害活性の検討
ＴＡＫ１キナーゼ活性はＴＡＫ１の自己リン酸化、ならびにＴＡＢ１のリン酸化を測定することで評価した。すなわち、ＴＡＫ１及びＴＡＢ１遺伝子を含有した組み換えバキュロウイルスベクター（ＷＯ９９／２１０１０号公報）をそれぞれ昆虫細胞Ｓｆ−９に共感染させ、３日間培養した。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３．０ ｘ １０７細胞／ｍＬとなるように抽出液（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１２．５ ｍＭ β−ｇｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ ｍＭ ＮａＦ、２ ｍＭ ＤＴＴ、１ ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、２０μＭＡｐｒｏｔｉｎｉｎ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に懸濁し細胞抽出液を調製した。細胞抽出液１０μＬに抗ＴＡＫ１抗体Ｍ−１７（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）１００ ｎｇ、及びＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）１ μＬを加え、４℃でインキュベートした後、免疫沈降物を洗浄液（２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４、５００ ｍＭ ＮａＣｌ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２）で３回洗浄、続いてキナーゼ溶液（１０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．４、１ ｍＭ ＤＴＴ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２）で２回洗浄し、ＴＡＫ１／ＴＡＢ１精製物を調製した。ＴＡＫ１／ＴＡＢ１精製物をキナーゼ溶液に再懸濁し、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の各穴に２５μＬずつ加えた後、ＤＭＳＯに溶解した試験化合物を１μＬずつ加え、室温にて３０分間インキュベートした。続いて、１ウエル当たり０．１μＣｉとなるように［γ−３３Ｐ］−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を加えた溶液（１００ ｍＭ ＭＯＰＳ， ｐＨ ７．２、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２μＭ ＡＴＰ）を２５μＬずつ加え、３７℃にて３０分間インキュベートしキナーゼ反応を行った。反応停止液（５０％ ＴＣＡ含有ＰＢＳ）を５０μＬずつ加え、さらに４℃にて１０分間インキュベートし、キナーゼ反応を停止した。フリーの３３Ｐ−ＡＴＰを除去するために、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで５回洗浄し、５０μＬずつのＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｗａｌｌａｃ社製）を加え、さらに室温にて３０分間清置した後ＴＡＫ１及びＴＡＢ１に取り込まれた３３Ｐ−ＡＴＰ量をｍｉｃｒｏ−ｂｅｔａにより測定することでＴＡＫ１キナーゼ活性を測定した。その結果、化合物（１）〜（３）は表１に示すようにＴＡＫ１キナーゼ活性を抑制し、特に化合物（１）はＩＣ５０値として８．１ ｎＭのＴＡＫ１キナーゼ阻害活性を示した。しかしながら、化合物（１）〜（３）の８位および９位に対応する位置に水酸基を有しない化合物であるＲａｄｉｃｉｃｏｌ
【００２２】
【化６】
【００２３】
、ゼアラレノン（式（Ａ））、ゼアラレノール（式（Ｂ））
【００２４】
【化７】
【００２５】
はＴＡＫ１キナーゼ阻害活性はほぼ認められなかった。
【００２６】
【表１】
【００２７】
（実施例２）ＴＡＫ１を介したシグナル伝達阻害作用の検討
ＴＡＫ１の活性化によりＭＡＰＫカスケードならびにＮＦ−κＢの活性化が誘導されることが知られている。そこで、ＴＡＫ１キナーゼ活性の阻害によりＴＡＫ１を介したシグナル伝達への影響をレポーターアッセイを用い検討した。
【００２８】
初めに、ＴＧＦ−β応答性エレメントの下流にルシフェラーゼの遺伝子を組み込んだｐ３ＴＰ−Ｌｕｘ（Ｃｅｌｌ， ７１， １００３−１０１４， １９９２）を用い、化合物（１）の影響を検討した。ヒトｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ細胞株ＨＴ−１０８０細胞１ ｘ １０６個を播種し終夜培養した後、２μｇのｐ３ＴＰ−Ｌｕｘと１０μＬのＦｕＧＥＮＥ遺伝子導入試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）の混合物を細胞に添加し、さらに８時間培養し遺伝子を導入した。遺伝子を導入した細胞をトリプシンにより剥がした後、１ウエル当たり１ ｘ １０４個となるように９６穴マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に播種し、さらに終夜培養した。ＤＭＥＭ培地で１回洗浄した後、０．２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈した化合物（１）を５０μＬずつ添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、終濃度で１０ ｎｇ／ｍＬとなるようにＴＧＦ−β（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を５０μＬずつ加え、さらに２４時間培養した。ルシフェラーゼ活性はＳｔｅａｄｙ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。
