Verwendung von amphiphilen, selbstassemblierenden Proteinen zur Formulierung von schwer wasserlöslichen Effektstoffen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von amphiphilen, selbstassemblie- renden Proteinen zur Formulierung von schwer wasserlöslichen Effektstoffen
Stand der Technik
DE 10059213A1 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung fester Zubereitungen was- serunlöslicher oder schwer wasserlöslicher Wirkstoffe durch Dispergieren der Wirkstoffe in einem proteinhaltigen Schutzkolloid, Ausflockung und Abtrennung des mit dem Schutzkolloid überzogenenen Wirkstoffes und Überführung in ein Trockenpulver. Als bevorzugte Schutzkolloide werden Casein und Rinder-, Schweine- und Fischgelatine genannt.
DE 102004057587A1 beschreibt wässrige Dispersionen eines Gemisches aus schwer wasserlöslichen Wirkstoffen und Einzellerproteinmaterial und daraus hergestellte Trockenpulver.
Aufgabenstellung
Die bisher bekannten Verfahren zur Formulierung von wasserunlöslichen bzw. schwer wasserlöslichen Wirk- und Effektstoffen erfüllen nicht alle Anforderungen, die an einen insbesondere für kosmetischen und pharmazeutischen Einsatz formulierten Wirkstoff gestellt werden, wie Temperatur- , Oxidations- und Lichtstabilität, mechanische Stabilität, toxische Unbedenklichkeit.
Es bestand daher die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, dass die Formulierung von schwer wasserlöslichen Wirkstoffen erlaubt und dabei die o.g. Kriterien besser erfüllt als die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer ersten Ausführungsform die Verwendung von amphiphilen, selbstassemblierenden Proteinen zur Formulierung von schwer wasserlöslichen Effektstoffen.
Amphiphile, selbstassemblierende Proteine eignen sich als Formulierungshilfsstoffe für schwer wasserlösliche, hydrophobe Wirkstoffe. Durch ihren amphiphilen Molekülcharakter können diese Proteine hydrophobe Wirkstoffe in wässrigen Lösungen stabilisieren. Ihre selbstassemblierenden Eigenschaften ermöglichen diesen Proteinen höher- molekulare Strukturen einzunehmen und damit hydrophobe Wirkstoffe dauerhaft zu verkapseln.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Effektstoffformulierungen, wobei man (i) den schwer wasserlöslichen Effektstoff zusammen mit dem amphiphilen selbstassemblierenden Protein in einer gemeinsamen dispersen Phase mischt, (ii) anschliessend eine Phasentrennung in eine protein- und effektstoffreiche Phase sowie eine protein- und effektstoffarme Phase durchführt .
Die protein- und effektstoffreiche Phase kann später ausgehärtet und als mechanisch stabile effektstoff-enthaltende Protein-Microbeads abgetrennt und ggf. getrocknet werden.
(i) Amphiphile, selbstassemblierende Proteine
Amphiphile, selbstassemblierende Proteine bestehen aus Polypeptiden, die aus Aminosäuren, insbesondere aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren, aufgebaut sind. Die Aminosäuren können auch modifiziert, beispielsweise acetyliert, glycosyliert, farnesyliert, sein.
Geeignete amphiphile, selbstassemblierende Proteine für die Formulierung schwer wasserlöslicher Effektstoffe sind solche Proteine, welche Protein-Microbeads ausbilden können. Protein-Microbeads besitzen eine globuläre Gestalt mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,1 bis 100, insbesondere von 0,5 bis 20, bevorzugt von 1 bis 5 und besonders bevorzugt von 2 bis 4 μm.
Protein-Microbeads lassen sich bevorzugt durch das im Folgenden beschriebene Verfahren herstellen:
Das Protein wird in einem ersten Lösungsmittel gelöst. Als Lösungsmittel können beispielsweise wässrige Salzlösungen verwendet werden. Insbesondere eignen sich hoch
konzentrierte Salzlösungen mit einer Konzentration größer 2, insbesondere größer 4 und besonders bevorzugt größer 5 molar, deren Ionen stärker ausgeprägte chaotrope Eigenschaften aufweisen als Natrium- und Chloridionen. Ein Beispiel für eine solche Salzlösung ist 6 M Guanidiniumthiocyanat oder 9 M Lithiumbromid. Des Weiteren kön- nen organische Lösungsmittel zum Lösen der Proteine verwendet werden. Insbesondere eignen sich fluorierte Alkohole oder zyklische Kohlenwasserstoffe oder organische Säuren. Beispiele dafür sind Hexafluorisopropanol, Cyclohexan und Ameisensäure. Die Herstellung der Protein-Microbeads kann in den beschriebenen Lösungsmitteln erfolgen. Alternativ kann dieses Lösungsmittel durch ein weiteres Lösungsmittel z.B. niedrig konzentrierte Salzlösungen (c < 0,5 M) durch Dialyse oder Verdünnung ersetzt werden. Die Endkonzentration des gelösten Proteins sollte zwischen 0,1-100 mg/ml betragen. Die Temperatur, bei der das Verfahren durchgeführt wird, beträgt üblicherweise 0-80, bevorzugt 5-50 und besonders bevorzugt 10 40 °C.
Bei Verwendung von wässrigen Lösungen können diese auch noch mit einem Puffer, bevorzugt im Bereich von pH 4-10, besonders bevorzugt 5 -9, ganz besonders bevorzugt 6 - 8,5 versetzt sein.
Durch Zugabe eines Additivs wird eine Phasentrennung induziert. Dabei entsteht eine in der Mischung von Lösungsmittel und Additiv emulgierte proteinreiche Phase. Aufgrund von Oberflächeneffekten nehmen emulgierte proteinreiche Tröpfchen eine runde Form an. Durch die Wahl des Lösungsmittels, des Additivs und der Proteinkonzentration kann der mittlere Durchmesser der Protein-Microbeads auf Werte zwischen 0,1 μm bis 100 μm eingestellt werden.
Als Additiv können alle Substanzen verwendet werden, die einerseits mit dem ersten Lösungsmittel mischbar sind und andererseits die Bildung einer proteinreichen Phase induzieren. Wird die Microbeadbildung in organischen Lösungsmitteln durchgeführt, so eignen sich dafür organische Substanzen, die eine geringere Polarität als das Lö- sungsmittel aufweisen, z.B. Toluol. In wässrigen Lösungen können Salze als Additiv verwendet werden, deren Ionen stärker ausgeprägte kosmotrope Eigenschaften aufweisen als Natrium- und Chloridionen (z.B. Ammoniumsulfat; Kaliumphosphat). Die Endkonzentration des Additivs sollte abhängig von der Art des Additivs zwischen 1 % und 50 Gew.-% bezogen auf die Proteinlösung betragen.
Die proteinreichen Tröpfchen werden durch Aushärtung fixiert, wobei die runde Form erhalten bleibt. Die Fixierung beruht dabei auf der Ausbildung starker intermolekularer Wechselwirkungen. Die Art der Wechselwirkungen kann nicht-kovalent, z.B. durch die Bildung intermolekularer ß-Faltblattkristalle oder kovalent, z.B. durch chemische Quer- Vernetzung sein. Die Aushärtung kann durch das Additiv und / oder durch die Zugabe einer weiteren geeigneten Substanz erfolgen. Die Aushärtung erfolgt bei Temperaturen zwischen 0 und 80°C, bevorzugt zwischen 5 und 60°C.
