WO2006077038A1 - Verfahren zum einkapseln von sensormolekülen mit einer semipermeablen membran - Google Patents

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WO2006077038A1
WO2006077038A1 PCT/EP2006/000165 EP2006000165W WO2006077038A1 WO 2006077038 A1 WO2006077038 A1 WO 2006077038A1 EP 2006000165 W EP2006000165 W EP 2006000165W WO 2006077038 A1 WO2006077038 A1 WO 2006077038A1
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WO
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membrane
matrix material
molecules
sensor molecules
semipermeable membrane
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PCT/EP2006/000165
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Károly Nagy
Thomas Freese
Andreas Greiner
Phillip Hanefeld
Joachim H. Wendorff
Original Assignee
Ehrfeld Mikrotechnik Bts Gmbh
Philipps-Universität Marburg
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Publication date
Application filed by Ehrfeld Mikrotechnik Bts Gmbh, Philipps-Universität Marburg filed Critical Ehrfeld Mikrotechnik Bts Gmbh
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/5436—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand physically entrapped within the solid phase
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose

Definitions

  • a method for encapsulating sensor molecules wherein the sensor molecules are introduced into a matrix material, then this is divided into defined units, these units are coated with a semi-permeable membrane, then dissolved or degraded the matrix material and selectively removed by the semipermeable membrane and against a fluid medium is exchanged so that the sensor molecules are freely movable within the volume enclosed by the membrane.
  • biomolecules and whole cells plays an important role in many applications of modern biotechnology and medical diagnostics.
  • the general goal is to immobilize the biomolecules (or cells) and to study their specific function under different conditions or to detect their presence.
  • the full functionality of the biomolecules can generally be studied in a freely mobile state, in solution, or the presence in the bound state can be detected and investigated.
  • Another prerequisite for modern technology is the parallel examination of numerous samples, such as e.g. through high-throughput screening.
  • This requirement is met by assigning the different molecules to specific positions in an array. The presence of a particular molecule is then determined by changing the properties of the site (e.g., fluorescence) where the molecules were selectively bound. The identification is thus solved by the localization of the changes in the array.
  • immobilization methods include the inclusion of biomolecules in a semipermeable membrane, according to Biosens. Bioelectron. 8 (1993) page 443, the microencapsulation in polymer microcapsules according to Meth. Enzymol. 44 (1976) page 169 or in hydrogels according to Meth. Enzymol. 135 (1987) page 30.
  • the disadvantage of these methods is that in many cases desorption or leaching of the biomolecules occurs, that it is unsuitable for many biomolecules, that immediate or delayed denaturation can occur, and finally, that the function required free movement in volume can not be adequately secured, see Analyst 121 (1996) 29R.
  • Another method is the incorporation of biomolecules in an inorganic matrix, prepared according to sol-gel method and characterized by a porous structure.
  • the disadvantage of this method is that often the function of the biomolecules is adversely affected by changes in their conformation in the pores, by strong interactions with the pore walls and / or by a hindered rotation in the pores, and that not all biomolecules are accessible, according to Analytica Chimica Acta 461 (2000) pages 1-36.
  • the object of the present invention was therefore to provide a method for the immobilization of biomolecules, which does not have the above disadvantages and further ensures a rapid interaction with the analyte.
  • the method according to the invention does not have the aforementioned disadvantages and thus a simple possibility of encapsulation of sensor molecules, which allows reactions of the entrapped biomolecules with other molecules in freely movable state and makes the positioning of the microcompartments possible. Therefore, the method is particularly suitable, for example, for the production of microarrays.
  • the present invention thus relates to a method for encapsulating sensor molecules, characterized in that the sensor molecules are introduced into a matrix material, this is then divided into defined units, these units are coated with a semipermeable membrane, then dissolved or degraded the matrix material and selectively is removed by the semipermeable membrane and exchanged for a fluid medium, so that the sensor molecules are freely movable within the volume enclosed by the membrane.
  • Sensor molecules in the sense of the invention are all molecules which change in their chemical or physical properties measurably when they come into contact with small molecules that can diffuse through the membrane.
  • the sensor molecules are preferably biomolecules, such as, for example, proteins, peptides, enzymes or amino acids.
  • sensor molecules such as Pfla ⁇ zenlektine and polysaccharides.
  • sensor molecules such as fluorescently labeled Concanavalin A and dextran, which are used for the detection of glucose by fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • matrix materials are preferably polymers which do not render the stored sensor molecules nonfunctional and which can be removed from the system by methods such as washing out or temperature treatment through the membrane and which can be processed well by the methods described.
  • a matrix material is used, which can be brought from the liquid form into a solid form.
  • This is preferably porous silicate or other inorganic matrix or hydrogel or low molecular weight polymer, e.g. For example, polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • a material which is swellable is particularly preferred.
  • the sensor molecules to be immobilized are added to the preferably present in liquid form matrix material and preferably solidified.
  • the division into defined units is preferably carried out in the solid state.
  • the solid matrix material including the sensor molecules, is preferably prepared by cutting and / or milling, or in liquid units, preferably by atomizing into defined units, i. brought into the desired shape and size.