【００２９】
また、ＮＦ−κＢの活性化の測定には応答性エレメントの下流にルシフェラーゼの遺伝子を組み込んだＮＦｋＢ−Ｌｕｃ（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， ７， １３５４−１３６３， １９９３）を用い、ＩＬ−１刺激、又はＴＡＫ１／ＴＡＢ１強制発現によりＴＡＫ１の活性化を誘導し行った。すなわち、ヒト胎児腎細胞株２９３細胞にＩＬ−１受容体を強制発現させた２９３−ＩＬ１Ｒ細胞（ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ， ５， ６４９−６５８， ２０００）を１ ｘ １０６個を播種し終夜培養した後、２μｇのＮＦｋＢ−Ｌｕｃと１０μＬのＦｕＧＥＮＥ遺伝子導入試薬（Ｒｏｃｈｅ社製）の混合物を細胞に添加し、さらに８時間培養し遺伝子を導入した。遺伝子を導入した細胞をトリプシンにより剥がした後、１ウエル当たり１ ｘ １０４個となるように９６穴マイクロプレート（Ｃｏａｎｉｎｇ Ｃｏａｓｔｅｒ社製）に播種し、さらに終夜培養した。ＤＭＥＭ培地で１回洗浄した後、０．２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈した化合物（１）を５０μＬずつ添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、終濃度で１０ ｎｇ／ｍＬとなるようにＩＬ−１α（ＰＥＰＲＯ ＴＥＣＨ社製）を５０μＬずつ加え、さらに２４時間培養した。ルシフェラーゼ活性はＳｔｅａｄｙ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて測定した。ＴＡＫ１／ＴＡＢ１強制発現によるＮＦｋＢの活性化に関しては、ＮＦｋＢ−Ｌｕｃの遺伝子導入と共に、ＴＡＫ１、ＴＡＢ１発現ベクターｐＴＡＫ１−ＨＡならびにｐＣＯＳ−ＦＴＡＢ１をそれぞれ２５０ ｎｇずつを同時に加え、上記と同様に遺伝子を導入した。遺伝子を導入した細胞は上記と同様に９６穴マイクロプレート（Ｃｏａｎｉｎｇ Ｃｏａｓｔｅｒ社製）に播種し、終夜培養した後、 ＤＭＥＭ培地で１回洗浄し、０．２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で希釈した化合物（１）を５０μＬずつ添加した。３７℃で２４時間培養した後、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【００３０】
結果を図１に示す。図１において、縦軸は、阻害活性（％）を示す。横軸は、化合物（１）濃度（Ｍ）を示す。黒塗り四角は、ｐ３ＴＰ−ＬｕｘアッセイにおけるＴＧＦ−βシグナル伝達経の阻害活性を示す。黒塗り三角はＮＦｋＢ−ＬｕｃアッセイにおけるＩＬ−１シグナル伝達系の阻害活性を示す。白抜き三角はＮＦｋＢ−ＬｕｃアッセイにおけるＴＡＫ１／ＴＡＢ１強制発現によるシグナル伝達系の阻害活性を示す。
【００３１】
図１に示すように、化合物（１）は容量依存的にＴＧＦ−β、ＩＬ−１α、ならびにＴＡＫ１／ＴＡＢ１強制発現によるルシフェラーゼの発現を抑制した。この結果はＴＡＫ１キナーゼ活性の阻害により下流へのシグナル伝達を阻害できることを示唆する。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の化合物は、はＴＡＫ１阻害作用を有するので、ＴＡＫ１の活性化を介した各種シグナル伝達系を阻害し、疾病の原因としてＴＡＫ１の活性化が関与する各種疾病、例えば、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１、ＬＰＳ、ＴＮＦ−α等が原因因子として知られる各種疾病の治療および予防する薬剤として有用であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】化合物（１）のＴＡＫ１を介したシグナル伝達阻害作用を示すグラフである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to TAK1 inhibitors and TAK1 activation inhibitors.
[0002]
[Prior art]
As a series of systems involved in intracellular signal transduction, a mitogen-activated protein kinase (MAPK) system is known. The MAPK system is a conserved eukaryotic signaling system that converts receptor signals into various actions. The MAPK system includes three types of protein kinases, namely, MAPKKK (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase), MAPKK (Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase), and MAPK (Mitogen-Kate-Migrate). MAPK is activated by phosphorylation by MAPKK. MAPKK is activated by phosphorylation by MAPKKK (Trends Biochem. Sci. (1993) 18, 128; Trends Biochem. Sci. (1993) 19, 236; Trends Biochem. Sci. (1993); 1995) 80, 179).
