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TECHNISCHER
BEREICH
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Substrat und ein Verfahren zum
Ermitteln und/oder Überwachen von
elektrophysiologischen Eigenschaften von Ionenkanälen von
Strukturen, welche Ionenkanäle
enthalten, typischerweise von Strukturen, die eine Lipid-Membran
enthalten, wie z.B. Zellen durch Herstellen einer elektrophysiologischen
Messkonfiguration, bei der eine Zellmembran eine Dichtung mit hohem
Widerstand um eine Messelektrode herum bildet, wodurch es möglich gemacht
wird, einen Stromfluss durch die Zellmembran zu ermitteln bzw. zu
messen und zu überwachen.
Das Substrat ist typischerweise Teil einer Vorrichtung zum Untersuchen
von elektrischen Ereignissen in Zellmembranen, wie z.B. eine Vorrichtung
zum Ausführen
eines Patch-Clamp-Verfahrens, wie es verwendet wird, um Ionentransferkanäle in biologischen
Membranen zu studieren. Genauer gesagt betrifft die Erfindung ein
Substrat für
eine solche Patch-Clamp-Vorrichtung mit einem hohen Durchsatz und
unter Verwendung nur kleiner Mengen von Testverbindungen und nur
kleiner Mengen von flüssigem
Träger,
bei dem es möglich
ist, viele Tests in einem kurzen Zeitraum dadurch durchzuführen, dass
parallele Tests an einer Reihe von Zellen gleichzeitig und voneinander
unabhängig
ausgeführt
werden.
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STAND DER
TECHNIK
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Die
allgemeine Idee einen Patch (Flecken) einer Membran elektrisch zu
isolieren und die Ionenkanäle in
diesem Patch unter Spannungs-Clamp-Bedingungen zu untersuchen, wurde
von Neher, Sakmann und Steinback in dem Artikel „The Extracellular Patch Clamp,
A Method For Resolving Currents Through Individual Open Channels
In Biological Membranes",
Pflueger Arch. 375; 219–278,
1978 umrissen. Sie fanden, dass sie dadurch, dass sie eine Pipette,
die Acetylcholin (ACh) enthielt, gegen die Oberfläche einer
Muskelzellen-Membran pressten, diskrete Sprünge im elektrischen Strom feststellen
konnten, die dem Öffnen
und Schließen
von durch ACh aktivierten Ionenkanälen zugeordnet werden konnten.
Sie waren bei ihrer Arbeit jedoch durch die Tatsache eingeschränkt, dass
der Widerstand der Dichtung zwischen dem Glas der Pipette und der
Membran (10–50
MΩ) sehr
klein im Vergleich zum Widerstand des Kanals (10GΩ) war. Das
elektrische Rauschen, das sich aus einer solchen Dichtung ergibt,
ist umgekehrt proportional zum Widerstand und war ausreichend groß, um die
Ströme
zu verdecken, die durch Ionenkanäle
fließen,
deren Leitfähigkeit
kleiner ist als die des ACh-Kanals. Es verhinderte auch aufgrund
der großen
Ströme
durch die Dichtung, die sich ergeben hätten, das Clampen der Spannung
in der Pipette auf Werfe, die von dem des Bades unterschiedlich
waren.
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Es
wurde dann erkannt, dass durch Feuerpolieren von Glaspipetten und
durch Anlegen einer Saugwirkung an das Innere der Pipette eine Dichtung
mit sehr hohem Widerstand (1–100
GΩ) mit
der Oberfläche der
Zelle erzielt werden konnte. Diese Giga-Dichtung verminderte das
Rauschen um eine Größenordnung
auf Pegel, bei denen die meisten Kanäle von biologischem Interesse
untersucht werden können,
und erweiterte den Spannungsbereich in starkem Masse, über den
hinweg diese Studien durchgeführt
werden konnten. Diese verbesserte Dichtung wird als „Giga"-Dichtung bezeichnet,
und die Pipette wird als „Patch"-Pipette bezeichnet. Eine
detailliertere Beschreibung der Giga-Dichtung findet sich im Artikel von
O.P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann & F.J. Sigworth mit dem Titel „Improved
patch-clamp techniques for high resolution current recordings from
cells and cell-free membrane patches", Pflügers Arch. 391, 85–100, 1981.
Für ihre
Arbeit bei der Entwicklung des Patch-Clamp-Verfahrens erhielten
Neher und Sakmann 1991 den Nobelpreis für Physiologie und Medizin.
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Ionenkanäle sind
transmembrane Proteine, die den Transport von anorganischen Ionen über die
Zellmembranen hinweg katalysieren. Die Ionenkanäle nehmen an den verschiedensten
Vorgängen
teil, wie z.B. der Erzeugung und zeitlichen Steuerung von Aktionspotentialen,
der synaptischen Übertragung,
der Sekretion von Hormonen, der Kontraktion von Muskeln usw. Viele
Medikamente üben
ihre speziellen Wirkungen durch die Modulation von Ionenkanälen aus.
Beispiele sind antiepileptische Verbindungen, wie z.B. Phenytoin
und Lamotrigin, welche spannungsabhängige Na+-Kanäle im Gehirn
blockieren, antihypertensive Medikamente, wie Nifedipin und Diltiazem,
welche spannungsabhängige
Ca2+-Kanäle
in glatten Muskelzellen blockieren, und Stimulatoren für die Freisetzung
von Insulin, wie z.B. Glibenclamid und Tolbutamid, die einen ATP-gesteuerten K+-Kanal in der Bauchspeicheldrüse blockieren.
Zusätzlich
zur chemisch induzierten Modulation der Ionenkanal-Aktivität hat das
Patch-Clamp-Verfahren Wissenschaftler in die Lage versetzt, Manipulationen
mit spannungsabhängigen
Kanälen
durchzuführen.
Diese Verfahren umfassen das Einstellen der Polarität der Elektrode
in der Patch-Pipette und die Änderung
der Salzlösungs-Zusammensetzung,
um die freien Ionenpegel in der Badlösung zu moderieren.
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Das
Patch-Clamp-Verfahren stellt eine wesentliche Entwicklung in der
Biologie und Medizin dar, da dieses Verfahren die Messung des Ionenstroms
durch einzelne Ionenkanal-Proteine
ermöglicht
und auch die Untersuchung der Reaktionen der einzelnen Ionenkanäle auf Medikamente.
Kurz gesagt, wird bei einem standardmäßigen Patch-Clamp-Verfahren
eine dünne
Glaspipette (mit einem Durchmesser von ungefähr 0,5 bis 2 μm) verwendet.
Die Spitze dieser Patch-Pipette wird gegen die Oberfläche der
Zellmembran gedrückt.
Die Pipettenspitze dichtet dicht mit der Zelle ab und isoliert einige
wenige Ionenkanal-Proteine in einem winzigen Patch der Membran.
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Die
Aktivität
dieser Kanäle
kann individuell gemessen werden (Einzelkanal-Aufzeichnung); alternativ kann
der Patch aufgerissen werden, wodurch Messungen der Kanalaktivität der gesamten
Zellmembran ermöglicht
werden (Gesamtzellen-Aufzeichnung). Es kann ein Zugang mit hoher
Leitfähigkeit
zum Inneren der Zelle zur Durchführung
von Messungen beispielsweise dadurch erzielt werden, dass die Membran
dadurch zerrissen wird, dass in der Pipette ein unter dem Atmosphärendruck
liegender Druck angelegt wird.
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Sowohl
während
der Einkanal-Aufzeichnung als auch der Gesamtzellen-Aufzeichnung
kann die Aktivität
einzelner Kanal-Unterarten dadurch charakterisiert werden, dass
eine „festgeklemmte
Spannung" über die
Membran angelegt wird. Bei dem Spannungs-Clamp-Verfahren wird der Membranstrom
bei einem konstanten Membranpotential aufgezeichnet. Oder – genauer
gesagt – der
Verstärker
liefert genau den Strom, der erforderlich ist, um das Membranpotential
auf einem Pegel zu halten, der durch den Experimentator festgelegt wurde.
Somit können
Ströme,
die sich aus dem Öffnen
und Schließen
von Ionenkanälen
ergeben, die Membran nicht wieder aufladen.
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1 zeigt
ein vereinfachtes Diagramm des grundlegenden Betriebs eines dem
Stand der Technik entsprechenden Standard-Spannungs-Clamp-Verstärkers, wie
z.B. des EPC-9 Verstärkers von
HEKA Elektronik. Eine Elektrode 6 innerhalb einer Pipette 4 ist
mit dem negativen Anschluss eines Rückkopplungsverstärkers verbunden,
während
die Klemmspannung (die auf eine geerdete Badelektrode bezogen ist)
mit einem positiven Anschluss (von Stim. In.) verbunden und als
Spannungsüberwachungsausgangssignal
verfügbar
gemacht ist. Da davon ausgegangen wird, dass die gemessene Pipettenspannung
und die Klemmspannung identisch sind, wird an der Pipettenelektrode
beständig
ein Korrekturpotential zugeführt,
während
ein Strom durch den großen
Rückkopplungswiderstand
erzwungen wird. Nach der Inversion wird der Strom als Analogspannung
am Strom-Monitor-Ausgang verfügbar
gemacht.
