WO2006136870A1 - Hydrogel bioresorbable - Google Patents

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WO2006136870A1
WO2006136870A1 PCT/IB2005/001742 IB2005001742W WO2006136870A1 WO 2006136870 A1 WO2006136870 A1 WO 2006136870A1 IB 2005001742 W IB2005001742 W IB 2005001742W WO 2006136870 A1 WO2006136870 A1 WO 2006136870A1
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hydrogel
albumin
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separation membrane
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Antoine Turzi
Guy Fortier
Yaode Liu
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Antoine Turzi
Guy Fortier
Yaode Liu
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    • A61L31/00—Materials for other surgical articles, e.g. stents, stent-grafts, shunts, surgical drapes, guide wires, materials for adhesion prevention, occluding devices, surgical gloves, tissue fixation devices
    • A61L31/14—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution

Definitions

  • the present invention relates to a hydrophilic gel, dissociable in an aqueous medium, a process for the preparation of this hydrogel, as well as a bioabsorbable separation membrane that can be used in particular in surgery and more particularly in order to minimize and / or prevent formation post-surgical adhesions.
  • adhesions are very common during cardiac, abdominal or pelvic surgery. These adhesions can degenerate into obstructive pathologies according to their extent and severity. During abdominal surgery, the formation of adhesions may, for example, compromise the mobility of the organs and induce chronic pain in the patient. The adhesions are responsible for 49 to 74% of obstructions of the small intestine, 10 to 15% of cases of infertility and 20 to 50% of chronic pelvic pain in women. In addition, during a re-operation, the presence of adhesions can significantly increase the complexity and duration of surgery, as well as post-operative complications. The same conclusions also apply for cardiac, pulmonary or thoracic surgeries. The presence of adhesions is a factor influencing both the operational risk (mortality and morbidity) and the costs of treatment.
  • adhesions occurs during the process of natural repair of healthy tissue and consist of fibrous attachments between the organs targeted by surgery or between a separating membrane such as peritoneum or pericardium and the underlying organs.
  • a separating membrane such as peritoneum or pericardium and the underlying organs.
  • fibrin accumulates on the surface of the latter. These fibrin strips act as glue and induce adhesion between the organ and the membrane.
  • Plasmin results from the action of the tissue activator of the plasminogen (mesothelial cells) on blood plasminogen. Fibrinolysis and the coagulation cascade are involved in this pathology. A recruitment of fibroblasts and their proliferation as well as the presence of inflammatory cells are also observed, along with the deposition of collagen. An angiogenesis mechanism under control of endothelial cells would eventually be involved in the formation of adhesions.
  • One of the innovative strategies currently proposed to limit the formation of adhesions, without interfering with the natural mechanism of repair, is to insert between the damaged membrane and the underlying organs, a sheet, dried or not, of synthetic polymer or natural, crosslinked chemically or not.
  • the dry sheet in contact with the tissues becomes hydrated and undergoes erosion by a slow mechanism of dissolution or by hydrolysis. This process leads to the complete resorption of the leaflet in the weeks following its implantation.
  • the formation of the adhesions which begins at the end of the operation ends approximately 7 days later.
  • a physical barrier is placed for example between the pericardium and the epicardium, or even between the peritoneum and the organs of the gastrointestinal system, or even between the pleura and the lung, the number of membership sites should be minimized. At the disappearance of the barrier, adhesions attached by only one of their ends should be observed.
  • This barrier or separator must have qualities of biodegradability, malleability, biocompatibility, be non-abrasive and easy to synthesize.
  • hydrogel refers by definition to a natural or artificial polymeric material that has the property of retaining several times its weight in water, which gives it a similarity in terms of hydration with living tissue. Thus, it appears that hydrogels can act as a barrier, i.e. separator leaflets.
  • the majority of the hydrated polymeric films are obtained by chemical crosslinking of natural or synthetic hydrophilic polymers in the presence of agents. bifunctional or by polymerization of monomers, which gives them a high structural stability and therefore low biodegradability.
  • Such films are useful externally as a skin dressing and for controlled drug release. In vivo, their uses and applications are limited by the fact that they degrade very slowly, when they do. There is therefore a need in the medical field for biodegradable hydrated hydrogel films that could be used in vivo during surgeries to decrease adhesions and even to allow controlled release of drugs in situ.
  • Several types of dry polymeric films exist for controlled drug release purposes and break up by dissolution.
  • dry films can not be implanted in certain parts of the human body, because they are solid, non-flexible and abrasive and require a place of implantation without mechanical stress, unlike a hydrated hydrogel which by its nature is flexible and not flexible. abrasive.
  • the hydrated and biodegradable hydrogel film can be positioned in all parts of the body, even those subjected to mechanical stress such as the joints, the heart and the peritoneal cavity. Following its degradation, no trace of the hydrogel should be found at the implantation site, eliminating any risk related to the bio accumulation of the polymer.
  • the majority of the hydrated polymer films are obtained by chemical crosslinking of natural or synthetic hydrophilic polymers in the presence of bifunctional agents or by polymerization of monomers which gives them a high structural stability and consequently a low biodegradability.