  • matrix material and sensor molecule are processed below the melting point of the matrix material in the solid state and brought into the desired shape. It is also possible that matrix material and sensor molecule is processed above the melting point in a liquid state and brought into the desired shape.
  • matrix material and sensor molecule are processed in the presence of solvents in a liquid state and brought into the desired shape.
  • solvents particularly suitable for this purpose are hydrogels or low molecular weight polymers such as, for example, poly (ethylene glycol) (PEG).
  • matrix material and sensor molecules can likewise be produced by means of conventional methods, for example by screen or mask printing, injection molding methods, embossing methods and / or stamping methods.
  • screen or mask printing for example by screen or mask printing, injection molding methods, embossing methods and / or stamping methods.
  • Matrix material and sensor molecules are preferably arranged in a grid (microarray).
  • the units containing the matrix material and the biomolecules are preferably coated in a subsequent step with a semipermeable membrane which prevents the washing out of the molecules to be immobilized.
  • thermoplastic polymers such as preferably polystyrene, polyurethane, polyurea, polycarbonates,
  • Polycarbonates polylactides, polyglycolides, polysulfones, polyethersulfones, polyesters, polyamides, polyesteramides, polyvinyl chloride, polynorbornene, polyethylene, polypropylene, polybutadiene, polysiloxanes, polyanhydrides, polyacrylates, polymethacrylates, polyethers, polylactide, and / or polycaprolactone, elastic polymers and crosslinked Polymers and especially by gas phase producible polymers, such as Parylene, are used. Furthermore, it can also be prepared from dissolved polymers (for example poly (venyl alcohol)), e.g.
  • aqueous lattices or suspensions of water-insoluble polymers created semipermeable membrane can be used.
  • Also possible is the use of blends, random copolymers, graft or block copolymers, dendrimers and / or highly branched polymers.
  • Also preferred as semipermeable layers is poly (p-xylylene).
  • Matrix material and sensor molecules can also be coated on one side or on all sides with a semipermeable membrane
  • the coating with a semipermeable membrane is preferably carried out
  • polymerization of [2.2] para-cyclophane followed by vapor deposition of the formed 1,4-quinodimethane to form a film of poly-p-xylylene (PPX) is preferred.
  • the permeability of the semipermeable membrane can be adjusted via the layer thickness, via the use of multilayers, via a subsequent grafting or another chemical type of modification. It is also possible to adjust the permeability of the semipermeable membrane via the use of block copolymers, via the use of polyelectrolytes and / or via the use of polymer blends.
  • the matrix material is washed out of the chambers, liquefied or swollen.
  • the chambers can be filled with the desired solution.
  • Particularly suitable as the solution are water, physiological buffer systems, organic solvents such as alcohols, saline solutions (e.g., isotonic saline), isotonic glycerol solutions, serum replacement, plasma substitutes, glucose solutions, nutrient media, and / or supercritical carbon dioxide.
  • analytes can be detected by applying specific reactions and using appropriate analytical methods.
  • the invention also relates to the use of the encapsulated sensor molecules produced by the process according to the invention, e.g. labeled or unlabelled plant lectins / metalloproteins preferably fluorescently labeled concanavalin A and polysaccharides such as dextran, dextran 40, 60 or 70 for the detection of analytes, particularly preferably for the detection of glucose by fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • labeled or unlabelled plant lectins / metalloproteins preferably fluorescently labeled concanavalin A and polysaccharides such as dextran, dextran 40, 60 or 70 for the detection of analytes, particularly preferably for the detection of glucose by fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the detections can be carried out in vitro or in vivo.
  • Fig. 1 is a schematic representation of the concept of the method according to the invention.
  • FIG. 5 Schematic representation of the coating of sensor molecules + matrix material with a semipermeable membrane.
  • FIG. 6 Alternative coating methods: application of sensor molecules + matrix material to a holder coated with semipermeable membrane or foil.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of the concept of erf ⁇ ndungswashen method.
  • a mixture of the solution with sensor molecules (1) and the solid dissolvable matrix material (2) or a solution of the matrix material is first prepared (FIG. 1a).
  • the sample solution (3) is then added e.g. solidified by freeze-drying.
  • the solid samples (4) may e.g. with an extruder (5) and by cutting the extruded mass produced (Fig. Ib) and coated with a semi-permeable membrane with an adjustable cut-off (6) (Fig. Ic).
  • the matrix material is then washed out (FIG. Id).
  • the samples (sensor molecules + matrix material) are placed in a suitable solution (7), wherein the molecules of the matrix material diffuse into the washing solution (8) through the semipermeable membrane (6). After several washes, the capsule is free of matrix material (9) and the sensor molecules remain trapped.
  • matrix materials with other properties are also conceivable.
  • Fig. 2 shows an example for the preparation of the sample (4) shows (sensor matrix material molecules +) ⁇ at low temperatures and positioning on a support (10).
  • This manufacturing method should be used at temperatures lower than the melting point of the sample.
