WO2008018488A1 - Antibacterial agent - Google Patents

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WO2008018488A1
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Toshiharu Ohba
Mariko Nishimura
Hiromu Ohnogi
Kiyozo Asada
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc.
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Definitions

  • antibacterial agents are used in many fields such as pharmaceuticals, foods or food additives, cosmetics, agricultural chemicals and detergents.
  • Antibacterial substances derived from natural products are expected to be safer for the human body and animals and have less impact on the environment, and antibacterial substances derived from natural products with more effective properties are desired! /
  • Step (2) culturing the culture obtained in Step (1) in a medium containing less than 0.2 mg / L auxins or a medium not containing auxins,
  • the extracted protein is insolubilized, it is possible to add a cationic, anionic, nonionic or amphoteric surfactant, or extract with water / butanol. it can.
  • the extraction solvent include a buffer solution of Example 4 described later.
  • the extraction time is not particularly limited, and examples include 30 minutes to 24 hours.
  • the extraction temperature is not particularly limited, but is exemplified by 4 to 25 ° C, for example.
  • the extract can be processed by filtration, centrifugation, concentration, ultrafiltration, molecular sieving and the like. It is also possible to use two or more of the above extracts. It is also possible to use two or more extracts obtained by different extraction methods from the raw material culture.
  • the candidate sequences of vacitapa-derived defensin were collected from the clustering results of (5). There are 9 9 candidate sequences, which were assembled based on the sequences and 32 types of gene sequences were determined. The sequence of this cDNA is shown in SEQ ID NOs: 27-58. In addition, the amino acid sequences encoded by these sequences are shown in SEQ ID NOs: 1-24. In addition, as a result of searching for signal peptides using the SignallP program, it was estimated that each peptide sequence was assumed to be a signal peptide. These results are shown in Table 1 above.
  • Example 3 Measurement of mRNA amount and peptide amount of defensin from citrus
  • the portion of base numbers 107 to 148 of SEQ ID NO: 41 in the sequence listing is expected to be present specifically in the defensin gene derived from wasabi as compared to the defensin gene sequences derived from other plants.
  • the glycol stock solution of the above clone is made into a saddle shape, and approximately 160 bp by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 73 and 74. The DNA fragment was amplified.

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Abstract

An antibacterial agent comprising a cell and/or a tissue of a plant “Ashitaba” (Angelica keiskei) produced by a specific culture method or a treatment product of the cell and/or the tissue as an active ingredient; a popypeptide having a novel antibacterial activity derived from a plant “Ashitaba”; and a nucleic acid encoding the polypeptide.

Description

明 細 書  Specification
抗菌斉 lj  Antibacterial lj
技術分野  Technical field
[0001] 本発明は、特定の培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織、もしく はそれらの処理物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤あるいはァシタ バ由来の新規な抗菌作用を有するポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする 核酸に関する。  [0001] The present invention relates to an antibacterial agent or a novel antibacterial derived from ashtaba, which contains, as an active ingredient, cells and / or tissues of ashitapa obtained by a specific culture method or a processed product thereof. The present invention relates to a polypeptide having an action, and a nucleic acid encoding the polypeptide.
背景技術  Background art
[0002] 医薬、食品又は食品添加物、化粧料、農薬、洗剤等の多くの分野で、種々の抗菌 剤が使用されている。天然物由来の抗菌物質は人体や動物に対してより安全で、ま た環境に負担の少ない抗菌剤として期待されており、より有効な性質をもつ天然物由 来の抗菌物質が望まれて!/、る。  [0002] Various antibacterial agents are used in many fields such as pharmaceuticals, foods or food additives, cosmetics, agricultural chemicals and detergents. Antibacterial substances derived from natural products are expected to be safer for the human body and animals and have less impact on the environment, and antibacterial substances derived from natural products with more effective properties are desired! /
[0003] ァシタパに豊富に含まれる 2種類の主要なカルコン類化合物（キサントアンゲロール と 4 ハイドロキシデリシン）は、枯草菌、セレウス菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球 菌、ルテウス菌に対する抗菌活性を有する事が知られている。 （例えば、非特許文献 D o  [0003] Two major chalcone compounds (xanthangelol and 4-hydroxyderricin) that are abundant in assipaca have antibacterial activity against Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, and Luteus It is known to have (For example, non-patent literature Do
[0004] 一方、抗菌タンパク質であるディフェンシンは、多数の生物種に存在しており、 α型  [0004] On the other hand, defensin, an antibacterial protein, exists in many biological species and is in α-type.
(ヒト）、 /3型 (ヒト）、 Θ型（サル）、サぺシン Α型（昆虫）、植物型などに分類される。特 に植物体においてはアブラナ科の植物由来のものについて、遺伝子の核酸配列が 決定され、その機能についての研究がなされている（例えば、非特許文献 2)。しかし 、これまでにァシタパでディフェンシンが生産されて!/、ることを報告した例はな!/、。  (Human), / 3 type (Human), Θ type (Monkey), Sapesin type (Insect), Plant type, etc. Particularly in plants, the nucleic acid sequences of genes have been determined for those derived from Brassicaceae plants, and their functions have been studied (for example, Non-Patent Document 2). However, no defensin has ever been produced in Ashitapa! /
[0005] 非特許文献 l : Foods & Food Ingredients Journal of Japan, No. 178, p. 52 - 60, 1998  [0005] Non-Patent Literature l: Foods & Food Ingredients Journal of Japan, No. 178, p. 52-60, 1998
非特許文献 2 :ィ匕学と生物、 Vol. 43、 No. 4、 p. 229— 234、 2005  Non-Patent Document 2: Science and Biology, Vol. 43, No. 4, p. 229—234, 2005
発明の開示  Disclosure of the invention
発明が解決しょうとする課題  Problems to be solved by the invention
[0006] 本発明は、生態系や環境に影響が少なく低コストで実用が可能な、植物の細胞及 び/又は組織培養物を用いる、抗菌剤を提供することを目的とする。また本発明は、 新規な抗菌作用をもつ蛋白質であるァシタパ由来のディフェンシンおよび該デイフェ ンシンをコードする核酸を提供することを目的とする。 [0006] The present invention relates to plant cells and plants that are less affected by ecosystems and the environment and can be used at low cost. It is an object to provide an antibacterial agent using a tissue culture. Another object of the present invention is to provide a defensin derived from ashitapa, which is a protein having a novel antibacterial action, and a nucleic acid encoding the defensin.
課題を解決するための手段  Means for solving the problem
[0007] 本発明者らは、先に、ァシタパの細胞及び/又は組織培養物の培養条件について 鋭意検討したところ、最初の工程において、植物成長調節物質を含有する培地で培 養することにより、ァシタパの初期培養物（カルス）を得ることができ、さらに次の工程 において、その培養物を特定の条件下で培養することにより、カルコン類化合物を高 効率で生産できることを見出した（特開 2007— 37535)。本発明者等はさらに検討し た結果、当該方法により、期待される抗菌活性を大きく上回る抗菌活性を有するァシ タパの培養物を得ることができることを見出した。さらに本発明者等は上記のァシタパ の培養物におレ、て高効率で発現してレ、る、新規ァシタバ由来ディフェンシンおよび それをコードする核酸を見出し、本発明を完成させた。  [0007] The inventors of the present invention have previously intensively studied the culture conditions of the cells and / or tissue cultures of assipaca, and in the first step, by culturing in a medium containing a plant growth regulator, It was found that an initial culture (callus) of assipaca can be obtained, and further, in the next step, the chalcone compound can be produced with high efficiency by culturing the culture under specific conditions (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-2007). — 37535). As a result of further studies, the present inventors have found that a culture of cistapa having antibacterial activity far exceeding the expected antibacterial activity can be obtained by this method. Furthermore, the present inventors have found a novel defensin derived from citrus and a nucleic acid encoding the same that has been expressed in the above-mentioned assipaca culture with high efficiency, and completed the present invention.
[0008] すなわち、本発明は、  That is, the present invention provides:
[1]工程（1) :植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程 [1] Step (1): A step of culturing assiapia tissue in a medium containing a plant growth regulator
、及び ,as well as
工程（2)：工程（1)で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する 培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、  Step (2): culturing the culture obtained in Step (1) in a medium containing less than 0.2 mg / L auxins or a medium not containing auxins,
を含む培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織、もしくはそれらの処 理物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤；  An antibacterial agent comprising, as an active ingredient, cells and / or tissues of ashitapa obtained by a culture method comprising:
[2]工程（ 1 )：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程 、及び  [2] Step (1): culturing assiitapa tissue in a medium containing a plant growth regulator, and
工程（2)：工程（1)で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する 培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、  Step (2): culturing the culture obtained in Step (1) in a medium containing less than 0.2 mg / L auxins or a medium not containing auxins,
を含む培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織の処理物；  A treated product of assipaca cells and / or tissues obtained by a culture method comprising:
[3]工程（ 1 )：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程 [3] Step (1): A step of cultivating the tissue of assiapia in a medium containing a plant growth regulator
、及び ,as well as
工程（2)：工程（1)で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する 培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、 を包含することを特徴とするァシタパ由来のディフェンシンの製造方法； Step (2): The culture obtained in step (1) contains less than 0.2 mg / L auxins. A step of culturing in a medium or a medium not containing auxins,
[4]下記（a)または (b)から選択されるポリペプチド、  [4] a polypeptide selected from the following (a) or (b),
(a)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the Sequence Listing,
(b)前記（a)のポリペプチドのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸残基の 置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列を有するポリぺ プチドであって、前記（a)のポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリぺプチ ド、； (b) a polypeptide having an amino acid sequence having at least one of substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of the polypeptide of (a), A polypeptide having a function equivalent to that of the polypeptide (a);
[5] [4]のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤；  [5] An antibacterial agent containing the polypeptide of [4] as an active ingredient;
[6]下記 (c)〜（g)から選択される核酸、 [6] A nucleic acid selected from the following (c) to (g),
(c)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ードする核酸、  (c) a nucleic acid that encodes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing;
(d)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列において 1もしくは数個の アミノ酸残基の置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列 を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配 列を有するポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸、 (d) a polypeptide having an amino acid sequence having at least one of substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing A nucleic acid encoding a polypeptide having a function equivalent to a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the Sequence Listing,
(e)配列表の配列番号 27〜60から選択される核酸、 (e) a nucleic acid selected from SEQ ID NOs: 27-60 in the sequence listing,
(f)前記（e)の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸であって、当 該核酸によってコードされるポリペプチド力 前記（e)の核酸によってコードされるポリ ペプチドと同等な機能を有する核酸、  (f) a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid of (e) above under stringent conditions, and has the same ability as a polypeptide encoded by the nucleic acid of (e). Having nucleic acid,
(g)前記（e)の核酸の塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基の置換、欠失、揷 入、もしくは付加の少なくとも 1つを有する塩基配列を有する核酸であって、当該核酸 によってコードされるポリペプチド力 前記（e)の核酸によってコードされるポリぺプチ ドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸、  (g) a nucleic acid having a base sequence having at least one of substitution, deletion, insertion, or addition of one or several bases in the base sequence of the nucleic acid of (e), The ability of the encoded polypeptide, a nucleic acid encoding a polypeptide having a function equivalent to the polypeptide encoded by the nucleic acid of (e) above,
に関する。 About.
発明の効果 The invention's effect
本発明により、特定の培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織培 養物、もしくはそれらの処理物を有効成分として含有する抗菌剤が得られる。これに より安価で安全な抗菌剤を提供する事ができる。また本発明により、抗菌作用を有す る新規な蛋白質であるァシタバ由来のディフェンシンおよび該ディフェンシンをコード する核酸が提供される。該ディフェンシンおよび該ディフェンシンをコードする核酸は 該ディフェンシンを高含有する抗菌剤の製造に非常に有用である。 According to the present invention, an antibacterial agent containing ascitapa cells and / or tissue culture obtained by a specific culture method or a processed product thereof as an active ingredient can be obtained. to this A cheaper and safer antibacterial agent can be provided. The present invention also provides a defensin derived from Acitaba, which is a novel protein having antibacterial action, and a nucleic acid encoding the defensin. The defensin and the nucleic acid encoding the defensin are very useful for the production of an antibacterial agent having a high content of the defensin.
図面の簡単な説明  Brief Description of Drawings
[0010] [図 1]ァシタパの組織培養物の 、アブラナ科黒スス病菌に対する抗菌活性を示す図 である。  FIG. 1 is a graph showing antibacterial activity of a tissue culture of assipaca against cruciferous black soot fungus.
[図 2]ァシタパの組織培養物の 、イネいもち病菌に対する抗菌活性を示す図である。  FIG. 2 is a graph showing antibacterial activity of ashitapa tissue culture against rice blast fungus.
[図 3]ァシタパの組織培養物の、エンドゥ褐班病菌に対する抗菌活性を示す図である  FIG. 3 is a diagram showing the antibacterial activity of tissue cultures of assipaca against Endo brown spot fungus
[図 4]ァシタパの組織培養物の 、トマト萎ちよう病菌に対する抗菌活性を示す図である FIG. 4 is a diagram showing antibacterial activity of tomato wilt fungus in a tissue culture of ashitapa
[図 5]ァシタバ由来のディフェンヘンン遺伝子に対するリアルタイム PCRの結果を示す 図である。 FIG. 5 is a diagram showing the results of real-time PCR on a defenhen gene derived from citrus.
[図 6]ァシタバディフェンシンの保存安定性を示す図である。  FIG. 6 is a graph showing the storage stability of assitabafenfensin.
[図 7]ァシタバディフェンシンのプロテアーゼ耐性を示す図である。  FIG. 7 is a graph showing protease resistance of vacitabadifensins.
[図 8]各種植物由来ディフェンシンポリペプチドのマルチシークェンスを示す図である 発明を実施するための最良の形態  FIG. 8 is a diagram showing multi-sequences of various plant-derived defensin polypeptides. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0011] 以下に、本発明について詳細に説明する。 [0011] The present invention is described in detail below.
[0012] ァシタパの細胞及び/又は組織培養物、もしくはそれらの処理物を有効成分として 含有する抗菌剤を製造するために用いるァシタパの細胞及び/又は組織の培養方 法は、特開 2007— 37535に記載の方法と同様の方法を用いる事ができる。以下に 詳細に説明する。なお本願明細書において、細胞及び/又は組織の培養物を単に 培養物と称することがある。  [0012] A method for cultivating cells and / or tissues of assipaca used for producing an antibacterial agent containing assipaca cells and / or tissue culture, or a processed product thereof as an active ingredient is disclosed in JP 2007-37535 A method similar to the method described in 1) can be used. This will be explained in detail below. In the present specification, a culture of cells and / or tissues may be simply referred to as a culture.
[0013] 工程（1)：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程 工程（1)で培養される培養物としては、ァシタパの組織切片を植物成長調節物質 を含有する培地で培養することにより誘導される初期培養物であるカルス、当該力ノレ スを植物成長調節物質を含有する培地でさらに培養することにより得られる、増殖さ れた培養細胞及び/又は組織、ァシタパの組織から分化した培養組織を植物成長 調節物質を含有する培地で直接培養したもののいずれもが包含される。 [0013] Step (1): Step of culturing assipaca tissue in a medium containing a plant growth regulator substance As a culture cultured in step (1), a tissue slice of assipaca is a medium containing a plant growth regulator substance. Callus, an initial culture induced by culturing in The cultured cells and / or tissues obtained by further culturing the plant in a medium containing a plant growth regulator, and the cultured tissue differentiated from the tissue of assipaca are directly cultured in a medium containing the plant growth regulator. Any of the above are included.
[0014] ここで使用されるァシタパの組織はいずれの部位由来でもよぐ特に限定はないが 、例えば根、茎、葉柄、葉又はこれらの混合物を使用することができ、カルスの誘導 率を向上させる観点から、好適には、茎、葉柄、又はこれらの混合物を使用すること ができる。 [0014] The tissue of ashipaca used here may be derived from any part, but there is no particular limitation, but for example, roots, stems, petiole, leaves or a mixture thereof can be used, and the callus induction rate is improved. From the point of view, it is preferable to use a stem, a petiole, or a mixture thereof.
[0015] 培養に使用するァシタパの組織は、通常は殺菌処理を施してから使用される。例え ば、ァシタパの組織切片を 70%アルコールで消毒した後、次亜塩素酸ナトリウム溶 液などで殺菌処理する。その後、無菌水で洗浄して、植物成長調節物質を含有する 植物組織培養用の固形培地等に置床して、一定温度で培養することでカルス誘導 が可能となる。  [0015] The tissue of assiapia used for culture is usually used after sterilization. For example, a tissue section of ashitapa is sterilized with 70% alcohol and then sterilized with sodium hypochlorite solution. Thereafter, it is washed with sterile water, placed on a solid medium for plant tissue culture containing a plant growth regulator, and cultured at a constant temperature, thereby inducing callus.
[0016] 植物成長調節物質としては、細胞***や細胞伸長、分化に関与するものであれば 特に限定はないが、例えば、オーキシン類やサイトカイニン類が例示され、特にォー キシン類を必須成分として培地中に含有させることが好ましい。オーキシン類としては 、例えば、 2, 4 ジクロロフエノキシ酢酸（2, 4— D)、インドール酢酸（IAA)、インド ール酪酸（IBA)、ナフタレン酢酸（NAA)、 2—ナフトキシ酢酸（NOA)等が例示され 、早期にカルスを誘導する観点から、好適には 2, 4— Dが使用される。また、サイト力 ィニン類を使用する場合は、力イネチン、 6—ベンジルァミノプリン (BA)、ゼァチン、 イソペンテュルアデニン、 4—ベンジルァミノべンゾイミダゾーノレ、 N, N，一ジフエ二ノレ 尿素系（例えば、 N—（2 クロロー 4 ピリジル） N' フエニル尿素等）等が例示さ れ、カルスの誘導率を向上させる観点から、好適には力イネチン、 BA、ゼァチンが使 用される。上記のオーキシン類やサイトカイニン類は、単独で又は 2種以上を混合し て用いることができる。  [0016] The plant growth regulator is not particularly limited as long as it is involved in cell division, cell elongation, and differentiation. For example, auxins and cytokinins are exemplified. In particular, auxins are essential components. It is preferable to make it contain in a culture medium. Examples of auxins include 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2, 4-D), indole acetic acid (IAA), indobutyric acid (IBA), naphthalene acetic acid (NAA), 2-naphthoxyacetic acid (NOA) From the viewpoint of inducing callus at an early stage, 2, 4-D is preferably used. In addition, when using cytosine derivatives, force rice, 6-benzylaminopurine (BA), zeatin, isopenturadenine, 4-benzylaminobenzoimidazole, N, N, dipheninore Urea (for example, N- (2 chloro-4-pyridyl) N ′ phenylurea etc.) and the like are exemplified, and from the viewpoint of improving the callus induction rate, force rice, BA, and zeatin are preferably used. The above auxins and cytokinins can be used alone or in admixture of two or more.
[0017] 培地中の植物成長調節物質の総含有量としては、特に限定はないが、カルスの誘 導串を向上させる観^ r、力、ら、 0. 001〜； 100mg/Lカ好まし <、 0. 005〜50mg/L 力 り好ましぐ 0. 01〜； 10mg/Lがさらに好ましい。例えば、オーキシン類を培地に 含有させる場合は、培地中のオーキシン類の含有量としては、好適には 0. 2〜； 10m g/L、より好適には 0. 2〜5mg/L、さらに好適には 0. 5〜2mg/Lが例示される。 また、サイトカイニン類を培地に含有させる場合は、培地中のサイトカイニン類の含有 量としては、好適には 0. 001〜； lmg/L、より好適には 0. 005—0. 5mg/L、さら に好適には 0. 01-0. 2mg/Lが例示される。これらの含有量については各種植物 成長調節物質の発揮する植物成長調節活性に応じて、適宜設定することができ、活 性の強い植物成長調節物質を含有させる場合は、含有量を減少させればよい。また 、オーキシン類とサイトカイニン類の!/、ずれをも培地に含有させる場合のそれぞれの 培地中の含有量は、例えば 2, 4— Dと力イネチンを使用する場合、それぞれ 0· 5〜 lmg/L, 0. 001~0. lmg/L力 適である。 [0017] The total content of the plant growth regulator in the medium is not particularly limited, but it is preferable to improve the callus induction skewer, strength, et al., 0.001 to 100 mg / L. <, 0.005 to 50 mg / L force, preferably 0.01 to 10 mg / L is more preferable. For example, when auxins are contained in the medium, the content of auxins in the medium is preferably 0.2 to 10 m Examples thereof include g / L, more preferably 0.2 to 5 mg / L, and still more preferably 0.5 to 2 mg / L. When cytokinins are contained in the medium, the content of cytokinins in the medium is preferably 0.001 to lmg / L, more preferably 0.005 to 0.5 mg / L. Preferably, 0.01 to 0.2 mg / L is exemplified. These contents can be set as appropriate according to the plant growth regulating activity exhibited by various plant growth regulators. When a highly active plant growth regulator is contained, the content can be reduced. Good. In addition, the contents in each medium when auxins and cytokinins are included in the medium are, for example, 2, 4—D and when using force rice, each 0.5 · lmg / l L, 0. 001 to 0. lmg / L force Suitable.
[0018] 培養に使用される基本培地としては、 MS (ムラシゲ&スターグ)培地や B5培地、ホ ワイト培地、 Nitsch&Nitsch培地、 SH培地、 LS培地、ヘラー培地の他、その他植 物組織培養に用いられる公知の基本培地を用いることができる。  [0018] The basic medium used for the culture is MS (Murashige & Stag) medium, B5 medium, white medium, Nitsch & Nitsch medium, SH medium, LS medium, Hella medium, and other plant tissue cultures. A known basic medium can be used.
[0019] さらに、カルスの誘導率や増殖率を向上させる観点から、培地は上記の基本培地 の組成以外にもショ糖、グルコース等の糖類を含有することが好ましい。培地中の糖 類の含有量としては、特に限定はないが、例えば 1〜； 100g/L、好適には 5〜70g /L、より好適には 10〜40g/Lである。  [0019] Further, from the viewpoint of improving the callus induction rate and growth rate, the medium preferably contains saccharides such as sucrose and glucose in addition to the composition of the basic medium. The content of sugars in the medium is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100 g / L, preferably 5 to 70 g / L, and more preferably 10 to 40 g / L.