  • the hydrogel films must degrade in a sufficiently short time, that is to say in a time less than the time required for the formation of a fibrous capsule that results from the cellular inflammatory reaction of the host on the implant.
  • hydrogel membrane obtained by spraying two liquids containing poly (ethylene glycol) at the pelvic surgical site in pigs has resulted in a significant 60% reduction in the number and intensity of adhesions.
  • the hydrogel coating was resorbed in 5 days (Ferland et al., Hum Reprod., 16: 2718.2723, 2001).
  • the first membranes to limit the formation of epicardial-pericardial adhesions were made of poly (2-hydroxyethyl methacrylate) reinforced with poly (ethylene terephthalate) (Walker et al., Asaio J. 38: M550- 554, 1992). These rather rigid hydrogel membranes were not biodegradable and were subject to calcification after 9 months of implantation in the dog. Poly (hydroxybutyrate) membranes gave good results in sheep, however they were resorbed very slowly by macrophages after more than 30 months (Maim et al., J. Thorac Cardiovasc Surg 104: 600-607 , 1992).
  • the object of the present invention is to provide a new type of hydrogel for forming a biodegradable separation membrane, to overcome the disadvantages of known polymeric films, and which has excellent biocompatibility, good degradability in vivo, viscoelastic characteristics which facilitate its handling and a lack of abrasive effect.
  • a first object of this invention to achieve the above purpose is therefore a physically crosslinked hydrogel, hydrophilic, swellable in water and slowly dissociable in aqueous medium, which consists essentially of albumin blood proteins associated in gel form in basic medium .
  • a second subject of the invention consists of a bioabsorbable separation membrane which is formed from a film of the aforementioned hydrogel.
  • a third object of the invention is a process for the preparation of the aforementioned hydrogel, which comprises mixing an aqueous solution of protein albumin with a base, and then allowing the mixture to rest until the polymerization of the albumin macromolecules. .
  • the subject of the invention is also the use of the separation membrane in veterinary and human surgery, as well as for the controlled administration of a therapeutically active substance.
  • Albumin blood proteins may be isolated from plasma or sera of animal origin (beef, rabbit, pork, etc.) or human sera.
  • Albumin of human origin can be obtained from a blood bank or by genetic engineering, or be of an autologous nature. In the latter case, it appears that the acceptability by the patient will be significantly better towards the implant, because of the autologous composition of the membrane.
  • the process for preparing the hydrogel according to the invention is preferably characterized in that the aqueous solution of albumin is between 10 and 20% (w / v), that the base is 5N NaOH and that the ratio between the NaOH and the albumin solution is 0.5 to 2.0% (w / v), and in that the duration of the polymerization is between about 1 hour and 8 hours. Also preferably, all the steps of the process according to the invention are carried out under sterile conditions.
  • biodegradable separation membrane As for the biodegradable separation membrane according to the invention, it can be advantageously used by a surgeon or a veterinarian to reduce the formation of adhesions during thoracic, pelvic, abdominal, cardiac or other surgeries.
  • the hydrogel forming the biodegradable separation membrane may also contain a therapeutically active substance, or a controlled release drug system having a physiologically acceptable form, suitable for oral, rectal, vaginal or surgical implant application. .
  • the separation membrane can also be surface-modified by the covalent addition of monoethoxy poly (ethylene glycol) chains of various molecular weights or by incubation in a poly (ethylene glycol) solution in order to modify its characteristics. biocompatibility and degradability.
  • the novel hydrogel according to the invention has particularly interesting biomedical qualities, namely its capacity to be in the form of a thin film of adjustable dimensions, its high water content, mechanical properties that allow its easy handling, the fact that it is translucent which facilitates its positioning, and its biodegradable character in situ in a physiological medium.
  • a commercial serum albumin such as and without limitation, that of rabbit or beef, when it is dissolved in distilled water at a concentration varying between 10 and 20% (weight / volume) and that a base, for example an aqueous solution of 5, ON of NaOH, is added therein in order to obtain a final percentage of the base which is between 1.5 and 0.6% (w / v); this albumin will gel after a waiting period at room temperature that can range from about 1 hour to 8 hours.
  • This gelation of albumin provides a gel that is hydrated, malleable, translucent and is found to be a hydrogel with a water content of up to 97% (see Table 1).
  • the texture of hydrogels obtained by varying the amount of base and albumin varies from highly viscoelastic to vitreous, while remaining flexible and hydrated.
  • the pH of the hydrogel can be adjusted to physiological pH or another pH by simply incubating for one hour in the desired physiological solution. During this incubation and equilibration period, the saline buffer solution will be changed twice.
  • the freshly added albumin solution of the necessary amount of the base solution can be cast between two clean glass plates, which are separated by spacer bars. desired thickness (0.75 to 2.0 mm) and which further ensure the desired sealing assembly.
  • An assembly of the type used to prepare electrophoresis polyacrylamide gels may be useful for this purpose. Table 1
  • Example 2 Autologous Hydrogel Human or Animal.
  • the animal albumin is replaced by human albumin isolated from the blood of the patient or the animal which is intended to receive the hydrogel surgically.
