WO2007003399A2 - Elektrodenanordnung, deren verwendung sowie verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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WO2007003399A2
WO2007003399A2 PCT/EP2006/006460 EP2006006460W WO2007003399A2 WO 2007003399 A2 WO2007003399 A2 WO 2007003399A2 EP 2006006460 W EP2006006460 W EP 2006006460W WO 2007003399 A2 WO2007003399 A2 WO 2007003399A2
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tip
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Dirk Zimmermann
Ernst Bamberg
Ulrich Zimmermann
Original Assignee
MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
Julius-Maximilians-Universität Würzburg
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp

Definitions

  • Electrode assembly its use and method for their preparation
  • the present invention relates to an electrode assembly, its use and - especially galvanic - process for their preparation.
  • the invention has for its object to provide an electrode assembly for electrophysiological examinations of biological species or cells and the like, a process for their preparation and corresponding uses in which access to the interior of a species or cell on especially simple, reliable, gentle and reproducible way to realize.
  • a biological species or cell subsumes a biological cell in the strict sense, a bacterium, a virus, an organelle, a liposome, a vesicle, a micellar structure, their constituents or fragments and their associations or aggregates
  • so-called fusion species or fusion cells should be included. According to the invention, each of these species can be used as a basis for the investigation.
  • an electrode assembly for electrophysiological examination of biological species, particularly biological cells or the like is provided.
  • the electrode arrangement according to the invention is formed with a contact region for contacting the electrode arrangement with at least one biological species, a biological cell or the like. Furthermore, a connection region is formed for external electrical connection of the electrode arrangement.
  • the contact region is formed with an electrode tip or a plurality of electrode tips as electrodes, which extend from the connection region of the electrode arrangement.
  • the electrode tips are each formed with a geometric shape, which in operation an otherwise non-destructive Permeation of the electrode tips into a biological species or cell or the like via the membrane in the interior thereof.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips are suitable for non-destructive penetration of a membrane of the biological species, in particular a biological cell, in order to gain access to the interior of the biological species or cell.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips prefferably be monotonically or strictly monotonically tapering from the connection area. This means, in particular, that the electrode tip tapers uniformly from the proximal to the distal end.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips are each cylindrical or cuboid running from the connection region and at the distal end of the electrode tip or the plurality of electrode tips remote from the connection region with a monotonically or strictly monotonically tapering tip.
  • the electrode tip or a plurality of electrode tips are formed with a cross section which is round, circular, elliptical, rectangular or square.
  • the electrode tip or a plurality of electrode tips are formed with a first and proximal end facing the connection region or forming the connection region.
  • the diameter of the electrode tip or a plurality of electrode tips is formed at the proximal end in the range from about 50 nm to about 5000 nm.
  • the diameter of the electrode tip or a plurality of electrode tips at the proximal end is below approximately 1/10 of the diameter of a species or cell to be contacted.
  • the electrode tip or a plurality of electrode tips are formed with a second and distal end facing away from the connection region.
  • the diameters of the electrode tip or the plurality of electrode tips are formed at the distal end in the range of 1/10 of the diameter of a species or cell to be contacted.
  • the electrode tip or plurality of electrode tips are formed at the distal end with a radius of curvature in the range of about 5 nm to about 50 nm.
  • the radius of curvature of the electrode tip is in particular the radius of that sphere which best approximates the electrode tip at its distal end.
  • the electrode tip or plurality of electrode tips are formed in the region of the distal ends at an acute angle in the range of about 10 ° to about 50 ° as the opening angle of the respective tip.
  • the electrode tip or plurality of electrode tips have a length in the range of about 4/5 of the diameter of a species to be contacted from the connection area.
  • the contact area is formed with a plurality of electrode tips.
  • the electrode tips are formed geometrically equal and / or the same effect.
  • connection area is formed as a materially coherent base with a surface and a bottom.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips are formed extending from the surface of the base.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips extend from the surface of the base vertically or horizontally.
  • Sense vertical extending formed, at least locally.
  • the electrode tips are oriented identically to one another and are designed to be parallel or substantially parallel, at least locally.
  • the electrode tips according to another preferred embodiment of the electrode arrangement according to the invention are alternatively or additionally arranged in the form of a row, matrix or vertical matrix arranged on top of the base.
  • the electrode tips according to a further preferred embodiment of the electrode arrangement according to the invention are formed with the same pairwise distances directly adjacent electrode tips arranged in the main axis directions of their arrangement arrangement.
  • the surface of the base is planar, at least locally.
  • the base and the electrode tip or the plurality of electrode tips are integrally formed with each other as an integral material region.
  • the base and the electrode tips or the plurality of electrode tips are formed integrally connected to one another.
  • the base and the electrode tip or the plurality of electrodes rod tips are formed from the same, in particular electrically conductive material.
  • the electrode tip or the plurality of electrode tips are formed as galvanically grown structures.
  • a carrier having a surface and a bottom side is formed from an electrically insulating material.
  • the proximal ends of the electrode tips and optionally the base are embedded in the carrier and are actually formed below the surface of the carrier and the distal ends of the electrode tips are actually above the surface of the carrier ,
  • the surface of the support is completely or locally conforming and, in particular, running parallel to the surface of the base.
  • the surface of the carrier is completely or locally planar, convex and / or concave.
  • the surface of the carrier is planar or substantially planar and formed with concave depressions in the region of the proximal ends of the electrode tips. It is also possible that the underside of the base is formed on the underside of the carrier at least partially uncovered by the carrier material to allow an external electrical tap.
  • a counter electrode arrangement and / or a reference electrode arrangement are formed electrically insulated from the contact area and the connection area.
  • the counter-electrode arrangement may be formed with one or a plurality of counter-electrodes.
  • the counter electrode arrangement or a part thereof and / or the reference electrode arrangement may be formed on the surface of the carrier.
  • the spatial arrangement and / or the geometry of the counter electrode arrangement are designed to generate a controlled inhomogeneous electric and / or electromagnetic field.
  • the counter electrode arrangement or a part thereof are formed opposite the electrode tip or the plurality of electrode tips.
  • the counterelectrode arrangement or a part thereof can be formed at a distance in the range from approximately 15 ⁇ m to approximately 1 cm from the electrode tip or a plurality of electrode tips.
  • a counter electrode of the counter electrode arrangement is formed with a planar geometry.
  • a counterelectrode of the counterelectrode arrangement has a size and / or area which are large in relation to the size / area of the electrode tips, in particular in a ratio in the range of about 5: 1 or in the range of about 100: 1 or above.
  • the electrode tips and / or the base may e.g. are formed from a material or a combination of materials from the group consisting of silver, gold, platinum, tungsten, alloys, alloys of these metals, platinum-iridium alloys and gold-iridium alloys.
  • a plurality of bases is formed, each with one or a plurality of electrode tips.
  • the bases individually or in groups are electrically isolated from each other and / or spatially separated.
  • a material region is formed with or made of a material or a combination of materials from the group consisting of glasses, glass-like materials, organic polymers and photoresists.
  • the present invention further provides methods for producing the electrode arrangement according to the invention.
  • Process or a combination of processes from the group. which includes galvanic deposition, galvanic growth and galvanic growth.
  • the basic idea is thus the electrical processing and / or manufacturing len 'of the electrode assembly according to the invention.
  • a base electrode e.g. in the form of a base
  • a single electrode tip is formed on the base electrode
  • a base electrode e.g. in the form of a base
  • a plurality of electrode tips is formed on this base electrode.
  • the base electrode or base electrodes with the formed electrode tips may be covered with an electrically insulating carrier region and for the electrode tips to extend with their distal ends above the surface of the electrically insulating carrier.
  • the electrode tips can be acted upon by electrical pulses, in particular in the microsecond range, in such a way that electrical openings are generated in relation to the surroundings.
  • a binding and electrically insulating material is used from the group consisting of covalently binding lipids, covalently binding to metals lipids and insulating plastics.
  • a base electrode is used, in particular in the form of a base, that on the surface of the base electrode or base a structured template is formed such that Recesses in the template Leave areas on the surface of the base electrode or the base at well-defined locations, and then the galvanic process is performed such that exclusively in the region of the recesses of the templates on the base electrode, the electrode tips or preforms thereof are formed.
  • the length of the electrode tips or the preforms thereof is defined by the thickness of the template and the depth of the recesses from the surface to the template to the surface of the underlying electrode or the base. It is also alternatively or additionally conceivable that the thickness of the electrode tips or the preforms thereof is defined by the clear width or the diameter of the recesses in the template.
  • a template with two layers is used, that the layer facing the base electrode or the base has electrically insulating properties and in a well-defibrated manner stable and inert against certain chemical and / or physical effects are formed, and that the second layer or subsequent layers are made removable by relatively mild chemical and / or physical agents, and more particularly by mild chemical reagents.
  • the ratio of the layer thicknesses of the lowest layer of the stencil to the total layer thickness of the subsequent and detachable layers is chosen such that a desired length for the can be reached from the insulating Trager outstanding areas of the electrode tips.
  • the multilayer stencil is first formed on the base electrode or the base, then the galvanic process is carried out, then after termination the galvanic process down to the lowest and layer directly on the base electrode or the base layer all layers of the stencil are removed, and then the lowest and on the base electrode or the base directly resting and remaining layer of the template is used as an insulating support for the electrode assembly.
  • the distal ends of the electrode tips may be post-treated by an electrochemical etching process to sharpen the electrode tip or plurality of electrode tips at their distal ends, particularly in combination with a masking process.
  • the required mask fabrication may e.g. via micropore filters or by treatment of support materials by means of heavy ion bombardment.
  • the invention also provides methods using the electrode arrangement according to the invention and applications of the electrode arrangement according to the invention.
  • the electrode arrangement according to the invention can be used according to the invention for the electrophysiological examination and / or manipulation of a species from the group formed by biological cells, liposomes, vesicles, micellar structures, bacteria, viruses, fusion cells, organelles, genetic, molecular biological and / or biochemical derivatives of which, components of these species and associations of these species.
  • the electrode arrangement according to the invention can also be used according to the invention for the microinjection of a substance into a species from the group formed by biological cells, liposomes, vesicles, micellar structures, bacteria, viruses, fusion cells, organelles, genetic, molecular biological and / or biochemical Derivatives thereof, components of these species and associations of these species.
  • the tip of the electrode tip or the tips of the electrode tips may be charged with the substance to be injected.
  • the application can also be effected by application of electric fields, for example in the case of electrically charged substances, for example DNA.
  • the electrode arrangement is provided embedded in a microstructure.
  • the electrode arrangement is provided in a lap-on-the-chip structure.
  • the electrode arrangement is possible for the electrode arrangement to be provided in or for an assay, in particular for high throughput applications.
  • the species to be examined and / or treated or a plurality of them are directed towards the electrode tip or the plurality of electrode tips.
  • the movement of the species to be examined and / or treated on the electrode tip or plurality of electrode tips is effected by applying force to the corresponding species.
  • the dielectrophoretic force is generated by generating a - in particular high-frequency - inhomogeneous alternating electric field between the electrode tip or plurality of electrode tips and the proposed counter electrode arrangement with the counter electrodes.
  • the electrode tips with an AC voltage in the range of about 10 mV to about 300 V and / or in the frequency range of about 100 Hz or about 60 MHz be applied to generate the dielectrophoretic force.
  • an electrical cell cage is used for the micropositioning of the species during the dielectrophoretic approximation.
  • the cell to be contacted is bulged up by iso-osmolar solutions.
  • the membrane By stiffening reagents, e.g. with EDTA or Pluronium - the membrane can be stiffened and the penetration of the electrode tip facilitated.
  • a counterelectrode 51 of the counterelectrode arrangement 50 has a large and / or flat area that is large in relation to the size / area of the electrode tips 40s, in particular in a ratio in the range of about 5: 1 or Range of about 100: 1 or above, preferably in the range of about 10000: 1.
  • an electrode arrangement in which the electrodes are modified by a chemical reaction such that an electrophysiological examination of biological cells is possible, facilitated or more sensitive, the chemical reaction being mainly an electrochemical oxidation of the aforementioned metals with a halogen, the chemical reaction takes place in particular before or after the contacting of the biological cell, in the latter case
  • an electrode arrangement in which the electrode arrangement is combined with a pressure measuring probe, which is in particular an external pressure measuring probe located outside, or an invasive pressure measuring probe located within a measuring object.
  • electrical isolation of non-cell-contacted free electrodes is performed such that a solution of liposomes of defined size, the minimum diameter being 100 nm and the maximum diameter being 5 ⁇ m, is rinsed across the electrode surface and by applying an alternating current is contacted to the said free electrode tips.
  • a method for electrically contacting a species Z to be examined and / or treated, in particular a biological cell or the like, with an electrode tip 40s of an electrode arrangement 10, in which a patch pipette or patch electrode is used as the electrode tip 40s or the electrode tip 40s and in which the electrode assembly 10 controlled in such a way is applied to an electric field that a dielectrophoretic force on the to be examined and / or treated species Z is exercised in such a way that the species Z to be examined and / or treated approaches the electrode tip 40s and is contacted therewith.
  • the focusing or contacting of the biological cells to be examined electrophysiologically preferably takes place electrically by modulation of the frequencies, the frequencies applied for this being in the range from at least 100 Hz to at most 100 MHz, especially in the range from 100 kHz to 40 MHz.
  • a particular embodiment provides for a combination of the previously described electrode arrangement with a pressure measuring probe, which is an external pressure measuring probe outside or an invasive pressure measuring probe located inside a measuring object.
  • an electrode arrangement in which the electrodes are modified by chemical reaction in such a way that an electrophysiological examination of biological cells is made possible, facilitated or made more sensitive, whereby the aforementioned chemical reaction mainly comprises an electrochemical reaction.
  • cal oxidation of the aforementioned metals with a halogen This chemical reaction can take place before or after the "contacting" of the biological cell, in which case the halogen is obtained from the cytosol of the cell.
  • a possible use is conceivable in which an electrical insulation is not made with cells contacted, free electrodes of the kind that a solution of liposomes of defined size, wherein the minimum diameter 100 nm and the maximum diameter is 5 microns, spooled over the electrode surface and is contacted by applying an alternating current to the said free electrode tips.
  • the dielectrophoretic contacting may also be possible with a construction resembling a normal patch pipette.
  • An electrode - hereafter referred to as A - is surrounded by a micro-glass capillary, which in turn is associated with a physiological
  • the electrode arrangement according to the invention will be synonymously referred to as fakir electrodes.
  • the invention thus also relates in particular to so-called fakir electrodes, their production and their use.
  • electrophysiological techniques the electrical parameters of biological systems can be studied and manipulated. These techniques are applied to cell aggregates, single cells, fragments of cell membranes and liposomes and proteoliposomes, the latter, inter alia, with the help of techniques based on so-called artificial membranes are based). In the following, the spectrum of these biological systems is abbreviated to "cells.” All these electrophysiological techniques have in common that they are also used to investigate the functional properties or for the manipulation of (membrane) proteins and the surrounding membranes.
  • the invention presented here does not have the above-mentioned disadvantages of existing technologies. It is characterized by a high robustness, flexibility in the application and allows both indirect and direct (reversible) electrical discharges to the cells used.
  • the present invention provides, in particular, an electrophysiological measuring arrangement for cells, fusion cells, liposomes, membrane fragments and cell aggregates - in the following simply summarized as cells.