[0020] また、培地の形態としては、液状、固形状のいずれでもよぐ固形状の培地を使用 する場合、固形剤としては寒天やゲランガム等が使用され、特に限定はないが、恒温 室にて静置培養により実施できる。液状培地を用いる場合は、回転振とう培養や振と う培養を行なうことが好ましレ、。  [0020] In addition, as a form of the medium, when using a solid medium that may be either liquid or solid, agar, gellan gum, or the like is used as the solid agent, and there is no particular limitation, but it is not limited to a constant temperature chamber. Can be performed by static culture. When using a liquid medium, it is preferable to carry out rotary shaking culture or shaking culture.
[0021] 誘導したカルスをさらに培養することにより培養物を得る場合は、一定期間で植継 ぎ増殖させること力 Sできる。増殖用の培地はカルスを誘導した培地と同じ組成でもよく 、また植物成長調節物質の種類を変更することもできる。変更する場合は、ォーキシ ン類に関しては、 2, 4— Dの培地中の含有量を 1とした場合、 IAAと IBAはそれぞれ 1から 10倍量の含有量に、 NAAは 1から 5倍量の含有量になるように変更することが 望ましい。  [0021] In the case of obtaining a culture by further culturing the induced callus, it is possible to inoculate and proliferate for a certain period of time. The growth medium may have the same composition as the callus-inducing medium, and the type of plant growth regulator can be changed. When changing the content of auxins, if the content in 2, 4-D medium is 1, IAA and IBA are 1 to 10 times the content, NAA is 1 to 5 times the amount. It is desirable to change so that the content of
[0022] 培養温度は、植物が低温で氷結しな!/、、高温で乾燥しな!/、、又は熱で枯死しな!/、 ような温度範囲であれば特に限定はないが、例えば 22°Cから 28°Cが適しており、特 に工程（1)の開始後早期にカルス誘導する場合には 25°Cから 28°Cが適している。ま た、安定して増殖させる場合には 22°Cから 25°Cが適して!/、る。 [0022] The culture temperature is not particularly limited as long as the temperature range is such that the plant does not freeze at a low temperature! /, Does not dry at a high temperature! /, Or does not die with heat! / 22 ° C to 28 ° C is suitable. In the case of inducing callus early after the start of process (1), 25 ° C to 28 ° C is suitable. For stable growth, 22 ° C to 25 ° C is suitable!
[0023] 培養日数については、特に限定はなぐ例えばカルスを誘導する場合には最低で も約 10日間培養することが好ましぐ好適には 10〜； 100日間、より好適には 10〜70 日間の培養が実施される。なお、長期間培養する場合は、培地の交換や新たな培地 への継代などを適宜実施することができる。  [0023] The number of days of culture is not particularly limited. For example, when inducing callus, it is preferable to culture for at least about 10 days, preferably 10 to; 100 days, more preferably 10 to 70 days. Is cultured. In addition, when culturing for a long period of time, replacement of a medium, passage to a new medium, and the like can be appropriately performed.
[0024] 培養は、明所でも喑所でも!/、ずれで行ってもよ!/、が、一般的なカルス誘導を行なう 場合は喑所で行なわれる。なお、本明細書において喑所とは、通常、植物組織培養 で用いられる喑所条件と同義であり、完全喑所である必要はない。すなわち、観察等 において通常の光条件に一時的に曝すことがあったとしても喑所とする。喑所条件の 作り方としては、特に限定はないが、暗室にて培養室の明力、りを点灯しない方法や培 養物の入った容器を遮光性の容器に封入する力、、もしくは容器をアルミホイル等によ り包む方法等が例示される。  [0024] Cultivation may be performed in a bright place or in a certain place! /, Or may be performed in a shifted position! /, But in the case of general callus induction, it is carried out in a certain place. In the present specification, the “spot” is usually synonymous with the “spot condition” used in plant tissue culture and does not need to be a complete spot. In other words, even if it is temporarily exposed to normal light conditions during observation, etc., it will be a place. There are no particular limitations on how to create the conditions, but the lightness of the culture room in the darkroom, the method of not lighting the light, the ability to seal the container containing the culture in a light-shielding container, or the container Examples include a method of wrapping with aluminum foil or the like.
[0025] 工程（2)：工程（1)で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する 培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程  [0025] Step (2): A step of culturing the culture obtained in step (1) in a medium containing less than 0.2 mg / L auxins or a medium not containing auxins.
後述の実施例 3に記載のとおり、上記工程（1)で得られた培養物中には、ディフエ ンシンの含有量は少なぐディフェンシンを高含有するァシタパの細胞及び/又は組 織培養物を得るためには、当該工程（2)の培養が必須となる。即ち、ディフェンシン を高含有するァシタパの細胞及び/又は組織培養物を得るためには、工程（1)で得 られた培養物を、オーキシン類を含有しないか、あるいは、含有量が 0. 2mg/L未 満である培地で培養すればよい。以降、本発明において、当該工程（2)を経て得ら れる培養物を単に本発明により得られるディフェンシンを高含有する培養物と称する ことがある。なお、ここで高含有とは、工程（1)で得られる培養物中のディフェンシン 量よりも工程（2)で得られる培養物中のディフェンシン量が多いことを示し、好適には 2倍以上、より好適には 5倍以上であることを示す。ここで培養物中のディフェンシン 量としては、培養物中のディフェンシンの量、もしくはディフェンシン遺伝子の発現量 のレヽずれかを指標とすることができる。  As described in Example 3 to be described later, in the culture obtained in the above step (1), there is obtained a cistapa cell and / or tissue culture containing a small amount of defensin and a high content of defensin. For this purpose, the culture in the step (2) is essential. That is, in order to obtain a cell and / or tissue culture of acitapa containing a high content of defensin, the culture obtained in step (1) does not contain auxins or has a content of 0.2 mg / It can be cultured in a medium that is less than L. Hereinafter, in the present invention, the culture obtained through the step (2) may be simply referred to as a culture containing high defensin obtained by the present invention. Here, high content means that the amount of defensin in the culture obtained in step (2) is larger than the amount of defensin in the culture obtained in step (1), preferably more than twice. More preferably, it is 5 times or more. Here, the amount of defensin in the culture can be used as an indicator whether the amount of defensin in the culture or the expression level of the defensin gene is within the range.
[0026] 本発明により得られるディフェンシンを高含有する培養物とは、工程（1)で得られた 培養物を、 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する培地もしくはオーキシン類を 含有しない培地で培養することにより得られるディフェンシン含有培養物や、当該デ ィフェンシン含有培養物をさらに 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する培地も しくはオーキシン類を含有しない培地で増殖させることにより得られる培養物のいず れもが包含される。また、ディフェンシンを高含有するという特徴を有する限り、継代し て系統化することもできる。 [0026] The culture containing a high content of defensin obtained by the present invention was obtained in step (1). A defensin-containing culture obtained by culturing the culture in a medium containing less than 0.2 mg / L auxins or a medium not containing auxins, or a defensin-containing culture further 0.2 mg / L Any medium containing less than auxins or cultures obtained by growing on media containing no auxins are included. In addition, as long as it has a characteristic of high content of defensin, it can be passaged and systematized.
[0027] 工程（1)で得られた培養物を、オーキシン類を含有しない、あるいは、含有量が 0.  [0027] The culture obtained in the step (1) does not contain auxins or has a content of 0.
2mg/L未満である培地で数日間培養することで、ディフェンシンを高含有するァシ タパの細胞及び/又は組織培養物を取得することができる。培地中のオーキシン類 含有量としては、培養物中のディフェンシン含有量を高める観点から、 0. lmg/L未 満、あるいはオーキシン類を含有しないことが好ましいが、培地に含有されるォーキ シン類の種類に依存するオーキシン活性により、培地中のオーキシン類含有量は 0. 2mg/L未満の範囲内で適宜調整することができる。なお、オーキシン類の種類とし ては、前述の工程（1)で例示するオーキシン類が挙げられる。  By culturing for several days in a medium of less than 2 mg / L, it is possible to obtain a cistapa cell and / or tissue culture containing a high amount of defensin. The content of auxins in the medium is preferably less than 0.1 mg / L or free of auxins from the viewpoint of increasing the defensin content in the culture. Depending on the type of auxin activity, the auxin content in the medium can be adjusted as appropriate within a range of less than 0.2 mg / L. Examples of auxins include the auxins exemplified in the above step (1).
[0028] また、工程（2)においては、オーキシン類以外の植物成長調節物質は、培地中に 含有されない方が好ましい。すなわち、当該工程で使用される培地としては、 MS培 地等の前述する基本培地そのものや、これらの基本培地にショ糖やグルコース等の 糖類を添加したもの、又は植物成長調節物質以外の成分を添加したものが例示され  [0028] In the step (2), it is preferable that plant growth regulators other than auxins are not contained in the medium. That is, as the medium used in the step, the basic medium itself as described above such as MS medium, those obtained by adding sugars such as sucrose and glucose to these basic medium, or components other than plant growth regulators are used. The ones added are illustrated
[0029] ディフェンシンを高発現する培養物は、培地の交換ゃ植継ぎ培養をすることでさら に増殖することができる。ここで使用される培地は上記と同じでも力、まわないし、 0. 2 mg/L未満のオーキシン類含有量の範囲内であれば、オーキシン類の種類を変更 してもよい。また、工程（2)の培養当初からオーキシン類を含有しない培地を使用す る場合は、植え継ぎや培地交換の際にもオーキシン類は含有しない方が良い。工程 (2)の培養期間としては、特に限定はないが、例えば、好適には 15日間以上、より好 適には 20〜250日間、さらに好適には 80〜； 120日間が例示される。その他、培養中 の光条件、基本培地や培養温度、培養時間、培地の形態等については、前述のェ 程（1)と同様に行なうことができる。 [0030] 本発明により、上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物、もし くはその処理物を有効成分とする抗菌剤が提供される。なお、上記の方法により取得 したディフェンシンを高含有する培養物中には、カルコン類化合物も高含有されてい る場合が多い。背景技術に記載の通り、カルコン類化合物は抗菌作用を有すること が知られている。し力、しながら、実施例 1および 4にて試験された、上記の方法により 得られる培養物の抗菌作用は、培養物中のカルコン類化合物に依存するものではな ぐァシタパ由来の新規なタンパク質であるディフェンシンの高発現に依存するもの である。つまり、上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物は、培 養物中に含まれるカルコン類化合物による抗菌作用からは明らかに予想できない程 度の高い抗菌作用を有するものである。また、ァシタパ由来のカルコン類の、真菌類 に対する抗菌作用はこれまで報告されておらず、本発明により初めて、ァシタパ由来 成分による真菌類に対する抗菌作用が示される。 [0029] A culture that highly expresses defensin can be further proliferated by exchanging the medium and performing subculture. The medium used here may be the same as described above, and the type of auxin may be changed as long as it is within the range of auxin content of less than 0.2 mg / L. In addition, when using a medium that does not contain auxins from the beginning of the culture in step (2), it is better not to contain auxins even during planting or medium exchange. The culture period in step (2) is not particularly limited, and examples thereof include preferably 15 days or more, more preferably 20 to 250 days, and further preferably 80 to 120 days. In addition, the light conditions during culture, the basic medium, the culture temperature, the culture time, the form of the medium, and the like can be performed in the same manner as in the above step (1). [0030] According to the present invention, a culture containing a high content of defensin obtained by the above method or an antibacterial agent containing the treated product as an active ingredient is provided. In addition, cultures containing a high amount of defensin obtained by the above method often contain a high amount of chalcone compounds. As described in the background art, chalcone compounds are known to have antibacterial action. However, the antibacterial action of the culture obtained by the above method tested in Examples 1 and 4 is not dependent on the chalcone compounds in the culture. It depends on the high expression of defensin. In other words, a culture containing a high amount of defensin obtained by the above method has a high antibacterial effect that is clearly unpredictable from the antibacterial effect of the chalcone compounds contained in the culture. In addition, the antibacterial action against fungi of chalcones derived from assipaca has not been reported so far, and for the first time by the present invention, the antibacterial action against fungi due to assipaca-derived components is shown.
[0031] 本発明において、上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物、 もしくはその処理物を有効成分とする抗菌剤の組成や形状、有効成分の含有量とし ては、特に限定はなぐ当該抗菌剤の用途によって適宜設定される。  [0031] In the present invention, the composition and shape of an antibacterial agent containing a defensin-rich culture obtained by the above method or a treated product thereof as an active ingredient, and the content of the active ingredient are not particularly limited. It is appropriately set depending on the use of the antibacterial agent.
[0032] 本願明細書において処理物（以下、本発明の処理物と称することがある）としては、 原料である上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物に対し何ら かの加工を施したものであって抗菌作用を有するものであれば特に限定はないが、 例えば抽出物、粉砕物、乾燥物、超音波処理物、搾汁液、破砕物、化学処理物、酵 素処理物が例示され、特に好適には抽出物、粉砕物および乾燥物が例示される。な お、本発明の処理物としては、特に好適には、ディフェンシンが高含有された処理物 を好適に使用することができ、当該処理物の抗菌作用としては、後述の実施例 1もし くは 4に記載された方法と同様の方法で確認することができる。なお、本発明の別の 態様としては、前記の本発明の処理物も提供するものである。  [0032] In the present specification, as a treated product (hereinafter sometimes referred to as a treated product of the present invention), a culture containing a high content of defensin obtained by the above method as a raw material is subjected to some processing. There is no particular limitation as long as it has an antibacterial action, but examples include extracts, pulverized products, dried products, sonicated products, squeezed liquids, crushed products, chemically processed products, and processed enzyme products. Particularly preferred are extracts, pulverized products and dried products. The treated product of the present invention is particularly preferably a treated product containing a high amount of defensin, and the antibacterial action of the treated product is described in Example 1 described later. It can be confirmed by the same method as described in 4. As another aspect of the present invention, the processed product of the present invention is also provided.
[0033] 本発明において、抽出物とは原料培養物に対し抽出溶媒を用いて抽出操作を行う 工程を経て得られる物質のことをいう。抽出条件は、得られる抽出物中にァシタパ由 来のディフェンシンが高含有された抽出物であれば特に限定はなぐ公知の抽出方 法により以下のように行うことができる。例えば原料をそのまま、あるいは粉砕、乾燥 及び/又は細断した後、溶媒を用いてバッチ式もしくは連続式で抽出を行うことがで きる。抽出物を得る際の抽出溶媒としては、特に限定はないが、例えば、水、リン酸緩 衝液、 Tris緩衝液、あるいは Hepes緩衝液、グリセロール、グリコール類（エチレング リコーノレ、プロピレングリコール等）、アルコール類（エタノール、メタノーノレ、イソプロピ ルアルコール等）、ケトン類（アセトン、メチルェチルケトン等）、もしくは親水性の溶媒 を挙げること力 Sでき、所望により単独で、もしくは適宜混合液として用いること力 Sできる 。これらの溶媒には、必要に応じて KC1あるいは NaCl等の無機塩を含有させることが できる。また溶媒の pHは抽出の効率を高める目的で適宜調整すればよい。また抽出 されるタンパク質の安定性を増す目的で、必要に応じて 2価イオンあるいは EDTAな どのキレート剤、グリセロール、ショ糖等を添加してもよい。またプロテアーゼによる分 解を防ぐ目的で、 PMSF等のプロテアーゼ阻害剤を加えてもよい。また抽出するタン ノ ク質が不溶化する場合は、陽イオン性 ·陰イオン性 ·非イオン性あるいは両性の界 面活性剤を添加する、あるいは水/ブタノールで抽出を行う等の手段を用いる事が できる。抽出溶媒としては、例えば、後述の実施例 4の緩衝液等が例示される。抽出 時間については、特に限定はないが、例えば 30分〜 24時間が例示される。抽出温 度についても、特に限定はないが、例えば 4〜25°Cが例示される。抽出物は必要に 応じ、ろ過、遠心分離、濃縮、限外ろ過、分子ふるい等の処理を行うことができる。ま た、以上の抽出物を 2種以上含有させて使用することもできる。また、原料培養物から 異なった抽出法で得られた抽出物を 2種以上含有させて使用することもできる。 [0033] In the present invention, an extract refers to a substance obtained through a step of performing an extraction operation on a raw material culture using an extraction solvent. Extraction conditions can be performed as follows by a known extraction method without particular limitation as long as the extract is an extract containing a high amount of defensin derived from ashtapa. For example, raw materials are left as they are, or pulverized and dried And / or after chopping, the extraction can be carried out batchwise or continuously using a solvent. The extraction solvent for obtaining the extract is not particularly limited. For example, water, phosphate buffer solution, Tris buffer solution or Hepes buffer solution, glycerol, glycols (ethylene glycolone, propylene glycol, etc.), alcohols, etc. (Ethanol, methanol, isopropyl alcohol, etc.), ketones (acetone, methyl ethyl ketone, etc.), or hydrophilic solvents can be listed, and can be used alone or as appropriate as a mixed solution as desired. . These solvents can contain inorganic salts such as KC1 or NaCl as required. The pH of the solvent may be adjusted as appropriate for the purpose of increasing the extraction efficiency. In addition, for the purpose of increasing the stability of the extracted protein, a chelating agent such as divalent ions or EDTA, glycerol, or sucrose may be added as necessary. In addition, a protease inhibitor such as PMSF may be added for the purpose of preventing degradation by protease. In addition, if the extracted protein is insolubilized, it is possible to add a cationic, anionic, nonionic or amphoteric surfactant, or extract with water / butanol. it can. Examples of the extraction solvent include a buffer solution of Example 4 described later. The extraction time is not particularly limited, and examples include 30 minutes to 24 hours. The extraction temperature is not particularly limited, but is exemplified by 4 to 25 ° C, for example. If necessary, the extract can be processed by filtration, centrifugation, concentration, ultrafiltration, molecular sieving and the like. It is also possible to use two or more of the above extracts. It is also possible to use two or more extracts obtained by different extraction methods from the raw material culture.
[0034] また、本発明においては、本発明の抽出物を公知の方法で分画することによって得 られる画分や、分画操作を複数回繰り返すことにより得られる画分についても本発明 の抽出物に包含される。上記の分画手段としては、抽出、分別沈殿、カラムクロマトグ ラフィー、が挙げられる。得られた画分の精製を、抗菌作用を指標としてさらに進める ことにより、ァシタパのディフェンシンを単離することもできる。  [0034] In the present invention, the extraction of the present invention also applies to a fraction obtained by fractionating the extract of the present invention by a known method and a fraction obtained by repeating the fractionation operation a plurality of times. It is included in the thing. Examples of the fractionation means include extraction, fractional precipitation, and column chromatography. By further purifying the obtained fraction using antibacterial action as an index, it is also possible to isolate the defensin of ashitapa.
[0035] 粉砕物としては、例えば上記のディフェンシンを高含有する培養物をそのまま、もし くは乾燥させ、粉砕機を使用して粉砕することで得られる粉状の粉砕物が例示される 。また、凍結粉砕により得られる粉砕物であってもよい。  [0035] Examples of the pulverized product include a powdered pulverized product obtained by, for example, directly drying a culture containing a high content of the above-described defensin and pulverizing it using a pulverizer. Further, it may be a pulverized product obtained by freeze pulverization.
[0036] 乾燥物としては、例えば上記のディフェンシンを高含有する培養物をそのまま乾燥 させたものや凍結乾燥物が例示される。 [0036] As the dried product, for example, a culture containing a high amount of the above defensin is dried as it is. Examples thereof include lyophilized products and freeze-dried products.
[0037] 破砕物とは、原料培養物を砕き壊したものであり、一般には粉砕物よりも組織片が 大きぐ例えば、破砕機を使用することにより製造することができる。また、化学処理物 とは、特に限定はないが、原料培養物を酸処理、アルカリ処理、酸化処理、還元処理 等に供して得られた物をいい、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、クェン酸、酢酸等の無機 酸や有機酸、又は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア等の無機塩基や有 機塩基を含む水溶液に原料培養物を浸漬することにより製造することができる。化学 処理物には、前記のような化学処理を受けた培養物に由来するすべてのものを含む 。酵素処理物とは、例えば、ぺクチナーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、アミラーゼ、 マンナナーゼ、ダルコシダーゼ等による酵素処理物、微生物による酵素反応物（例え ば、発酵物）をいい、例えば、原料培養物に対して上記酵素を適当な緩衝液中で作 用させることにより製造すること力 Sできる。酵素処理物には、前記のような酵素処理を 受けた培養物に由来するすべてのものを含む。  [0037] The crushed product is a material obtained by crushing a raw material culture, and generally has a tissue piece larger than the pulverized product, and can be produced, for example, by using a crusher. The chemical treatment product is not particularly limited, but refers to a product obtained by subjecting the raw material culture to acid treatment, alkali treatment, oxidation treatment, reduction treatment, etc., for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, citrate. It can be produced by immersing the raw material culture in an aqueous solution containing an inorganic acid such as acetic acid or an organic acid, or an inorganic base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia, or an organic base. Chemically treated products include all those derived from cultures that have undergone chemical treatment as described above. The enzyme-treated product refers to, for example, an enzyme-treated product such as pectinase, cellulase, xylanase, amylase, mannanase, and dalcosidase, and an enzyme reaction product (for example, fermented product) by microorganisms. Manufactured by using the enzyme in an appropriate buffer. Enzyme-treated products include all those derived from cultures that have undergone enzyme treatment as described above.
[0038] また、本発明は、ァシタパ由来の新規なポリペプチドであるディフェンシン (以下、 本発明のポリペプチドと称することがある）をも提供する。該ポリペプチドは下記（a)ま たは (b)から選択される。  [0038] The present invention also provides defensin (hereinafter sometimes referred to as the polypeptide of the present invention) which is a novel polypeptide derived from assipaca. The polypeptide is selected from the following (a) or (b).