[0003]
TAK1 (TGF-β-Activated Kinase 1), which is one of the MAPKKK family that functions in the intracellular signal transduction system, is disclosed in Yamaguchi, K. et al. (Science (1995) 270, 2008) and has been shown to be involved in TGF-β signal transduction and activated by TGF-β. Also, TAB1 (TAK1 Binding Protein 1), which is a protein involved in the TGF-β signal transduction system that binds to TAK1 and activates TAK1, is disclosed in Shibuya, H .; (Science (1996) 272, 1179-1182). TAB1 binds to TAK1 to activate the kinase activity of TAK1, induces activation of c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 MAPK through activation of MAPKK MKK4 and MKK3 / 6, and TGF- Transmits signals such as β (J. Biol. Chem., (1996) 271, 13675-13679; J. Biol. Chem., (1997) 272, 8141-8144). Furthermore, it was revealed that the expression of activated TAK1 induces cardiac hypertrophy and further heart failure (Nature Med., (2000) 6, 556-563).
Recently, it has been revealed that TAK1 is also activated by various stresses such as stimulation of interleukin-1 (IL-1) and tumor necrosis factor (TNF) (J. Biol. Chem. (1997)). 272, 8141-8144; J. Biol. Chem., (1999) 274, 10641-10648), TAK1 activates JNK through the MAPK cascade in the IL-1 signal transduction system, as well as nuclear factor-κB (NF -ΚB) -inducing kinase (NIK), was found to be involved in the activation of NF-κB through the activation of IκB kinases (IKK) (Nature (1999) 398, 252-256; Mol. Cell, (2000) 5, 649-658 ). Further, LPS stimulation activated TAK1, induced NF-κB activation, and revealed that LPS is involved in signal transduction (FEBS Lett., (2000) 467, 160-164).
TGF-β is a multifunctional factor that controls many cell functions, and as one of them, TGF-β is responsible for tissue repair and regeneration associated with various injuries (New Engl. J. Med., (1994) 331). , 1286-1292). However, in the case of chronic injury, abnormal production of TGF-β may disrupt the balance between tissue repair and regeneration, resulting in pathological fibrosis. TGF-β enhances the production of extracellular matrix proteins, inhibits the synthesis of extracellular matrix-degrading enzymes, and induces inhibitors of extracellular matrix-degrading enzymes to produce various organs such as liver and kidney fibers. It has been shown to act as a major causative factor of the disease (New Engl. J. Med., (1994) 331, 1286-1292). Other effects include cell growth inhibitory activity (Cell (1990) 63, 245-247), monocyte migration activity (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1987) 84, 5788-5792), physiology Active substance-inducing activity (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1987) 84, 5788-5792) and β-amyloid protein depositing action (Nature, (1997) 389, 603-606) are known. Liver fibrosis, pulmonary fibrosis, glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal sclerosis, vascular restenosis, keloidosis, scleroderma, scarring after ophthalmic surgery, proliferative retinopathy, autoimmune disease and Alzheimer's disease And the abnormal production of TGF-β have been reported.
Inflammatory cytokines such as IL-1 and TNF play an important role as biological defense factors such as inflammation due to invasion of foreign substances. However, when this reaction is excessively expressed, various pathological conditions are known to be caused. ing. IL-1 is thought to be an important mediator in the immune and inflammatory responses, and acts on various cells to enhance their respective cell functions. As a result, differentiation and proliferation of T and B lymphocytes, production of inflammatory cytokines such as IL-2 and colony stimulating factors, IL-6, IL-8 and TNF, induction of fever, sleep, loss of appetite, and hypotension; Increased hormone secretion from the pituitary gland, destruction of articular cartilage due to increased production of collagenase, induction of a decrease in pain threshold due to increased prostaglandin production, and further destruction of β cells in the islets of Langerhans, proliferation of myeloid leukemia cells, Involvement in various inflammations such as arthritis and enteritis, and various physiological reactions such as formation of atherosclerotic plaque have been clarified. In addition, diseases considered to be caused by overproduction of IL-1 include rheumatoid arthritis, osteoporosis, sepsis, inflammatory bowel disease, insulin-dependent diabetes, arteriosclerosis, psoriasis, asthma, alcoholic hepatitis, and the like. (TIPS, (1988) 9, 171-177; New Engl. J. Med., (1993) 328, 106-113; Blood, (1996) 87, 2095-2147).