  • the electrical manipulation of the cells is carried out by one or more electrodes that penetrate directly into the cells.
  • the size of the electrodes depends on the cellular system used.
  • the electrode will have a very small diameter for very small cells - diameter in the range of 15 microns, for example in the range of about 900 nm, and only have a small length, for example in the range of about 5 microns. It is also important that the fakir electrodes have a fine tip, for example less than about 500 nm, in order to minimize injury to the cellular system during penetration.
  • FIG. 1 shows a possible electrophysiological arrangement of the fakir technology presented here. Shown is a cell contacted by a fakir electrode with multiple peaks.
  • the carrier material determines the exposed length of the electrode.
  • the fakir electrodes used must have dimensions of the nanometer and micrometer order, both in their geometry and in their length, depending on the cellular system used: the diameter must be between about 50 nm and about 5000 nm, the length between about 500 nm and about 250 microns.
  • the fakir electrodes are made of conductive materials, preferably metals of silver, gold, platinum, tungsten and / or alloys such as Pt-Ir and Au-Ir. production method
  • One possible method of fabricating metal electrodes having the properties described above may be by nanostructuring of electrodes.
  • the surface of a metal electrode can be structured by means of electrodeposition in such a way that it has metal tips with the spatial dimensions described above.
  • different “configurations” are possible, e.g.
  • the latter configuration has the advantage that the individual Fakirspitzen are electrically independent of each other and can be tapped individually.
  • the entire electrode surface (except the fakir tip) must be covered with an electrically insulating layer.
  • an electrically insulating layer For this purpose, two different methods are to be used, a) The first method is based on a coating of the electrode surface with a metal covalently binding lipid. It should be noted that this treatment also stripping the nanostructures on the electrode surface.
  • this treatment also stripping the nanostructures on the electrode surface.
  • electrical ⁇ s pulses that expose the tip, which is done selectively at the points of the nanostructuring and not on the entire planar one (planar in relation to the nanostructures).
  • Electrode surface since the electric fields in the places of greatest curvature are greatest this type can be produced Fakirspitzen with desired geometric and spatial dimensions, b)
  • the second method already intervenes in the manufacturing process during the galvanic deposition for nanostructuring of the surface.
  • This template In order to make a nanostructuring of the surface possible, it must be covered with a stencil.
  • This template has holes. The diameters of these holes determine the diameters of the nanostructures.
  • the layer thickness of the template determines the length of the nanostructures.
  • the stencil used has at least two layers. The lower layer has electrical insulating properties and is stable against chemical / physical agents. The second layer can be dissolved by mild chemical reagents.
  • the layer thickness of the upper layer is chosen so that it corresponds to the desired length of the fakir electrodes.
  • the fakir electrodes presented above should penetrate cells so that they become electrically conductive.
  • Part of the invention presented here is that the electrodes are not brought to the cell as in conventional systems, but the cell to the fakir electrode. This should be achieved by applying a dielectrophoretic force.
  • This force can be generated by the application of high-frequency, highly inhomogeneous alternating fields and, with suitable dielectric properties of the cell - with respect to the dielectric properties of the medium - a migration of the cell in the direction of the Fakirelektrode. It does not end until the fakir electrode is inside the cell. This contacts the cell to the fakir electrode.
  • the described contacting of the cell can also be used for nano- or microinjection of bioactive substances into cellular systems.
  • the fakir electrodes are previously coated or coated with these substances. This can be done, for example, with substances that carry electrical charges (DNA), by applying appropriate electric fields that generate forces on the particles and cause movement to Fakirelektrodenober Structure. If the cell is then contacted with the fakir electrode, then the bioactive substance is in the cell. Advantages of this method are on the one hand the low consumption of bioactive substance, which is used with the "inoculation" of the cell, and the simple selection of the inoculated cells of those, which were not injected, the latter is possible, if one after contacting the cell medium against a cell-free Exchange medium and harvest the daughter cells of the inoculated, contacted cells. " By measuring the electrical parameters In addition, the vitality state of the cells can be determined from the cell contacted, and it is thus possible to optimally control the nutrition of the cells or to stop the harvesting process if the contacted cells lose their vitality.
  • DNA electrical charges
  • Another aspect of the present invention is the use of fakir electrodes for direct or intracellular electrical conduction.
  • the fakir electrode has a very high sealing resistance against the bath solution. This ensures that the resistance (or other electrical parameters of the system) measured by the fakir tip against a reference electrode is determined solely by the conductivity of the "cell" membrane of the cell contacted with the fakir electrode So a very important part of our invention.
  • the fakir electrode (or the fakir board electrode) must be electrically sealed except for the tips of the fakir needles.
  • (2) is described how this is achieved in our invention.
  • Theoretical explanation is based on the fact that under suitably chosen conditions the dielectrophoretic forces only act on objects of specific diameter. With suitable frequencies it is therefore possible selectively to attract smaller sized objects (eg small liposomes of 50 nm to 1 ⁇ m), whereas large objects (eg cells of 20 ⁇ m diameter) do not experience any force.
  • smaller sized objects eg small liposomes of 50 nm to 1 ⁇ m
  • large objects eg cells of 20 ⁇ m diameter
  • Fusion of other cells or liposomes to the system already contacted can also be used to increase the sealing resistance of the fakir electrode.
  • the fusion can be achieved by moderate ⁇ s high-voltage pulses (to merge several laterally or vertically dielectrophoretically arranged cells electrically into a fusion product, so-called electrofusion, thereby simultaneously creating "sensor head" with very large, intact membrane surfaces.
  • the electrical parameters of the cell can be determined by various electrical methods:
  • the fakir electrode in this case should be separated from the cytosol by an intracellular salt bridge.
  • This salt bridge may consist, for example, of hydrogels, such as, for example, alginate, which are doped with Cl-containing salts. Depending on the method, different electrode materials must be used (see (1) and (2)).
  • Fakir electrodes should be tapped together on the one hand and on the other hand individually.
  • the use of multiple fakir electrodes has the advantage that the failure of one or more electrodes is reduced by e.g. a possible deposition of cytoplasmic lipid and protein components or of membrane components during penetration due to the redundant system can be compensated.
  • the advantage of several independent faded Fakirelektroden has the additional advantage that in parallel several different cells can be tapped simultaneously and thus when using extremely small volumes of solution many independent results can be determined.
  • a further measure for increasing the mechanical stability of the complex of Fakir electrode and contacted cell is the embedding of this complex (the hybrid sensor head) in a cross-linked hydrogel matrix (for example, of a Ba 2+ ions is crosslinked Alginatmatrize). This immobilization of the complex simultaneously ensures long-term vitality of the complex and also facilitates the (cryo) preservation of the hybrid sensor heads.
  • the transmembrane resistance an important electrical parameter of the cell
  • the transmembrane resistance depends on the ion channels in the membrane of a system whose electrical conductivity is specifically influenced by a broad spectrum of analytes (ligands, inhibitors, etc.). can be.
  • the fakir technology can be used in screening tools (eg high throughput drug target method).
  • targets eg membrane proteins such as ion channels, see above
  • Such hybrid sensor heads formed from fakir electrodes and contacted cells allow the screening of a wide range of drugs in analytical laboratories ("high throughput screening", “lab on the chip") as well as under in situ conditions (as " In addition to native cells, animal and plant sensor cells should be used which can be tailored by specific heterologous overexpression of transporters or cell-cell or cell-membrane fusion.
  • Specifically designed sensor heads can be made available as disposables for universal electronic peripherals
  • the sensor units can be manufactured either individually or in the form of micromodules, comparable to microtiter plates
  • the latter configuration guarantees the possibility of redundant measurements with comparable sensor heads under identical measuring conditions a se hr high reliability of the analysis.
  • complex detection of multiple components in small sample volumes eg for the purpose of drug screening, can be carried out with high accuracy.
  • the sensor head must be integrated into a probe - lab-in-the-probe - which provides direct, minimally invasive access to liquid-filled compartments of plant or animal / human systems.
  • the new sensor head technology is to be connected to a miniaturized tube / pressure sensor / catheter system.
  • the integration of the sensor head / catheter assembly into a measuring machine based on the principle of a belt hole punch is also planned.
  • An important requirement for being able to contact cells successfully is the shape of the tip of the electrode tip 40s and in particular its radius or radius of curvature Ks at the distal end 40d of the electrode tip 40s, which should not exceed 1/10 of the diameter Dz of the cell Z to be penetrated.
  • the cell membrane M is stretched, that is, the cell Z is filled. This can be achieved by using non-isoosmolar solutions in which the cells Z are incubated or used as measuring media 30.
  • the correct dielectrophoretic force is generated, matching the diameter Dz of the cell Z and the distance of the cell Z from the fakir electrode 40s.
  • the parameters for this process are chosen for each cell type depending on the above conditions. They are in the specified ranges. Not necessary, but favorable is the application of a modulated alternating field, ie an electric field, which changes in a pre-programmed manner during the attraction experiment.
  • the time range for generating the attractive force is about 10 ⁇ s to about 30 s.
  • the modulation of the alternating field can be effected via the amplitude-lowering of the amplitude, for example as a ramp protocol, in particular linear or exponential-or via the frequency.
  • the dielectrophoretic force is inversely proportional to the fifth power of the distance between the cell Z and the fakir electrode 40s.
  • the attraction process is such that initially, by choosing appropriate frequencies and high amplitudes, a relatively small force is generated on cell Z.
  • the force rapidly increases and the cell Z can be drastically accelerated if the original field parameters are maintained. This can lead to too fast movement of the cell and destruction of the cell Z, e.g. by bursting, lead in the contact.
  • too low attraction forces cause the cell Z not to be penetrated by the fakir electrode 40s, because then the mechanical resistance of the membrane M of the cell can not be overcome.
  • the automated use of the fakir electrode in mechanical systems is to be achieved in that the chip carrying the fakir electrodes can be inserted into a microfluidic chamber.
  • this chamber is to ensure that cells can be positioned automatically and with regard to the individual fakir tips exactly opposite the fakir electrodes. This is to ensure that the system can be contacted with automatically applied dielectrophoresis protocols - as already described.
  • the microfluidic system should also allow the possibility of change of solution.
  • FIG. 1 is a schematic and sectional side view of a first embodiment of the electrode assembly according to the invention with an electrode tip.
  • Fig. 2 is a schematic and sectional side view of another embodiment of the electrode assembly according to the invention having a plurality of electrode tips.
  • 3A, 3B are schematic and sectional side views of another embodiment of the electrode assembly according to the invention, once with and without a contacted biological cell.
  • FIGS. 4A-4D are schematic and sectional side views of various further embodiments of the electrode arrangement according to the invention.
  • FIGS. 5A, 5B illustrate certain details of the invention in the form of a schematic and sectional side view and a schematic plan view, respectively, of an embodiment of the electrode arrangement according to the invention.
  • FIG. 6 is a schematic plan view of another embodiment of the electrode arrangement according to the invention.
  • FIG. 7A is a schematic and sectioned side view of another embodiment of the electrode assembly according to the invention.
  • FIG. 7B is an electron micrograph of an embodiment of the electrode arrangement according to the invention, which has been galvanically produced according to the invention.
  • FIGS. 8-10 show, in the form of microscopic photographs, certain applications which are suitable for the electrode arrangement according to the invention.
  • FIGS. IIA-12B schematically illustrate further applications of the present invention.
  • Fig. 1 is a schematic and sectional side view describing a first embodiment of the electrode assembly 10 according to the invention and its application in the investigation of a cell Z.
  • the embodiment of the electrode arrangement 10 according to the invention shown here is based on a carrier 20 or carrier substrate 20 with a surface 20a and a bottom 20b.
  • a contact region 4OK in part and the connection region 4OA are formed integrally in the support 20 in such a way that the electrode tip 40s forming the contact region 4OK of the electrode assembly 10 with its terminal region 40AA or proximal end 40p completely below the surface 20a of the support 20 and with its distal end 4Od, which faces away from the connection area 4OA, is formed strictly above the surface 40a of the carrier 40.
  • connection region 40A is formed by a base 40b which has a one-piece material region - here in the form of a planar plate - realized whose upper side 40ba is contacted with the proximal end 40p of the electrode tip 40s and the bottom 40bb flush with the bottom 20b of the carrier 20 and thus allows an external contact.
  • an electrical tap into the interior I of a contacted cell Z takes place in that the distal end 40d of the electrode tip 40s penetrates through the cell membrane M into the interior I of the cell Z and so on the conductivity of the electrode tip 40s realized a corresponding electrical tap.
  • a current measurement or voltage measurement can take place via the outer measuring circuit 60 and the connection lines 61 and 62, so that charge carriers which have been displaced by the transmembrane protein P can be measured as corresponding displacement currents I (t) as a function of time, the electrode tip 40s being referred to as
  • the first electrode of the electrode assembly 10 and provided in the surface 20 a reference electrode R are formed as a corresponding second measuring electrode, wherein the circuit is closed by the correspondingly to be envisaged aqueous measuring medium 30.
  • the reference electrode R can serve as a measuring electrode. It is also conceivable, however, for this reference electrode R to be used for the approximation and contacting of the cell Z with the contact region 40K by forming a counter electrode 51 of a counterelectrode arrangement 50.
  • the counterelectrode arrangement 50 can also have a counterelectrode 51, which supports the electrode tip. ze 40s of the contact area facing, as indicated by a dashed line.
  • FIG. 1 The embodiment of FIG. 1 is defined with only a single electrode tip 40s in the contact region 4OK.
  • the contact region 40K of the electrode arrangement 10 is defined by a plurality of, in particular identical or identically acting, electrode tips 40s.
  • FIG. 2 shows such an embodiment with a plurality of similar electrode tips 40s in the contact region 4OK.
  • the embodiment of the electrode arrangement 10 according to the invention shown here is based on a carrier 20 or carrier substrate 20 with a surface 20a and a bottom 20b.
  • a contact region 4OK in part and a connection region 4OA are again formed integrally in the carrier 20 in such a way that the electrode tip 40s forming the contact region 4OK of the electrode assembly 10s is completely below the surface 20a of the terminal 40A facing or proximal end 40p Carrier 20 and with its distal end 40d, which is oriented away from the terminal portion 4OA, strictly above the surface 40a of the carrier 40 is located.
  • connection region 4OA is likewise formed by a so-called base 40b, which realizes an integral material region whose upper side 40ba is in contact with the proximal end 40p of the electrode tip 40s and whose underside 40bb terminates flush with the underside 20b of the carrier 20 and thus again an external contact allowed.
  • Electrode tips 40 s penetrate through the cell membrane M into the interior I of the cell Z and so realize a corresponding electrical tap on the conductivity of the electrode tips 40s as an electrode.
  • a current measurement or voltage measurement can take place via the outer measuring circuit 60 and the connection lines 61 and 62, so that charge carriers displaced by the transmembrane protein P can be measured as corresponding displacement currents I (t) as a function of time, the electrode tip 40s being the first electrode the electrode arrangement 10 and a reference electrode R provided in the surface 20 a is designed as a corresponding second measuring electrode, the circuit being closed by the aqueous measuring medium 30 to be correspondingly provided.
