WO2007018281A1

WO2007018281A1 - Ａｋｔ活性化抑制剤

Info

Publication number: WO2007018281A1
Application number: PCT/JP2006/315897
Authority: WO
Inventors: Sonoko Ishizaki; Asami Kawakami
Original assignee: Ajinomoto Co., Inc.
Priority date: 2005-08-05
Filing date: 2006-08-04
Publication date: 2007-02-15
Also published as: JP5217436B2; JPWO2007018281A1

Abstract

本発明は、Ａｋｔの活性化を抑制することによって、高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び／又は進展を抑制する薬剤を提供する。具体的には、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも１種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、Ａｋｔ活性化抑制剤を提供する。

Description

明細書

A k t活性化抑制剤技術分野

本発明は、新規の A k t活性化抑制剤、並びに高ィンスリン血症を示すか又は高ィンスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び Z又は進展を抑制するための薬剤に関する。背景技術

肥満は、糖尿病、高血圧、高脂血症などの生活習慣病を起こしやすいことが知られている。特に内臓脂肪型肥満は、耐糖能異常、インスリン抵抗性を併発しやすく、体脂肪量とインスリン抵抗性は有意な正の相関を示す。肥満のモデル動物 ( o b / o bマウスや Z u c k e r f a t t yラット）では、肥満とともに著しい高インスリ：/血症が見られることが証明されている。臨床的にも、肥満者では空腹時の血中インスリン値が高く、グルコース負荷後のインスリン反応も亢進している。すなわち、血糖曲線を一致させて肥満者と非肥満者を比較すると、どの時点でも肥満者のインスリン値は高レ、（Fuj.ioka S, Matsuzawa Y, Tokunaga K， et al. Contribution of intra-abdominal fat accumulation to the irapairrae nt of glucose and lipid metabolism in human obesity. Metabolism 36 : 54 19 87)。

一方、 2型糖尿病の特徴的病態はインスリン作用の低下であるが、糖尿病発症前に空腹時および糖負荷時の血中ィンスリン濃度の増加が長期間にわたって認められることが報告されている（Mertin BC， Warram JH, et al. Role of glucose and insulin resistance in development of type 2 diabetes mell itus ^ result s of a 25-year follow-up study. Lancet 340 : 925 - 929 1992)。

近年、これらの疾患と癌の関連が明らかとなってきた。すなわち、 9 0万人の米国民を 1 6年間追跡したところ、肥満度が高くなるほど全がん死亡率が高くなること力 S報告された (Calle EE, et al. Overweight, obesity, and mortality from cancer in a prospectively studied cohorts of U. S. adults. New Engla nd Journal of Medicine 2003 ; 348 ; 1625 - 1638)。

また別の報告では、糖尿病は癌のリスクファクタ一であることが示された（Na th et a丄. Fasting Serum Glucose Level ana Cancer Risk in Korean Men and Women, JAMA. 2005； 293： 2210-2211)。

糖尿病や肥満における発癌のメカニズムの 1つとして、高インスリン血症が想定される。インスリンには、細胞増殖作用があることはよく知られており（Gupt a K， rishnaswamy G， Karnad A, Peiris AN. Insulin : A novel factor in care inogenesis. Am. J. Med. Sci 323 : 140_145 ; 2002)、有糸***誘発作用は I G F— 1受容体、インスリン受容体を介して作動するが、この作用は血中インスリン値が正常よりも高い場合により強く生じやすい。インスリンのシグナルにおいて、細胞増殖の中心を担っている分子のひとつとして A k tが報告されている（La d or MA and Alessi DR. PKB/Akt, ： a key mediator of cell proliferation, sur vival and insulin responses? J. Cell Sci. 114 : 2903— 2910 ; 2001)。発明の開示

本発明は、 A k tの活性化を抑制することによって、高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生ぴ Z又は進展を抑制する薬剤を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、イソロイシン、口イシン、及びパリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする組成物が、 A k t活性化を抑制する作用を有することを見出じ、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである：

( 1 ) イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、 A k t活性化抑制剤。 (2) 少なくともロイシンを含む、（1) に記載の A k t活性化抑制剤。

(3) イソロイシン、ロイシン、及びパリンの 3種からなる、（1) に記載の A k t活性化抑制剤。

(4) イソロイシン、ロイシン、及びパリンの重量比が、 1 : 1. 5〜2. 5 ： 0. 8〜1. 7であることを特徴とする、（3) に記截の A k t活性化抑制剤。

(5) 高インスリン血症を示すか又は高ィンスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び又は進展を抑制するために用いられる、（1) 〜（4) のいずれかに記載の A k t活性化抑制剤。 .