Diese weitere Substanz kann ein chemischer Quervernetzer sein. Unter einem chemi- sehen Quervernetzer wird dabei ein Molekül verstanden, bei dem mindestens zwei chemisch reaktive Gruppen über einen Linker miteinander verbunden sind. Beispiele dafür sind Sulfhydryl-reaktive Gruppen (z.B. Maleimide, Pydridyldisulfide, α - Haloacetyle, Vinylsulfone, Sulfatoalkylsulfone (bevorzugt Sulfatoethylsulfone)), Amin- reaktive Gruppen (z.B. Succinimidylester, Carbodiimde, Hydroxymethyl- Phosphin, Imidoester, PFP-Ester, Aldehyde, Isothiocyanate etc.), Carboxy-reaktive Gruppen (z.B. Amine etc.), Hydroxyl-reaktive Gruppen (z.B. Isocyanate etc.), unselektive Gruppen (z.B. Arylazide etc.) und photoaktivierbare Gruppen (z.B. Perfluorphenylazid etc.). Diese reaktiven Gruppen können mit in Proteinen vorhandenen Amin-, Thiol-, Carboxyl- oder Hydroxylgruppen kovalente Verknüpfungen bilden.
Die stabilisierten Microbeads werden mit einem geeigneten weiteren Lösungsmittel, z.B. Wasser gewaschen und anschließend durch dem Fachmann geläufige Verfahren getrocknet, z.B. durch Lyophilisierung, Kontakttrocknung oder Sprühtrocknung. Der Erfolg der Kugelbildung wird mit Hilfe der Rasterelektronenmikroskopie überprüft.
Für die Herstellung von Protein-Microbeads sind Proteine geeignet, die in wässriger Lösung überwiegend intrinsisch entfaltet vorliegen. Dieser Zustand kann beispielsweise nach einem Algorithmus berechnet werden, der dem Programm lUpred zugrunde liegt (http://iupred.enzim.hu/index.html; The Pairwise Energy Content Estimated from Amino Acid Composition Discriminates between Folded and Intrinsically Unstructured Proteins; Zsuzsanna Dosztänyi, Veronika Csizmόk, Peter Tompa and Istvän Simon; J. Mol. Biol. (2005) 347, 827-839). Ein überwiegend intrinsisch entfalteter Zustand wird dann angenommen, wenn für über 50% der Aminosäurereste nach diesem Algorithmus ein Wert > 0,5 berechnet wird (prediction type: long disorder).
Weitere geeignete Proteine für die Formulierung von schwer wasserlöslichen Effektstoffen sind Seidenproteine. Darunter verstehen wir im Folgenden solche Proteine, die hoch repetitive Aminosäuresequenzen enthalten und im Tier in einer flüssigen Form gespeichert werden und bei deren Sekretion durch Scherung oder Verspinnen Fasern entstehen (Craig, C. L. (1997) Evolution of arthropod silks. Annu. Rev. Entomol. 42: 231-67).
Besonders geeignete Proteine für die Formulierung von schwer wasserlöslichen Effektstoffen sind Spinnenseidenproteine, die in ihrer ursprünglichen Form aus Spinnen isoliert werden konnten.
Ganz besonders geeignete Proteine sind Seidenproteine, die aus der „Major Ampulla- te"-Drüse von Spinnen isoliert werden konnten.
Bevorzugte Seidenproteine sind ADF3 und ADF4 aus der der „Major Ampullate"-Drüse von Araneus diadematus (Guerette et al., Science 272, 5258:1 12-5 (1996)).
Ebenso geeignete Proteine für die Formulierung von schwer wasserlöslichen Effektstoffen sind natürliche oder synthetische Proteine, die sich von natürlichen Seidenproteinen ableiten und welche unter Verwendung gentechnologischer Arbeitsmethoden heterolog in prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystemen hergestellt wurden. Nichtlimitierende Beispiele für prokaryontische Expressionsorganismen sind Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Corynebacterium glutamicum u.a.. Nichtlimitierende Beispiele für eukaryontische Expressionsorganismen sind Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris u.a., filamentöse Pilze, wie Asper- gillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei, Acremonium chrysogenum u.a., Säugetierzellen, wie Heia-Zellen, COS-Zellen, CHO-Zellen u.a., Insektenzellen, wie Sf9-Zellen, MEL-Zellen u.a..
Besonders bevorzugt für die Formulierung von schwer wasserlöslichen Effektstoffen sind synthetische Proteine, welche auf Wiederholungseinheiten von natürlichen Seidenproteinen basieren. Neben den synthetischen repetitiven Seidenprotein-Sequenzen können diese zusätzlich eine oder mehrere natürliche nicht-repetitve Seidenprotein- Sequenzen enthalten (Winkler und Kaplan, J Biotechnol 74:85-93 (2000)).
Unter den synthetischen Seidenproteinen bevorzugt für die Formulierung von schwer wasserlöslichen Effektstoffen sind synthetische Spinnenseidenproteine, welche auf
Wiederholungseinheiten von natürlichen Spinnenseidenproteinen basieren. Neben den synthetischen repetitiven Spinnenseidenprotein-Sequenzen können diese zusätzlich eine oder mehrere natürliche nicht-repetitve Spinnenseidenprotein-Sequenzen enthalten.
Unter den synthetischen Spinnenseidenproteinen ist bevorzugt das sog. C16-Protein zu nennen (Huemmerich et al. Biochemistry, 43(42):13604-13612 (2004)). Dieses Protein hat die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Polypeptidsequenz. Neben der in SEQ ID NO:1 dargestellten Polypeptidsequenz sind auch besonders funktionale Äquivalente, funktionale Derivate und Salze dieser Sequenz bevorzugt.
Unter „funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotz- dem die Eigenschaft zur Verpackung schwer wasserlöslicher Effektstoffe besitzt.
„Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure- Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch „Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie „funktionale Derivate" und „Salze" der Polypeptide.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne die gewünschte biologische Aktivität.
Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entneh- men:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
AIa Ser
Arg Lys
Asn GIn; His
Asp GIu
Cys Ser
GIn Asn
GIu Asp
GIy Pro
His Asn ; GIn
Me Leu; VaI
Leu Me; VaI
Lys Arg ; GIn ; GIu
Met Leu ; He
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
VaI Me; Leu
Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.
(ii) Schwer wasserlösliche Effektstoffe
Im folgenden werden die Begriffe schwer-wasserlösliche Effektstoffe und hydrophobe Effektstoffe und hydrophobe Wirkstoffe und Effektormoleküle synonym verwendet. Als schwer wasserlöslichen Effektstoffe werden im folgenden solche Verbindungen bezeichnet, deren Wasserlöslichkeit bei 20°C < 5 Gew.-%, bevorzugt < 1 Gew.-%, besonders bevorzugt < 0,5 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt < 0,1 Gew.-% beträgt.
Geeignete schwer wasserlösliche Effektstoffe sind Farbstoffe, insbesondere die in der folgenden Tabelle genannten:
Besonders vorteilhafte Farbstoffe sind die in der folgenden Liste genannten öllöslichen oder in Öl dispergierbaren Verbindungen. Die Colour Index Nummern (CIN) sind dem Rowe Colour Index, 3. Auflage, Society of Dyers and Colourists, Bradford, England, 1971 entnommen.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind Fettsäuren, insbesondere gesättigte Fettsäuren, die eine Alkylverzweigung tragen, besonders bevorzugt verzweigte Eicosan- säuren, wie 18-Methyl-Eicosansäure.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind Carotinoide. Unter Carotinoide sind erfindungsgemäß folgende Verbindungen sowie deren veresterte oder glykosylierte Deriva-
te zu verstehen: ß-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Cryptoxanthin, Citranaxanthin, Canthaxanthin, Bixin, ß-Apo-4-carotinal, ß-Apo-8-carotinal, ß-Apo-8- carotinsäureester, Neurosporen, Echinenon, Adonirubin, Violaxanthin, Torulen, Toru- larhodin, einzeln oder als Mischung. Bevorzugt verwendete Carotinoide sind ß-Carotin, Lycopin, Lutein, Astaxanthin, Zeaxanthin, Citranaxanthin und Canthaxanthin.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind Vitamine, insbesondere Retinoide und deren Ester.