  • the reference electrode R can again serve as a measuring electrode. However, it is also conceivable that this reference electrode R is used for the reflector-approximation and contacting of the cell Z with the contact region 4OK by forming a counter-electrode 51 of a counter-electrode arrangement 50. Alternatively or additionally, the counter-electrode arrangement 50 can also have a counter electrode 51, which faces the electrode tips 40s of the contact region, as indicated by a dashed representation.
  • FIGS. 3A and 3B only differs from the embodiment shown in FIG. 2 in that the surface 20a of the carrier 20 does not run strictly planar, but in the region of the electrode tips 40s form a concave depression 22, in particular in the form of a depression, so that, as becomes clear in the transition from the state of FIG. 3A to the state of FIG. 3B, an approaching cell Z better abuts against the surface 20a in the region of the recess 22 can cling to the surface, so that better Abdichtwiderstande at the points X over the proposed measuring medium 30 to avoid short circuits are possible.
  • FIGS. 4A to 4D show a schematic and sectional side view of various embodiments of the electrode arrangement 10 according to the invention.
  • a single electrode tip 40s is provided which defines the contact region 40K of the electrode assembly 10 and which is attached and contacted at its proximal end 40p to the top surface 40ba.
  • the electrode tip 40s and the base 40b as a connection portion 40A are formed einstuckig.
  • a single and separate electrode tip 40s which is to form the contact region 40K of the electrode assembly 10 can also be attached to the upper side 40ba of the base 40b in a downstream process, so that gives a one-piece structure, as shown in Fig. 4B.
  • FIG. 4C likewise shows a one-piece embodiment of the electrode arrangement 10 according to the invention, but this time with a plurality of electrode tips 40s, which are each formed with their proximal ends on the upper side 40ba of the carrier 40b.
  • Fig. 4D again a Ausbowungs form of the inventive electrode assembly 10 is shown in which there is no Einstuckmaschine between the electrode tips 40 and the base 40 b. Rather, the electrode tips 40s, which are the contact region 4OK of the electrode assembly 10 of FIG. 4D form on the top 40ba applied in a downstream process, electrically and mechanically contacted.
  • the embodiment of the electrode arrangement 10 according to the invention which is illustrated in the form of a schematic and sectional side view or in the form of a schematic plan view in FIGS. 5A and 5B, shows a plurality of electrode tips 40s in a row on the base 40b in the form of a planar Plate are arranged, in a non-integral manner.
  • the distal ends 40d and the proximal ends 40p of the electrode tips 40s are shown, which face away from the upper side 40ba of the base 40b and are in contact therewith.
  • the electrode tips 40s shown in Figs. 5A and 5B have a length Ls and are equidistant from each other in pairs with equal distances dd, ds. Also their geometric design is the same. This means that they have the same square cross-section with an edge length Dp and a corresponding diameter Dp in the region of the distal end 40p.
  • the electrode tips 40s are of equal length and extend strictly monotonically tapering to their tip.
  • FIG. 6 shows an embodiment of the electrode arrangement according to the invention, in which a plurality of electrode tips 40s, which form the contact region 40K of the electrode arrangement 10 according to the invention, are arranged in the form of a square matrix with an equal spacing dd, ds from each other and with an identical diameter Dp, which here describes the diameter of the circular cross-section proximal end 40p of the respective electrode tips 40s.
  • FIG. 7A shows an embodiment of the electrode arrangement according to the invention, in which a type of lawn of a plurality of electrode tips 40s is provided on the base 40b of the electrode arrangement 10.
  • FIG. 7B is an electron micrograph of an embodiment of the electrode arrangement 10 according to the invention, which has been galvanically produced according to the invention.
  • the individual electrode tips 40s do not have the same length, and have different orientations and directions.
  • FIGS. 8 to 10 show microscopic photographs of corresponding applications of an electrode arrangement 10 according to the invention with a single electrode tip 40s, which is in contact with a test cell Z.
  • carrier substrate 20a surface, surface area, top

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Elektrodenanordnung (10) für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Zellen (Z) und dergleichen. Die Elektrodenanordnung (10) weist einen Kontaktbereich (40k) zum Kontaktieren der Elektrodenanordnung (10) mit einer biologischen Zelle (Z) oder dergleichen, sowie einen Anschlussbereich (40A) zur externen elektrischen Kontaktierung der Elektrodenanordnung (10) auf . Der Kontaktbereich (40K) ist mit einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet, die sich vom Anschlussbereich (40a) her erstrecken und eine geometrische Gestalt aufweisen, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen in eine biologische Zelle (Z) oder dergleichen über deren Membran (M) in das Zellinnere (I) erlaubt.

Description

Elektrodenanordnung , deren Verwendung sowie Verfahren zu deren Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrodenanordnung, deren Verwendung sowie - insbesondere galvanische - Verfahren zu deren Herstellung.
Zur Untersuchung und/oder zur Manipulation biologischer Spezies oder Zellen und dergleichen sind unterschiedliche Verfahren und Mess- bzw. Manipulationsanordnungen bekannt.
Zum einen ist ein äußeres Kontaktieren der Membran der Spezies oder Zelle durch Anlagern der entsprechenden Spezies oder Zelle an eine Elektrode denkbar, wobei ein direkter Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle oder dergleichen in diesem Fall nicht möglich ist, da die Membran der Spezies oder Zelle der nicht durchdrungen wird.
Andererseits sind verschiedene Patch- und Voltage-Clamp-Techniken bekannt, mit deren Hilfe auch ein Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle möglich ist, um diese zu manipulieren und/oder elektrisch abzugreifen.
Nachteilig bei den bekannten Verfahren sind zum einen die ver- gleichsweise indirekte Ableitung und der indirekte Zugriff auf das Innere der Spezies oder Zelle und zum anderen die geringe
Reproduzierbarkeit der Manipulationen und der entsprechenden
Messergebnisse sowie ferner die Instabilität der Anordnung aus
Spezies oder Zelle und manipulierender oder messender Einrichtung und der Stress für die Spezies oder Zelle selbst.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Elektrodenanordnung für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Spezies oder Zellen und dergleichen, ein Verfahren zu deren Herstel- lung sowie entsprechende Verwendungen anzugeben, bei welchen sich ein Zugriff auf das Innere einer Spezies oder Zelle auf besonders einfache, zuverlässige, schonende und reproduzierbare Art und Weise realisieren lässt.
Gelöst wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bei einer Elektrodenanordnung erfindungsgemäß durch die Merkmale des unabhängigen Patentanspruchs 1. Des Weiteren wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch ein Herstellungsverfahren erfindungsgemäß mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 43 gelöst. Ferner wird die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe durch Verwendungen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung gemäß den unabhängigen Patentansprüchen 60 und 61 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind jeweils Gegenstand der abhängigen Unteransprüche .
Im Sinne der Erfindung werden unter einer biologischen Spezies oder Zelle jeweils subsumiert eine biologische Zelle im engeren Sinne, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle, ein Liposom, ein Vesikel, eine micelläre Struktur, deren Bestandteile oder Fragmente sowie deren Verbände oder Aggregate, wobei auch so genannte Fusionsspezies oder Fusionszellen, im Hinblick auf Quer- und Längsfusion, mit umfasst sein sollen. Erfindungsgemäß kann dem jeweiligen System zur Untersuchung eine jede dieser Spezies zugrunde gelegt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Elektrodenanordnung für elektrophysiologische Untersuchung an biologischen Spezies, insbesondere an biologischen Zellen oder dergleichen geschaffen. Die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung ist mit einem Kontaktbereich ausgebildet zum Kontaktieren der Elektrodenanordnung mit mindestens einer biologischen Spezies, einer biologischen Zelle oder dergleichen. Des Weiteren ist ein Anschlussbereich ausgebildet zum externen elektrischen Anschließen der Elektrodenanordnung. Der Kontaktbereich ist mit einer Elektrodenspitze oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen als Elektroden ausgebildet, die sich vom Anschlussbereich der Elektrodenanordnung her erstrecken. Die Elektrodenspitzen sind jeweils mit einer geometrischen Gestalt ausgebildet, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen der Elektrodenspitzen in eine biologische Spezies oder Zelle oder dergleichen über deren Membran in deren Inneres erlaubt.
Es ist somit eine Kernidee, bei einer Elektrodenanordnung den Kontaktbereich mit einer Elektrodenspitze oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen auszubilden. Die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen sind geeignet, eine Membran der biologischen Spezies, insbesondere einer biologischen Zelle, zerstö- rungsfrei zu durchdringen, um einen Zugriff auf das Innere der biologischen Spezies oder Zelle zu erlangen.
Bei einer Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elekt- rodenspitzen sich jeweils vom Anschlussbereich her monoton oder streng monoton verjüngend erstreckend ausgebildet sind. Das heißt insbesondere, dass sich die Elektrodenspitze vom proximalen zum distalen Ende hin gleichförmig verjüngt.
Alternativ oder zusätzlich kann es vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen sich jeweils vom Anschlussbereich her zylindrisch oder quaderförmig verlaufend und am vom Anschlussbereich abgelegenen und distalen Ende der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einer sich mono- ton oder streng monoton verjüngenden Spitze ausgebildet sind.
Bei einer anderen alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einem Querschnitt ausgebildet sind, der rund, kreisförmig, elliptisch, rechteckig oder quadratisch ist.'
Bei einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einem dem Anschlussbereich zugewandten oder den Anschlussbereich bildenden ersten und proximalen Ende ausgebildet sind. - A -
Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass der Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am proximalen Ende im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 5000 nm ausgebildet ist.
Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass der Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehr- zahl Elektrodenspitzen am proximalen Ende unterhalb von etwa 1/10 des Durchmessers einer zu kontaktierenden Spezies oder Zelle liegt .
Bei einer besonders vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen mit einem vom Anschlussbereich abgewandten zweiten und distalen Ende ausgebildet sind.
Dabei kann es in diesem Fall gemäß einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung vorgesehen sein, dass die Durchmesser der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am distalen Ende im Bereich von 1/10 des Durchmessers einer zu kontaktierenden Spezies oder Zelle ausgebildet sind.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen am distalen Ende mit einem Krümmungsradius im Bereich von etwa 5 nm bis etwa 50 nm ausgebildet sind.
Dabei ist der Krümmungsradius der Elektrodenspitze insbesondere der Radius derjenigen Kugel, welche die Elektrodenspitze an ihrem distalen Ende am besten approximiert.
Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen im Bereich der distalen Enden mit einem spitzen Winkel im Bereich von etwa 10° bis etwa 50° als Öffnungswinkel der jeweiligen Spitze ausgebildet sind.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen vom Anschlussbereich her eine Länge im Bereich von etwa 4/5 dem Durchmesser einer zu kontaktierenden Spezies aufweisen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass der Kontaktbereich mit einer Mehrz.ahl E- lektrodenspitzen ausgebildet ist.
Bei einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitzen geometrisch gleich und/oder gleich wirkend ausgebildet sind.
Bei einer anderen Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass der Anschlussbereich als materiell zusammenhängende Basis mit einer Oberfläche und einer Unterseite ausgebildet ist.
Bei einer weiteren Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen sich von der Oberfläche der Basis aus erstreckend ausgebildet sind.
Bei einer besonders bevorzugten Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen sich von der Oberfläche der Basis aus senkrecht oder im We- sentlichen senkrecht erstreckend ausgebildet sind, zumindest lokal.
Bei einer anderen vorteilhaften Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Elektrodenspitzen zueinander gleich orientiert und parallel oder im Wesentlichen parallel ausgerichtet ausgebildet sind, zumindest lokal.
Denkbar ist es auch, dass die Elektrodenspitzen gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung alternativ oder zusätzlich in Form einer Reihe, Matrix oder senkrechten Matrix auf der Oberseite der Basis angeordnet ausgebildet sind.
Möglich ist es auch, dass die Elektrodenspitzen gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung mit gleichen paarweisen Abständen direkt benachbarter Elektrodenspitzen in den Hauptachsenrichtungen ihrer Anord- nung angeordnet ausgebildet sind.
Auch ist es denkbar, dass die Oberfläche der Basis planar ausgebildet ist, zumindest lokal.
Ferner ist es möglich, dass die Basis und die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen miteinander einstückig als integraler materieller Bereich ausgebildet sind.
Bei einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbil- düng der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Basis und die Elektrodenspitzen oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen einteilig miteinander verbunden ausgebildet sind.
Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbil- düng der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Basis und die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elekt- rodenspitzen aus demselben, insbesondere elektrisch leitfähigen Material ausgebildet sind.
Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass die Elektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen als galvanisch gewachsene Strukturen ausgebildet sind.
Bei einer besonders vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass ein Träger mit einer Oberfläche und einer Unterseite aus einem elektrisch isolierenden Material ausgebildet ist.
Dabei kann es in diesem Fall gemäß einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung vorgesehen sein, dass die proximalen Enden der Elektrodenspitzen und gegebenenfalls die Basis im Träger eingebettet und echt unterhalb der Oberfläche des Trägers und die distalen Enden der Elektrodenspitzen echt oberhalb der Oberfläche des Trägers ausgebildet sind.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Oberfläche des Trägers vollständig oder lokal konform und insbesondere parallel zur Oberfläche der Basis verlaufend ausgebildet ist.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Oberfläche des Trägers vollständig oder lokal planar, konvex und/oder konkav ausgebildet ist.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Oberfläche des Trägers planar oder im Wesentlichen planar und mit konkaven Vertiefungen im Bereich der proximalen Enden der Elektrodenspitzen ausgebildet ist. Es ist auch möglich, dass die Unterseite der Basis an der Unterseite des Trägers zumindest zum Teil vom Trägermaterial unbedeckt ausgebildet ist, um einen externen elektrischen Abgriff zu ermöglichen .
Denkbar ist auch, dass elektrisch isoliert zum Kontaktbereich und zum Anschlussbereich eine Gegenelektrodenanordnung und/oder eine Referenzelektrodenanordnung ausgebildet sind.
Die Gegenelektrodenanordnung kann mit einer oder einer Mehrzahl Gegenelektroden ausgebildet sein.
Die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon und/oder die Referenzelektrodenanordnung können auf der Oberfläche des Trägers ausgebildet sein.
Bei einer besonders bevorzugten Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die räumliche Anordnung und/oder die Geometrie der Gegenelektrodenanordnung zur Erzeugung eines gesteuert inhomogenen elektrischen und/oder elektromagnetischen Feldes ausgebildet sind.
Bei einer anderen vorteilhaften Fortbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung kann es alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein, dass die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon der Elektrodenspitze oder der Mehrzahl Elektrodenspitzen gegenüberliegend ausgebildet sind.
Denkbar ist es auch, dass die Gegenelektrodenanordnung oder ein Teil davon in einem Abstand im Bereich von etwa 15 μm bis etwa 1 cm von der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet sind.
Auch ist es denkbar, dass eine Gegenelektrode der Gegenelektrodenanordnung mit einer flächenhaften Geometrie ausgebildet ist. Bei einer besonders bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Gegenelektrode der Gegenelektrodenanordnung eine Größe und/oder eine Fläche aufweist, die groß sind im Ver- hältnis zur Größe/Fläche der Elektrodenspitzen, insbesondere in einem Verhältnis im Bereich von etwa 5:1 oder im Bereich von etwa 100:1 oder darüber.
Die Elektrodenspitzen und/oder die Basis können z.B. aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe gebildet sind, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platin-Iridium- Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen.
