WO2007055165A1 - 核酸の分離方法、核酸検査用マイクロリアクタ、核酸検査システム - Google Patents

核酸の分離方法、核酸検査用マイクロリアクタ、核酸検査システム Download PDF

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WO2007055165A1
WO2007055165A1 PCT/JP2006/322086 JP2006322086W WO2007055165A1 WO 2007055165 A1 WO2007055165 A1 WO 2007055165A1 JP 2006322086 W JP2006322086 W JP 2006322086W WO 2007055165 A1 WO2007055165 A1 WO 2007055165A1
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nucleic acid
microreactor
cells
flow path
liquid
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PCT/JP2006/322086
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Akihisa Nakajima
Koji Miyazaki
Yasuhiro Sando
Kusunoki Higashino
Youichi Aoki
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Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
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    • B01L2400/0403—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces
    • B01L2400/0415—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific forces electrical forces, e.g. electrokinetic

Definitions

  • nucleic acid separation method Nucleic acid detection microreactor, nucleic acid detection system
  • the present invention relates to a nucleic acid separation method, a nucleic acid detection microreactor, and a nucleic acid detection system including the microreactor. More specifically, the present invention relates to a nucleic acid detection microreactor having a pretreatment means to which a nucleic acid separation method is applied, and a nucleic acid test system including the microreactor.
  • ⁇ -TAS Micro total Analysis System
  • nanoreactor Nanoreactor
  • Lab_on-chips and biochip
  • its application is expected in the medical examination / diagnosis field, environmental measurement field, and agricultural production field. Yes.
  • skilled procedures, and equipment operations as seen in genetic testing, automation, acceleration, and simplification of microanalysis systems are costly and require samples.
  • the benefits of enabling analysis not only in volume and time but also in any time and place are enormous.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-322099
  • Patent Document 2 JP 2004-108285 A
  • Patent Document 3 Japanese Translation of Special Publication 2003-522521
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-217
  • Patent Document 5 WO02 / 23180
  • the present invention made in view of the above circumstances is a microreactor for nucleic acid detection that enables high-sensitivity analysis using a chip having a pretreatment means and a waste liquid reservoir even for a sample with a small amount or a low concentration. Propose.
  • the microreactor is of the disposal type in order to make the analysis tool less susceptible to infection and contamination.
  • the present invention aims to provide a nucleic acid test system that incorporates a simple configuration and a high-accuracy liquid feeding system, and enables high-precision analysis. Means for solving the problem
  • the method for separating nucleic acids of the present invention is a method for extracting and separating nucleic acids from cells
  • a liquid containing cells is sequentially passed through a filter A having a pore size larger than the cells and a filter B having a pore size smaller than the cells to hold the cells on the supply port side of the filter B
  • the cells are taken out into the washing solution by flowing a washing solution from the outlet of the filter B opposite to the side holding the cells.
  • the nucleic acid extract is then obtained by destroying the cells by passing the washing solution containing the cells through a cell disruption section holding vibrating beads.
  • the nucleic acid extract is introduced from the cell disruption section through the flow path into the nucleic acid capture section where the electric field is applied in the direction crossing the flow path, and the nucleic acid is collected on the force sword side of the nucleic acid capture section.
  • the beads are vibrated by the action of an external actuator attached to the upper surface of the cell destruction part that holds them.
  • This external actuator is preferably a piezoelectric.
  • the electric field is attached to an upper surface of the nucleic acid capturing unit or the contaminant capturing unit having a comb structure.
  • the cell filtration device of the present invention is a cell filtration device used for carrying out the step G) and the step (ii) in the nucleic acid separation method, wherein the filter A and the filter B are used.
  • the partition walls are arranged on the inlet side and the outlet side of the apparatus, respectively, and a space that can be sealed is formed by these partition walls and the side wall of the apparatus, and a cleaning liquid discharge pipe is passed through the side wall surface. Open and close each hole in the mouth and discharge pipe It is characterized by having means to be.
  • the microreactor for nucleic acid testing of the present invention is destroyed in the specimen receiving part that receives a liquid containing cells, the cell destruction part that destroys cells delivered from the specimen receiving part, and the cell destruction part
  • a specimen pretreatment section having a nucleic acid capture section for capturing nucleic acid released from cells, wherein the sample receiving section, the cell destruction section and the nucleic acid capture section are connected in a fine flow path. I'm going
  • the microreactor for nucleic acid detection of the present invention has a reagent storage section for storing a reagent, a waste liquid storage section, a micropump connection section, and a microchannel that communicates each section,
  • the cell disruption section has beads that are vibrated by an external actuator disposed in the cell disruption section to destroy the cells
  • the nucleic acid capturing unit captures a nucleic acid released from a cell destroyed by the cell destructing unit by an electric field applied to an external electrode disposed in the nucleic acid capturing unit.
  • the micropump connection portion includes:
  • a second flow path whose rate of change in flow path resistance with respect to a change in differential pressure is smaller than that of the first flow path; a pressure chamber connected to the first flow path and the second flow path;
  • the waste liquid storage section is provided at the bottom of the microreactor, and is characterized in that it is a hollow chamber communicating with at least the end of the specimen pretreatment section and the detection section.
  • microreactor for nucleic acid detection of the present invention comprises:
  • the pressure If the pressure is lower than the preset pressure, the pressure will block the passage of the liquid, and the pressure will be higher than the preset pressure. Then, the liquid feed control unit that allows the passage of liquid,
  • a backflow prevention unit for preventing backflow of liquid in the flow path
  • It is characterized by having a liquid feeding dividing means for controlling the liquid feeding and the quantity of the liquid feeding in the branched flow path.
  • a nucleic acid test system characterized in that a nucleic acid is measured by attaching the microreactor to the apparatus main body.
  • the nucleic acid detection system of the present invention separates the chip 'component, which is a microreactor for each specimen, and the control' detection component, which is the main body of the device, equipped with elements for reagents and liquid delivery systems. System configuration. Therefore, cross-contamination and carry-over are difficult for microanalysis and amplification reactions.
  • the microreactor chip has a very limited volume into which a sample can be introduced. Therefore, it is difficult to capture the target nucleic acid or bacteria when the concentration is low.
  • the microreactor for nucleic acid detection of the present invention it has a specimen pretreatment unit capable of extracting nucleic acids and genes as analysis target substances from cells, separating them and concentrating them. Therefore, the substance can be concentrated even in a dilute sample, and at the same time, harmful substances that interfere with the reaction and contaminants that clog the flow path can be excluded.
  • the microreactor for nucleic acid test of the present invention has a flow channel configuration that can simultaneously analyze positive control and negative control in order to eliminate the influence of reaction inhibition, contamination, and increase in backround. Such a microreactor realizes highly reliable and highly accurate analysis even with a very small amount of sample.
  • nucleic acid testing system and nucleic acid testing microreactor of the present invention are based on the configuration and analysis principle of the apparatus, and the conventional nucleic acid sequence analysis, restriction enzyme analysis, and nucleic acid hybridization. Much smaller sample volume compared to analysis It is clear that highly accurate results can be obtained with effort and a simple device.
  • the nucleic acid detection system of the present invention can be used for various gene analyzes, clinical tests, diagnosis, pharmaceutical screening, safety of drugs, agricultural chemicals or various chemicals, examination of toxicity, environmental analysis, food It can be used for inspection, forensic medicine, chemistry, brewing, fishery, livestock, agricultural production, agriculture and forestry. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a nucleic acid test system comprising a nucleic acid test microreactor and an apparatus main body.
  • FIG. 2 is a schematic view of a microreactor for nucleic acid testing in one embodiment of the present invention.
  • the micropump belongs to a separate device from the nucleic acid testing microreactor.
  • FIG. 3 is a schematic view of the cell filtration device of the present invention, with the upper view showing a front view and the lower view showing a cross-sectional view.
  • FIG. 4 is a diagram showing a procedure for recovering cells using a cell filtration device.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of a pretreatment unit attached to the nucleic acid detection microreactor of the present invention.
  • the left compartment represents a cell disruption part
  • the right part represents a nucleic acid capture part.
  • FIG. 6 shows a piezo pump
  • FIG. 3 (a) is a cross-sectional view showing an example of this pump.
  • FIG. 3 (b) is a top view thereof.
  • FIG. 3 (c) is a cross-sectional view showing another example of a piezo pump.
  • FIG. 7 is a diagram showing a configuration around a pump connection part of a microreactor for nucleic acid detection when the piezo pump is separated from the microreactor. Explanation of symbols
  • the nucleic acid detection microreactor of the present invention (hereinafter sometimes simply referred to as a microreactor) and a nucleic acid detection system including the microreactor, a micropump, various control devices, and a detection device will be described below.
  • the “specimen” is a fluid containing the nucleic acid to be measured.
  • “Gene” may also refer to DNA or RNA, which is simply a chemical entity, that refers to DNA or RNA that carries genetic information that expresses some function. These and the polynucleotide are collectively referred to as “nucleic acid”.
  • “Element” means a functional component installed in the microphone port reactor.
  • the “fine channel” is a channel formed in the microreactor of the present invention.
  • the method for separating nucleic acids of the present invention is a method for extracting and separating nucleic acids from cellular force
  • a liquid containing cells is sequentially passed through a filter A having a pore size larger than the cells and a filter B having a pore size smaller than the cells to hold the cells on the supply port side of the filter B
  • the cells are taken out into the washing solution by flowing a washing solution from the outlet of the filter B opposite to the side holding the cells.
  • the nucleic acid extract is introduced from the cell disruption section through the flow path into the nucleic acid capture section where the electric field is applied in the direction crossing the flow path, and the nucleic acid is collected on the force sword side of the nucleic acid capture section.
  • the filter mesh used in the method for separating nucleic acids of the present invention takes into consideration the size of cells, blood cells, winoles, bacteria, and the like.
  • the form of the filter and the thickness of the filter layer should be set appropriately according to the purpose. For example, insoluble materials and dust are first filtered out, and then two types of filters with different sizes are used in combination to carry out the prescribed treatment.
  • As the shape of the filter there is a force S such as a layered configuration, a resin layer, a hollow fiber aggregate configuration, etc., but it can be selected arbitrarily.
  • the filter A is a filter containing a target nucleic acid and having a pore size larger than that of the cells in the sample.
  • the filter A is a so-called “prefilter” for removing insoluble contaminants, dust, and the like by filtration.
  • the filter B is a “sterile filter” having a pore size smaller than that of the cell, and the cell cannot pass through the filter B.
  • the filter A having a large hole size filters coarse particles such as salt crystals, cell debris, hair, and tissue. Therefore, the average hole size should be small enough to filter the sample fluid force such coarse particles and large enough to pass the target cells and viruses containing nucleic acids. Selected. In general, the hole size should be in the range of about 2-25 ⁇ m, and preferably about 5 ⁇ m.
  • the filter B having a small hole size captures cells and viruses in the sample fluid.
  • the average hole size is selected according to the average size of the cell or virus containing the nucleic acid of interest. For example, 0.1 to 5 zm, preferably 0.5 to 2 zm.
  • the filter may be a commercially available filter such as cellulose acetate, Membrane filters such as cellulose nitrate mixed ester, polytetrafluoroethylene, polyethersulfone, nylon, polyvinylidene difluoride, and glass fiber are shown. Polycarbonate, polyethylene, polypropylene, and glass are used as filter housing materials. Etc.
  • the cells can be taken out into the washing solution by pouring the washing solution into the space from the take-out port on the side opposite to the cell holding side of the filter B.
  • the washing liquid in which the cells are dispersed is passed through the flow path to the cell destruction section that holds the vibrating beads.
  • the nucleic acid extract containing the released nucleic acid and the like is further passed through a nucleic acid capturing part to which an electric field is applied in a direction crossing the flow path.
  • Nucleic acids which are negatively charged linear molecules, tend to migrate and collect on the anode side.
  • Nucleic acids collected on the force sword side of the nucleic acid capture unit can be separated from the nucleic acid capture unit with a nucleic acid recovery solution.
  • the cleaning liquid, the extraction liquid, and the recovery liquid are not particularly limited, but are various salt solutions, buffer solutions, physiological saline, and aqueous solutions.
  • nucleic acid separation method of the present invention is easily carried out in the following sample filtration apparatus and specimen pretreatment unit installed on a microreactor.
  • the cell filtration device of the present invention is a cell filtration device used for carrying out the steps G) and (i) in the nucleic acid separation method of the present invention, and has the following configuration. Yes.
  • the filter A and the filter B are arranged as partition walls on the inlet side 81 and the outlet side 82 of the apparatus, respectively, and a space (filtration space) 86 that can be sealed is formed by these partition walls and the apparatus side wall.
  • the side wall surface has a cleaning liquid discharge pipe 83, and each hole in the inlet, the outlet and the discharge pipe has means that can be opened and closed arbitrarily (FIG. 3).
  • the space 86 is a filtrate reservoir, but preferably has a cylindrical shape, such as a syringe type.
  • the device is convenient.
  • Transparent plastics such as polyethylene, polypropylene, polycarbonate and the like are suitable materials because they are easy to handle and readily manufactured, but are not particularly limited thereto.
  • the opening for introducing the sample liquid containing cells, the outlet for discarding the filtrate, and the hole in the cleaning liquid discharge pipe for collecting the cleaning liquid have means that can be opened and closed. Open and close those holes as needed at each stage.
  • a preferable example of such means may be a detachable screw cap, a plug stopper or a three-way cock.
  • the size of the filtration device of the present invention is appropriately set depending on the type and concentration of the sample. In general:! ⁇ 50ml capacity is easy to handle and operate.
  • steps (i) and (ii) in the method for separating nucleic acids of the present invention can be carried out simply as follows (FIG. 4).
  • the inlet side 81 of the cell filtration device of the present invention is placed in a sample solution in a sample container (such as a blood collection tube, a urine cup, a vial, or a sample bottle) containing the collected sample liquid.