(a)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the Sequence Listing,
(b)前記（a)のポリペプチドのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸残基の 置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列を有するポリぺ プチドであって、前記（a)のポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリぺプチ ド、。 (b) a polypeptide having an amino acid sequence having at least one of substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of the polypeptide of (a), A polypeptide having a function equivalent to that of the polypeptide (a);
[0039] ここで同等な機能とは、例えば抗菌活性が例示され、後に述べる実施例 1もしくは 4 記載の方法を用いて確認することができる。本発明を特に限定するものではないが、 配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは一般 細菌、酵母類、カビ類、真菌類に対して抗菌活性を有する。  Here, the equivalent function is exemplified by, for example, antibacterial activity, and can be confirmed using the method described in Example 1 or 4 described later. Although the present invention is not particularly limited, a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the Sequence Listing has antibacterial activity against general bacteria, yeasts, molds and fungi.
[0040] なお、配列表の配列番号 1〜24から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド は、後述の実施例 2に記載のとおり、いずれもァシタバ由来のディフェンシンである。 すなわち、ァシタパには少なくとも本発明者らにより見出された 24種類のディフェンシ が存在することが、今回明らかになった。これらのタンパク質と、それをコードする核 酸の関係について下記表 1に示す。また後述するシグナルペプチドがどのアミノ酸残 基の間で切断されるかを表 1に示す。表 1において、シグナルペプチドの切断位置（ 1)は Neutral networkを、（2)は Hidden Markov modelsをそれぞれ計算アル ゴリズムとして用いたことを示す。 [0040] The polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 24 in the sequence listing is a defensin derived from Ashitaba as described in Example 2 described later. That is, at least 24 kinds of defensive features found by the present inventors are included in ashitapa. It has become clear this time. Table 1 below shows the relationship between these proteins and the nuclear acids that encode them. Table 1 shows which amino acid residues the signal peptide described below is cleaved between. In Table 1, the cleavage position (1) of the signal peptide used Neutral network, and (2) shows that Hidden Markov models were used as calculation algorithms.
[表 1] [table 1]
表 1 table 1
Figure imgf000014_0001
本発明のポリペプチドの具体的な例としては、配列表の配列番号 1〜26から選択さ れるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。また、配列表の配列番号;!〜 2 6から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等な機能、例えば抗菌活性を 示す限りにおいて、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列に 1もしく は数個のアミノ酸残基の欠失、付カロ、揷入もしくは置換の少なくとも 1つがなされたァ ミノ酸配列で示されるポリペプチドを包含する。このような変異を有するポリペプチドと しては、例えば配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに 5 0%以上の同一性を有するポリペプチド、好ましくは 70%以上の同一性を有するポリ ペプチド、特に好ましくは 90%以上の同一性を有するポリペプチドが例示される。こ れらの変異を有するポリペプチドは、配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を 有するポリペプチドと同等な機能を有するもの、例えば抗菌活性を示すものであって 、作用する菌の種類が異なるもの等であっても本発明に包含される。
Figure imgf000014_0001
Specific examples of the polypeptide of the present invention include polypeptides having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing. Moreover, as long as it exhibits a function equivalent to a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs:! To 26, for example, antibacterial activity, an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing 1 or Includes a polypeptide represented by an amino acid sequence in which at least one of deletion, appendage, insertion or substitution of several amino acid residues has been made. As a polypeptide having such a mutation, for example, a polypeptide having 50% or more identity to a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26, preferably 70% or more identity And a polypeptide having an identity of 90% or more is particularly preferable. The polypeptide having these mutations has a function equivalent to that of a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26, for example, exhibits antibacterial activity, and the type of bacteria that acts is Even different ones are included in the present invention.
[0043] 特に本発明のポリペプチドはその N末端側にシグナルペプチドを有しており、植物 体内ではこのシグナルペプチドが切断された、成熟したディフェンシンが存在すると 予想される。シグナルペプチドの切断位置については表 1及び図 8に示すとおりであ る。なお、図 8は各種植物由来のディフェンシンのアミノ酸配列比較について示した 図であり、 AkDEFlはァシタバディフェンシン (配列表の配列番号 1に記載のァミノ 酸配列）、 HaDEFはヒマヮリディフェンシン、 RsAFPlはダイコンディフェンシン、 Bn DEFはセィヨウアブラナディフェンシン、 BrDEFはチャイニーズキャベツディフェンシ ン、 MsDEFlはアルファルフアディフェンシン、 NaDlはハナタバコディフェンシン、 PhDlはペチュニアディフェンシンを示す。すなわち、本発明のポリペプチドは、配列 表の配列番号 1〜24から選択されるアミノ酸配列からシグナルペプチドを除いたアミ ノ酸配列からなるポリペプチドが例示される。より具体的には、上記表 1に記載のシグ ナルペプチド切断位置から N末端側が欠失したポリペプチドが例示される。例えば、 配列表の配列番号 25で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列表の配 列番号 1で表されるアミノ酸配列から、 N末端側のシグナルペプチド（27アミノ酸）が 除去されたポリペプチドである。さらに配列表の配列番号 59で表される核酸配列は、 当該ポリペプチドをコードする核酸である。  [0043] In particular, the polypeptide of the present invention has a signal peptide on the N-terminal side, and it is expected that mature defensins in which this signal peptide is cleaved exist in the plant body. The signal peptide cleavage positions are shown in Table 1 and FIG. FIG. 8 is a diagram showing amino acid sequence comparisons of various plant-derived defensins. AkDEFl is vasitadefensin (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing), HaDEF is castor ridifensin, RsAFPl Stands for radish defensin, Bn DEF stands for oilseed rape defensin, BrDEF stands for Chinese cabbage defensin, MsDEFl stands for alfalfa defensin, NaDl stands for Hana tobacco defensin, PhDl stands for petunia defensin. That is, the polypeptide of the present invention is exemplified by a polypeptide comprising an amino acid sequence obtained by removing a signal peptide from an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 24 in the Sequence Listing. More specifically, there are exemplified polypeptides in which the N-terminal side is deleted from the signal peptide cleavage position shown in Table 1 above. For example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 in the sequence listing is a polypeptide obtained by removing the N-terminal signal peptide (27 amino acids) from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It is a peptide. Furthermore, the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 in the sequence listing is a nucleic acid encoding the polypeptide.
[0044] さらに図 8に示すとおり、ァシタバ由来のディフェンシンは、アミノ酸配列比較から、 その他の植物由来のディフェンシンとは異なり、 N末端側に特異的な 14アミノ酸残基 を有していることが本発明者らにより初めて明らかになった。さらにこのァシタパ由来 のディフェンシンは、後述の実施例 6に記載のとおり、その他のディフェンシンと比較 して保存安定性やプロテアーゼ耐性において優れており、従来知られている植物由 来のディフェンシンと比較して極めて優れた効果を発揮するものであり、安定性の高 い抗菌剤としての使用に極めて有用である。また、後述の実施例 5に記載のとおり、 ァシタパ由来のディフェンシンに特異的な N末端側の 14アミノ酸を除去した場合、よ り強い抗菌活性が確認されている。なお、当該 14アミノ酸を除去したポリペプチドの アミノ酸配列については、配列表の配列番号 26に、また当該アミノ酸配列をコードす る核酸配列は配列表の配列番号 60に示す。 [0044] Further, as shown in Fig. 8, from the amino acid sequence comparison, defensin derived from Ashitaba has a specific 14 amino acid residue on the N-terminal side, unlike other plant-derived defensins. First revealed by the inventors. Furthermore, this defensin derived from assipaca was compared with other defensins as described in Example 6 below. It is excellent in storage stability and protease resistance, and exhibits extremely superior effects compared to the conventionally known plant-derived defensin, and is extremely useful as a highly stable antibacterial agent. Useful. Further, as described in Example 5 described later, stronger antibacterial activity was confirmed when 14 amino acids on the N-terminal side specific to assipaca-derived defensin were removed. The amino acid sequence of the polypeptide from which the 14 amino acids have been removed is shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing, and the nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 60 in the sequence listing.
[0045] また、本発明のポリペプチドはその活性には必須でな!/、ペプチド領域を有して!/、て もよい。例えば遺伝子工学的に本発明のポリペプチドを製造した場合、翻訳の効率 を向上させるためのペプチドや、精製を容易とするためのペプチド（例えばヒスチジン タグ、ダルタチオン S—トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等）、シャ ペロンなど発現効率を向上させるタンパクが付加されたものであっても、配列表の配 列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同等の機能、例え ば抗菌活性を示す限り本発明のポリペプチドに包含される。  [0045] The polypeptide of the present invention may have a peptide region that is not essential for its activity! /. For example, when the polypeptide of the present invention is produced by genetic engineering, a peptide for improving the efficiency of translation, a peptide for facilitating purification (for example, histidine tag, dartathione S-transferase, maltose binding protein, etc.), Even if a protein that improves expression efficiency such as chaperone is added, as long as it exhibits the same function as a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing, for example, antibacterial activity Included in the polypeptides of the present invention.
[0046] 本発明のポリペプチドは、例えば、前述のディフェンシンを高含有する培養物もしく はそれらの処理物や、ァシタパの植物体から、公知の方法を組み合わせて製造する ことができる。すなわち、本発明は、前述のディフェンシンを高含有する培養物もしく はそれらの処理物を用いたァシタパ由来のディフェンシンの製造方法も提供される。 当該ディフェンシンの製造方法としては、前述のディフェンシンを高含有する培養物 力、らディフェンシンを採取する工程が包含される。ここで採取とは、精製や部分精製 など、ァシタバディフェンシンを生成する目的で各種操作を行うことを意味する。例え ば、細胞または組織の破砕処理物に対して有機溶媒 ·水による抽出操作を行い、さら に公知の化学的'物理的精製手段、すなわち硫安分画、イオン交換樹脂、各種クロ マトグラフィー、ゲルろ過法、分画膜による分画法、溶媒分配法、電気泳動等の公知 の方法を組み合わせて精製を行う事ができる。また、好適には後述の実施例 5に記 載のように、遺伝子工学的手法により本発明のポリペプチドを製造することもできる。 本発明のポリペプチドの抗菌活性は、後に述べる実施例 1または 3記載の方法を用 いて確認することができ、精製純度の指標とする事ができる。 [0047] 本発明は、ァシタパ由来の、抗菌活性を有する新規なポリペプチドであるディフェン シンをコードする核酸 (以下、本発明の核酸と称することがある）を提供する。前記核 酸としては、本発明を特に限定するものではないが、下記 (c)〜（g)のから選択され [0046] The polypeptide of the present invention can be produced, for example, from a culture containing a high content of the above-mentioned defensin, a processed product thereof, or a plant of assipaca by a combination of known methods. That is, the present invention also provides a culture product containing a high amount of the above-described defensin, or a method for producing defensin derived from ashitapa using the treated product thereof. The method for producing the defensin includes the step of collecting the defensin from the above-mentioned culture strength containing a high defensin content. Collecting here means performing various operations for the purpose of producing vasitadefensin, such as purification and partial purification. For example, the cell or tissue disrupted product is extracted with an organic solvent and water, and further known chemical 'physical purification means, ie ammonium sulfate fraction, ion exchange resin, various chromatographs, gels. Purification can be performed by a combination of known methods such as filtration, fractionation with a membrane, solvent partitioning, and electrophoresis. In addition, the polypeptide of the present invention can be preferably produced by genetic engineering techniques as described in Example 5 described later. The antibacterial activity of the polypeptide of the present invention can be confirmed using the method described in Example 1 or 3, which will be described later, and can be used as an indicator of purification purity. [0047] The present invention provides a nucleic acid encoding defensin, which is a novel polypeptide having antibacterial activity derived from assipaca (hereinafter sometimes referred to as the nucleic acid of the present invention). The nuclear acid is not particularly limited, but is selected from the following (c) to (g).
(c)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ードする核酸、 (c) a nucleic acid that encodes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing;
(d)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列において 1もしくは数個の アミノ酸残基の置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列 を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配 列を有するポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸、 (d) a polypeptide having an amino acid sequence having at least one of substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues in an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing A nucleic acid encoding a polypeptide having a function equivalent to a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the Sequence Listing,
(e)配列表の配列番号 27〜60から選択される核酸、 (e) a nucleic acid selected from SEQ ID NOs: 27-60 in the sequence listing,
(f)前記（e)の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸であって、前 記（e)の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドを コードする核酸、  (f) a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid of (e) under stringent conditions, the nucleic acid encoding a polypeptide having a function equivalent to the polypeptide encoded by the nucleic acid of (e) above,
(g)前記（e)の核酸の塩基配列において、 1もしくは数個の塩基の置換、欠失、揷入 (g) Substitution, deletion or insertion of one or several bases in the base sequence of the nucleic acid of (e) above
、もしくは付加の少なくとも 1つを有する塩基配列を有する核酸であって、当該核酸に よってコードされるポリペプチドが、前記（e)の核酸によってコードされるポリペプチド と同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸。 Or a nucleic acid having a base sequence having at least one addition, wherein the polypeptide encoded by the nucleic acid has a function equivalent to that of the polypeptide encoded by the nucleic acid of (e) above. Nucleic acid to encode.
[0048] ここで、上記（d)記載の、「配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列に 1もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付カロ、揷入もしくは置換の少なくとも 1つがなさ れたアミノ酸配列で示されるポリペプチド」とは、当該アミノ酸配列に 50%以上の同一 性を有するポリペプチド、好ましくは 70%以上の同一性を有するポリペプチド、特に 好ましくは 90%以上の同一性を有するポリペプチドが例示される。これらの変異を有 するポリペプチドは、配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリぺプチ ドと同等な機能を有するもの、例えば抗菌活性を示すものであって、作用する菌の種 類が異なるもの等であっても本発明に包含される。  [0048] Here, as described in the above (d), “at least one of deletion of 1 or several amino acid residues, addition of caroten, insertion or substitution in the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing” `` Polypeptide represented by a single amino acid sequence '' means a polypeptide having 50% or more identity to the amino acid sequence, preferably a polypeptide having 70% or more identity, particularly preferably 90% or more Polypeptides having the same identity are exemplified. A polypeptide having these mutations has a function equivalent to a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26, for example, exhibits antibacterial activity, and acts as a species of fungus. Even different types are included in the present invention.
[0049] また、前述するとおり、本発明のポリペプチドはシグナルペプチドを有することが予 想されることから、本発明の核酸としては、この領域を含まないポリペプチドをコード する核酸、具体的には上記表 1に記載のシグナルペプチド切断位置で N末端側が 除去されたポリペプチドをコードする核酸が例示される。 [0049] Further, as described above, since the polypeptide of the present invention is expected to have a signal peptide, the nucleic acid of the present invention encodes a polypeptide not containing this region. Specifically, nucleic acids encoding the polypeptides from which the N-terminal side has been removed at the signal peptide cleavage positions shown in Table 1 above are exemplified.
[0050] また「（e)の核酸によってコードされるポリペプチドと同等な機能」とは（e)の核酸に よってコードされるポリペプチドと同等な機能を有するもの、例えば抗菌活性を示すも のであって、作用する菌の種類が異なるもの等であっても本発明に包含される。 [0050] The "function equivalent to the polypeptide encoded by the nucleic acid (e)" has a function equivalent to the polypeptide encoded by the nucleic acid (e), for example, exhibits antibacterial activity. Thus, even those having different types of acting bacteria are included in the present invention.
[0051] また上記（f)に記載のストリンジェントな条件としては、 1989年、コールド 'スプリング [0051] The stringent conditions described in (f) above include cold springs in 1989.
.ハーバー.ラボラトリー発行、】· サムブルック (j. Sambrook)ら編集、モレキユラ 一.クローニング：ァ.ラボラトリー.マニュアル第 2版（Molecular Cloning ： A L aboratory Manual 2nd ed. )等に記載された条件が例示される。具体的には、 例えば 0· 5% SDS、 5 Xデンノ、ルツ溶液、 0. 01 % 変性サケ*** DNAを含む 6 X SSC中、プローブとともに 65°Cにて 12〜20時間インキュベートする条件が挙げら れる。プローブにハイブリダィズした核酸は、例えば 0. 5% SDSを含む 0. 1 X SSC 中、 37°Cで洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後に検出することがで きる。  Published by Harbor Laboratory; · Edited by j. Sambrook et al., Cloning: Molecular Cloning: 2nd edition (Molecular Cloning: AL aboratory Manual 2nd ed.), Etc. Is done. Specifically, for example, the conditions of incubation with a probe at 65 ° C for 12 to 20 hours in 6 X SSC containing 0.5% SDS, 5 X denno, Ruth solution, 0.01% denatured salmon sperm DNA It is Nucleic acid hybridized to the probe can be detected after removing non-specifically bound probe by washing at 37 ° C in 0.1 X SSC containing 0.5% SDS, for example.
[0052] 本発明の核酸は、例えば下記のような手段により取得することができる。例えば、配 列表の配列番号 27〜60の核酸配列情報をもとに特異的なプライマーを作成し、ァ シタパの植物体すなわち葉、茎、根等、あるいは前述のディフェンシンを高含有する ァシタパの培養物より作製された cDNAライブラリーを铸型にして PCRによりァシタ バの cDNAを取得して本発明の核酸とすることができる。また、上記のァシタバのデ ィフェンシンを高含有する培養物を用レ、て、特異的に多く発現して!/、る mRNAを公 知の方法、例えば後述の実施例 2に記載の DNAビーズマイクロアレイを用いた方法 で特定し、その情報をもとに cDNAをクローユングして本発明の核酸とすることができ る。また、 DNA合成機を用いて本発明の核酸の全配列を合成することもできる。  [0052] The nucleic acid of the present invention can be obtained, for example, by the following means. For example, a specific primer is prepared based on the nucleic acid sequence information of SEQ ID NOs: 27 to 60 in the sequence listing, and the plant of assipaca, that is, leaves, stems, roots, etc. A cDNA library prepared from the product can be used as a saddle to obtain cDNA of ashitababa by PCR to obtain the nucleic acid of the present invention. In addition, the above-described culture containing a high amount of defensin is used to specifically express a large amount of mRNA! /, A method of notifying mRNA such as the DNA bead microarray described in Example 2 described later. The nucleic acid of the present invention can be identified by cloning the cDNA based on the information using the method described above. In addition, the entire sequence of the nucleic acid of the present invention can be synthesized using a DNA synthesizer.
[0053] 上記の工程で得られた本発明の核酸を組み込んだ発現ベクターで形質転換した 適当な宿主、例えば大腸菌を培養して、本発明のポリペプチドを発現させることがで きる。  [0053] A suitable host transformed with the expression vector incorporating the nucleic acid of the present invention obtained in the above step, for example, E. coli can be cultured to express the polypeptide of the present invention.
[0054] 本発明のポリペプチドは、例えば前記のヒスチジン タグ、ダルタチオン S トラ ンスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質等を付加する目的で、発現ベクターをこの ようなタグある!/、はタンパク質のコード領域を含むよう構築する事が有効である。これ らのタグあるいはタンパク質と融合して発現した本発明のポリペプチドは、これらのタ グあるいはタンパク質に特異的なァフィ二ティ担体を利用したクロマトグラフィー等に より容易に精製すること力できる。またこれらのタグあるいはタンパク質は、融合部分 を切断するプロテアーゼが認識する部位が揷入されるように発現ベクターを構築して おけば、融合部分を切断するプロテアーゼで処理して容易に除くことができる。また 配列表の配列番号 1〜26から選択される本発明のポリペプチドのアミノ酸配列には 複数箇所のシスティン残基が存在していることから、公知の手段、例えば Chaperoni n GroE、 Corystein、 Protein Disulfide— isomerase (レヽずれ bタ刀フノ イ '干土 製)等の試薬を用いて正当な分子内のジスルフイド結合を構築しなおすこともできる。 [0054] For the purpose of adding the histidine tag, dartathione S transferase, maltose-binding protein, and the like, the polypeptide of the present invention is used as an expression vector. It is effective to construct such a tag to include the coding region of the protein. The polypeptide of the present invention expressed by fusion with these tags or proteins can be easily purified by chromatography using an affinity carrier specific for these tags or proteins. These tags or proteins can be easily removed by treating with a protease that cleaves the fusion part if an expression vector is constructed so that the site recognized by the protease that cleaves the fusion part is inserted. . Further, since there are a plurality of cysteine residues in the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing, known means such as Chaperoni n GroE, Corystein, Protein Disulfide — It is also possible to reconstruct a proper intramolecular disulfide bond using a reagent such as isomerase (Lesson b).
[0055] またカラシナ由来のディフェンシンをコードする遺伝子を導入した遺伝子組み換え イネが病害抵抗性を持つという報告があることから（非特許文献 2)、本発明の核酸を 用いて、他の植物を形質転換し、該植物に病原菌への抵抗性を付与することができ [0055] In addition, since there has been a report that transgenic rice introduced with a gene encoding mustard-derived defensin (Non-Patent Document 2), the nucleic acid of the present invention is used to characterize other plants. Can be converted to confer resistance to pathogens on the plant
[0056] また、本発明により、本発明のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤が提 供される。本発明において、本発明のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤 の組成や形状、有効成分の含有量としては、特に限定はなぐ当該抗菌剤の用途に よって適宜設定される。 [0056] The present invention also provides an antibacterial agent containing the polypeptide of the present invention as an active ingredient. In the present invention, the composition and shape of the antibacterial agent containing the polypeptide of the present invention as an active ingredient, and the content of the active ingredient are appropriately set depending on the use of the antibacterial agent without particular limitation.
[0057] 以下、ディフェンシンを高含有する培養物、もしくはその処理物を有効成分とする抗 菌剤、ならびに本発明のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤（以下、これ らの抗菌剤をあわせて本発明の抗菌剤と称することがある）の用途について詳細に 説明する。本発明の抗菌剤は、抗菌成分としてァシタパ由来のディフェンシンを含有 する新規な抗菌剤である。  [0057] Hereinafter, an antibacterial agent containing a culture containing a high amount of defensin or a treated product thereof as an active ingredient, and an antibacterial agent containing the polypeptide of the present invention as an active ingredient (hereinafter, these antibacterial agents are combined). The application of the antibacterial agent of the present invention may be described in detail. The antibacterial agent of the present invention is a novel antibacterial agent containing defensin derived from ashitapa as an antibacterial component.