(6) 前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者力インスリン抵抗性、糖代謝異常、及び Z又は脂質代謝異常の症状を有する、

(5) に記載の A k t活性化抑制剤。

(7) 前記高ィンスリン血症を示すか又は高ィンスリン血症の危険性のある患者 1 肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している、（5) に記載の A k t活性化抑制剤。

(8) 前記癌が、肝癌である、（5) 〜（7) のいずれかに記載の A k t活性化抑制剤。

(9) アポトーシスを促進するために用いられる、（1)'〜（4) のいずれかに記载の Ak t活性化抑制剤（すなわち、アポトーシス促進剤）。

(1 0) アポトーシスの促進がアポトーシス抑制遺伝子発現の抑制によるものである、（9) に記載の A k t活性化抑制剤。

(1 1) アポトーシス抑制遺伝子が Mc 1— 1または I AP— 1である、（1 0) に記載の A k t活性化抑制剤。

(1 2) 高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び又は進展を抑制するために用いられる、（9) に記載の Ak t活性化抑制剤。

(1 3) 前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者が、インスリン抵抗性、糖代謝異常、及び Z又は脂質代謝異常の症状を有する、 (1 2) に記載の A k t活性化抑制剤。

(14) 前記高ィンスリン血症を示すか又は高ィンスリン血症の危険性のある患者が、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している、（1 2) に記載の Ak t活性化抑制剤。

(1 5) 前記癌が、肝癌である、（1 2) 〜（14) のいずれかに記載の Ak t活性化抑制剤。

(1 6) 有効量のイソロイシン、ロイシン、及ぴバリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖ァミノ酸を被験体に投与することを含む、 A k t活性化の抑制方法。

(1 7) Ak t活性化抑制剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖アミノ酸の使用。

(1 8) イソロイシン、ロイシン、及ぴパリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬組成物、ならびに当該組成物を A k t活性化の抑制に使用し得るまたは使用すべきであることを記載した記載物を含む、商業的パッケージ。図面の簡単な説明

図 1は、 ΗΈΚ 29 3細胞の増殖に対する、 B C A A混合物の抑制効果を示す。図 2は、 Ak t活性化に対する、ロイシンの抑制効果を示す。

図 3は、アポトーシス抑制遺伝子発現に対する、 BCAA混合物の抑制効果を示す。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の実施の形態について説明する。

「Ak t」とは、セリンスレオニンプロテインキナーゼ B (P KB) とも呼ばれ、リン酸化されることにより活性化十る酵素であり、活性化した Ak tは、細胞内の種々の機構の調節に関与しており、例えば、インスリン刺激による細胞増殖の促進やアポトーシスの抑制などに関与していることが知られている（Lawlor MA and Alessi DR. PKB/Akt, ： a key mediator of cell proliferation, surviv al and insulin responses? J. Cell Sci. 114:2903- 2910;2001)。従って、本明細書において「Ak t活性化」とは、 Ak tのリン酸化を指標とする。

本明細書中において「高ィンスリン血症を示すか又は高ィンスリン血症の危険性のある患者」とは、インスリン抵抗性、糖代謝異常、脂質代謝異常などの症状を有する患者のことをいい、例えば、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) などに罹患した患者がこのような症状を有する。

「高インスリン血症」とは、血液中.のインスリン量が正常値よりも異常に高い状態のことをいう。高インスリン血症は、インスリンの過剰シグナルにより Ak tの活性化を生じ、その結果として、癌（例えば、肝癌、睥癌、大腸癌、肺癌、胃癌、胆嚢 '胆管癌、乳癌、子宮癌など）を引き起こす危険性がある。