Bei einer vorteilhaften alternativen oder zusätzlichen Weiterbildung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Mehrzahl Basen mit jeweils einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet ist.
Auch ist dabei es denkbar, dass die Basen einzeln oder gruppenweise voneinander elektrisch isoliert und/oder räumlich getrennt ausgebildet sind.
Bei einer bevorzugten alternativen oder zusätzlichen Weiterbil- düng der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass als Träger ein Materialbereich mit oder aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe ausgebildet ist, die besteht aus Gläsern, glasähnlichen Materialien, organischen Polymeren und Fotolacken.
Durch die vorliegende Erfindung werden des Weiteren Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung geschaffen.
Dabei ist es erfindungsgemäß vorgesehen, dass zumindest die E- lektrodenspitze oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen durch einen
Prozess oder eine Kombination von Prozessen aus der Gruppe ausge- bildet werden, die umfasst galvanisches Abscheiden, galvanisches Wachsen und galvanisches Aufwachsen.
Grundidee ist also das galvanische Prozessieren und/oder Herstel- len'der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung.
Bei einer ersten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Grundelektrode, z.B. in Form einer Basis, zugrunde gelegt wird und dass eine einzelne Elektrodenspitze auf der Grundelektrode ausgebildet wird.
Bei einer alternativen Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Grundelektrode, z.B. in Form, einer Basis, zugrunde gelegt wird und dass auf dieser Grundelektrode eine Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet wird.
In diesem Fall kann es bei einer anderen Weiterbildung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung vorgesehen sein, dass eine Mehrzahl Grundelektroden, z.B. in Form einer entsprechenden Mehrzahl Basen, zugrunde gelegt wird und dass auf jeder der Grundelektroden eine einzelne Elektrodenspitze oder eine Mehrzahl Elektrodenspitzen ausgebildet wird, wobei insbesondere die Grundelektroden oder Basen paarweise oder gruppenweise voneinander elektrisch isoliert bleiben .
Ferner ist es alternativ oder zusätzlich denkbar, dass die Grund- elektrode oder Grundelektroden mit den ausgebildeten Elektrodenspitzen mit einem elektrisch isolierenden Trägerbereich bedeckt werden und dass dabei die Elektrodenspitzen mit ihren distalen Enden sich oberhalb der Oberfläche des elektrisch isolierenden Trägers erstrecken.
In diesem Fall kann es vorgesehen sein, dass nach dem Bedecken mit dem elektrisch isolierenden Träger zumindest die distalen Enden der Elektrodenspitzen einem Reinigungs- oder Abisolierungs- prozess unterzogen werden.
Dabei kann zur Abisolierung der Elektrodenspitzen und insbesonde- re der distalen Enden der Elektrodenspitzen die Elektrodenspitzen mit elektrischen Pulsen, insbesondere im Mikrosekundenbereich, derart beaufschlagt werden, dass im Verhältnis zur Umgebung e- lektrische Durchbrüche erzeugt werden.
Bei einer anderen vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass ein kovalent an die Grundelektrode oder an die Basis bindendes und elektrisch isolierendes Material verwendet wird.
Dabei ist es denkbar, dass ein bindendes und elektrisch isolierendes Material aus der Gruppe verwendet wird, die besteht aus kovalent bindenden Lipiden, kovalent an Metalle bindenden Lipiden und isolierenden Kunststoffen.
Bei einer anderen und bevorzugten Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass eine Grundelektrode zugrunde gelegt wird, insbesondere in Form einer Basis, dass auf der Ober- fläche der Grundelektrode oder Basis eine strukturierte Schablone derart ausgebildet wird, dass durch Ausnehmungen in der Schablone Bereiche auf der Oberfläche der Grundelektrode oder der Basis an wohldefinierten Stellen frei bleiben, und dass dann der galvanische Prozess derart durchgeführt wird, dass ausschließlich im Bereich der Ausnehmungen der Schablonen auf der Grundelektrode die Elektrodenspitzen oder Vorformen davon ausgebildet werden.
Dabei kann es vorgesehen sein, dass durch die Dicke der Schablone und die Tiefe der Ausnehmungen von der Oberfläche zur Schablone zur Oberfläche der zugrunde gelegten Elektrode oder der Basis die Länge der Elektrodenspitzen oder der Vorformen davon definiert wird. Auch ist es alternativ oder zusatzlich denkbar, dass durch die lichte Weite oder den Durchmesser der Ausnehmungen in der Schablone die Starke der Elektrodenspitzen oder der Vorformen davon definiert wird.
Es kann eine schichtartig aufgebaute Schablone verwendet werden.
In diesem Fall ist es gemäß einer anderen vorteilhaften Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung vorgesehen, dass eine Schablone mit zwei Schichten verwendet wird, dass die der Grundelektrode oder der Basis zugewandte Schicht elektrisch isolierende Eigenschaften besitzt und in wohldefmierter Weise stabil und inert gegen bestimmte chemische und/oder physikalische Einwirkun- gen ausgebildet wird und dass die zweite Schicht oder darauf folgende Schichten durch vergleichsweise milde chemische und/oder physikalische Einwirkungen und insbesondere durch milde chemische Reagentien entfernbar ausgebildet wird.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausfuhrungsform des erfindungs- gemaßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass das Verhältnis der Schichtstarken der untersten Schicht der Schablone zu der gesamten Schichtstarke der nachfolgenden und ablösbaren Schichten so ge- wählt wird, dass eine gewünschte Lange für die aus dem isolierenden Trager herausragenden Bereiche der Elektrodenspitzen erreichbar ist.
Alternativ oder zusatzlich kann es bei einer anderen vorteilhaf- ten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens zum Herstellen der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung ist es vorgesehen, dass auf der Grundelektrode oder der Basis zunächst die mehrschichtige Schablone ausgebildet wird, dass dann der galvanische Prozess durchgeführt wird, dass dann nach Abschluss des galvani- sehen Prozesses bis auf die unterste und direkt auf der Grundelektrode oder der Basis aufliegenden Schicht samtliche Schichten der Schablone entfernt werden, und dass dann die unterste und auf der Grundelektrode oder der Basis direkt aufliegende und verbliebene Schicht der Schablone als isolierender Träger für die Elektrodenanordnung verwendet wird.
Die distalen Enden der Elektrodenspitzen können durch ein elektrochemisches Ätzverfahren nachbehandelt werden, um die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen an ihren distalen Enden zu schärfen, insbesondere in Kombination mit einem Maskierungs- prozess .
Die benötigte Maskenherstellung kann z.B. über Mikroporefilter oder durch Behandlung von Trägermaterialien mittels Schwerionen- beschuss erfolgen.
Durch die Erfindung werden auch Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung und Anwendungen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung geschaffen.
Die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung kann erfindungsgemäß zur elektrophysiologischen Untersuchung und/oder Manipulation einer Spezies aus der Gruppe verwendet werden, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellären Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestand- teilen dieser Spezies und Verbänden dieser Spezies.
Die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung kann erfindungsgemäß auch zur Mikroinjektion einer Substanz in eine Spezies aus der Gruppe verwendet werden, die gebildet wird von biologischen ZeI- len, Liposomen, Vesikeln, micellären Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies und Verbänden dieser Spezies.
Im letzteren Fall können vor der Mikroinjektion die Spitze der Elektrodenspitze oder die Spitzen der Elektrodenspitzen mit der zu injizierenden Substanz beaufschlagt werden. Die Beaufschlagung kann insbesondere auch durch Applizierung von elektrischen Feldern geschehen, z.B. bei elektrisch geladenen Substanzen, z.B. bei DNA.
Es ist von besonderem Vorteil, wenn die Elektrodenanordnung in eine Mikrostruktur eingebettet vorgesehen wird.
Es ist auch denkbar, dass die Elektrodenanordnung in einer Lap- on-the-Chip-Struktur vorgesehen wird.
Ferner ist es möglich, dass die Elektrodenanordnung in oder für einen Assay vorgesehen wird, insbesondere für High-Throughput-An- wendungen .
Es kann bei diesen Verwendungen und Anwendungen auch vorgesehen sein, dass bei ruhender Elektrodenanordnung die zu untersuchende und/oder zu behandelnde Spezies oder eine Mehrzahl davon auf die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen zu geführt werden.
Dabei kann es vorgesehen sein, dass das Bewegen der zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies auf die Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen zu durch Kraftausübung auf die entsprechende Spezies bewirkt wird.
Denkbar ist, dass die Kraftausübung bewirkt wird durch eine die- lektrophoretische Kraft.
Dabei kann es vorgesehen sein, dass die dielektrophoretische Kraft erzeugt wird durch das Erzeugen eines - insbesondere hochfrequenten - inhomogenen elektrischen Wechselfeldes zwischen der Elektrodenspitze oder Mehrzahl Elektrodenspitzen und der vorgesehenen Gegenelektrodenanordnung mit den Gegenelektroden.
Dabei kann es von Vorteil sein, dass die Elektrodenspitzen mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen .
Alternativ oder zusatzlich ist es denkbar, dass ein elektrischer Zellkafig zur Mikropositionierung der Spezies wahrend der die- lektrophoretischen Annäherung verwendet wird.
Ferner kann es zusatzlich oder alternativ zur Erleichterung der Zellkontaktierung vorgesehen werden, dass die zu kontaktierende Zelle durch isoosmolare Losungen prall aufgefüllt wird.
Durch Versteifungsreagentien können - z.B. durch EDTA oder Pluro- nium - können die Membran versteift und das Penetrieren der E- lektrodenspitze erleichtert werden.
Es wird ferner eine Elektrodenanordnung vorgeschlagen, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung 50 oder ein Teil 51 davon nach einem der vorangehenden Ansprüche ausgebildet ist, um insbesondere eine dielektrische Kontaktierung biologischer Zellen in einer Art von Sandwichsystem zu ermöglichen, bei der die zu untersuchende biologische Zelle nach elektrischer Kontaktierung und Fusion eine Überbruckung zwischen den beiden Elektroden ermöglicht.
Es wird auch eine Elektrodenanordnung vorgeschlagen, bei welcher eine Gegenelektrode 51 der Gegenelektrodenanordnung 50 eine Große und/oder eine Flache aufweist, die groß sind im Verhältnis zur Große/Flache der Elektrodenspitzen 40s, insbesondere in einem Verhältnis im Bereich von etwa 5:1 oder im Bereich von etwa 100:1 oder darüber, vorzugsweise im Bereich von etwa 10000:1.
Denkbar ist auch eine Elektrodenanordnung bei welcher die Elektroden durch eine chemische Reaktion derart modifiziert sind, dass eine elektrophysiologische Untersuchung von biologischen Zellen ermöglicht, erleichtert oder sensitiver ist, wobei die chemische Reaktion insbesondere hauptsachlich eine elektrochemische Oxida- tion der vorgenannten Metalle mit einem Halogen ist, wobei die chemische Reaktion insbesondere zeitlich vor oder nach der Kon- taktierung der biologischen Zelle erfolgt, wobei im letzteren
Fall das Halogen aus dem Zytosol der Zelle gewonnen und/oder geliefert wird.
Ferner kann auch eine Elektrodenanordnung vorgesehen sein, bei welcher die Elektrodenanordnung mit einer Druckmesssonde kombiniert ist, wobei es sich dabei insbesondere um eine externe, außen an einem Messobjekt, oder eine invasive, sich innerhalb eines Messobjektes befindliche Druckmesssonde handelt.
Auch ist eine andere Verwendung vorgesehen, bei welcher die E- lektrodenspitze 40s oder Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 100 MHz, vorzugsweise von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz, weiter bevorzugt von etwa 100 Hz bzw. etwa 40 MHz beaufschlagt werden, um die dielektropho- retische Kraft zu erzeugen.
Bei einer anderen Verwendung wird eine elektrische Isolation nicht mit Zellen kontaktierter, freier Elektroden sondern derart vorgenommen, dass eine Lösung von Liposomen definierter Größe, wobei der minimale Durchmesser 100 nm und der maximale Durchmesser 5 μm beträgt, über die Elektrodenfläche gespült und durch Anlegen eines Wechselstroms auf die besagten freien Elektrodenspitzen kontaktiert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum elektrischen Kontaktieren einer zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies Z, insbesondere einer biologischen Zelle oder dergleichen, mit einer Elektrodenspitze 40s einer Elektrodenanordnung 10 vorgeschlagen, bei welchem eine Patchpipette oder Patchelektrode als Elektrodenspitze 40s verwendet wird oder die Elektrodenspitze 40s aufweist und bei welchem die Elektrodenanordnung 10 derart gesteuert mit einem elektrischen Feld beaufschlagt wird, dass ein dielektrophoretische Kraft auf die zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies Z derart ausgeübt wird, dass die zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies Z an die Elektrodenspitze 40s angenähert und mit dieser kontaktiert wird.
Dabei kann die Elektrodenspitze 40s oder eine Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 100 MHz, vorzugsweise von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz, weiter bevorzugt von etwa 100 Hz bzw. etwa 40 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen.
Die Fokussierung bzw. Kontaktierung der elektrophysiologisch zu untersuchenden biologischen Zellen erfolgt vorzugsweise die- elektrisch durch Modulation der Frequenzen, wobei die dazu appli- zierenden Frequenzen im Bereich von mindestens 100 Hz bis maximal 100 MHz, besonders im Bereich von 100 kHz bis 40 MHz liegen.
Eine besondere Ausführung sieht eine Kombination der vorgehend beschriebenen Elektrodenanordnung mit einer Druckmesssonde vor, wobei es sich dabei um eine externe, außen an einem Messobjekt oder eine invasive, sich innerhalb eines Messobjektes befindliche Druckmesssonde handelt.
Vorgesehen sein kann auch eine Elektrodenanordnung, bei welcher die Gegenelektrode ebenfalls als Fakirelektrode ausgebildet ist und somit eine dielektrische Kontaktierung biologischer Zellen in einer Art von „Sandwich"System ermöglicht bei der die zu untersuchenden biologischen Zellen nach elektrischer Kontaktierung und Fusion eine Überbrückung zwischen den beiden Elektroden ermögli- chen. Dies ist in den Figuren IIA und IIB sowie 12A und 12B gezeigt .
Auch ist denkbar eine Elektrodenanordnung, bei welcher die Elektroden durch chemische Reaktion derart modifiziert werden, dass eine elektrophysiologische Untersuchung von biologischen Zellen ermöglicht, erleichtert oder sensitiver gestaltet wird, wobei vorgenannte chemische Reaktion hauptsächlich eine elektrochemi- sche Oxidation der vorgenannten Metalle mit einem Halogen ist. Diese chemische Reaktion kann zeitlich vor oder nach der „Kontak- tierung" der biologischen Zelle geschehen. Im letzteren Fall wird das Halogen aus dem Zytosol der Zelle gewonnen/geliefert.
Ein mögliche Verwendung ist denkbar, bei welcher eine elektrische Isolation nicht mit Zellen kontaktierter, freier Elektroden vorgenommen wird der Art, dass eine Losung von Liposomen definierter Große, wobei der minimale Durchmesser 100 nm und der maximale Durchmesser 5 μm betragt, über die Elektrodenflache gespult und durch Anlegen eines Wechselstroms auf die besagten freien Elektrodenspitzen kontaktiert wird.