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Die
Zeitauflösung
und die Spannungssteuerung bzw. Regelung bei solchen Experimenten
sind beeindruckend, häufig
im Bereich von ms oder μs.
Ein Haupthindernis für
die Patch-Clamp-Technologie als allgemeines Verfahren beim pharmakologischen
Screening war jedoch die begrenzte Anzahl von Verbindungen, die pro
Tag getestet werden konnten (typischerweise nicht mehr als 1 oder
2). Auch kann die äußerst langsame Rate
des Lösungswechsels,
der um die Zellen und die Patches herum durchgeführt werden kann, ein beträchtliches
Hindernis bilden.
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Eine
Haupteinschränkung
für den
Durchsatz des Patch-Clamp-Verfahrens ist die Lokalisierung und das
Clampen von Zellen und der Pipette sowie die Beschaffenheit des
Zuführsystems,
das die gelöste
Verbindung zu den Zellen und Patches leitet.
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Bei üblichen
Patch-Clamp-Einrichtungen werden die Zellen in Experimentalkammern
eingebracht, die kontinuierlich von einer physiologischen Salzlösung durchströmt werden.
Die Ausbildung der Zellen-Pipetten-Verbindung in diesen Kammern
ist zeitraubend und schwierig. Verbindungen werden dadurch zugeführt, dass
der Einlass auf ein Ventil umgewechselt wird, das mit einer kleinen
Anzahl von Zuführflaschen
verbunden ist. Die erforderlichen Volumina der Trägerflüssigkeit
und der zu testenden Probe sind groß. Es wurden Systeme mit hohem
Durchsatz für
die Durchführung
von Patch-Clamp-Messungen vorgeschlagen, die typischerweise aus
einem Substrat mit einer Vielzahl von Stellen bestehen, die ausgebildet
sind, um Zellen in einer Messkonfiguration zu halten, so dass die
elektrischen Eigenschaften der Zellmembran ermittelt werden können.
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Das
US-Patent 5,187,096 für
Rensselaer beschreibt eine Vorrichtung zum Überwachen der Zellen-Substrat-Impedanz
von Zellen. Die Zellen werden direkt auf den Elektroden kultiviert,
die dann mit einer Vielzahl von Zellen bedeckt sind, so dass eine
Messung von einzelnen Zellen nicht durchgeführt werden kann.
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WO-98/54294,
Leland Stanford, beschreibt ein Substrat mit Vertiefungen, die Elektrodenanordnungen enthalten.
Das Substrat mit den Vertiefungen und den Elektroden (Metallelektroden)
wird aus Silizium unter Verwendung von CVD (Chemischer Dampfabscheidung)
und von Ätz-Verfahren
hergestellt und umfasst Siliziumnitrid-Passivierungs-Schichten, welche
die Elektroden umgeben. Die Zellen werden direkt auf der Elektrodenanordnung
kultiviert. Das Substrat ist geeignet, elektrophysiologische Eigenschaften
zu messen, und es wird eine Vielzahl von Mess-Schemata beschrieben.
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WO
99/66329, Cenes, beschreibt ein Substrat mit in Vertiefungen angeordneten
Perforationen und Elektroden, die auf jeder Seite des Substrats
vorgesehen sind. Das Substrat wird dadurch hergestellt, dass ein Siliziumsubstrat
mit einem Laserstrahl perforiert wird, und es kann mit einem Anti-Haftmaterial
auf der Oberfläche
beschichtet sein. Das Substrat ist geeignet, Giga-Dichtungen mit
Zellen dadurch zu bilden, dass die Zellen auf den Perforationen
unter Verwendung eines Unterdrucks positioniert werden, der einen
Flüssigkeitsstrom
durch die Perforationen erzeugt, oder dadurch, dass eine Anti-Haft-Schicht
vorgesehen wird, welche die Perforationen umgibt, oder dadurch,
dass die Zellen elektrisch geführt
werden. Die Zellen können
durch EM-Felder oder chemische Verfahren permeabilisiert werden,
um eine Gesamtzellen-Mess-Konfiguration zu schaffen. Alle Perforationen
und somit alle messbaren Zellen in einer Vertiefung teilen sich
eine Arbeitselektrode und eine Referenzelektrode, siehe 1;
somit können
keine Messungen an einzelnen Zellen durchgeführt werden.
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WO
99/31503, Vogel et al., beschreibt eine Messeinrichtung mit einer
Aperfur, die in einer Vertiefung auf einem Substrat (Träger) angeordnet
ist und zwei Abteile voneinander trennt. Die Messvorrichtung umfasst zwei
Elektroden, die auf den beiden Seiten der Apertur angeordnet und
geeignet sind, eine Zelle an der Aperturöffnung zu positionieren. Das
Substrat kann hydrophobe und hydrophile Bereiche besitzen, um die
Positionierung der Zellen an der Aperturöffnung zu unterstützen.
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WO
00/73784 (mit dem Prioritätsdatum
vom 28.05.1999 und einem Veröffentlichungsdatum
vom 7.12.2000), Case Western Reserve University, beschreibt ein
Verfahren zum Messen des Ab- und Zuflusses von chemischen Medikamenten,
wie z.B. Doxorubicin aus einer bzw. in eine Zelle, wie z.B. einer
menschlichen Krebszelle oder einer anderen biologischen Zelle. Das
Verfahren umfasst das Einführen
des Medikaments in die Zelle beispielsweise dadurch, dass die Zelle
in ein Kulturmedium eingetaucht wird, welches das Medikament enthält, oder
durch direkte Injektion in die Zelle. Die das Medikament enthaltende
Zelle wird dann in ein medikamentenfreies flüssiges Medium eingetaucht und
der Ab- bzw. der Zufluss des Medikaments aus der bzw. in die Zelle
wird mit einer elektrochemischen Ausrüstung gemessen. Zur Erfassung
des Abflusses einer kleinen Zellpopulation oder einer einzigen Zelle
kann die Signalstärke
dadurch erhöht
werden, dass das Medikament an einer Arbeitselektrode vorkonzentriert
wird, und dadurch, dass die Sauerstoffkonzentration des Mediums
um die Zelle herum erhöht
wird. Eine Zelle oder eine kleine Gruppe von Zellen, die untersucht
werden sollen, können
auf einem Substrat dadurch räumlich
positioniert werden, dass ein kleiner Bereich des Substrates mit
einer Schicht aus hydrophilem Material überzogen wird, an welchem die
Zelle haftet.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung sieht ein Substrat und ein Verfahren vor,
die zur Ermittlung oder Überwachung
von Strömen
optimiert sind, welche durch Strukturen fließen, die Ionenkanäle enthalten,
wie z.B. durch Zellmembranen, mit einem hohen Durchsatz und einer
hohen Zuverlässigkeit
und unter Bedingungen, die bezüglich
der Einflüsse
realistisch sind, denen Zellen oder Zellmembranen unterworfen sind.
Somit kann man sich auf die Ergebnisse, die unter Verwendung des
Substrates und des Verfahrens gemäß der Erfindung erzielt werden,
beispielsweise die Variationen in der Ionenkanalaktivität als Ergebnis
einer Beeinflussung der Zellmembran beispielsweise mit verschiedenen
Testverbindungen, als echte Manifestationen der tatsächlichen Einflüsse verlassen,
und es werden keine Artefakte durch das Mess-System eingeführt, so
dass die Ergebnisse als gültige
Basis für
die Untersuchung von elektrophysiologischen Phänomenen verwendet werden können, die
im Zusammenhang mit der Leitfähigkeit
oder der Kapazität
von Zellmembranen unter gegebenen Bedingungen stehen.
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Dies
ist der Fall, weil der Strom durch einen oder mehrere Ionenkanäle direkt
unter Verwendung von reversiblen Elektroden gemessen wird, wie dies
im folgenden erläutert
ist, bei denen es sich typischerweise um Silber/Silberhalid-Elektroden,
wie z.B. Silberchlorid-Elektroden
handelt, die sowohl als Messelektroden als auch als Referenzelektroden
verwendet werden.