ところで、癌は細胞の生と死のバランスが崩れた病態である。すなわち、正常な細胞では DN Aに損傷が蓄積すると自らアポトーシスを誘導し'細胞死に至る力癌細胞においてはアポトーシスに対して耐性を獲得し細胞死を免れていることが明らかになつてきており、これが癌発生進展の原因の 1つと考えられている。ァポトーシスを制御する経路は、 TNF-ひなどのデスレセプター、 JUNK、 p 3 8などの MAPキナーゼ、 B e 1 -2フアミリータンパク質、 p 53など各種知られているが、 P I 3 K-Ak t経も重要である。 B a d (Bel- 2 antagonist of cell death) は、 B c 1 -2や B e 1 - x _Lと結合してそれらを不活性化することでアポトーシスを誘導するが、 Ak tは B a dの S e r l 36をリン酸化して不活性化する。また Ak tは、 J NKの上流である AS K 1 (apoptosis

signal-regulating kinase 1) の S r 8 3をリン酸化することでその下流で誘導されるアポトーシスを抑制する。また、 Ak tは膜上で活性化すると一部が核に移行し、 FOXO 1, 3， 4をリン酸化して不活性化するが、 FOXOは、 F a sリガンドゃ B i m (Bcl-2 interacting mediator of cell death) といったァポトーシスを誘導する因子の転写を活性化するため、 Ak tによる FOXOの不活性化は、アポトーシスの抑制につながる。また p 53や p 73は、 B a x、 P uma _s N o x aなどのアポトーシス促進因子の転写を活性化するが、 Ak tは p 5 3や p 7 3に対して抑制的に働くことが知られている。すなわち、 p 5 3を負に制御している MDM2 (mouse double minute 2) を Ak tがリン酸化して活性を上昇させることや、 ρ 7 3のコアクチベータ一である YAP (yes-associated protein)を A k tはリン酸化して核外移行を促すことによりアポトーシス促進因子の転写活性化が抑制される。さらには、転写因子 N F- K Bは阻害因子である I κ Bが I KKによりリン酸化されることにより活性化されるが、 Ak tは I KK をリン酸化して活性化する。 N F- K Bは I A Pや A 1および B c 1 _x_Lを転写活性化することでアポトーシスを抑制する. (Romashkova, J. A.， and Makarov, S. S. (1999) NF - κΒ is a target of AKT in anti-apoptotic PDGF signalling. Nature 401： 86-90、 Chu ZL, McKinsey TA， Liu L, Gentry JJ, Malim MH, and Ballard DW (1997) Suppression of tumor necrosis factor-induced cell death by inhibitor of apoptosis c- IAP2 is under NF - kappaB control. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10057 10062)。また、 Ak tは CREB (c AMP-responsive element binding protein) の S e r l 3 3をリン酸化して活性化することが知られているが、 CR EBはアポトース抑制因子である B c 1 - 2や M'c 1 -1の転写を活性化する

(The antiapoptotic gene tncl - 1 is up-regulated by the phosphatidyl inositol 3 kinase/Akt signaling pathway through a transcription factor complex , containing CREB. Mol Cell Biol. 1999 Sep; 19 (9) : 6195- 206)。

このように、 A k tは多くの段階、多様なターグットでアポトーシスを抑制している。したがって、 Ak tの活性化を抑制することは、アポトーシスの抑制を解除することになり、癌発生抑制、進展抑制につながることが期待できる。よつて、本発明の Ak t活性化抑制剤は、アポトーシスの促進、癌発生または進展の抑制に用いることもでき、これらの態様も本発明の権利に包含される。

本発明の有効成分（分岐鎖アミノ酸） 'である、イソロイシン、ロイシン及びバリンは、それぞれ、 L一体、 D—体、 D L—体のいずれも使用可能であるが、好ましくは、 L一体、 DL—体であり、さらに好ましくは、 L一体である。また、イソロイシン、ロイシン、及びバリンは、それぞれ、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができる。塩の形態としては、酸付加塩や塩基との塩等を挙げることもでき、イソロイシン、ロイシン、及びパリンの医薬品として許容される塩を選択することが好ましい。

イソロイシン、ロイシン、及びパリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩を形成する酸としては、例えば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸等の無機酸；酢酸、乳酸、クニン酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、モノメチル硫酸等の有機酸が挙げられる。 .