  • the solid sample Substance is pressed out with an extruder (5) and cut with a knife, a laser or a waterjet cut (11).
  • the dimensions of the samples (4) are limited by the exit opening and the feed of the extruder (5).
  • By moving the holder (10), the desired arrangement of the samples (4) can be achieved.
  • the thus positioned samples are coated with a semipermeable membrane (12).
  • the application of the semipermeable membrane is carried out by spin-coating, coating with a film or preferably by vapor deposition (see Figures 5 and 6).
  • the permeability of the membrane envelope is adjusted by the thickness or structure of the membrane so that the molecules 'of the Mairixm ⁇ erialsliurchBiffunlliererrkö ⁇ rie ⁇ ", but not the to be immobilized' molecules.
  • a microarray With various specific samples such a microarray can be produced.
  • the holder 10 is coated with a semipermeable membrane or any film prior to placing the samples (see Fig. 6a), the samples are placed on the membrane and also coated from above with a membrane. As a result, the samples are enclosed in a thin membrane structure (13) without a holder.
  • the sample can also be processed in liquid form, as shown in FIG. 3.
  • the molten sample is collected in a die head (14), e.g. InkJet filled, and held there in liquid form (temperature> melting point). So the sample can be sprayed onto a holder. On the cold holder, the liquid sample is cooled and transferred to the solid state, wherein the solvent also partially evaporated.
  • the sample can be placed on the fixture in a desired pitch and amount.
  • the solid samples are then coated with a semipermeable membrane. As described in Fig. 2 (see also Fig. 6a), the samples can also be applied to a membrane-coated holder whereby, after coating with a cover membrane, the samples are enclosed in a clean membrane structure (13).
  • a polymer strand in viscoelastic form could be applied to a fixture and cut into small pieces after cooling. The samples are then positioned in an array.
  • a layer (15) of desired thickness from the sample substance in solid or molten state to a suitable surface (16).
  • the layer can be cut into small pieces in the solid state.
  • the sample pieces (4) can then be applied to a holder (10) in the desired grid, where they are coated with a semipermeable membrane (12). Similar to FIG. 2 and 3 (see also Fig. 6a), the inclusion of the samples in a pure membrane structure (13) is also possible here.
  • the resulting pattern (array) can then also be further coated.
  • the dimensions of the samples are determined by the application. When applying for microarrays they are in the micrometer range, whereas in biotechnological applications -wo_die amount of biomolecules .ein mentionen a _wichtige_Rolle_spieJt_ (eg, _B ..._ e ⁇ ⁇ ⁇ i? -Beta u ng of enzymes) the dimensions of the samples can be in the centimeter range.
  • the individual working steps of the coating are shown in FIG. 5a.
  • the samples (4) lying on the holder (10) are preferably coated with a semipermeable membrane by vapor deposition. Coating with plastics from solution or melt, coating with a film, spin coating, laser welding or similar conventional methods of encapsulation are also applicable.
  • the molecules (18) preferably polymers, such as [2.2] ⁇ ara-cyclophane escape from a source (17).
  • these reactive molecules spontaneously polymerize to form a membrane (12).
  • a film of poly-p-xylylene (PPX) can be generated.
  • the permeability of the membrane can be adjusted. If the adhesion of the membrane to the surface of the support (matrix structure) is stable (not dissipated by solvent), and a thickness of the membrane meeting the requirements of the material penetration has been achieved, the incorporation of the samples is completed.
  • Stable adhesion can be achieved by selecting a suitable material for the support, or by functionalizing or treating the surface of the support.
  • the membrane can be pulled off the support together with the samples and turned over (Figure 5b), exposing the bottom surface.
  • the exposed surface of the sample-membrane structure can then also be coated (FIG. 5c).
  • the samples (4) can be cut out of the flat membrane ( Figure 5d) and incorporated into a desired structure.
  • FIG. 6 shows an alternative procedure to the method in FIG. 5.
  • the holder (10) is first coated with a membrane (12).
  • This membrane may alternatively have identical or different properties than the membrane that ensures the semipermeability and functionality of the concept.
  • the samples are coated and coated with a semi-permeable membrane, as described in Fig. 5. After removal from the support, the samples are in a free membrane structure (Figure 6c).
  • the samples may also be coated in a floating state by vapor deposition ( Figure 7).
  • the samples (4) are placed on a vibrating table (19) (e.g., vibrator, loudspeaker) and constantly pushed upwards. Due to the statistical orientation, they are coated with the membrane on each side.
  • a vibrating table (19) e.g., vibrator, loudspeaker
  • FIG. 8 Various shapes of individual samples can be made by screen / mask printing ( Figure 8).
  • the mask (20) is placed on a holder (10) and the sample mass lubricated in the mask. After removal of the mask, the sample remains on the holder.
  • Fig. 9 demonstrates the preparation of 3D samples. With a suitable mold (21) it is possible to produce any 3D shapes at lower temperatures. The solid samples can then be coated with the method in FIG. 7 with a semipermeable membrane.
  • the viscous solution was gently de-watered in a desiccator until the mixture solidified.