Unter Retinoide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Vitamin A Alkohol (Retinol) und seine Derivate wie Vitamin A Aldehyd (Retinal), Vitamin A Säure (Retinsäure) und Vitamin A Ester (z.B. Retinylacetat, Retinylpropionat und Retinylpalmitat) gemeint. Der Begriff Retinsäure umfasst dabei sowohl all-trans Retinsäure als auch 13-cis Retinsäure. Die Begriffe Retinol und Retinal umfassen bevorzugt die all-trans Verbindun- gen. Als bevorzugtes Retinoid verwendet man für die erfindungsgemäßen Formulierungen all-trans-Retinol, im folgenden als Retinol bezeichnet.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind Vitamine, Provitamine und Vitaminvorstufen aus den Gruppen A, C, E und F, insbesondere 3,4-Didehydroretinol, ß-Carotin (Provi- tamin des Vitamin A), Palmitinsäureester der Ascorbinsäure, Tocopherole, insbesondere α-Tocopherol sowie seine Ester, z.B. das Acetat, das Nicotinat, das Phosphat und das Succinat; weiterhin Vitamin F, worunter essentielle Fettsäuren, besonders Linol- säure, Linolensäure und Arachidonsäure, verstanden werden.
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind lipophile, öllösliche Antioxidantien aus der Gruppe Vitamin E, d.h. Tocopherol und dessen Derivate, Gallussäureester, Flavonoide und Carotinoide sowie Butylhydroxytoluol/anisol.
Ein weiteres bevorzugtes Effektormolekül ist Liponsäure und geeignete Derivate (SaI- ze, Ester, Zucker, Nukleotide, Nukleoside, Peptide und Lipide).
Weitere bevorzugte Effektormoleküle sind UV-Lichtschutzfilter. Darunter sind organische Substanzen zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, z.B. Wärme, wieder abzugeben.
Als öllösliche UV-B-Filter können z.B. folgende Substanzen verwendet werden:
3-Benzylidencampher und dessen Derivate, z.B. 3-(4-Methylbenzyliden)campher;
4-Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2- ethylhexylester, 4-( Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4-(Dimethylamino)- benzoesäureamylester;
Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4 Methoxy- zimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimtsäureisoamylester, 4 Methoxyzimtsäureisopenty- lester, 2-Cyano-3-phenyl-zimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene); Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4 isopropylbenzylester, Salicylsäurehomomenthylester;
Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-
Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4-methoxybenzophenon;
Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2- ethylhexylester;
Triazinderivate, wie z.B. 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1 '-hexyloxy)-1 ,3,5-triazin (Oc- tyltriazone) und Dioctyl Butamido Triazon (Uvasorb® HEB):
Propan-1 ,3-dione, wie z.B. 1 -(4-tert. Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1 ,3- dion. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Estern der Zimtsäure, vorzugsweise 4-
Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4-Methoxyzimtsäureisopentylester, 2-Cyano-3- phenyl-zimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene).
Des weiteren ist die Verwendung von Derivaten des Benzophenons, insbesondere 2-
Hydroxy-4-methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4"-methylbenzophenon, 2,2'- Dihydroxy-4-methoxybenzophenon sowie der Einsatz von Propan-1 ,3-dionen, wie z.B.
1 -(4-tert. Butylphenyl)-3-(4-'methoxyphenyl)propan-1 ,3-dion bevorzugt.
Als typische UV-A-Filter kommen in Frage:
Derivate des Benzoylmethans, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'- methoxyphenyl)propan-1 ,3-dion, 4-tert. -Butyl-4'-methoxydibenzoylmethan oder 1- Phenyl-3-(4'-isopropylphenyl)-propan-1 ,3-dion;
Amino-hydroxy-substituierte Derivate von Benzophenonen wie z.B. N,N-Diethylamino- hyd roxybenzoyl-n-hexyl benzoat.
Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden.
Geeignete UV-Filtersubstanzen sind in der folgenden Tabelle genannt.
Neben den beiden vorgenannten Gruppen primärer Lichtschutzstoffe können auch sekundäre Lichtschutzmittel vom Typ der Antioxidantien eingesetzt werden, die die photochemische Reaktionskette unterbrechen, welche ausgelöst wird, wenn UV- Strahlung in die Haut eindringt. Typische Beispiele hierfür sind Tocopherole (Vitamin E) und öllösliche Ascorbinsäurederivate (Vitamin C).
Erfindungsgemäß können geeignete Derivate (Salze, Ester, Zucker, Nukleotide, Nukleoside, Peptide und Lipide) der genannten Verbindungen als Effektormoleküle verwendet werden.
Weiter bevorzugt sind sogenannte Peroxydzersetzter, d.h. Verbindungen die in der Lage sind Peroxyde, besonders bevorzugt Lipidperoxyde zu zersetzen. Darunter sind organische Substanzen zu verstehen, wie z.B. 5-Pyrimidinol- sowie 3-Pyridinolderivate und Probucol.
Weiterhin handelt es sich bei den genannten Peroxydzersetzern bevorzugt um die in den Patentanmeldungen WO/0207698 und WO/03059312, auf deren Inhalt hiermit ausdrücklich bezuggenommen wird, beschriebenen Substanzen, bevorzugt die dort beschriebenen Bor-enthaltenden oder Stickstoff-enthaltenden Verbindungen, die Peroxide oder Hydroperoxide zu den entsprechenden Alkoholen ohne Bildung radikalischer Folgestufen reduzieren können. Ferner können für diesen Zweck sterisch gehinderte Amine eingesetzt werden.
Eine weitere Gruppe sind Antiirritantien, die eine entzündungshemmende Wirkung auf durch UV-Licht geschädigte Haut besitzten. Solche Stoffe sind beispielsweise Bisabo- lol, Phytol und Phytantriol.
Eine weiter Gruppe von schwer wasserlöslichen Effektorstoffen sind Wirkstoffe, die im Pflanzenschutz eingesetzt werden können, beispielsweise Herbizide, Insektizide und Fungizide.
Desweiteren geeignet als schwer wasserlösliche Effektstoffe sind Wirkstoffe für die pharmazeutische Anwendung, insbesondere solche für die orale Verabreichung. Das erfindungsgemäße Verfahren ist prinzipiell unabhängig von der medizinischen Indikation auf eine Vielzahl von Wirkstoffen anwendbar.
Beispiele für geeignete schwer wasserlösliche pharmazeutische Wirkstoffe sind in der folgenden Tabelle genannt.
(iii) Formulierung hydrophober Wirkstoffe
Formulierungen schwer wasserlöslicher Wirkstoffe können unter Verwendung amphiphiler selbstassemblierender Proteine auf verschiedene Art und Weise herge- stellt werden. Schwer wasserlösliche, hydrophobe Wirkstoffe können in Protein- Microbeads verpackt oder kolloidal-dispers durch eine Proteinummantelung, welche z.B. in Mikronisierungsansätzen erzielt werden kann, stabilisiert werden. Die Formulierung hydrophober Wirkstoffe kann durch Einschließen in Microbeads erfolgen. Dieser Prozess umfasst zwei Schritte. Im ersten Schritt werden der hydrophobe Wirkstoff und das amphiphile selbstassemblierende Protein in einer gemeinsamen
Phase gelöst. Dazu können der Wirkstoff und das Protein direkt durch ein Lösungsmittel oder eine Lösungsmittelmischung in Lösung gebracht werden. Alternativ können der Wirkstoff und das Protein zunächst in unterschiedlichen Lösungsmitteln gelöst und die Lösungen im Anschluss miteinander vermischt werden, so dass wiederum eine ge- meinsame Phase entsteht. Bei der gemeinsamen Phase kann es sich um eine molekular-disperse Phase oder eine kolloidal-disperse Phase handeln.