  • a sample container such as a blood collection tube, a urine cup, a vial, or a sample bottle
  • Aspirate from the outlet 82 on the opposite side and introduce the sample liquid into the filtration space (filtrate reservoir) 86 through the filter A84.
  • the portion remaining in the filtration space includes the particles and cells that cannot pass through the pores of the filter B85.
  • the suction may be performed by an appropriate pressure reducing means such as a water pump, but when there is no need to increase the amount of the specimen, a disposable syringe, a vacuum blood collection tube, or the like is used. Install it in the hole on the outlet side and suck it. In the case of a vacuum blood collection tube, it is automatically sucked after installation.
  • the filtrate that has passed through filter B is convenient because it is accommodated in a disposable syringe or vacuum blood collection tube.
  • a washing liquid is fed into the space from the take-out port side 82, and the liquid containing cells is washed. Unnecessary cleaning solution is removed by suction from the outlet side 82. Repeat if necessary.
  • the hole on the inlet side 81 is closed, the hole of the cleaning liquid discharge pipe 83 that has been closed until then is opened, air is supplied from the outlet side 82, and the air is pressurized, so that the inlet side is supplied from the outlet side. Remove the cleaning fluid from the open cleaning fluid drain.
  • the washing solution contains cells.
  • the washing solution containing the cells is directly injected into the sample receiving portion of the microreactor for nucleic acid analysis of the present invention. For this reason, it is preferable that the cleaning liquid discharge tube and the specimen receiving portion are joined in a liquid tight manner.
  • the position, size, etc., of the washing liquid discharge pipe provided on the side wall of the cell filtration device are designed to be optimal in the above relationship with the microreactor as a chip.
  • a needle tip may be attached to the washing liquid discharge tube and injected into the sample insertion port made of silicon rubber in the sample receiving part of the microreactor.
  • the configuration, size, etc. of the cell filtration device according to various circumstances of the specimen can be designed separately from the microreactor by using a separate device.
  • the cell filtration device of the present invention has a very simple configuration.
  • Insoluble contaminants can be removed in advance, and the cells can be easily separated from the sample solution.
  • a washing solution containing only the target cells can be injected into the sample receiving part of the microreactor in an appropriate amount.
  • the number of cells in the washing liquid in which the cells are suspended can be easily adjusted.
  • the nucleic acid to be detected especially the genes of microorganisms such as viruses or fungi (bacteria, fungi)
  • viruses or fungi are present at very low concentrations.
  • Gram-negative bacteria are present in less than 10 copies per milliliter of blood
  • Taliptosporidium is usually only a few copies per gallon of drinking water
  • anthrax is less than 100 copies per milliliter of water.
  • the microreactor chip has a very limited capacity for introducing the sample, so the concentration of the target bacteria in the sample solution is low. It is virtually impossible to capture this. Therefore, it is extremely useful that a large amount of sample solution can be passed through filter A and concentrated in filter B.
  • the cell filtration device of the present invention By using the cell filtration device of the present invention, it is possible to separate cells easily and cleanly without being contaminated by bacteria, viruses, etc., and to transfer the specimen to the nucleic acid detection microreactor of the present invention. .
  • a commercially available disposable syringe and syringe filter can be used to perform the same treatment as described above, although it is somewhat complicated. Specifically, first attach a commercially available syringe 'filter (a small-capacity filtration filter of the type attached to the syringe) equivalent to filter A to a plastic syringe of appropriate volume, and put the sample liquid in the sample liquid. Aspirate into syringe. Next, filter A is removed, and instead a commercially available syringe corresponding to filter B is attached as the second filter, and the sample liquid in the syringe is filtered through the filter by pushing the plunger.
  • a commercially available syringe 'filter a small-capacity filtration filter of the type attached to the syringe
  • the second filter can be removed, and a needle tip is attached instead, and the washing solution containing the cells can be transferred to the mouth reactor.
  • FIG. 1 is a schematic view in one embodiment of a nucleic acid inspection system comprising a microreactor for nucleic acid testing detachable from an apparatus main body and the apparatus main body.
  • FIG. 2 is a schematic view of a microreactor for nucleic acid detection according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention can be arbitrarily modified and changed in accordance with the spirit of the present invention, and these are included in the present invention. That is, as long as the structure, configuration, arrangement, shape, dimensions, material, method, method, etc. of the microreactor for nucleic acid detection and the nucleic acid detection system of the present invention are all or part of the present invention, are consistent with the spirit of the present invention, It can be various.
  • the microreactor 2 for nucleic acid detection shown in FIGS. 1 and 2 is a single chip produced by appropriately combining one or more members such as plastic resin, glass, silicon, ceramics and the like.
  • the micro flow path and the housing of the microreactor are formed of a plastic resin that is easy to process and inexpensive, and easy to dispose of by incineration.
  • polystyrene The resin is preferable because it has excellent moldability and has a strong tendency to adsorb streptavidin and the like, as will be described later, so that the detection part can be easily formed on the fine channel.
  • the fine channel is formed with a width of about 100 xm and a depth of about 100 zm, for example.
  • the detection part covering at least the detection part of the fine channel on the surface of the microphone outlet reactor is transparent.
  • Fig. 2 shows an example of a typical flow path configuration of the microreactor for nucleic acid detection of the present invention.
  • the nucleic acid test system of the present invention includes a device body 1 in which a micro pump, a control device that controls the micro pump, a temperature control device that controls temperature, a detection device, and the like are integrated, and the device body 1 is mounted.
  • Possible microreactor 2 When the sample liquid is injected into the sample receiving part of the microreactor 2 in which the reagent is preliminarily sealed and the microreactor 2 is attached to the main body 1 of the nucleic acid detection system, a mechanical connection for operating the liquid feed pump is necessary. For example, electrical connection for control is also made. Therefore, when the apparatus main body 1 and the microreactor 2 are joined, the flow path of the microreactor 2 is also activated.
  • the flow of analytes and reagents, amplification of nucleic acids based on mixing, reactions such as nucleic acid and probe binding, detection of reactants and optical measurement are a series of sequential steps.
  • Measurement data is stored in a file together with necessary conditions and recorded items, and nucleic acid measurement is automatically performed.
  • the detection device is an optical detection means such as a photodiode or a photomultiplier tube, which irradiates measurement light from, for example, an LED on the detection section on the analysis flow path for each inspection item. It is a device that detects transmitted light or reflected light. There are various optical devices with different principles as means of optical detection, but an ultraviolet / visible spectrophotometer is desirable. It may be a device incorporated in the above detection device, or may be connected as a separate device at the time of use.
  • the detection device for optically detecting the nucleic acid contained in the specimen is incorporated in the device main body 1 together with the liquid feeding means including the micropump and the temperature control device, It has an integrated configuration.
  • Control system, optical detection, data collection and processing related to control of liquid feeding, temperature and reaction constitutes the main body of the nucleic acid detection system of the present invention together with the micropump and the optical device.
  • the apparatus main body 1 is commonly used for a specimen sample by mounting a microreactor 2 for nucleic acid detection.
  • the reaction and detection such as amplification described above are performed under the conditions set in advance with respect to the order of delivery, volume, timing, etc., and the nucleic acid detection system as a program along with the micropump, temperature control, and optical detection data processing. It is built into the software installed in the.
  • the control program stored in the main unit 1 can be modified as appropriate.
  • nucleic acid test system of the present invention all components are miniaturized and are in a form that is convenient to carry. Therefore, the nucleic acid test system is excellent in workability and operability without being restricted by the place and time of use. Because it can be measured quickly regardless of location and time, it can be used for emergency medical treatment or for personal use in home medical care. Numerous micropump units used for liquid delivery are built into the main body 1 side, so the microreactor for nucleic acid testing can be used as a disposable type.
  • the microreactor and nucleic acid detection system for nucleic acid testing of the present invention can be suitably used particularly for testing genes or nucleic acids.
  • a mechanism for DNA amplification is installed on the nuclear acid detection microreactor.
  • the basic configuration of nucleic acids other than genes is almost the same.
  • the microreactor for nucleic acid test of the present invention has a sample receiving part, a sample pretreatment part, a reagent storage part, a waste liquid storage part, a micropump connection part, and a fine channel.
  • the cell filtration device has a specimen receiving part that receives a washing liquid containing cells through its washing liquid discharge pipe, and a cell destruction part and a nucleic acid capturing part that are specimen pretreatment parts. It communicates with the channel.
  • a cleaning liquid containing cells and viruses in the specimen receiving section is sent as a specimen liquid to the specimen pretreatment section through a fine flow path, and the specimen liquid is pretreated using the pretreatment means of the specimen pretreatment section.
  • the nucleic acid to be measured is extracted, separated, and concentrated, and the substance is measured by flowing it to the flow path constituting the reaction part and then the flow path constituting the detection part provided downstream of the fine flow path.
  • a nucleic acid detection microreactor characterized in that waste liquid generated as a result of concentration and measurement of nucleic acid is transferred to and confined in the waste liquid reservoir.
  • each element such as a liquid feed control section, a backflow prevention section, a reagent quantification section, and a mixing section has a microfabrication technique at a functionally appropriate position. It is installed by.
  • RNA it is converted to cDNA using an appropriate reverse transcriptase and then used for analysis.
  • Such a pre-processing operation is an operation different from a method in which a predetermined amount of sample is applied to a predetermined position of a conventional analysis chip at a time and the sample is measured.
  • the present invention is characterized in that it is composed of two stages: a pretreatment before the application to the nucleic acid detection microreactor and a pretreatment performed on the nucleic acid detection microphone reactor thereafter.
  • the specimen pretreatment unit is a part that preliminarily performs extraction, separation, concentration, and the like of the nucleic acid to be analyzed by cell destruction (bacterial or hemolysis).
  • the shape, structure, etc. are arbitrary, and pretreatment means such as vibrating beads and an electric field by an external electrode are applied.
  • an extraction liquid, a cleaning liquid, a recovery liquid, and the like are sealed as necessary.
  • the specimen pretreatment unit includes at least two independent parts in the flow path, a cell destruction unit, and a cell destruction unit. And a nucleic acid trap.
  • the specimen containing cells and viruses is sent from the specimen receiving section to the cell destruction section of the specimen pretreatment section.
  • the cell destruction part nucleic acids are extracted by physically destroying cells and viruses.
  • the cell destruction part provided on the fine flow path downstream from the specimen receiving part is a space that is wider than the flow path before and after it and spreads up and down. Inside the space, the required number of beads are added. And retained ( Figure 5). Therefore, it should be thick enough to provide space for the beads to move or to rupture cells or viruses.
  • the size of the beads needs to be larger than the diameter of the fine flow path so as to remain in the space, and if arranged, it is in the range of 50 to 600 / im, preferably 100 to 400 x m.
  • the average diameter of the beads does not need to be the same as long as it stays in the space inside the cell disruption that can be selected according to the cells, bacteria, or viruses to be ruptured by the beads.
  • the shape of the beads can be either porous or non-porous.
  • the material of the beads is not particularly limited, but suitable beads for rupturing cells or viruses include zirconia, borosilicate glass, lime glass, silica, and polystyrene beads. In particular, materials that do not adsorb nucleic acids are preferred.
  • Beads that remove unwanted substances eg, proteins and peptides
  • chemicals eg, salts, metal ions, surfactants
  • ion-exchange beads for removing proteins are known, and beads having a metal ion chelate H glaze such as iminoniacetic acid remove metal ions from biological samples.
  • the beads are vibrated by an external actuator attached to the cell destruction portion.
  • a piezoelectric PZT (lead zirconate titanate) ceramic resonator is a suitable example of such an actuator.
  • Cells that come into contact with or collide with beads that are vibrated by the PZT vibrator have their membrane structure destroyed, and intracellular substances are released out of the cells.
  • the intracellular substance contains the target nucleic acid.
  • bacterial cells and viruses are lysed very quickly, and as a result, the nucleic acid comes out into the liquid, and the nucleic acid extract becomes can get.
  • the vibration strength of the beads is appropriate for the type and nature of cells in the specimen. Just set it up.
  • a lysis agent for example, a surfactant, an enzyme, or an organic compound
  • a lysis agent for example, a surfactant, an enzyme, or an organic compound
  • the extract must be treated with chaotropic salt to denature contaminating proteins (enzymes used) and potentially interfering proteins.
  • the above chemical agent force suppresses subsequent DNA amplification
  • surfactants denaturants such as ethanol may change the water repellency of the water repellent valve of the fine flow path. This necessitates a step of separating the target nucleic acid from the chemical agent, resulting in a reduction in the amount of nucleic acid as well as complexity.
  • the nucleic acid capture unit may be located on the downstream side of the cell destruction unit and may be substantially adjacent.
  • a pair of external electrodes are attached to the outer surface of the chip that is located above and below the trapping part and the contaminant trapping part facing each other (Fig. 5).
  • An electric field is applied in the crossing direction.
  • electrophoresis is supplementarily performed for nucleic acid separation, an electric field is generated in a direction crossing the flow path and applied to cell components. Since the dimension across the flow path, for example, the width direction or height direction of the flow path, is extremely small compared to the length direction of the flow path, the applied voltage required to generate the desired electric field can be small.
  • the voltage applied between the channel widths is about 40-60V.
  • electrophoresis is performed as a driving force for biomolecules, it can be seen that a very low voltage can be applied compared to the need to apply a voltage of several kV. Note that the application of voltage to the electrodes and the action of the PZT vibrator of the cell destruction unit are electrically controlled from the apparatus body while the microreactor is mounted on the apparatus body.
  • the pair of opposed external electrodes may be formed by depositing an electrode such as platinum on the upper surface of the nucleic acid capturing unit or on the side wall of the channel.
  • these electrodes and the structure having a comb structure can be manufactured by an etching technique as disclosed in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-233792.