  • the volume of blood to be collected will depend on the size and the number of hydrogels to be synthesized.
  • the albumin is isolated from a freshly drawn blood volume according to the method of Hao (Hao, Vox, Blood 36: 313-320, 1979), given here by way of example only. All the steps are carried out at a temperature between -5 and 0 ° C.
  • this method consists of a dilution of a volume of blood plasma with two volumes of an aqueous solution of 0.15 M NaCl, and the pH is adjusted to 5.6 by the addition of a quantity of a 0.8M sodium acetate solution at pH 4.0.
  • an aqueous solution of ethanol at 95% v / v is added slowly with stirring until a final concentration of ethanol of 42% (v / v) is obtained. Then the stirring is maintained for one hour and the solution is centrifuged at 12,000 g / 1 h. The pH of the supernatant is then adjusted to 4.8 with the acetate buffer solution. The solution is then stirred for 1 h and left stirring for 3 h.
  • the solution is then centrifuged at 12,000g / 1h.
  • the precipitate is then recovered and contains the albumin.
  • Albumin is dissolved in one volume of water, and the amount of protein is evaluated by the bicinchoninic acid assay (BCA, Pierce, USA).
  • the albumin is diluted with sterile water to the desired final concentration (between 15 and 20% w / v), then filtered through a 0.01 micron porosity membrane to sterilize it.
  • Example 3 Implantation of a Pericardial-Epicardial Hydrogel in the Rabbit for the Prevention of Postoperative Adhesions
  • hydrogels of a dimension of 25 X 20 X 1 mm are prepared by mixing 150 mg of rabbit albumin (Sigma, USA) per ml of 0.9% NaCl solution to which is added 50 ml of 5.0N NaOH and a drop of methylene blue 1% to stain the hydrogel.
  • An Ethicon 910 (J & J, USA) wire was added beforehand between the glass plates to allow the surgeon to fix the hydrogel on the inside of the pericardium.
  • the hydrogels are washed several times and stored in 0.9% NaCl. All solutions are filtered on a Millipore 0.2 micron filter and all manipulations are performed under sterile conditions.
  • Rabbits are anesthetized with isoflurane (1.5%) after premedication with 0.5 mg atropine, 0.5 mg / kg midazolam and 6 mg / kg azaperone. After muscle relaxation with 0.2 mg / kg pancuronium via the right jugular route, the animals are intubated and mechanically ventilated. A dose of 10 mg / kg fentanyl is given at the beginning of surgery and then repeated with 0.05 mg every 30 minutes. The rabbit is placed in the supine position. After shaving and disinfection of the thorax a median sternotomy and dissection of the various planes are made to land on the pericardium which is open.
  • the pericardium is closed with a continuous suture of Vicryl / 0 (controlled rabbit) or, there is establishment of the rabbit albumin hydrogel, attachment points on the inner wall of the pericardium and closure. Hemostasis and closure of the sternum, subcutaneous tissue and skin is made. The scar is disinfected and the animal is awake. The animals are sacrificed at 1-2-3-4-5-7-8 weeks, and the hydrogel / pericardial section removed for histological analysis.
  • the histological evaluation consists of sections of the previously fixed tissue of interest in a 10% neutral formaldehyde solution, followed by hematoxylin-eosin staining. According to the microscopic evaluation, the degree of fibrosis and inflammation will be classified according to a scale of 0 for absence of fibrosis and of 4 when there is presence of granulomatous cells, cell proliferation and so on.
  • Hydrogels of the same composition of above were synthesized with a final size of 12.5 X 10 X 1.5 mm. After having been washed in physiological medium 0.9% NaCl, the hydrogels are incubated for 3 hours either in a 0.5% ibuprofen solution in 0.9% NaCl, in a solution of 2% poly (ethylene glycol) with a molecular mass of 4,000. Da or simply in a solution of 0.9% NaCl. Subsequently, the various hydrogels are implanted subcutaneously in the dorsal position in the rabbit.
  • Hydrogels of different compositions in terms of amount of albumin and base were prepared and washed in physiological buffer. They were incubated separately in a physiological buffer solution at 37 ° C. to evaluate the time required for the complete dissolutions, namely to determine the time necessary for their resorption by dissolution.

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Abstract

La présente invention concerne un hydrogel physiquement réticulé, hydrophile, gonflable dans l'eau et lentement dissociable en milieu aqueux, qui consiste essentiellement en protéines sanguines d'albumine associées sous forme de gel en milieu basique, ainsi que son utilisation comme membrane de séparation biorésorbable et un procédé pour sa préparation.

Description

HYDROGEL BIORESORBABLE
La présente invention concerne un gel hydrophile, dissociable en milieu aqueux, un procédé pour la préparation de cet hydrogel, ainsi qu'une membrane de séparation biorésorbable utilisable notamment en chirurgie et plus particulièrement dans le but de minimiser et/ou d'empêcher la formation d'adhérences postchirurgicales.