Das Lösen des hydrophoben Wirkstoffes und des Proteins in verschiedenen Lösungsmitteln und das anschließende Mischen beider Lösungen ist insbesondere dann von Vorteil, wenn sich der hydrophobe Wirkstoff und das Protein nicht in einem gemeinsamen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch lösen lassen. Auf diese Art und Weise lassen sich durch dieses Vorgehen auch kolloidal-disperse Lösungen hydrophober Wirkstoffe herstellen, indem der in einem geeigneten Lösungsmittel gelöste Wirkstoff in ein anderes Lösungsmittel verdünnt wird, in dem dieser Wirkstoff unlöslich ist. Da Proteine in der Regel gut wasserlöslich sind, wird bevorzugt mit wässrigen Lösungen und Mischungen aus Wasser und wassermischbaren, organischen Lösungsmitteln gearbeitet. Bespiele für geeignete, wassermischbare Lösungsmittel sind Alkohole wie Methanol, Ethanol und Isopropanol, fluorierte Alkohole wie Hexafluorisopropanol und Trifluorethanol, Alkanone wie Aceton oder auch Sulfoxide wie z.B. Dimethylsulfoxid oder Formamide wie Dimethylformamid oder andere organische Lösungsmittel wie z.B. Tetrahydrofuran und Acetonitril oder N-Methyl-2-pyrrolidon. Im allgemeinen kann mit allen Lösungsmitteln und Lösungsmittelgemischen gearbeitet werden, in denen sich die Proteine lösen lassen. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind fluorierte Alkoho-
Ie wie z.B. Hexafluorisopropanol oder Trifluorethanol, ionische Flüssigkeiten wie z.B. EMIM-Acetat, wässrige Lösungen chaotroper Salze wie z.B. Harnstoff, Guanidiunium- hydrochlorid und Guanidiniumthiocyanat oder organische Säuren wie z.B. Ameisensäure sowie Mischungen dieser Lösungsmittel mit anderen organischen Lösungsmit- teln. Beispiele für Lösungsmittel, die sich mit den Lösungsmitteln für das Protein mischen lassen sind u.a. Alkohole wie Methanol, Ethanol und Isopropanol, Alkanone wie Aceton, Sulfoxide wie z.B. Dimethylsulfoxid, Formamide wie Dimethylformamid, HaIo- genalkane wie Methylenchlorid oder auch weitere organische Lösungsmittel wie z.B. Tetrahydrofuran. Der zweite Schritt der Formulierung hydrophober Wirkstoffe in Microbeads ist eine Phasentrennung in eine protein- und wirkstoffarme Phase und in eine protein- und wirkstoffreiche Phase, die anschließend aushärtet. Dabei wird der hydrophobe Wirkstoff in die Assemblierungsform des Proteins eingeschlossen. Aufgrund von Oberflächeneffekten während der Phasentrennung bilden sich bevorzugt runde Proteinstruktu- ren, sogenannte Microbeads.
Die Phasentrennung wird bevorzugt durch Zugabe wässriger Lösungen lyotroper Salze zu den Mischungen aus Proteinen und hydrophoben Wirkstoffen induziert. Geeignete lyotrope Salze werden durch die Hofmeister'sche Reihe beschrieben. Besonders ge- eignet sind Ammoniumsulfat und Kaliumphosphat. Die Zugabe dieser Lösungen kann durch einfaches Mischen, Eintropfen oder durch Dialyse erfolgen. Die Wechselwirkungen zwischen dem hydrophoben Wirkstoff und dem Protein beruht im wesentlichen auf ihren hydrophoben Eigenschaften, wobei allerdings auch Wasserstoffbrücken, ionische Wechselwirkungen und van-der-Waals-Wechselwirkungen betei- ligt sein können. Der hydrophobe Wirkstoff kann an die Oberfläche gebunden sein, in die Microbeads eingeschlossen sein oder auch auf beide Arten mit den Microbeads assoziiert sein. Die Bindung des hydrophoben Wirkstoffs an die Microbeads kann durch die Verarmung des Assemblierungsansatzes an gelöstem Wirkstoff bestimmt werden. Die Konzentration des Wirkstoffs kann durch eine quantitative Analyse seiner Eigenschaften gemessen werden. So kann die Bindung von lichtabsorbierenden Wirkstoffen z.B. durch photometrische Methoden analysiert werden. Dazu werden z.B. die Färbung der Microbeads oder die Entfärbung der protein- und Wirkstoff armen Phase des Formulierungsansatzes durch Messen der Absorption eines farbigen Wirkstoffs bestimmt. Mit Hilfe dieser Methoden kann auch bestimmt werden, wie hoch der Wirk- stoffanteil in den Microbeads ist.
Die Freisetzung der Wirkstoffe aus den Microbeads kann durch Desorption in geeignete Lösungsmittel, durch den Abbau der Microbeads durch Proteasen oder durch Auflösen der Microbeads durch geeignete Lösungsmittel erfolgen. Geeignete Lösungsmittel für die Desorption sind alle Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische, in denen sich der Wirkstoff lösen lässt. Geeignete Proteasen können als technische Proteasen einer Suspension von Protein-Microbeads gezielt zugesetzt werden oder am gewünschten Wirkort der Effektormoleküle natürlicherweise vorkommen, wie z.B. Hautproteasen, Proteasen des Verdauungstraktes, z.B. Magen- oder Darmproteasen oder von Mikroorganismen freigesetzte Proteasen. Lösungsmittel, die die Microbeads auflösen kön- nen, sind z.B. fluorierte Alkohole wie z.B. Hexafluorisopropanol oder Trifluorethanol, ionische Flüssigkeiten wie z.B. EMIM Acetat, wässrige Lösungen chaotroper Salze wie z.B. Harnstoff, Guanidiuniumhydrochlorid und Guanidiniumthiocyanat oder organische Säuren wie z.B. Ameisensäure sowie Mischungen dieser Lösungsmittel mit anderen organischen Lösungsmitteln. Die Geschwindigkeit und die Kinetik der Freisetzung der Effektormoleküle können z.B. durch die Beladungsdichte mit Wirkstoffen und die Größe der Microbeads bzw. ihrem Verhältnis von Volumen zur Oberfläche gesteuert werden.
Die Formulierung schwer wasserlöslicher hydrophober Wirkstoff kann auch durch Stabilisierung ihrer kolloid-dispersen Lösung z.B. durch Mikronisierung erfolgen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der unter Benutzung der beschriebenen amphiphilen selbstassemblierenden Proteine hergestellten Protein- Microbeads oder der z.B. durch Mikronisierung hergestellten kolloidal-dispersen Proteinformulierungen zur Speicherung, zum Transport oder zur Freisetzung von Wirkstoffen in pharmazeutischen Produkten, kosmetischen Produkten, Pflanzenschutzprodukten, Nahrungs- und Futtermitteln. Dabei dienen z.B. die Protein-Microbeads weiterhin dem Schutz der verpackten Wirkstoffe vor Umwelteinflüssen, wie z.B. oxidativen Prozessen oder UV-Strahlung, oder vor Zerstörung durch Reaktion mit anderen Bestandteilen der Produkte oder vor Abbau durch bestimmte Proteasen. Der Wirkstoff kann durch De- sorption, proteolytischen Abbau, gezielte Freisetzung oder langsame Freisetzung oder Kombination dieser Mechanismen aus den Protein-Microbeads oder kolloidaldispersen Proteinformulierungen freigesetzt werden.