  • a nucleic acid extract containing a nucleic acid from the cell disruption section is sent to the nucleic acid capturing section through the fine channel.
  • the nucleic acid extract is passed through a nucleic acid capture section where an electric field is applied across the flow path, the nucleic acid having a negative charge moves toward the anode (anode) and hits the anode.
  • the positively charged contaminant is the opposite surface corresponding to the force sword (cathode), that is, the surface of the flat portion facing the concave comb structure in FIG. Is trapped).
  • the liquid containing other cell components passes through the trapping part and flows downstream.
  • the sample pretreatment unit receives the sample from the sample receiving unit 20 and the treatment liquid used for the pretreatment from the reagent storage unit 18 (which may be provided separately from the other reagent storage units), and the reagent storage unit. It communicates with the flow path from 18 to the reaction section downstream of the fine flow path. Since there is a waste liquid reservoir (waste liquid reservoir) on the bottom surface of the chip, for example, a valve disposed at the boundary with the pretreatment section is opened, and unnecessary sample pretreatment waste liquid and cleaning liquid are discarded there. be able to.
  • the nucleic acid capturing part preferably has a comb structure as a microstructure.
  • the nucleic acid is attracted by electrophoresis under an applied electric field to gather the nucleic acid at a high density away from the fluid flow.
  • the fluid is pumped out, but the nucleic acid is taken into the comb-shaped partial region so that it does not flow along with the fluid.
  • the comb-shaped structure does not occupy the entire cross-section of the flow path, and nothing is arranged on the other side of the flow path, so it does not obstruct the flow of fluid and is continuously efficient.
  • there is an advantage that the nucleic acid is separated from other components and recovered.
  • the nucleic acid collected in the concave nucleic acid capture unit on the anode side can be separated from the nucleic acid capture unit with a nucleic acid recovery solution.
  • the biasing means applies a voltage to the counter electrode so as to generate an electric field in the opposite direction to the nucleic acid
  • the nucleic acid is separated and collected more efficiently.
  • the electric field is turned off, the foreign matter trapped on the flat surface of the force sword (contaminant catching part) also detaches, but such foreign matter tends to flow out before the nucleic acid in the recess. Therefore, when changing the direction of the electric field, it is desirable to make adjustments so that the electric field is weaker than the trapped voltage.
  • Nucleic acids can be concentrated by such treatment.
  • the pre-treated specimen as described above can then be The liquid is divided into two or more micro channels for sample analysis by the following liquid sending and dividing means, and is sent to the downstream analysis flow channel that communicates.
  • the divided specimens enter from the Sampno report into the fine channel through which the reagents flow.
  • the sample receiving part 20 of the microreactor for nucleic acid detection of the present invention has the following configuration.
  • the sample receiving unit 20 communicates with the sample injection unit to temporarily store the sample (that is, the above-described washing liquid containing cells or viruses) and supply the sample to the mixing unit.
  • the cell-containing liquid injected into the sample receiving unit 20 is connected to the micropump 11 and the pump connection unit 12, and is sent to the sample pretreatment unit by these actions.
  • the portion (sample injection portion) for injecting the sample on the upper surface of the sample receiving portion 20 is made of an elastic material such as a rubber-like material to prevent leakage, infection and contamination to the outside and to ensure sealing performance. It is desirable that the plug is covered with a resin or reinforced film such as polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • the specimen in the syringe is injected with a needle pierced with the stopper made of the rubber material or a needle through a pore with a lid. In the former case, it is preferable that the needle hole is immediately closed when the needle is pulled out. Alternatively, you can install another specimen injection mechanism.
  • the sample to be measured in the present invention is not particularly limited to a biological sample itself, but most biological samples such as whole blood, plasma, serum, buffy coat, urine, feces, saliva, sputum, etc.
  • the sample is applicable.
  • gene, DNA or RNA is the target of analysis as a nucleic acid that is a type of amplification reaction.
  • the specimen may be prepared or isolated from a sample that may contain such nucleic acid. Therefore, in addition to the above samples, cell cultures; nucleic acid-containing samples such as viruses, bacteria, molds, yeasts, plants and animals; samples that may contain or contain microorganisms, and other nucleic acids. Any sample that may be present is considered.
  • the microreactor for nucleic acid testing of the present invention requires a very small amount of sample compared to the case of manual testing. For example, a blood sample of about 2 to 3 zL is simply injected into a chip with a length and width of several centimeters. For example, in the case of genes, 0.001 to 100 ng as DNA It is. For this reason, including the case where only a very small amount of specimen can be obtained, the nucleic acid detection mic mouth reactor of the present invention has few restrictions on the specimen surface, and inevitably requires a small amount of reagents, and the inspection cost is low. Reduction.
  • the waste liquid storage part is a hollow chamber provided at the bottom of the microreactor, and it should be used to store excess specimens, cleaning liquid generated in the specimen separation / concentration process, waste liquid, and waste liquid generated as a result of specimen reaction and measurement. It is a sealed waste liquid reservoir for storing.
  • the specimen pretreatment unit when the analyte concentration step is performed as a pretreatment, it is necessary to treat the waste liquid generated by the concentration and washing. Such waste liquid is less troublesome to store automatically inside than to be discharged outside the microreactor for processing.
  • the waste liquid storage part is provided immediately below the valve part of the specimen pretreatment part of the microreactor, and communicates with at least the specimen pretreatment part, the reaction part of the flow path, the end part of the detection part and the like and has a necessary capacity.
  • Any hollow structure in which a through-hole communicating with each part that generates waste liquid is formed may be used.
  • the waste liquid storage part may be in the form of a multi-compartment cavity divided into a plurality of compartments that may be a single hollow chamber.
  • the volume, shape, etc. are not particularly limited, but it is necessary to consider the strength of the chip itself and the space limitations associated with the arrangement of other elements.
  • the capacity of the waste liquid storage part is several hundreds of square liters when it is provided at the bottom of most chips of several centimeters square.
  • a valve that opens and closes at an appropriate place in the through hole may be provided as necessary so that the waste liquid in the waste liquid reservoir does not enter other parts of the microreactor or leak outside. Good.
  • the installation and structure of the waste liquid reservoir further provide the following advantages to the user. Workers who analyze clinical samples are always at risk of infection from the sample, such as bacteria or viruses. Not only the handling and pre-treatment of specimens, but also the treatment of cleaning liquid during measurement and waste liquid after measurement are not only complicated, but there is still a risk of infection and the possibility of environmental pollution.
  • a waste liquid storage part is provided at the bottom of the microphone mouth reactor, and all of the above unnecessary specimens, waste liquids, etc. are finally disposed in the waste liquid reservoir. Yes.
  • This waste liquid reservoir is completely sealed inside the microreactor, and is a disposable type nucleic acid test microarray of the present invention. After use, the reactor is stored in a hazard box installed in the inspection room and incinerated.
  • the microreactor for nucleic acid testing of the present invention In the microreactor for nucleic acid testing of the present invention, necessary reagents (including a cleaning solution) are sealed in a predetermined amount in a reagent storage unit 18 in the microreactor in advance. Accordingly, the microreactor for nucleic acid testing of the present invention is ready for use without having to fill the required amount of reagent each time it is used.
  • necessary reagents are known, and various reagents for amplification, probes used for detection, color reagents, and the like can be mentioned.
  • a micropump 11 is provided for each of the specimen receiving part 20, the reagent containing part 18 and, if necessary, the control containing part, to feed the contents of these containing parts.
  • the micropump 11 is connected to the upstream side of the reagent storage unit 18, and supplies the driving liquid to the reagent storage unit side by the micropump 11, thereby pushing out the reagent to the flow path and feeding the liquid.
  • the micropump unit is incorporated in an apparatus main body (nucleic acid detection apparatus) separate from the microreactor. By attaching the microreactor to the apparatus main body, the micropump unit is connected to the microreactor from the pump connection portion 12. (Fig. 7).
  • a piezo pump is used as the micro pump. That is,
  • a second flow path whose rate of change in flow path resistance with respect to a change in differential pressure is smaller than that of the first flow path; a pressure chamber connected to the first flow path and the second flow path;
  • a medicine container is provided, and a pump connection part is provided on the upstream side of each of these container parts, and the micropump is connected to these pump connection parts, and the driving liquid is supplied from each micropump.
  • the reaction liquid necessary for gene amplification analysis is started by extruding the sample solution and the reagent in each container and joining them together.
  • Mixing of reagent and reagent, and mixing of specimen and reagent may be performed at a desired ratio in a single mixing section, or a plurality of merging sections may be provided by dividing either force or both. They may be mixed so as to have a desired mixing ratio.
  • the form of such a reaction part is not particularly limited, and various forms and modes are conceivable. Basically, at least two kinds of liquids including a reagent and a specimen liquid are fed by a micropump and joined together,
  • a fine channel that is provided first from the merging portion and in which each of the liquids is diffused and mixed, and is provided first from a downstream end of the fine channel, and a space wider than the fine channel, It is preferable to provide a liquid reservoir for storing and reacting the mixed liquid that has been diffusively mixed in the fine channel.
  • the amplification method is not limited.
  • DNA amplification technology can use PCR amplification methods that are widely used in various fields.
  • Various conditions for implementing the amplification technique have been examined in detail and described in various documents including improvements.
  • the present inventors have already proposed a flow channel device that enables temperature control suitable for a microchip ( JP 2004-108285 A).
  • This device system may be applied to the amplification flow path of the microreactor for nucleic acid detection of the present invention.
  • the heat cycle can be switched at high speed, and the microchannel is a micro reaction cell with a small heat capacity. This can be done in a much shorter time than the method.
  • the ICAN (Isothermal chimera primer initiated nucleic acid amplification) method recently developed as an improvement of the PCR amplification method is 50-65. It has a feature that DNA amplification can be carried out in a short time at an arbitrary constant temperature in C (see Japanese Patent No. 3433929). Accordingly, the ICAN method is a suitable amplification technique because the nucleic acid detection microreactor of the present invention requires simple temperature control. In the manual operation, this method, which takes 1 hour, is completed in 10 to 20 minutes, preferably 15 minutes, in the nucleic acid detection microreactor of the present invention.
  • a detection unit for detecting amplified nucleic acid is provided on the downstream side of the reaction unit of the fine channel. At least the detection part is made of a transparent material, preferably a transparent plastic, in order to enable optical measurement. Furthermore, the biotin-affinity protein (avidin, streptavidin) adsorbed on the detection section on the microchannel is either piotin labeled on the probe substance or piotin labeled on the 5 'end of the primer used for gene amplification reaction. Binds specifically. As a result, the probe labeled with biotin or the amplified nucleic acid is trapped in this detection unit.
  • biotin-affinity protein avidin, streptavidin
  • the method for detecting the separated amplified nucleic acid is not particularly limited, but as a preferred embodiment, it is basically carried out in the following steps. That is, using the microreactor for nucleic acid detection of the present invention,
  • a step of amplifying the nucleic acid in the microchannel of the reaction unit a step of mixing the amplification reaction solution containing the amplified nucleic acid and the denaturing solution in the microchannel, and denaturing the amplified DNA into a single strand, A solution obtained by denaturing the amplified DNA into a single strand is sent to the detection section in the microchannel adsorbed with the piotin affinity protein, and the amplified nucleic acid is trapped through the trapping of the amplified gene.
  • a probe DNA whose end is fluorescently labeled with FITC fluorescein isothiocyanate is allowed to flow through the detection section in the fine channel, and this is hybridized to the immobilized gene.
  • FITC fluorescently labeled with fluorescein isothiocyanate
  • a gold colloid solution whose surface is modified with an anti-FITC antibody that specifically binds to FITC is allowed to flow into the microchannel, and the gold colloid is adsorbed to the FITC-modified probe hybridized to DNA.
  • streptavidin When streptavidin is immobilized in a microchannel formed on a polystyrene substrate, it is not necessary to perform a special chemical treatment. It is only necessary to apply the piotino-affinity protein onto the fine flow path downstream of the amplification reaction part and to adsorb the biotin-affinity protein onto the flow path.
  • a probe DNA for genetic testing fluorescently labeled oligonucleotides are preferably used.
  • the DNA base sequence a sequence that is complementary to a part of the gene base sequence to be detected is selected. By appropriately selecting the base sequence of the probe DNA, it is possible to detect with high sensitivity without being affected by the coexisting DNA and background by specifically binding to the target gene.
  • FITC anti-FITC antibodies for example, gold colloid anti-FITC anti-mouse IgG are preferable because they are available.
  • the probe may be labeled with horseradish peroxidase (HRP) instead of the fluorescent dye.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Typical coloring substances for this purpose are 3,3 ', 5,5' _tetramethylbenzidine (0 ⁇ 48), 3,3'-diaminobenzidine (D AB), p-phenylenediamine (OPD) Etc. are known.
  • enzyme / chromogenic systems such as alkaline phosphatase and galactosidase can be used.
  • Preferred embodiments of the microreactor for nucleic acid testing of the present invention include: Within one chip,
  • a sample pretreatment unit for performing pretreatment of the sample for performing pretreatment of the sample
  • a reagent container for storing reagents used in probe binding reactions, detection reactions (including gene amplification reactions, etc.);
  • a probe container that houses a probe for example, a probe that is hybridized to a gene to be detected amplified by a gene amplification reaction
  • a pump connection portion connectable to a separate micropump for feeding the liquid in each storage portion and the flow path;
  • a micropump is connected to the chip via a pump connection unit, and the nucleic acid extracted from the sample stored in the sample receiving unit and the reagent stored in the reagent storage unit are fed to the channel, and the microchannel
  • the reaction solution for example, the amplification reaction portion, is mixed and reacted, and then the processing solution obtained by treating the reaction solution and the probe accommodated in the probe accommodating portion are sent to the detection portion in the downstream flow path. Liquid, mix in the flow path and bind (or hybridize) with the probe, detect nucleic acid based on this reaction product,
  • the sample pretreatment unit and the detection unit communicate with each other through a through-hole, and is a hollow chamber provided at the bottom of the microreactor. Measurement of excess sample, cleaning liquid generated in the sample concentration process, waste liquid, and sample As a result, it is configured to have a waste liquid storage portion that is a sealed waste liquid reservoir for storing the generated waste liquid and the like.