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Das
Substrat und das Verfahren gemäß der Erfindung
können
nicht nur für
Messungen an Zellmembranen sondern auch an anderen Strukturen verwendet
werden, die Ionenkanäle
enthalten, wie z.B. an künstlichen
Membranen. Die Erfindung ermöglicht
die Durchführung
mehrerer Tests, wie z.B. elektrophysiologischer Messungen an Ionentransfer-Kanälen und
Membranen gleichzeitig und voneinander unabhängig. Das Substrat der Erfindung
bildet ein vollständiges
und einfach zu handhabendes Mikrosystem, das nur kleine Mengen von
Trägerflüssigkeit
(einer physiologischen Salzlösung,
die mit den Zellen isotonisch ist, d.h. normalerweise eine Osmolarität von 150
millimolarem NaCl oder einem anderen geeigneten Salz aufweist) und
kleine Mengen von Testproben verwendet.
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Gemäß einem
Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Baueinheit, die folgendes
umfasst:
ein ebenes Substrat, das einen ersten Oberflächenbereich
und einen gegenüberliegenden
zweiten Oberflächenbereich
besitzt, wobei der erste Oberflächenbereich
eine Vielzahl von Plätzen
aufweist, von denen jeder geeignet ist, eine Ionenkanäle enthaltende
Struktur aufzunehmen, die in einer Flüssigkeit enthalten ist, und
von denen jeder einen in ihm verlaufenden Durchgang durch das Substrat
aufweist, wobei der Durchgang den ersten Oberflächenbereich und den zweiten
Oberflächenbereich
miteinander verbindet und wobei der Durchgang Wände besitzt und so dimensioniert
ist, dass er eine Ionenkanäle
enthaltende Struktur hält,
eine
Vielzahl von Messelektroden, von denen jede einem entsprechenden
Platz zugeordnet ist,
eine oder mehrere Referenzelektroden,
wobei die Messelektroden und die entsprechende Referenzelektrode oder
Referenzelektroden Elektroden sind, die in der Lage sind, dann,
wenn sie miteinander in einem elektrolytischen Kontakt stehen und
wenn zwischen ihnen eine Potentialdifferenz angelegt wird, durch
die Abgabe von Ionen durch eine Elektrode und die Aufnahme von Ionen
durch die andere Elektrode zwischen sich einen Strom fließen zu lassen,
und ist
dadurch gekennzeichnet, dass
jeder der Plätze in der
Lage ist, eine Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand zu schaffen,
die zwischen einem Berührungsbereich
der äußeren Oberfläche einer
Ionenkanäle
enthaltenden Struktur, die an diesem Platz gehalten wird, und dem
umgebenden ersten Oberflächenbereich
des Substrates oder längs
der Wände des
Durchgangs gebildet wird, wobei die Dichtung dann, wenn sie ausgebildet
ist, eine Domäne,
die auf der einen Seite der Dichtung definiert ist und von der Ionenkanäle enthaltende
Struktur gebildet wird und in elektrolytischem Kontakt mit der Messelektrode
steht, von einer Domäne
trennt, die auf der gegenüberliegenden Seite
der Dichtung von der Ionenkanäle
enthaltenden Struktur gebildet wird und in elektrolytischem Kontakt mit
der entsprechenden Referenzelektrode steht, wodurch ein Strom, der
zwischen der Referenzelektrode und entsprechenden Messelektroden
und durch die Ionenkanäle
enthaltende Struktur fließt,
ermittelt und/oder überwacht
werden kann,
wobei die Elektroden mit der Baueinheit integriert
sind und wobei die Baueinheit weiterhin eine Vielzahl von Strömungskanal-Strukturen
umfasst, die in dem Substrat erzeugt sind, um Flüssigkeit an die Vielzahl von
Plätzen
zu liefern.
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Gemäß einem
anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Ausbildung
einer Ganzzellen-Messkonfiguration zum Ermitteln und/oder Überwachen
einer elektrophysiologischen Eigenschaft eines oder mehrerer Ionenkanäle von einer
oder mehreren Ionenkanäle
enthaltenden Strukturen, wobei dieses Verfahren folgende Schritte
umfasst:
Bereitstellen einer Baueinheit, die folgendes aufweist:
ein ebenes Substrat, das einen ersten Oberflächenbereich und einen gegenüberliegenden
zweiten Oberflächenbereich
aufweist, wobei dieses Substrat eine Vielzahl von Plätzen in
dem ersten Oberflächenbereich
des Substrates besitzt, von denen jeder geeignet ist, eine Ionenkanäle enthaltende
Struktur zu halten, und von denen jeder einen in ihm ausgebildeten
Durchgang durch das Substrat hindurch aufweist, der den ersten Oberflächenbereich
und den zweiten Oberflächenbereich
miteinander verbindet, wobei der Durchgang Wände besitzt und so dimensioniert
ist, dass er eine Ionenkanäle enthaltende
Struktur hält
und eine Dichtung mit hohem Widerstand zwischen der Ionenkanäle enthaltenden Struktur
und dem Substrat längs
der Wände
des Durchgangs oder um diese herum bildet, und eine Vielzahl von
Messelektroden, von denen jede einem entsprechenden Platz zugeordnet
ist, und eine oder mehrere Referenzelektroden,
Zuführen einer
Trägerflüssigkeit
zu einem oder mehreren Plätzen
unter Verwendung einer Vielzahl von Strömungskanal-Strukturen, die
in dem Substrat ausgebildet sind, wobei die Trägerflüssigkeit eine oder mehrere Ionenkanäle enthaltende
Strukturen enthält
und die Trägerflüssigkeit
mit dem ersten Oberflächenbereich
des Substrates in Berührung
steht,
Positionieren wenigstens einer der Ionenkanäle enthaltenden
Strukturen an einer entsprechenden Anzahl von Plätzen,
Ausbilden einer
einen hohen elektrischen Widerstand aufweisenden Dichtung zwischen
einem Berührungsbereich
der äußeren Oberfläche einer
Ionenkanäle
enthaltenden Struktur, die an dem Platz gehalten wird, und einem
ersten Oberflächenbereich
des Substrates, um die Wände
des Durchgangs herum oder längs
dieser Wände,
wobei die Dichtung dann, wenn sie ausgebildet ist, eine Domäne, die
auf der einen Seite der Dichtung durch die Ionenkanäle enthaltende
Struktur definiert ist und in elektrolytischem Kontakt mit der Messelektrode steht,
von einer Domäne
trennt, die auf der gegenüberliegenden
Seite der Dichtung definiert ist und von der Ionenkanäle enthaltenden
Struktur gebildet wird und in elektrolytischem Kontakt mit der entsprechenden
Referenzelektrode steht,
Suchen nach einer Dichtung mit hohem
elektrischen Widerstand zwischen einer Ionenkanäle enthaltenden Struktur, die
an einem Platz in dem ersten Oberflächenbereich des Substrates
oder längs
der Wände
des besagten Durchgangs gehalten wird, mit dem die den hohen elektrischen
Widerstand besitzende Dichtung ausgebildet werden soll, durch nacheinander
erfolgendes Anlegen einer ersten elektrischen Potentialdifferenz
zwischen der Messelektrode, die dem Platz zugeordnet ist, und einer
Referenzelektrode, Überwachen
eines ersten Stroms, der zwischen der Messelektrode und der Referenzelektrode
fließt,
und Vergleichen dieses ersten Stromes mit einem vorbestimmten Schwellenstrom,
und dann, wenn der erste Strom im wesentlichen der vorbestimmte
Schwellenstrom ist, Zulassen des Platzes als Platz, der eine akzeptable
Dichtung zwischen der Ionenkanäle
enthaltenden Struktur und dem ersten Oberflächenbereich des Platzes aufweist,
und
Ausbilden einer Ganzzellen-Konfiguration an zugelassenen
Plätzen,
wodurch
ein dritter Strom, der durch Ionenkanäle der Ionenkanäle enthaltenden
Struktur zwischen der Messelektrode und den Referenzelektroden fließt, bestimmt
und/oder überwacht
werden kann.
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Eine
Ionenkanäle
enthaltende Struktur in einer Lösung
kann zu einem Platz auf einem Substrat entweder durch aktive oder
passive Einrichtungen geführt
werden. Wenn die Ionenkanäle
enthaltende Struktur mit dem Platz in Berührung kommt, beispielsweise
mit dem Substrat um eine Elektrode herum, bilden die Kontaktoberflächen eine
Dichtung mit hohem elektrischen Widerstand (eine Giga-Dichtung)
an dem Platz, d.h. um die Elektrode herum, so dass eine elektrophysiologische
Eigenschaft des Ionenkanals unter Verwendung der betreffenden Elektrode
gemessen werden kann. Eine solche elektrophysiologische Eigenschaft
kann der Strom sein, der durch den Teil der Membran der Ionenkanäle enthaltenden
Struktur geleitet wird, der von der Giga-Dichtung umgeben ist.
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Im
vorliegenden Zusammenhang bezeichnet der Ausdruck „Giga"-Dichtung normaler
weise eine Dichtung mit wenigstens einem GΩ (Giga-Ohm) und dies ist die
Größe einer
Dichtung, die normalerweise als Minimum angestrebt wird, doch können für bestimmte Arten
von Messungen, bei denen die Ströme
groß sind, niedrigere
Werte als Schwellenwerte ausreichend sein.