  • the shaping of the matrix mixture was carried out by three different methods:
  • the matrix mixture in a template with the hole dimensions of 8 mm x 8 mm x 1 mm was formed in a press at 35 0 C for 10 minutes. Subsequently, the resulting solids were cooled to -78 ° C, removed from the template and coated at room temperature with PPX.
  • the matrix mixture was extruded at a flow temperature of 35 0 C and an ejection temperature of 15 0 C. When cooled to 15 ° C., the matrix mixture showed good stiffness and was immediately cut with a blade into pieces of defined dimensions.
  • the pallet thus obtained had a diameter of 1 mm and a thickness of about 50 - 100 microns.
  • the pallets were applied to a previously prepared PPX film and coated with PPX at room temperature. In a final process, the matrix material was liquefied at 35 ° C and applied to a pre-coated PPX glass surface in a defined amount. After solidification at room temperature, it was coated with PPX.
  • the applied PPX layers had a thickness of 1.6 ⁇ m and 2.4 ⁇ m.
  • Vibrating table e.g., speaker

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Abstract

Verfahren zur Einkapselung von Sensormolekülen, wobei die Sensormoleküle in ein Matrixmaterial eingebracht werden, anschließend dieses in definierte Einheiten zerteilt wird, diese Einheiten mit einer semipermeablen Membran überzogen werden, anschließend das Matrixmaterial gelöst oder abgebaut und selektiv durch die semipermeable Membran entfernt und gegen ein fluides Medium ausgetauscht wird, so dass die Sensormoleküle innerhalb des von der Membran umschlossenen Volumens frei beweglich werden aber dennoch immobilisiert in der Membrane vorliegen.

Description

Verfahren zum Einkapseln von Sensormolekfilen mit einer semipermeablen Membran
Verfahren zur Einkapselung von Sensormolekülen, wobei die Sensormoleküle in ein Matrixmaterial eingebracht werden, anschließend dieses in definierte Einheiten zerteilt wird, diese Einheiten mit einer semipermeablen Membran überzogen werden, anschließend das Matrixmaterial gelöst oder abgebaut und selektiv durch die semipermeable Membran entfernt und gegen ein fluides Medium ausgetauscht wird, so dass die Sensormoleküle innerhalb des von der Membran umschlossenen Volumens frei beweglich werden.
Die Einkapselung von Biomolekülen und ganzen Zellen spielt eine wichtige Rolle bei vielen Anwendungen der modernen Biotechnologie und medizinischen Diagnostik. Das allgemeine Ziel ist es, die Biomoleküle (oder Zellen) zu immobilisieren und ihre spezifische Funktion unter verschiedenen Bedingungen zu untersuchen oder ihre Anwesenheit nachzuweisen. Die volle Funktionalität der Biomoleküle kann allgemein in frei beweglichem Zustand, in Lösung untersucht werden, oder die Anwesenheit in gebundenem Zustand kann nachgewiesen und untersucht werden.
Eine weitere Voraussetzung für die moderne Technologie ist die parallele Untersuchung von zahl- reichen Proben, wie z.B. durch Hochdurchsatz-Screening. Diese Voraussetzung wird durch die Zuordnung der unterschiedlichen Moleküle zu bestimmten Positionen in einem Array erfüllt. Die Anwesenheit eines bestimmten Moleküls wird dann durch die Änderung der Eigenschaften der Stelle (z.B. Fluoreszenz), wo die Moleküle selektiv gebunden wurden, ermittelt. Die Identifikation wird also durch die Lokalisierung der Änderungen im Array gelöst.
Um die Targetmoleküle in einem Array fest halten zu können, müssen sie an einer definierten Stelle gebunden werden. Dies könnte durch physikalische Adsorption, wie in hnmobilized Biosystems in Theory and Praktical Applications, Elsevier, Holland, 1983, Seite 129 beschrieben, oder die chemische Bindung gemäß Appl. Biochem. Biotechnol. 41 (1993) 157, an organischen, anorganischen oder polymeren Oberflächen gelöst werden. Durch die Bindung wird der Nachweis, also die Lokalisierung der Analytmoleküle, möglich, jedoch geht die Funktionalität vieler Moleküle zum Teil oder vollständig verloren. So ist die Anwendungsmöglichkeit dieser Technologie begrenzt.
Weitere Methoden zur Immobilisierung ist der Einschluss der Biomoleküle in eine semipermeable Membranen, gemäß Biosens. Bioelectron. 8 (1993) Seite 443, die Mikroemkapselung in Polymer- mikrokapseln gemäß Meth. Enzymol. 44 (1976) Seite 169 oder in Hydrogelen gemäß Meth. Enzymol. 135 (1987) Seite 30. Der Nachteil dieser Methoden ist, dass im Einsatz in vielen Fällen eine Desorption bzw. eine Auswaschung der Biomoleküle auftritt, dass sie für viele Biomoleküle nicht geeignet ist, dass eine sofortige oder zeitlich verzögerte Denaturierung auftreten kann, sowie schließlich, dass die für die Funktion erforderliche freie Bewegung im Volumen nicht ausreichend gesichert werden kann, siehe Analyst 121 (1996) 29R.