  • the liquid feed dividing means includes a branched fine channel, a liquid feeding control unit 13 and a backflow prevention unit.
  • the liquid supply control unit 13 blocks the passage of the liquid until the liquid supply pressure in the forward direction (usually the direction in which the fluid is pushed out by the pump, that is, the downstream direction) reaches a predetermined pressure, and supplies the liquid above the predetermined pressure. Allow fluid to pass by applying hydraulic pressure.
  • the backflow prevention unit that prevents the backflow of the liquid in the flow path is a check valve in which the valve body closes the flow path opening due to the backflow pressure, or the valve body is moved to the flow path opening by the valve body deforming means. It consists of an active valve that presses and closes the opening.
  • the micropump In the microchannel of the microreactor for nucleic acid test of the present invention, the micropump, a liquid feeding control unit capable of controlling the passage of liquid by the pump pressure, and a backflow prevention for preventing the backflow of the liquid in the channel Depending on the part, the liquid feeding, the fixed amount of the liquid feeding amount, and the mixing of each liquid in the branched flow path are controlled. Reagents and specimens are divided at an appropriate ratio by the powerful liquid dividing means and the action of the micro pump 11.
  • Nucleic acid analysis is usually performed in parallel with sample analysis by adding a negative control to the analysis. This is because it is essential for correction of contamination, for example, color development and fluorescence of substances mixed in reagents. Furthermore, in order to increase the reliability of the analysis results, it is also necessary to add positive controls. This is useful for detecting interfering factors in added reagents, verifying the appropriateness of set conditions, and nonspecific interactions. Similarly, it is often necessary to provide internal control, especially for quantitative analysis.
  • Simultaneous positive control and internal control are particularly important for gene amplification by PCR. This is because it is particularly necessary to check that the PCR reaction is occurring correctly. For example, when a problem occurs, it is optimal for verifying whether it originates from set conditions, reagents, operation, analysis system, or sample. The ability of PCR to amplify trace amounts of genes present in specimens several hundred thousand to several million times, and the effects of contamination such as cross-contamination are extremely serious.

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Abstract

　本発明は、前処理手段を有し、信頼性で可能とする核酸検査用マイクロリアクタおよび核酸検査システムを提供する。 本発明の核酸検査システムは、試薬類・送液系用のエレメントを搭載した、検体ごとのチップコンポーネントと、検査装置本体として、制御・検出コンポーネントとを別個にするシステム構成である。検体中の核酸を抽出し、濃縮する前処理工程を行う検体前処理部を有するため、希薄試料であっても該物質を濃縮することができ、同時に反応を妨害する有害物質、流路の目詰まりを起こす夾雑物を除外する。また、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールも同時に分析できる流路構成を有する。したがって、微量分析、増幅反応に対し、クロス・コンタミネーション、キャリーオーバー・コンタミネーションといった深刻な問題が生じにくい。

Description

明 細 書
核酸の分離方法、核酸検查用マイクロリアクタ、核酸検查システム 技術分野
[0001] 本発明は、核酸の分離方法、核酸検查用マイクロリアクタおよびこのマイクロリアクタ を含む核酸検查システムに関するものである。さらに詳しくは、核酸の分離方法を適 用した前処理手段を有する核酸検查用マイクロリアクタおよびこのマイクロリアクタを 含む核酸検査システムに関する。
背景技術
[0002] 近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試 料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段 (例えばポンプ、バルブ、 流路、センサーなど)を微細化して 1チップ上に集積化したシステムが開発されている 。これ〖ま、
μ -TAS (Micro total Analysis System)、ノ ィォリアクタ、ラブ'オン'チップ（Lab_on -chips)、バイオチップとも呼ばれ、医療検査 ·診断分野、環境測定分野、農産製造 分野でその応用が期待されている。とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑なェ 程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、 自動化、高速化および 簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時 間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。
[0003] 臨床検查を始めとする各種検查を行う現場では、場所を選ばず迅速に結果を出す これらの分析用チップにおける測定においても、その定量性、解析の精度などが重 要視される。分析チップではそのサイズ、形態の点から厳しい制約があるため、シン プルな構成で、高い信頼性の送液システムを確立することが課題となる。そのため精 度が高ぐ信頼性に優れるマイクロ流体制御素子が求められている。これに好適なマ イク口ポンプシステムを本発明者らはすでに提案している（特許文献 1および 2)。
[0004] チップ上で検査などを行うために、試料の必要量を極少の量とし、必要とされる試 薬量も少なくて済む分析の微量化を図ることは、マイクロリアクタに求められる最大課 題である。ところが試料によっては、検出対象である遺伝子または核酸の濃度が希薄 であることがある。チップに導入できる検体量も限られていることから、そうした検体量 では測定可能な範囲内に収まらない。したがって、チップに導入する前に予備的な 濃縮または分離の操作が必要となってくる。あるいは微量の反応生成物を高感度で し力も簡便に検出、または定量できる機構をチップに搭載することが必要とされる。遺 伝子の検出では、 PCR (polymerase chain reaction)法による増幅反応を利用するの が通例である。血液などの生体液を試料とする場合、そのまま検体として分析に供す ることができないことが多ぐ通常は何らかの前処理をカ卩えることが要求されることも多 い。
[0005] 生物試料から核酸を抽出、分離する方法として、化学的方法または物理的方法が 用いられる。後者に属する方法として、振動するビーズの作用により細胞から核酸を 抽出する方法 (特許文献 3)、電場を適用して分離、濃縮する方法 (特許文献 4およ び 5)が報告されている。これらの方法をそのまま超微細な装置のマイクロリアクタに 適用することには、多くの問題がある。
[0006] このように簡便かつ迅速な検査手段を提供するマイクロリアクタには、実用上依然と して解決すべき具体的な問題、要望が提起され、その解決が望まれている。
特許文献 1：特開 2001-322099号公報
特許文献 2：特開 2004-108285号公報
特許文献 3：特表 2003-522521号公報
特許文献 4：特開 2004-217号公報
特許文献 5： WO02/23180号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 上記の実状に鑑みてなされた本発明は、微量または濃度が希薄な試料であっても 前処理手段および廃液溜りを有するチップにより、高感度の分析を可能とする核酸 検查用マイクロリアクタを提案する。し力も感染および汚染の危険の少ない分析ツー ルとするために、そのマイクロリアクタは、デイスポーサルタイプとしている。さらに本発 明はシンプルな構成と高精度の送液システムを組み込み、し力も精度の高い分析を 可能とする核酸検査システムを提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0008] 本発明の核酸の分離方法は、細胞から核酸を抽出し、分離する方法であって、
(i)細胞を含む液体を、該細胞より大きい孔径のフィルター Aと、該細胞より小さい孔 径のフィルター Bとに順次通過させて該フィルター Bの供給口側に該細胞を保持する
(ii)該フィルター Bの該細胞を保持する側と反対側の取り出し口から、洗浄液を流す ことにより、該細胞をその洗浄液中に取り出す、
(iii)次いで該細胞を含む洗浄液を、振動するビーズを保持する細胞破壊部に通すこ とにより、該細胞を破壊して核酸抽出液を得る、
(iv)その細胞破壊部から流路を通して該核酸抽出液を、電場が流路を横断する方向 にかけられている核酸捕捉部に導入して、その核酸捕捉部の力ソード側に核酸を集 める、
(v)その核酸捕捉部の力ソード側に集められた核酸を、核酸回収液で該核酸捕捉部 から
回収する、
ことを特徴としている。
[0009] 前記ビーズが、それらを保持する該細胞破壊部の上面に付設された外部ァクチュ エータの作用により振動させられている。この外部ァクチユエータは、好ましくは圧電
PZTセラミック振動子である。
[0010] 前記電場が、櫛型構造の該核酸捕捉部もしくは夾雑物捕捉部の上面に付設された
、 1対の外部対向電極により印加されることが望ましい。
[0011] また、前記核酸捕捉部の力ソード側に集まった核酸を回収する際に、電場の当初 の方向を逆転するように電圧を外部対向電極に印加することが望ましレ、。
[0012] 本発明の細胞ろ過装置は、上記の核酸の分離方法における前記ステップ G)およ びステップ (ii)を実施するために用いる細胞ろ過装置であって、前記のフィルター A およびフィルター Bを、隔壁としてそれぞれ装置の入り口側と取り出し口側に配置し、 これらの隔壁と装置側壁とにより密閉可能な空間が形成されるともに、その側壁面に 洗浄液排出管を貫通させており、入り口、取り出し口および排出管にある各穴が開閉 される手段を有することを特徴としている。
[0013] 本発明の核酸検查用マイクロリアクタは、細胞を含有する液を受ける検体受容部、 並びに、該検体受容部から送出される細胞を破壊する細胞破壊部及び該細胞破壊 部において破壊された細胞から放出される核酸を捕捉する核酸捕捉部を有する検 体前処理部を備えており、前記検体受容部、細胞破壊部及び核酸捕捉部が微細流 路で連通されてレ、ることを特徴としてレヽる。
[0014] さらに、本発明の核酸検查用マイクロリアクタは、試薬を収容する試薬収容部、廃液 貯留部、マイクロポンプ接続部および各部を連通する微細流路を有し、
前記微細流路の下流に前記検体前処理部で前処理された検体液と前記試薬収容 部に収容される試薬が反応する反応部を構成する流路、及び該反応部で反応して 得られる反応物を検出する検出部を構成する流路が設けられていることを特徴として いる。
[0015] 前記細胞破壊部は、該細胞破壊部に配置される外部ァクチユエータにより振動さ せられて細胞を破壊するビーズを有し、