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Die
Ganzzellen-Konfiguration kann dadurch erzielt werden, dass zwischen
der Messelektrode, die jedem zugelassenen Platz zugeordnet ist,
und einer Referenzelektrode eine Reihe von Impulsen mit einer zweiten
elektrischen Potentialdifferenz angelegt wird, sowie durch das Überwachen
eines zweiten Stroms, der zwischen der Messelektrode und der Referenzelektrode
fließt,
und das Unterbrechen der Reihe von Impulsen mit einer zweiten elektrischen
Potentialdifferenz immer dann, wenn der zweite Strom einen vorbestimmten Schwellenwert überschreitet,
wodurch der Teil der Ionenkanäle
enthaltenden Struktur aufgerissen wird, der sich am nächsten an
der Messelektrode befindet.
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Alternativ
kann die Ganzzellen-Konfiguration dadurch erhalten werden, dass
der Teil der Ionenkanäle enthaltenden
Struktur, der sich am nächsten
an der Messelektrode befindet, eine Wechselwirkung mit einer Poren
bildenden Substanz unterworfen wird.
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Es
sei darauf hingewiesen, dass im vorliegenden Zusammenhang der Ausdruck „Ganzzellen-Konfiguration" nicht nur Konfigurationen
bezeichnet, in denen eine ganze Zelle mit dem Substrat an einem
Messplatz in Berührung
gebracht und punktiert worden ist oder mit einer Poren bildenden
Substanz für
einen elektrischen Kontakt mit dem Inneren der Zelle geöffnet worden
ist, sondern auch Konfigurationen, bei denen ein ausgeschnittener
Zellmembran-Patch so angeordnet worden ist, dass die äußere Oberfläche der
Membran „nach oben" zu einer aufzubringenden
Testprobe weist.
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Wenn
es sich bei der Messelektrode, die einem Platz zugeordnet ist, um
eine aus einer Vielzahl von Elektroden auf dem Substrat handelt,
und wenn die Ionenkanäle
enthaltende Struktur eine von vielen solchen Strukturen in einer
Lösung
ist, ist es möglich,
viele solche vorbereiteten Messanordnungen auf einem Substrat zu
erzielen. Eine typische Messung umfasst das Hinzufügen einer
speziellen Testprobe zur Messanordnung; aus diesem Grund ist jede
Messanordnung von den anderen Messanordnungen getrennt, um eine
Vermischen der Testproben und eine elektrische Leitung zwischen
den Anordnungen zu vermeiden.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNG
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Die
Erfindung wird im Folgenden noch mehr im Einzelnen unter Bezugnahme
auf die beigefügte
Zeichnung beschrieben; in dieser zeigen:
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1 wie
oben erwähnt,
ein Diagramm einer typischen bekannten elektronischen Schaltung
für Spannungs-Clamp-Messungen,
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2 eine schematische Darstellung von Beispielen
von Substraten, welche Plätze
mit Elektroden zum Halten von Zellmembranen oder künstlichen
Membranen aufweisen,
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3A–3D Querschnitts-Seitenansichten
von Substraten, welche die unterschiedlichen bis 3D Schichten wiedergeben,
die in Wafer-Bearbeitungs-Technologie (Abscheidungs- /Fotolithographie-/Ätz-Technologie)
hergestellt worden sind,
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4A eine
Querschnitts-Seitenansicht eines anderen Aufbaus eines Substrates,
das Plätze
mit Elektroden zum Halten von Zellmembranen oder künstlichen
Membranen aufweist,
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4B eine
Draufsicht auf die Struktur aus 4A,
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5 eine
Vergrößerung von
Plätzen,
die von einem Bereich aus hydrophobem Material umgeben sind,
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6 einen
Testbezirk mit einem Array von Elektroden, die mit einer Reihe von
Kontakten verbunden sind, und
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7 ein
Flussdiagramm für
ein Verfahren zur Erkennung, ob eine Zelle mit einem Substrat, beispielsweise
um eine Elektrode herum, eine Giga-Dichtung bildet.
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BESCHREIBUNG
VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Substrat mit einer Vielzahl von
Elektroden an Stellen, die geeignet sind, Zellen (oder andere Ionenkanäle enthaltende
Strukturen) aufzunehmen oder festzuhalten, so dass die Zellmembran
und die Substratzwischenfläche
eine Giga-Dichtung um eine Elektrode herum erzeugen, die es möglich macht,
elektrophysiologische Eigenschaften der Zellmembran zu ermitteln
oder zu überwachen.
Es sei darauf hingewiesen, dass dann, wenn der Ausdruck „Zelle" oder „Zellmembran" in der vorliegenden
Beschreibung verwendet wird, es in Abhängigkeit vom Zusammenhang normalerweise
möglich
ist, jede andere Ionenkanäle
enthaltende Struktur, wie z.B. eine andere Ionenkanäle enthaltende
Lipid-Membran oder eine Ionenkanäle
enthaltende, künstliche
Membran zu verwenden. Elektrophysiologische Eigenschaften können beispielsweise
der Stromfluss durch einen Ionenkanal oder die Kapazität einer
Ionenkanäle
enthaltenden Membran sein. Es ist möglich, individuelle Testproben
(typischerweise pharmakologische Medikamente) an jeder eine Zelle
haltenden Stelle hinzuzugeben, so dass an jeder Zelle individuelle
Experimente durchgeführt
werden können.
Ein Experiment kann sein, die Reaktion des Ionenübertragungs-Kanals auch die
Zugabe einer Testprobe zu messen. Um individuelle Experimente durchzuführen, können unterschiedliche
Testproben unterschiedlichen, eine Zelle festhaltenden Plätzen hinzugefügt werden.
Einer oder mehrere eine Zelle haltende Plätze, an denen eine spezifische
Testprobe hinzugefügt
wird oder hinzugefügt
werden soll, wird im Folgenden als Testbezirk bezeichnet.
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Das
Substrat der Erfindung ist typischerweise ein Bestandteil, der in
einer Vorrichtung zur Durchführung
von Messungen der elektrophysiologischen Eigenschaften von Ionentransfer-Kanälen in Lipid-Membranen,
wie z.B. Zellen verwendet wird.
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Die
Vorrichtung ist so aufgebaut, dass sie Mittel zum Durchführen einer
großen
Anzahl von individuellen Experimenten in einem kurzen Zeitraum zur
Verfügung
stellt. Dies wird dadurch erzielt, dass ein Mikrosystem vorgesehen
wird, das eine Vielzahl von Testbezirken aufweist, von denen jeder
Plätze
besitzt, die integrierte Messelektroden umfassen, und in dem eine
geeignete Testproben-Zuführung
vorgesehen ist. Jeder Testbezirk kann Mittel zum Positionieren der
Zellen, zur Ausbildung einer Giga-Dichtung, zur Auswahl von Plätzen, an
denen eine Giga-Dichtung ausgebildet worden ist, Messelektroden
und eine oder mehrere Referenzelektroden umfassen. Dadurch ist es
möglich,
unabhängige
Experimente in jedem Testbezirk durchzuführen und die Vorbereitung und
die Messungen aller Experimente von einer zentralen Steuerungseinheit,
wie z.B. einem Computer aus zu steuern. Aufgrund der kleinen Größe der Testbezirke
ermöglicht
die Erfindung die Durchführung
von Messungen unter Verwendung von nur sehr kleinen Mengen von Trägerflüssigkeit
und Testproben. Die vorliegende Erfindung schafft auch mehrere verschiedene
Prozeduren zur Durchführung
von Messungen; hierzu gehören
Messungen an Fragmenten von Zellen und künstlichen Membranen.
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Das
Substrat, das Plätze
mit Messelektroden aufweist (im Folgenden als Elektroden bezeichnet)
kann auf verschiedene Weisen aufgebaut sein, von denen drei in den 2A bis 2C und
weitere in den 4A und 4B dargestellt
sind. Der Unterschied zwischen den Ausführungsformen ist der Aufbau
der Plätze
auf dem Substrat. Plätze
sind geeignet, eine Ionenkanäle
enthaltende Struktur, wie z.B. eine Zelle dadurch festzuhalten,
dass das Oberflächenmaterial
an der Stelle gut geeignet ist, eine Dichtung mit der Zellenmembran (oder
Struktur-Membran) zu erzeugen, wie dies im Stand der Technik beschrieben
wird. Solche Materialien umfassen Silizium, Kunststoff, reines Siliziumdioxid
und andere Gläser,
wie z.B. Quarz und Pyrex oder Siliziumoxid, das mit einem oder mehreren
Dope-Mitteln dotiert ist, die aus der Gruppe Be, Mg, Ca, B, Al,
Ga, Ge, N, P, As und den Oxiden dieser Elemente ausgewählt sind.