Eine weitere Methode ist die Einlagerung der Biomoleküle in einer anorganischen Matrix, hergestellt gemäß Sol-Gel-Verfahren und gekennzeichnet durch eine poröse Struktur. Der Nachteil dieser Methode ist, dass häufig die Funktion der Biomoleküle durch Veränderungen ihrer Konfor- "mation "in den "Poren, durch starke Wechselwirkungen -mit -den Porenwänden und/oder durch -eine behinderte Rotation in den Poren, negativ beeinflusst wird und dass nicht alle Biomoleküle zugänglich sind, gemäß Analytica Chimica Acta 461 (2000) Seiten 1-36.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Immobilisierung von Biomolekülen, das die obigen Nachteile nicht aufweist und des Weiteren eine schnelle Wechselwirkung mit dem Analyten gewährleistet.
Es wurde nun gefunden, dass das erfindungsgemäße Verfahren die zuvor genannten Nachteile nicht aufweist und somit eine einfache Möglichkeit der Einkapselung von Sensormolekülen, die Reaktionen der eingeschlossenen Biomoleküle mit anderen Molekülen in frei beweglichem Zustand ermöglicht und die Positionierung der Mikrokammern möglich macht. Daher ist das Verfahren beispielsweise für die Herstellung von Microarrays besonders geeignet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Einkapselung von Sensormolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensormoleküle in ein Matrixmaterial eingebracht werden, anschließend dieses in definierte Einheiten zerteilt wird, diese Einheiten mit einer semipermeablen Membran überzogen werden, anschließend das Matrixmaterial gelöst oder abgebaut und selektiv durch die semipermeable Membran entfernt und gegen ein fluides Medium ausge- tauscht wird, so dass die Sensormoleküle innerhalb des von der Membran umschlossenen Volumens frei beweglich werden.
Sensormoleküle im Sinne der Erfindung sind alle Moleküle, die sich in ihren chemischen oder physikalischen Eigenschaften in messbarer Weise ändern, wenn sie mit kleinen Molekülen, die durch die Membran hindurch diffundieren können, in Kontakt kommen.
Bei den Sensormolekülen handelt es sich dabei vorzugsweise um Biomoleküle, wie beispielsweise Proteine, Peptide, Enzyme oder Aminosäuren. Bevorzugt sind Sensormoleküle wie z.B. Pflaαzenlektine und Polysaccharide. Besonders bevorzugt sind Sensormoleküle wie z.B. fluoreszenzmarkiertes Concanavalin A und Dextran, die zum Nachweis von Glukose durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) eingesetzt werden. Auch andere Markierungen wie z.B. radioaktive Markierung sind denkbar.
Matrixmaterialien im Sinne der Erfindung sind vorzugsweise Polymere, die die eingelagerten Sensormoleküle nicht funktionsuntüchtig machen und die durch Methoden wie Auswaschen oder Temperaturbehandlung durch die Membrane aus dem System entfernt werden können und die gut nach den beschriebenen Methoden verarbeitet werden können.
Besonders bevorzugt wird dabei ein Matrixmaterial eingesetzt, das aus der flüssigen Form in eine feste Form gebracht werden kann. Dies ist vorzugsweise poröses Silikat oder eine andere anorganische Matrix oder ein Hydrogel oder niedermolekulares Polymer, z. B. Polyethylenglycol (PEG). Ganz besonders bevorzugt ist ein Material, das quellbar ist. Die zu immobilisierenden Sensormoleküle werden zum vorzugsweise in flüssiger Form vorliegenden Matrixmaterial zugemischt und vorzugsweise verfestigt.
Das Zerteilen in definierte Einheiten erfolgt dabei vorzugsweise im festen Zustand.
Dieser kann beispielsweise durch Gefriertrocknung erreicht werden oder durch Temperaturbehandlung im allgemeinen, wie z.B. durch schmelzen.
Das feste Matrixmaterial einschließlich der Sensormoleküle wird vorzugsweise durch Schneiden und/oder Mahlen oder bei flüssigen Einheiten bevorzugt durch Verdüsen in definierte Einheiten, d.h. in die gewünschte Form und Größe gebracht.
Vorzugsweise werden Matrixmaterial und Sensormolekül unterhalb des Schmelzpunktes des Matrixmaterials in festem Zustand bearbeitet und in die gewünschte Form gebracht. Ebenfalls möglich ist, dass Matrixmaterial und Sensormolekül oberhalb des Schmelzpunktes in flüssigen Zustand bearbeitet und in die gewünschte Form gebracht wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Matrixmaterial und Sensormolekül in Gegenwart von Lösungsmitteln in flüssigen Zustand bearbeitet und in die gewünschte Form gebracht. Hierfür eignen sich besonders Hydrogele oder niedrigmolekulare Polymere wie zum Beispiel Poly(ethylenglycol) (PEG).