[0058] 本発明の抗菌剤は特に植物病原菌に対する防除剤として有効である。対象となる 植物病原菌としては、糸状菌、細菌等、特に限定されるものではないが、例としてィ ネのいもち病菌、イネの紋枯病菌、イネの白葉枯病菌、アブラナ科植物のクロスス病 菌、エンドゥ褐班病菌、トマト萎ちよう病菌などがあげられる。  [0058] The antibacterial agent of the present invention is particularly effective as a control agent against plant pathogens. The target phytopathogenic fungi include, but are not limited to, filamentous fungi, bacteria, etc. Examples include rice blast fungus, rice blight fungus, rice leaf blight fungus, cruciferous plant cress Examples include fungi, Endo brown spot fungus, and tomato wilt fungus.
[0059] 本発明の抗菌剤は、農薬、土壌の改良剤、農業資材あるいは肥料等の農業もしく は園芸用途に用いることができ、その形態や剤形は特に限定されるものではなぐ液 剤、粒剤などに必要に応じて加工するのが望ましい。また使用の場所、環境、 目的等 にあわせて、本発明の抗菌剤が有効に抗菌作用を保持し作用する様に、例えば粒 子径の制御、浮遊性の制御、ぬれの制御、混用活性成分の安定化、浸透移行性、 残効性あるいは耐雨性の向上などの目的で、本発明の抗菌剤を液体、粉体あるいは 粒体などの様々な剤形とする事ができる。また、展着剤、水和剤、または乳化剤など の添加剤を添加することができる。これらの添加剤は特に限定されるものではな!/、が 、たとえば展着剤、水和剤、または乳化剤としては陰イオン (ァニオン)性界面活性剤 、陰イオン (カチオン)性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン (ノユオン)性界面 活性剤、あるいはパラフィンを組み合わせたもの等を用いることができる。 [0059] The antibacterial agent of the present invention can be used for agriculture such as agricultural chemicals, soil conditioners, agricultural materials or fertilizers. Can be used for horticultural purposes, and its form and dosage form are not particularly limited, and it is desirable to process liquids and granules as necessary. In addition, according to the place of use, environment, purpose, etc., the antibacterial agent of the present invention can effectively maintain and act as an antibacterial agent, for example, control of particle diameter, control of floating, control of wetting, mixed active ingredients. The antibacterial agent of the present invention can be made into various dosage forms such as liquids, powders or granules for the purpose of stabilization of water, penetration and migration, after-effect or rain resistance. In addition, additives such as spreading agents, wettable powders, or emulsifiers can be added. These additives are not particularly limited! /, For example, as a spreading agent, a wettable powder, or an emulsifier, an anionic surfactant, an anionic surfactant, Amphoteric surfactants, nonionic surfactants, or combinations of paraffins can be used.
[0060] 本発明の抗菌剤を農薬、土壌の改良剤、農業資材あるいは肥料等の農業もしくは 園芸用途に用いる場合には、本発明の抗菌剤の含有比率は特に限定されるもので はないが、例えば上記の方法により取得したディフェンシンを高含有する培養物を抗 菌剤として使用する場合、乾燥重量換算で 0. ；!〜 90重量％の間、望ましくは 5〜80 重量％の間の量を、本発明のポリペプチドを抗菌剤として使用する場合は、 0. 001 〜； 10重量％、好ましくは 0. 005〜5重量％含有するものが例として挙げられる。  [0060] When the antibacterial agent of the present invention is used for agricultural or horticultural applications such as agricultural chemicals, soil improvers, agricultural materials or fertilizers, the content ratio of the antibacterial agent of the present invention is not particularly limited. For example, when a culture containing a high amount of defensin obtained by the above method is used as an antibacterial agent, an amount of 0.;! To 90% by weight, preferably 5 to 80% by weight in terms of dry weight When the polypeptide of the present invention is used as an antibacterial agent, examples thereof include those containing 0.001 to 10% by weight, preferably 0.005 to 5% by weight.
[0061] また本発明は、本発明の抗菌剤を含有する食品又は食品添加物（以下、本発明の 食品又は食品添加物と称することがある）を提供する。なお、本発明の食品又は食品 添加物において「含有」とは、含有、添加及び/又は希釈を意味する。ここで、「含有 」とは食品又は食品添加物中に本発明の抗菌剤が含まれるという態様を、「添加」と は食品又は食品添加物の原料に、本発明の抗菌剤を添加するという態様を、「希釈」 とは本発明の抗菌剤に、食品又は食品添加物の原料を添加すると!/、う態様を表すも のである。本発明の食品又は食品添加物は抗菌機能を有するため、例えば口腔内 を清潔にする機能に優れてレ、る。  [0061] The present invention also provides a food or food additive (hereinafter sometimes referred to as the food or food additive of the present invention) containing the antibacterial agent of the present invention. In the food or food additive of the present invention, “containing” means containing, adding and / or diluting. Here, “containing” means that the antibacterial agent of the present invention is contained in food or food additive, and “addition” means that the antibacterial agent of the present invention is added to the raw material of food or food additive. In the embodiment, "dilution" represents an embodiment when a food or food additive ingredient is added to the antibacterial agent of the present invention. Since the food or food additive of the present invention has an antibacterial function, it has an excellent function of cleansing the oral cavity, for example.
[0062] 本発明の食品としては、本発明の抗菌剤を含有する嗜好飲料 (青汁、緑茶、紅茶、 ウーロン茶、コーヒー、清涼飲料、乳酸飲料など）、アルコール飲料（日本酒、中国酒 、ワイン、ウィスキー、焼酎、ウォッカ、ブランデー、ジン、ラム酒、ビール、清涼アルコ ール飲料、果実酒、リキュールなど）、穀物加工品（小麦粉加工品、デンプン類加工 品、プレミックス加工品、麵類、マカロニ類、パン類、あん類、そば類、麩、ビーフン、 はるさめ、包装餅など）、油脂加工品（可塑性油脂、てんぷら油、サラダ油、マヨネ一 ズ類、ドレッシングなど）、大豆加工品（豆腐類、味噌、納豆など）、食肉加工品（ノヽム 、ベーコン、プレスハム、ソーセージなど）、水産製品（冷凍すりみ、力、まぼこ、ちくわ、 はんぺん、さつま揚げ、つみれ、すじ、魚肉ハム、ソーセージ、かつお節、魚卵加工 品、水産缶詰、つくだ煮など）、乳製品（原料乳、クリーム、ヨーグルト、バター、チー ズ、練乳、粉乳、アイスクリームなど）、野菜'果実加工品（ペースト類、ジャム類、漬け 物類、果実飲料、野菜飲料、ミックス飲料など）、菓子類 (チョコレート、ビスケット類、 菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類、ガム類、飴類など）、調味料 (しょうゆ、ソース 、酢、みりんなど）、缶詰 ·瓶詰め ·袋詰め食品（牛飯、釜飯、赤飯、カレー、その他の 各種調理済み食品）、半乾燥または濃縮食品（レバーペースト、その他のスプレッド、 そば'うどんの汁、濃縮スープ類）、乾燥食品（即席麵類、即席カレー、インスタントコ 一ヒー、粉末ジュース、粉末スープ、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調 理済みスープなど）、冷凍食品（すき焼き、茶碗蒸し、うなぎかば焼き、ハンバーグス テーキ、シユウマイ、餃子、各種スティック、フルーツカクテルなど）、固形食品、液体 食品（スープなど）、香辛料類などの農産'林産加工品、畜産加工品、水産加工品な ど力 S挙げられる。特にァシタパの青汁に本発明の抗菌剤を添加することにより、ディ フェンシンの含有量を向上させた青汁とすることができる。また本発明の食品又は食 品添加物は、形状に限定はなぐタブレット状、顆粒状、カプセル状等の形状で経口 的に摂取可能な形状物をとることもできる。 [0062] Examples of the food of the present invention include taste drinks (green juice, green tea, black tea, oolong tea, coffee, soft drinks, lactic acid drinks, etc.) containing the antibacterial agent of the present invention, alcoholic drinks (Japanese sake, Chinese sake, wine, Whiskey, shochu, vodka, brandy, gin, rum, beer, refreshing alcoholic beverage, fruit liquor, liqueur, etc., processed grain products (wheat flour processed products, starch processed products) Products, premix processed products, rice cakes, macaroni, breads, sweet potatoes, buckwheat, rice cakes, rice noodles, rice cakes, packaging rice cakes, etc.), oils and fats processed products (plastic oils, tempura oil, salad oil, mayonnaise, Dressing, etc.), processed soybean products (tofu, miso, natto, etc.), processed meat products (nome, bacon, press ham, sausage, etc.), marine products (frozen surimi, force, maboko, chikuwa, hampen, Deep-fried Satsuma, Tsumire, Line, Fish Ham, Sausage, Bonito, Fish Egg Products, Canned Seafood, Boiled Tsukuda, etc.), Dairy Products (Raw Milk, Cream, Yogurt, Butter, Cheese, Condensed Milk, Powdered Milk, Ice Cream, etc.) 'Processed fruit products (pastes, jams, pickles, fruit drinks, vegetable drinks, mixed drinks, etc.), confectionery (chocolate, biscuits, confectionery breads, cakes) Candy, rice confectionery, gums, potatoes, etc.), seasonings (soy sauce, sauce, vinegar, mirin, etc.), canned foods, bottled foods, bagged foods (beef rice, kettle rice, red rice, curry, and other cooked foods) ), Semi-dried or concentrated food (liver paste, other spreads, buckwheat noodle soup, concentrated soup), dried food (improvised pork, instant curry, instant coffee, powdered juice, powdered soup, instant miso soup, Prepared foods, prepared beverages, prepared soups, etc., frozen foods (sukiyaki, steamed sushi, eel kabayaki, hamburger steak, sweet potato, dumplings, various sticks, fruit cocktails, etc.), solid foods, liquid foods (soups, etc.) Agricultural products such as spices, processed forest products, processed livestock products, processed fishery products. In particular, by adding the antibacterial agent of the present invention to the green juice of ashitapa, the green juice having an improved defensin content can be obtained. In addition, the food or food additive of the present invention can be in the form of a tablet, granule, capsule or the like that can be taken orally in any shape.
[0063] 本発明の食品又は食品添加物中の本発明の抗菌剤の含有量は特に限定されず、 その官能と抗菌活性の観点から適宜選択できるが、例えば、食品又は食品添加物中 の本発明の抗菌剤の総含有量として、上記の方法により取得したディフェンシンを高 含有する培養物を抗菌剤として使用する場合、乾燥重量に換算して、好ましくは 0. 0 1重量％以上、より好ましくは 0· 05〜； 100重量％、さらに好ましくは 0. ；!〜 100重量 %、本発明のポリペプチドを抗菌剤として使用する場合は、 0. 001〜； 10重量％、好 ましくは 0. 005〜5重量％が好ましい。  [0063] The content of the antibacterial agent of the present invention in the food or food additive of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected from the viewpoint of its functionality and antibacterial activity. When the culture containing a high amount of defensin obtained by the above method is used as the antibacterial agent, the total content of the antibacterial agent of the invention is preferably 0.01% by weight or more, more preferably in terms of dry weight. 0 · 05 ~; 100% by weight, more preferably 0.;! ~ 100% by weight, 0.001 ~; 10% by weight, preferably 0 when the polypeptide of the present invention is used as an antibacterial agent. 005 to 5% by weight is preferred.
[0064] また、本発明の抗菌剤は、機能性食品素材としても適しており、本発明の抗菌剤を 含有する食品は、その抗菌作用力 歯周病予防や口内環境を整えて、歯を丈夫に することが期待されるため、そのような効果を有する旨の表示を付した機能性食品（ 例えば、特定保健用食品）として有用である。さらに本発明の食品添加物は、このよう な機能性食品の関与成分としても有用である。 [0064] The antibacterial agent of the present invention is also suitable as a functional food material. The contained food is expected to have antibacterial activity, prevent periodontal disease, improve the oral environment, and make the teeth strong. Therefore, functional foods with such an effect indication (for example, It is useful as a food for specified health use. Furthermore, the food additive of the present invention is also useful as a component involved in such a functional food.
[0065] 本発明の抗菌剤を有効成分とする食品添加物の一例として、公知の製剤化方法に より、食品の変色 ·腐敗 ·酸化等を効果的に防止する食品の鮮度保持剤あるいは防 腐剤を製造することができる。本発明の抗菌剤を有効成分とする食品の鮮度保持剤 あるいは防腐剤は種々の食品 ·生鮮食品 ·加工食品等の味や鮮度の保持に極めて 有用である。 [0065] As an example of a food additive comprising the antibacterial agent of the present invention as an active ingredient, a food freshness-preserving agent or antiseptic that effectively prevents discoloration, decay, oxidation, etc. of food by a known formulation method. Agent can be produced. The food freshness-preserving agent or preservative containing the antibacterial agent of the present invention as an active ingredient is extremely useful for maintaining the taste and freshness of various foods, fresh foods, processed foods and the like.
[0066] また本発明は、本発明の抗菌剤を含有する化粧料 (以下、本発明の化粧料と称す ること力 Sある）を提供する。本発明の化粧料の形態としては、例えば洗浄料、化粧水、 クリーム類、おしろい類、洗顔剤、乳液類、軟膏、浴用石鹼、洗顔石鹼などの皮膚用 製品、洗髪料、ローション、整髪料、パーマ用品、脱毛剤等の毛髪用製品、マニキュ ァ製品、歯磨き、うがい薬、口腔香料、洗口剤などの口中用製品、浴場剤、液体また は固体の芳香製品、 日焼け止め剤、しみ'ソバカス用剤、にきび用剤、パック料、脱 臭剤、白髪染め等の特殊化粧料等があげられる。本発明の化粧料は本発明の抗菌 剤を有効成分とするものであり、公知の化粧料用の原料、例えば陰イオン性界面活 性剤、陽イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン 化セルロース、ポリサッカライド、合成セラミド、精製脂肪酸、高級アルコール、グリセリ ンゃポリエチレングリコールなどの多価アルコール、エステル油、ワックス、グリセリン 脂肪酸エステルなどと組み合わせて製剤化すればょレ、。本発明の化粧料への本発 明の抗菌剤の含有量は特に限定されるべきものではないが、例えば前記の方法によ り取得したディフェンシンを高含有する培養物を抗菌剤として使用する場合、乾燥重 量に換算して、好ましくは 0. 01重量％以上、より好ましくは 0. 05〜20重量％、さら に好ましくは 0. ；!〜 15重量％であり、本発明のポリペプチドを抗菌剤として使用する 場合は、 0. 005〜5重量％、好ましくは 0. 00；!〜 3重量％が好ましい。本発明の化 粧料は、その抗菌作用により、アトピー性皮膚炎等の細菌性の皮膚炎の人が使用す る化粧料として有用である。さらに本発明の化粧料はその抗菌作用により劣化しにく いという特徴を有する。 [0066] The present invention also provides a cosmetic containing the antibacterial agent of the present invention (hereinafter referred to as the cosmetic of the present invention S). Examples of the cosmetic composition of the present invention include cleansing products, lotions, creams, funny products, facial cleansers, emulsions, ointments, sarcophagus for bathing, facial sarcophagus, etc. Products for hair such as cosmetics, permanent products, hair removal agents, nail polish products, toothpastes, mouthwashes, mouth perfumes, mouthwashes, bath products, liquid or solid fragrance products, sunscreens, stains 'Sobacas agents, acne agents, packs, deodorants, and special cosmetics such as hair dyes. The cosmetic of the present invention comprises the antibacterial agent of the present invention as an active ingredient, and is a known raw material for cosmetics, for example, an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, a non-active agent. It can be formulated in combination with ionic surfactants, cationized cellulose, polysaccharides, synthetic ceramides, purified fatty acids, polyhydric alcohols such as higher alcohols and glycerin polyethylene glycol, ester oils, waxes, glycerin fatty acid esters, etc. Les. The content of the antibacterial agent of the present invention in the cosmetic of the present invention is not particularly limited. For example, when a culture containing a high amount of defensin obtained by the above method is used as the antibacterial agent. In terms of dry weight, it is preferably 0.01% by weight or more, more preferably 0.05 to 20% by weight, still more preferably 0.;! To 15% by weight. When used as an antibacterial agent, 0.005 to 5% by weight, preferably 0.00;! To 3% by weight is preferred. The cosmetic of the present invention is useful as a cosmetic used by persons with bacterial dermatitis such as atopic dermatitis because of its antibacterial action. Furthermore, the cosmetic of the present invention is not easily deteriorated by its antibacterial action. It has the characteristic that
[0067] また本発明は、本発明の抗菌剤を含有する医薬品（以下、本発明の医薬品と称す ること力 Sある）を提供する。本発明の医薬品は本発明の抗菌剤の有する抗菌活性を 利用した医薬、例えば、水虫薬などの、感染症の治療のための医薬として有用であ る。また植物由来のディフェンシンにより、哺乳動物のカルシウムイオンチャンネルが ブロックされているという幸告カあること力、ら（Plant Physiol. 135, p2055, 2004 年）、本発明の医薬品は高血圧の治療又は予防をおこなうこともできる。  [0067] The present invention also provides a pharmaceutical product (hereinafter referred to as the pharmaceutical product of the present invention S) containing the antibacterial agent of the present invention. The medicament of the present invention is useful as a medicament for treating infectious diseases such as a medicament utilizing the antibacterial activity of the antibacterial agent of the present invention, for example, athlete's foot drug. In addition, there is a good news that a mammalian calcium ion channel is blocked by a plant-derived defensin (Plant Physiol. 135, p2055, 2004), and the pharmaceutical of the present invention can treat or prevent hypertension. You can also do it.
[0068] 本発明の医薬の製造は、通常、本発明の抗菌剤を有効成分として薬学的に許容で きる液状または固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、 乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆 粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤と すること力 Sできる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品 や、その他、外用剤とすることもできる。  [0068] The preparation of the medicament of the present invention is usually carried out by blending the antibacterial agent of the present invention with a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier as an active ingredient, and optionally a solvent, a dispersant, an emulsifier. , Buffering agents, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, etc., solids such as tablets, condyles, powders, powders, capsules, etc., usually liquids, suspensions, It can be used as a solution such as emulsion. Further, it can be made into a dry product that can be made liquid by adding an appropriate carrier before use, or other external preparations.
[0069] 医薬用担体は、医薬の投与形態および製剤形態に応じて選択することができる。  [0069] The pharmaceutical carrier can be selected depending on the administration form and formulation of the pharmaceutical.
固体形状の経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤 等とすること力でき、たとえば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセ ノレロース、コーンスターチ、無機塩などの医薬用担体が利用される。また経口剤の調 製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤 、着色剤、香料などを配合することもできる。たとえば、錠剤または丸剤とする場合は 、所望によりショ糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性 もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。液体形状の経口剤とする場合は、 薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、た とえば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、さらに所望により湿潤 剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加してもよい。  In the case of a solid oral preparation, it can be made into tablets, pills, capsules, powders, fine granules, granules, etc. For example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch Pharmaceutical carriers such as inorganic salts are used. In preparation of an oral preparation, a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a corrigent, a colorant, a fragrance and the like can be further added. For example, in the case of a tablet or pill, if desired, it may be coated with a sugar coating such as sucrose, gelatin or hydroxypropylcellulose, or a film of a gastric or enteric substance. In the case of liquid oral preparations, pharmacologically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, etc. can be used, for example, purified water, ethanol, etc. are used as carriers. Is done. Further, if desired, auxiliary agents such as wetting agents and suspending agents, sweetening agents, flavoring agents, preservatives and the like may be added.
[0070] 一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記有効成分を希釈剤として の注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油 、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解 ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えるこ とにより調製すること力 Sできる。また、前記有効成分を含む固体組成物を製造し、使 用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。 [0070] On the other hand, when a parenteral preparation is used, distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, peanut oil, soybean oil are used as the diluent according to a conventional method. Dissolve or suspend in corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, etc., and add bactericides, stabilizers, tonicity agents, soothing agents, etc. as necessary. The ability to prepare by In addition, a solid composition containing the active ingredient can be produced and dissolved in sterile water or a sterile solvent for injection before use.
[0071] 外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半 固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。たとえば、乳剤、口 ーシヨン剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性 軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用 または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。  [0071] External preparations include solid, semi-solid or liquid preparations for transdermal administration or transmucosal (oral or intranasal) administration. Also included are suppositories and the like. For example, emulsions such as emulsions and mouth preparations, external tinctures, liquid preparations such as liquids for transmucosal administration, ointments such as oily ointments and hydrophilic ointments, transdermal such as films, tapes, and poultices It can be a patch for administration or transmucosal administration.
[0072] 上記のような各種製剤形態の医薬は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して 、適宜、常法により製造すること力 Sできる。また、力、かる医薬における有効成分の含有 量は、特に限定されるものではないが、例えば前記の方法で取得したディフェンシン を高含有する培養物を有効成分として使用する場合、その投与形態、投与方法など を考慮し、好ましくは乾燥重量換算で 1〜100重量％程度力 S、また本発明のポリぺプ チドを有効成分として使用する場合は、 0. 001〜； 10重量％、好ましくは 0. 005-5 重量％であることが望まし!/、。  [0072] The pharmaceuticals in various dosage forms as described above can be appropriately produced by conventional methods using known pharmaceutical carriers and the like. In addition, the content of the active ingredient in force and medicinal medicine is not particularly limited. For example, when a culture containing a high amount of defensin obtained by the above method is used as the active ingredient, its dosage form, administration In consideration of the method and the like, the force S is preferably about 1 to 100% by weight in terms of dry weight, and 0.001 to 10% by weight, preferably 0 when the polypeptide of the present invention is used as an active ingredient. 005-5 Desirable to be by weight! //.
[0073] 本発明の医薬は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も特 に限定はなぐ例えば内用、外用および注射により投与することができる。本発明の 治療剤又は予防剤を注射により投与する場合は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、 皮内などに投与し得、外用により投与する場合は、たとえば、座剤等の外用剤として 、その適する投与方法により投与すればよい。  [0073] The medicament of the present invention is administered by an appropriate administration method according to the preparation form. The administration method is not particularly limited, and for example, it can be administered by internal use, external use or injection. When the therapeutic agent or prophylactic agent of the present invention is administered by injection, it can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, and when administered externally, for example, as an external preparation such as a suppository, What is necessary is just to administer by the suitable administration method.