Das Substrat selbst kann aus irgendeinem Material hergestellt sein,
das für
eine Wafer-Bearbeitungstechnologie geeignet ist, wie z.B. Silizium,
Kunststoff, reines Siliziumdioxid und andere Gläsern, wie z.B. Quarz und Pyrex
oder Siliziumdioxid, das mit einem oder mehreren Dope-Mitteln dotiert
ist, die aus der Gruppe Be, Mg, Ca, B, Al, Ga, Ge, N, P, As ausgewählt sind.
Silizium ist das zurzeit bevorzugte Substratmaterial.
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Bei
den Konstruktionen der 2A bis 2C sind
die Plätze 14 an
einer örtlich
flachen Oberfläche auf
dem Substrat 12 angeordnet. Örtlich flach bedeutet, dass
die Oberfläche
des Substrates eine gewisse Substruktur 13 mit einem Maßstab aufweisen
kann, der größer ist
als der von einem oder mehreren Plätzen, wie man der 2B entnimmt.
Plätze
und damit Elektroden 16 können innerhalb dieser Substruktur
einzeln oder in Gruppen angeordnet werden.
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Die
Verfahren zur Herstellung der drei Konstruktionen aus 2 sind zueinander analog. Die 2A und 2B umfassen
lediglich eine Unterteilung der Grundstruktur von 2C.
Die Herstellung der Strukturen wird nun unter Bezugnahme auf die 3A und 6 beschrieben:
Leitungen 18 aus
leitfähigem
Material werden auf der Oberfläche
des Substrates dadurch ausgebildet, dass zunächst eine Schicht aus leitfähigem Material
auf dem Substrat abgeschieden wird. Die Abscheidung von Materialien
auf dem Substrat und auf anderen, in der Beschreibung erwähnten Oberflächen kann
dadurch erfolgen, dass eine von mehreren Abscheidungstechnologien
verwendet werden, wie z.B. Physical Vapour Deposition, das folgendes
umfasst 1) Aufbringen von Material aus einer Dampfphase, 2) Sputtern
und 3) Laserabtragung; Chemical Vapour Depositions-Verfahren, die
umfasst 1) unter Atmosphärendruck
erfolgende chemische Dampfabscheidung (APCVD), 2) unter niederem
Druck erfolgende chemische Dampfabscheidung (LPCVD), 3) plasmaverstärkte chemische
Dampfabscheidung (PECVD) und 4) lichtverstärkte chemische Dampfabscheidung;
auch sind eine Rotationsbeschichtung und Wachstums-Verfahren möglich. Zweitens
werden die einzelnen Leitbahnen in einem fotolithographischen Schritt
definiert, und drittens wird leitfähiges Material, das nicht Teil
einer Leitbahn ist, durch Ätzen
entfernt. Die Leitbahnen sind vorzugsweise so definiert, dass ein
Teil der Leitbahnen eine Linie von Kontaktflecken 20 bildet,
während
ein anderer Teil eine Anordnung von Messelektrodenteilen 16 und
eine oder mehrere Referenzelektroden 8 bildet. Die Anordnung
von Elektrodenteilen ist nicht notwendigerweise ein geordnetes Muster.
Der Kontaktfleck und der Elektrodenteil sind vorzugsweise die beiden
Endteile der Leitbahn, doch können
sie irgendwelche Teile beispielsweise eines Musters von Leitbahnstreifen
sein. Vorzugsweise besteht das leitfähige Material aus Metallen
oder dotiertem Silizium.
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Um
die Elektroden und Kontakte auszubilden, wird das leitfähige Material,
das keinen Teil der Elektroden oder Kontaktteil einer jeden Leitbahn
bildet, mit einem isolierenden (hydrophilen) Film 22, beispielsweise Siliziumdioxid
oder mehreren Schichten aus Siliziumnitrid und Siliziumdioxid abgedeckt.
Dies wird in der Weise ausgeführt,
dass die gesamte Oberfläche
mit einer Schicht des isolierenden Films entweder durch thermische Oxidation
von Silizium, physikalische oder chemische Dampfabscheidung oder
Rotations-Schleuder-Beschichtung
abgedeckt wird. Unter Verwendung eines Fotolithographie- und eines Ätzschrittes
werden Teile des isolierenden Films entfernt, um die Leitbahnen
freizulegen und dadurch Elektroden 16 und 8 und
Kontaktflächen 20 auszubilden.
Für einen
besseren elektrischen Kontakt können
die Elektroden (und Kontakte) mit Silber 24 beschichtet
werden. Alternativ können
in den Fällen
Abhebe-Verfahren verwendet werden, in welchen mehrere Materialschichten
in mehreren dünnen
Lagen abgeschieden werden sollen. Hier wird ein Fotolack über dem
Substrat abgeschieden und das auszubildende Muster wird in dem Fotolack
durch Beleuchtung durch eine Maske hindurch hindurchgeführt, worauf
ein Ätz-Schritt
folgt. Eine Schicht aus Material, typischerweise ein Metall wird
durch Dampfabscheidung auf der Struktur abgeschieden und der Fotolack
wird aufgelöst,
wodurch Metall in dem definierten Muster zurückbleibt. In diesem Stadium
erscheint das Substrat wie in 7 dargestellt,
wobei die dünnen
Leitbahnen 18, welche die Elektroden und die Kontakte miteinander
verbinden, durch einen isolierenden Film abgedeckt sind.
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Optional
werden, wie in 3A gezeigt, hydrophobe Bereiche 26,
die vollständig
die Elektrodenplätze oder
Gruppen von Plätzen
umgeben, unter Verwendung einer Kombination aus einer Abscheidung
eines hydrophoben Materials wie z.B. Teflon und Fotolithographie
ausgebildet. Das hydrophobe Material wird entweder durch Rotationsschleuder-Beschichtung,
chemische Dampfabscheidung oder plasmaverstärkte chemische Dampfabscheidung
abgeschieden. 2A zeigt eine mögliche Verwendung
solcher Bereiche.
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Schließlich wird
vor der Verwendung eine Silberchloridschicht 28 auf der
Elektrode 16 unter Verwendung einer elektrolytischen Behandlung
ausgebildet. Die gleiche Vorgehensweise erfolgt normalerweise für alle Mess-
und Referenzelektroden in den Substraten der Erfindung, um sie als
Silber/Silberhalid-Elektroden wie z.B. Silber/Silberchlorid-Elektroden herzustellen.
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3B zeigt
eine vergrößerte Darstellung
eines Platzes, der eine Zelle 2 festhält, wobei die Dichtung 25 an
dem Platz ausgebildet ist, der die AgCl-Schicht 28 umgibt.
Bei der Herstellung der Elektrode wird ein großes Volumen einer AgCl-Schicht 28 auf
der Oberseite des Silbers 24 vor der Abscheidung der Siliziumschicht 22 ausgebildet,
wodurch eine starke Zufuhr von AgCl sichergestellt wird.
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3C zeigt
eine Baueinheit, bei der die Messelektrode in einer kleinen Vertiefung 27 positioniert
ist, wodurch die Dichtung zwischen der Membran und dem Rand der
Vertiefung 27 gebildet wird. In Abhängigkeit von der Größe der Vertiefung 27 erlaubt
diese Baueinheit eine stärkere
Trennung der Membran und der Arbeitselektrode sowie ein größeres Volumen
der Trägerflüssigkeit,
welche die Elektrode umgibt.
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3D zeigt
eine weitere Baueinheit, bei der die Arbeitselektrode in einer kleinen
Vertiefung 27 wie in 3C positioniert
ist. Hier wurde eine Poren bildende Substanz 40 an dem
Platz abgeschieden, um durch die Wirkung der aufgelösten, Poren
bildenden Substanz auf der Zelle eine Gesamtzellen-Mess-Konfiguration zu
schaffen, wenn eine Zelle dort positioniert wird.
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Bei
der Konstruktion aus 4A ist ein Platz am Boden einer
Vertiefung, eine geometrisch geformte Struktur auf dem Substrat.
Die Funktion der Vertiefung ist sowohl eine Positionierung der Zelle 2 an
dem Platz als auch die Abtrennung eines Festbezirks, der in diesem
Fall aus einzelnen Plätzen
besteht.
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Ein
Substrat mit einer Vertiefung, die wie eine stumpfkegelige Pyramide
geformt ist, ist in 4A dargestellt, wobei eine Öffnung oder
ein Durchgang 30 vom engen Ende der stumpfkegeligen Pyramide
zum unteren Oberflächenteil
des Substrates ebenfalls im Substrat ausgebildet ist, so dass die
Vertiefung und der Durchgang auf diese Weise einen Trichter bilden.
Eine Messelektrode 16 ist auf dem unteren Oberflächenteil des
Substrates in der Nähe
der Öffnung
oder des Durchgangs angeordnet und eine Referenzelektrode 8 ist auf
einer der Seitenoberflächen
der Vertiefung vorgesehen, wie in 4A gezeigt.