Bevorzugt sind Protein-Microbeads und damit formulierte Wirkstoffe in pharmazeutischen Produkten für eine per orale Aufnahme. Dabei kann die Stabilität der Wirkstoffe bei Magenpassage erhöht werden, da unter den dort vorherrschenden Bedingungen kein proteolytischer Abbau der Protein-Microbeads erfolgt. Die Freisetzung der Wirk-
Stoffe aus den per oral aufgenommenen Wirkstoff-enthaltenden Microbeads erfolgt dann im Darm. Auch topische Anwendungen der Protein-Microbeads sowie der darin eingebetteten pharmazeutischen Wirkstoffe sind möglich. Der Abbau der Protein- Microbeads und die daraus resultierende Freisetzung der Wirkstoffe wird dann durch auf der Haut bzw. in den oberen Hautschichten enthaltene Proteasen gesteuert.
In pharmazeutischen Produkten, Nahrungs- und Futtermitteln bzw. Pflanzenschutzprodukten kann eine Formulierung von Wirkstoffen mit den beschriebenen amphiphilen selbstassemblierenden Proteinen weiterhin zu einer erhöhten Bioverfügbarkeit der Wirkstoffe führen. Die Verpackung von pharmazeutischen Wirkstoffen in Protein- Microbeads bzw. die kolloidal-disperse Formulierung von Wirkstoffen unter Verwendung der beschriebenen amphiphilen selbstassemblierenden Proteine kann weiterhin zur verbesserten Blut-Hirnschranken-Überwindung des Wirkstoffs oder verbesserten Aufnahme über die Darmschleimhaut führen. Pflanzenschutzprodukte können durch Verkapselung bzw. Einbettung in Protein-Microbeads vor Auswaschprozessen geschützt werden. Bestimmte Wirkstoffpartikelgrößen, welche besser aufgenommen oder resorbiert werden bzw. besser bioverfügbar sind, können durch Verpackung in Protein- Microbeads bzw. durch kolloidal-disperse Formulierung, z.B. durch Mikronisierungsan- sätze unter Verwendung von amphiphilen selbstassemblierenden Proteinen eingestellt werden.
Durch Variation der Aminosäuresequenz der beschriebenen amphiphilen selbstassemblierenden Proteine bzw. Fusionierung mit zusätzlichen Protein- oder Peptidse- quenzen ist es möglich, Strukturen zu generieren, welche bestimmte Oberflächen, z.B. Haut, Haar, Blätter, Wurzeln oder Darm- oder Blutgefäßoberflächen, spezifisch erkennen bzw. von diesen Oberflächen oder den enthaltenen Rezeptoren erkannt und gebunden werden.
Dadurch ist es möglich, die mit den beschriebenen amphiphilen selbstassemblierenden Proteinen formulierten Wirkstoffe effektiver an den gewünschten Wirkort zu bringen bzw. die Wirkstoffaufnahme zu verbessern. Die Bioverfügbarkeit von pharmazeutischen Wirkstoffen bzw. Wirkstoffen in Nahrungs- und Futtermitteln kann erhöht werden, wenn diese in Protein-Microbeads verpackt werden, welche zusätzlich mit Proteinen fusioniert bzw. assoziert vorliegen, die an bestimmte Oberflächenmarker (z.B. Re- zeptoren) von Zellen des Darmtraktes (z.B. Mucosazellen) binden. Solche Proteine sind z.B. das MapA-Protein oder das Kollagen-bindende Protein CnBP aus Lactobacil-
lus reuteri (Miyoshi et al., 2006, Biosci. Biotechnol. Biochem. 70:1622-1628) oder funktional vergleichbare Proteine aus anderen Mikroorganismen, vor allem der natürlichen Magen-Darmflora. Die beschriebenen Bindeproteine vermitteln ein Anhaften der Mikroorganismen an Zelloberflächen. Durch Kopplung bzw. Fusionierung der Bindeproteine an die beschriebenen amphiphilen selbstassemblierenden Proteine würden daraus hervorgehende Wirkstoff-beinhaltende Protein-Microbeads gezielter an entsprechende Aufnahmeorte gelenkt werden bzw. an diesen Orten länger verweilen, was eine verlängerte und verbesserte Wirkstoff-Freisetzung und -aufnähme zur Folge hat. Weiterhin ist es durch Variation der Aminosäuresequenz der für die Wirkstoffformulie- rung beschriebenen amphiphilen selbstassemblierenden Proteine bzw. Fusionierung mit zusätzlichen Protein- oder Peptidsequenzen möglich, Wirkstoffe gezielt an gewünschte Wirkorte zu lenken, um damit z.B. eine höhere Spezifität, geringeren Wirkstoffverbrauch oder Wirkstoffdosis, eine schnellere oder stärkere Wirkung zu erzielen.
Experimenteller Teil
Beispiel 1
Verpacken von ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol in Microbeads und Freisetzung durch Proteolyse Herstellen der ß-Carotinlösungen
Eine Stammlösung wurde hergestellt, indem 80 mg ß-Carotin und 16 mg Tocopherol in 10 g THF gelöst wurden. Im Anschluss wurden aus dieser Stammlösung durch Verdünnen entsprechend der Tabelle 1.1 die Lösungen 1-4 hergestellt. Alle Lösungen wurden kurz vor Gebrauch angesetzt und sofort nach dem Verdünnen weiter verarbeitet.
Tab. 1 .1 : ß-Carotinlösungen
Verpacken von ß-Carotin in Microbeads durch direkte Zugabe von Kaliumphosphat Um ß-Carotin in die C16-Protein-Microbeads zu verpacken, wurde zunächst eine ge- meinsame Phase aus C16-Protein und ß-Carotin hergestellt. Dazu wurden jeweils 500 μl einer Lösung von 10 mg/ml C16-Protein in 5 mM Kaliumphosphat, pH 8 mit 50 μl bzw. 100 μl der ß-Carotinlösungen (Lösungen 1-4) vermischt (Tab. 1.2). Im Fall der Ansätze mit ß-Carotin aus THF/Isopropanol (Ansätze 1-4) wurden orange Dispersionen erhalten, im Fall der Ansätze mit ß-Carotin aus THF (Ansätze 5-8) gelbe Dispersionen. Um die C16-Protein-Microbeadbildung durch Phasentrennung zu induzieren, wurden zu jedem der Ansätze 1000 μl einer 1 M Kaliumphosphatlösung, pH 8,0 gegeben (Tab. 1.2). Nach 15 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Ansätze durch Abzentri- fugieren in ein deutlich gefärbtes Pellet aus C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin und farblosen Überstand getrennt. Das eingesetzte ß-Carotin ging bei der Phasentrennung also vollständig in die Microbeads über. Der farblose Überstand wurde abgenommen. Die Pellets wurden im Anschluss zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und redispergiert.
Nach dem Redispergieren der C16-Protein-Microbeads erhielt man im Fall der Ansätze mit den ß-Carotinlösungen aus THF/Isopropanol (Ansätze 1-4) orange Dispersionen, im Fall der Ansätze mit den ß-Carotinlösungen aus THF (Ansätze 5-8) gelbe Dispersionen.
Tab. 1 .2: Verpacken von ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol in C16-Protein- Microbeads durch Zugabe von 1 M Kaliumphosphatlösung
Verpacken von ß-Carotin in C16-Protein-Microbeads durch Dialyse gegen Kaliumphosphat
Alternativ zur direkten Zugabe von Kaliumphosphat zu der gemeinsamen Phase aus ß- Carotin und C16-Protein kann die Phasentrennung auch durch Dialyse gegen 1 M Kaliumphosphat erfolgen. Da die Dialyse in Dialyseschläuchen erfolgte, wurde jeweils das 10-fache Ansatzvolumen im Vergleich zur direkten Zugabe der Kaliumphosphatlösung pipettiert (Tab. 1.3).