前記核酸捕捉部は、該核酸捕捉部に配置される外部電極に印加される電場により、 前記細胞破壊部で破壊された細胞から放出される核酸を捕捉する、ことを特徴として いる。
[0016] 前記マイクロポンプ接続部は、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、 該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのァクチユエータと、
を有するマイクロポンプに接続されることを特徴としている。
[0017] 前記廃液貯留部が、マイクロリアクタの底部に設けられ、少なくとも前記検体前処理 部および前記検出部の端部と連通した中空室であることを特徴としている。
[0018] また、本発明の核酸検查用マイクロリアクタは、
分岐した微細流路と、
予め設定された圧より低レ、圧では液体の通過を遮断し、予め設定された圧以上の圧 では液体の通過を許容する、送液制御部と、
流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部と、
から構成され、
分岐した流路内における液体の送液および送液量の定量を制御する送液分割手段 を有することを特徴としてレ、る。
[0019] さらに、細胞から抽出された核酸の検出を光学的に行う検出装置とともにマイクロポ ンプおよび温度の制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能 な前記本発明の核酸検査用マイクロリアクタとからなり、装置本体に該マイクロリアクタ を装着することにより、核酸の測定を行うことを特徴としている核酸検査システムも本 発明に含まれる。
発明の効果
[0020] 本発明の核酸検查システムは、試薬類 ·送液系用のエレメントを搭載した、検体ごと のマイクロリアクタであるチップ 'コンポーネント、装置本体である制御'検出コンポ一 ネントとを別個にするシステム構成である。よって微量分析、増幅反応に対し、クロス' コンタミネーシヨン、キャリーオーバ^ ~ ·コンタミネーシヨンが生じにくレ、。
[0021] マイクロリアクタのチップでは検体を導入できる容量がきわめて限られているために 、 目的の核酸または菌の濃度が薄いとこれを捕捉することが困難となる。本発明の核 酸検查用マイクロリアクタの構成によれば、細胞から分析対象物質である核酸、遺伝 子を抽出し、分離して濃縮することが可能な検体前処理部を有する。したがって希薄 試料でも該物質を濃縮することができ、同時に反応を妨害する有害物質、流路の目 詰まりを起こす夾雑物を除外することもできる。
[0022] 本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、反応阻害、コンタミネーシヨン、バックダラ ゥンドの上昇などによる影響を排除するために、ポジティブコントロールおよびネガテ イブコントロールも同時に分析できる流路構成を有する。このようなマイクロリアクタに より、超微量の検体量であっても、信頼性の高い高精度の分析を実現する。
[0023] 本発明の核酸検査システムおよび核酸検査用マイクロリアクタを用いることによる各 種遺伝子検査法は、その装置の構成と分析原理から、従来の核酸配列分析、制限 酵素分析、核酸ハイブリダィゼーシヨン分析と比べ、はるかに少ない検体量、僅かな 手間と簡便な装置により高い精度の結果を得ることができることが明らかである。
[0024] 本発明の核酸検查システムは、遺伝子の種々の解析、臨床検查 '診断、医薬スクリ 一二ング、医薬、農薬あるいは各種化学物質の安全性 ·毒性の検査、環境分析、食 品検査、法医学、化学、醸造、漁業、畜産、農産製造、農林業等で利用可能である。 図面の簡単な説明
[0025] [図 1]図 1は、核酸検査用マイクロリアクタと装置本体とからなる核酸検査システムの概 略図である。
[図 2]図 2は、本発明の一実施形態における核酸検査用マイクロリアクタの概略図で ある。なお、マイクロポンプは、核酸検査用マイクロリアクタとは別途の装置に属する。
[図 3]図 3は、本発明の細胞ろ過装置の概略図であり、上図が正面図、下図が断面図 を示す。
[図 4]図 4は、細胞ろ過装置を使用して細胞を回収する手順を示した図である。
[図 5]図 5は、本発明の核酸検查用マイクロリアクタに付設された前処理部の断面図 を示す。左側のコンパートメントは、細胞破壊部、右側が核酸捕捉部を表す。
[図 6]図 6は、ピエゾポンプを示し、図 3 (a)は、このポンプの一例を示した断面図、図
3 (b)は、その上面図である。図 3 (c)は、ピエゾポンプの他の例を示した断面図であ る。
[図 7]図 7は、ピエゾポンプをマイクロリアクタとは別体とした場合における核酸検查用 マイクロリアクタのポンプ接続部周辺の構成を示した図である。 符号の説明
[0026] 1 装置本体
2 マイクロリアクタ（検査チップ）
3 ペルチヱ素子
4 ヒーター
5 ホトダイオード
6 LED
10 駆動液タンク
11 マイクロポンプ（ピエゾポンプ） ポンプ接続部 送液制御部 流路 試薬収容部 検体 検体受容部 駆動液収容部 封止液収容部 空気抜き用流路 試薬
上側基板 基板
振動板 圧電素子 加圧室 第 1流路 第 2流路 第 1液室 第 2液室 シリコン基板 ポート ポート 入り口側 取り出し口側 洗浄液排出管 フィルター A フィルター B ろ過空間 発明を実施するための最良の形態
[0027] —般に、血液、尿などの生物試料は、試料に含まれる不要成分 (タンパク質、脂質 やイオン性物質など）を除去するために、分析に先立って検体の前処理が必要とす ることが通例である。マイクロリアクタにおいても、搭載された分析システムが優れた性 能を発揮できるのは、検体が標準品のような理想的な状態にある場合に限られること も往々にしてあり、検体前処理が適切に行われているかが分析の成否を左右するこ とも多い。しかし試料の前処理自体が煩雑な時間の力かる工程であって、しかも適切 に実施するのにも技術と経験が必要とされるのが現状である。特に臨床現場からの 試料は、ウィルス、細菌などの感染、汚染の危険性を常に内包している。そうした試 料の前処理もまた、分析 ·検出を行う同一のチップにおいて、その全体または一部で あっても安全に実施でき、測定可能である検体を迅速かつ自動的に調製できれば、 このような態様でチップ化することの意義は極めて大きい。
[0028] 以下、本発明の核酸検查用マイクロリアクタ（以下、単にマイクロリアクタということも ある。）およびこのマイクロリアクタとマイクロポンプ、各種制御装置、検出装置とからな る核酸検查システムについて説明する。なお本明細書において、「検体」とは、測定 対象の核酸を含有する流体である。 「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情 報を担う DNAまたは RNAをいう力 単に化学的実体である DNA、 RNAの形でいう こともある。これらとポリヌクレオチドを総称して「核酸」という。 「エレメント」とは、マイク 口リアクタに設置される機能部品をいう。「微細流路」は、本発明のマイクロリアクタに 形成された流路のことである。
[0029] [核酸分離方法]
本発明の核酸の分離方法は、細胞力ら核酸を抽出し、分離する方法であって、
(i)細胞を含む液体を、該細胞より大きい孔径のフィルター Aと、該細胞より小さい孔 径のフィルター Bとに順次通過させて該フィルター Bの供給口側に該細胞を保持する
(ii)該フィルター Bの該細胞を保持する側と反対側の取り出し口から、洗浄液を流す ことにより、該細胞をその洗浄液中に取り出す、
(iii)次いで該細胞を含む洗浄液を、振動するビーズを保持する細胞破壊部に通すこ とにより、該細胞を破壊して核酸抽出液を得る、
(iv)その細胞破壊部から流路を通して該核酸抽出液を、電場が流路を横断する方向 にかけられている核酸捕捉部に導入して、その核酸捕捉部の力ソード側に核酸を集 める、
(v)その核酸捕捉部の力ソード側に集められた核酸を、核酸回収液で該核酸捕捉部 から回収する、
ことを特徴とする。
[0030] 本発明の核酸の分離方法において使用されるフィルターのメッシュは、細胞、血球 、ゥイノレス、細菌などのサイズなどを考慮する。フィルターの形態、フィルタ一層の厚さ なども目的に応じて適切に設定する。例えば、最初に不溶性物質、塵などを濾過除 去し、その後に所定の処理を行うために、サイズを変えた 2種のフィルターを併用する 。フィルターの形状として、層状に積載した形態、樹脂の層、中空糸の集合形態など 力 Sあるが任意に選択される。
[0031] フィルター Aは、 目的の核酸を含有する、試料中の細胞より大きい孔径のフィルター であり、いわゆる「プレフィルター」として不溶性の夾雑物質、塵などをろ過除去する ためのものである。他方、フィルター Bは、該細胞より小さい孔径の「滅菌フィルター」 であり、細胞はフィルター Bを通過できず、フィルター Aおよびフィルター Bで隔絶され た空間内部、あるいは該フィルター Bの供給口側（取り出し口の反対側）に保持される
[0032] 穴の大きさが大きいフィルター Aは、塩の結晶、細胞片、毛髪、組織などの粗粒物 質を濾過する。従って、その平均的な穴の大きさは、試料流体力 そうした粗粒物質 を濾過して取り除くのに充分小さぐかつ、核酸を含有する目的細胞やウィルスを通 過させるのに充分大きくなるように選択される。一般に、その穴の大きさは、約 2〜25 μ mの範囲にあるのが望まし 好ましくは約 5 μ mである。
[0033] 穴の大きさが小さいフィルター Bは、試料流体中の細胞やウィルスを捕捉する。その 平均的な穴の大きさは、 目的の核酸を含有する細胞あるいはウィルスの平均的な大 きさに応じて選択される。例えば、 0.1〜5 z m、好ましくは 0.5〜2 z mである。
[0034] フィルタ一は、市販のフィルターを装着すればよぐ例えばセルロースアセテート、 硝酸セルロース混合エステル、ポリテトラフルォロエチレン、ポリエーテルスルホン、ナ ィロン、ポリビニリデンジフルオリド、グラスファイバーなどのメンブレン ·フィルターが示 され、フィルター用ハウジジングの材質としてポリビュルカーボネート、ポリエチレン、 ポリプロピレン、ガラスなどが挙げられる。
[0035] 上記フィルター Bの該細胞を保持する側と反対の側である取り出し口から、洗浄液 を該空間内に流し入れることにより、該細胞をその洗浄液中に取り出すことができる。 次いで、細胞が分散している該洗浄液を、流路を通して、振動するビーズを保持する 細胞破壊部に通す。これにより、振動するビーズと衝突することにより、細胞が破壊さ れ、その内容物が液中に放出される。放出された核酸などを含む核酸抽出液を、さら に流路を横断する方向に電場がかけられている核酸捕捉部に通す。マイナスに荷電 した線状分子である核酸は、陽極側に泳動して集まる傾向を有する。該核酸捕捉部 の力ソード側に集められた核酸は、核酸回収液で該核酸捕捉部から分離することが できる。
[0036] 上記の洗浄液、抽出液および回収液は、特に限定されなレ、が、各種の塩溶液、緩 衝液、生理食塩水とレ、つた水性の液体である。
[0037] 本発明の核酸の分離方法により簡便に細胞が採取され、その細胞から核酸が抽出 され、しかも濃縮された形で分離することができる。本発明の核酸の分離方法は、以 下の細胞ろ過装置、マイクロリアクタ上に設置された検体前処理部で容易に実施さ れる。
[0038] [細胞ろ過装置]
本発明の細胞ろ過装置は、本発明の核酸の分離方法における前記ステップ G)お よびステップ (Π)を実施するために用いる細胞ろ過装置であって、以下の構成を有す ることを特徴としている。
[0039] 前記フィルター Aおよびフィルター Bを、隔壁としてそれぞれ装置の入り口側 81と取 り出し口側 82に配置し、これらの隔壁と装置側壁とにより密閉可能な空間（ろ過空間） 86が形成され、その側壁面に洗浄液排出管 83を有しており、入り口、取り出し口およ び排出管にある各穴は、随意に開閉できる手段を有する（図 3)。
[0040] 上記空間 86はろ液溜めであるが、好ましくは円筒形であり、例えば注射筒タイプの 装置が好都合である。材質も透明なプラスチック、例えばポリエチレン、ポリプロピレ ン、ポリカーボネートなどが取り扱いやすぐ作製も容易なために好適な材質であるが 、特にこれらに限定されない。
[0041] さらに細胞を含む試料液体を導入するための入り口、ろ過液を廃棄する取り出し口 、さらに洗浄液を回収する洗浄液排出管にある穴には、開閉可能な手段を有してお り、処理の各段階に必要に応じてそれらの穴を開閉する。そうした手段の好ましい例 として、着脱可能なスクリューキャップ、プラグ栓または三方コックなどであってもよい
[0042] 本発明のろ過装置のサイズ、特に上記空間 86のサイズは、試料の種類、濃度など によって適宜設定される。一般的には：!〜 50ml容量であれば、取り扱い、操作も手軽 である。
[0043] この細胞ろ過装置を用いることにより、以下のようにして本発明の核酸の分離方法 における前記ステップ (i)およびステップ (ii)を簡便に実施することができる（図 4)。
[0044] 採取された試料液体を収容する試料容器 (採血管、尿カップ、バイアル、試料びん など）に、本発明の細胞ろ過装置の入り口側 81を試料液中に入れる。反対側の取り 出し口側 82から吸引して、試料液をフィルター A84越しにろ過空間（ろ液溜め） 86に 導入する。必要な分量だけの試料液を採取したら、試料容器から細胞ろ過装置を取 り出す。さらに吸引を続行して、ろ過空間中のろ液を次のフィルター B85越しにろ過 して、そのろ液は取り出し口側 82から廃棄する。その結果当該ろ過空間に残留する 部分は、フィルター B85の細孔を通過できなレ、細胞などが含まれる。
[0045] 吸引は、例えば水流ポンプを始めとする適当な減圧手段で吸引してもよいが、検体 の必要量を多くする必要がない場合には、デイスポーザブルシリンジ、真空採血管な どをこの取り出し口側の穴に装着して吸引してもょレ、。真空採血管の場合には装着 後、 自動的に吸引する。フィルター Bを通過したろ過液は、デイスポーザブルシリンジ 、真空採血管内に収容されるために好都合である。
[0046] 次に洗浄液を、取り出し口側 82から上記空間内へ送り込み、細胞を含有する液体 を洗浄する。不要な洗浄液は、取り出し口側 82から吸引して除去する。必要であれば 、これをさらに繰り返す。 [0047] 次いで、入り口側 81の穴を閉じ、それまで終始閉じてあった洗浄液排出管 83の穴を 開き、取り出し口側 82から空気などを送り込んで加圧することにより、取り出し口側か ら送り込んだ洗浄液を、開いた洗浄液排管から取り出す。その洗浄液には細胞が含 有されている。