Vorzugsweise ist eine Leitungsanordnung 32 zum Anlegen
eines Unterdrucks an den Durchgang auf der unteren Seite des Substrates vorgesehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
führt diese
Leitungsanordnung zur oberen Seite des Substrates und kann die elektrische
Verdrahtung für
die Messelektrode mit umfassen.
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Wenn
oben der Ausdruck „Unterseite" verwendet wird,
so bezieht sich dies lediglich auf die Ausrichtung der Zeichnung.
Bei der Verwendung des Substrates gemäß der Erfindung ist es keine
Bedingung, dass der erste Oberflächenteil
des Substrates der obere Oberflächenteil
und der zweite Oberflächenteil
der untere Oberflächenteil
ist. Mit anderen Worten, die Schwerkraft wird in Verbindung mit
diesen sehr kleinen Strukturen nicht in wesentlichem Maße verwendet,
und beispielsweise könnte
die Anordnung gemäß 4A auch
in einer Orientierung verwendet werden, die der Orientierung entspricht,
die sich ergibt, wenn die Figur um einen Winkel von 180° (oder irgendeinen
anderen Winkel für
diesen Zweck) gedreht worden ist.
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Die
in 4A gezeigte Vertiefung ist im Wesentlichen ein
stumpfkegelig-pyramidenförmiger
Hohlraum mit einem Loch 30 am Scheitel. Die Basis der Pyramide
ist ein Quadrat. Der Scheitelwinkel der Pyramide ist 2 × 54,7°, die Wafer-Dicke
d = 350–650 μm, die Seitenlänge am Scheitel
der Pyramide ist w ≈ 30 μm, um Raum für eine Zelle
zu lassen. Der Scheitel der Pyramide ist mit einer Siliziumdioxid-Membran 31 mit
einer Dicke h ≈ 3 μm abgedeckt.
In dieser Membran ist ein Loch mit einem Durchmesser a ≈ 0,1 bis 10 μm, beispielsweise 1–5 μm ausgebildet.
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Die
eine oder mehrere Vertiefungen umfassende Struktur kann auf mehrere
ziemlich unterschiedliche Weisen hergestellt werden. Im Folgenden
werden zwei unterschiedliche Herstellungsverfahren für die Basisstruktur
zusammengefasst, nämlich
das „Oxid-Zuerst-Verfahren" und das „Oxid-Zuletzt-Verfahren".
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Oxid-Zuerst-Verfahren
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Aufwachsen
lassen von 3 μm
nassem, thermischen SiO2, das das gesamte
Substrat bedeckt.
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Ausbilden
des Lochs an der Bodenseite des Substrats durch Fotomaskierung und
reaktives Ionenätzen
zur Herstellung des Lochs durch das Oxid im Silizium-Substrat. Abscheiden
von LPCVD-Siliziumnitrid für eine Ätzmaske
auf beiden Seiten des Substrats. Definieren von Nitrid-Fenstern
zur Ausbildung einer Pyramiden-Basisebene auf der oberen Seite des
Substrates durch Fotomaskierung und reaktives Ionenätzen und nasses
Oxidätzen
(gepufferte Fluorsäure).
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Ätzen der
pyramidenförmigen
Hohlräume
durch die Fenster durch anisotropes Ätzen im Silizium. Dies erzeugt
Pyramidenseiten mit einer Neigung von 54,7°.
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Abziehen
des Nitrid-Ätz-Stopps
unter Verwendung von heißer
H3PO4.
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Wachsen
lassen von 1 um nassem, thermischen SiO2,
um den Körper
des Silizium-Wafers elektrisch zu isolieren und um die Seiten der
Pyramide abzudecken. Andere SiO2-Bereiche wachsen
nicht wesentlich.
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Oxid-Zuletzt-Verfahren
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Ausbilden
einer Ätz-Stopp-Schicht
im Silizium (Bor-Dotierung) auf der Unterseite des Substrats unter Verwendung
einer Dotierung durch Implantation oder epitaxiales Wachstum. Die Ätz-Stopp-Schicht
ist typischerweise ungefähr
1 μm dick.
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Abscheiden
von LPCVD-Siliziumnitrid für
eine Ätzmaske
auf beiden Seiten des Substrats. Definieren von Nitrid-Fenstern
zur Bildung einer Pyramidenbasis-Ebene auf der oberen Seite des
Substrates durch Fotomaskierung und reaktive Ionenätzung und
Nassoxid-Ätzung
(gepufferte Fluorsäure).
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Ätzen von
pyramidalen Hohlräumen
durch die Fenster durch anisotropes Ätzen im Silizium. Dies erzeugt
Pyramidenseiten mit einer Neigung von 54,7°. Die Ätzung stoppt an der mit Bor
dotierten Ätz-Stopp-Schicht
um eine ungefähr
1 μm dicke
Siliziummembran zu bilden.
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Ablösen der
Nitrid-Ätz-Stopp-Schicht
unter Verwendung von heißer
H3PO4.
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Definieren
des Lochs auf der Unterseite durch Fotomaskierung und reaktives
Ionen-Ätzen
des Siliziums.
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Wachstum
von nassem thermischen SiO2 zum Umwandeln der Siliziummembran in
ein Oxid überall auf
dem Substrat. Dieser Prozess lässt
das Loch schrumpfen, da SiO2 auch innerhalb
des Loches gebildet wird, das dadurch kleiner gemacht werden kann
im Vergleich zu dem, was unter Verwendung von Fotolithographie möglich ist.
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Bei
beiden Produktionsverfahren gilt die Hauptsorge während der
Herstellung der mechanischen Stabilität der SiO2-Membran
mit dem Loch während
des abschließenden
Hochtemperatur-Oxidationsschritts. Das Oberflächenmaterial (hier SiO2) kann
optional mit Siliziumnitrid beschichtet werden, um einen Beitrag
zur elektrischen Leitfähigkeit
zu verhindern.
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Jetzt
können
die Mess- und Referenzelektroden ausgebildet werden. Die Messelektrode
auf der Unterseite kann unter Verwendung von standardmäßigen Abscheide-
und Fotolithographie-Verfahren ausgebildet werden. Die Referenzelektrode
wird vorzugsweise unter Verwendung der Verdampfung von leitfähigem Material
durch eine Schattenmaske oder durch Verwendung eines Elektrophorese-Lack-Verfahrens
ausgebildet.
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Weiterhin
können
Strömungskanalstrukturen
zum Hinzugeben von Flüssigkeit
zum Trichter möglicherweise
im Substrat hergestellt werden, indem man einen Einström- und einen
Ausström-Durchgang
zum bzw. vom Trichter und sonst wo auf dem Substrat herstellt. Alternativ
werden die Strömungskanäle unter
Verwendung von normalen Ätz-Verfahren
auf einem anderen Substrat ausgebildet, das auf die Oberseite des
Substrats aufgebracht werden soll.
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Die
beschriebenen Merkmale sind vorzugsweise so angeordnet, dass ein
einfacher Zugang zu allen Verbindungs-Ein- und -Auslässen von
der Oberseite der Baueinheit her besteht, wie in 4B gezeigt
(Absaugauslass 32, Kontakte zur Messelektrode 16 und
zur Referenzelektrode 8). Diese bevorzugte Konfiguration ist
für ein
Anlegen an eine Einheit geeignet, die ähnliche aber umgekehrte Ein-
und Auslässe
auf der Oberseite der Baueinheit besitzt.
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Es
ist ein wesentlicher Gesichtspunkt, dass das Substrat Mittel zum
Trennen der Testbezirke 15 liefern kann, wie in 2 gezeigt. Die Testbezirke enthalten vorzugsweise
Volumina im Bereich von Nanolitern. Dies ist günstig, wenn man die erforderlichen
Mengen der häufig
teuren Testproben bedenkt; darüber
hinaus nimmt die Zeit, die für
das Mischen der Lösung
durch Diffusion benötigt
wird, mit abnehmenden Volumen ab.
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In 2A sind
die Testbezirke durch Verwendung von Oberflächenmaterialien definiert,
die dazu dienen, hydrophobe Bereiche 26 und hydrophile
Plätze 14 auf
dem Substrat zu definieren, wie zuvor beschrieben. Wenn die Oberfläche durch
eine wässrige
Lösung,
wie z.B. eine Salzlösung
benetzt (aber nicht überschwemmt)
wird, begrenzt sich die Flüssigkeit
selbst auf die hydrophilen Bereiche und definiert dadurch die Testbezirke.
Jeder hydrophile Bereich umfasst einige Plätze 14 mit Elektroden 16 und
kann auch hydrophobe Bereiche mit kleinerem Maßstab umfassen.
