Verfahren zum gekoppelten enzym-immunchemischen Nachweis von Analyten mittels endogener Kalibratoren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zahlreichen Analyten, wie z.B. von Metaboliten und Antigenen in biologischen oder anderen flüssigen Proben, mittels Analysenelementen, insbesondere lateral-flow Teststreifen, Durchfluss- Membransystemen (flow-through Test), Wells/Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Röhrchen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind vor allem die medizinische Diagnostik, die pharmazeutische Industrie und der Umweltschutz. Analytische Elemente, wie z.B. immunochromatografische Testssysteme, zum Nachweis von zahlreichen Analyten in biologischen Flüssigkeiten oder zum Nachweis von Schadstoffen in Umweltproben sind seit Jahren bekannt und haben sich in der Praxis sehr bewährt. Sie arbeiten vornehmlich nach dem Sandwich- oder Konkurrenzprinzip (bei kleinen Analyten). Die Verwendung von Affinitätsassays, zum Beispiel Immunoassays, Rezeptor- und DNA-Assays, ist von immer größerer Bedeutung für klinische und zahlreiche andere Anwendungen. Dabei werden in verschiedenen Probenmatrices (z.B. Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Liquor oder Blut) sehr unterschiedliche Analyte nachgewiesen. Ein Problem stellt dabei gegenwärtig noch dar, dass zumindest ein Teil der genannten Matrices (z.B. Urin) in ihrer Verdünnung nicht konstant sind; im Tagesverlauf treten also deutliche Konzentrationsänderungen auf, die dem entsprechend den Analyt-Messwert beeinflussen. Für einzelne Körpermatrices sind jedoch endogen gebildete Substanzen beschrieben, mit deren Hilfe die jeweilige Verdünnung korrigiert werden kann; das System wird somit kalibrierbar (Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 5 2005; Norpoth K, Heger M (1984) Kreatinin als Bezugsgröße bei der Angabe von Stoffkonzentrationen im Harn. In: Hentschler D, Lehnert G (Hrsg) Biologische Arbeitsstoff-Toleranz-Werte (BAT-Werte)
Arbeitsmedizinischtoxikologische Begründungen, Bd. 1. Kommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der DFG). Ein Beispiel für diese, als endogene Kalibratoren fungierenden Substanzen ist das Kreatinin in der Probenmatrix Urin. Bei Spontan-Urinproben von gesunden Probanden sind Konzentrationsschwankungen zwischen 4 und 28 mmol Kreatinin je Liter Urin durchaus normal (Fundamentals of Laboratory Testing: Urine, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Vergleicht man diese Werte mit dem Durchschnittswert (15 mmol/l) des 24-Stunden
Urins, dann wird deutlich, dass eine Verdünnung um den Faktor 3,5 im Normbereich liegt, der Urin aber auch um den Faktor 2 aufkonzentriert sein kann. Bezogen auf einen Analyten, der in der Probenmatrix Urin bestimmt werden soll, heißt das: der ermittelte Messwert muss entsprechend korrigiert werden, es ist also eine Doppelbestimmung (endogener Kalibrator und Analyt) und eine anschließende Kalkulation notwendig. In der Praxis bedeutet das die Durchführung von zwei separaten Tests. Im Falle von Urin wird über eine enzymatische Kaskade zunächst die Kreatininkonzentration bestimmt und im zweiten Schritt die Menge des Analyten (meist immunchemisch). Diese Herangehensweise ist zeit- und arbeitsaufwendig. Die Aufgabe der Erfindung war deshalb, für Testsysteme, welche verschiedene Analyte in Probenmatrices mit nicht konstanten Konzentrationen bestimmen, neuartige Lösungen zu finden.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert. Sie betrifft ein Verfahren zum Nachweis von zahlreichen Analyten, wie z.B. von Metaboliten und Antigenen in biologischen oder anderen flüssigen Proben, mittels Analysenelementen, insbesondere lateral-flow Teststreifen, Durchfluss-Membransystemen (flow-through Test), Wells/Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Röhrchen, wobei das Verfahren auf miteinander gekoppelte Enzym- und Affinitätsreaktionen beruht und mittels endogener Kalibratoren realisiert wird.