Tab. 1 .3: Verpacken von ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol in C16-Protein- Microbeads durch Dialyse gegen 1 M Kaliumphosphatlösung
Dazu wurde die C16-Lösung (10 mg/ml in 5 mM Kaliumphosphat, pH 8,0) mit der jeweiligen ß-Carotinlösung vermischt und die Mischung im Anschluss sofort in die Dialyseschläuche gegeben und gegen 1 M Kaliumphosphatlösung dialysiert. Nach Übernacht-Dialyse wurden die Microbeaddispersion aus den Schlächen genommen und durch Abzentrifugieren in einen farblosen Überstand und in ein farbiges Pellet getrennt. Wie auch im Fall der direkten Zugabe von Kaliumphosphat zur gemeinsamen Phase aus C16-Protein und ß-Carotin wurde das ß-Carotin quantitativ durch das C16-Protein in Form der Protein-Microbeads gebunden. Der farblose Überstand wurde abgenom-
men. Die Pellets wurden im Anschluss zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann redispergiert.
Nach dem Redispergieren der Protein-Microbeads erhielt man im Fall der Ansätze mit den ß-Carotinlösungen aus THF/Isopropanol (Ansätze D1-D4) orange Dispersionen, im Fall der Ansätze mit den ß-Carotinlösungen aus THF (Ansätze D5-D8) gelbe Dispersionen (Abb. 1).
Abb. 1 : Dispersionen der C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol in Wasser. Von links nach rechts: Ansätze D1 -D4 (THF/Isopropanol) und Ansätze D5-D8 (THF). Der Anteil an ß-Carotin in den C16-Protein-Microbeads ist als Gewichtsprozent bezogen auf das Gewicht der C16-Protein-Microbeads angegeben.
Um die unterschiedlichen Färbungen der C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol zu reproduzieren, wurden die Ansätze D4 und D5 im größeren Maßstab wiederholt (Tab. 1.4). Wiederum erhielt man mit ß-Carotin aus THF gelbe C16-Protein-Microbeads und mit ß-Carotin aus THF/Isopropanol orange C16-Protein- Microbeads (Abb. 2).
Tab. 1 .4: Verpacken von ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol in C16-Protein- Microbeads durch Dialyse gegen 1 M Kaliumphosphatlösung
Abb. 1 : Dispersionen der C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol in Wasser. Von links nach rechts: Ansätze D1 -D4 (THF/Isopropanol) und Ansätze D5-D8 (THF). Der Anteil an ß-Carotin in den C16-Protein-Microbeads ist als Gewichtsprozent bezogen auf das Gewicht der C16-Protein-Microbeads angegeben.
Um die unterschiedlichen Färbungen der C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol zu reproduzieren, wurden die Ansätze D4 und D5 im größeren Maßstab wiederholt (Tab. 1.4). Wiederum erhielt man mit ß-Carotin aus THF gelbe
C16-Protein-Microbeads und mit ß-Carotin aus THF/Isopropanol orange C16-Protein- Microbeads (Abb. 2).
Tab. 1 .4: Verpacken von ß-Carotin aus THF und THF/Isopropanol in C16-Protein- Microbeads durch Dialyse gegen 1 M Kaliumphosphatlösung
Abb. 2: Dispersionen der C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF/Isopropanol (0,9 Gewichtsprozent ß-Carotin, Ansatz G1 , links) und THF (0,3 Gewichtsprozent ß- Carotin, Ansatz G2, rechts).
Freisetzung von ß-Carotin aus C16-Protein-Microbeads durch Verdau mit Proteinase K Um zu zeigen, dass das ß-Carotin in den C16-Protein-Microbeads durch Proteolyse freigesetzt werden kann, wurden 200 μl der Microbeaddispersionen G1 und G2 in Wasser mit 500 μl 5 mM Kaliumphosphat pH 8,0 vermischt. Im Anschluss wurden 5 μl Proteinase K (Roche, 19,45 mg/ml) zugegen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Als Kontrolle diente jeweils ein Ansatz der C16-Protein-Microbeaddispersionen ohne Proteinase K. Nach Übernachtinkubation wurde abzentrifugiert. In Anwesenheit der Protease wurden die C16-Protein-Microbeads verdaut und das ß- Carotin freigesetzt. Nach dem Abzentrifugieren war kein Pellet sichtbar. Der Überstand war deutlich gefärbt. Ohne Protease ließen sich die intakten C16-Protein-Microbeads abzentrifugieren. Es wurde ein deutlich gefärbtes Pellet beobachtet. Der Überstand war farblos.
Abb. 3 Verdau der C16-Protein-Microbeaddispersionen durch Proteinase K. A) C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF/Isopropanol (0,9 Gewichtsprozent ß- Carotin, Ansatz G1 ) ohne Protease; B) C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF/Isopropanol (0,9 Gewichtsprozent ß-Carotin, Ansatz G1) mit Protease; C) C16- Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF (0,3 Gewichtsprozent ß-Carotin, Ansatz G2) ohne Protease; D) C16-Protein-Microbeads mit ß-Carotin aus THF (0,3 Gewichtsprozent ß-Carotin, Ansatz G2) mit Protease.
Beispiel 2
Stabilität von ß-Carotin-enthaltenden Microbeads und Freisetzung von ß-Carotin aus Microbeads durch proteolytischen Verdau
Durch Behandlung von ß-Carotin-enthaltenden C16-Protein-Microbeads mit unter- schiedlichen Proteasen, welche im humanen Magen bzw. Darm aktiv sind sollte die Eignung von Protein-Microbeads als Speicher-, Transport- bzw. „Delivery"-System für pharmakologische Effektstoffe nachgewiesen werden.
Zur Herstellung ß-Carotin-haltiger C16-Protein-Microbeads wurden 80 mg ß-Carotin und 16 mg Vitamin E in 10 ml THF gelöst und anschließend mit 90 ml Isopropanol ver- dünnt. Ein Teil dieser Lösung wurde dann mit 10 Volumen C16-Proteinlösung (10 mg/ml in 5 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8) gemischt. Anschließend wurde der Ansatz mit 2 Volumen 1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8 versetzt. Die dabei entstandenen ß- Carotin-enthaltenden C16-Protein-Microbeads wurden abzentrifugiert und durch Waschen des Sediments mit Wasser überschüssiges, freies ß-Carotin entfernt. 20 mg ß-Carotin-enthaltende C16-Protein-Microbeads wurden mit 2 ml künstlichem Magensaft (6,4 mg Pepsin, 80 mM HCl, 4 mg NaCI) oder 2 ml künstlichem Darmsaft I (20 mg Pankreatin, 0,45 M Natriumphosphat pH 7,5, 0,9 mM Natriumtaurocholat) oder 2 ml künstlichem Darmsaft Il (20 mg Pankreatin, 0,45 M Natriumphosphat pH 7,5, 6 mM Natriumtaurocholat) resuspendiert und für 0, 1 , 2, 6, 24 und 48 h unter Schütteln (140 rpm) bei 37 °C inkubiert. Nicht proteolytisch abgebaute C16-Protein-Microbeads wurden über die Streuung der Suspension bei 600 nm bestimmt (Abb. 4). Intakte C16- Protein-Microbeads wurden anschließend abzentrifugiert und im Überstand der ß- Carotin-Gehalt durch Bestimmen der Absorption bei 445 nm analysiert (Abb. 5). Durch Behandlung mit Pepsin-haltigem künstlichen Magensaft konnten selbst nach 48 h kaum C16-Protein-Microbeads abgebaut (Abb. 4) und somit ß-Carotin freigesetzt (Abb. 5) werden. Bei Behandlung mit Pankreatin-haltigem künstlichen Darmsaft I und Il hingegen wurden C16-Protein-Microbeads schon innerhalb 6 h nahezu vollständig abgebaut (Abb. 4) und das enthaltene ß-Carotin freigesetzt (Abb. 5). Demnach würden C16-Protein-Microbeads die humane Magenpassage ohne wesentlichen Abbau über- stehen und erst im Darmtrakt die gebundenen Effektorstoffe durch proteolytischen Abbau freigeben.