Matrixmaterial und Sensormoleküle können jedoch ebenfalls mittels gängiger Verfahren, wie z.B. durch Sieb- oder Maskendruck, Spritzgussverfahren, Prägeverfahren und/oder Stempelverfahren hergestellt werden. - A -
Matrixmaterial und Sensormoleküle werden dabei vorzugsweise in einem Raster (Microarray) angeordnet.
Die Einheiten, die das Matrixmaterial und die Biomoleküle enthalten, werden vorzugsweise in einem anschließenden Schritt mit einer semipermeablen Membran beschichtet, die das Aus- waschen der zu immobilisierenden Moleküle verhindert.
Als semipermeable Membran können alle gängigen Polymere, wie u.a. thermoplastische Polymere, wie vorzugsweise Polystyrol, Polyurethan, Polyharnstoff, Polycarbonate,
Polycarbonate, Polylaktide, Polyglykolide, Polysulfone, Polyethersulfone, Polyester, Polyamide, Polyesteramide, Polyvinylchlorid, Polynorbornen, Polyethylen, Polypropylen Polybutadien, PoIy- siloxane, Polyanhydride, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polyether, Polylactid, und/oder PoIy- caprolacton, elastische Polymere sowie quervernetzte Polymere und besonders durch Gasphasen- abscheidung herstellbare Polymere, wie zum Beispiel Parylene, eingesetzt werden. Es können weiterhin auch aus gelösten Polymeren (zum Beispiel Poly(venylalkohol)), wie z.B. durch Abscheidung von wässrigen Lattices oder aus Suspensionen wasserunlöslicher Polymere, erstellte semipermeable Membran eingesetzt werden. Ebenfalls möglich ist der Einsatz von Blends, statistischen Copolymeren, Pfropf- oder Blockcopolymeren, Dendrimeren und/oder hochverzweigte Polymere.
Besonders bevorzugt werden alle handelsüblichen Parylene oder deren Mischungen gemäß der nachfolgenden Formel eingesetzt.
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Parylene-HT ????
Figure imgf000006_0001
Parylene-C
Ä.ParyleneJD .
Ebenfalls bevorzugt als semipermeable Schichten ist Poly(p-xylylene).
Matrixmaterial und Sensormoleküle können zudem einseitig oder allseitig mit einer semipermeablen Membran beschichtet werden
Die Beschichtung mit einer semipermeablen Membran erfolgt dabei vorzugsweise
über Tauchen, Sprühen, Spincoating und/oder Gasphasenabscheidung.
Im Fall der Gasphasenabscheidung ist die Polymerisation von [2.2]para-Cyclophan und anschließender Gasphasenabscheidung des gebildeten 1,4-Quinodimethans zur Bildung eines Films von Poly-p-xylylen (PPX) bevorzugt.
Die Durchlässigkeit der semipermablen Membran kann dabei über die Schichtdicke, über die Verwendung von Multischichten, über eine anschließende Propfung oder eine andere chemische Art der Modifizierung eingestellt werden. Ebenfalls möglich ist die Einstellung der Durchlässigkeit der semipermablen Membran über die Verwendung von Blockcopolymeren, über die Verwendung von Polyelektrolyten und/oder über die Verwendung von Polymerblends.
Nach dem Aufbringen der semipermeablen Membran wird das Matrixmaterial aus den Kammern ausgewaschen, verflüssigt bzw. gequollen. Die Kammern können mit der gewünschten Lösung aufgefüllt werden. Besonders geeignet sind als Lösung Wasser, physiologische Puffersysteme, organische Lösungsmittel, wie Alkohole, Salzlösungen (z.B. isotonische Kochsalzlösung), isotonische Glycerollösungen, Serumersatz, Plasmaersatz, Glucoselösungen, Nährmedien und/oder überkritisches Kohlendioxid.
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass a) beliebige Biomoleküle eingesetzt werden können,
b) durch die semipermeable Membran Ionen und kleinere Moleküle in die Kammern diffundieren und dort mit den eingeschlossenen Molekülen in Wechselwirkung treten können.
c) durch das Anwenden spezifischer Reaktionen und den Einsatz dafür passender analy- tischer Methoden Analyten nachgewiesen werden können und
d) durch Anwendung verschiedener Reagenzien und Bildung einer Matrixstruktur (Micro- array) gleichzeitig zahlreiche verschiedene Analyten nachgewiesen werden können.
Gegenstand der Erfindung ist zudem die Verwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten eingekapselten Sensormoleküle, z.B. markierte oder unmarkierte Pflanzen- lektine/Metalloproteine vorzugsweise fluoreszenzmarkiertes Concanavalin A und Polysaccharide wie beispielsweise Dextran, Dextran 40, 60 oder 70 zur Detektion von Analyten, besonders bevorzugt zum Nachweis von Glukose durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET).
Die Nachweise können dabei in vitro oder in vivo durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Darstellungen im Einzelnen ver- deutlicht. Diese Darstellungen sind nur beispielhaft und sollten nicht als Einschränkung der technischen Ausführungsform oder der verwendeten Materialien aufgefasst werden.
Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des Konzeptes des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Fig. 2 Herstellung der Proben (4) (Sensormoleküle + Matrixmaterial) bei tiefen Temperaturen und Positionierung auf eine Halterung (10).