La formation d'adhérences post-opératoire est très fréquente lors de chirurgies cardiaques, abdominales ou pelviennes. Ces adhérences peuvent dégénérer en pathologies obstructives en fonction de leur étendu et de leur sévérité. Lors de chirurgies abdominales, la formation d'adhésions peut par exemple compromettre la mobilité des organes et induire des douleurs chroniques chez le patient. Les adhésions sont responsables de 49 à 74% des obstructions du petit intestin, de 10 à 15% des cas d'infertilité et de 20 à 50% des douleurs pelviennes chroniques chez la femme. De plus, lors d'une ré-opération, la présence d'adhésions peut augmenter de manière significative la complexité et la durée de la chirurgie, de même que les complications post-opératoires. Les mêmes conclusions s'appliquent aussi pour les chirurgies cardiaques, pulmonaires ou thoraciques. La présence d'adhésions est un facteur influant aussi bien sur le risque opératoire (mortalité et morbidité) que sur les coûts du traitement.
La formation d'adhérences apparaît durant le processus de réparation naturelle des tissus sains et sont constitués par des attachements fibreux entre les organes visés par la chirurgie ou encore entre une membrane séparatrice comme le péritoine ou le péricarde et les organes sous-jacents. A titre d'exemple, lorsque le péritoine est endommagé durant une chirurgie, de la fibrine s'accumule à la surface de ce dernier. Ces bandes de fibrine agissent comme une colle et induisent une adhésion entre l'organe et la membrane. Dans les conditions idéales, suivant la réparation du site, la fibrine présente au site des dommages mésothéliales serait détruit par la plasmine. La plasmine résulte de l'action de l'activateur tissulaire du plasminogène (cellules mésothéliales) sur le plasminogène sanguin. La fibrinolyse ainsi que la cascade de coagulation sont mises à contribution dans cette pathologie. Un recrutement de fibroblastes et leur prolifération ainsi que la présence de cellules inflammatoires sont aussi observées, parallèlement à la déposition de collagène. Un mécanisme angiogénèse sous contrôle des cellules endothéliales serait éventuellement impliqué dans la formation des adhésions.
Une des stratégies innovantes actuellement proposée pour limiter la formation d'adhésions, sans pour autant interférer avec le mécanisme naturel de réparation, consiste à insérer entre la membrane endommagée et les organes sous- jacents, un feuillet, séché ou non, de polymère synthétique ou naturel, réticulé chimiquement ou non. Le feuillet sec au contact des tissus s'hydrate et subit une érosion par un mécanisme lent de dissolution ou par d'hydrolyse. Ce processus conduit à la résorption complète du feuillet dans les semaines suivant son implantation. La formation des adhérences qui débute dès la fin de l'opération prend fin environ 7 jours plus tard. Ainsi donc, si au cours de la première semaine une barrière physique est placée par exemple entre le péricarde et l'épicarde, ou bien encore entre le péritoine et les organes du système gastro-intestinal, ou même entre la plèvre et le poumon, le nombre de sites d'adhésion devrait y être minimisé. A la disparition de la barrière, des adhésions rattachées par une seule de leurs extrémités devraient être observées. Cette barrière ou séparateur doit posséder des qualités de biodégradabilité, de malléabilité, de biocompatibilité, être non abrasive et facile à synthétiser.
Le terme hydrogel réfère par définition à un matériau polymérique naturel ou artificiel qui a la propriété de retenir plusieurs fois son poids en eau, ce qui lui confère une ressemblance en terme d'hydratation avec les tissus vivants. Ainsi, il apparaît que les hydrogels peuvent jouer le rôle de barrière, i.e. de feuillets séparateurs.
La majorité des films polymériques hydratés sont obtenus par réticulation chimique de polymères hydrophiles naturels ou synthétiques en présence d'agents bifonctionnels ou par polymérisation de monomères, ce qui leur confèrent une stabilité structurale élevée et conséquemment une faible biodégradabilité. De tels films sont utiles en usage externe comme pansement cutané et pour la libération contrôlée de médicament. In vivo, leurs utilisations et applications sont limitées par le fait qu'ils se dégradent très lentement, lorsqu'il le font. Il existe donc un besoin dans le domaine médical pour des films d'hydrogel hydratés biodégradables qui pourraient être utilisés in vivo lors de chirurgies afin de diminuer les adhérences et même pour permettre la libération contrôlée de médicaments in situ. Plusieurs types de films polymériques secs existent à des fins de libération contrôlée de médicaments et qui se désagrègent par dissolution. Ces films secs ne peuvent être implantés dans certaines parties du corps humain, car ils sont solides, non flexibles et abrasifs et requièrent un lieu d'implantation sans contrainte mécanique, au contraire d'un hydrogel hydraté qui de part sa nature est flexible et non abrasif. Le film d'hydrogel hydraté et biodégradable peut être positionné dans toutes les parties du corps, même celles soumises à un stress mécanique tels les articulations, le cœur et la cavité péritonéale. Suite à sa dégradation, plus aucune trace de l'hydrogel ne devrait être retrouvée au site d'implantation, éliminant tout risque relié à la bio accumulation du polymère.