Abb. 4: Bestimmung intakter C16-Protein-Microbeads durch photometrische Messung der Absorption bei 600 nm.
Abb. 5: Bestimmung des aus C16-Protein-Microbeads freigesetzten ß-Carotins durch photometrische Absorptionsmessung bei 445 nm.
Beispiel 3 Mikronisierung mit C16-Spinnenseidenprotein
2 g kristallines Lycopin und 0,4 g Alpha-Tocopherol wurden in 500 g THF gelöst. Die Wirkstofflösung wurde bei Raumtemperatur und einer Flussrate von 2,42 g/min kontinuierlich mit einer wässrigen Lösung, bestehend aus 0,2 g/l C16-Protein in 5 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 8), und einer Flussrate von 25,4 g/min vermischt. Die bei der Mischung entstandenen Wirkstoffteilchen wiesen im THF/Wasser-Gemisch eine Teilchengröße von 103 nm auf. Nach 2 Stunden zeigte sich eine klare Dispersionsstabilisierung der mit C16-Protein behandelten Probe (Abb. 6B) im Vergleich zur unbehandelten Probe (Abb. 6A). Auch nach mehreren Tagen schien die Lycopindispersion mit C16-Protein stabil, während die unbehandelte Lycopindispersion stark ausflockte (Abb. 7). Ein Teil der mit C16-Protein stabilisierten Lycopin-Dispersion wurde auf einen Feststoffgehalt von 0,28% aufkonzentriert. In diesem Zustand getrocknetes Lycopin wäre schlecht redispergierbar. Alternativ wurde eine mit C16- Protein stabilisierte Lycopin-Dispersion mit 330 mM Kaliumphosphat (Endkonzentration in der Mischung) behandelt und getrocknet. Das dabei erhaltene Lycopin-Pulver war gut redispergierbar.
Abb. 6: Formulierung von Lycopin mit C16-Spinnenseidenprotein. Absorption von unbehandelter Lycopin-Probe (A) und mit C16-Protein behandelter Lycopin-Probe (B) direkt nach Mischung (schwarzer Graph) bzw. 2 Stunden nach Mischung (roter Graph).
Abb. 7: Formulierung von Lycopin mit C16-Spinnenseidenprotein. Vergleich von unbehandelter Lycopin-Dispersion (links) mit einer C16-Protein-stabilisierten Lycopin- Dispersion (rechts) etwa 30 Tage nach Mischung.
Beispiel 4
Verpacken von Metazachlor aus Isopropanol in Microbeads und Freisetzung durch Proteolyse
Schwer wasserlösliche Pflanzenwirkstoffe lassen sich in Protein-Microbeads verpa- cken, welche aus amphiphilen selbstassemblierenden Proteinen hergestellt werden
und anschließend auch daraus freisetzen. Dazu wurde als nicht limitierendes Beispiel der Herbizid-Wirkstoff Metazachlor ausgewählt.
500 μl einer 10 mg/ml C16-Protein enthaltenden Kaliumphosphat-Lösung (5 mM, pH 8,0) wurden mit 100 μl einer Metazachlor-Lösung (50 mg/ml in Isopropanol) gemischt. Die C16-Protein-Microbeadbildung wurde durch Zugabe von 1 ml 1 M Kaliumphosphat- Puffer (pH 8,0) induziert. Der Ansatz wurde für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 10 min bei 20000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 5 ml H2O bidest. gewaschen und dann lyophilisiert. Als Kontrolle wurde ein gleicher An- satz ohne C16-Protein durchgeführt.
Nach Fällung mit Kaliumphosphat bildeten sich im Ansatz mit C16-Protein und Metazachlor Microbeads. Diese waren morphologisch mit denen eines Standardansatzes mit C16-Protein aber ohne Wirkstoff vergleichbar. Im C16-Metazachlor-Ansatz waren keine Metazachlor-Kristalle sichtbar. Im Ansatz Metazachlor ohne C16-Protein bildeten sich dagegen große Wirkstoffkristalle. Dies verdeutlicht, dass das C16-Protein signifikanten inhibierenden Einfluß auf die Kristallisation von Metazachlor in Anwesenheit von wässrigem Kaliumphosphat-Puffer hat.
Die Bestimmung der Metazachlor-Konzentration im Überstand nach C16-Proteinfällung bzw. C16-Microbeadbildung zeigte, dass etwa 90% des Wirkstoffes in die Protein- Microbeads verpackt bzw. mit diesen assoziiert vorlagen. In den Waschüberständen waren jeweils etwa 20% des Wirkstoffes enthalten.
Die lyophilisierten Metazachlor enthaltenden C16-Protein-Microbeads wurden in 1 ml 10 mM Tris-Puffer; 0,1 % SDS; 100 μg Proteinase K für 1 h bei 37°C proteolytisch verdaut. Die nach zehnminütiger Zentrifugation (20000 x g) aus diesem Ansatz zurück- bleibenden Wirkstoff-Kristalle wurden in 500 μl Isopropanol gelöst. Im Überstand des Proteaseverdaues wurde etwa 1 1 % der eingesetzten Metazachlor-Menge detektiert. Die in Isopropanol wieder gelösten Wirkstoff-Kristalle machten etwa 35% der eingesetzten Metazachlor-Menge aus.
Analyse der Wirkstoffverteilung (photometrische Bestimmung bei λ=215 nm)
Beispiel 5
Verpacken und Stabilisierung von Retinol in Protein-Microbeads
Schwer bzw. nicht wasserlösliche Wirkstoffe, welche labil gegenüber Einflüssen wie Sauerstoffradikalen, UV u.a. sind, lassen sich in Protein-Microbeads verpacken, welche aus amphiphilen selbstassemblierenden Proteinen hergestellt werden. Anschließend können sie auch wieder daraus freigesetzt werden. Zusätzlich werden die Wirk- Stoffe durch Formulierung bzw. Verpackung in Protein-Microbeads vor den schädigenden Einflüssen und daraus resultierendem Abbau geschützt. Um dies zu zeigen wurde als nicht limitierendes Beispiel der Wirkstoff Retinol ausgewählt, welcher in C16- Protein-Microbeads verpackt und unter Luftbegasung sowie homogener Durchmischung für mehrere Stunden gerührt wurde. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben entnommen und das verbliebene Retinol nach THF-Extraktion quantifiziert. Die in Tabelle 5.1 dargestellten Ansätze wurden untersucht. Dabei wurde zuerst die Retinol-THF-Lösung in Isopropanol verdünnt, anschließend mit der wässrigen C16- Proteinlösung versetzt und dann im Falle von Ansatz 1 die C16-Protein- Microbeadbildung durch Zugabe von 1 M Kaliumphosphatlösung induziert. Da das Vorhandensein von Kationen, z. B. durch Kaliumphosphat im C16-Protein- Verpackungsansatz, prinzipiell zur Steigerung der Oxidation von frei gelöstem oder partikulär auftretendem Retinol beiträgt, wurde in Kontrollansätzen mit und ohne C16- Spinnenseidenprotein, bei denen aber keine C16-Protein-Microbeadbildung induziert werden sollte, eine 154 mM Natriumchlorid-Lösung zugegeben (siehe Fisher et al., 1972, Biochem. J. 132: 259-270). Die Ansätze wurden in mit Plastikdeckeln verschließbaren Glasgefäßen unter Rühren auf einem Magnetrührer sowie kontinuierlicher Begasung über eine Kanüle bis zu 7 Stunden inkubiert. Bei Probennahme wurden je-
weils 4 x 300 μl entnommen, in welchen rechnerisch maximal je 9,38 μg Retinol enthalten sein sollten. Nach Entnahme wurden die C16-Microbeads des Verpackungsansatzes abzentrifugiert und das enthaltene Retinol mit 1 ,5 ml THF extrahiert und absorpti- onsphotometrisch bei 325 nm quantifiziert. Bei den Ansätzen ohne C16-Microbeads wurde direkt 1 ,5 ml THF zu den 300 μl Probe gegeben, die Probe gemischt und zentri- fugiert, um eine Phasentrennung zu erzeugen. Das dann in der oberen THF-Phase enthaltene Retinol wurde ebenfalls absorptionsphotometrisch bei 325 nm quantifiziert.