イソロイシン、ロイシン、及びパリンにそれぞれ付加して医薬として許容される塩基を形成する塩基の例としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシゥム等の金属の水酸化物または炭酸化物、あるいはァ.ンモニケ等の無機塩基；ェチレンジァミン、プロピレンジァミン、エタノールァミン、モノアルキルエタノーノレアミン、ジァノレキノレエタノ一ノレアミン、ジタノーノレアミン、 'トリエタノーノレァミン等の有機塩基が挙げられる。

上記塩は水和物（含水塩）であってもよい。また、水和物としては、例えば 1 〜 6水和物などが挙げられる。これらの塩、水和物も本発明の権利に包含されるものである。

本発明の薬剤は、イソロイシン、ロイシン、及ぴパリンのいずれか 1種以上が分岐鎖アミノ酸として含有されていればよく、イソロイシン、ロイシン、及びバリンの 3種全てが含有されていてもよい。

好適な実施形態では、本発明の薬剤は、少なくともロイシンを含有する。

別の好適な実施形態では、本発明の製剤は、イソロイシン、ロイシン、及ぴバリンの 3種全てを含有する。

イソロイシン、ロイシン、及ぴバリンの 3種全てを用いる場合、イソロイシンと、ロイシンと、バリンの重量比は、 1 : 1 . 5〜2 . 5 : 0 . 8〜1 . 7であり、特に 1 : 1 . 9〜2 . 2 : 1 . 1〜1 . 3の範囲が好ましい。

本発明の薬剤の投与形態 ·剤型は、経口投与、非経口投与のいずれでもよく、経口投与剤としては、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チユアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤が、また、非経口投与剤としては、注射剤、スプレー剤などが挙げられる。

本発明の薬剤は、動物（好ましくは、ヒト等の哺乳動物）に投与することがでさる。 .

本発明の薬剤は、経口、注射、あるいは局所投与等の任意の投与方法によって投与することができる。

投与量は、対象患者の年齢、体重も.しくは病態、剤形、または投与方法などによっても異なるが、通常 1日量として、イソロイシン 0. 5〜30. O g、ロイシン 1. 0〜60. O g、ノリン 0. 5〜30. 0 gを目安とする。一般の成人の場合、好ましくは、ー量として、ィソロイシン 2. 0〜1 0. 0 g、口イシン 3. 0〜20. 0 g、ノリン 2. 0〜： L O. 0 g、より好ましくは、イソロイシン 2. 5~3. 5 g、ロイシン 5. 0〜7., O g、ノリン 3. 0〜4. O gであり、アミノ酸全体量としては 1日当たり 2. 0 g〜50. O g程度が好ましく、これを 1〜6回、好ましくは 1~3回に分割して投与する。

本発明の有効成分である分岐鎖アミノ酸の投与量（摂取量）について算出する際、その値は、本発明が目的とする疾患の治療または予防等の目的で使用される薬剤の有効成分の量として前記の算定方法が決められているので、これとは別目的で、例えば、通常の食生活の必要から、あるいは別の疾患の治療目的のために、摂取又は投与される分岐鎖ァミノ酸については、前記算定に含める必要はない。例えば、通常の食生活から摂取される一日あたりの分岐鎖アミノ酸の量を、前記本発明における有効成分の 1日あたりの投与量から控除して算定する必要はない。 . .