La majorité des films polymériques hydratés sont obtenus par réticulation chimique de polymères hydrophiles naturels ou synthétiques en présence d'agents bifonctionnels ou par polymérisation de monomères ce qui leur confèrent une stabilité structurale élevée et conséquemment une faible biodégradabilité. Ainsi, pour des utilisations in vivo, les films d'hydrogel doivent se dégrader dans un temps suffisamment court, c'est à dire dans un temps inférieur au temps requis pour la formation d'une capsule fibreuse qui résulte de la réaction inflammatoire cellulaire de l'hôte sur l'implant. On parle ici d'un temps de dégradation d'une vingtaine de jours à quelques semaines.
Des membranes amniotiques humaines irradiées (Young et al., Fertil. Steril., 55:624-628,1991) ont été utilisées avec un certain succès chez le lapin modèle lors de chirurgies pelviennes. Cependant des problèmes éthiques et d'approvisionnement ont limité son développement. Deux hydrogels ont été évalués chez le rat modèle (West et Hubbell, Biomaterials, 16 : 1153-1156, 1995), le premier photo-polymérisé in situ et fait de poly(éthylène glycol)-co-acide lactique diacrylique et le deuxième réticulé physiquement et fait de poly(éthylène glycol)-co- polyφropylène glycol) et Poloxamer 407. Une diminution des adhérences de 75 et de 38% a été observée, respectivement; les temps de biodégradation respectifs étaient de 4 jours pour le premier et de 2 jours pour le second. Plus récemment, une membrane d'hydrogel obtenue par pulvérisation de deux liquides contenant du poly(éthylène glycol) sur le site chirurgical pelvien chez le porc a permis une réduction significative de 60% du nombre et de l'intensité des adhésions. Le revêtement d'hydrogel s'est résorbé en 5 jours (Ferland et al, Hum. Reprod., 16 : 2718.2723, 2001).
Des hydrogels d'acide hyaluronique réticulé ont donné une réduction significative des adhésions et des ré-adhésions abdominales chez le lapin, cependant la dégradabilité du polymère n'a pas été discutée (Osada et al., J. Int. Med. Res., 27:233-241 , 1999). Lors d'une étude clinique, des feuillets d'acide hyaluronique et de carboxyméthylcellulose ont permis une diminution de 51 % de l'incidence des adhérences et de 87% de la sévérité de ces adhérences (Becker et al., J. Am. Coll. Surg., 183 : 297-306, 1996) après une chirurgie abdominale.
Pour les chirurgies cardiaques, les premières membranes pour limiter la formation d'adhésions épicarde-péricarde ont été faites de poly(2-hydroxyéthyle méthacrylate) renforcées avec du poly(éthylène térephthalate) (Walker et al., Asaio J. 38:M550-554, 1992). Ces membranes d'hydrogel assez rigides n'étaient pas biodégradables et étaient sujettes à la calcification après 9 mois d'implantation chez le chien. Les membranes de poly(hydroxybutyrate) ont donné de bons résultats chez le mouton, cependant elles étaient résorbées que très lentement par les macrophages après plus de 30 mois (MaIm et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104:600-607, 1992). Des expériences similaires chez le chien, utilisant des membranes résorbables à base de poly(éthylène glycol) et d'acide poly(lactique) ont montré un abaissement des adhérences, cependant leur biodégradabilité était très rapide et la résorption était complète après quelques jours (Okuyama et al., Ann. Thorac. Surg. 68:913-918, 1999). Des membranes résorbables de collagène élastine (Florez et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 117:185,1999) ont été utilisées avec succès pour limiter le nombre d'adhésions lors de chirurgie cardiaque chez l'humain. Plus récemment, des feuillets de N-O carboxyméthyl-chitosan ont été utilisés aux même fins, mais chez le lapin, et ils ont permis une réduction très significative du nombre d'adhésions, cependant on n'y discute pas de la biodégradabilité de ces feuillets (Krause et al., J. Invest. Surg., 14:93-97, 2001).
Le but de la présente invention consiste à fournir un nouveau type d'hydrogel destiné à former une membrane de séparation biodégradable, visant à remédier aux inconvénients des films polymériques connus, et qui présente une excellente biocompatibilité, une bonne dégradabilité in vivo, des caractéristiques viscoélastiques qui facilitent sa manipulation et une absence d'effet abrasif.
Un premier objet de cette invention visant à atteindre le but précité est donc un hydrogel physiquement réticulé, hydrophile, gonflable dans l'eau et lentement dissociable en milieu aqueux, qui consiste essentiellement en protéines sanguines d'albumine associées sous forme de gel en milieu basique. Un second objet de l'invention consiste en une membrane de séparation biorésorbable qui est formée d'un film de l'hydrogel susmentionné.
Un troisième objet de l'invention est un procédé pour Ia préparation de l'hydrogel susmentionné, qui consiste à mélanger une solution aqueuse d'albumine protéique avec une base, puis à laisser reposer le mélange jusqu'à la polymérisation des macromolécules d'albumine.
Enfin, l'invention a également pour objet l'utilisation de la membrane de séparation en chirurgie vétérinaire et humaine, ainsi que pour l'administration contrôlée d'une substance thérapeutiquement active. Les protéines sanguines d'albumine peuvent être isolées du plasma ou des sérums d'origine animale (bœuf, lapin, porc, etc.) ou humaine.