[0074] 本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬 の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一 般には、製剤中に含有される前記有効成分の投与量で、例えば前記の方法により取 得したディフェンシンを高含有する培養物を有効成分として使用する場合、乾燥重 量で成人 1日当り好ましくは 0. 5mg〜50g/kg体重、より好ましくは 5mg〜5g/kg 体重、さらに好ましくは 50mg〜500mg/kg体重であり、また本発明のポリペプチド を使用する場合、成人 1日当り好ましくは 1 μ g〜100mg/kg体重、より好ましくは 10 μ g〜； 10mg/kg体重、さらに好ましくは 100 μ g〜； lmg/kg体重である。もちろん 投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場 合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内 において、 1日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。投与期間も任 意である。また、本発明の医薬はそのまま経口投与するほか、任意の食品に添加し て日常的に摂取させることもできる。 [0074] The dose of the medicament of the present invention is appropriately set according to the formulation form, administration method, purpose of use, and age, weight, and symptoms of the patient to whom the medicament is administered, and is not constant. In general, the dosage of the active ingredient contained in the preparation, for example, when a culture containing a high content of defensin obtained by the above method is used as an active ingredient is preferably a dry weight per day for an adult. 0.5 mg to 50 g / kg body weight, more preferably 5 mg to 5 g / kg body weight, more preferably 50 mg to 500 mg / kg body weight, and preferably 1 μm per adult when using the polypeptide of the present invention. g to 100 mg / kg body weight, more preferably from 10 μg to 10 mg / kg body weight, more preferably from 100 μg to lmg / kg body weight. Of course, since the dosage varies depending on various conditions, an amount smaller than the above dosage is sufficient. Sometimes it is necessary or beyond the scope. Administration may be performed within a desired dose range, in a single day, or in several divided portions. The duration of administration is also optional. In addition to the oral administration of the medicament of the present invention as it is, it can be added daily to any food.
[0075] また、本発明の抗菌剤は、動物類 ·鳥類 ·魚類等の飼料の原料として使用することも できる。調製や製造につ!、ては公知の方法に従えばよ!/、。  [0075] The antibacterial agent of the present invention can also be used as a raw material for feeds of animals, birds, fish and the like. For preparation and production, follow any known methods! /.
[0076] また、本発明の抗菌剤は洗剤に添加して使用することもできる。ここで洗剤としては 、特に限定はないが、衣類や布類の洗濯に使用される洗濯用洗剤、食器洗い用洗 剤、台所、浴室、トイレ、ガラス、家具または車等の住宅用洗剤等が例示される。また 、かかる洗剤における有効成分の含有量は、特に限定されるものではないが、例え ば前記の方法で取得したディフェンシンを高含有する培養物を有効成分として使用 する場合、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは乾燥重量換算で;!〜 7 0重量％程度が、また本発明のポリペプチドを有効成分として使用する場合は、 0. 0 0；!〜 10重量％、好ましくは 0. 005〜5重量％であることが望ましい。  [0076] The antibacterial agent of the present invention can also be used by adding to a detergent. The detergent here is not particularly limited, but examples include laundry detergents used for washing clothes and fabrics, dishwashing detergents, kitchens, bathrooms, toilets, glass, furniture and residential detergents for cars, etc. Is done. Further, the content of the active ingredient in such a detergent is not particularly limited. For example, when a culture containing a high amount of defensin obtained by the above-described method is used as an active ingredient, its dosage form and administration method In consideration of the above, preferably in terms of dry weight; about! To 70% by weight, and when the polypeptide of the present invention is used as an active ingredient, 0.0%;! To 10% by weight, preferably 0 Desirably, 005-5% by weight.
[0077] また、本発明の別の態様として、本発明のポリペプチドを識別する抗体（以下、本発 明の抗体と称すること力ある）も提供すること力できる。特に限定はないが、配列表の 配列番号 1〜26記載のアミノ酸配列から選択される抗菌活性を有するポリペプチド に結合する抗体が好ましい。さらに好ましくは、配列表の配列番号 1、 25及び 26記 載のアミノ酸配列のうちいずれ力、から選択されるポリペプチドに結合する抗体であつ て、種々のディフェンシンポリペプチドを識別する抗体が挙げられる。特に、配列表の 配列番号 25で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである AkDEFlに結合す る力 配列表の配列番号 26で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである AkD EF2に結合しない抗体、あるいは AkDEF2に結合する力 AkDEFlに結合しない 抗体、さらに AkDEFl及び AkDEF2の両方に結合する抗体のいずれもが好適に使 用できる。例えば、配列表の配列番号 25で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプチ ドである AkDEFlに結合する力 S、配列表の配列番号 26で表されるアミノ酸配列から なるポリペプチドである AkDEF2に結合しない抗体としては、後述の実施例 3— (2) に記載の AD— Nが例示され、 AkDEFl及び AkDEF2の両方に結合する抗体とし ては、後述の実施例 3—（2)に記載の AD— M及び AD— Cが例示される。また、当 該抗体は、ァシタパ由来ディフェンシンポリペプチドを識別する抗体であれば、ポリク ローナル抗体であってもよぐモノクローナル抗体であってもよい。 [0077] Further, as another aspect of the present invention, an antibody that identifies the polypeptide of the present invention (hereinafter also referred to as the antibody of the present invention) can be provided. Although there is no particular limitation, an antibody that binds to a polypeptide having antibacterial activity selected from amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing is preferable. More preferably, an antibody that binds to a polypeptide selected from any one of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 1, 25, and 26 in the sequence listing, and that distinguishes various defensin polypeptides. . In particular, an antibody that does not bind to AkD EF2, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 in the Sequence Listing, which binds to AkDEFl, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 in the Sequence Listing Alternatively, an antibody that does not bind to AkDEFl, or an antibody that binds to both AkDEFl and AkDEF2, can be preferably used. For example, S binds to AkDEFl, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 in the sequence listing, and binds to AkDEF2, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 26 in the sequence listing. Examples of antibodies that do not include AD-N described in Example 3- (2) below, and are antibodies that bind to both AkDEFl and AkDEF2. Examples thereof include AD-M and AD-C described in Example 3- (2) described later. In addition, the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, as long as it is an antibody that distinguishes vasitapa-derived defensin polypeptide.
[0078] また、当該抗体の調製方法は、上記性質を有する抗体を取得できる方法であれば 特に限定はないが、例えば、前記のような、ァシタバ由来ディフェンシンポリペプチド を識別する抗体を調製する場合は、配列表の配列番号 1〜26記載のいずれかのァ ミノ酸配列を有するポリペプチドを合成し、当該ポリペプチドを動物に免疫する工程、 前記免疫された動物から採血し、抗血清を調製する工程、前記抗血清から、（ィ) Ak DEF1ポリペプチドに結合し、 AkDEF2ポリペプチドに結合しないクローン、（口） Ak DEF2ポリペプチドに結合し、 AkDEFlポリペプチドに結合しないクローンあるいは 、 （ハ） AkDEFlポリペプチド及び AkDEF2ポリペプチドに結合するクローン、のい ずれかを選択する工程、を実施することにより当該抗体を製造することができる。例え ば、後述の実施例 3— (2)に記載のとおり、配列表の配列番号;!〜 26で表されるアミ ノ酸配列のうち適当な長さの部分ペプチドを合成し、ゥサギ等の動物に免疫して取得 すること力 Sでさる。 [0078] The method for preparing the antibody is not particularly limited as long as it is a method capable of obtaining an antibody having the above properties. For example, in the case of preparing an antibody for identifying a vaccinia-derived defensin polypeptide as described above, for example. Is a step of synthesizing a polypeptide having any amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1-26 in the sequence listing, immunizing the animal with the polypeptide, collecting blood from the immunized animal, and preparing antiserum (Ii) a clone that binds to Ak DEF1 polypeptide and does not bind to AkDEF2 polypeptide, (mouth) a clone that binds to Ak DEF2 polypeptide and does not bind to AkDEFl polypeptide, or (c) The antibody can be produced by performing a step of selecting either a clone that binds to AkDEFl polypeptide or AkDEF2 polypeptide.For example, as described in Example 3- (2) below, a partial peptide having an appropriate length is synthesized from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs:! Immunize animals to get them.
[0079] さらに、配列表の配列番号;!〜 26記載のいずれかのアミノ酸配列を有するポリぺプ チドを合成し、当該ポリペプチドで動物を免疫する工程、前記免疫された動物の細胞 を用いてハイプリドーマを生産する工程、前記ハイプリドーマから、（ィ) AkDEFlポリ ペプチドに結合し、 AkDEF2ポリペプチドに結合しないクローン、（口） AkDEF2ポリ ペプチドに結合し、 AkDEFlポリペプチドに結合しないクローンあるいは、（ハ） AkD EF1ポリペプチド及び AkDEF2ポリペプチドに結合するクローン、のいずれかを選 択する工程、前記選択されたクローンから細胞を増殖する工程、前記細胞の生産す る抗体を単離する工程、を実施することにより当該抗体を製造することもできる。  [0079] Further, a step of synthesizing a polypeptide having any one of the amino acid sequences described in SEQ ID NOs:! To 26 in the sequence listing, and immunizing the animal with the polypeptide, using the cells of the immunized animal From the hyperidoma, (i) a clone that binds to AkDEFl polypeptide and does not bind to AkDEF2 polypeptide, (mouth) a clone that binds to AkDEF2 polypeptide and does not bind to AkDEFl polypeptide, or (C) a step of selecting any of the clones that bind to the AkD EF1 polypeptide and the AkDEF2 polypeptide, a step of growing a cell from the selected clone, a step of isolating the antibody produced by the cell, The antibody can also be produced by carrying out
[0080] 本発明の抗体は、ァシタパ抽出物、あるいはァシタパ組織培養物、あるいは本発明 のポリペプチドをコードする核酸を導入した微生物、植物、動物から、本発明のポリぺ プチドを精製する際に、樹脂のような固相に固定化することによって好適に使用でき る。前記固相としては、例えば磁気ビーズを用いても良い。また、本発明の抗体は、 金粒子のような化学物質あるいはアルカリフォスファターゼゃペルォキシダーゼのよう な酵素によって標識することにより、本発明のポリペプチドを産生する天然物、人工 物のスクリーニングに使用できる。また、本発明のポリペプチドの発現あるいは部位特 異的発現を検出するための抗体としても使用できる。さらに、 AkDEFlのプロテア一 ゼ切断部位を当該プロテアーゼから保護することができる。従って、時期あるいは部 位特異的にディフェンシン活性を発揮させたい対象に投与する際には、本発明の抗 体をディフェンシンに結合させることで特定の時期あるいは部位にくるまではディフエ ンシン活性を抑え、その特定の時期あるいは部位にきた際に、熱処理等の処理によ り当該抗体を除去して、ディフェンシン活性型に変換させることにより、時期あるいは 部位特異的に必要なディフェンシン活性を発現させることができる。 [0080] The antibody of the present invention is used when purifying the polypeptide of the present invention from microorganisms, plants, or animals into which a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention has been introduced. It can be suitably used by immobilizing it on a solid phase such as a resin. As the solid phase, for example, magnetic beads may be used. The antibody of the present invention may be a chemical substance such as gold particles or alkaline phosphatase or peroxidase. By labeling with a simple enzyme, it can be used for screening natural products and artificial products that produce the polypeptide of the present invention. It can also be used as an antibody for detecting the expression or site-specific expression of the polypeptide of the present invention. Furthermore, the protease cleavage site of AkDEFl can be protected from the protease. Therefore, when administered to a subject who wants to exert defensin activity in a specific or time-specific manner, the defensin activity is suppressed until a specific time or site is reached by binding the antibody of the present invention to defensin. When a specific time or site is reached, the antibody can be removed by heat treatment or the like and converted to a defensin active form, so that the required defensin activity can be expressed specifically for the time or site.
実施例  Example
[0081] 以下に本発明を実施例をもって示すが、本発明はこれらの実施例の範囲のみに限 定されるものではない。また、本明細書に記載の操作のうち、遺伝子工学上の基本 的な操作にっレ、てはサムブルック（Sambrook)ら、モレキュラー ·クローニング：ァ'ラ ボラトリー.マ二ユアノレ第 3版 (Molecular Cloning —A Laboratory Manual— )、 コールド スプリング ノヽーノ ー ラボラトリー プレス（Cold Spring Harbor L aboratory Press) , 2001年に記載の方法によった。  [0081] The present invention is described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the scope of these examples. In addition, among the operations described in this specification, the basic operations in genetic engineering, Sambrook et al., Molecular Cloning: A La Volatry. Cloning —A Laboratory Manual—), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
[0082] 実施例 1 ァシタパ培養物の調製およびその抗菌活性の確認  Example 1 Preparation of assipaca culture and confirmation of its antibacterial activity
ァシタパの培養細胞を寒天培地上に置き、真菌類に対する抗菌活性を調べた。  The cultured cells of assipac were placed on an agar medium and examined for antibacterial activity against fungi.
(1)ァシタパのカルス培養条件の検討  (1) Examination of callus culture conditions
栽培 1 2年目のァシタパの葉、茎、葉柄、根を 70%アルコールで 5分間消毒した 後、次亜塩素酸ナトリウム溶液 (有効塩素濃度約 2. 2%)に 10分間つけて殺菌処理 した。その後、無菌水で洗浄して、カルス誘導に供する植物体の切片を作成した。切 片は基本的にオーキシン類 lppm、サイトカイニン類 0. lppmを含む MS寒天培地（ ショ糖 30g/L含有）に置床して、一定温度（22°Cまたは 25°Cまたは 28°C)で喑所で 培養した。なお、オーキシン類（2, 4— D、 IAA、 IBA)、サイトカイニン類（力イネチン 、 BA)を含有する各種培地について、下記表 2に示す。  Cultivation 1 Leaves, stems, petiole, and roots of 2 years old were sterilized with 70% alcohol for 5 minutes, then sterilized with sodium hypochlorite solution (effective chlorine concentration of about 2.2%) for 10 minutes . Thereafter, it was washed with sterile water to prepare a section of a plant body for callus induction. The slices are basically placed on MS agar medium (containing 30 g / L sucrose) containing lppm auxin and 0. lppm auxin and sprinkled at a constant temperature (22 ° C, 25 ° C or 28 ° C). Incubated in place. Table 2 below shows various media containing auxins (2, 4-D, IAA, IBA) and cytokinins (strength rice, BA).
[0083] [表 2] 表 2 [0083] [Table 2] Table 2
培地名 植物成長調節物質 (m g / 1 )  Medium name Plant growth regulator (mg / 1)
- 才ーキシン類 サイ トカイニン類  -Age-xins Cytokinins
o  o
2， 4-D IAA IBA 力イネチン BA  2, 4-D IAA IBA force inine BA
1, 0 0. 1  1, 0 0. 1
MSAO. 2B 1. 0 0. 2  MSAO. 2B 1. 0 0. 2
1. 0 0. 1  1. 0 0. 1
1 , 0 0. 1  1, 0 0. 1
[0084] 培養から 10〜60日目のカルスの形成率を測定した。その結果、早いもので培養 1 0日目よりカノレスの誘導が始まった。どの部位力、らもカノレスの誘導が可能である力 S、茎 と葉柄が安定に誘導できた。培地は MSDO. 1K>MSB0. 1K = MSA0. 2B〉M SAO. IKの順に誘導に優れていた。つまり、いずれのオーキシン類でもカルスの誘 導は可能である力 同濃度では 2, 4— Dが適していることが明らかになった。 [0084] The rate of callus formation on the 10th to 60th day from the culture was measured. As a result, induction of canores began on the 10th day of culture at an early stage. The force of any part, the force S that can induce canores, and the stem and petiole could be induced stably. The medium was excellent in induction in the order of MSDO.1K> MSB0.1.1K = MSA0.2.2B> M SAO.IK. In other words, it was found that 2, 4-D is suitable at the same concentration that can induce callus with any auxin.
[0085] オーキシン類として 2, 4-D lmg/1存在下でのカルス誘導におけるサイトカイ二 ンの種類と温度の組み合わせでカルス誘導を検討した結果、サイトカイニン類は BA ゃゼァチンが適していた。温度はいずれの温度でも誘導可能である力 特に 25°Cか ら 28°Cが適している。但し、 日数が経過すると 28°Cでは褐変化する傾向があるので 、培養維持という意味では、 25°Cが適していた。  [0085] As a result of examination of callus induction by a combination of the kind and temperature of cytokinin in callus induction in the presence of 2,4-D lmg / 1 as auxins, BA zeatin was suitable as the cytokinin. The temperature is a force that can be induced at any temperature, especially 25 ° C to 28 ° C. However, since there is a tendency to brown at 28 ° C with the passage of days, 25 ° C was suitable in terms of maintaining culture.
[0086] オーキシン類として 2, 4— Dの最適濃度を植物体組織部位との組み合わせでカル ス誘導を検討した結果、 2, 4— D濃度は 0. 5〜5mg/Lのいずれでも誘導可能であ る力 特に 0. 5〜lmg/Lが適当であった。部位は葉を除くすべての供試部位から 誘導が可能であつたが、特に茎と葉柄が安定に誘導できた。  [0086] As a result of investigating the induction of callus at the optimal concentration of 2, 4-D as a auxin in combination with plant tissue sites, it can be induced at any concentration of 2, 4–D from 0.5 to 5 mg / L. A force of 0.5 to 1 mg / L was appropriate. The site could be derived from all the test sites except the leaves, but the stem and petiole were particularly stable.
[0087] (2)ァシタパのカルスおよび組織の継代培養  [0087] (2) Callipapa callus and tissue subculture
(1)で誘導したカルスあるいは組織を、 MSD培地すなわち 2, 4— Dを lmg/1含有 する MS寒天培地（ショ糖 30g/L含有）で 2週間あるいは 4週間の間隔をお!/、て継代 培養を行った。 （以後、この工程で得られた培養物を MSD培養物と称する。 )  Callus or tissue induced in (1) is placed on MSD medium, ie MS agar medium (containing 30 g / L sucrose) containing lmg / 1 of 2, 4-D at intervals of 2 or 4 weeks! Subculture was performed. (Hereafter, the culture obtained in this step is referred to as MSD culture.)
[0088] (3)培地への移植培養  [0088] (3) Transplant culture to medium
(2)で得られた MSD培養物を、 2, 4— Dを含有しない以外は MSD培地と同じ組 成の培地（以後この培地を MS0と称する）に移植して、移植後から、光を照射しない 条件で 25°Cで培養をおこなった。 日数が 30日を越えたものは同じ培地に移植し継 代培養した。 （以後、この工程で得られた培養物を MS0培養物と称する。 ) The MSD culture obtained in (2) was transplanted into a medium having the same composition as the MSD medium except that 2, 4-D was not contained (hereinafter this medium is referred to as MS0). Incubation was performed at 25 ° C without irradiation. If the number of days exceeds 30 days, transfer and transfer to the same medium. Subcultured. (Hereafter, the culture obtained in this step is called MS0 culture.)
[0089] (4)培養物の抗菌活性の測定 [0089] (4) Measurement of antibacterial activity of culture
上記（2)および（3)で得られた MS0培養物の抗菌活性を測定した。以下の表 3に 示す真菌類を、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（NBRC)より分譲を受けて、 PDA培地上での成長を比較するこ とにより培養物の抗菌活性を調べた。  The antibacterial activity of the MS0 culture obtained in (2) and (3) above was measured. The fungi listed in Table 3 below were purchased from the National Institute of Biotechnology, Biotechnology Headquarters, Biogenetic Resources Division (NBRC), and the antibacterial properties of the cultures were compared by comparing the growth on PDA medium. The activity was examined.
[0090] [表 3] [0090] [Table 3]
表 3  Table 3
菌株 学名 植物病原菌としての菌名 番号  Strain Scientific name Bacterial name as plant pathogen No.
31226 Alternaria brassicicola アブラナ科黒スス病菌 31226 Alternaria brassicicola Brassicaceae
7642 Ascochyta pisi エンドゥ褐班病菌 7642 Ascochyta pisi Endo brown spot fungus
6531 Fusarium oxysporum r. sp. lycopersi ci トマト萎ちよう病菌  6531 Fusarium oxysporum r. Sp. Lycopersi ci Tomato wilt fungus
5279 Pyricularia oryzae イネいもち病菌  5279 Pyricularia oryzae rice blast fungus
[0091] まず、真菌類の培養寒天ディスク（9mm)を、 PDA培地の中央に、切り出した寒天 と入れ替えて設置した。その菌ディスクから同心円上に、 1. MS0培養物 2. MS0 培養物をオートクレーブしたもの（MS0培養物 +オートクレーブ）の 2点のサンプルを 設置した。 [0091] First, a fungal culture agar disk (9 mm) was placed in the center of the PDA medium, replacing the cut out agar. Two samples of 1. MS0 culture 2. MS0 culture autoclaved (MS0 culture + autoclave) were placed concentrically from the fungal disk.