In addition, TNFα is released from cells such as macrophages activated by contact with foreign antigens that have invaded the living body, and not only enhances chemotaxis and phagocytic activity of macrophages, but also expresses HLA antigens on T lymphocytes. Enhances the function of T cells through increasing the expression of the IL-2 receptor, and further enhances the chemotaxis and activation of neutrophils to remove foreign substances. In addition, it promotes proliferation of fibroblasts in inflamed areas and repairs the tissue. Furthermore, TNFα enhances the expression of various cytokines in these cells, and is involved in the formation of a cytokine network like IL-1. However, when these reactions are overexpressed, they may act as exacerbating factors, and as diseases in which overproduction of TNFα is known, sepsis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease, ulcerative colitis, Crohn's disease, SLE, Kawasaki disease, etc. have been reported (Japanese clinical practice, (1999) 57, Suppl: 794-797).
Therefore, if a substance that inhibits TAK1 kinase activity or TAK1 activation is found, TGF-β, IL-1, LPS, TNF, etc., for which TAK1 is known to be involved in signal transduction, are known as causative factors. It is thought to lead to the development of drugs for treating and preventing various diseases as well as cardiac hypertrophy and heart failure. However, no TAK1 kinase inhibitor or TAK1 activation inhibitor has been known to date.
By the way, various compounds have been reported as zearalenones, and various actions, for example, suppression of production of cytokines, particularly IL-1 (JP-A-8-40893, European Patent No. 606044A, etc.) ), Tyrosine kinase inhibition (WO96 / 13259), activation of T cells based on MEK1 kinase inhibition and growth inhibition accompanying activation (Biochemistry, 37; 9579-9585, 1998), inhibition of JNK / p38 activation ( Commun., 257; 19-23, 1999), MEK inhibition (J. Antibiotics, 52; 1086-1094, 1999), cytokines after LPS stimulation (IL-1, IL-6, TNF-). α) Production inhibition (Int. J. Im) nopharmacol., 21; 799-814, 1999), LPS, suppression of cytokine (IL-1β, TNF-α) production after IFN-γ stimulation (Cytokine, 8; 751-761, 1996), and the like. I have.
However, it has not been known that zearalenones have an effect of inhibiting TAK1 or TAK1 activation. Further, it is not known at all that zearalenones having a hydroxyl group at both the 8-position and the 9-position have the particularly excellent action.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a TAK1 inhibitor or a TAK1 activation inhibitor.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems. As a result, certain zearalenones have excellent TAK1 kinase inhibitory activity, and TGF-β and IL-1 through activation of TAK1. And the like, and found that the present invention inhibits signal transmission, and completed the present invention based on this finding.
[0006]
That is, the present invention provides a TAK1 inhibitor or a TAK1 activation inhibitor comprising a zearalenone having a hydroxyl group at each of the 8th and 9th positions as an active ingredient.
[0007]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, zearalenones having a hydroxyl group at each of the 8-position and 9-position include zearalenone (Zearalone: the following formula (A)) or zearalenol (Zearalenol: the following formula (B))
[0008]
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And a compound having a hydroxyl group (-OH) at each of the 8-position and the 9-position. These compounds may exist in the form of optical isomers and geometric isomers, both of which are included in the present invention, and mixtures thereof in any ratio.
[0010]
Specific examples of zearalenones having a hydroxyl group at each of the 8-position and the 9-position include compounds as shown below:
[0011]
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These compounds (1) to (13) are compounds known per se and described in the literature (for example, Int. J. Immunopharmacol., 21: 799-814, 1999; J. Org. Chem., 43: 2339-2343). Chem. Pharm. Bull. 41: 373-375, 1993; J. Antibiotics, 52: 1077-1085, 1999; Biochem. Biophys. Res. Commun., 257: 19-23, 1999; Cytokine, 1978; Pharmacol. Commun., 7: 301-308, 1996; Japanese Patent Publication No. 8-40893; European Patent Publication No. 606044A; Biochemistry, 37: 9579-. 9585, 1998).
[0014]
As the zearalenones having a hydroxyl group at both the 8-position and the 9-position, compounds (1) to (13) are preferable, compounds (1) to (3) are more preferable, and compound (1) is particularly preferable.