Die dielektrophoretische Kontaktierung kann auch mit einer Kon- struktion möglich sein, die einer normalen Patch-Pipette ähnelt.
Eine Elektrode - in Folge mit A bezeichnet - die von einer Mikro- glaskapillare umgeben ist, die wiederum mit einer physiologischen
Losung gefüllt ist. Die anziehende Kraft auf die Zelle wird - bei geeigneter Gegenelektrode B - in Richtung der Elektrode A erfol- gen. Dadurch wird die Zelle gleichzeitig in Richtung der Mikro- glaskapillare beschleunigt und von dieser „aufgespießt".
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend weiter erläutert:
Nachfolgend wird die erfindungsgemaße Elektrodenanordnung synonym auch als Fakirelektroden bezeichnet. Die Erfindung betrifft also insbesondere auch so genannte Fakirelektroden, deren Herstellung und deren Verwendung.
Problemstellung
Mit Hilfe elektrophysiologischer Techniken können die elektrischen Parameter von biologischen Systemen untersucht und manipu- liert werden. Angewendet werden diese Techniken auf Zellverbande , einzelne Zellen, Fragmente von Zellmembranen und Liposomen und Proteoliposomen, letztere u.a. mit Hilfe von Techniken, die auf so genannten künstlichen Membranen beruhen) . Im Folgenden wird das Spektrum dieser biologischen Systeme verkürzt „Zellen" genannt. All diesen elektrophysiologischen Techniken ist gemein, dass sie auch zur Untersuchung der Funktionseigenschaften bzw. zur Manipulation von (Membran) -Proteinen und den sie umgebenden Membranen eingesetzt werden.
Ein entscheidendes Problem der existierenden elektrophysiologischen Technologien, z.B. bei Voltage-, Current- und Patch-Clamp- Techniken, ist, dass mit diesen nur direkte elektrische Ableitungen an Zellen ab bestimmter Größe - z.B. mit einem Durchmesser größer als 10 μm - möglich sind, andererseits wobei an lebenden Zellen irreversible Schädigungen durch die Mikroelektroden erzeugt werden. Darüber hinaus sind diese Technologien bei mechani- sehen Einwirkungen instabil. Dies führt nach kurzem Zeitraum zu einer Zerstörung der Zelle. Es lässt sich auch feststellen, dass alle existierenden elektrophysiologischen Techniken den - insbesondere für kommerzielle Applikationen - schwerwiegenden Nachteil aufweisen, dass sie äußerst kompliziert sind und dadurch eine Automatisierung der Prozessführung bei diesen Techniken aufwendig und sehr fehleranfällig ist.
Die hier vorgestellte Erfindung weist die oben besagten Nachteile existierender Technologien nicht auf. Sie zeichnet sich durch eine hohe Robustheit, Flexibilität in der Anwendung aus und erlaubt sowohl indirekte wie auch direkte (reversible) elektrische Ableitungen an den eingesetzten Zellen.
Idee
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem insbesondere eine elektrophysiologische Messanordnung für Zellen, Fusionszellen, Liposomen, Membranfragmente und Zellverbände - im Folgenden einfach als Zellen zusammengefasst - vor.
Die elektrische Manipulation der Zellen erfolgt durch eine oder mehrere Elektroden, die direkt in die Zellen eindringen. Die Größe der Elektroden hängt dabei vom verwendeten zellulären System ab. Die Elektrode wird bei sehr kleinen Zellen - Durchmesser im Bereich von 15 μm - einen sehr kleinen Durchmesser haben, z.B. im bereich von etwa 900 nm, und nur eine geringe Länge aufweisen, z.B. im Bereich von etwa 5 μm. Wichtig ist auch, dass die Fakirelektroden eine feine Spitze haben, z.B. kleiner als etwa 500 nm, um das zelluläre System beim Eindringen möglichst wenig zu verletzen .
Fig. 1 zeigt eine mögliche elektrophysiologische Anordnung der hier vorgestellten Fakirtechnologie. Dargestellt ist eine Zelle, kontaktiert durch eine Fakirelektrode mit mehrfachen Spitzen.
Herstellungsarten der Fakirelektrode
Wichtige Eigenschaften der hier vorgestellten Fakir-Elektroden sind bei einigen Ausführungsformen
a) ihre geometrischen Abmessungen und/oder
b) das elektrisch isolierende Trägermaterial für die Elektrode .
Durch das Trägermaterial wird die freiliegende Länge der Elektro- de bestimmt. Die Herstellung solcher Fakirelektroden aus Nanoe- lektrodenstrukturen und Trägermaterial ist Teil der hier vorgestellten Erfindung.
Wie in (1) ausgeführt, müssen die verwendeten Fakirelektroden bei einigen Anwendungen sowohl in ihrer Geometrie als auch in ihrer Länge Dimensionen in der Größenordnung von Nano- und Mikrometern aufweisen, und zwar abhängig vom verwendeten zellulären System: Der Durchmesser muss zwischen etwa 50 nm und etwa 5000 nm liegen, die Länge zwischen etwa 500 nm und etwa 250 μm. Die Fakirelektro- den bestehen aus leitfähigen Materialien, vorzugsweise Metallen aus Silber, Gold, Platin, Wolfram und/oder Legierungen wie z.B. Pt-Ir und Au-Ir. Herstellungsverfahren
Ein mögliches Verfahren zur Herstellung von Metall-Elektroden, die die oben beschriebenen Eigenschaften aufweisen, kann durch die Nanostrukturierung von Elektroden erfolgen.
Dabei kann die Oberfläche einer Metallelektrode mittels galvanischer Abscheidung derart strukturiert werden, dass sie Metallspitzen mit den weiter oben beschriebenen räumlichen Dimensionen aufweist. Prinzipiell sind dabei verschiedene „Konfigurationen" möglich, z.B.
a) die Erzeugung einer einzelnen Nanofakirspitze auf der E- lektrodenoberfläche, b) die Erzeugung mehrerer Nanofakirspitzen auf einer Elektrodenoberfläche sowie c) die Erzeugung einer oder mehrere Fakirspitzen auf der O- berfläche von voneinander isolierten Elektroden.
Letztere Konfiguration hat den Vorteil, dass die einzelnen Fakirspitzen elektrisch unabhängig voneinander sind und einzeln abgegriffen werden können.
Um aus den derart nanostrukturierten Elektroden Fakir-Elektroden zu gewinnen, muss die gesamte Elektrodenfläche (ausgenommen die Fakirspitze) mit einer elektrisch isolierenden Schicht bedeckt werden. Dafür sollen zwei verschiedene Verfahren genutzt werden, a) Das erste Verfahren beruht auf einer Beschichtung der Elektrodenoberfläche mit einem an Metall kovalent bindenden Lipid. Dabei muss beachtet werden, dass dadurch eine solche Behandlung auch die Nanostrukturierungen auf der Elektrodenoberfläche abisoliert werden. Allerdings ist es möglich an den Fakirspitzen durch e- lektrische μs-Pulse einen „Durchbruch" zu erzeugen, der die Spitze freilegt. Dies erfolgt selektiv an den Stellen der Nanostruk- turierungen und nicht an der gesamten planaren (planar in Relation zu den Nanostrukturierungen) Elektrodenfläche, da die elektrischen Felder an den Orten größter Krümmungen am größten sind. Auf diese Art können Fakirspitzen mit gewünschten geometrischen und raumlichen Dimensionen hergestellt werden, b) Das zweite Verfahren greift bereits in den Herstellungsprozess wahrend der galvanischen Abscheidung zur Nanostrukturierung der Oberflache ein. Um eine Nanostrukturierung der Oberflache möglich zu machen, muss diese mit einer Schablone bedeckt sein. Diese Schablone weist Locher auf. Die Durchmesser dieser Locher bestimmen die Durchmesser der Nanostrukturierungen . Die Schichtdicke der Schablone bestimmt die Lange der Nanostrukturen . Teil der Erfindung ist es, dass die verwendete Schablone mindestens zwei Schichten aufweist. Die untere Schicht hat elektrisch isolierende Eigenschaften und ist stabil gegen chemisch/physikalische Einwirkungen. Die zweite Schicht lasst sich durch milde chemische Reagenzien auflosen. Weiterhin ist die Schichtdicke der oberen Schicht so gewählt, dass sie der gewünschten Lange der Fakir-Elektroden entspricht. Ist der galvanische Abscheidungsprozess abgeschlossen, wird nun die obere Schicht durch entsprechende Behandlung abgebaut, so dass nur noch die isolierende Schicht auf der Elektrodenoberflache zurückbleibt. Durch diesen Prozess ist es möglich schnell und effizient abisolierte Fakir-Elektroden zu erhalten.
Kontaktierung von Zellen an Nanofakirelektroden
Die in oben vorgestellten Fakirelektroden sollen in Zellen ein- dringen, damit diese elektrisch ableitbar werden. Teil der hier vorgestellten Erfindung ist, dass die Elektroden nicht wie bei herkömmlichen System zur Zelle gebracht werden, sondern die Zelle zur Fakirelektrode. Dies soll durch das Applizieren einer die- lektrophoretischen Kraft erreicht werden. Diese Kraft kann durch das Anlegen hochfrequenter, stark inhomogener Wechselfelder erzeugt werden und bewirkt bei geeigneten dielektrischen Eigenschaften der Zelle - in Bezug auf die dielektrischen Eigenschaften des Mediums - eine Wanderung der Zelle in Richtung der Fakirelektrode. Sie endet erst, wenn die Fakirelektrode im Inneren der Zelle ist. Dadurch wird die Zelle an die Fakirelektrode kontaktiert. Theoretische Erklärung: Bei konstanter Feldstarke nimmt die Kraft mit der Inhomogenität des Feldes zu, so dass bei elekt- rischen Feldern, die zwischen einer Spitze und einer planaren Referenzelektrode (daher rührt die Inhomogenität des Feldes her) existieren, die Kräfte so groß werden können, dass die Zelle auf atomaren Abstand an die Elektrode heran gezogen werden kann. Die Kraft auf die Zelle in einem solchen inhomogenen Wechselfeld nimmt weiterhin mit fallendem Abstand zur Fakir-Elektrode stark zu. Dies hat zur Folge, dass die Kontaktierung sehr schnell verläuft und das Eindringen der Metallspitze ein für die Membran der Zelle relativ stressfreier Vorgang ist. Dieser auf den ersten Blick verwirrender Befund lässt sich darauf zurückführen, dass die Membran aufgrund der Schnelligkeit des Heranführens an die Spitze schnell penetriert wird und sich dem Aufprall kaum widersetzt. Dies hat zur Folge, dass die Zelle den Prozess ohne Verlust ihrer Vitalität überstehen kann und der entstehende Komplex aus Elektrode und Zelle extrem stabil gegen mechanische Beeinflussungen ist.
Nanoinjektion von DNA und/oder anderen Substanzen
Die beschriebene Kontaktierung der Zelle kann auch zur Nano- oder Mikroinj ektion von bioaktiven Substanzen in zelluläre Systeme verwendet werden.
Dazu werden die Fakirelektroden vorher mit diesen Substanzen gecoated oder beschichtet. Dies kann z.B. bei Substanzen, die elektrischen Ladungen tragen (DNA), auch durch Anlegen entsprechender elektrischer Felder geschehen, die Kräfte auf die Partikel erzeugen und eine Bewegung zur Fakirelektrodenoberfläche bewirken. Wird die Zelle anschließend mit der Fakir-Elektrode kontaktiert, dann befindet sich die bioaktive Substanz in der Zelle. Vorteile bei diesem Verfahren sind einerseits der geringe Verbrauch bioaktiver Substanz, die beim „Animpfen" der Zelle verwendet wird, und die einfache Selektion der angeimpften Zellen von jenen, denen nichts injiziert wurde. Letzteres ist möglich, wenn man nach Kontaktierung das Zellmedium gegen ein zellfreies Medium austauscht und die Tochterzellen der angeimpften, kontaktierten Zellen erntet". Über die Messung der elektrischen Parame- ter der kontaktierten Zelle lasst sich zudem der Vitalitatszu- stand der Zellen bestimmen und es ist dadurch möglich optimal die Ernährung der Zellen zu steuern bzw. den Erntevorgang abzubrechen, falls die kontaktierten Zellen ihre Vitalität verlieren.
Herstellung eines Hybridsensorkopfes zur elektrischen Ableitung
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Nutzung von Fakirelektroden zu direkten oder intrazellularen elektrischen Ableitungen.
Dafür ist es erforderlich, dass die Fakirelektrode einen sehr hohen Abdichtungswiderstand gegenüber der Badlosung aufweist. Dadurch wird gewahrleistet, dass der von der Fakirspitze gegen eine Referenzelektrode gemessene Widerstand (bzw. andere elektrische Parameter des Systems) ausschließlich von der Leitfähigkeit der „Zell"-Membran der mit der Fakir-Elektrode kontaktierten Zelle bestimmt wird. Die Etablierung eines hohen Abdichtwiderstandes ist also ein sehr wichtiger Bestandteil unser Erfindung.
Zunächst muss die Fakir-Elektrode (bzw. die Fakirbrett-Elektrode) bis auf die Spitzen der Fakir-Nadeln elektrisch abgedichtet werden. In (2) ist beschrieben wie dies bei unserer Erfindung erreicht wird.
Nach der Kontaktierung der Fakirspitzen mit den besagten Systemen ist es notwendig die Flachen der Fakir-Elektrode, die noch zur Badlosung freiliegen, abzudichten.
a) Dies kann durch nachtragliche Lipidbeschichtung dieser freiliegenden Elektrodenflachen erfolgen. b) Eine andere Methode ist es Liposomen (50 nm bis 1 μm) mit Hilfe geeigneter hochfrequenter Wechselfelder anzuziehen bis alles Elektrodenmaterial abgedichtet ist.
Theoretische Erklärung: Das Verfahren beruht darauf, dass bei geeignet gewählten Bedingungen dielektrophoretische Kräfte nur auf Objekte bestimmten Durchmessers wirken. Bei Wahl geeigneter Frequenzen ist es daher möglich selektiv Objekte kleiner Große anzuziehen (z.B. kleine Liposomen von 50 nm bis 1 μm) wobei große Objekte (z.B. Zellen von 20 μm Durchmesser) keine Kraft erfahren.
c) Auch Fusion weiterer Zellen oder Liposome an das System, das bereits kontaktiert ist, kann dazu verwendet werden den Abdichtwiderstand der Fakir-Elektrode zu erhohen. Die Fusion kann durch moderate μs- Hochspannungspulse erreicht werden (um mehrere lateral oder vertikal dielektrophoretisch angeordnete Zellen elektrisch zu einem Fusionsprodukt zu verschmelzen, so genannte Elektrofusion, Dadurch entstehen gleichzeitig „Sensorkopfe" mit sehr großen, intakten Membranflachen.
Durch Verwendung von elektrischen Zellkafigen soll der Prozess der Kontaktierung automatisiert werden.
Elektrische Messungen an Hybridsensorkopfen
Die elektrische Parameter der Zelle können über verschiedene elektrische Verfahren ermittelt werden:
a) Impedanzverfahren, b) Voltageclampverfahren und c) Currentclampverfahren .