[0092] 25°Cで、 5〜10日間培養し、各サンプル周辺でのコロニーの成長を観察した。抗 菌活性物質を培地上に溶出しているサンプルの周辺ではコロニーは同心円状には 広がらず、サンプルの周辺を避けるように成長する。表 3に示したそれぞれの菌につ いて上記の試験を行い、コロニーが各サンプルに到達した時点のサンプルと中心を 結んだコロニーの直径を測定することにより、抗菌活性の度合いを比較したグラフを 図 1〜4に示す。いずれの真菌類を用いた試験でも、 MS 0培養物に抗菌活性が認 められ、 MS0培養物 +オートクレーブは抗菌活性を全く示さなかった。各々の培養 物について、カルコン類化合物（キサントアンゲローノレ（XA)と 4 ハイド口キシデリシ ン (4HD) )の含有を下記の方法で測定した。すなわち、培養組織を凍結乾燥後、乾 燥物 50mgに対して lmlの 60%エタノール水溶液を加え、 30分間、室温で抽出を行 つた。次に抽出液を逆相系カラム（ODS— 80TsQA;東ソ一社製）を用いて HPLC で定量分析した。その結果、 MS0培養物と MS0培養物 +オートクレーブにはいず れもカルコンが検出された。この結果より、 MS0培養物にはカルコン以外の抗菌活 性を有する物質が存在することが示唆された。またカルコンが難水溶性であることか ら、上記の MS0培養物の抗菌活性は、寒天培地上に拡散し得る水溶性の抗菌物質 に起因することが予想された。 [0092] The cells were cultured at 25 ° C for 5 to 10 days, and colony growth around each sample was observed. The colony does not spread concentrically around the sample eluting the antibacterial substance on the medium, but grows so as to avoid the sample. A graph comparing the degree of antibacterial activity by performing the above test for each of the bacteria shown in Table 3 and measuring the diameter of the colony that connects the center of the sample when the colony reaches each sample. It is shown in Figs. In all fungal tests, the MS 0 culture showed antibacterial activity, and the MS0 culture + autoclave showed no antibacterial activity. Each culture was measured for the content of chalcone compounds (Xanthoangelonore (XA) and 4-Hydoxydelicin (4HD)) by the following method. That is, after freeze-drying the cultured tissue, 1 ml of 60% ethanol aqueous solution was added to 50 mg of the dried product, and extraction was performed for 30 minutes at room temperature. Next, the extract was subjected to HPLC using a reverse phase column (ODS-80TsQA; manufactured by Tosohichi Co., Ltd.). Was quantitatively analyzed. As a result, chalcone was detected in both MS0 culture and MS0 culture + autoclave. From these results, it was suggested that substances having antibacterial activity other than chalcone exist in the MS0 culture. In addition, since chalcone is poorly water-soluble, the antibacterial activity of the MS0 culture was expected to be caused by a water-soluble antibacterial substance that can diffuse on the agar medium.
[0093] 実施例 2 DNAマイクロビーズアレイ解析によるディフェンシン遺伝子の単離  Example 2 Isolation of defensin gene by DNA microbead array analysis
DNAマイクロビーズアレイ解析により遺伝子の発現の状態を観察することにより、 抗菌物質を生産して!/、る遺伝子あるいは抗菌活性物質の同定を試みた。  By observing the expression status of genes by DNA microbead array analysis, we tried to identify the genes or antibacterial active substances that produced antibacterial substances!
[0094] (1)試料の調製  [0094] (1) Sample preparation
実施例 1で得られた MSO培養物および MSD培養物からトリゾル試薬 (ギブコ社製) により全 RNAを抽出した。  Total RNA was extracted from the MSO culture and MSD culture obtained in Example 1 with Trizol reagent (Gibco).
[0095] (2)タグライブラリー作製  [0095] (2) Tag library creation
米国公開公報第 2004/0002104号記載のタグベクター pMBSlを BamHIおよ び Bbsl〔いずれもニュー イングランド バイオラブ（NEB)社製〕により消化したあと、 ゥシ小腸アルカリホスファターゼ（CIAP、タカラバィォ社製）により脱リン酸処理を行 つた。 MS0培養物由来の全 RNAlO ^ gを铸型とし、配列表の配列番号 61で示され るビォチン化プライマーを用いて 5'—メチル化 dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTPを 基質として M— MLV RTase (タカラバイオ社製）で逆転写反応を行い、続いて 5' —メチル化一 dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTPを基質として RNaseH、 E. coli DNA ligase, E. coli DNA polymerase I (いずれもタカラバィォ社製）にて 2nd str and合成を行い、合成した二本鎖 cDNAを、フエノール処理、クロ口ホルム処理、エタ ノーノレ沈殿 ίこより精製し、 400 1の丁 E緩衝溶 ί夜 10mM Tris -HCl pH7. 5, 1 mM EDTA)に溶解した。 UR—20P (トミー精ェ社製）により 15秒間の超音波処理 を 4回行った後、 CIAPにより脱リン酸処理を行った。この DNAをフエノール処理、ク ロロホルム処理、エタノール沈殿によって精製し、タカラ Blunting Kination Ligat ionキット（タカラバイオ社製）を用いて末端の平滑化とリン酸化を行った。ァガロース ゲル電気泳動により DNAを分離し、 400— 600bpのゲノレブロックを切り出し、 QIAG EN gel purification Kit (キアゲン社製）により DNAを抽出した。この DNAを 1 mgのダイナビーズ M— 280ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナ ル社製）に、 25°Cで 30分間結合させ、 MPC (ダイナル社製）に 30秒間静置した後、 上清を除去した。 lxBW緩衝液（10mM Tris— HCl pH7. 5, ImM EDTA,After digesting the tag vector pMBSl described in US Publication No. 2004/0002104 with BamHI and Bbsl (both manufactured by New England Biolab (NEB)), the urine small intestine alkaline phosphatase (CIAP, manufactured by Takarabio) Dephosphorization was performed. Total RNAlO ^ g derived from MS0 culture is used as a cocoon type, and 5'-methylated dCTP, dATP, dGTP, and dTTP as substrates using the biotinylated primer shown in SEQ ID NO: 61 in the Sequence Listing. Reverse transcription reaction with Takara Bio, followed by 5'-methylation dCTP, dATP, dGTP, dTTP as substrates RNaseH, E. coli DNA ligase, E. coli DNA polymerase I (all from Takara Bio) ) 2nd str and synthesize, and the synthesized double-stranded cDNA is purified from phenol treatment, black mouth form treatment, ethanol precipitation, and 400 1 D E buffer solution. 10 mM Tris-HCl pH 7.5 , 1 mM EDTA). After 15 times of sonication with UR-20P (Tomy Seye) 4 times, dephosphorylation with CIAP was performed. The DNA was purified by phenol treatment, chloroform treatment, and ethanol precipitation, and the ends were blunted and phosphorylated using a Takara Blunting Kination Ligate ion kit (manufactured by Takara Bio Inc.). DNA was separated by agarose gel electrophoresis, 400-600 bp genomic block was excised, and DNA was extracted by QIAG EN gel purification Kit (Qiagen). This DNA 1 mg Dynabeads M—280 Streptavidin (Magnetic Streptavidin Beads, manufactured by Dynal) was bound at 25 ° C for 30 minutes, allowed to stand on MPC (Dinal) for 30 seconds, and the supernatant was removed. . lxBW buffer (10 mM Tris—HCl pH 7.5, ImM EDTA,
2. OM NaCl)によりビーズの洗浄を行った後、内部に Sfa NI部位を持つァダプ ター DNAを添加し、 T4 DNA ligase (タカラバイオ社製）により、 16°C、一晩、ライ ゲーシヨン反応を行った。なお、アダプター DNAは、配列表の配列番号 62で示され るオリゴヌクレオチドと配列表の配列番号 63で示されるオリゴヌクレオチドをァニール させたものである。アダプターが連結された DNAを含むアビジンビーズ懸濁液を铸 型とし、 PCRを行った。 cDNAのポリ A側のプライマーには、 5'側に Sfa NI認識配 列を揷入しておいた。 PCR産物の一部を Sfa NIで消化した後、ダイナビーズ M— 2 80ストレプトアビジン（ダイナル社製）に結合させ、回収した上清 DNAを、フエノール 処理、クロ口ホルム処理、エタノール沈殿により精製した。 2. Wash the beads with OM NaCl), add adapter DNA with Sfa NI site inside, and perform ligation reaction at 16 ° C overnight with T4 DNA ligase (Takara Bio). went. The adapter DNA is obtained by annealing an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 62 in the sequence listing and an oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 63 in the sequence listing. PCR was performed using a suspension of avidin beads containing the DNA to which the adapter was linked as a cage. Sfa NI recognition sequence was inserted on the 5 'side of the primer on the poly A side of the cDNA. A portion of the PCR product was digested with Sfa NI, then bound to Dynabeads M-280 Streptavidin (manufactured by Dynal), and the recovered supernatant DNA was purified by phenol treatment, Kuroguchi form treatment, and ethanol precipitation. .
この断片ィ匕 DNAと Brenner S.他 12名 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 年 vol. 97, pl665- 1670 の方法にて直鎖ィ匕した pMBS lを T4 DNA Ligas e (タカラバイオ社製）により連結し、得られた組換えプラスミドを用いたエレクトロボレ ーシヨンにより Ε· coli TOP 10 (インビトロジェン社製）を形質転換した。クローン数 1 00万相当の培養物から QIAGEN Plasmid Midi Kit (キアゲン社製）を用いてプ ラスミド DNAを精製し、タグライブラリーを得た。  This fragment DNA and Brenner S. and 12 others Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 vol. 97, pl665-1670 pMBS l was linearized and T4 DNA Ligas e (Takara Bio Inc. And then, E. coli TOP 10 (manufactured by Invitrogen) was transformed with the electroboration using the obtained recombinant plasmid. Using a QIAGEN Plasmid Midi Kit (Qiagen), the plasmid DNA was purified from a culture equivalent to 100 million clones to obtain a tag library.
(3)マイクロビーズの調製 (3) Preparation of microbeads
(2)で得られたタグライブラリーを铸型にして、上記 Proc. Natl. Acad. Sci. USA Using the tag library obtained in (2) as a saddle, the above Proc. Natl. Acad. Sci. USA
2000年 vol. 97、 pl665— 1670 記載の方法を一部改良し PCRを行った。 PC Rは 5'—メチル化 dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTPを基質とし、プライマーには配列 表の配列番号 64で示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号 65で示される FAMで標 識したものと配列表の配列番号 65で示されるオリゴヌクレオチドをビォチン化したも のを 9 : 1の比率で混合した混合オリゴヌクレオチドを用い、 Ex Taq Hot Start V ersion (タカラバイオ社製）にて反応した。その後上記 Proc. Natl. Acad. Sci. US A 2000年 vol. 97、 pl665— 1670 記載の方法に従い、制限酵素 Pad (NEB 社製）による消化及び T4 DNAポリメラーゼ（NEB社製）によるタグ部分の 1本鎖化 を fiつた。 2000 vol. 97, pl665—A method described in pl665—1670 was partially improved to perform PCR. PCR uses 5'-methylated dCTP, dATP, dGTP, and dTTP as substrates, and the primer is the oligonucleotide shown by SEQ ID NO: 64 in the sequence listing and the FAM shown by SEQ ID NO: 65 and the sequence listing The reaction mixture was reacted with Ex Taq Hot Start Version (manufactured by TAKARA BIO INC.) Using a mixed oligonucleotide prepared by biotinylating the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 65 in a ratio of 9: 1. Then, according to the method described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 vol. 97, pl665-1670, digestion with restriction enzyme Pad (NEB) and tag part 1 with T4 DNA polymerase (NEB) Main chain Fi.
[0097] 1本鎖タグつき標的 DNA断片 150 gと、アンチタグが結合したマイクロビーズ 2· 7  [0097] Single-stranded tagged target DNA fragment 150 g and anti-tag-bound microbeads 2 · 7
X 107個を混合し、 500〃1の 500mM NaCl、 10mM リン酸ナトリウム、 0. 01 % Tween 20、 3%デキストラン硫酸中で 69°C、 4日間ハイブリダィズさせた。マイクロ ビーズを 14· 3mM Tris— HCl (pH8)、 1. 43mM EDTA、 0· 02% Tween 2 0に続き、 lOmM Tris-HCl (pH7. 5)、 lOmM MgCl、 ImM Dithiothreitol Seven X 10 cells were mixed and hybridized in 69 ° C., 500 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate, 0.01% Tween 20, 3% dextran sulfate at 69 ° C. for 4 days. Microbeads in 14 · 3mM Tris—HCl (pH8), 1.43mM EDTA, 0 · 02% Tween 20 followed by lOmM Tris-HCl (pH7.5), lOmM MgCl, ImM Dithiothreitol
2  2
、 50mM NaCl, 0. 01 % Tween 20で洗浄した後、 T4 DNAリガーゼを作用さ せることによって標的 DNA断片とアンチタグの間に共有結合を形成させた。その後、 600 Gダイナビーズ M— 280ストレプトアビジン（磁性ストレプトアビジンビーズ、ダ イナル社製）に 25°Cで 30分間結合させ、 MPC (ダイナル社製）に 1分間静置した後 、上清を除去した。 10mM Tris— HCl (pH8)、 ImM EDTA、 0. 01 % Tween 20 lmLにて再懸濁し、 MPC (ダイナル社製）に静置した後、上清を除去するとい う洗浄操作を繰り返し、 1本鎖タグつき標的 DNA断片の載ったマイクロビーズのみを 分離した。  After washing with 50 mM NaCl, 0.01% Tween 20, a T4 DNA ligase was allowed to act to form a covalent bond between the target DNA fragment and the anti-tag. Then, bind to 600 G Dynabeads M-280 Streptavidin (Magnetic Streptavidin Beads, manufactured by Dinal) for 30 minutes at 25 ° C, and allow to stand on MPC (Dynal) for 1 minute, then remove the supernatant did. 10ml Tris—HCl (pH8), ImM EDTA, 0.01% Tween 20ml mL, resuspend in MPC (Dinal), and then repeat the washing procedure to remove the supernatant. Only microbeads carrying target-tagged DNA fragments with strand tags were isolated.
分離したマイクロビーズを Spelで消化し、ダイナビーズ M— 280ストレプトアビジン（ 磁性ストレプトアビジンビーズ、ダイナル社製）より切り出した。最後に、アルカリ処理 による一本鎖化を行った。  The separated microbeads were digested with Spel and cut out from Dynabeads M-280 streptavidin (magnetic streptavidin beads, manufactured by Dynal). Finally, single strands were formed by alkali treatment.
[0098] (4)競合ハイブリダィゼージョン [0098] (4) Competitive hybridization
MS0培養物、および MSD培養物由来の全 RNA各 lO ^ gを铸型とし、配列表の 配列番号 61で示される T7プロモーター配列付きのオリゴヌクレオチドをプライマーと して、 M— MLV逆転写酵素（タカラバイオ社製）により cDNA合成を行った。この cD NAを铸型として、 T7 RNA polymease (タカラバイオ社製）により RNAを合成した 。なお、 MSD培養物由来の cDNAには Fluorescein— dUTPを、 MS0培養物由来 の cDNAには Cy5— dUTPを取り込ませ、 RNAプローブを得た。これらのプローブ を、上記（3)で作製したマイクロビーズ 20万個につ!/、てハイブリダィゼーシヨンを行つ た。 lxSSC/0. 1 % SDS、次レヽで、 0. lxSSC/0. l 0/0SDS iこよる洗净を ί亍った 後、 MoFloサイトメーター（ダコ サイトメーシヨン社製）を用いて解析を行った。 MS0 培養物に特異的に発現量が上昇した遺伝子が結合したマイクロビーズを含む領域よ り、全マイクロビーズ数の 1 %相当をソートした。 Each RNA lO ^ g derived from MS0 culture and MSD culture is in a saddle shape, and M-MLV reverse transcriptase (with the T7 promoter sequence shown in SEQ ID NO: 61 in the sequence listing as a primer) CDNA synthesis was performed by Takara Bio. Using this cDNA as a saddle, RNA was synthesized by T7 RNA polymease (manufactured by Takara Bio Inc.). Fluorescein-dUTP was incorporated into the cDNA derived from the MSD culture, and Cy5-dUTP was incorporated into the cDNA derived from the MS0 culture to obtain an RNA probe. These probes were hybridized to 200,000 microbeads prepared in (3) above. lxSSC / 0. 1% SDS, in the next Rere, after was ί Tsu a 0. lxSSC / 0. l 0/ 0 SDS i Koyoru CLEANING, analyzed using a MoFlo cytometer (Dako cytometer Chillon Co., Ltd.) Went. An area containing microbeads to which a gene whose expression level was specifically increased is bound to the MS0 culture. 1% of the total number of microbeads was sorted.
[0099] (5)選択的クローニング  [0099] (5) Selective cloning
ソートされたビーズの一部、約 1200個相当を铸型とし、配列表の配列番号 66で示 されるオリゴヌクレオチドと、配列表の配列番号 67で示されるオリゴヌクレオチドをブラ イマ一に用いて、 PCRにより、マイクロビーズ上の DNAを増幅した。 SfaNIで消化し た後、 DNA断片を精製し、 pUC19を BsmBIをマルチクローニングサイトに持つよう に改変して作製したプラスミドベクター pMSLlを BamHI、 BsmBIで消化し直鎖化し たものに、 Takara ligation kit Mighty Mix (タカラバイオ社製）を用いて連結し た。得られたクローン、つまり、 MS0培養物に特異的に発現量が上昇した遺伝子断 片を含むクローン約 1200個をシークェンス解析した。パラセルクラスタリングパッケ一 ジ (パラセル社）によるクラスタリング解析を行った結果、上記クローンの配列は 86種 類に分類された。 nrデータベースに対して BLAST検索を行った結果、 MS0培養物 に特異的に発現している mRNAの約 6%という高い率でディフェンシン様の配列が 大量に発現して!/、ることがわ力 た。  A portion of the sorted beads, equivalent to about 1,200, is used as a cage, and the oligonucleotide shown by SEQ ID NO: 66 in the sequence listing and the oligonucleotide shown by SEQ ID NO: 67 in the sequence listing are used as a primer. DNA on the microbead was amplified by PCR. After digestion with SfaNI, the DNA fragment was purified, and the plasmid vector pMSLl prepared by modifying pUC19 to have BsmBI at the multiple cloning site was linearized by digestion with BamHI and BsmBI. Takara ligation kit Mighty Ligation was performed using Mix (Takara Bio). The obtained clones, that is, about 1200 clones containing gene fragments whose expression level specifically increased in the MS0 culture, were subjected to sequence analysis. As a result of the clustering analysis by Paracel Clustering Package (Paracel), the clone sequences were classified into 86 types. As a result of a BLAST search against the nr database, a large amount of defensin-like sequences were expressed at a high rate of about 6% of the mRNA specifically expressed in MS0 cultures! It was.
[0100] (6)ァシタバ由来ディフェンシン遺伝子の全長の解析  [0100] (6) Analysis of the full-length defensin gene derived from citrus
ァシタパ由来ディフェンシンの候補配列を（5)のクラスタリングの結果より集めた。 4 9の候補配列があり、その配列をもとにアッセンブルし、 32種類の遺伝子配列を決定 した。この cDNAの配列を配列番号 27〜58に示した。また、これらの配列がコードす るアミノ酸の配列を配列番号 1〜24に示した。また SignallPプログラムによるシグナ ルペプチドの検索の結果、各々のペプチドの配列において、シグナルペプチドと推 定される部分が推定された。これらの結果を、前述の表 1に示す。  The candidate sequences of vacitapa-derived defensin were collected from the clustering results of (5). There are 9 9 candidate sequences, which were assembled based on the sequences and 32 types of gene sequences were determined. The sequence of this cDNA is shown in SEQ ID NOs: 27-58. In addition, the amino acid sequences encoded by these sequences are shown in SEQ ID NOs: 1-24. In addition, as a result of searching for signal peptides using the SignallP program, it was estimated that each peptide sequence was assumed to be a signal peptide. These results are shown in Table 1 above.
[0101] 実施例 3 ァシタバ由来ディフェンシンの mRNA量およびペプチド量の測定  [0101] Example 3 Measurement of mRNA amount and peptide amount of defensin from citrus
( 1 )リアルタイム RT— PCRによるァシタバ由来ディフェンシンの mRNA量の比較 本発明のァシタバ培養物中のァシタバ由来ディフェンシンの mRNA量を比較し、 調べるためにリアルタイム PCRを行った。試料は、 MS0培養物、 MSD培養物、種子 力、ら栽培して 1年たつたァシタパの葉、茎、芽、根元、根毛、主根を回収または採取し て、液体窒素中で乳鉢にて破砕し、トリゾル試薬 (ギブコ社製）により全 RNAを抽出し た後、 RNase free DNasel (タカラバイオ社製）によりゲノム DNAを除去した。逆 転写反応およびリアルタイム PCRは、 SYBR RT-PCR Kit (Perfect Real Ti me) (タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った。すなわち、全 R NAを鍀型とし、 Random hexamerをプライマーに用いた逆転写反応により一本鎖 cDNAを合成した。なお、 MS0培養物の全 RNAについては、検量線作成用として、 段階希釈したものを用いた。次に、各試料から調製した一本鎖 cDNAを铸型とし、 S mart Cycler II System (Cepheid社製）によるリアルタイム PCRを行った。ァシタ バ由来ディフェンシン遺伝子の増幅には、配列表の配列番号 68および 69記載の塩 基配列を有するプライマーを用いた。コントロールのハウスキーピング遺伝子としたポ リュビキチン遺伝子の増幅には、配列表の配列番号 70および 71記載の塩基配列を 有するプライマーを用いた。上記プライマー対を用いてリアルタイム PCR実施後、得 られた Ct値をそれぞれの検量線に代入し、初期铸型量を算出した。ポリュビキチン の発現量により、個体間の RNA量を補正した後、各試料におけるァシタパ由来ディ フェンシン遺伝子の mRNAの相対量、すなわち MSD培養物におけるァシタバ由来 ディフェンシン遺伝子の mRNAの発現量を 1とした場合の含量を算出した。その結 果を図 5に示す。図 5中、縦軸は MSD培養物に対するァシタバ由来ディフェンシン 遺伝子の発現量に対する相対倍率を示し、横軸は、試料の種類を示す。ァシタパの 培養細胞および植物体の各組織間において、ァシタバ由来ディフェンシンの mRNA 量を比較したところ、 MS0培養物においては MSD培養物やその他の植物体組織に 比較して、約 5〜200倍のァシタバ由来ディフェンシンの mRNAが発現していること カゎカゝつた。 (1) Real-time RT—Comparison of mRNA amount of defensin derived from citrus by real-time PCR Real-time PCR was performed in order to compare and examine the amount of mRNA of defensin derived from citrus in the citrus culture of the present invention. Samples were collected or collected from the leaves, stems, buds, roots, root hairs, and main roots of ashipapa grown for 1 year after cultivating MS0 culture, MSD culture, seed strength, and crushed in a mortar in liquid nitrogen. After extracting total RNA with Trizol reagent (Gibco), genomic DNA was removed with RNase free DNasel (Takara Bio). Reverse Transcription reaction and real-time PCR were performed using SYBR RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the attached protocol. That is, single-stranded cDNA was synthesized by reverse transcription using all RNAs as cages and Random hexamer as a primer. As for the total RNA of MS0 culture, serially diluted one was used for preparing a calibration curve. Next, the single-stranded cDNA prepared from each sample was used as a saddle shape, and real-time PCR was performed using the Smart Cycler II System (Cepheid). Primers having the base sequences described in SEQ ID NOs: 68 and 69 in the sequence listing were used for amplification of the defensin gene derived from citrus. For amplification of the polyubiquitin gene as a control housekeeping gene, primers having the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 70 and 71 in the Sequence Listing were used. After carrying out real-time PCR using the above primer pairs, the obtained Ct value was substituted into each calibration curve to calculate the initial template amount. After correcting the RNA amount between individuals by the expression level of polyubiquitin, the relative amount of mRNA of assipaca-derived defensin gene in each sample, that is, the amount of mRNA expression of assicitabium-derived defensin gene in MSD culture is taken as 1. The content was calculated. Figure 5 shows the results. In FIG. 5, the vertical axis represents the relative magnification of the expression level of the citrus-derived defensin gene with respect to the MSD culture, and the horizontal axis represents the type of sample. A comparison of the amount of mRNA of defensin derived from vasitapa between cultured cells of vacitapa and each tissue of the plant revealed that the MS0 culture had about 5 to 200 times more assitababa than the MSD culture and other plant tissues. The expression of the defensin-derived mRNA.