本発明の有効成分であるイソロイシン、ロイシン、及ぴバリンは、それぞれが単独で、若レくは任意の組合わせで製斉 ljに含有されていてもよいし、全てが 1種の製剤中に含有されていてもよい。別途製剤化して投与する場合、それらの投与経路、投与剤形は同一であっても、異なっていてもよい。また各々を投与するタィングも、同時であっても別々であってもよい。これらは、併用する薬剤の種類や効果なども考慮して、適宜決定され得る。

即ち、本発明の薬剤は、 2種以上の分岐鎖アミノ酸を含有する場合、複数の分岐鎖アミノ酸を同時に含有する製剤であってもよいし、それぞれを別途製剤化して併用するような併用剤であってもよく、これらの形態全てを包含するものである。特に、同一製剤中に全ての分岐鎖アミノ酸を含有する態様が、簡便に投与できるため好ましい。

本発明において、「重量比」とは、製剤中のそれぞれの成分の重量の比を示す。例えば、イソロイシン、ロイシンおよび.バリンの各有効成分を 1つの製剤中に含めた場合には、個々の含有量の比であり、各有効成分のそれぞれを単独でまたは任意の組み合わせで複数製剤中に含めた場合には、各製剤【こ含められる各有効成分の重量の比である。なお、本明細書中において各アミノ酸の重量は、遊離アミノ酸としてのものである。 .

また本発明において、実際の投与量の比は、投^対象（即ち患者）あたりの各有効成分 1回投与量あるいは 1日投与量の比である。例えば、イソロイシン、口イシンおよびパリンの各有効成分を 1つの製剤中に含め、それを投与対象に投与する場合には、重量比が投与量比に相当する。各有効成分を単独でまたは任意の組み合わせで複数の製剤中に含めて投与する場合には、 1回あるいは 1日投与,した各製剤中の各有効成分の合計量の比が重量比に相当する。

イソロイシン、ロイシン、およぴバリンは既に、医薬 '食品分野において広く用いられていて、安全性は確立している。例えば、これらのアミノ酸を 1 ： 2 ： 1 . 2の比で含有する製剤の急性毒 '14 ( L D ₅₀) は、マウスの経口投与において 1 0 _g / K g以上である。

本発明の薬剤は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チユアブル剤などの固形剤、溶液剤、シロップ剤などの液剤、または、注射剤、スプレー剤などに製剤化することができる。

このような製剤は、必要に応じて、薬学的に許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤などを配合される。賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、 D—マンニトールなどの糖類、でんぷん類、結晶セルロースなどのセルロース類などの有機系賦形剤、炭酸カルシウム、カオリンなどの無機系賦形剤などが挙げられる。 .

結合剤としては、 α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、カノレボキシメチノレセノレロース、カノレポキシメチノレセノレロースナトリウム、結晶セノレ口一ス、 D—マンニト—ノレ、トレノ、.ロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビ、ニルピロリドン、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。

滑沢剤としては、ステアリン酸、ステアリン酸塩などの脂肪酸塩、タルク、珪酸塩類などが挙げられる。

溶剤としては、精製水、生理的食塩水などが挙げられる。

崩壌剤としては、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、化学修飾されたセルロースやデンプン類などが挙げられる。

溶解補助剤としては、ポリエチレングリコール、' プロピレングリコール.、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。

懸濁化剤あるいは乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、アラビアゴム、ゼラチン、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビエノレピロリドン、カノレポキシメチノレセノレロースナトリウムなどのセノレロース類、ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。等張化剤としては、塩化チトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン、尿素などが挙げられる。

安定化剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン硫酸ナトリウム、その他のァミノ酸類などが挙げられる。

無痛化剤としては、ブドウ糖、ダルコン酸カルシウム、塩酸プロ力インなどが挙げられる。

防腐剤としては、パラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジノレアルコール、フエネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。 '

抗酸化剤としては、亜硫酸塩、ァスコルビン酸などが挙げられる。

矯味矯臭剤としては、医薬および食品分野において通常に使用される甘味料、香料などが挙げられる。 '

着色剤としては、医薬および食品分野において通常に使用される着色料が挙げられる。

本発明の A k t抑制剤には、他の薬剤、例えば、糖尿病用剤、高脂血症治療剤、高血圧用治療剤、肝臓病用剤、抗がん剤（例えば、力.ルポプラチン、テガフール、パクリタキセル、酢酸リュープロレリンなど）などを配合してもよい。