L'albumine d'origine humaine peut être obtenue d'une banque de sang ou par génie génétique, ou bien être de nature autologue. Dans ce dernier cas, il apparaît que l'acceptabilité par le patient sera nettement meilleure envers l'implant, de par la composition autologue de la membrane.
En ce qui concerne le procédé de préparation de l'hydrogel selon l'invention, il est de préférence caractérisé en ce que la solution aqueuse d'albumine est comprise entre 10 et 20% (poids/vol.), que la base est du NaOH 5N et que le rapport entre le NaOH et la solution d'albumine est de 0.5 à 2.0% (poids/vol.), et par le fait que la durée de la polymérisation est comprise entre environ 1 h et 8h. De préférence également, toutes les étapes du procédé selon l'invention sont effectuées sous conditions stériles.
Quant à la membrane de séparation biodégradable selon l'invention, elle peut être avantageusement utilisée par un chirurgien ou par un vétérinaire pour réduire la formation d'adhérences lors de chirurgies thoraciques, pelviennes, abdominales, cardiaques ou autres.
L'hydrogel formant la membrane de séparation biodégradable peut également contenir une substance thérapeutiquement active, ou bien un système à libération contrôlée de médicament ayant une forme physiologiquement acceptable, qui convient pour une administration orale, rectale, vaginale ou sous forme d'un implant chirurgical.
Enfin, la membrane de séparation peut également être modifiée en surface par l'addition covalente de chaînes de monoéthoxy poly(éthylène-glycol) de masses moléculaires variées ou encore par incubation dans une solution de poiy(éthylène- glycol) afin de modifier ses caractéristiques de biocompatibilité et de dégradabilité.
Compte tenu de ce qui précède, le nouvel hydrogel selon l'invention possède des qualités biomédicales particulièrement intéressantes, à savoir sa capacité à être sous forme d'un film mince de dimensions ajustables, sa forte teneur en eau, des propriétés mécaniques qui permettent sa manipulation aisée, le fait qu'il soit translucide ce qui facilite son positionnement, et son caractère biodégradable in situ en milieu physiologique.
La présente invention sera maintenant illustrée au moyen des exemples suivants :
Exemple 1 : Synthèse de l'hydrogel d'albumine sérique résorbable
A titre d'exemple, une albumine sérique commerciale telle que et de manière non restrictive, celle du lapin ou du bœuf, lorsqu'elle est dissoute dans l'eau distillée à une concentration variant entre 10 et 20 % (poids/volume) et qu'une base, par exemple une solution aqueuse de 5,ON de NaOH, y est ajoutée afin d'obtenir un pourcentage final de la base se situant entre 1.5 et 0.6% (p/v); cette albumine se gélifiera suite à une période d'attente à la température de la pièce pouvant aller d'environ 1 heure jusqu'à huit heures. Cette gélification de l'albumine fournit un gel qui est hydraté, malléable, translucide et qui se révèle être un hydrogel dont le contenu en eau s'élève jusqu'au 97% (se référer au Tableau 1). La texture des hydrogels obtenus par variation de la quantité de la base et de l'albumine varie de très viscoélastique à vitreux, tout en demeurant flexible et hydraté. Le pH de l'hydrogel peut être ajusté au pH physiologique ou à un autre pH par simple incubation d'une heure dans la solution physiologique désirée. Durant cette période d'incubation et d'équilibrage, la solution tampon saline sera changée deux fois. Pour obtenir un hydrogel de dimension voulue et d'épaisseur désirée, la solution d'albumine fraîchement additionnée de la quantité nécessaire de la solution de base peut être coulée entre deux plaques de verre propres, qui sont séparées par des barres d'espacement d'épaisseur désirée (0,75 à 2,0 mm) et qui assurent de plus l'étanchéité voulue au montage. Un montage du type de celui utilisé pour préparer des gels de polyacrylamide pour électrophorèse peut être utile à cette fin. Tableau 1
Conditions de synthèse de l'hydrogel à base d'albumine sérique et caractéristiques des hydrogels obtenus.
Quantité1 AS NaOH" Ratio Gélification Dureté3 Poids après EWC5
5,ON %AS/%Base lavage
% (p/v) 0MpIv) (ul) + ou- g %
10 2.4 (120) 4.2 n.a. n.a.
10 1.2 (60) 8.4 ± ± 3.04 96
10 1.0 (50) 10.0 + + 3.72 97
10 0.8 (40) 12.5 + ++ 3.43 97
10 0.6 (30) 16.7 + +++ 3.40 97
17.5 1.2 (60) 14.6 + ++++ 2.8 93
17.5 0.6 (30) 29.2 + ++++ 4.37 96
20 1.2 (60) 16.7 + ++++ n.d. n.d.
20 0.6 (30) 33.3 + ++++ n.d. n.d.
1 solution initiale d'albumine sérique bovine (100 mg/ml d'eau (10%p/v) etc., 1 ml a été utilisé pour la synthèse des hydrogels. 2 % (p/v) final de NaOH dans la solution d'albumine, le volume en micro litre de la solution aqueuse 5N de NaOH ajouté à 1 ml de la solution d'albumine est donnée entre parenthèse.