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Auf
dem in 2B gezeigten Substrat sind die
Testbezirke durch Unterteilungen 13 voneinander getrennt,
die auf der Oberfläche
des Substrates ausgebildet sind. Diese Unterteilungen können dadurch
auf dem Rohsubstrat erzeugt werden, dass die Substratoberfläche mit
einem Fotolack abgedeckt wird und die Vertiefungsöffnungen
unter Verwendung einer Fotolithographie definiert werden. Ein Ätz-Schritt,
auf den die Beseitigung des verbliebenen Fotolacks erfolgt, macht
das Substrat bereit für
die Ausbildung von Plätzen
und Elektroden.
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2C zeigt
ein Substrat, das mit Elektroden bedeckt ist, jedoch ohne irgendeine
wesentliche Unterteilung. In diesem Fall werden die Testbezirke
unter Verwendung eines Strukturteils 17 mit hohlen Unterteilungen/Kammern
definiert, der auf die Oberseite des Substrats aufgebracht wird.
Durch Herstellung eines engen mechanischen Kontakts mit dem Substrat
bildet der Strukturteil geschlossene Kammern, von denen jede einen oder
mehrere Plätze
mit Elektroden enthält.
Gegebenenfalls kann ein ähnliches
Strukturteil auf die Oberseite eines jeden der in den 2A und 2B gezeigten
Substrate aufgebracht werden.
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Bei
allen in 2 dargestellten Ausführungsformen
muss eine Referenzelektrode innerhalb eines jeden Testbezirks angeordnet
sein. Dies kann entweder dadurch realisiert werden, dass man eine
Elektrode an einem Platz vorsieht, wo sie von keiner Zelle abgedeckt
werden kann, oder eine Elektrode so groß wählt, dass sie von keiner Zelle
abgedeckt werden kann, oder durch Dosieren der Anzahl von Zellen
derart, dass die Zellen nicht alle Elektroden abdecken können. Diese
letzte Option ermöglicht
es, dass irgendeine der Messelektroden als Referenzelektrode dient.
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In
Abhängigkeit
von der speziellen Form des Substrats mit Elektroden wird die Zugabe
von der die Zellen tragenden Flüssigkeit
und der Zellen in einer der folgenden Weisen durchgeführt. Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Testbezirke von oben zugänglich und es können Tröpfchen der
Trägerflüssigkeit
und Zellen an jedem Testbezirk mit Hilfe eines Dispersions- oder
Pipettiersystems zugeführt
werden. Es können auch
Systeme wie ein Tintenstrahl-Druckerkopf oder ein Tröpfchenstrahl-Druckerkopf
verwendet werden. Eine andere Möglichkeit
ist ein nQUAD-Ansaugdispenser oder irgendeine andere Dispensier-/Pipettier-Vorrichtung, die
geeignet ist, kleine Flüssigkeitsmengen
zu dosieren. Alternativ werden die Trägerflüssigkeit und die Zellen auf
das gesamte Substrat aufgebracht (beispielsweise durch Gießen der
die Zellen enthaltenden Trägerflüssigkeit über das
Substrat oder durch Eintauchen des Substrats in eine solche Flüssigkeit),
wodurch Trägerflüssigkeit
und Zellen einem jeden Testbezirk zugeführt werden. Da die Volumina
der Trägerflüssigkeit
und der späteren
Testproben im Nanoliterbereich liegen, könnte die Wasserverdampfung
ein Problem darstellen. Daher sollte in Abhängigkeit von dem speziellen
Volumina die Handhabung der Flüssigkeiten
auf dem Substrat vorzugsweise in einer Atmosphäre mit hoher Feuchtigkeit durchgeführt werden.
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Falls
die Testbezirke geschlossene Kammern sind, können sie nur durch ein System
von Kanälen,
d.h. ein Mikro-Flüssigkeits-Handhabungssystem
zugänglich
sein. Dies ist der Fall, wenn ein zweites Strukturteil 17 (2C)
auf die Oberseite irgendeines der Substrate mit oder ohne Testbezirke
aufgebracht wird. In diesem Fall müssen die Trägerflüssigkeit und die Zellen durch
Einlasskanäle
zugegeben werden, die typischerweise in dem zweiten Strukturteil 17 ausgebildet
sind. Ein solches zweites Strukturteil kann beispielsweise aus Silizium
hergestellt sein, wobei in diesem Fall Strömungskanäle unter Verwendung von standardmäßigen Fotolithographie-
und Ätz-Verfahren
ausgebildet werden können.
Ein solches zweites Strukturteil kann auf die Oberseite einer jeden
Ausführungsform
aufgebracht werden.
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Gemäß einem
anderen Gesichtspunkt werden die Zellen direkt auf dem Substrat
kultiviert, während dieses
in ein Wachstumsmedium eingetaucht ist. Im optimalen Fall bilden
die Zellen eine homogene Monoschicht (in Abhängigkeit von der Art der Zellen,
die man wachsen lässt)
auf der gesamten Oberfläche
mit Ausnahme von Bereichen, in denen die Oberfläche absichtlich für ein Zellwachstum
ungeeignet gemacht worden ist. Der Erfolg der Kultivierung von Zellen
auf dem Substrat hängt
in starken Maße
vom Substratmaterial ab.
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Bei
noch einem anderen Aspekt kann eine künstliche Membran mit inkorporierten
Ionenkanälen
statt einer Zelle verwendet werden. Eine solche künstliche
Membran kann aus einer gesättigten
Lösung
von Lipiden dadurch hergestellt werden, dass ein kleiner Klumpen
des Lipids über
einer Öffnung
positioniert wird. Dieses Verfahren wird genau beispielsweise in „Ion Channel
Reconstitution" von
Christopher Miller, in Plenum 1986, S. 577 beschrieben. Wenn die Öffnungsgröße geeignet
und eine polare Flüssigkeit,
wie z.B. Wasser, auf beiden Seiten der Öffnung vorhanden ist, kann
sich eine Lipid-Doppelschicht über
der Öffnung
ausbilden. Der nächste
Schritt besteht darin, einen Protein-Ionenkanal in die Doppelschicht
einzubringen. Dies kann dadurch erreicht werden, dass man Lipid-Bläschen mit
eingebauten Ionenkanälen
einer Seite der Doppelschicht zuführt. Die Bläschen können dann in eine Fusion mit
der Doppelschicht beispielsweise durch osmotische Gradienten gezogen
werden, wodurch die Ionenkanäle
in die Doppelschicht aufgenommen werden.
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Die
Erzielung eines guten Kontaktes zwischen der Zelle und einer Glaspipette
und dadurch die Erzeugung einer Giga-Dichtung zwischen einer Zelle
und der Spitze der Pipette sind im Stand der Technik genau beschrieben.
Um die Zelle zur Spitze der Pipette zu ziehen und auch um den erforderlichen
Kontakt für
die Erzielung der Giga-Dichtung herzustellen, ist es üblich, an
die Pipette einen Unterdruck (Saugwirkung) anzulegen.
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Im
Fall der in den 2A bis 2C beschriebenen
Substrate wird kein Unterdruck vorgesehen und die Positionierung
der Zellen wird mit Hilfe anderer Mittel durchgeführt. Darüber hinaus
wurde gezeigt, dass der bloße
Kontakt zwischen der Zellmembran und dem Substrat, typischerweise
einem ultrareinen Silizium, für die
Zelle ausreichend ist, um eine gewisse Bindung zur Oberfläche herzustellen
und eine Giga-Dichtung zu erzeugen.
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Die
Positionierung kann durch Elektrophorese durchgeführt werden,
bei der ein elektrisches Feld von einer Elektrode die geladene Zelle
zu ihr hin zieht. Negativ geladene Zellen werden zu positiven Elektroden gezogen
und umgekehrt. Die elektrostatische Zugwirkung kann auch als Führungsmittel
für eine
Gruppe von Elektroden dienen. Alternativ kann in einem Testbezirk
ein hydrophobes Material 26 die Oberfläche des Substrates mit Ausnahme
von Bereichen unmittelbar um die Elektroden herum bedecken. Dies
ist in 5 dargestellt. Dadurch können sich die Zellen nur an
Elektrodenplätze 14 binden.
Es ist möglich,
diese beiden Verfahren gleichzeitig oder optional in Kombination
mit einer geeigneten geometrischen Form der Substratoberfläche um die
Elektroden herum anzuwenden, um die sinkenden Zellen zur Elektrode
hin zu führen.
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Bei
einer anderen Ausführungsform
sind die Dichte und das Muster von Plätzen und Messelektroden nahe
zu gleich oder größer als
die Dichte von Zellen, wenn diese gepackt werden, um die dichtestmögliche Packung
auf der Substratoberfläche
zu erzielen. Dies stellt sicher, dass dann, wenn eine ausreichende
Anzahl von Zellen zugeführt
wird, zumindest eine Elektrode durch eine Zelle bedeckt ist, ohne
dass weitere Führungsmittel
erforderlich sind.