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すもにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。実施例

(実施例 1 )

S u b c o n f l u e n tに培養した HE K 29 3細胞をトリプシン処理レ、 DMEM+ 10 % F C S培地中に 1 χ 10⁵ c e l l s /m 1で懸濁し、得られた懸濁液を l w e l lあたり Ι Ο Ο μ Ιずつ 96w e l l l a t eにまいた, DMEM+ 1◦ %F C S培地で 1晚培養後、コントロール群（n = 4) は、 DM EM+ 1 0 %F C S培地に交換し、 5mM BCAA群（n = 4) は、イソロイシン、ロイシン、及びバリンを重量比 1 : 2 : 1. 2で含有する 5'mM BCA A混合物を DMEM+ 10% FC Sに添加した培地に交換し、さらに 3日間培養した。培養終了後、 C e l l C o u n t i n g K i t— 8 (和光純薬）を用いてプロトコール通りに細胞数を測定した。

結果を、コントロール群の OD値からバックグラウンドの OD値を引いた値を 1 0 0 %として、％ o f c o n t r o 1 として表す（図 1)。図 1に示されるように、イソロイシン、ロイシン、及びパリンから構成される B CAA混合物は、有意に HE K 2 9 3細胞の増殖を抑制した。

(実施例 2 )

S u b c o n f l u e n tに培養した H 4 I I E細胞をトリプシン処理し、 D MEM+ 1 0 %F C S培地中に 1 X 1 0⁵ c e l l s /m 1で懸濁し、得られた懸濁液を 1 w e 1 1あたり 1 m 1ずつ 2 4 w e 1 1 l a t eにまいた。 DM EM+ 1 0 %F C S培地で 4時間培養後、以下の 5群に分けて、 1晚培養した： ( 1 ) DMEM F C S (—）培地（n = 2) ；

(2) DMEM F C S (-) +インスリン nM (n = 2) ；

( 3 ) DMEM F C S (-) +インスリン n'M+ロイシン 3 mM (n 2) ；

(4) DMEM F C S (-) +インスリン 0 nM (n = 2) ； .

( 5) DMEM , F C S (-) +インスリン O nM+ロイシン 3 mM (n = 2)。

培養終了後、 P a t h S c a n P h o s p h d -A k t l ( S e r 4 7 3 ) S a n d w i c h E L I SA k i t (C e l l S i g n a l i n g T e c h n o 1 o g y)を用いて、プロトコ一ノレ通りにリン酸化 A k tを定量した.。結果を図 2に示す。 A k tは、インスリン 1 nM、 1 0 nM (図 2の（2) 及び（4)) で用量依存的に活性化されたが、ロイシンは、これらの活性化を抑制した（図 2の（3) 及び（5.))。

(実施例 3 )

H4 I I E細胞を D-MEM+ 1 0 % F B S培地で 4 X 1 0⁵個/ w e l 1で 1 2ゥエルプレートにまき、ー晚培養した。翌日 D- MEM F C S (―) 培地に交換し、さらにー晚培養した。

翌日 D-MEMから B C AAのみ除去した培地（ iB C AA培地）に交換して 1 時間培養した後に、 B CAA添加条件では 2 mMの B CAAを添加してさらに 0. 5日き間培養した。その後 10 nMのインスリンあるいは 14 nMの I GF- 1を添加して、 8時間後に細胞中の mRNAを抽出し、 c DNAを合成した後に、以下のプライマーを用いて R e a 1 -T i m e P CR法によりアポトーシス抑制遺伝子 M c l - 1および I AP_1、 h o u s e k e e p i n g g e n eである R p 1 36の発現量を定量した。号： 1)

a n t i s e n s e : A A G A A C T C C A C A A A C C C A T C C (配列番号： 2)

I AP-l : s e n s e : c g a g g a g g a g g a g t c a g a t g (酉己列番号： 3)

a n t i s e n s e ： g c a c t t a g g a g g c a a t c c a g (配列香： 4)