3 dureté de l'hydrogel évaluée manuellement; ± gel visqueux et difficilement manipulable, + gel très viscoélastique, ++ légèrement vitreux, +++ vitreux et ++++ très vitreux, facilement manipulable, friable sous la pression des doigts.
4 poids de l'hydrogel après rinçage de 1 heure dans l'eau distillé contenant 0.02% azoture de sodium comme préservatif. 5 EWC, % eau de l'hydrogel à équilibre= ((poids humide - poids sec théorique)/ poids humide) X 100. Le poids sec théorique correspond aux quantités d'albumine et de NaOH utilisées pour la synthèse de l'hydrogel.
Exemple 2 : Hydrogel autologue humain ou animal.
Suivant le protocole précédemment décrit, l'albumine animale est remplacée par de l'albumine humaine isolée du sang du patient ou de l'animal qui est destinée à recevoir l'hydrogel chirurgicalement. Le volume de sang à prélever sera fonction de la dimension et du nombre d'hydrogels à synthétiser. Pour ce faire, l'albumine est isolée à partir d'un volume de sang fraîchement prélevé selon la méthode de Hao (Hao, Vox. Sang. 36:313-320, 1979), donnée ici à titre d'exemple seulement. Toutes les étapes sont effectuées à une température se situant entre -5 et O0C. En bref, cette méthode consiste en une dilution d'un volume de plasma sanguin par deux volumes d'une solution aqueuse de 0,15 M NaCI, et le pH est ajusté à 5,6 par l'addition d'une quantité d'une solution d'acétate de sodium 0,8M à pH 4.0. Une fois le mélange refroidi, une solution aqueuse d'éthanol à 95% v/v est ajoutée lentement sous agitation jusqu'à l'obtention d'une concentration finale d'éthanol de 42% (v/v). Puis l'agitation est maintenue durant une heure et la solution est centrifugée à 12,000g/1 h. Le pH du surnageant est alors ajusté à 4.8 avec la solution de tampon acétate. La solution est ensuite agitée durant 1 h et est laissée sans agitation pour 3 h. La solution est par la suite centrifugée à 12,000g/1 h. Le précipité est alors récupéré et contient l'albumine. L'albumine est dissoute dans un volume d'eau, et la quantité de protéine est évaluée par l'essai à l'acide bicinchoninique (BCA, Pierce, USA). L'albumine est diluée avec de l'eau stérile à la concentration finale désirée (entre 15 et 20% p/v), puis filtrée sur une membrane de porosité de 0.01 micron afin de la stériliser.
L'hydrogel est obtenu tel que décrit précédemment. De plus, toutes les manipulations sont effectuées de manières à ce que l'hydrogel obtenu soit stérile. Exemple 3 : Implantation d'un hydrogel en position péricarde-épicarde chez le lapin pour la prévention des adhérences post-opératoires
Afin d'évaluer la protection conférée par l'hydrogel contre les adhérences résultant d'une chirurgie cardiaque et pour évaluer la vitesse de résorption in vivo de l'hydrogel, ces derniers seront implantés dans la cavité cardiaque chez le lapin.
Pour ce faire des hydrogels d'une dimension de 25 X 20 X 1 mm sont préparés en mélangeant 150 mg d'albumine de lapin (Sigma, USA) par ml de solution 0.9% NaCI à laquelle est ajoutée 50 ml de NaOH 5.0N et une goutte de bleu de méthylène 1 % pour colorer l'hydrogel. Un fil Ethicon 910 (J&J, USA) a été ajouté préalablement entre les plaques de verres pour permettre au chirurgien de bien fixer l'hydrogel sur l'intérieur du péricarde. Après la synthèse, les hydrogels sont lavés plusieurs fois et conservés dans du NaCI 0.9%. Toutes les solutions sont filtrées sur filtre Millipore 0.2 microns et toutes les manipulations sont effectuées en conditions stériles.
Les lapins sont anesthésiés par l'isoflurane (1 ,5%) après prémédication avec 0,5 mg d'atropine, 0,5 mg/kg de midazolam et 6 mg/kg d'azaperone. Après relaxation musculaire avec 0.2 mg/kg de pancuronium via la voie jugulaire droite, les animaux sont intubes et ventilés mécaniquement. Une dose de 10 mg/kg de fentanyl est administrée en début de chirurgie, puis répétée avec 0,05 mg toutes les 30 minutes. Le lapin est placé en décubitus dorsal. Après rasage et désinfection du thorax une sternotomie médiane et une dissection des divers plans sont faîtes pour atterrir sur le péricarde qui est ouvert. Immédiatement, le péricarde est refermé avec une suture continue de Vicryl/0 (lapin contrôlé) ou bien, il y a mise en place de l'hydrogel d'albumine de lapin, fixation par points sur la paroi interne du péricarde et fermeture. Une hémostase et la fermeture du sternum, du tissu sous-cutané et de la peau est faite. La cicatrice est désinfectée et l'animal est réveillé. Les animaux sont sacrifiés à 1 -2-3-4-5-7-8 semaines, et la section hydrogel/péricarde prélevée pour analyse histologique. L'évaluation histologique consiste en des coupes du tissu d'intérêt préalablement fixé dans une solution de formaldéhyde neutre à 10%, suivie d'une coloration à hématoxyline-éosine. Suivant l'évaluation microscopique, le degré de fibrose et d'inflammation sera classifié selon une échelle de 0 pour absence de fibrose et de 4 lorsqu'il y a présence de cellules granulomateuses, de prolifération cellulaire etc.