(2)ウェスタンブロッテイングによるァシタバ由来ディフェンシンのペプチド量の測定 本発明のァシタバ培養物中の抗菌ペプチドァシタバ由来ディフェンシンのペプチド 含量を比較、調べるためにウェスタンブロッテイング解析を行った。試料は、 MS0培 養物、 MSD培養物、種子から栽培して 1年たつたァシタパの葉、茎、芽、根元、根毛 、主根から回収または採収し、液体窒素中ですりつぶした後に、抽出バッファーで抽 出した。すなわち、約 25gの植物組織を液体窒素中で乳鉢にて破砕した後、約 50ml の緩衝液（10mM NaH PO 、 15mM Na HPO 、 lOOmM KCL 2mM EDT (2) Measurement of peptide amount of detercin derived from citrus by Western blotting Western blotting analysis was performed in order to compare and examine the peptide content of the antibacterial peptide definitin in the citrus culture of the present invention. Samples were collected or collected from MSO culture, MSD culture, and leaves of ashitapa, stems, buds, roots, root hairs, and main roots grown from seeds for 1 year and ground in liquid nitrogen before extraction. Extracted with buffer. That is, about 25 g of plant tissue was crushed in a mortar in liquid nitrogen and then about 50 ml of buffer solution (10 mM NaH PO, 15 mM Na HPO, lOOmM KCL 2 mM EDT
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Aになるように超純水に溶力、した）にカテキン類、カルコン類などのポリフエノール類 の吸着を取り除くために 1 · 5% (w/v)の PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone)およ びプロテアーゼ阻害剤として ImM PMSFを加えた抽出緩衝液を加えて 4°C、 2時 間かくはんしながら抽出した。次に 7000g、 20分の遠心分離で上清を得た。これを 粗タンパク液として、硫安分画に用いた。硫安分画は一般的な生化学の方法により 行い試験用抽出液とした。抽出サンプルは、 BCA Protein Assayキット（PIERC E社製）で総タンパク量を定量した。抽出サンプルの一部を用いて SDS— PAGE後 、トランスブロット SDセル (バイオラッド社製）を用いてウェスタンブロッテイングを行つ た。ブロッテイングしたメンブレンは抗体によるディフェンシン検出のためにハイプリバ ック（コスモバイオ社製）にいれて反応に供した。 1次抗体として、配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列の 3；!〜 45番に相当するアミノ酸配列からなる合成ペプチド N、 配列番号 1に示すアミノ酸配列の 47〜58番に相当するアミノ酸配列からなる合成ぺ プチド M、及び配列表の配列番号 1に示すアミノ酸配列の 78〜87番に相当するアミ ノ酸配列からなる合成ペプチド Cを作製して、各合成ペプチド 2mgを抗原にしてゥサ ギ 1羽をそれぞれ免疫し、 51日後に採血して、ポリクローナル抗体 AD— N、 AD-M 及び AD— Cを作製した。なお、合成ペプチド M及び Cのアミノ酸配列は配列表の配 列番号 1、 25及び 26に含まれる配列であり、合成ペプチド Nのアミノ酸配列は配列 表の配列番号 1及び 25に含まれる力 S、配列表の配列番号 26には含まれない配列で ある。上記の 3種の 1次抗体でそれぞれ 1時間反応し、洗浄後、市販の抗ゥサギ HRP 標識 2次抗体（ザィムド社製）で 1時間反応、洗浄した。さらに、 TrueBlue Peroxida se Substrate (KPL社製）を用いて反応、発色することにより検出した。ァシタパの 培養細胞において、ァシタパ由来ディフェンシンタンパク質を検出したところ、 MS0 培養物においては AD— N、 AD— M及び AD— Cのいずれの抗体でもァシタバ由 来ディフェンシンタンパク質を検出できた力 S、 MSD培養物においては AD— N抗体 で検出できず、 AD— M、 AD— C抗体で弱いながらも検出できた。植物体の組織か らのサンプルについては、サンプル量を大量に使用することで、 AD— M、 AD— C抗 体でァシタバ由来ディフェンシンタンパク質を検出できる力 S、茎および芽生えでは検 出量が少なかった。また、 AD— N抗体で植物体組織中のァシタバ由来ディフェンシ ンタンパク質を検出したところ、種子でのみ検出できた。 [0103] 実施例 4 ァシタパ培養物からの粗タンパク抽出物の抗菌活性 Polyphenols such as catechins and chalcones were dissolved in ultrapure water to become A) Extraction was carried out at 4 ° C for 2 hours with the addition of extraction buffer containing 1/5% (w / v) PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone) and ImM PMSF as a protease inhibitor . Next, a supernatant was obtained by centrifugation at 7000 g for 20 minutes. This was used as a crude protein solution for ammonium sulfate fractionation. Ammonium sulfate fractionation was conducted by a general biochemical method to obtain a test extract. The extracted protein was quantified with BCA Protein Assay kit (PIERC E). A part of the extracted sample was subjected to SDS-PAGE, and then Western blotting was performed using a transblot SD cell (Bio-Rad). The blotted membrane was placed in a high protection (manufactured by Cosmo Bio) for detection of defensin with an antibody and subjected to the reaction. As a primary antibody, 3 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing; synthetic peptide N consisting of an amino acid sequence corresponding to! -45, amino acid sequence corresponding to 47-58 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 And synthetic peptide C consisting of amino acid sequences corresponding to amino acids 78 to 87 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and 2 mg of each synthetic peptide as an antigen. One rabbit was immunized, and blood was collected 51 days later to produce polyclonal antibodies AD-N, AD-M and AD-C. The amino acid sequences of the synthetic peptides M and C are the sequences included in SEQ ID NOs: 1, 25, and 26 in the sequence listing, and the amino acid sequence of the synthetic peptide N is the force S, included in SEQ ID NOS: 1 and 25 in the sequence listing. It is a sequence not included in SEQ ID NO: 26 in the Sequence Listing. Each of the above three primary antibodies was reacted for 1 hour, washed, and then reacted and washed with a commercially available anti-rabbit HRP-labeled secondary antibody (Zymed) for 1 hour. Furthermore, it detected by reacting and coloring with TrueBlue Peroxidase Substrate (manufactured by KPL). In the cultured cells of Ashitapa, the defensin protein derived from Ashitapa was detected. In the MS0 culture, any antibody of AD-N, AD-M and AD-C was able to detect the defensin protein derived from Ashitaba S, MSD culture The product could not be detected with the AD-N antibody, but could be detected with the AD-M and AD-C antibodies although they were weak. For samples from plant tissues, the ability to detect the defensin protein from Acitaba with AD-M and AD-C antibodies by using a large amount of sample S, the amount detected in stems and seedlings is small It was. In addition, when AD-N antibody was used to detect the defensin protein derived from citrus in plant tissues, it was detected only in the seeds. Example 4 Antibacterial Activity of Crude Protein Extract from Vashitapa Culture
実施例 3 (2)と同様にして、 MS0培養物および MSD培養物からペプチド溶液を調 製した。すなわち、約 25gの植物組織を液体窒素中で乳鉢にて破砕した後、約 50ml の緩衝液（10mM NaH PO 、 15mM Na HPO、 lOOmM KCL 2mM EDT  In the same manner as in Example 3 (2), peptide solutions were prepared from MS0 cultures and MSD cultures. That is, about 25 g of plant tissue was crushed in a mortar in liquid nitrogen, and then about 50 ml of buffer solution (10 mM NaH PO, 15 mM Na HPO, lOOmM KCL 2 mM EDT
2 4 2 4  2 4 2 4
Aになるように超純水に溶力、した）にカテキン類、カルコン類などのポリフエノール類 の吸着を取り除くために 1 · 5% (w/v)の PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone)およ びプロテアーゼ阻害剤として ImM PMSFを加えた抽出緩衝液を加えて 4°C、 2時 間かくはんしながら抽出した。次に 7000g、 20分の遠心分離で上清を得た。これを 粗タンパク液として、硫安分画に用いた。硫安分画は一般的な生化学の方法により 行い、 30〜70%飽和画分を試験用抽出液とした。この抽出液を用いて、以下の方 法で抗菌活性を調べた。表 3に示す各病原菌を PDA(Potato Dextrose Agar : DIFCO社製)培地に接種して、 25°Cで 8日間培養した。次にシャーレを無菌水で満 たしスパチュラで擦り取るように菌体胞子を集めた。集めた胞子は綿布で濾した後、 遠心分離（4000xg、 15分）により集めた。 2回洗浄した後、 1mlあたり 2X107個の胞 子になるように PDB (Potato Dextrose Broth)に懸濁し、濃度 20% (v/v)にな る様にグリセロールを添加して一 80°Cにストックした。次に、このストック胞子液から、 96ゥエルのプレート（FALCON製）の各ゥエルに 2000個の胞子を入れ、上記のぺ プチド溶液試料および PDBを加えて 25°Cで培養した。培養;!〜 2日後に胞子からの 発芽と菌糸の伸長を顕微鏡下で観察することにより抗菌性を判断した。その結果、い ずれの菌においても、 MS0培養物からの粗タンパク抽出物を添加した群では発芽菌 糸が殆ど伸長しないのに対して、 MSD培養物からの粗タンパク抽出物を添加した群 では若干の菌糸の伸長がみられた。以上より、 MS0培養物からの抽出物に特に強 い抗菌活性が認められた。 1) 5% (w / v) PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone) and protease inhibition to remove adsorption of catechins, chalcones and other polyphenols Extraction buffer containing ImM PMSF was added as an agent, and the mixture was extracted at 4 ° C for 2 hours with stirring. Next, a supernatant was obtained by centrifugation at 7000 g for 20 minutes. This was used as a crude protein solution for ammonium sulfate fractionation. Ammonium sulfate fractionation was carried out by a general biochemical method, and the 30-70% saturated fraction was used as the test extract. Using this extract, antibacterial activity was examined by the following method. Each pathogen shown in Table 3 was inoculated into PDA (Potato Dextrose Agar: DIFCO) medium and cultured at 25 ° C for 8 days. Next, cell spores were collected so that the petri dish was filled with sterile water and scraped with a spatula. The collected spores were filtered through a cotton cloth and then collected by centrifugation (4000 × g, 15 minutes). After washing twice, suspend in PDB (Potato Dextrose Broth) to 2X10 7 spores per ml, and add glycerol to a concentration of 20% (v / v). Stocked. Next, from this stock spore solution, 2000 spores were added to each well of a 96-well plate (manufactured by FALCON), and the above-mentioned peptide solution sample and PDB were added and incubated at 25 ° C. Culture;! ~ After 2 days, antibacterial activity was judged by observing germination and hyphal elongation from spores under a microscope. As a result, the germination mycelia hardly grew in the group to which the crude protein extract from the MS0 culture was added, while in the group to which the crude protein extract from the MSD culture was added in any group. Some hyphal elongation was observed. Based on the above, particularly strong antibacterial activity was observed in the extract from the MS0 culture.
[0104] 実施例 5 ァシタパ由来ディフェンシンの遺伝子工学的な製造  Example 5 Genetic engineering production of assipaca-derived defensin
ァシタパ由来ディフェンシンを遺伝子工学的に製造するために、大腸菌内で、マル トース結合タンパク (MBP)との融合タンパク質として発現させることを試みた。  To genetically engineer the defensin derived from assipaca, we tried to express it in E. coli as a fusion protein with maltose binding protein (MBP).
[0105] (1)プラスミドおよび形質転換体の作成  [1] Preparation of plasmid and transformant
実施例 2にて得られたァシタバ由来ディフェンシンを含むクローンのうち、配列表の 配列番号 41の核酸配列を有するクローン体 H338— U1L1— PCM— PI— H02を選 択した。このクローン体のグリセロール保存溶液を铸型にして、配列番号 72および 7 3で示されるプライマーを用いた PCRにより、約 200bpの DNA断片を増幅した。この 断片は配列番号 41で示されるァシタパ由来ディフェンシン遺伝子の塩基番号 107か ら 307の部分、すなわち配列表の配列番号 59で表される核酸配列を含む DNA断 片である。 PCR産物を EcoRIおよび Pstlで消化した後、 pMALp— 2xベクター（NE B製）にライゲーシヨンしてプラスミド pMBP— AkDEFlを得た。このプラスミドを用い て Ε· coli Rossetta (Novagen社製）または Ε· coli BL21 (タカラバイオ社製）を 形質転換し、得られた菌株をそれぞれ pMBP—AkDEFl/Ros、 pMBP—AkDE F1/BL21と命名した。配列表の配列番号 41の塩基番号 107から 148の部分は、 図 8に示すとおり、他の植物体由来のディフェンシン遺伝子配列と比較して、ァシタ バ由来ディフェンシン遺伝子に特異的に存在すると予想される部分である。上記の 部分を欠失させた部分遺伝子配列を取得する目的で、上記のクローンのグリセロー ル保存溶液を铸型にして、配列番号 73および 74で示されるプライマーを用いた PC Rにより、約 160bpの DNA断片を増幅した。この断片は配列番号 41で示されるァシ タパ由来ディフェンシン遺伝子の塩基番号 149から 307の部分、すなわち配列表の 配列番号 60で表される核酸配列を含む DNA断片である。この PCR産物を EcoRIお よび Pstlで消化した後、 pMALp2xベクター（NEB製）にライゲーシヨンしてプラスミド pMBP— AkDEF2を得た。このプラスミドを用いて Ε· coli Rossetta (Novagen社 製）または E. coli BL21 (タカラバイオ社製）を形質転換し、得られた菌株をそれぞ れ pMBP— AkDEF2/Ros、 pMBP— AkDEFl/BL21と命名した。コントローノレ として用いる大根のディフェンシンである AFP2ペプチドをコードする DNA断片を下 記の方法で得た。 Plant Geno— DNA— Template (Geno Technology社製）に より、大根の葉からゲノム DNAを抽出した。 GenBankのァクセッションナンバー U18 556. 1の配列情報より、配列番号 75および 76で示されるプライマーを用いた PCR により、約 160bpの DNA断片を増幅した。 PCR産物を EcoRIおよび Pstlで消化した 後、 pMAL— p2xベクター（NEB製）にライゲーシヨンしてプラスミド pMBP— RsAFP 2を得た。このプラスミドを用いて Ε· coli Rossetta (Novagen社製）または Ε· coli BL21 (タカラバイオ社製）を形質転換し、得られた菌株をそれぞれ pMBP— RsAFP 2/Ros、 pMBP— RsAFP2/BL21と命名した。 Among the clones containing ashci defensin obtained in Example 2, A clone H338-U1L1-PCM-PI-H02 having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 41 was selected. A glycerol stock solution of this clone was made into a saddle shape, and a DNA fragment of about 200 bp was amplified by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 72 and 73. This fragment is a DNA fragment containing the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 59 in the sequence listing, that is, the base number 107 to 307 portion of the defensin gene derived from Acitapa represented by SEQ ID NO: 41. The PCR product was digested with EcoRI and Pstl and ligated into pMALp-2x vector (manufactured by NE B) to obtain plasmid pMBP-AkDEFl. Using this plasmid, E. coli Rossetta (Novagen) or E. coli BL21 (Takara Bio) was transformed, and the resulting strains were named pMBP-AkDEFl / Ros and pMBP-AkDE F1 / BL21, respectively. did. As shown in Fig. 8, the portion of base numbers 107 to 148 of SEQ ID NO: 41 in the sequence listing is expected to be present specifically in the defensin gene derived from wasabi as compared to the defensin gene sequences derived from other plants. Part. For the purpose of obtaining a partial gene sequence from which the above portion has been deleted, the glycol stock solution of the above clone is made into a saddle shape, and approximately 160 bp by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 73 and 74. The DNA fragment was amplified. This fragment is a DNA fragment containing the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 60 in the sequence listing, that is, the base number 149 to 307 portion of the defensin gene derived from cifacta shown in SEQ ID NO: 41. This PCR product was digested with EcoRI and Pstl, and then ligated into pMALp2x vector (manufactured by NEB) to obtain plasmid pMBP-AkDEF2. Using this plasmid, Escherichia coli Rossetta (Novagen) or E. coli BL21 (Takara Bio) was transformed, and the resulting strains were designated as pMBP—AkDEF2 / Ros, pMBP—AkDEFl / BL21, respectively. Named. A DNA fragment encoding the AFP2 peptide, a radish defensin used as a controller, was obtained by the following method. Genomic DNA was extracted from radish leaves using Plant Geno-DNA-Template (Geno Technology). From the sequence information of GenBank accession number U18 556.1, a DNA fragment of about 160 bp was amplified by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 75 and 76. The PCR product was digested with EcoRI and Pstl and ligated into pMAL-p2x vector (manufactured by NEB) to obtain plasmid pMBP-RsAFP2. Using this plasmid, Ε · Coli Rossetta (Novagen) or Ε · Coli BL21 (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed, and the obtained strains were named pMBP-RsAFP 2 / Ros and pMBP-RsAFP2 / BL21, respectively.
[0106] (2)大腸菌における MBP融合タンパク質の発現  [0106] (2) Expression of MBP fusion protein in E. coli
pMBP— AkDEF 1/BL21、 pMBP— AkDEF2/BL21および pMBP— RsAF P2/BL21を、 25〃 g/ml アンピシリンおよび 20〃 g/mlのクロラムフエ二コール を加えた LB培地 5mLで 37°C終夜培養した。培養液の一部は 25 g/ml アンピシ リンおよび SO ^ g/ml クロラムフエ二コールを加えた LB培地 5mLに移し、培養液の OD600の値が 0. 4-0. 6になるまで 37°Cで培養した。培養液の OD値を確認後、 終濃度が 0. 3mMになるようにイソプロピル 0 D チォガラタトピラノシド（IPTG )を添加し、 15°Cで 24時間の培養後に遠心でその菌体を回収した。  pMBP—AkDEF 1 / BL21, pMBP—AkDEF2 / BL21 and pMBP—RsAF P2 / BL21 were cultured overnight at 37 ° C in 5 mL of LB medium supplemented with 25 〃 g / ml ampicillin and 20 〃 g / ml chloramphenicol. . A portion of the culture is transferred to 5 mL of LB medium supplemented with 25 g / ml ampicillin and SO ^ g / ml chloramphenicol, and 37 ° C until the OD600 of the culture reaches 0.4-0.6. In culture. After confirming the OD value of the culture solution, add isopropyl 0 D thiogalatatopyranoside (IPTG) to a final concentration of 0.3 mM, and collect the cells by centrifugation after incubation at 15 ° C for 24 hours. did.
[0107] (3)発現タンパク質の精製  [3] (3) Purification of expressed protein
上記（2)で回収した菌体を、 0. 5mlのカラムバッファー（20mM Tris— HC1、 0. 2 M NaCl、 ImM EDTA、 ImM DTT pH7. 4)に再懸濁し、 PMSF (終濃度 1 mM)およびァプロチュン（終濃度 10mM)を添加し、 SONIFIER 250D (BRANS ON)で超音波破砕した。破砕した菌体は、 1500rpmで 4°Cで 10分間遠心し、その 上清を精製に用いた。遠心後の沈殿は、 PreserveX—QML Polymeric Micelle s (QBI社製）を用いて可溶化後、アセトン沈殿を行い、 200 Lのカラムバッファーに 再懸濁した。カラムバッファーで平衡化した Amylose Magnetic Beads (NEB社 製） 0. 1mlに遠心回収した上清を添加し、 4°C、 60分間の転倒混和後、磁性スタンド を用いて上清を除去した。次いで、ビーズを 500〃 Lのカラムバッファ一にて 3回洗浄 した。洗浄後のビーズに、 10mMマルトースを加えたカラムバッファー 50 しを加え、 4°C、 10分間転倒混和し、上清を回収した。  The cells recovered in (2) above were resuspended in 0.5 ml column buffer (20 mM Tris—HC1, 0.2 M NaCl, ImM EDTA, ImM DTT pH 7.4) and PMSF (final concentration 1 mM) And Aprotune (final concentration 10 mM) were added and sonicated with SONIFIER 250D (BRANS ON). The disrupted cells were centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes at 4 ° C, and the supernatant was used for purification. The precipitate after centrifugation was solubilized using PreserveX-QML Polymeric Micelles (QBI), then subjected to acetone precipitation, and resuspended in 200 L column buffer. Amylose Magnetic Beads equilibrated with column buffer (manufactured by NEB) 0.1 ml of supernatant collected by centrifugation was added, mixed by inverting at 4 ° C for 60 minutes, and then removed using a magnetic stand. Next, the beads were washed three times with one 500 μL column buffer. 50 ml of column buffer added with 10 mM maltose was added to the washed beads, and the mixture was mixed by inverting at 4 ° C for 10 minutes, and the supernatant was recovered.