Ansatz 1 : Verpackungsansatz 0,9 ml lsopropanol (Fa. Sigma, kristallin)
0,1 ml Retinol 5mg/ml in THF
5 ml C16-Lösung 10 mg/ml in 5 mM K2HPO4-Puffer
10 ml 1 M K2HPO4-Puffer
Ansatz 2: Stabilisierungsansatz 0,9 ml lsopropanol (Fa. Sigma, kristallin)
„Coating" 0,1 ml Retinol 5mg/ml in THF
5 ml C16-Lösung 10 mg/ml in 5 mM K2HPO4-Puffer
10 ml 154 mM NaCI-Lösung
Ansatz 3: Kontrollansatz ohne 0,9 ml lsopropanol (Fa. Sigma, kristallin)
C16-Protein 0,1 ml Retinol 5 mg/ml in THF
5 ml 5 mM K2HPO4-Puffer
10 ml 154 mM NaCI-Lösung
Tab. 5.1 : Verschiedene Ansätze zur Quantifizierung der C16-Spinnenseidenprotein- vermittelten Oxidationsstabilität von Retinol.
In den Verläufen der Ansätze mit C16-Spinnenseidenprotein (Ansatz 1 -Verpackung in C16-Microbeads, Ansatz 2 - lösliches C16) ist im Vergleich zur Kontrolle ohne C16- Protein eine deutliche Stabilisierung von Retinol unter Luftsauerstoff zu beobachten (Tab. 5.2; Abb. 8) Während sich im Ansatz 2 die Retinolmenge ab 5-7 h allerdings auch deutlich reduziert, ist im Ansatz 1 , bei dem der Wirkstoff in die C16-Microbeads verpackt wurde, auch nach 7 h noch mehr als 70 % intaktes Retinol nachweisbar (Tab. 5.2; Abb. 8). Demnach scheint die Verpackung von Retinol in C16-Protein-Microbeads ein geeignetes Verfahren zu sein, mit dem eine Stabilisierung gegen Sauerstoffradikal- induzierten Abbau erzielt werden kann. Durch einen proteolytischen Abbau der Retinol- beladenen C16-Microbeads mit Proteinase K (2,25 U) in 1 ml 5 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8 konnte der Wirkstoff freigesetzt werden.
Tab. 5.2: Bestimmung der Retinol-Stabilität in C16-Formulierungsansätzen.
Abb. 8: Bestimmung der Retinol-Stabilität in C16-Formulierungsansätzen in Abhängig- keit von der Inkubationsdauer.
Um die maximale Beladungsdichte der C16-Microbeads mit Wirkstoff zu ermitteln, wurden in Verpackungsansätze (siehe Ansatz 1 ) verschiedene Mengen Retinol eingesetzt. Als Lösungsmittel für den Wirkstoff wurde hier ausschließlich THF genutzt. An- schließend wurde die C16-Protein-Microbeadbildung durch Zugabe von 1 M Kaliumphosphat-Puffer (pH 8,0) induziert. Der Ansatz wurde für 1 h bei 10 °C inkubiert und anschließend für 10 min bei 20000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Danach wurde der Wirkstoff durch Waschen der C16- Protein-Microbeads mit 2 ml THF herausgelöst und absorptionsphotometrisch bei 325 nm quantifiziert (siehe Tab. 5.3). Es zeigte sich, dass die maximale Beladungsdichte für Retinol in diesem Versuch bei etwa 1 ,9 mg pro eingesetzten 5 mg C16-Protein liegt (Tab. 5.3). Bei quantitativer Fällung zu C16-Microbeads liegt die Retinol- Wirkstoffkonzentration bzw. Beladungsdichte demnach bei etwa 38 %.
Tab. 5.3: Quantifizierung des in 5 mg C16-Microbeads verpackten und daraus wieder freigesetzten Retinols.
Beispiel 6
Verpacken von Ibuprofen aus THF in Microbeads und Freisetzung durch Proteolyse
Schwer bzw. nicht wasserlösliche pharmakologisch aktive Wirkstoffe lassen sich in Protein-Microbeads verpacken, welche aus amphiphilen selbstassemblierenden Prote- inen hergestellt werden. Anschließend können sie auch wieder daraus freigesetzt werden. Zusätzlich können diese Wirkstoffe durch Formulierung bzw. Verpackung in Protein-Microbeads vor den schädigenden Einflüssen, z.B. bestimmten Proteasen oder stark sauren pH-Werten und daraus resultierendem Abbau geschützt werden. Bestimmte Wirkstoffpartikelgrößen oder Wirkstoffstrukturen, welche besser resorbiert werden bzw. besser bioverfügbar sind, können durch Verpackung in Protein-Microbeads bzw. durch Mikronisierungsansätze unter Verwendung von amphiphilen selbstassemblierenden Proteinen eingestellt werden. Um dies zu zeigen wurde als nicht limitierendes Beispiel der Wirkstoff Ibuprofen [(RS)-2-(4-lsobutylphenyl)propionsäure] ausgewählt. 500 μl einer 10 mg/ml C16-Protein enthaltenden Kaliumphosphat-Lösung (5 mM, pH 8,0) wurden mit 100 μl einer Ibuprofen-Lösung (5 mg/ml in Isopropanol) vermischt. Die C16-Protein-Microbeadbildung wurde durch Zugabe von 1 ml 1 M Kaliumphosphat- Puffer (pH 8,0) induziert. Der Ansatz wurde für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 10 min bei 20000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit 5 ml H2O bidest. gewaschen. Nach Fällung mit Kaliumphosphat bildeten sich im Ansatz mit C16-Protein und Ibuprofen Microbeads. Diese waren morphologisch mit denen eines Standardansatzes mit C16-Protein aber ohne Wirkstoff vergleichbar. Die Verpackung von Ibuprofen in die C16-Protein-Microbeads erfolgte in diesem Ansatz quantitativ, weshalb im Überstand nach Induktion der Microbead-Bildung kein Ibuprofen absorptionsphotometrisch nach- gewiesen werden konnte. Durch einen unspezifischen proteolytischen Abbau der I- buprofen-beladenen C16-Microbeads mit Proteinase K (2,25 U) in 1 ml 5 mM Kaliumphosphatpuffer pH 8 konnte der Wirkstoff freigesetzt werden.
Ein proteolytischer Verdau der Ibuprofen-beladenen C16-Protein-Microbeads in einem Pepsin-enthaltenden Ansatz (analog Beispiel 2) führte nicht zur Freisetzung des Wirk- Stoffes. Die Behandlung der Ibuprofen-beladenen C16-Protein-Microbeads in Pankrea- tin-enthaltenden Ansätzen (analog Beispiel 2) führte zur Freisetzung des Wirkstoffes.
Die C16-Microbeads können demnach einen Schutz vor Magenprotease sowie den im Magen vorherrschenden sehr sauren pH-Werten vermitteln. Eine Freisetzung unter Darmbedingungen ist aber möglich. C16-Microbeads eignen sich deshalb u.a. für die Verpackung und Formulierung von per oral applizierten Wirkstoffen, die im Darm aufgenommen werden oder wirken, und die bei Magenpassage geschützt werden sollen.