Cette série d'expériences a montré qu'après 8 semaines, l'hydrogel est entièrement résorbé, qu'aucune activité inflammatoire n'est retrouvée sur le site d'implantation et que seuls des résidus d'adhésions non significatifs sont observés ça et là.
Les résultats préliminaires de l'étude in vivo, pratiquée chez le lapin, confirment donc les caractères de biocompatibilité, biodégradabilité et limitant le degré de fibrose post-opératoire. Effectivement, il n'y a pas eu de réaction de rejet à l'implantation du gel (biocompatibilité), le matériel s'est dissout en l'espace de 3 à 4 semaines (biodégradabilité) et enfin, le phénomène de protection, limitant, voire éliminant la fibrose post-opératoire, caractère le plus important, a été respecté jusqu'ici.
Exemple 4 : Implantation sous-cutanée d'un hydrogel chez le lapin pour la libération contrôlée de médicaments et la prévention des adhérences postopératoires
Des hydrogels de même composition de précédemment ont été synthétisés avec une dimension finale de 12.5 X 10 X 1.5 mm. Après avoir été lavés en milieu physiologique 0.9% NaCI, les hydrogels sont incubés pour 3 heures soit dans une solution d'ibuprofène 0.5% dans le NaCI 0.9%, dans une solution de 2% de poly(éthylène glycol) de masse moléculaire de 4,000 Da ou simplement dans une solution de 0.9% NaCl. Par la suite, les différents hydrogels sont implantés en sous- cutané en position dorsale chez le lapin.
Après 1 -2-3-4-5-7-8 semaines, les lapins ont été sacrifiés et des coupes histologiques ont été effectuées au niveau des sites d'implantation pour évaluer les adhérences, l'inflammation et la présence de résidus d'hydrogel. Les observations suivantes ont été faites, à savoir que les résultats préliminaires confirment les caractères de bio compatibilité, biodégradabilité et un moindre degré de fibrose post-opératoire en présence des principes actifs dont les hydrogels ont étés imbibés.
Exemple 5 : Vitesse de dissolution de l'hydrogel in vitro
Des hydrogels de différentes compositions en terme de quantité d'albumine et de base ont été préparés et lavés dans un tampon physiologique. Ils ont été incubés séparément dans une solution de tampon physiologique à 370C pour évaluer le temps requis pour les dissolutions complètes à savoir pour déterminer le temps nécessaire à leur résorption par dissolution.
A 8 semaines, il a été observé que les gels se sont délités, ont perdu leur consistance initiale et leur résistance mécanique; de ce fait, il est constaté que la biodégradation est effective in vitro après 8 semaines, ce qui confirme l'intérêt de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Hydrogel physiquement réticulé, hydrophile, gonflable dans l'eau et lentement dissociable en milieu aqueux, qui consiste essentiellement en protéines sanguines d'albumine associées sous forme de gel en milieu basique.
2. Hydrogel selon la revendication 1 , caractérisé par le fait que les protéines sanguines d'albumine sont isolées de plasma ou de sérum d'origine animale ou humaine.
3. Hydrogel selon la revendication 2, caractérisé par le fait que l'albumine d'origine humaine provient d'une banque du sang, est de nature autologue ou est obtenue par génie génétique.
4. Membrane de séparation biorésorbable, caractérisée par le fait qu'elle est formée d'un film de l'hydrogel selon l'une des revendications 1 à 3.
5. Membrane de séparation selon la revendication 4, caractérisée par le fait que l'hydrogel constituant ladite membrane contient une substance thérapeutiquement active.
6. Membrane de séparation selon la revendication 4, caractérisée par le fait qu'elle présente à sa surface des chaînes de monométhoxy- poly(éthylène-glycol) fixées par liaisons covalentes.
7. Utilisation de la membrane de séparation selon la revendication 4 en chirurgie vétérinaire ou humaine.
8. Utilisation de la membrane de séparation selon la revendication 5 pour l'administration contrôlée d'une substance thérapeutiquement active.
9. Procédé de préparation d'un hydrogel selon la revendication 1 , qui consiste à mélanger une solution aqueuse d'albumine protéique avec une base, puis à laisser reposer le mélange jusqu'à la polymérisation des monomolécules d'albumine.
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la solution aqueuse d'albumine est comprise entre 10 et 20% (poids/vol.), que la base est du NaOH 5N et que le rapport entre le NaOH et la solution d'albumine est de 0.5 à 2.0% (poids/vol.), et par le fait que la durée de la polymérisation est comprise entre environ 1 h et 8h.
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