[0048] 細胞が含有されている洗浄液を直接に本発明の核酸分析用マイクロリアクタの検 体受容部に注入する。そのため洗浄液排出管と検体受容部は液密に接合する形態 となっていることが好ましい。細胞ろ過装置の側壁に設けられた洗浄液排出管の位 置、サイズなどは、チップであるマイクロリアクタとの上記関係で最適となるように設計 される。簡便には洗浄液排出管にニードル 'チップを装着し、マイクロリアクタの検体 受容部のシリコンゴム製検体挿入口に刺して注入してもよい。
[0049] 本発明の細胞ろ過装置を核酸分析用マイクロリアクタと別途の装置とすることの利 点として以下のことがらが挙げられる。
[0050] まず、マイクロリアクタの寸法上の制約から、別途の装置とすることにより、検体の様 々な事情に応じた細胞ろ過装置の形態、サイズなどをマイクロリアクタとは別個に設 計できる。上記の構成で明らかなように、本発明の細胞ろ過装置は極めてシンプノレな 構成となっている。
[0051] マイクロリアクタの微細流路内にフィルターを設置する必要がなくなり、フィルターの 目詰まりなどによる流路抵抗の上昇、乱流の発生などのトラブルから回避できる。
[0052] 不溶性の夾雑物を予め除去できるとともに、簡便に細胞を試料液から分離すること 力 Sでき、 目的の細胞のみを含有する洗浄液を適切な分量でマイクロリアクタの検体受 容部に注入できる。
[0053] 本発明の細胞ろ過装置では、細胞を懸濁する洗浄液中の細胞数も容易に調整で きる。検出の対象である核酸、特にウィルスまたは菌類（細菌、真菌類）などの微生物 の遺伝子が、極めて低濃度で存在する試料が実際には多い。例えば伝染病の検出 では、グラム陰性のバクテリアは血液 1ミリリットルにっき 10コピー以下で存在し、タリ プトスポリジゥムは通常飲料水 1ガロンにつきほんの 2, 3コピー、炭疽菌などは水 1ミリ リットルにっき 100コピー以下で現れる。上述したようにマイクロリアクタのチップでは 検体を導入する容量がきわめて限られているため、試料液中の対象菌の濃度が薄い とこれを捕捉することが実質的に不可能となる。そこでフィルター A越しに大量の試料 液を流してフィルター B内で濃縮することも可能であることは極めて有用である。
[0054] 本発明の細胞ろ過装置を使用することにより、細菌、ウィルスなどに汚染されること なぐ簡便かつ清浄に細胞を分離し、本発明の核酸検查用マイクロリアクタへ検体を 移すこと力 Sできる。
[0055] 特に汚染の危険がなければ、市販のディスポーザブル.シリンジとシリンジ.フィルタ 一を使用することにより、やや煩雑であるが上記と同様の処理を行うこともできる。具 体的には、最初に適当な容量のプラスチックシリンジにフィルター Aに相当する市販 シリンジ 'フィルター（シリンジに装着するタイプの小容量ろ過フィルター）を装着し、試 料液中に入れて試料液をシリンジ内に吸引する。次にフィルター Aをはずし、代わり にフィルター Bに相当する巿販シリンジ 'フィルターを第 2番目のフィルタ一として装着 し、プランジャーを押すことによりシリンジ内の試料液を、当該フィルターを通してろ過 する。その後、第 2フィルターを装着したまま、洗浄液を吸引し、排出して、必要なら 反復して洗浄操作を行う。細胞は、シリンジ内に止まっているため、洗浄操作後、第 2 のフィルターをはずし、代わりにニードル 'チップを装着し細胞を含有する洗浄液をマ イク口リアクタに移せばよい。
[0056] [核酸検査用マイクロリアクタおよび核酸検査システムの概要]
図 1は、装置本体に脱着可能な核酸検査用マイクロリアクタと装置本体とからなる核 酸検查システムの一実施形態における概略図である。また、図 2は、本発明の一実 施形態における核酸検查用マイクロリアクタの概略図である。本発明は、種々の実施 の形態において、本発明の趣旨に沿って任意の変形、変更が可能であり、それらは 本発明に含まれる。すなわち、本発明の核酸検查用マイクロリアクタおよび核酸検查 システムの全体または一部について、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方 式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。
[0057] 図 1および図 2に示した核酸検查用マイクロリアクタ 2は、プラスチック樹脂、ガラス、 シリコン、セラミックスなどの 1以上の部材を適宜組み合わせて作製される一枚のチッ プである。好ましくは、マイクロリアクタの微細流路および躯体は、加工成型が容易で 安価であり、焼却廃棄が容易なプラスチック樹脂で形成される。なかでもポリスチレン 樹脂は成型性に優れ、後述するようにストレプトアビジンなどを吸着する傾向が強ぐ 微細流路上に検出部を容易に形成することができるために望ましい。微細流路は、 例えば幅 100 x m、深さ 100 z m程度に形成される。また、そうしたマイクロリアクタに おいて、蛍光物質または呈色反応の生成物などを光学的に検出するために、マイク 口リアクタ表面のうち少なくとも微細流路の検出部を覆うその検出部分は透明である 部材、好ましくは透明なプラスチックとなっていることが必要である。
[0058] 図 2は、本発明の核酸検查用マイクロリアクタの典型的な流路構成の一例を示すも のである。
[0059] 本発明の核酸検査システムは、マイクロポンプ、マイクロポンプを制御する制御装 置、温度を制御する温度制御装置および検出装置などが一体化された装置本体 1と 、この装置本体 1に装着可能なマイクロリアクタ 2とからなる。予め試薬が封入された マイクロリアクタ 2の検体受容部に検体液を注入して、そのマイクロリアクタ 2を核酸検 查システムの本体 1に装着すると、送液ポンプを作動させるための機構的連結、必要 であれば制御用の電気的接続もなされる。したがって装置本体 1とこのマイクロリアク タ 2とを接合させると、マイクロリアクタ 2の流路も作動状態となる。好ましくは分析が開 始されると、検体および試薬類の送液、混合に基づく核酸の増幅、核酸とプローブと の結合などの反応、反応物の検出および光学的測定が、一連の連続的工程として 自動的に実施され、測定データが、必要な条件、記録事項とともにファイル内に格納 され、核酸の測定が自動的に行われる。
[0060] 前記検出装置とは、検查項目ごとの分析流路上の検出部に対して、例えば LEDな どから測定光を照射し、フォトダイオード、光電子増倍管などの光学的検出の手段で 透過光もしくは反射光を検出する装置である。光学的検出の手段として、原理を異に する各種の光学装置があるが、紫外 ·可視分光光度計が望ましい。上記検出装置に 組み込んだ装置であってもよぐあるいは別途の装置として、使用時に連結する態様 であってもよレ、。好ましくは、本発明の核酸検查システムは、検体に含有されている 核酸の検出を光学的に行う検出装置が、上記マイクロポンプを含む送液手段および 温度制御装置とともに装置本体 1に組み込まれ、一体化した構成となっている。
[0061] 送液、温度、反応の各制御に関わる制御系、光学的検出、データの収集および処 理を受け持つユニットは、マイクロポンプおよび光学装置とともに本発明の核酸検查 システムの本体を構成する。この装置本体 1は、これに核酸検查用マイクロリアクタ 2 を装着することにより検体サンプルに対して共通で使用される。上記の増幅などの反 応および検出は、送液順序、容量、タイミングなどについて予め設定された条件とし て、マイクロポンプおよび温度の制御、光学的検出のデータ処理とともにプログラムと して核酸検查システムに搭載されたソフトウェアに組みこまれている。従来の分析チッ プでは、異なる分析または合成などを行う場合には、変更される内容に対応するマイ クロ流体デバイスをその都度構成する必要があった。これとは異なり、本発明では脱 着可能な核酸検査用マイクロリアクタのみ交換すればよい。各エレメントの制御変更 も必要となる場合には、装置本体 1に格納された制御プログラムを適宜改変すればよ い。
[0062] 本発明の核酸検査システムは、いずれのコンポーネントも小型化され、持ち運びに 便利な形態としているために、使用する場所および時間に制約されず、作業性、操 作性が良好である。場所、時間を問わず迅速に測定することができるために、緊急医 療での利用や、在宅医療での個人的な利用も可能である。送液に使用する多数の マイクロポンプユニットが装置本体 1側に組み込まれているので、核酸検査用マイクロ リアクタはデイスポーザブルタイプとして使用できる。
[0063] 本発明の核酸検查用マイクロリアクタおよび核酸検查システムは、特に遺伝子また は核酸の検査に好適に用いることができる。その場合、 DNA増幅のための機構が核 酸検查用マイクロリアクタ上に搭載される。しかし、遺伝子以外の核酸についても基 本的な構成は、ほぼ同一になるといえる。例えば逆転写酵素収容部を設置してもよ レ、。通常は検体前処理部、試薬類、プローブ類などを変更すればよぐその場合、送 液エレメントの配置、数などは変化するであろう。
[0064] [核酸検查用マイクロリアクタ]
本発明の核酸検査用マイクロリアクタは、検体受容部、検体前処理部、試薬収容部 、廃液貯留部、マイクロポンプ接続部および微細流路を有している。前記細胞ろ過装 置力 その洗浄液排出管を通して、細胞を含有する洗浄液を受ける検体受容部なら びに検体前処理部である細胞破壊部および核酸捕捉部を備えており、各部を微細 流路で連通させている。該検体受容部にある、細胞、ウィルスを含有する洗浄液を、 検体液として微細流路を通して該検体前処理部に送り、該検体前処理部の前処理 手段を用いて検体液を前処理することにより、測定対象の核酸を抽出、分離、濃縮し 、該物質を該微細流路の下流に設けられた、反応部を構成する流路、次いで検出部 を構成する流路へ流して測定するとともに、核酸の濃縮および測定の結果、生じる廃 液を該廃液貯留部へ移して閉じ込めることを特徴とする核酸検查用マイクロリアクタ である。
[0065] さらに各収容部、流路、ポンプ接続部に加えて、送液制御部、逆流防止部、試薬定 量部、混合部などの各エレメントが、機能的に適当な位置に微細加工技術により設 置されている。
[0066] [検体前処理部]
.冃11処理
試料の前処理として、 目的物質である核酸を増幅、検出に先立ち、分離、濃縮する ことが望ましい。試料によっては、検出対象の核酸濃度が極めて希薄である。そうし た場合、マイクロリアクタに導入できる試料液量 (数 cm四方のチップで、数/ L)も限 られていることから、そのままでは測定可能な範囲内に収まらなレ、。したがって、 目的 物質の濃縮または分離の操作が必要となってくる。さらに RNAの場合、適当な逆転 写酵素を利用して cDNAに変換してから分析に供することになる。
[0067] このような前処理操作は、従来の分析チップの所定位置に一定量の検体を一度に 適用し、その検体について測定する方式とは異なる操作である。本発明では、核酸 検查用マイクロリアクタに適用する前の段階の前処理と、その後に核酸検查用マイク 口リアクタ上で実施する前処理の二段階としている点に特徴がある。
[0068] 検体前処理部は、細胞破壊 (溶菌または溶血処理）により分析対象である核酸の抽 出、分離、濃縮等を予備的に行う部分である。その形状、構造などは任意であり、振 動するビーズ、外部電極による電場などといった前処理手段が適用される。前処理 部に連通する試薬収容部には、抽出液、洗浄液、回収液などが必要に応じて封入さ れている。
[0069] 検体前処理部は、流路途上にある少なくとも 2つの独立した部分、細胞破壊部およ び核酸捕捉部で構成されてレ、る。
•細胞破壊部
微細流路を通じて、検体受容部から細胞、ウィルスを含有する検体が、検体前処理 部の細胞破壊部に送られる。その細胞破壊部で、物理的に細胞やウィルスを破壊し て核酸の抽出が行われる。検体受容部より下流の微細流路上に設けられた細胞破 壊部は、その前後の流路より広幅で、上下にも広がった空間であり、その空間内部に は、ビーズを必要な数だけ加えられて、保持されている（図 5)。従ってビーズが移動 したり、細胞あるいはウィルスを破裂させるための空間を提供するのに充分な厚さを 備えるべきである。そのビーズのサイズは、当該空間内に留まるように、微細流路の 径より大きレヽこと力必要であり、 ί列えば、 50〜600 /i m、好ましくは 100〜400 x mの 範囲にある。ビーズの平均直径は、ビーズによって破裂させるべき細胞または細菌、 ウィルスに応じて選択するのがよぐ細胞破壊部内部の空間にとどまる限り、そのサイ ズを揃える必要もない。ビーズは、多孔でも無孔でもよぐその形状も特に限定されな レ、。ビーズの材質は特に限定されなレ、が、細胞あるいはウィルスを破裂させるのに適 したビーズには、ジルコニヤ、ホウケィ酸ガラス、石灰ガラス、シリカ、およびポリスチレ ンのビーズなどが挙げられる。特に核酸を吸着しなレ、ような性質の材料が好ましレ、。
[0070] DNA増幅を妨げる不要な物質 (例えばタンパク質やペプチド)、または化学薬品 (例 えば塩、金属イオン、界面活性剤)を、試料から除去するビーズを収容してもよい。例 えば、タンパク質を除去するためのイオン交換ビーズが知られており、イミノニ酢酸の ような金属イオンキレー H匕剤を有するビーズは、生物学的試料から金属イオンを除 去する。
[0071] 当該ビーズは、該細胞破壊部に付設された外部ァクチユエータにより振動させられ る。そうしたァクチユエータとして好適なものとして、圧電体 PZT (チタン酸ジルコン酸 鉛)セラミック振動子が挙げられる。 PZT振動子により振動させられるビーズと接触し たり、衝突した細胞は、その膜構造が破壊されて、細胞内の物質が細胞外へ放出さ れる。細胞内の物質には、対象とする核酸が含まれ、このような処理により、極めて迅 速に細菌細胞、ウィルスは溶菌され、その結果、核酸が液中に出て来て、核酸抽出 液が得られる。ビーズの振動強度は、検体にある細胞の種類、性質などに応じて適 宜設定すればよい。
[0072] 従来の溶菌、細胞破壊の方法では、物理的または化学的な方法で実施されてレ、る 。本発明の核酸検查用マイクロリアクタにおける核酸の抽出と分離の方法は、以下に 述べる従来の方法に見られる問題点、不都合がな 増幅が円滑に進む核酸を分離 すること力 Sできる。
[0073] 化学的な方法は、細胞を破壊させ、核酸を解離するために、溶解剤（例えば界面 活性剤、酵素、あるいは有機化合物など）が用いられる。その後、汚染するタンパク 質 (使用した酵素類)や潜在的に干渉するタンパク質を変性させるために、カオトロピ ック塩での上記抽出物の処理が必要となる。さらに不都合なこととして上記化学薬剤 力 その後の DNA増幅を抑制し、界面活性剤、エタノールなどの変性剤は、微細流 路の撥水バルブの撥水性を変更することがある。このため化学薬剤から目的の核酸 を分離する工程が必要となり、煩雑のみならず、核酸の量を減少させる結果となる。 また、酵素を用いる方法では、インキュベーションの手間も含めて時間がかかる。