Die Hauptidee besteht darin, dass enzym- und immunchemische Methoden gekoppelt werden und die Konzentration endogener Kalibratoren der jeweiligen Probenmatrix in das Gesamtergebnis mit einfließt, wobei die zu bestimmende Analytkonzentration durch das realisierte System automatisch korrigiert wird. Bei diesem kombinierten enzymatischen / immunologischen Testsystem, werden Körperflüssigkeiten mit einem Enzymmix inkubiert (Reaktion 1 ), wobei das bei der Inkubation durch Umwandlung des endogenen Kalibrators entstandene Wasserstoffperoxid (H2O2) teilweise oder vollständig in einer zweiten, jetzt Immunreaktion (Reaktion 2), mit der gleichen Körperflüssigkeit durch ein Markerenzym zur Signalbildung genutzt wird. Dieses Signal wird erfasst und mit dem Signal des in der 1. Reaktion entstandenen H2O2 verglichen oder verrechnet. Die beiden Reaktionen des Verfahrens können simultan oder sequentiell durchgeführt werden, ferner können sie in einem oder in 2 von einander getrennten Kompartiments durchgeführt werden. Als Kompartiments dienen bevorzugt lateral- flow Teststreifen, Durchfluss-Membransysteme (flow-through Test), Wells/Kavitäten von Mikrotiterplatten oder Röhrchen. Die Signalerfassung erfolgt gemäß der
Erfindung visuell (bloßes Auge), kolorimetrisch, durch Fluoreszenz oder elektrochemisch.
Die Auswertung wird mittels Nomogramm, Komparator (Referenzstreifen), Lesegerät oder bloßem visuellen Vergleich vorgenommen, wobei bei letzterem die Anzahl der mittels Kalibrator enzymatisch generierten Signale (z.B. Testlinien oder Testpunkte (Dots)) in das Verhältnis zu der Anzahl mittels Analyt immunologisch generierten Signale (z.B. Testlinien oder Testpunkte (Dots)) gesetzt wird. Mit dem neuen Verfahren lassen sich Körperflüssigkeiten, u. a. Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Schweiß, Liquor oder Blut untersuchen. Als endogene Kalibratoren dienen insbesondere Kreatinin, Glucose, Glucose-6-Phosphat, Lactat, Glutamat, Aspartat, Cholesterol, Pyruvat, Harnstoff und Triglyceride. Markerenzyme sind bevorzugt Peroxidasen und Oxidasen. Es wird bevorzugt ein Enzymmix verwendet, der mit dem in der jeweiligen Körperflüssigkeit vorhandenen endogenen Kalibrator unter Bildung von H2O2 reagiert. So wird im Falle der Körperflüssigkeit Urin bei Nutzung von Kreatinin als endogenem Kalibrator ein Mix aus Creatininase, Creatinase und Sarcosin Oxidase eingesetzt. Dient jedoch in der gleichen Probenmatrix Glucose als endogener Kalibrator, wird Glucose Oxidase zur Generierung des H2O2 verwendet.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass mit einem derartigen kombinierten System in Probenmatrices mit nicht konstanten Konzentrationen verschiedenste Analyte direkt, also mit der entsprechenden Verdünnungskorrektur, zuverlässig bestimmt werden können. Die Erfindung soll nachstehend durch Abbildungen näher erläutert werden.
Beispiele:
Beispiel 1 : Nachweis von Herz-spezifischem Fettsäure Bindungsprotein (FABP) bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem Kalibrator (Kreatinin) bei lateral-flow Testsystemen in der Samplematrix Urin (siehe Abbildungen 1 , 3, 4 und 6).