[0108] 実施例 3の（2)と同様の方法を用いてウェスタンブロッテイングを行った。 1次抗体と しては抗 MBP抗体（NEB社製）または実施例 3の（2)で得られた抗ディフェンシンポ リクローナル抗体 AD - Mを用レ、た。 pMBP—AkDEF 1 /BL21および pMBP— A kDEF2/BL21では、ァシタバ由来のディフェンシンポリペプチドと MBPタンパク質 の融合タンパク質が発現していることを確認した。また、 pMBP— RsAFP2/BL21 では、抗 MBP抗体を用いた場合には検出される力 抗ァシタパディフェンシンポリク ローナル抗体では反応しない MBPタンパク質の融合タンパク質が発現していること を確認した。 [0108] Western blotting was performed using the same method as in Example 3 (2). As the primary antibody, anti-MBP antibody (manufactured by NEB) or anti-defensin polyclonal antibody AD-M obtained in Example 3 (2) was used. In pMBP—AkDEF 1 / BL21 and pMBP—AkDEF2 / BL21, it was confirmed that a fusion protein of defensin polypeptide derived from vasitaba and MBP protein was expressed. In addition, with pMBP-RsAFP2 / BL21, the force detected when anti-MBP antibody is used. It was confirmed that a fusion protein of MBP protein that does not react with the local antibody was expressed.
[0109] pMBP— AkDEFl/BL21、 pMBP— AkDEF2/BL21および、 pMBP— RsA
Figure imgf000039_0001
100 1を100 8/1111 Ampicillinを含 む 100mlの LB培地に接種し、 37°Cで 1晚振とう培養した。 60mlの前培養液を 3Lの 同薬剤を含む LB培地に植え継ぎ、 37°C、 200rpm、通気量 2L/minで約 1. 5時間 振とう培養した。 OD600力 . 7付近になった時点で、 15°Cで 30分間培養後、 0. 3 mMとなるように IPTGを添加し、さらに 15°Cで 22時間培養した。培養液を遠心分離 により集菌後、— 80°Cで保存した。 [0109] pMBP— AkDEFl / BL21, pMBP— AkDEF2 / BL21, and pMBP— RsA
Figure imgf000039_0001
100 1 was inoculated into 100 ml of LB medium containing 100 8/1111 Ampicillin and cultured at 37 ° C for 1 shake. 60 ml of the preculture was transferred to 3 L of LB medium containing the same drug, and cultured with shaking at 37 ° C, 200 rpm, aeration rate of 2 L / min for about 1.5 hours. When the OD600 force reached around 7, after culturing at 15 ° C for 30 minutes, IPTG was added to a concentration of 0.3 mM, followed by further culturing at 15 ° C for 22 hours. The culture was collected by centrifugation and stored at -80 ° C.
[0110] 凍結した菌体を 200mM NaCl, ImM EDTA、及び ImM PMSFを含む 20m M Tris-HCl (pH7. 5)緩衝液 70mlに懸濁し、超音波破砕した。その後、遠心分 離（20, 000 X g、 30分）により可溶性画分を得た。  [0110] The frozen cells were suspended in 70 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 200 mM NaCl, ImM EDTA, and ImM PMSF, and sonicated. Thereafter, a soluble fraction was obtained by centrifugation (20,000 Xg, 30 minutes).
[0111] 得られた 76mlの可溶性画分について、 200mM NaCl, ImM EDTAを含む 20 mM Tris-HCl (pH7. 5)緩衝液で平衡化した 9mlの Amylose Resinカラムにァ プライした。 45mlの上記緩衝液で 2回洗浄した後、 200mM NaCl、 ImM EDTA 及び lOmM maltoseを含む 20mM Tris— HCl (ρΗ7· 5)緩衝液 9mlを用いて 5 回溶出した。得られた各融合タンパク質の含まれる溶出画分を vivaspin20 (分画分 子量 10, 000)で濃縮し、ミリ Q水に対して透析した。また、融合蛋白質 MBP— Ak DEF1には抗菌活性も認められた。  [0111] The obtained 76 ml soluble fraction was applied to a 9 ml Amylose Resin column equilibrated with 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer containing 200 mM NaCl and ImM EDTA. After washing twice with 45 ml of the above buffer, elution was performed 5 times using 9 ml of 20 mM Tris-HCl (ρΗ7.5) buffer containing 200 mM NaCl, ImM EDTA and lOmM maltose. The obtained elution fraction containing each fusion protein was concentrated with vivaspin20 (fraction fraction amount 10,000) and dialyzed against milli-Q water. The fusion protein MBP-Ak DEF1 also showed antibacterial activity.
[0112] (4)発現蛋白質からの MBP除去と抗菌活性の測定  [0112] (4) Removal of MBP from expressed protein and measurement of antibacterial activity
上記（3)の融合蛋白質 MBP— AkDEFl (9. 3mg/ml)、 MBP— AkDEF2 (6. 6mg/ml)または MBP— RsAFP2 (9. 2mg/ml)の各サンプル 400 1に 150 m M NaCl及び ImM CaClを含む 10mM Tris— HCl (ρΗ7· 5)緩衝液 1600〃1  In each sample 400 1 of the fusion protein MBP— AkDEFl (9.3 mg / ml), MBP— AkDEF2 (6.6 mg / ml) or MBP— RsAFP2 (9.2 mg / ml) of (3) above, 150 mM NaCl and ImM CaCl-containing 10 mM Tris—HCl (ρΗ7 · 5) buffer 1600〃1
2  2
ならびに FactorXaを 35U加え、 4°Cで 23時間反応させた。  In addition, 35 U of FactorXa was added and reacted at 4 ° C for 23 hours.
[0113] 反応終了後、各々の反応液を 150mM NaClを含む 50mM Tris-HCl (pH7. [0113] After completion of the reaction, each reaction solution was mixed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.
5)で平衡化した lmlの HiTrap Benzamidine FFカラムにアプライし、通過させた 。 3mlの同緩衝液の洗浄画分とまとめた 5mlを 200mM NaCl及び ImM EDTA を含む 20mM Tris -HCl (pH7. 5)で平衡化した 7mlの Amylose Resin カラム にアプライした。次ぎに、上記緩衝液 7mlで 2回洗浄した後、 10mM Maltoseを含 む上記緩衝液 7mlを用いて 3回溶出させた。 It was applied to an lml HiTrap Benzamidine FF column equilibrated in 5) and passed through. 7ml Amylose Resin column equilibrated with 20mM Tris-HCl (pH7.5) containing 200mM NaCl and ImM EDTA. Applied. Next, after washing twice with 7 ml of the above buffer, elution was performed 3 times with 7 ml of the above buffer containing 10 mM Maltose.
[0114] クロマト後の各々の Amylose Resin非吸着、洗浄画分をまとめて回収し、 vivaspi n6 (MWCO 3, 000)で濃縮後、ミリ Q水を添加、濃縮を繰り返し、 AkDEFl、 AkD EF2および RsAFP2のペプチド溶液を得た。得られた AkDEFl、 AkDEF2および RsAFP2ペプチド溶液の濃度、純度を定量するため、 SDS— PAGE解析を行った。 電気泳動は、 15%アクリルアミドゲノレ/トリス—トリシン緩衝液を用いて行い、 CBB染 色により解析を行った。 目的タンパク質の定量は、濃度既知の BSAのバンドより検量 線を求め算出した。純度は、レーン当たりの目的タンパク質の占める割合を算出した 。得られた AkDEFl及び AkDEF2は、それぞれ配列表の配列番号 25及び 26で表 されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。  [0114] Each Amylose Resin non-adsorbed and washed fraction after chromatography was collected together, concentrated with vivaspi n6 (MWCO 3,000), added milli-Q water, repeated concentration, AkDEFl, AkD EF2 and RsAFP2 A peptide solution was obtained. SDS-PAGE analysis was performed to quantify the concentration and purity of the resulting AkDEFl, AkDEF2 and RsAFP2 peptide solutions. Electrophoresis was performed using 15% acrylamide Genole / Tris-Tricine buffer and analyzed by CBB staining. The target protein was quantified by calculating a calibration curve from a BSA band of known concentration. For the purity, the ratio of the target protein per lane was calculated. The obtained AkDEFl and AkDEF2 are polypeptides having the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 25 and 26 in the sequence listing, respectively.
[0115] 実施例 3の（2)と同様の方法を用いてウェスタンブロッテイングを行った。 1次抗体と しては実施例 3の（2)で得られた抗ディフェンシンポリクローナル抗体である AD— N 、 AD— M及び AD— Cをそれぞれ用いた。その結果、一次抗体として AD— M及び AD— Cを用いた場合は AkDEFl及び AkDEF2のいずれのポリペプチドも検出され た力 AD— Nを用いた場合は AkDEFlのみ検出された。  [0115] Western blotting was performed using the same method as in Example 3 (2). As the primary antibodies, anti-defensin polyclonal antibodies AD-N, AD-M and AD-C obtained in (2) of Example 3 were used, respectively. As a result, when AD-M and AD-C were used as the primary antibody, both AkDEFl and AkDEF2 polypeptides were detected. When AD-N was used, only AkDEFl was detected.
[0116] 上記濃縮精製品を用いて、以下の方法で抗菌活性を調べた。まず表 2に示す各病 原菌を PDA(Potato Dextrose Agar : DIFCO社製）培地に摂取して、 25°Cで 8 日間培養した。次にシャーレを無菌水で満たしスパチュラで擦り取るように菌体胞子 を集めた。集めた胞子は綿布で濾した後、遠心分離 (4000 X g、 15分）により集めた 。 2回洗浄した後、 1mlあたり 2 X 107個の胞子になるように PDB (Potato Dextrose Broth)に懸濁し、濃度 20% (v/v)になる様にグリセロールを添加して 80°Cにス トツクした。次に、このストック胞子液から、 96ゥエルのプレート（FALCON製）の各ゥ エルに 2000個の胞子を入れ、上記のペプチド溶液試料および PDBを加えて 25°C で培養した（n = 3)。培養 1〜2日後に OD600を測定して n = 3の平均値を用いて増 殖曲線を描いた。試料濃度と増殖曲線から求めた阻害曲線を描いて、 50%阻害を 示す試料濃度を IC50として計算した結果、 Fusarium oxysporumに対する IC50 は、 AkDEFl力 g/ml、 AkDEF2および RsAFP2が 1 μ g/mlであり、非特許 文献「JBC, 267, 15301 , 1992年」上、最も強い植物ディフェンシンである RsA FP2と同じレベルの抗菌活性があることが確認できた。 [0116] The antibacterial activity was examined by the following method using the concentrated purified product. First, each pathogen shown in Table 2 was ingested in PDA (Potato Dextrose Agar: DIFCO) medium and cultured at 25 ° C. for 8 days. Next, cell spores were collected so that the petri dish was filled with sterile water and scraped with a spatula. The collected spores were filtered through a cotton cloth and collected by centrifugation (4000 × g, 15 minutes). After washing twice, suspend in PDB (Potato Dextrose Broth) to 2 × 10 7 spores per ml, and add glycerol to a concentration of 20% (v / v) to 80 ° C. Stocked. Next, from this stock spore solution, 2000 spores were added to each well of a 96-well plate (manufactured by FALCON), and the above peptide solution sample and PDB were added and incubated at 25 ° C (n = 3). . After 1-2 days of culture, OD600 was measured and a growth curve was drawn using the average value of n = 3. As a result of drawing an inhibition curve obtained from the sample concentration and growth curve and calculating the IC50 as the sample concentration showing 50% inhibition, the IC50 for Fusarium oxysporum is AkDEFl force g / ml, AkDEF2 and RsAFP2 is 1 μg / ml. Yes, non-patent According to the document “JBC, 267, 15301, 1992”, it was confirmed that the antibacterial activity of the same level as RsA FP2, which is the strongest plant defensin, was confirmed.
[0117] 実施例 6 明日葉ディフェンシンの安定性とプロテアーゼ耐性  [0117] Example 6 Stability and protease resistance of tomorrow defensins
(1)実施例 5で調製した AkDEFlまたは RsAFP2ペプチドのディフェンシンおよび 抗菌ペプチドとして知られるプロチォニン (タカラバイオ社製）を約 5ヶ月凍結保存、 数回の凍結融解を行ったサンプルを用意した。このサンプルを実施例 5と同様にして 、 Fusarium oxysporumniに対する IC50を算出した。その結果を図 6に示す。即 ち、図 6は、 5ヶ月間の保存安定性を示す図であり、縦軸は、保存前と比較した相対 活性であり、横軸は、供試サンプルのペプチド名である。  (1) The AkDEFl or RsAFP2 peptide defensin prepared in Example 5 and prothionine known as an antibacterial peptide (manufactured by Takara Bio Inc.) were stored frozen for about 5 months and subjected to freeze-thaw several times. IC50 for Fusarium oxysporumni was calculated for this sample in the same manner as in Example 5. The result is shown in Fig. 6. That is, FIG. 6 is a graph showing storage stability for 5 months, the vertical axis is the relative activity compared to before storage, and the horizontal axis is the peptide name of the test sample.
[0118] 図 6に示したように、 AkDEFlペプチドは、大根のディフェンシン RsAFP2や抗菌 ペプチドプロチォニンに比較して、保存安定性に優れ、むしろ抗菌活性が増大する ことが確認できた。  [0118] As shown in Fig. 6, it was confirmed that the AkDEFl peptide was superior in storage stability and rather increased in antibacterial activity compared to radish defensin RsAFP2 and the antibacterial peptide protonin.
[0119] (3)さらに、実施例 5で調製した AkDEFl、 AkDEF2ペプチドまたは RsAFP2ディフ ェンシンおよび抗菌ペプチドとして知られるプロチォニン（タカラバイオ社製）を 150 g/mlになるように 2. 5mM DTTを含む 10mM リン酸ナトリウム緩衝液に溶解 し、プロテアーゼとしてキモトリブシンを 100 g/mlになるように加えた。また、未処 理のコントロールとしてプロテアーゼを加えなレ、サンプルも調製した。このサンプルを 37°Cで 3時間反応したあとに、実施例 5と同様にして、 Fusarium oxysporumniに 対する IC50を算出した。  [0119] (3) Furthermore, AkDEFl, AkDEF2 peptide or RsAFP2 defensin prepared in Example 5 and prothionine (manufactured by Takara Bio Inc.) known as an antibacterial peptide are contained so as to be 150 g / ml. It was dissolved in 10 mM sodium phosphate buffer, and chymotrypsin was added as a protease to 100 g / ml. In addition, a sample and a sample with no protease added were prepared as an untreated control. After reacting this sample at 37 ° C for 3 hours, the IC50 for Fusarium oxysporumni was calculated in the same manner as in Example 5.
[0120] (4)この結果を図 7に示す。即ち、図 7は、プロテアーゼ耐性を示す図であり、縦軸は 、残存活性、つまり、プロテアーゼ未処理のコントロールと比較した相対活性であり、 横軸は、供試サンプルのペプチド名である。  [0120] (4) The results are shown in FIG. That is, FIG. 7 is a graph showing protease resistance, the vertical axis is the residual activity, that is, the relative activity compared to the protease-untreated control, and the horizontal axis is the peptide name of the test sample.
[0121] 図 7に示したように、明日葉のディフェンシン AkDEFl、 AkDEF2は、大根のディ フェンシン RsAFP2や抗菌ペプチドプロチォニンに比較して、プロテアーゼに耐性で あり、プロテアーゼ処理後も約 80%の残存活性があることが確認できた。  [0121] As shown in Fig. 7, tomorrow's defensin AkDEFl and AkDEF2 are more resistant to proteases than radish defensin RsAFP2 and antimicrobial peptide prothionine, and about 80% after protease treatment. It was confirmed that there was residual activity.
産業上の利用可能性  Industrial applicability
[0122] 本発明により、特定の培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織培 養物、もしくはそれらの処理物を有効成分として含有する抗菌剤が得られる。これに より安価で安全な抗菌剤を提供する事ができる。また本発明により、新規な抗菌作用 をもつタンパク質であるァシタバ由来のディフェンシンおよび該ディフェンシンをコー ドする核酸を得る事ができる。該ディフェンシンおよび該ディフェンシンをコードする 核酸は該ディフェンシンを高含有する抗菌剤の製造に非常に有用である。 [0122] According to the present invention, an antibacterial agent containing ascitapa cells and / or tissue culture obtained by a specific culture method or a processed product thereof as an active ingredient can be obtained. to this A cheaper and safer antibacterial agent can be provided. In addition, according to the present invention, a defensin derived from Ashitaba, which is a protein having a novel antibacterial action, and a nucleic acid encoding the defensin can be obtained. The defensin and the nucleic acid encoding the defensin are very useful for the production of an antibacterial agent having a high content of the defensin.
配列表フリーテキスト Sequence listing free text
SEQ ID NO: :61; ; Oligonucleotide used as a primer in a reverse transcriptionSEQ ID NO:: 61;; Oligonucleotide used as a primer in a reverse transcription
SEQ ID NO: :62; ; Oligonucleotide used as an adaptor SEQ ID NO:: 62;; Oligonucleotide used as an adaptor
SEQ ID NO: :63; ; Oligonucleotide used as an adaptor  SEQ ID NO:: 63;; Oligonucleotide used as an adaptor
SEQ ID NO: :64; ； PCR primer to amplify a cDNA library  SEQ ID NO:: 64;; PCR primer to amplify a cDNA library
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SEQ ID NO: :73; ； PCR primer to amplify a defensin cDNA  SEQ ID NO:: 73;; PCR primer to amplify a defensin cDNA
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SEQ ID NO: :75; ； PCR primer to amplify a radish genomic DNA  SEQ ID NO:: 75;; PCR primer to amplify a radish genomic DNA
SEQ ID NO: :76; ； PCR primer to amplify a radish genomic DNA  SEQ ID NO:: 76;; PCR primer to amplify a radish genomic DNA

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
[1] 工程（1)：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程、 及び  [1] Step (1): cultivating the tissue of assipaca in a medium containing a plant growth regulator, and
工程（2)：工程（1 )で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する 培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、  Step (2): culturing the culture obtained in Step (1) in a medium containing less than 0.2 mg / L auxins or a medium not containing auxins,
を含む培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織、もしくはそれらの処 理物を有効成分として含有することを特徴とする抗菌剤。  An antibacterial agent comprising, as an active ingredient, a cell and / or tissue of assipaca obtained by a culture method comprising:
[2] 工程（1)：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程、 及び [2] Step (1): culturing the tissue of assipaca in a medium containing a plant growth regulator, and
工程（2)：工程（1 )で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する 培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、  Step (2): culturing the culture obtained in Step (1) in a medium containing less than 0.2 mg / L auxins or a medium not containing auxins,
を含む培養方法により得られるァシタパの細胞及び/又は組織の処理物。  A processed product of cells and / or tissues of assipaca obtained by a culture method comprising
[3] 工程（1)：植物成長調節物質を含有する培地でァシタパの組織を培養する工程、 及び [3] Step (1): cultivating the tissue of assipaca in a medium containing a plant growth regulator, and
工程（2)：工程（1 )で得られた培養物を 0. 2mg/L未満のオーキシン類を含有する 培地もしくはオーキシン類を含有しない培地で培養する工程、  Step (2): culturing the culture obtained in Step (1) in a medium containing less than 0.2 mg / L auxins or a medium not containing auxins,
を包含することを特徴とするァシタパ由来のディフェンシンの製造方法。  A method for producing defensin derived from assipaca, comprising:
[4] 下記（a)または (b)から選択されるポリペプチド、 [4] a polypeptide selected from the following (a) or (b),
(a)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 (a) a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the Sequence Listing,
(b)前記（a)のポリペプチドのアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸残基の 置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列を有するポリぺ プチドであって、前記（a)のポリペプチドと同等な機能を有するものであるポリぺプチ ド、。 (b) a polypeptide having an amino acid sequence having at least one of substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues in the amino acid sequence of the polypeptide of (a), A polypeptide having a function equivalent to that of the polypeptide (a);
[5] 請求項 4記載のポリペプチドを有効成分として含有する抗菌剤。  [5] An antibacterial agent comprising the polypeptide according to claim 4 as an active ingredient.
[6] 下記 (c)〜（g)から選択される核酸、 [6] A nucleic acid selected from the following (c) to (g),
(c)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ ードする核酸、  (c) a nucleic acid that encodes a polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing;
(d)配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配列において 1もしくは数個の アミノ酸残基の置換、欠失、揷入、もしくは付加の少なくとも 1つを有するアミノ酸配列 を有するポリペプチドであって、配列表の配列番号 1〜26から選択されるアミノ酸配 列を有するポリペプチドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸、(d) 1 or several amino acids in the amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing A polypeptide having an amino acid sequence having at least one of substitution, deletion, insertion, or addition of an amino acid residue, the polypeptide having an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 26 in the sequence listing; A nucleic acid encoding a polypeptide having an equivalent function,
(e)配列表の配列番号 27〜60から選択される核酸、 (e) a nucleic acid selected from SEQ ID NOs: 27-60 in the sequence listing,
(f)前記（e)の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸であって、当 該核酸によってコードされるポリペプチド力 前記（e)の核酸によってコードされるポリ ペプチドと同等な機能を有する核酸、  (f) a nucleic acid that hybridizes with the nucleic acid of (e) above under stringent conditions, and has the same ability as a polypeptide encoded by the nucleic acid of (e). Having nucleic acid,
(g)前記（e)の核酸の塩基配列において、 1個もしくは数個の塩基の置換、欠失、揷 入、もしくは付加の少なくとも 1つを有する塩基配列を有する核酸であって、当該核酸 によってコードされるポリペプチド力 前記（e)の核酸によってコードされるポリぺプチ ドと同等な機能を有するポリペプチドをコードする核酸。  (g) a nucleic acid having a base sequence having at least one of substitution, deletion, insertion, or addition of one or several bases in the base sequence of the nucleic acid of (e), Encoded polypeptide power A nucleic acid encoding a polypeptide having a function equivalent to that of the polypeptide encoded by the nucleic acid of (e).
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