[0074] 細胞を破壊する物理的な方法は化学薬品を必要としないが、物理的方法にもまた 欠点がある。典型的な物理的方法である加熱法ではタンパク質の変性を招き、このタ ンパク質が解離された核酸に固着してその後の DNA増幅を妨げる。他の方法である 凍結解凍も、ある種の胞子やウィルスでは破壊が不充分になることがある。高圧下で 微小径の穴を通過させる方式も知られている力 そのようなシステムは大型で高価と なり、制約も多い。細胞を超音波振動に曝すことによって核酸が分離できることも知ら れている。典型的な例では、細胞を含んだ液体の中に超音波プローブを直接配置し て細胞を破裂させる。上記プローブは試料液に直接接触するため、クロスコンタミネ ーシヨンやキヤビテーシヨンに起因する泡立ちが、危険で複雑な状況をもたらす。
[0075] 細胞破壊について、米国特許 5,374,522号にマーフィーらによって他の方法が開 示されている。この方法によると細胞の懸濁液力 小ビーズとともに容器の中に配置 される。その容器は、細胞が破裂して細胞の構成要素を放出するまで、超音波槽内 に入れられる。し力しながら上記槽内での超音波の分配は一様でなぐそのため、技 術者は槽内の高エネルギー領域を探し当てて、この領域に上記容器を配置しなけれ ばならない。上記超音波エネルギーの一様でない分配は、首尾一貫しない結果を生 む。また上記超音波槽は、容器にエネルギーを集中させないので、細胞の破裂が完 了するのに数分の時間がかかることが多い。
•核酸捕捉部
核酸捕捉部は、細胞破壊部の下流側に位置し、ほぼ隣接させてもよい。当該捕捉 部および対面する夾雑物捕捉部の上下に当たるチップ外表面には 1対の外部電極 が対向して付設されており（図 5)、これらの電極に電圧を印加することにより、流路を 横断する方向に電場がかけられる。本発明では、核酸の分離のために補助的に電 気泳動を実施する関係で、流路を横断する方向に電場を発生させて細胞成分に適 用する構成としている。流路を横断する方向、例えば流路の幅方向または高さ方向 は流路の長さ方向に比べて極めて寸法が小さいために、所望の電場を発生させるの に要する印加電圧は小さくて済む。流路幅はせいぜい 200 μ m程度までであるので 、流路幅間に印加する電圧は、 40〜60V程度となる。生体分子の推進力として電気 泳動を行なう場合に、数 kVの電圧を印加する必要があることと比較すれば、極めて 低電圧の印加で済むことがわかる。なお、上記電極への電圧を印加すること、ならび に細胞破壊部の PZT振動子の作用については、マイクロリアクタが装置本体に装着 されている状態で、装置本体から電気的に制御される。
[0076] 対向する 1対の外部電極は、白金などの電極を核酸捕捉部の上面の部または流路 側壁に蒸着すればよい。あるいは、これらの電極および櫛型構造の構造体は、例え ば特開 2002-233792号公報に開示されているようにエッチング加工技術により作製で きる。
[0077] 微細流路を通じて細胞破壊部から核酸を含有する核酸抽出液が、核酸捕捉部へと 送られる。その核酸抽出液が流路を横断する方向に電場がかけられている核酸捕捉 部に通されると、マイナスの電荷を有する核酸は、アノード（陽極）の方へ移動して行 き、アノードにあたる櫛型構造物に結合する力 \その近辺に集合するようになる。他方 、プラスに荷電した夾雑物は、力ソード（陰極）に相当する反対側の面部、すなわち図 5で凹型の櫛型構造物に対向している平坦部の面（ここでは「夾雑物捕捉部」と名づ ける）にトラップされる。その他の細胞成分を含む液体はそのまま捕捉部を通過して 下流へ流れる。この液体は微細流路の適当な下流位置で廃液溜め部へ送り込むよう にすればよい。菌体、細胞膜残渣、夾雑物質を除去して微細流路の目詰まりを防止 すること、ならびに分析のための反応を阻害する物質、一緒に反応してしまう物質な ども予め除去することを目的として、当該捕捉部直後の位置で廃液貯留部に廃棄す ることが望ましい。検体前処理部は、検体受容部 20から検体を、試薬収容部 18 (他 の試薬収容部とは別個に設けてもよい）から前処理に使用する処理液を受けるととも に、試薬収容部 18から微細流路下流の反応部へ至る流路と連通している。なおチッ プの底面部には廃液貯留部 (廃液溜り）が設けてあるために、例えば前処理部との境 界に配設した弁を開いてそこへ不要な検体前処理廃液、洗浄液を捨てることができ る。
[0078] 該核酸捕捉部は、好ましくはマイクロストラクチャーとしての櫛型構造をとつている。
捕捉部の比較的狭い範囲内に、適用された電場の下、核酸を泳動により引き寄せて 流体の流れから離れて核酸を高密度に集合させる。流体はポンプ力で送出されて行 くが、核酸を櫛型部分領域に取り込んで、流体とともに流れてレ、かないようにしている 。さらに、櫛形構造をとることにより、流路断面全体を占有しておらず、流路の一部他 側には何も配置されていないため、流体の流れを阻害することはなぐ連続して効率 的に核酸が他の成分から分離され、回収されるという利点もある。
[0079] 上記櫛型構造の代わりに当該核酸捕捉部の構造を特開 2004-217号公報に開示さ れたような、流路を交互に広狭とするクサビ型構造において電場をかけることにより、 核酸を流路幅が狭くなつている部分近辺にトラップし、リリースする方式であっても良 レ、。
[0080] アノード側の凹部核酸捕捉部に集められた核酸を、核酸回収液で該核酸捕捉部か ら分離することができる。その際、偏向手段により、上記とは逆向きの電場を生じさせ るように対向電極に電圧を印加して、捕捉部から核酸を遊離させると、核酸の分離回 収がより効率的に行なわれる。具体的には電場を切ると力ソード側平坦面（夾雑物捕 捉部）にトラップされていた夾雑物も離脱するが、凹部の核酸よりも先にそうした夾雑 物が流れ出す傾向にある。このため電場の方向を変える場合には捕捉電圧より若干 低くして、弱い電場とするような調整を行うことが望ましい。このような処理で核酸を濃 縮することも可能となる。次いで、上記のように前処理された検体は、必要であれば 下記の送液分割手段により、 2以上の検体分析用の微細流路に分割されて、連通す る下流の分析流路へ送液される。分割された検体は、サンプノレポートから、試薬類が 流れる微細流路へ入って合流する。
[0081] [検体受容部]
本発明の核酸検查用マイクロリアクタの検体受容部 20は、次のような構成を有する 。検体受容部 20は、検体注入部に連通して検体 (すなわち上記の細胞もしくはウイ ルスを含む洗浄液）の一時収容および混合部への検体供給を行う。検体受容部 20 に注入された細胞含有液体は、マイクロポンプ 11およびポンプ接続部 12と接続して おり、これらの作用により、上記の検体前処理部へ送液される。
[0082] また検体受容部 20の上面で検体を注入する部分 (検体注入部）は、外部への漏失 、感染および汚染を防ぎ、密封性を確保するために、ゴム状材質などの弾性体から なる栓が形成されている力、あるいはポリジメチルシロキサン（PDMS)などの樹脂、 強化フィルムで覆われていることが望ましい。例えば、当該ゴム材質の栓を突き刺し たニードルまたは蓋付き細孔を通したニードルでシリンジ内の検体を注入する。前者 の場合、ニードルを抜くとその針穴が直ちに塞がることが好ましい。あるいは他の検 体注入機構を設置してもよレヽ。
•検体
本発明の測定対象となる検体として、生体由来の試料自体にも特に制限はないが 、例えば全血、血漿、血清、バフィ一コート、尿、糞便、唾液、喀痰など生体由来のほ とんどの試料が該当する。遺伝子検査の場合、増幅反応の鎳型となる核酸として遺 伝子、 DNAまたは RNAが分析の対象となる。検体は、このような核酸を含む可能性 のある試料から調製または単離したものであってよい。したがって、上記の試料の他 に、細胞培養物；ウィルス、細菌、カビ、酵母、植物、動物などの核酸含有試料;微生 物などが混入または含有する可能性のある試料、その他核酸が含有されている可能 性のあるあらゆる試料などが対象となる。
[0083] 本発明の核酸検查用マイクロリアクタは、手作業検査の場合に比べて、必要とされ る検体量は極めて少なレ、。例えば、縦横の長さが数 cmのチップに 2〜3 z L程度の 血液検体を注入するだけである。例えば、遺伝子の場合、 DNAとして 0.001〜100ng である。このため、微量の検体しか得られない場合も含めて、本発明の核酸検查用マ イク口リアクタは、検体面からの制約は少なぐ必然的に試薬類も少ない量で済み、 検查コストの低減となる。
[0084] [廃液貯留部]
廃液貯留部は、マイクロリアクタの底部に設けられた中空室であり、余分な検体、検 体の分離'濃縮工程で生成した洗浄液、廃液、ならびに検体の反応、測定の結果、 生じる廃液などをすベて収容する密閉された廃液溜りである。上記検体前処理部で 、前処理としてアナライトの濃縮工程を実施する場合には、濃縮および洗浄に伴って 生じる廃液を処理する必要がある。そのような廃液は、マイクロリアクタ外に排出させ て処理するよりも、 自動的に内部に貯留する方が煩わしくない。好ましくは、廃液貯留 部はマイクロリアクタの、検体前処理部の弁部直下に設けられ、少なくとも上記検体 前処理部、流路の反応部部、検出部の端部などとも通じるとともに必要な容量を有す る密封構造、すなわち廃液を生じる各部と通じる貫通穴が形成されている空洞であ ればよい。廃液貯留部は、 1つの中空室でもよぐ複数の区画に分けられた多区画空 洞の形態であってもよい。その容積、形状などは、特に限定されないが、チップ自体 の強度、他のエレメント配設に伴うスペースの制限なども勘案される必要がある。例え ば、廃液貯留部の容量は、数 cm四方のチップで、その底部大半に設けた場合、数 百 x L〜2mLとなる。また、廃液貯留部内の廃液が、マイクロリアクタの他の部分に侵 入したり、外部に漏れたりすることのないように、必要に応じて上記貫通穴の適当な 場所に開閉する弁を設けてもよい。
[0085] 上記廃液貯留部の設置とその構造は、さらに使用者に次の利点を提供する。臨床 検体の分析を行う作業者は、常に検体からの細菌またはウィルスなどの感染のリスク に曝されている。検体の取り扱い、その前処理のみならず、測定中の洗浄液、測定 後の廃液などの処理も煩雑であるだけでなぐ依然として感染のリスク、環境汚染の 可能性が残っている。本発明の核酸検查用マイクロリアクタは、廃液貯留部をマイク 口リアクタ底部に設けており、上記の不要な検体、廃液などはすべて最後にはこの廃 液溜りへ捨てられる流路の構成となっている。この廃液貯留部は、完全にマイクロリア クタ内部に密閉されており、デイスポーザブルタイプの本発明の核酸検査用マイクロ リアクタは、使用後はそのまま、検查室などに備え付けられたハザードボックス内に収 められ、焼却処分される。
[0086] このような廃液貯留部を設けることにより、作業者は、臨床検体をマイクロリアクタに 注入した後は、検査の間、検查後の廃棄においても、一貫して全く検体などに接触 する可能性はなぐ感染からの安全確保が図られている。し力も廃棄処分も汚染のお それがなく簡便に行なわれる。またチップの軽量化、製造コスト低減などの利点もある
[0087] [試薬収容部]
本発明の核酸検査用マイクロリアクタでは、必要な試薬類 (洗浄液を含む）が予め 所定の量、マイクロリアクタ内の試薬収容部 18に封入されている。したがって本発明 の核酸検査用マイクロリアクタは使用時にその都度、試薬を必要量充填する必要は なぐ即使用可能の状態になっている。検体中の核酸を分析する場合、必要な試薬 類はそれぞれ知られており、増幅用の各種試薬、検出に使用されるプローブ類、発 色試薬などが挙げられる。
[0088] [マイクロポンプおよびポンプ接続部]
本実施形態では、検体受容部 20、試薬収容部 18、さらに必要に応じてコントロー ル収容部のそれぞれについて、これらの収容部内容液を送液するマイクロポンプ 11 が設けられている。マイクロポンプ 11は試薬収容部 18の上流側に接続され、マイクロ ポンプ 11により駆動液を試薬収容部側へ供給することによって、試薬を流路へ押し 出して送液している。マイクロポンプユニットは、マイクロリアクタとは別途の装置本体（ 核酸検查装置）に組み込まれており、マイクロリアクタを装置本体に装着することによ つて、ポンプ接続部 12からマイクロリアクタに接続されるようになっている（図 7)。
[0089] 本実施形態では、マイクロポンプとしてピエゾポンプを用いている。すなわち、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、 該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのァクチユエータと
を備えたピエゾポンプであり（図 6)、その詳細は特許文献 1および 2に記載されている [反応部]
測定対象である核酸を含む検体液と、試薬 (混合液)とを合流させる合流部の上流 側の各流路に、前記検体が収容される検体受容部と、前記試薬液体が収容される試 薬収容部とが設けられるとともに、これらの各収容部の上流側にポンプ接続部が設け られ、これらのポンプ接続部に前記マイクロポンプを接続し、各マイクロポンプから駆 動液を供給することにより前記各収容部内の前記検体液および前記試薬を押し出し てこれらを合流させることによって、遺伝子増幅分析に必要な反応を開始するように 構成されている。試薬と試薬との混合、および検体と試薬との混合は、単一の混合部 で所望の比率で混合してもよぐあるいは何れ力もしくは両方を分割して複数の合流 部を設け、最終的に所望の混合比率となるように混合しても構わない。そうした反応 部の態様は特に限定されるものではなぐ様々な形態および様式が考えられる。基本 的には試薬および検体液を含む少なくとも 2種類の液体を、マイクロポンプにより送 液して合流させる合流部と、
前記合流部から先に設けられ、前記各液体が拡散混合される微細流路と、 前記微細流路の下流側端部から先に設けられ、該微細流路よりも広幅の空間と からなり、該微細流路で拡散混合された混合液を貯留して反応を行う液溜部とを備 えることが好ましい。
•DNA増幅法
本発明の核酸検查用マイクロリアクタを使用する遺伝子検查では、増幅方法を限定 されなレ、。例えば DNA増幅技術は、多方面で盛んに利用されている PCR増幅法を 使用することができる。その増幅技術を実施するための諸条件が詳細に検討され、 改良点も含めて各種文献などに記載されている。 PCR増幅法においては、 3つの温 度間で昇降させる温度管理が必要になるが、マイクロチップに好適な温度制御を可 能とする流路デバイスが、すでに本発明者らにより提案されている（特開 2004— 1082 85号公報)。このデバイスシステムを本発明の核酸検查用マイクロリアクタの増幅用流 路に適用すればよい。これにより、熱サイクルが高速に切り替えられ、微細流路を熱 容量の小さいマイクロ反応セルとしているため、 DNA増幅は、手作業で行う従来の 方式よりはるかに短時間で行うことができる。