Die Urinprobe (200 μl) wird in 2 gleiche Teile (A und B) portioniert. Teil A wird in ein Röhrchen gegeben (siehe Abbildung 3), welches folgenden Enzymmix lyophilisiert (je 20 μl) enthält: Creatininase (18,8 U/ml), Creatinase (7,5 U/ml) und Sarcosin Oxidase (11.3 U/ml). Das Röhrchen wird gemixt und 20 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 0C) inkubiert. Durch den so rekonstituierten Enzymmix wird das im Urin endogen vorhandene Kreatinin u.a. zu Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt (siehe Abbildung 1 ). Teil B wird zunächst 1 :4 mit einem kommerziellen Proteinstabilisator verdünnt und anschließend werden 50 μl auf den Teststreifen aufgebracht (Abbildung 4; Probenöffnung 1). Das unter Probenöffnung 1 immobilisierte Anti- FABP / Meerrettich-Peroxidase Konjugat wird so aus seiner Matrix herausgelöst, bildet mit dem Analyten einen Komplex (FABP - Anti-FABP / Meerrettich- Peroxidase) und überströmt so das Testfeld, auf dem ein weiterer Anti-FABP Antikörper als Fänger immobilisiert ist. Letzterer bindet bei Vorhandensein von FABP den erwähnten Komplex in Abhängigkeit von der Analytkonzentration. 20 Minuten nach dem Aufbringen von Teil B werden 100 μl vorinkubierter Teil A in die Probenöffnung 2 gegeben. Damit wird das auf dem Teststreifen vorhandene immobilisierte, H2θ2-freie und lokal eng begrenzt päzipitierende Peroxidase Substrat in Lösung gebracht und überströmt zusammen mit dem H2O2 (resultierend aus der Umwandlung des Kreatinin) das Testfeld. Wird die Position der Fängerlinie erreicht kommt es jetzt zur Umwandlung des flüssigen und farblosen Substrates in ein blau/violettes Präzipitat. Die Menge des Präzipitates, also das generierte Signal, ist abhängig von der Analytkonzentration und der Menge an endogenem Kalibrator, welcher zur Generierung des für die Reaktion notwendigen H2O2 genutzt wird. Viel endogener Kalibrator (konzentrierter Morgenurin) erzeugt bei gleicher Analytkonzentration ein stärkeres Signal als eine Probe mit einer durchschnittlichen Kalibratorkonzentration (Tagesurin). Das beschriebene Testsystem korrigiert diesen Effekt durch seine Funktionsweise und erlaubt in diesem Fall mit Hilfe einer Komparatorkarte (siehe Abbildung 6) die wahre Analytkonzentration zu erfassen.
Beispiel 2: Nachweis von FABP bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem
Kalibrator (Glucose) bei Mikrotiterplatten-basierten Makro-Dot-Assays in der Samplematrix Urin (siehe Abbildungen 2 und 5). Für die Makro-Dot-Assays werden handelsübliche Membran-beschichtete Mikrotiterplatten (96 Wells) verwendet (Abbildung 5 / 1 ). Das Membranmaterial besteht vorzugsweise aus PVDF oder Nitrocellulose. Das verwendete Punkt- (Dot-) Schema hängt von der jeweiligen Applikation ab; Beispiele sind in Abbildung 5 / 2 dargestellt. Vorzugsweise wird mit 5 Dots gearbeitet (Abbildung 5 / 3), wobei der Mittelpunkts-Dot in der Regel als Kontrolle fungiert. Die äußeren Dots können sowohl für den Nachweis verschiedener Analyte als auch für Verdünnungskorrekturen einzelner Analytkonzentration genutzt werden. Im zu beschreibenden Beispiel wurde auf den Nachweis eines einzelnen Analyten (FABP) bei gleichzeitiger Korrektur der Verdünnung der verwendeten Samplematrix (Urin) fokussiert. Dazu wurde mit 4 Dots gearbeitet (siehe Abbildung 