Fig. 3 Herstellung der Proben (4) (Sensormoleküle + Matrixmaterial) bei höheren
Temperaturen und Positionierung auf eine Halterung (10).
Fig. 4 Herstellung von festen Einheiten aus Sensormolekülen + Matrixmaterial und
Verteilung auf einer Halterung für die Beschichtung mit einer semipermeablen Membran.
Fig. 5 Schematische Darstellung der Beschichtung von Sensormolekülen + Matrixmaterial mit einer semipermeablen Membran. Fig. 6 Alternative Beschichtungsverfahren: Auftragung von Sensormolekülen + Matrixmaterial auf eine mit semipermeabeler Membran oder Folie beschichteten Halterung.
Fig. 7 Beschichtung von Sensormoleküle + Matrixmaterial im schwebenden Zustand.
Fig. 8 Aufbringen der semipermeablen Membran mit Sieb-/Maskendruck.
Fig. 9 Herstellung von 3D-Proben (4) mit (Mikro-)Spritzguss.
Fig.10 Nachweis der Freisetzung von Farbstoff in die Waschlösung durch Detektion des spezifischen Fluoreszenzsignals und Nachweis der Hinderung der Freisetzung des Proteins durch Messung der Fluoreszenzänderung gegen die Zeit
Die Funktionsweise des erfϊndungsgemäßen Verfahrens wird in folgender Weise näher beschrieben, ohne dabei limitierend zu wirken:
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Konzeptes des erfϊndungsgemäßen Verfahrens. Eine Mischung der Lösung mit Sensormolekülen (1) und des festen auflösbaren Matrixmaterials (2) oder einer Lösung des Matrixmaterials wird zunächst vorbereitet (Fig. Ia). Die Probenlösung (3) wird anschließend z.B. durch Gefriertrocknung verfestigt. Die festen Proben (4) können z.B. mit einem Extruder (5) und durch Schneiden der extrudierten Masse hergestellt (Fig. Ib) und mit einer semipermeablen Membran mit einem einstellbaren cut-off (6) beschichtet werden (Fig. Ic). Das Matrixmaterial wird anschließend ausgewaschen (Fig. Id). Die Proben (Sensormoleküle + Matrixmaterial) werden in eine geeignete Lösung (7) gesetzt, wobei die Moleküle des Matrixmaterials in die Waschlösung (8) durch die semipermeable Membran (6) diffundieren. Nach mehrmaligen Waschvorgängen ist die Kapsel frei vom Matrixmaterial (9) und die Sensormoleküle bleiben eingeschlossen.
Die Anwendung von Matrixmaterialien mit anderen Eigenschaften ist ebenfalls vorstellbar. A) Falls die Moleküle des Matrixmaterials durch die semipermeable Membran nicht diffundieren können, sollen sie in dem von der Membran umschlossenen Volumen durch ein chemisches Verfahren zerlegt werden, um die Diffusion der Matrixfragmente ermöglichen. B) Matrixmaterialien mit großen Molekülen können aber auch nach Auflösung in den Kammern bleiben, wenn sie die vorgesehenen Reaktionen der Biomoleküle nicht beeinflussen.
Fig. 2 zeigt ein Beispiel für die Herstellung der Proben (4) (Sensormoleküle + Matrixmaterial) bei ■ tiefen Temperaturen und Positionierung auf eine Halterung (10). Dieses Herstellungsverfahren soll bei tieferen Temperaturen als dem Schmelzpunkt der Probe verwendet werden. Die feste Proben- substanz wird mit einem Extruder (5) heraus gepresst und mit einem Messer, einem Laser oder per Wasserstrahlschnitt (11) klein geschnitten. Die Dimensionen der Proben (4) werden durch die Ausgangsöffhung und den Vorschub des Extruders (5) begrenzt. Durch Bewegung der Halterung (10) kann die gewünschte Anordnung der Proben (4) erreicht werden. Die so positionierten Proben werden mit einer semipermeablen Membran (12) beschichtet.
Das Aufbringen der semipermeablen Membran erfolgt durch Spincoating, Überziehen mit einer Folie oder vorzugsweise durch Gasphasenabscheidung (s. Fig. 5 und 6). Die Permeabilität der Membranhülle wird durch die Dicke bzw. Struktur der Membran so eingestellt, dass die Moleküle "des Mairixm^erialsliurchBiffunlliererrköήrieή", nicht aber die zu immobilisierenden'Moleküle.
Mit verschiedenen spezifischen Proben kann so ein Microarray hergestellt werden. Alternativ, wenn die Halterung 10 vor das Aufsetzen der Proben mit einer semipermeablen Membran oder beliebigen Folie beschichtet wird (s. Fig. 6a), werden die Proben auf die Membran gesetzt und von oben ebenfalls mit einer Membran beschichtet. Dadurch werden die Proben in eine dünne Membranstruktur (13) ohne Halterung eingeschlossen.