結果は h o u e k e e i n g g e n e (R p 1 36) の発現量で割り返して、インスリンなし、 BCAAなし、又は I GF— 1なし、 B CAAなしの時の値を 1 00 %として⁰/ 0 o f c o n t r o lで表示した（図 3 ) 。ィソロィシン、ロイシン、及びパリンから構成される BCAA混合物は、アポトーシス抑制遺伝子 Mc 1 - 1および I AP- 1の発現を抑制した。産業上の利用可能性

本発明により提供される、イソロイシン、ロイシン、及ぴバリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする Ak t活性化抑制剤は、高ィンスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び又は進展を抑制する。

本発明の薬剤は、アミノ酸を有効成分とすることから、安全性が高く、副作用がほとんどないため長期間にわたって投与可能であり、高インスリン血症を示すか又は高ィンスリン血症の危険性のある患者が癌発生に至るまでの長期経過におけ予防または治療に有利に用いることができる。

本出願は、日本で出願された特願 200 5- 227780 (出願曰： 2005 年 8月 5日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1. イソロイシン、ロイシン、及びパリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖アミノ酸を有効成分とする、 Ak t活性化抑制剤。

2. 少なくともロイシンを含む、請求の範囲 1に記載の A k t活性化抑制剤。

3. イソロイシン、ロイシン、及ぴバリンの 3種からなる、請求の範囲 1に記載の Ak t活性化抑制剤。

4. ィソロイシン、ロイシン、及びバリンの重畺比が、 1 : 1. 5〜2. 5 : 0. 8~1. 7であることを特徴とする、請求の範囲 3に記載の A k t活性化抑制剤。

5. 高インスリン血症を示すか又は高ィンスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び/又は進展を抑制するために用いられる、請求の範囲 1〜4のいずれか 1項に記載の A k t活性化抑制剤。

6.前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者が、インスリン抵抗性、糖代謝異常、及び Z又は脂質代謝異常の症状を有する、請求の範囲 5に記載の A k t活性化抑制剤。

7.前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者が、肥満、糖尿病、非アルコ^"ル性脂肪性肝炎に罹患している、請求の範囲 5に記载の Ak t活性化抑制剤。

8. 前記癌が、肝癌である、請求の範囲 5〜7のいずれか 1項に記載の Ak t活性化抑制剤。

9. アポトーシスを促進するために用いられる、請求の範困 1〜4のいずれか 1 項に記載の A k t活性化抑制剤。

10. アポトーシスの促進がアポトーシス抑制遺伝子発現の抑制によるものである、請求の範囲 9に記載の A k t活性化抑制剤。

1 1. アポトシス抑制遺伝子が Mc 1— 1または I AP— 1である、請求の範囲 1 0に記載の A k t活性化抑制剤。 '

1 2. 高インスリン血症を示すか又は高ィンスリン血症の危険性のある患者における癌の発生及び Z又は進展を抑制するために用いられる、請求の範囲 9に記載の Ak t活性化抑制剤。

1 3. 前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者、インスリン抵抗性、糖代謝異常、及びノ又は脂質代謝異常の症状を有する、請求の範囲 1 2に記載の A k t活性化抑制剤。

14. 前記高インスリン血症を示すか又は高インスリン血症の危険性のある患者力肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎に罹患している、請求の範囲 1 2 に記載の A k t活性化抑制剤。

1 5. 前記癌が、肝癌である、請求の範囲 1 2〜14のいずれか 1項に記載の A k t活性化抑制剤。

1 6. 有効量のイソロイシン、ロイシン、及びパリンから選ばれる少なくとも 1 種の分岐鎖アミノ酸を被験体に投与することを含む、 Ak t活性化の抑制方法。

1 7. Ak t活性化抑制剤の製造における、イソロイシン、ロイシン、及びバリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖アミノ酸の使用。

1 8. イソロイン、ロイシン、及びパリンから選ばれる少なくとも 1種の分岐鎖アミノ酸および医薬として許容される担体を含有してなる医薬钽成物、ならびに当該組成物を A k t活性化の抑制に使用し得るまたは使用すベきであることを記載した記載物を含む、商業的パッケージ。 ·