5, Mittelteil), die unterschiedliche Konzentrationen von Anti-FABP Antikörpern (Fänger) enthalten. Die Uhnprobe (400 μl) wird in 2 gleiche Teile (A und B) portioniert. Teil A wird in ein Röhrchen gegeben welches 6,5 U Glucose Oxidase und 0,5 mM Glucose enthält. Die separate Zugabe einer geringen und fixen Glucosemenge ist für die Erzeugung eines Basislevels an H2O2 notwendig. Das Röhrchen wird gemixt und 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 CC) inkubiert. Dadurch wird die im Urin endogen vorhandene Glucose u.a. zu Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt (siehe Abbildung 2). Teil B wird zunächst 1 :10 mit einem kommerziellen Proteinstabilisator verdünnt. Anschließend werden folgende Reaktionsansätze hergestellt (Tabelle 1 ):
Tabelle 1
Je Well werden 100 μl Reaktionsansatz zugegeben und alles 60 Minuten bei Raumtemperatur (20-25 0C) inkubiert. Die Zugabe von FABP erfolgte, um die zu beschreibenden Effekte deutlicher darstellen zu können. Nur bei Vorhandensein von FABP kann sich am Fänger-Antikörper der Komplex: Fänger-Antikörper / FABP / Anti-FABP-Antikörper-Meerrettich-Peroxidase Konjugat bilden. Danach wird die Platte 4 x gewaschen (0,1 M Na-P Puffer, pH 7.2) und jedem Well 50 μl folgenden Ansatzes zugegeben: 1 Teil Teil A
1 Teil H2θ2-freies, lokal eng begrenzt päzipitierendes Peroxidase-Substrat. Es folgt eine mindestens 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur. Dabei wird an den Positionen, an denen Meerrettich-Peroxidase gebunden ist, das flüssige und farblose Substrat in ein blaues Präzipitat umgewandelt, wobei die Menge des Präzipitates, also das generierte Signal, von der Analytkonzentration und der Menge an endogenem Kalibrator (Glucose), welcher zur Generierung des für die Reaktion notwendigen H2O2 genutzt wird, abhängig ist. Anschließend wird die Platte wiederum 4 x gewaschen (wie oben). Nach dem Trocknen erfolgt die Auswertung beispielsweise mit einem Bildgebenden Verfahren. Abbildung 5 zeigt sowohl die RGB-Bilder ohne (4) und mit FABP Zusatz (5) als auch die zur Auswertung
genutzten Graustufen-Bilder ohne (6) und mit FABP Zusatz (7). Auf Basis letzterer Bilder erfolgte die Quantifizierung, deren Daten in Tabelle 1 dargestellt sind. Die Effekte dieses selbst-kalibrierenden Assays werden bei Zusatz von 100 ng/ml FABP zu beiden Urinproben deutlich. Aus der letzten Zeile ist ersichtlich, dass der verwendete Morgenurin im Vergleich zum Tagesurin 1 , 74-fach konzentriert ist. Die durch das verwendete Schema bei den Fängerantikörpern (1 ; 2; 4 und 8 ng/ml) generierten Signale werden hinsichtlich ihrer Dynamik bewertet. Nach jeweils starken Signalen für 1 ng/ml Fängerantikörper erfolgt ab 2 ng/ml Fängerantikörper ein kontinuierlicher Signalanstieg bis zur Sättigung. Diese Sättigung ist bei gleichen Analytkonzentration im Tagesurin sehr viel eher erreicht, da diese nicht-konzentrierte Probe weniger endogenen Kalibrator (hier Glukose) enthält und somit nur eine geringere Menge an H2O2 gebildet werden kann. So können die Sättigungsverläufe für diagnostisch relevante Konzentrationsbereiche mathematisch beschrieben und in die Auswertungssoftware implementiert werden. Die korrigierte Konzentrationsermittlung von Analyten in Proben erfolgt dann durch den Vergleich der Sättigungsverläufe.