Beim Voltageclampverfahren ist es erforderlich reversibel arbeitende Elektroden wie die Ag/AgCl-Elektrode zu verwenden. Eine Chlorierung der Silberfakirelektrode soll vorher und bei Bedarf auch nach Kontaktierung erfolgen. Im letzten Fall wird dafür das intrazellular vorhandene Chlorid verwendet. Um Verunreinigungen oder Störungen bei diesem Prozess zu vermeiden, soll die Fakirelektrode in diesem Fall durch eine intrazellulare Salzbrucke vom Zytosol abgetrennt sein. Diese Salzbrucke kann z.B. aus Hydroge- len, wie z.B. Alginat, bestehen, die mit Cl-haltigen Salzen dotiert sind. Abhängig vom Verfahren müssen verschiedene Elektrodenmaterialien verwendet werden (siehe dazu (1) und (2)). Es sollen je nach Zweck verschiedene Verfahrensweise angewandt werden a) Verwendung einer einzeln Fakir-Elektrode zur Kontaktierung einer Zelle b) Verwendung mehrerer Fakir-Elektroden zur Kontaktierung einer Zelle d) Verwendung mehrerer Fakir-Elektroden zur Kontaktierung mehrerer Zellen. Im letzten Fall sollen die Fakirelektroden einerseits zusammen, andererseits einzeln abgegriffen werden.
Generell hat der Einsatz mehrerer Fakir-Elektroden den Vorteil, dass der Ausfall von einer oder mehreren Elektroden durch z.B. eine eventuelle Ablagerung von zytoplasmatischen Lipid- und Proteinkomponenten oder von Membrankomponenten bei der Penetrierung aufgrund des redundanten Systems kompensiert werden kann. Der Vorteil mehrerer unabhängige abgegriffener Fakirelektroden hat zusätzlich den Vorteil, dass parallel mehrere unterschiedliche Zellen simultan abgegriffen werden können und dadurch bei Einsatz äußerst geringer Lösungsvolumina viele voneinander unabhängige Ergebnisse ermittelt werden können.
Etablierung der Langzeitvitalität des Hybridsensorkopfes
Für kommerzielle Applikationen der hier vorgestellten Erfindung ist es von entscheidender Bedeutung nicht nur ein mechanisch stabiles System zu erzeugen, sondern gleichzeitig auch die Funktion des Systems über einen langen Zeitraum aufrecht zu erhalten. Die Grundvoraussetzungen hierfür sind weiter oben bereits geschildert. Eine weitere Maßnahme zur Erhöhung der mechanischen Stabilität des Komplexes aus Fakir-Elektrode und kontaktierte Zelle ist die Einbettung dieses Komplexes (des Hybrid- Sensorkopfes) in eine vernetzte Hydrogelmatrix (die z.B. aus einer mit Ba2+-Ionen vernetzten Alginatmatrize besteht) . Diese Immobilisierung des Komplexes gewährleistet gleichzeitig eine Langzeit-Vitalität des Komplexes und erleichtert auch die (Kryo- ) Konservierung der Hybrid-Sensorköpfe .
Anwendungsgebiete des Hybridsensorkopfes Die hier vorgestellte Erfindung konnte bestehende elektrophysio- logische Technologien komplementär erganzen. Sie soll in verschiedenen Variationen zur Anwendung kommen. Hintergrund hierfür liegt darin, dass zum Beispiel der Transmembran-Widerstand (ein wichtiger elektrischen Parameter des Zelle) von den Ionenkanalen in der Membran eines Systems abhangt, deren elektrische Leitfähigkeit spezifisch über ein breites Spektrum von Analyten (Liganden, Inhibitoren etc.) beeinflusst wird/werden kann.
Deshalb kann die Fakir-Technologie in Screeningtools (z.B. High- Throughput-Drug-Target-Verfahren) eingesetzt werden. Dazu werden so genannte Targets (z.B. Membranproteine wie Ionenkanale, siehe oben) in die Membran des Sensorkopfes eingebaut (durch z.B. hete- rologe Überexpression von Proteinen oder Dotierung mit rekonsti- tuierten Proteinen) . Derartige, aus Fakirelektroden und kontaktierten Zellen entstandene Hybrid-Sensorkopfe erlauben das Scree- nen eines breiten Spektrums von Wirkstoffen in analytischen Laboratorien ( „High-throughput-Screening" , „Lab on the Chip") sowie unter in-situ-Bedingungen (als „Lab in the Probe" im huma- nen/tierischen und pflanzlichen System) . Zusatzlich zu nativen Zellen sollen tierische und pflanzliche Sensorzellen verwendet werden, die über spezifische heterologe Überexpression von Transportern oder Zeil-Zeil- bzw. Zell-Membranfusion maßgeschneidert hergestellt werden können. Spezifisch auslegbare Sensorkopfe können als Disposables zur universellen elektronischen Peripherie vorgehalten werden. Die Sensoreinheiten können sowohl einzeln als auch in Form von Mikromodulen, vergleichbar mit Mikrotiterplat- ten, hergestellt werden. Letztere Konfiguration garantiert durch die Möglichkeit redundanter Messungen mit vergleichbaren Sensor- köpfen unter identischen Messbedingungen eine sehr hohe Zuverlässigkeit der Analytik. Darüber hinaus können bei Verwendung unterschiedlicher maßgeschneiderter Sensorkopfe auf demselben Modul auch komplexe Nachweise multipler Komponenten in kleinen Probenvolumina, z.B. zum Zweck von Drugscreenings , mit hoher Genauig- keit durchgeführt werden. Fur in-situ-Anwendungen muss der Sensorkopf in eine Sonde integriert werden - lab-in-the-probe - die den direkten, minimalinva- siven Zugang zu flussigkeitsgefullten Kompartimenten pflanzlicher oder tierischer/menschlicher Systeme ermöglicht. Für die Ablei- tung der Signale und für die Versorgung der Zellen mit geeigneten Medien soll die neue Sensorkopf-Technologie mit einem miniaturisierten Schlauch/Drucksensor/KatheterSystem verbunden werden. Für die schnelle und routinemäßige Vermessung von Wirkstoffkonzentra- tionen in intakten Pflanzen ist außerdem die Integration der Sensorkopf-/Katheteranordnung in einen Messautomaten nach dem Prinzip einer Gurtellochzange geplant.
Aspekte des Kontaktierens
Ein wichtige Voraussetzung, Zellen erfolgreich kontaktieren zu können, sind die Form der Spitze der Elektrodenspitze 40s und insbesondere deren Radius oder Krümmungsradius Ks am distalen Ende 4Od der Elektrodenspitze 40s, dieser sollte nicht über 1/10 des Durchmessers Dz der zu penetrierenden Zelle Z liegen.
Weiterhin ist es von Vorteil, wenn die Zellmembran M gespannt ist, sprich die Zelle Z gefüllt ist. Dies kann durch Verwendung nicht isoosmolare Losungen erreicht werden, in denen die Zellen Z inkubiert werden oder die als Messmedien 30 verwendet werden.
Für ein erfolgreiches Kontaktieren ist weiterhin hilfreich, dass - passend zum Durchmesser Dz der Zelle Z und zum Abstand der Zelle Z von der Fakirelektrode 40s die richtige dielektrophoreti- sche Kraft erzeugt wird. Die Parameter für diesen Prozess werden für jeden Zelltyp abhangig von oben genannten Bedingungen gewählt. Sie liegen in den angegebenen Bereichen. Nicht notwendig, aber gunstig ist die Applikation eines modulierten Wechselfeldes, d.h. eines elektrischen Feldes, welches sich in vorprogrammierter Weise wahrend des Anziehexperiments verändert. Der Zeitbereich zur Erzeugung der anziehenden Kraft liegt bei etwa 10 μs bis etwa 30 s. Die Modulation des Wechselfeldes kann über die Amplitude - Erniedrigung der Amplitude, z.B. als Rampenprotokoll, insbesondere linear oder exponentiell - oder über die Frequenz erfolgen.
Theoretischer Hintergrund
Die dielektrophoretische Kraft umgekehrt proportional zur fünften Potenz des Abstandes zwischen der Zelle Z und der Fakirelektrode 40s. Der Anziehungsprozess ist so beschaffen, dass zunächst durch Wahl geeigneter Frequenzen und hoher Amplituden eine relativ geringe Kraft auf die Zelle Z erzeugt wird. Nähert sich die Zelle Z der Elektrode 40s, so wird die Kraft schnell größer und die Zelle Z kann - wenn die ursprünglichen Feldparameter beibehalten werden - drastisch beschleunigt werden. Dies kann zu einer zu schnellen Bewegung der Zelle und zur Zerstörung der Zelle Z, z.B. durch Platzen, bei der Kontaktierung führen. Hingegen führen zu niedrige Anziehkräfte dazu, dass die Zelle Z nicht durch die Fakirelektrode 40s penetriert wird, weil der mechanische Widerstand der Membran M der Zelle dann nicht überwunden werden kann.
Automatisierter Einsatz der Fakirelektrode in Kombination mit Zellkäfigen
Der automatisierte Einsatz der Fakirelektrode in maschinellen Systemen (Sensorsysteme, High-Throughput-Systeme, etc.) soll dadurch erreicht werden, dass der Chip, der die Fakir-Elektroden trägt, in eine Mikrofluidikkammer eingesetzt werden kann. Diese Kammer soll durch geeignete Systeme, basierend auf dem Prinzip der elektrischen Zellkäfige, gewährleisten, dass Zellen automatisch und in Hinblick auf die einzelnen Fakir-Spitzen exakt gegenüber den Fakirelektroden positioniert werden können. Dies soll gewährleisten, dass das System mit automatisch applizierten Die- lektrophoresprotokollen Zellen - wie bereits beschrieben - kon- taktiert werden können. Das Mikrofluidiksystem soll auch die Möglichkeit des Lösungswechsels zulassen. Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand der beigefügten Figuren erläutert, welche exemplarisch Ausführungsformen der Erfindung zeigen:
Fig. 1 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung mit einer E- Iektrodenspitze.
Fig. 2 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht einer anderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen.
Fig. 3A, 3B sind schematische und geschnittene Seitenansicht einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung, einmal mit und einmal ohne kontaktierte biologische Zelle.
Fig. 4A - 4D sind schematische und geschnittene Seitenansichten verschiedener weiterer Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung.
Fig. 5A, 5B demonstrieren in Form einer schematischen und geschnittenen Seitenansicht bzw. einer schematischen Draufsicht auf eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung bestimmte Details der Erfindung.
Fig. 6 ist eine schematische Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen E- lektrodenanordnung .
Fig. 7A ist eine schematische und geschnittene Seiten- ansieht einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung . Fig. 7B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen E- lektrodenanordnung, welche erfindungsgemäß galvanisch erzeugt wurde.
Fig. 8 - 10 zeigen in Form mikroskopischer Aufnahmen bestimmte Anwendungsfälle, wie sie für die erfindungsgemäße Elektrodenanordnung in Frage kommen .
Fig. IIA - 12B zeigen schematisch weitere Anwendungen der vorliegenden Erfindung.
Nachfolgend werden strukturell und/oder funktionell ähnliche oder äquivalente Strukturen oder Verfahrensschritte mit denselben Bezugszeichen bezeichnet. Nicht in jedem Fall ihres Auftretens wird eine Detailbeschreibung der strukturellen Elemente oder Verfahrensschritte wiederholt.
Fig. 1 ist eine schematische und geschnittene Seitenansicht, welche eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 und deren Anwendung bei der Untersuchung einer Zelle Z beschreibt.
Die Ausführungsform der hier gezeigten erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 basiert auf einem Träger 20 oder Trägersubstrat 20 mit einer Oberfläche 20a und einer Unterseite 20b. In den Träger 20 sind ein Kontaktbereich 4OK zum Teil und der Anschlussbereich 4OA vollständig integriert ausgebildet, und zwar derart, dass die den Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 bildende Elektrodenspitze 40s mit ihrem dem Anschlussbereich 4OA zugewandten oder proximalen Ende 40p vollständig unterhalb der Oberfläche 20a des Trägers 20 und mit ihrem distalen Ende 4Od, welches vom Anschlussbereich 4OA abgewandt ist, strikt oberhalb der Oberfläche 40a des Trägers 40 ausgebildet ist. Der Anschlussbereich 40A wird von einer Basis 40b gebildet, die einen einstückigen Materialbereich - hier in Form einer planaren Platte - realisiert, dessen Oberseite 40ba mit dem proximalen Ende 40p der Elektrodenspitze 40s kontaktiert ist und deren Unterseite 40bb bundig mit der Unterseite 20b des Tragers 20 abschließt und somit eine externe Kontaktierung erlaubt.
Über den Kontaktbereich 40K mit der Elektrodenspitze 40s und deren distalem Ende 4Od erfolgt ein elektrischer Abgriff in das Innere I einer kontaktierten Zelle Z, indem das distale Ende 40d der Elektrodenspitze 40s durch die Zellmembran M hindurch in das Innere I der Zelle Z eindringt und so über die Leitfähigkeit der Elektrodenspitze 40s einen entsprechenden elektrischen Abgriff realisiert. Somit kann über den äußeren Messkreis 60 und die Anschlussleitungen 61 und 62 eine Strommessung oder Spannungsmessung erfolgen, so dass durch das transmembrane Protein P verscho- bene Ladungsträger als entsprechende Verschiebungsstrome I(t) als Funktion der Zeit gemessen werden können, wobei die Elektrodenspitze 40s als erste Elektrode der Elektrodenanordnung 10 und eine in der Oberflache 20a vorgesehene Referenzelektrode R als entsprechende zweite Messelektrode ausgebildet sind, wobei der Stromkreis durch das entsprechend vorzusehende wassrige Messmedium 30 geschlossen wird.
Dabei ist wichtig, dass über den elektrisch isolierenden Trager 20 and den mechanischen Kontaktstellen X zwischen Zelle Z und Trager 20 ein hoher elektrischer Abdichtwiderstand realisiert ist, um die Elektrodenanordnung 10 nicht kurz zu schließen.
Die Referenzelektrode R kann, wie eben gezeigt wurde, als Messelektrode dienen. Denkbar ist aber auch, dass diese Referenz- elektrode R zur dielektorphoretischen Annäherung und Kontaktierung der Zelle Z mit dem Kontaktbereich 40K genutzt wird, indem diese eine Gegenelektrode 51 einer Gegenelektrodenanordnung 50 bildet.
Alternativ oder zusätzlich kann die Gegenelektrodenanordnung 50 auch eine Gegenelektrode 51 aufweisen, welche der Elektrodenspit- ze 40s des Kontaktbereichs gegenübersteht, wie dies durch eine gestrichelte Darstellung angedeutet ist.
Die Ausführungsform der Fig. 1 wird mit nur einer einzigen Elekt- rodenspitze 40s im Kontaktbereich 4OK definiert.
Es sind jedoch auch Ausführungsformen denkbar, bei welchen der Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 über eine Mehrzahl, insbesondere gleichartiger oder gleich wirkender, Elektrodenspit- zen 40s definiert wird.
Die Anordnung der Fig. 2 zeigt eine solche Ausführungsform mit mehreren gleichartigen Elektrodenspitzen 40s im Kontaktbereich 4OK.