[0015]
In the present invention, TAK1 inhibition means inhibiting the kinase activity of TAK1. TAK1 inhibitory activity can be measured, for example, by the method described in Example 2 below.
[0016]
TAK1 activation inhibition refers to inhibiting TAK1-mediated intracellular signal transduction. The TAK1 inhibitory activation inhibitory action can be measured, for example, by the method described in Example 3 described later.
[0017]
Various diseases in which TAK1 activation is involved as a cause of the disease include TGF-β, IL-1, LPS, TNF, and the like, which are involved in an intracellular signal transduction system through TAK1 activation. And cardiac hypertrophy, heart failure and the like.
[0018]
The administration route and dosage of the TAK1 kinase inhibitor or TAK1 activation inhibitor of the present invention can be appropriately selected depending on the patient's body type, age, physical condition, type and degree of disease, elapsed time after onset, and the like. In the case of parenteral administration, an effect can generally be expected at a dose of 0.02 μg to 2 mg / kg of body weight / day, and for oral administration, an effect of generally 5 μg to 500 mg / kg of body weight / day.
[0019]
The TAK1 inhibitor or TAK1 activation inhibitor of the present invention may comprise one or more pharmaceutically acceptable diluents, wetting agents, emulsifiers, dispersants, adjuvants, preservatives, buffers, binders, stabilizers. It can be administered as a pharmaceutical composition containing an agent or the like in any appropriate form depending on the intended administration route.
[0020]
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0021]
【Example】
Evaluation of TAK1 Kinase Inhibitory Activity (Example 1) Examination of TAK1 Kinase Inhibitory Activity of Compounds (1) to (3) TAK1 kinase activity was evaluated by measuring TAK1 autophosphorylation and TAB1 phosphorylation. That is, the insect cells Sf-9 were each co-infected with a recombinant baculovirus vector containing the TAK1 and TAB1 genes (WO99 / 21010) and cultured for 3 days. After the culture, the cells were washed with PBS, and the extract was adjusted to 3.0 × 10 7 cells / mL (20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 12.5 mM β-glycerophosphate, 1.5 mM). The cells were suspended in mM MgCl 2 , 2 mM EGTA, 10 mM NaF, 2 mM DTT, 1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM PMSF, 20 μMA Protinin, 0.5% Triton X-100) to prepare a cell extract. To 10 μL of the cell extract, 100 ng of anti-TAK1 antibody M-17 (manufactured by Santa Cruz) and 1 μL of Protein G-Sepharose (manufactured by Amersham Pharmacia) were added, and the mixture was incubated at 4 ° C., and the immunoprecipitate was washed with 20 mM HEPES , PH 7.4, 500 mM NaCl, 10 mM MgCl 2 ), followed by two washes with a kinase solution (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 mM DTT, 5 mM MgCl 2 ) and TAK1 / TAB1 purified product was prepared. The purified TAK1 / TAB1 was resuspended in a kinase solution, added to each well of a Multiscreen plate (manufactured by Millipore) in an amount of 25 μL, and then 1 μL of a test compound dissolved in DMSO was added, followed by incubation at room temperature for 30 minutes. Subsequently, 1 so that per well 0.1μCi [γ- 33 P] -ATP ( Amersham Pharmacia Co. Ltd.) was added a solution (100 mM MOPS, pH 7.2,10 mM MgCl 2, 2μM ATP) to 25 μL each was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes to perform a kinase reaction. A reaction stop solution (PBS containing 50% TCA) was added in 50 μL portions, and the mixture was further incubated at 4 ° C. for 10 minutes to stop the kinase reaction. To remove free 33 P-ATP, the plate was washed five times with PBS containing 0.05% Tween-20, 50 μL of Supermix (manufactured by Wallac) was added, and the plate was further incubated at room temperature for 30 minutes. Thereafter, TAK1 kinase activity was measured by measuring the amount of 33 P-ATP incorporated into TAK1 and TAB1 by micro-beta. As a result, Compounds (1) to (3) suppressed TAK1 kinase activity as shown in Table 1, and particularly, Compound (1) showed a TAK1 kinase inhibitory activity of 8.1 nM as an IC 50 value. However, Radidicol which is a compound having no hydroxyl group at the position corresponding to the 8-position and 9-position of the compounds (1) to (3)
[0022]
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[0023]
, Zearalenone (formula (A)), zearalenol (formula (B))
[0024]
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[0025]
Showed almost no TAK1 kinase inhibitory activity.