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Bei
der in 4A dargestellten Ausführungsform
werden eine oder mehrere Zellen 2 in einer Trägerflüssigkeit
zugeführt
und sinken zum unteren Ende des Trichters, wobei dies ein Beispiel
für eine
Positionierung durch geometrische Formgebung ist. Wenn eine Saugwirkung
angelegt wird, zieht sie die Zelle zur Öffnung 30 und etabliert
eine Verbindung zwischen der Zelle und der Öffnung, wodurch eine Giga-Dichtung
erzeugt wird, welche die Öffnung
innen und die Lösung
voneinander trennt. Die Giga-Dichtung kann irgendeine Form annehmen,
beispielsweise kreisförmig,
oval oder rechtwinklig. Die Trägerflüssigkeit
stellt einen elektrischen Kontakt zwischen der Zellmembran und der
Referenzelektrode her. Die Zelle kann durch die Saugwirkung verformt
werden und ein Fall, in dem sich die Zelle in die Öffnung hinein
erstreckt, kann, wenn dies kontrolliert erfolgt, erwünscht sein.
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Jeder
Testbezirk enthält
vorzugsweise mehrere Elektrodenplätze. Um zu erkennen, ob eine
Elektrode durch eine Zelle bedeckt und durch eine Giga-Dichtung
isoliert ist, werden Leckströme
zwischen Elektroden oder zwischen Elektroden und der Referenzelektrode
gemessen. Obwohl ein Testbezirk zahlreiche Elektroden enthalten
kann, ist es eine einfache Aufgabe, nach Elektroden zu suchen, die
durch Giga-Dichtungen isoliert sind, und diese Aufgabe ist für einen
Computer gut geeignet.
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Die 6 und 7 schlagen
ein Schema für
dieses Vorgehen vor, wobei die Elektroden 16 in einem Testbezirk
eine nxm-Matrix (hier 3 × 3)
bilden. Die Elektrodenverbindungen 18 führen zu einer Kontaktreihe 20 (Nr.
1–9) auf
dem Substrat, die durch einen Computer einzeln mit Strom-Messeinrichtungen
angewählt
werden können.
Eine Liste von durch eine Giga-Dichtung isolierten Elektroden kann
unter Verwendung eines einfachen Verfahrens erstellt werden, das
im Flussdiagramm der 7 skizziert ist. Zunächst (1) werden
zwei Schleifen gebildet, um alle Einträge in der Matrix von Elektroden
zu durchlaufen. In Schritt (2) wird die nxm-Anordnung der
Matrix entfaltet, um eine individuelle Adressierung (3) von
Elektrodenkontakten mit einer Elektrodenkontaktnummer N (Nr. 1–9) zu liefern.
Der Strom bei einer zwischen dem Kontakt N und der Referenzelektrode 8,
Kontaktnummer 0, angelegten Spannung wird bei (4) gemessen
und sein Wert wird mit einem Schwellenwerfstrom ISchwelle verglichen (5) um
zu ermitteln, ob die Elektrode durch eine Giga-Dichtung isoliert
ist. Wenn eine Giga-Dichtung detektiert wird, wird die Kontaktnummer
einer Liste von geeigneten Elektroden hinzugefügt (6) aus der eine
Messelektrode ausgewählt
wird (7). Dieses Schema liefert Informationen bezüglich der
relativen Positionen von n, m geeigneten Elektroden. Diese Informationen
können
verwendet werden, um die optimale Messelektrode in Schritt (7)
auszuwählen,
doch kann dies weggelassen werden, so dass jede Elektrode einfach
durch ihre Kontaktnummer N bekannt ist. Typischerweise wird pro
Testbezirk nur eine Elektrode ausgewählt.
-
Die
Aktivität
dieser Kanäle
kann elektrisch (Einzelkanalaufzeichnung) gemessen werden oder alternativ
kann der Patch aufgerissen werden, was eine Messung der Kanalaktivität der gesamten
Zellmembran ermöglicht
(Ganzzellenaufzeichnung). Ein Zugang mit hoher Leitfähigkeit
zum Inneren der Zelle zur Durchführung
von Ganzzellen-Messungen kann auf wenigstens drei verschiedenen
Wegen erzielt werden (alle Verfahren sind geeignet, doch können verschiedene
Zellen unter Umständen
mit verschiedenen Vorgehensweisen besser arbeiten):
- a) Bei der in 4A gezeigten Ausführungsform
kann die Membran durch Saugwirkung von der Öffnungsseite her zerrissen
werden. Drücke,
die kleiner sind als der Atmosphärendruck,
werden entweder als kurze Impulse mit zunehmender Stärke oder
als Rampen oder Stufen mit zunehmender Stärke angelegt. Das Reißen der
Membran wird durch stark erhöhte
kapazitive Stromspitzen (die die gesamte Zellmembran-Kapazität darstellen)
in Reaktion auf einen Testimpuls mit gegebener Spannung detektiert.
- b) Das Reißen
der Membran durch angelegte Spannungsimpulse. Spannungsimpulse werden
entweder als kurze Impulse mit zunehmender Stärke (von mV bis V) und Zeitdauer
(μs bis
ms) oder als Rampen oder als Stufen mit zunehmender Größe zwischen
den Elektroden angelegt. Die Lipide, welche die Membran einer typischen
Zelle bilden, werden durch die große elektrische Feldstärke von
den Spannungsimpulsen beeinflusst, wodurch die Membran in der Nachbarschaft
der Elektrode desintegriert. Das Reißen der Membran wird durch
stark erhöhte
kapazitive Stromspitzen in Reaktion auf einen Testimpuls mit gegebener
Spannung detektiert.
- c) Permeabilisierung der Membran. Das Aufbringen von Poren bildenden
Substanzen (z.B. Antibiotika, wie z.B. Nystatin oder Amphotericin
B) beispielsweise durch vorher erfolgende Abscheidung dieser Substanzen an
der Stelle. Statt die Membran aufzureißen, wird der Membranwiderstand
wahlweise durch die Inkorporation von permeabilisierenden Molekülen abgesenkt,
was zu einer wirksamen Zellspannungs-Kontrolle über das Elektrodenpaar führt. Auf
die Inkorporation folgen ein graduell abnehmender Gesamtwiderstand und
eine zunehmende Kapazität.
-
In
diesem Stadium ist ein Substrat mit einigen Elektroden geschaffen,
von denen jede eine Zelle hält, wobei
die ausgewählten
Zellen eine Giga-Dichtung um ihre jeweiligen Elektroden herum bilden,
was es der Elektrode ermöglicht,
elektrophysiologische Eigenschaften der Ionen-Transferkanäle in der
Zellmembran zu messen. Dies stellt den Hauptgesichtspunkt der Erfindung
dar, nämlich
das zur Verfügungstellen
einer Vielzahl von vorbereiteten Probezellen zur Durchführung von
elektrophysiologischen Experimenten. Darüber hinaus ist jede Zelle umgrenzt,
um das individuelle Testen von Zellen zu ermöglichen. Der Rest dieser Beschreibung
konzentriert sich auf das Aufbringen des auf diese Weise fertig
gemachten Substrats.
-
Die
Testproben müssen
jeden Testbezirk individuell zugegeben werden, mit unterschiedlichen
Testproben für
jeden Testbezirk. Dies kann unter Verwendung der Verfahren zum Aufbringen
der Trägerflüssigkeit
mit der Ausnahme der Verfahren durchgeführt werden, bei denen die Trägerflüssigkeit
dem Substrat als Ganzem zugeführt
wird.
-
Nach
dem Positionieren der Zelle in einer Messkonfiguration können mehrere
elektrophysiologische Eigenschaften gemessen werden, wie z.B. der
Strom durch die Ionenkanäle
(Spannungs-Clamp) oder die Kapazität von Ionenkanäle enthaltenden
Membranen. In jedem Fall sollte eine geeignete elektronische Messschaltung
vorgesehen werden. Der Fachmann ist in der Lage, solche geeigneten
Messschaltungen auszuwählen.
Eine mögliche
Schaltung für
Spannungs-Clamp-Messungen ist oben unter Bezugnahme auf 1 beschrieben.
-
Im
Fall von Spannungs-Clamp-Messungen führt der elektrische Strom,
der von den Ionen-Übertragungskanälen in der
Zellmembran geleitet wird, zu einer Ladungsübertragung von der Lösung (Referenzelektrode)
zur Messelektrode typischerweise in der Größenordnung von pA bis μA (Pikoampere
10–12 A).
Ein Verstärker
mit niedrigem Rauschen ist vorgesehen, um diese Ströme zu messen.
Die elektronischen Schaltungen können
in eine separate Standardeinheit integriert sein, die Verbindung
mit den beiden Elektroden und eventuell vorhandenen Strömungskanälen für die Zufuhr
von Medikamenten hat.