Die Ausführungsform der hier gezeigten erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 basiert auf einem Träger 20 oder Trägersubstrat 20 mit einer Oberfläche 20a und einer Unterseite 20b. In den Träger 20 sind wieder ein Kontaktbereich 4OK zum Teil und ein Anschlussbereich 4OA vollständig integriert ausgebildet, und zwar derart, dass die den Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 bildende Elektrodenspitze 40s mit ihrem dem Anschlussbereich 4OA zugewandten oder proximalen Ende 40p vollständig unterhalb der Oberfläche 20a des Trägers 20 und mit ihrem distalen Ende 40d, welches vom Anschlussbereich 4OA abgewandt orientiert ist, strikt oberhalb der Oberfläche 40a des Trägers 40 liegt. Der Anschlussbereich 4OA wird ebenfalls von einer so genannten Basis 40b gebildet, die einen einstückigen Materialbereich realisiert, dessen Oberseite 40ba mit dem proximalen Ende 40p der Elektroden- spitze 40s kontaktiert ist und deren Unterseite 40bb bündig mit der Unterseite 20b des Trägers 20 abschließt und somit wieder eine externe Kontaktierung erlaubt.
Über den Kontaktbereich 4OK, hier mit einer Mehrzahl Elektroden- spitzen 40s, und den distalen Enden 4Od der Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s erfolgt ein elektrischer Abgriff in das Innere I einer kontaktierten Zelle Z, indem die distalen Enden 4Od der Elektrodenspitzen 40s durch die Zellmembran M hindurch in das Innere I der Zelle Z eindringen und so über die Leitfähigkeit der Elektrodenspitzen 40s als Elektrode einen entsprechenden elektrischen Abgriff realisieren. Somit kann über den äußeren Messkreis 60 und die Anschlussleitungen 61 und 62 eine Strommessung oder Spannungsmessung erfolgen, so dass durch das transmembrane Protein P verschobene Ladungsträger als entsprechende Verschiebungsstrome I(t) als Funktion der Zeit gemessen werden können, wobei die Elektrodenspitze 40s als erste Elektrode der Elektrodenanord- nung 10 und eine in der Oberfläche 20a vorgesehene Referenzelektrode R als entsprechende zweite Messelektrode ausgebildet ist, wobei der Stromkreis durch das entsprechend vorzusehende wassrige Messmedium 30 geschlossen wird.
Die Referenzelektrode R kann wieder als Messelektrode dienen. Denkbar ist aber auch wieder, dass diese Referenzelektrode R zur dielektorphoretischen Annäherung und Kontaktierung der Zelle Z mit dem Kontaktbereich 4OK genutzt wird, indem diese eine Gegenelektrode 51 einer Gegenelektrodenanordnung 50 bildet. Alternativ oder zusatzlich kann die Gegenelektrodenanordnung 50 auch eine Gegenelektrode 51 aufweisen, welche den Elektrodenspitzen 40s des Kontaktbereichs gegenübersteht, wie dies durch eine gestrichelte Darstellung angedeutet ist.
Die in den Fig. 3A und 3B dargestellte Ausfuhrungsform der erfin- dungsgemaßen Elektrodenanordnung 10 unterscheidet sich nur dadurch von der Ausfuhrungsform, welche in Fig. 2 dargestellt ist, dass die Oberflache 20a des Tragers 20 nicht strikt planar verlauft, sondern im Bereich der Elektrodenspitzen 40s eine konkave Vertiefung 22 bilden, insbesondere in Form einer Mulde, so dass, wie das im Übergang vom Zustand der Fig. 3A zum Zustand der Fig. 3B deutlich wird, eine sich annähernde Zelle Z besser an die Oberflache 20a im Bereich der Ausnehmung 22 an die Oberflache anschmiegen kann, so dass bessere Abdichtwiderstande an den Stel- len X gegenüber dem vorgesehenen Messmedium 30 zur Vermeidung von Kurzschlüssen möglich sind. Die Fig. 4A bis 4D zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht verschiedene Ausfuhrungsformen der erfindungsgema- ßen Elektrodenanordnung 10.
Diese Ausfuhrungsformen sind jeweils ohne einen Trager 20 oder Tragersubstrat 20 dargestellt und zeigen ausschließlich den Kontaktbereich 4OK in Form einer oder mehrerer Elektrodenspitzen 40s und den Anschlussbereich 4OA jeweils in Form einer einstuckig ausgebildeten Basis 40b nach Art einer planaren Platte mit einer Oberseite 40ba und einer Unterseite 4 Obb .
Bei der Ausfuhrungsform der Fig. 4A ist eine einzelne Elektrodenspitze 40s vorgesehen, die den Kontaktbereich 40K der Elektrodenanordnung 10 definiert und die mit ihrem proximalen Ende 40p an der Oberseite 40ba angebracht und kontaktiert ist. Die Elektrodenspitze 40s und die Basis 40b als Anschlussbereich 40A sind einstuckig ausgebildet.
Im Gegensatz dazu ist in der Fig. 4B dargestellt, dass eine ein- zelne und separate Elektrodenspitze 40s, die den Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 bilden soll, auch in einem nachgeschalteten Vorgang an der Oberseite 40ba der Basis 40b angebracht werden kann, so dass sich eine einteilige Struktur ergibt, wie dies in Fig. 4B dargestellt ist.
Die Fig. 4C zeigt ebenfalls eine einstuckige Ausgestaltungsform der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung 10, diesmal aber mit einer Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, die jeweils mit ihren proximalen Enden auf der Oberseite 40ba des Tragers 40b ausgebildet sind.
Im Gegensatz dazu ist in der Fig. 4D wieder eine Ausfuhrungs form der erfindungsgemaßen Elektrodenanordnung 10 gezeigt, bei welcher keine Einstuckigkeit vorliegt zwischen den Elektrodenspitzen 40s und der Basis 40b. Vielmehr sind die Elektrodenspitzen 40s, welche den Kontaktbereich 4OK der Elektrodenanordnung 10 der Fig. 4D bilden sollen, auf der Oberseite 40ba in einem nachgeschalteten Prozess aufgebracht, elektrisch und mechanisch kontaktiert.
Die Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10, die in den Fig. 5A und 5B in Form einer schematischen und geschnittenen Seitenansicht bzw. in Form einer schematischen Draufsicht dargestellt ist, zeigt eine Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, die in einer Reihe auf der Basis 40b in Form einer planaren Platte angeordnet sind, und zwar in nicht einstückiger Art und Weise. Es sind auch hier noch einmal die distalen Enden 40d und die proximalen Enden 40p der Elektrodenspitzen 40s dargestellt, die von der Oberseite 40ba der Basis 40b abgewandt bzw. zugewandt und mit dieser in Kontakt stehend ausgebildet sind. Die in den Fig. 5A und 5B gezeigten Elektrodenspitzen 40s weisen eine Länge Ls auf und sind paarweise zueinander äquidistant beabstandet mit gleichen Abständen dd, ds . Auch ist ihre geometrische Ausgestaltung gleich. Das bedeutet, dass sie den gleichen quadratischen Querschnitt mit einer Kantenlänge Dp und einem entsprechenden Durchmesser Dp im Bereich des distalen Endes 40p besitzen. Die Elektrodenspitzen 40s sind gleich lang und erstrecken sich streng monoton verjüngend bis zu ihrer Spitze hin.
Fig. 6 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung, bei welcher eine Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s, welche den Kontaktbereich 40K der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 bilden, in Form einer quadratischen Matrix angeordnet sind mit einem gleichen Abstand dd, ds voneinander sowie mit einem identischen Durchmesser Dp, welcher hier den Durchmesser des mit kreisförmigem Querschnitt versehenen proximalen Endes 40p der jeweiligen Elektrodenspitzen 40s beschreibt.
Die Fig. 7A zeigte eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung, bei welcher eine Art Rasen einer Mehrzahl Elektrodenspitzen 40s auf der Basis 40b der Elektrodenanordnung 10 vorgesehen ist. Die Fig. 7B ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme einer Ausgestaltungsform der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10, welche erfindungsgemäß galvanisch erzeugt wurde. Hier ist auch gezeigt, dass, im Gegensatz zu den bisher gezeigten Ausführungs- formen der erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10, die einzelnen Elektrodenspitzen 40s nicht die gleiche Länge aufweisen, und unterschiedliche Orientierungen und Richtungen besitzen.
Die Fig. 8 bis 10 zeigen mikroskopische Aufnahmen entsprechender Anwendungen einer erfindungsgemäßen Elektrodenanordnung 10 mit einer einzelnen Elektrodenspitze 40s, die mit einer Testzelle Z in Kontakt steht.
Bezugszeichenliste
10 erfindungsgemäße Elektrodenanordnung
20 Träger, Trägersubstrat 20a Oberfläche, Oberflächenbereich, Oberseite
20b Unterseite
30 Messmedium
4OA Anschlussbereich
40b Basis, Basisbereich 40ba Oberfläche, Oberflächenbereich, Oberseite
40bb Unterseite
4Od distales Ende
4OK Kontaktbereich
40p proximales Ende 40s Elektrodenspitze
50 Gegenelektrodenanordnung
51 Gegenelektrode
60 Messkreis
61 Messleitung 62 Messleitung
Dd Durchmesser der Elektrodenspitze am distalen
Ende 40d dd Abstand der Spitzen oder distalen Enden 4Od der Elektrodenspitzen
Dp Durchmesser der Elektrodenspitze am proximalen
Ende 40p dp Abstand der proximalen Enden 4Od der Elektrodenspitzen ds Abstand der Spitzen der Elektrodenspitzen
Dz Durchmesser der Zelle oder Spezies
I Innenraum der Zelle oder Spezies
Ks Krümmungsradius der Spitzen der Elektrodenspitzen Ls Länge der Elektrodenspitze
M Zellmembran
P Transmembranprotein Z biologische Zelle, Spezies αs Öffnungswinkel der Spitzen der Elektrodenspitzen

Claims

Patentanspiüche
1. Elektrodenanordnung (10) für elektrophysiologische Untersuchungen biologischer Zellen und dergleichen - welche mit einem Kontaktbereich (40K) ausgebildet ist zum elektrischen Kontaktieren der Elektrodenanordnung (10) mit mindestens einer biologischen Spezies (Z) oder Zelle (Z) oder dergleichen und welche mit einem Anschlussbereich (40A) ausgebildet ist zum externen elektrischen Anschließen der Elektrodenanordnung (10) , wobei der Kontaktbereich (40K) mit einer Elektrodenspitze (40s) oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) als E- lektroden ausgebildet ist, die sich vom Anschlussbereich (40A) der Elektrodenanordnung (10) her erstrecken, und wobei die Elektrodenspitzen (40s) jeweils mit einer geometrischen Gestalt ausgebildet sind, die im Betrieb ein ansonsten zerstörungsfreies Eindringen in eine biologische Spezies (Z) oder Zelle (Z) oder dergleichen über deren Membran (M) in deren Inneres (I) erlaubt.
2. Elektrodenanordnung nach Anspruch 1, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich jeweils vom Anschlussbereich (40A) her monoton oder streng monoton verjüngend erstreckend ausgebildet sind oder bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich jeweils vom Anschlussbereich (40a) her zylindrisch oder quaderförmig verlaufend und am vom An- Schlussbereich (40a) abgelegenen und distalen Ende (4Od) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einer sich monoton oder streng monoton verjüngenden Spitze ausgebildet sind.
3. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einem Querschnitt ausgebildet sind, der rund, kreisförmig, elliptisch, rechteckig oder quadratisch ist.
4. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einem dem Anschlussbereich (40A) zugewandten oder den Anschlussbereich (40A) bildenden ersten und proximalen Ende (40p) ausgebildet sind.
5. Elektrodenanordnung nach Anspruch 4, bei welcher der Durchmesser (Dp) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am proximalen Ende (40p) im Bereich von etwa 50 nm bis etwa 5000 nm ausgebildet ist.
6. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 4 oder 5, bei welcher der Durchmesser (Dp) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am proximalen Ende (40p) unter- halb von etwa 1/10 des Durchmessers (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) liegt.
7. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektroden- spitzen (40s) mit einem vom Anschlussbereich (40A) abgewandten zweiten und distalen Ende (40d) ausgebildet sind.
8. Elektrodenanordnung nach Anspruch 7, bei welcher der Durchmesser (Dd) der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am distalen Ende (40d) im Bereich von 1/10 des Durchmessers (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) ausgebildet sind.
9. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 7 oder 8, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) am distalen Ende (4Od) mit einem Krümmungsradius (Ks) im Bereich von etwa 5 nm bis etwa 50 nm ausgebildet sind.
10. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 7 bis 9, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) im Bereich der distalen Enden (4Od) mit einem spitzen Winkel (αs) im Bereich von etwa 10° bis etwa 50° als öff- nungswinkel der jeweiligen Spitze ausgebildet sind.
11. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) vom Anschlussbereich (40a) her eine Länge (Ls) im Bereich von etwa 4/5 dem Durchmesser (Dz) einer zu kontaktierenden Spezies (Z) aufweisen.
12. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher der Kontaktbereich (40K) mit einer Mehrzahl Elektro- denspitzen (40s) ausgebildet ist.
13. Elektrodenanordnung nach Anspruch 12, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) geometrisch gleich und/oder gleich wirkend ausgebildet sind.
14. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher der Anschlussbereich (40A) als materiell zusammenhängende Basis (40b) mit einer Oberfläche (40ba) und einer Unterseite (40bb) ausgebildet ist.
15. Elektrodenanordnung nach Anspruch 14, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich von der Oberfläche (40ba) der Basis (40b) aus erstreckend ausgebildet sind.
16. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 oder 15, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) sich von der Oberfläche (40ba) der Basis (40b) aus senkrecht oder im Wesentlichen senkrecht erstreckend ausgebildet sind, zumindest lokal.
17. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 16, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) zueinander gleich orientiert und parallel oder im Wesentlichen parallel ausgerichtet ausgebildet sind, zumindest lokal.
18. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 17, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) in Form einer Reihe Mat- rix oder senkrechten Matrix auf der Oberseite (40ba) der Basis (40b) angeordnet ausgebildet sind.
19. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 12 bis 17, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) mit gleichen paarweisen Abständen (dd, dp) direkt benachbarter Elektrodenspitzen (40s) in den Hauptachsenrichtungen ihrer Anordnung angeordnet ausgebildet sind.
20. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 19, bei welcher die Oberfläche (40ba) der Basis (40b) planar ausgebildet ist, zumindest lokal.
21. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
14 bis 20, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) miteinander einstückig als integraler materieller Bereich ausgebildet sind.
22. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche
14 bis 20, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitzen (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen einteilig miteinander verbunden ausgebildet sind.
23. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 14 bis 22, bei welcher die Basis (40b) und die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) aus demselben, insbesondere elektrisch leitfähigen Material ausgebildet sind.
24. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) als galvanisch gewachsene Strukturen ausgebildet sind .
25. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher ein Träger (20) mit einer Oberfläche (20a) und einer Unterseite (20b) aus einem elektrisch isolierenden Material ausgebildet ist.
26. Elektrodenanordnung nach Anspruch 25, bei welcher die proximalen Enden (40p) der Elektrodenspitzen (40s) und gegebenenfalls die Basis (40b) im Träger (20) eingebettet und echt unterhalb der Oberfläche (20a) des Trägers (20) und die distalen Enden (4Od) der Elektrodenspitzen (40s) echt oberhalb der Oberfläche (20a) des Trägers (20) ausgebildet sind.
27. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 oder 26, bei welcher die Oberfläche (20a) des Trägers (20) vollständig oder lokal konform und insbesondere parallel zur Oberfläche (40ba) der Basis (40b) verlaufend ausgebildet ist.
28. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 bis 27, bei welcher die Oberfläche (20a) des Trägers (20) vollständig oder lokal planar, konvex und/oder konkav ausgebildet ist.
29. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 bis 28, bei welcher die Oberfläche (20a) des Trägers (20) planar oder im Wesentlichen planar und mit konkaven Vertiefungen (22) im Bereich der proximalen Enden (40p) der Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet ist.
30. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 25 oder 29, bei welcher die Unterseite (40bb) der Basis (40b) an der Unterseite (20b) des Trägers (20) zumindest zum Teil vom Trägermaterial unbedeckt ausgebildet ist, um einen externen elektrischen Abgriff zu ermöglichen.
31. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher elektrisch isoliert zum Kontaktbereich (40K) und zum Anschlussbereich (40A) eine Gegenelektrodenanordnung (50) und/oder eine Referenzelektrodenanordnung (R) ausgebildet sind.
32. Elektrodenanordnung nach Anspruch 31, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) mit einer oder einer Mehrzahl Gegenelektroden (51) ausgebildet ist.
33. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 oder 32, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon und/oder die Referenzelektrodenanordnung (R) auf der Oberfläche (20a) des Trägers (20) ausgebildet sind.
34. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 33, bei welcher die räumliche Anordnung und/oder die Geometrie der Gegenelektrodenanordnung (50) zur Erzeugung eines gesteuert inhomogenen elektrischen und/oder elektromagnetischen Feldes ausge- bildet sind.
35. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 34, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon der Elektrodenspitze (40s) oder der Mehrzahl Elektroden- spitzen (40s) gegenüberliegend ausgebildet sind.
36. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 35, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon in einem Abstand im Bereich von etwa 15 μm bis etwa 1 cm von der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet sind.
37. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 36, bei welcher die Gegenelektrodenanordnung (50) oder ein Teil (51) davon nach einem der vorangehenden Ansprüche ausgebildet ist, um insbesondere eine dielektrische Kontaktierung biologischer Zellen in einer Art von Sandwichsystem zu ermöglichen, bei der die zu untersuchende biologische Zelle nach elektrischer Kontaktierung und Fusion eine Uberbrückung zwischen den beiden Elektroden ermöglicht.
38. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 37, bei welcher eine Gegenelektrode (51) der Gegenelektrodenanordnung (50) mit einer flächenhaften Geometrie ausgebildet ist.
39. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 31 bis 38, bei welcher eine Gegenelektrode (51) der Gegenelektrodenanordnung (50) eine Größe und/oder eine Fläche aufweist, die groß sind im Verhältnis zur Größe/Fläche der Elektrodenspitzen (40s), insbe- sondere in einem Verhältnis im Bereich von etwa 5:1 oder im Bereich von etwa 100:1 oder darüber, vorzugsweise im Bereich von etwa 10000:1.
40. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektroden durch eine chemische Reaktion derart modifiziert sind, dass eine elektrophysiologische Untersuchung von biologischen Zellen ermöglicht, erleichtert oder sensi- tiver ist, wobei die chemische Reaktion insbesondere hauptsachlich eine elektrochemische Oxidation der vorgenannten Metalle mit einem Halogen ist, wobei die chemische Reaktion insbesondere zeitlich vor oder nach der Kontaktierung der biologischen Zelle erfolgt, wobei im letzteren Fall das Halogen aus dem Zytosol der Zelle gewonnen und/oder geliefert wird.
41. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenspitzen (40s) und/oder die Basis (40b) aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe gebildet sind, die besteht aus Silber, Gold, Platin, Wolfram, Legierungen, Legierungen dieser Metalle, Platin-Iridium- Legierungen und Gold-Iridium-Legierungen.
42. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher eine Mehrzahl Basen (40b) mit jeweils einer oder einer Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet ist.
43. Elektrodenanordnung nach Anspruch 42, bei welcher die Basen (40b) einzeln oder gruppenweise voneinander elektrisch isoliert und/oder raumlich getrennt ausgebildet sind.
44. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher als Trager (20) ein Materialbereich mit oder aus einem Material oder einer Kombination von Materialien aus der Gruppe ausgebildet ist, die besteht aus Glasern, glasahnlichen Materialien, organischen Polymeren und Fotolacken.
45. Elektrodenanordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher die Elektrodenanordnung mit einer Druckmesssonde kombiniert ist, wobei es sich dabei insbesondere um eine externe, außen an einem Messobjekt, oder eine invasive, sich innerhalb eines Messobjektes befindliche Druckmesssonde handelt.
46. Verfahren zum Herstellen einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 45, bei welchem zumindest die Elektrodenspitze (40s) oder die Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) durch einen Prozess oder eine Kombination von Prozessen aus der Gruppe ausgebildet werden, die um- fasst galvanisches Abscheiden, galvanisches Wachsen und galvanisches Aufwachsen.
47. Verfahren nach Anspruch 46, bei welchem eine Grundelektrode, z.B. in Form einer Basis (40b), zugrunde gelegt wird und bei welchem eine einzelne Elektrodenspitze (40s) auf der Grundelektrode ausgebildet wird.
48. Verfahren nach Anspruch 46, - bei welchem eine Grundelektrode, z.B. in Form einer Basis (40b), zugrunde gelegt wird und bei welcher auf dieser Grundelektrode eine Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) ausgebildet wird.
49. Verfahren nach Anspruch 48, bei welchem eine Mehrzahl Grundelektroden, z.B. in Form einer entsprechenden Mehrzahl Basen (40b), zugrunde gelegt wird und bei welchem auf jeder der Grundelektroden eine einzelne Elektrodenspitze (40s) oder eine Mehrzahl Elektrodenspitzen
(40s) ausgebildet wird, wobei insbesondere die Grundelektroden oder Basen (40b) paarweise oder gruppenweise voneinander elektrisch isoliert bleiben .
50. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 46 bis 49, bei welchem die Grundelektrode oder Grundelektroden mit den ausgebildeten Elektrodenspitzen (40s) mit einem elektrisch isolierenden Trägerbereich (20) bedeckt werden und bei welchem dabei die Elektrodenspitzen (40s) mit ihren distalen Enden (4Od) sich oberhalb der Oberfläche (20a) des elektrisch isolierenden Trägers (20) erstrecken.
51. Verfahren nach Anspruch 50, bei welchem nach dem Bedecken mit dem elektrisch isolierenden Träger (20) zumindest die distalen Enden (4Od) der Elektrodenspitzen (40s) einem Reinigungs- oder Abisolierungsprozess unterzogen werden.
52. Verfahren nach Anspruch 51, bei welchem zur Abisolierung der Elektrodenspitzen (40s) und insbesondere der der distalen Enden (4Od) der Elektrodenspitzen (40s) die Elektrodenspitzen (40s) mit elektrischen Pulsen, insbesondere im Mikrosekundenbereich, derart beaufschlagt werden, dass im Verhältnis zur Umgebung elektrische Durchbrüche erzeugt wer- den.
53. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 46 bis 52, bei welchem ein kovalent an die Grundelektrode oder an die Basis
(40b) bindendes und elektrisch isolierendes Material verwendet wird.
54. Verfahren nach Anspruch 53, bei welchem ein bindendes und elektrisch isolierendes Material aus der Gruppe verwendet wird, die besteht aus kovalent bindenden Lipiden, kovalent an Metalle bindenden Lipiden und isolierenden Kunststoffen .
55. Verfahren nach Anspruch 46, bei welchem eine Grundelektrode zugrunde gelegt wird, ins- besondere in Form einer Basis (40b), bei welcher auf der Oberfläche (40ba) der Grundelektrode oder Basis (40b) eine strukturierte Schablone derart ausge- bildet wird, dass durch Ausnehmungen in der Schablone Bereiche auf der Oberfläche der Grundelektrode oder der Basis
(40b) an wohldefinierten Stellen freibleiben, und bei welchem dann der galvanische Prozess derart durchge- führt wird, dass ausschließlich im Bereich der Ausnehmungen der Schablonen auf der Grundelektrode die Elektrodenspitzen
(40s) oder Vorformen davon ausgebildet werden.
56. Verfahren nach Anspruch 55, bei welchem durch die Dicke der Schablone und die Tiefe der Ausnehmungen von der Oberfläche zur Schablone zur Oberfläche der zugrunde gelegten Elektrode oder der Basis (40b) die Länge der Elektrodenspitzen (40s) oder der Vorformen davon definiert wird.
57. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 55 oder 56, bei welchem durch die lichte Weite oder den Durchmesser der Ausnehmungen in der Schablone die Stärke der Elektrodenspitzen (40s) oder der Vorformen davon definiert wird.
58. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 55 bis 57, bei welchem eine schichtartig aufgebaute Schablone verwendet wird.
59. Verfahren nach Anspruch 58, bei welchem eine Schablone mit zwei Schichten verwendet wird, bei welcher die der Grundelektrode oder der Basis (40b) zugewandte Schicht elektrisch isolierende Eigenschaften be- sitzt und in wohldefinierter Weise stabil und inert gegen bestimmte chemische und/oder physikalische Einwirkungen ausgebildet wird und bei welchem die zweite Schicht oder darauf folgende Schichten durch vergleichsweise milde chemische und/oder physika- lische Einwirkungen und insbesondere durch milde chemische Reagentien entfernbar ausgebildet wird.
60. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 55 bis 54, bei welchem das Verhältnis der Schichtstarken der untersten Schicht der Schablone zu der gesamten Schichtstarke der nachfolgenden und ablösbaren Schichten so gewählt wird, dass eine ge- wünschte Lange für die aus dem isolierenden Trager (20) herausragenden Bereiche der Elektrodenspitzen (40s) erreichbar ist.
61. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 55 bis 60, bei welchem auf der Grundelektrode oder der Basis (40b) zunächst die mehrschichtige Schablone ausgebildet wird, bei welchem dann der galvanische Prozess durchgeführt wird, bei welchem dann nach Abschluss des galvanischen Prozesses bis auf die unterste und direkt auf der Grundelektrode oder der Basis (40b) aufliegenden Schicht samtliche Schichten der Schablone entfernt werden, und bei welchem dann die unterste und auf der Grundelektrode oder der Basis (40b) direkt aufliegende und verbliebene Schicht der Schablone als isolierender Trager (20) für die Elektrodenanordnung (10) verwendet wird.
62. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 46 bis 61, bei welchem die distalen Enden (4Od) der Elektrodenspitzen (40s) durch ein elektrochemisches Atzverfahren nachbehandelt werden, um die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) an ihren distalen Enden (4Od) zu scharfen, insbesondere in Kombination mit einem Maskierungsprozess .
63. Verwendung einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 45 zur elektrophysiologischen Untersuchung und/oder Manipulation einer Spezies (Z) aus der Gruppe, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micel- laren Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies (Z) und Verbanden dieser Spezies (Z).
64. Verwendung einer Elektrodenanordnung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 45 zur Mikroinjektion einer Substanz in eine Spezies (Z) aus der Gruppe, die gebildet wird von biologischen Zellen, Liposomen, Vesikeln, micellären Strukturen, Bakterien, Viren, Fusionszellen, Organellen, genetischen, molekularbiologischen und/oder biochemischen Derivaten davon, Bestandteilen dieser Spezies (Z) und Verbänden dieser Spezies (Z).
65. Verwendung nach Anspruch 64, bei welcher vor der Mikroinjektion die Spitze der Elektrodenspitze (40s) oder die Spitzen der Elektrodenspitzen (40s) mit der zu injizierenden Substanz beaufschlagt werden.
66. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 63 bis 65, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in einer Mikrostruktur eingebettet vorgesehen wird.
67. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 63 bis 66, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in einer Lap-on-the- Chip-Struktur vorgesehen wird.
68. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 60 bis 64, bei welcher die Elektrodenanordnung (10) in oder für einen Assay vorgesehen wird, insbesondere für High-Throughput-Anwendungen .
69. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 60 bis 65, bei welcher bei ruhender Elektrodenanordnung (10) die zu untersuchende und/oder zu behandelnde Spezies (Z) oder eine Mehrzahl davon auf die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) zu geführt werden.
70 . Verwendung nach Anspruch 66 , bei welcher das Bewegen der zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies (Z) auf die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) zu durch Kraftausubung auf die entsprechende Spezies (Z) bewirkt wird.
71. Verwendung nach Anspruch 67, bei welcher die Kraftausubung bewirkt wird durch eine die- lektrophoretische Kraft.
72. Verwendung nach Anspruch 68, bei welcher die dielektrophoretische Kraft erzeugt wird durch das Erzeugen eines - insbesondere hochfrequenten - inhomogenen elektrischen Wechselfeldes zwischen der Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) und der vorgesehenen Gegenelekt- rodenanordnung (50) mit den Gegenelektroden (51) .
73. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 71 oder 72, bei welchem die Elektrodenspitze (40s) oder Mehrzahl Elektrodenspitzen (40s) mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 100 MHz, vorzugsweise von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz, weiter bevorzugt von etwa 100 Hz bzw. etwa 40 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen.
74. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 71 bis
73, bei welcher ein elektrischer Zellkafig zur Mikropositionierung der Spezies (Z) oder Zelle (Z) wahrend der dielektrophoretischen
Annäherung verwendet wird.
75. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 63 bis 74, bei welcher zur Erleichterung der Zellkontaktierung die zu kon- taktierende Spezies (Z) oder Zelle (Z) durch isoosmolare Losungen prall aufgefüllt wird.
76. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche 63 bis 75, bei welcher eine elektrische Isolation nicht mit Zellen kontak- tierter, freier Elektroden derart vorgenommen wird, dass eine Lösung von Liposomen definierter Größe, wobei der minimale Durchmesser 100 nm und der maximale Durchmesser 5 μm beträgt, über die Elektrodenfläche gespült und durch Anlegen eines Wechselstroms auf die besagten freien Elektrodenspitzen kontaktiert wird.
77. Verfahren zum elektrischen Kontaktieren einer zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies (Z), insbesondere einer biologischen Zelle oder dergleichen, mit einer Elektrodenspitze (40s) einer Elektrodenanordnung (10), bei welchem eine Patchpipette oder Patchelektrode als E- lektrodenspitze (40s) verwendet wird oder die Elektrodenspitze (40s) aufweist und - bei welchem die Elektrodenanordnung (10) derart gesteuert mit einem elektrischen Feld beaufschlagt wird, dass ein dielektrophoretische Kraft auf die zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies (Z) derart ausgeübt wird, dass die zu untersuchenden und/oder zu behandelnden Spezies (Z) an die Elektrodenspitze (40s) angenähert und mit dieser kontaktiert wird.
78. Verfahren nach Anspruch 77, bei welchem die Elektrodenspitze (40s) oder eine Mehrzahl Elekt- rodenspitzen (40s) mit einer Wechselspannung im Bereich von etwa 10 mV bis etwa 300 V und/oder im Frequenzbereich von etwa 100 Hz bzw. etwa 100 MHz, vorzugsweise von etwa 100 Hz bzw. etwa 60 MHz, weiter bevorzugt von etwa 100 Hz bzw. etwa 40 MHz beaufschlagt werden, um die dielektrophoretische Kraft zu erzeugen.
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