[0026]
[Table 1]
[0027]
(Example 2) Investigation of TAK1-mediated signal transduction inhibitory action It is known that activation of TAK1 induces activation of the MAPK cascade and NF-κB. Therefore, the effect of TAK1 kinase activity on TAK1-mediated signal transduction was examined using a reporter assay.
[0028]
First, the effect of compound (1) was examined using p3TP-Lux (Cell, 71, 1003-1014, 1992) having a luciferase gene incorporated downstream of the TGF-β responsive element. After inoculating 1 × 10 6 human fibrosarcoma cell line HT-1080 cells and culturing overnight, a mixture of 2 μg of p3TP-Lux and 10 μL of FuGENE gene transfer reagent (Roche) was added to the cells, and the cells were further cultured for 8 hours. The gene was introduced. The cells into which the gene was introduced were detached with trypsin, and then seeded on a 96-well microplate (Falcon) at 1 × 10 4 cells per well, and further cultured overnight. After washing once with the DMEM medium, 50 μL of the compound (1) diluted with the DMEM medium containing 0.2% fetal bovine serum was added. After incubating at 37 ° C. for 1 hour, 50 μL of TGF-β (Promega) was added thereto at a final concentration of 10 ng / mL, and the cells were further cultured for 24 hours. Luciferase activity was measured using Steady Glo Luciferase Assay Kit (Promega).
[0029]
For the measurement of NF-κB activation, NFkB-Luc (Genes Dev., 7, 1354-1363, 1993) having a luciferase gene incorporated downstream of the responsive element was used to stimulate IL-1 or TAK1. / TAB1 forced expression induced TAK1 activation. That is, 1 × 10 6 293-IL1R cells (Mol. Cell, 5, 649-658, 2000) in which IL-1 receptor was forcibly expressed in human fetal kidney cell line 293 cells were seeded and cultured overnight. A mixture of 2 μg of NFkB-Luc and 10 μL of FuGENE gene transfer reagent (Roche) was added to the cells, and the cells were further cultured for 8 hours to introduce the gene. After the cells into which the gene was introduced were detached with trypsin, the cells were seeded on a 96-well microplate (manufactured by Coating Coaster) at 1 × 10 4 cells per well, and further cultured overnight. After washing once with the DMEM medium, 50 μL of the compound (1) diluted with the DMEM medium containing 0.2% fetal bovine serum was added. After incubation at 37 ° C. for 1 hour, 50 μL of IL-1α (manufactured by PEPRO TECH) was added thereto at a final concentration of 10 ng / mL, and the cells were further cultured for 24 hours. Luciferase activity was measured using Steady Glo Luciferase Assay Kit (Promega). Regarding the activation of NFkB by forced expression of TAK1 / TAB1, along with the introduction of the NFkB-Luc gene, 250 ng each of TAK1, TAB1 expression vector pTAK1-HA and pCOS-FTAB1 was simultaneously added, and the gene was introduced in the same manner as described above. . The cells into which the gene has been introduced are seeded in a 96-well microplate (manufactured by Coating Coaster) in the same manner as described above, cultured overnight, washed once with DMEM medium, and diluted with DMEM medium containing 0.2% fetal bovine serum. Compound (1) was added in an amount of 50 μL each. After culturing at 37 ° C. for 24 hours, luciferase activity was measured.
[0030]
The results are shown in FIG. In FIG. 1, the vertical axis indicates the inhibitory activity (%). The horizontal axis indicates the concentration (M) of the compound (1). The filled squares indicate the inhibitory activity of TGF-β signaling transduction in the p3TP-Lux assay. Closed triangles indicate the inhibitory activity of the IL-1 signaling system in the NFkB-Luc assay. Open triangles indicate the inhibitory activity of the signal transduction system due to forced expression of TAK1 / TAB1 in the NFkB-Luc assay.
[0031]
As shown in FIG. 1, compound (1) suppressed the expression of TGF-β, IL-1α, and luciferase due to forced expression of TAK1 / TAB1 in a dose-dependent manner. This result suggests that inhibition of TAK1 kinase activity can inhibit downstream signal transduction.
[0032]
【The invention's effect】
Since the compound of the present invention has a TAK1 inhibitory action, it inhibits various signal transduction systems through activation of TAK1, and various diseases in which TAK1 activation is involved as a cause of diseases, for example, TGF-β, IL -1, LPS, TNF-α, etc. are expected to be useful as agents for treating and preventing various diseases known as causative factors.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing the inhibitory effect of compound (1) on signal transmission via TAK1.