Tabelle 2: Quantifizierung der in Abbildung 5 dargestellten Ergebnisse
Messwerte entsprechen dem Pixel-Durchschnittswert des zur Auswertung jeweils ausgewählten Bereiches
Beispiel 3: Durchfluss- (flow-through) Makro-Dot-Assays zum Nachweis von
Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogener Kalibratoren für diverse Samplematrices (Abbildung 7).
Beispiel 3 beschreibt die Anwendung von Durchfluss- (flow-through) Makro-Dot- Assays zum Nachweis von Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogener Kalibratoren für diverse Samplematrices. Dabei werden auf einem Durchfluss- Membransystem (flow-through-device) zunächst 7 Punkte (Dots) aufgetragen (vgl. Abbildung 7). Die Punkte „1" bis „4" enthalten jeweilige Anti-Analytantikörper in steigenden Konzentrationen. Punkt „K" fungiert als Kontrolle und enthält vorzugsweise Anti-Maus-Immunglobulin G oder Protein A. Punkt „EK" dient zum Nachweis des jeweiligen endogenen Kalibrators, besteht also vorzugsweise aus Einzelenzymen oder Enzymgemischen sowie Peroxidase. Punkt „EK-Ü" ist optional und enthält bei Anwendung den jeweiligen Kalibrator (z.B. Kreatinin oder Glucose) in der für die Applikation optimalen Konzentration sowie die Komponenten, die zur Umwandlung des Kalibrators in beispielsweise H2O2 notwendig sind. Allen Punkten ist ein lokal eng begrenzt päzipitierendes Peroxidase-Substrat zugemischt. Bei Anwendung dieses Testsystems wird die Probe zunächst in einem Röhrchen, welches den zur Umwandlung des jeweiligen endogenen Kalibrators notwendigen Enzymmix oder das entsprechende Einzelenzym sowie Meerrettich-Peroxidase gekoppelten Anti-Analytantikörper enthält, vorinkubiert. Anschließend wird dieser Reaktionsmix auf das Testfeld des Durchfluss-Membransystems aufgetragen. Wenn Analyt in der Probe vorhanden ist, bindet der Komplex Analyt - Meerrettich- Peroxidase gekoppelter Anti-Analytantikörper an den jeweiligen Fängerantikörpern (Punkte „1" bis „4"). Aufgrund der unterschiedlichen Fängerantikörper Konzentrationen erfolgt eine Sättigung in Richtung Punkt „4". Das durch Umwandlung des endogenen Kalibrators im Reaktionsmix gebildete Produkt (vorzugsweise H2O2) initiiert nun die Umwandlung des in jedem Dot vorab immobilisierten H2O2-freien, lokal eng begrenzt päzipitierenden Peroxidase- Substrates von seiner farblosen Vorstufe zu einem blau-violetten Präzipitat. Dabei hängt die Präzipitatmenge von der lokal vorhandenen Peroxidase und beispielsweise der H2O2 Konzentration ab.
Legende zu den Abbildungen
Abbildung 1 : Komplettes Reaktionsschema für die Probenmatrix Urin und den endogenen Kalibrator Kreatinin
Abbildung 2: Komplettes Reaktionsschema für den endogen Kalibrator Glucose
Abbildung 3: Schema der „Reaktion 1" für die Probenmatrix Urin (endogener Kalibrator: Kreatinin)
Abbildung 4: Nachweis von Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem Kalibrator bei lateral-flow Testsystemen (schematische Darstellung)
Abbildung 5: Nachweis von Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem Kalibrator bei Mikrotiterplatten-basierten Makro-Dot- Assays
Abbildung 6: Komparatorkarte für den Nachweis von FABP bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogenem Kalibrator (Kreatinin) bei lateral- flow Testsystemen in der Samplematrix Urin
Abbildung 7: Durchfluss- (flow-through) Makro-Dot-Assays zum Nachweis von Analyten bei gleichzeitiger Korrektur mittels endogener Kalibratoren für diverse Samplematrices
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