[0091] PCR増幅法の改良として最近開発された ICAN (Isothermal chimera primer initiat ed nucleic acid amplification )法は、 50〜65。Cにおける任意の一定温度の下に DN A増幅を短時間で実施できる特徴を有する（特許第 3433929号公報参照）。したがつ て、 ICAN法は、本発明の核酸検查用マイクロリアクタでは、簡便な温度管理で済む ために好適な増幅技術である。手作業では、 1時間力かる本法は、本発明の核酸検 查用マイクロリアクタにおいては、 10〜20分、好ましくは、 15分で解析まで終わる。
[0092] [検出部]
本発明の核酸検査用マイクロリアクタでは、微細流路の反応部よりも下流上に、増 幅された核酸を検出するための検出部が設けられている。少なくともその検出部分は 、光学的測定を可能とするために透明な材質、好ましくは透明なプラスチックとなって いる。さらに微細流路上の検出部に吸着されたビォチン親和性タンパク質（アビジン 、ストレプトアビジン）は、プローブ物質に標識されたピオチン、または遺伝子増幅反 応に使用されるプライマーの 5'末端に標識されたピオチンと特異的に結合する。これ によりビォチンで標識されたプローブまたは増幅された核酸が本検出部でトラップさ れる。
[0093] 分離された増幅核酸を検出する方法は特に限定されないが、好ましい態様として 基本的には以下の工程で行なわれる。すなわち本発明の核酸検查用マイクロリアク タを用い、
(1)検体もしくは検体から抽出した DNA、あるいは検体もしくは検体力 抽出した R NAから逆転写反応により合成した cDNAと、 5'位置でピオチン修飾したプライマー とを、これらの収容部から下流の微細流路へ送液する。反応部の微細流路内で、核 酸を増幅する工程、微細流路内で増幅核酸を含む増幅反応液と変性液とを混合し、 増幅された DNAを一本鎖に変性処理する工程、増幅された DNAを一本鎖に変性 処理した処理液を、ピオチン親和性タンパク質を吸着させた微細流路内の検出部に 送液し、前記増幅遺伝子をトラップする工程を経て、増幅核酸をトラップした微細流 路内の検出部に、末端を FITC (fluorescein isothiocyanate)で蛍光標識したプローブ DNAを流し、これを固定化した遺伝子にハイブリダィズさせる。 （予め増幅遺伝子と 蛍光標識したプローブ DNAとをハイブリダィズさせたものを検出部でトラップしてもよ い。）
(2)上記微細流路内に FITCに特異的に結合する抗 FITC抗体で表面を修飾した金 コロイド液を流し、これにより DNAにハイブリダィズした FITC修飾プローブに、その 金コロイドを吸着させる。
(3)上記微細流路の金コロイドの濃度を光学的に測定する。
[0094] ポリスチレン基板に形成された微細流路内にストレプトアビジンを固定化する際、特 別な化学的処置を行うことは必要としなレ、。単にピオチン親和性タンパク質を増幅反 応部よりも下流の微細流路上に適用して該流路上にビォチン親和性タンパク質を吸 着させるだけでよい。遺伝子検査用のプローブ DNAとして、蛍光標識されたオリゴデ ォキシヌクレオチドが好ましく用いられる。その DNA塩基配列は、検出目的の遺伝 子塩基配列の一部分と相補的である配列が選択される。プローブ DNAの塩基配列 を適切に選択することにより、 目的の遺伝子に特異的に結合し、共存する DNA、パ ックグラウンドに影響されることなく高感度の検出が可能となる。
[0095] プローブを標識する蛍光色素として、公知の FITC、 RITC、 NBD、 Cy3、 Cy5など の蛍光物質などを用いることができる。特に FITC力 抗 FITC抗体、例えば金コロイ ド抗 FITC抗マウス IgGを入手できることから望ましい。
[0096] 蛍光色素 FITCの蛍光を測定することも可能であるが、蛍光色素の光褪色、バック グラウンドノイズなどを考慮する必要がある。最終的に可視光により、高感度で測定で きる方式が好ましい。可視光の吸光分析が優れるのは、蛍光測光よりも機器が汎用 的であり、妨害因子が少なくデータ処理も容易であるためである。金コロイド抗 FITC 抗マウス IgGを用いた金コロイドの光学検出を利用するかわりに、上記蛍光色素の代 わりに上記プローブを西洋わさびパーォキシダーゼ（HRP)で標識してもよレ、。検出 にはこの酵素が触媒する発色反応を利用することもできる。そのための典型的な発 色物質として、 3,3'，5,5' _テトラメチルべンジジン0^48)、 3，3'—ジァミノべンジジン (D AB)、 p—フエ二レンジァミン (OPD)などが知られている。他にアルカリホスファターゼ、 ガラクトシダーゼなどの酵素 ·発色系も使用できる。
[0097] 本発明の核酸検査用マイクロリアクタとして好ましい態様は、 一つのチップ内において、
検体もしくは検体力 抽出した核酸が注入される検体受容部と、
検体の前処理を行う検体前処理部、
プローブ結合反応、検出反応 (遺伝子増幅反応なども含む)などに用いる試薬が収 容される試薬収容部と、
ポジティブコントロールが収容されるポジティブコントロール収容部と、
ネガティブコントロールが収容されるネガティブコントロール収容部と、
プローブ（例えば、遺伝子増幅反応により増幅された検出対象の遺伝子にハイプリ ダイズさせるプローブ）が収容されるプローブ収容部と、
これらの各収容部に連通する微細流路と、
前記各収容部および流路内の液体を送液する別途のマイクロポンプに接続可能な ポンプ接続部と、
廃液貯留部とが設けられ、
前記チップにポンプ接続部を介してマイクロポンプを接続し、検体受容部に収容さ れた検体から抽出した核酸と、試薬収容部に収容された試薬とを流路へ送液し、微 細流路の反応部、例えば増幅反応部で混合して反応させた後、その下流側流路に ある検出部へこの反応液を処理した処理液と、プローブ収容部に収容されたプロ一 ブとを送液し、流路内で混合してプローブと結合 (またはハイブリダィゼーシヨン)させ 、この反応生成物に基づいて核酸の検出を行い、
ポジティブコントロール収容部に収容されたポジティブコントロールおよびネガティ ブコントロール収容部に収容されたネガティブコントロールについても同様に上記反 応および検出を行うとともに、
上記検体前処理部および検出部と貫通穴を介して連通しており、マイクロリアクタの 底部に設けられた中空室であり、余分な検体、検体の濃縮工程で生成した洗浄液、 廃液、および検体の測定の結果、生じる廃液などを収容する密閉廃液溜りである廃 液貯留部を有するように構成されてレ、ることを特徴としてレ、る。
•送液分割手段
本発明において、 1つの検体についてポジティブコントロールおよびネガティブコン トロールを同時に分析する場合には、試薬類および検体を 2以上に分割して、それぞ れの分析流路へ送り出す必要がある。送液分割手段はそのために設置される。送液 分割手段は、分岐した微細流路、送液制御部 13および逆流防止部から構成される。
[0098] 送液制御部 13は、正方向（通常、流体をポンプで押出す方向、すなわち下流方向 )への送液圧力が所定圧に達するまで液体の通過を遮断し、所定圧以上の送液圧 力を加えることにより液体の通過を許容する。また流路内の液体の逆流を防止する逆 流防止部は、逆流圧により弁体が流路開口部を閉止する逆止弁か、あるいは弁体変 形手段により弁体を流路開口部へ押圧して該開口部を閉止する能動弁からなる。
[0099] 本発明の核酸検査用マイクロリアクタの微細流路においては、前記マイクロポンプ、 そのポンプ圧により液体の通過を制御可能な送液制御部と、流路内の液体の逆流を 防止する逆流防止部とによって、分岐した流路内における液体の送液、送液量の定 量および各液体の混合が制御されてレ、る。力かる送液分割手段およびマイクロボン プ 11の働きにより、試薬類および検体は適当な比率で分割される。
'コントロールの測定
核酸の分析では、通例、分析にネガティブコントロールを加え、検体の分析と並行 して行われる。コンタミネーシヨン、例えば試薬等に混在する物質の発色、蛍光など の補正に必須であるためである。さらに分析結果の信頼性を増すためには、ポジティ ブコントロールも加えることも必要である。添加する試薬等における妨害因子の検出、 設定した条件の適切性、非特異的な相互作用などの検証に有用である。同様にイン ターナルコントロールをカ卩えることも往々必要とされ、特に定量分析には有用である。
[0100] ポジティブコントロール、インターナルコントロールを同時に行うことは、特に PCR法 による遺伝子増幅では重要である。 PCR反応が正しく起きていることのチェックも特 に必要とされるためである。例えば何らかの問題が生じた場合、それが設定条件、試 薬類、操作、分析系に由来するか、あるいは検体に由来するかの検証に最適である 。 PCR法は検体中に存在する微量の遺伝子を数十万〜数百万倍以上にも増幅でき ること力 、クロス'コンタミネーシヨンといった汚染による影響は著しく深刻である。
[0101] 偽陽性および偽陰性の判定に有用なこれらのコントロールの設定は、従来の分析 技術の慣行に従う。本発明のマイクロリアクタの流路構成によれば、検体とは別個の 分析流路において、同一試薬、同一条件のもとで、同時進行で行うことができる。 以上、本発明の好ましい実施態様の一例として示された図面を参照しながら、遺伝 子検查を説明したが、本発明は、力かる態様および例に限定されるものではない。

Claims

請求の範囲
[1] 細胞から核酸を抽出し、分離する方法であって、
(i)細胞を含む液体を、該細胞より大きい孔径のフィルター Aと、該細胞より小さい孔 径のフィルター Bとに順次通過させて該フィルター Bの供給口側に該細胞を保持する
(ii)該フィルター Bの該細胞を保持する側と反対側の取り出し口から、洗浄液を流す ことにより、該細胞をその洗浄液中に取り出す、
(iii)次いで該細胞を含む洗浄液を、振動するビーズを保持する細胞破壊部に通すこ とにより、該細胞を破壊して核酸抽出液を得る、
(iv)その細胞破壊部から流路を通して該核酸抽出液を、電場が流路を横断する方向 にかけられている核酸捕捉部に導入して、その核酸捕捉部の力ソード側に核酸を集 める、
(v)その核酸捕捉部の力ソード側に集められた核酸を、核酸回収液で該核酸捕捉部 から回収する、
ことを特徴とする核酸の分離方法。
[2] 前記ビーズが、それらを保持する該細胞破壊部の上面に付設された外部ァクチュ エータの作用により振動させられている、ことを特徴とする請求の範囲第丄項に記載 の核酸の分離方法。
[3] 前記の外部ァクチユエータが、圧電 PZTセラミック振動子であることを特徴とする請 求の範囲第 2項に記載の核酸の分離方法。
[4] 前記電場が、櫛型構造の該核酸捕捉部もしくは夾雑物捕捉部の上面に付設された
、 1対の外部対向電極により印加される、ことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載 の核酸の分離方法。
[5] 前記核酸捕捉部の力ソード側に集まった核酸を回収する際に、電場の当初の方向 を逆転するように電圧を外部対向電極に印加する、ことを特徴とする請求の範囲第 4 項に記載の核酸の分離方法。
[6] 請求の範囲第 1項に記載の核酸の分離方法におけるステップ (i)およびステップ (ii )を実施するために用いる細胞ろ過装置であって、 前記のフィルター Aおよびフィルター Bを、隔壁としてそれぞれ装置の入り口側と取り 出し口側に配置し、これらの隔壁と装置側壁とにより密閉可能な空間が形成されると もに、その側壁面に洗浄液排出管を貫通させており、入り口、取り出し口および排出 管にある各穴が開閉される手段を有することを特徴とする細胞ろ過装置。
[7] 細胞を含有する液を受ける検体受容部、並びに、該検体受容部から送出される細 胞を破壊する細胞破壊部及び該細胞破壊部において破壊された細胞から放出され る核酸を捕捉する核酸捕捉部を有する検体前処理部を備えており、前記検体受容 部、細胞破壊部及び核酸捕捉部が微細流路で連通されていることを特徴とする核酸 検査用マイクロリアクタ。
[8] さらに、試薬を収容する試薬収容部、廃液貯留部、マイクロポンプ接続部および各部 を連通する微細流路を有し、
前記微細流路の下流に前記検体前処理部で前処理された検体液と前記試薬収容 部に収容される試薬が反応する反応部を構成する流路、及び該反応部で反応して 得られる反応物を検出する検出部を構成する流路が設けられていることを特徴とする 請求の範囲第 7項に記載の核酸検査用マイクロリアクタ。
[9] 前記細胞破壊部は、該細胞破壊部に配置される外部ァクチユエータにより振動さ せられて細胞を破壊するビーズを有し、
前記核酸捕捉部は、該核酸捕捉部に配置される外部電極に印加される電場により、 前記細胞破壊部で破壊された細胞から放出される核酸を捕捉する、ことを特徴とする 請求の範囲第 7項または第 8項に記載の核酸検查用マイクロリアクタ。
[10] 前記マイクロポンプ接続部は、
流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、
差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、 該第一流路および該第二流路に接続された加圧室と、
該加圧室の内部の圧力を変化させるためのァクチユエータと、
を有するマイクロポンプに接続されることを特徴とする請求の範囲第 8項または第 9項 に記載の核酸検查用マイクロリアクタ。
[11] 前記廃液貯留部が、マイクロリアクタの底部に設けられ、少なくとも前記検体前処理 部および前記検出部の端部と連通した中空室であることを特徴とする請求の範囲第 8項乃至第 10項のいずれかに記載の核酸検查用マイクロリアクタ。
[12] 分岐した微細流路と、
予め設定された圧より低レ、圧では液体の通過を遮断し、予め設定された圧以上の圧 では液体の通過を許容する、送液制御部と、
流路内の液体の逆流を防止する逆流防止部と、
から構成され、
分岐した流路内における液体の送液および送液量の定量を制御する送液分割手段 を有することを特徴とする請求の範囲第 8項乃至第 11項のいずれかに記載の核酸 検査用マイクロリアクタ。
[13] 細胞から抽出された核酸の検出を光学的に行う検出装置とともにマイクロポンプお よび温度の制御装置が一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な請求 の範囲第 7項乃至第 12項のいずれかに記載の核酸検査用マイクロリアクタとからなり 、装置本体に該マイクロリアクタを装着することにより、核酸の測定を行うことを特徴と する核酸検査システム。
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