Die Probe kann zunächst in flüssiger Form ebenfalls bearbeitet werden, wie dieses in Fig. 3 darstellt ist. Die geschmolzene Probe wird in einem Düsenkopf (14), z.B. InkJet gefüllt, und dort in flüssiger Form gehalten (Temperatur > Schmelzpunkt). So kann die Probe auf eine Halterung aufgespritzt werden. Auf der kalten Halterung wird die flüssige Probe abgekühlt und in den festen Zustand überführt, wobei auch das Lösungsmittel teilweise verdampft. Die Probe kann in einem gewünschten Raster und einer gewünschten Menge auf die Halterung gebracht werden. Die festen Proben werden anschließend mit einer semipermeablen Membran beschichtet. Wie in Fig. 2 beschrieben (s. auch Fig. 6a), können die Proben auf eine mit Membran beschichtete Halterung ebenfalls aufgetragen werden, wodurch, nach dem Überziehen mit einer Deckmembran, die Proben in einer reinen Membranstruktur (13) eingeschlossen werden.
Die Kombination der Methoden in Fig. 2 und 3 ebenfalls vorstellbar. Zum Beispiel, könnte ein Polymerstrang in viskoelastischer Form auf eine Halterung aufgetragen werden und nach Abkühlung in kleine Stücke geschnitten werden. Die Proben werden anschließend in ein Array positioniert.
Wie in Fig. 4 dargestellt ist es ebenfalls vorstellbar, eine Schicht (15) mit gewünschter Dicke aus der Probensubstanz in festem oder in geschmolzenem Zustand auf eine geeignete Oberfläche (16) aufzutragen. Hier kann die Schicht im festen Zustand in kleine Stücke geschnitten werden. Die Probenstücke (4) können anschließend auf eine Halterung (10) in gewünschten Raster aufgetragen werden, wo sie mit einer semipermeablen Membran (12) beschichtet werden. Ähnlich wie in Fig. 2 und 3 (s. auch Fig. 6a), ist hier die Einschließung der Proben in eine reine Membranstruktur (13) ebenfalls möglich.
Ebenfalls möglich ist eine Erstellung einer Platte des Trägermediums (Matrix) und eine spätere Formgebung durch lithographische oder stempeltechnische Verfahren. Das so entstehend Muster (Array) kann dann ebenfalls weiter beschichtet werden.
Die Dimensionen der Proben werden durch die Anwendung festgelegt. Bei der Anwendung für Microarrays liegen sie in Mikrometer-Bereich, wohingegen bei biotechnologischen Anwendungen, -wo_die Menge der .eingeschlossenen Biomoleküle eine _wichtige_Rolle_spieJt_(z,_B..._E^§^i?-ßung von Enzymen) die Dimensionen der Proben im Zentimeter-Bereich liegen können.
Die einzelnen Arbeitsschritte der Beschichtung sind in Fig. 5a dargestellt. Die auf der Halterung (10) liegenden Proben (4) werden vorzugsweise durch Gasphasenabscheidung mit einer semipermeablen Membran beschichtet. Beschichten mit Kunststoffen aus Lösung oder Schmelze, überziehen mit einer Folie, Spincoating, Laserschweißen oder für die Einkapselung übliche ähnliche Methoden sind ebenfalls anwendbar. Bei Gasphasenabscheidung treten die Moleküle (18) (vorzugsweise Polymere, wie [2.2]ρara-Cyclophan aus einer Quelle (17) aus. An festen Oberflächen (auf Halterung und Proben) polymerisieren diese reaktiven Moleküle spontan zu Polymeren und bilden eine Membran (12). So kann durch Pyrolyse von [2.2]para-Cyclophan und anschließender Gasphasenabscheidung des gebildeten 1,4-Quinodimethans ein Film von Poly-p- xylylen (PPX) erzeugt werden.
Durch die Abscheidungsdauer und damit die Schichtdicke und -morphologie sowie die Wahl des Monomers kann die Permeabilität der Membran eingestellt werden. Wenn die Haftung der Membran zur Oberfläche der Halterung (Matrixstruktur) stabil ist (wird durch Lösungsmittel nicht abgelöst), und eine den Anforderungen der Stoffdurchdringung entsprechende Dicke der Membran erreicht worden ist, ist der Einbau der Proben abgeschlossen.
Eine stabile Haftung kann durch die Auswahl eines geeigneten Materials für die Halterung, oder durch Funktionalisierung oder Behandlung der Oberfläche der Halterung erreicht werden.
Wenn eine stabile Haftung zwischen Membran und Halterung nicht erreichbar ist, oder eine halterungsfreie Struktur hergestellt werden soll, kann die Membran zusammen mit den Proben von der Halterung abgezogen und umgedreht werden (Fig. 5b), wodurch die untere Oberfläche freigelegt wird. Die freigelegte Oberfläche der Proben-Membran-Struktur kann denn ebenfalls beschichtet werden (Fig. 5c). Für spezielle Anwendung können die Proben (4) aus der Flachmembran ausgeschnitten werden (Fig. 5d) und in eine gewünschte Struktur eingebaut werden.
Fig. 6 zeigt eine alternative Vorgehensweise zum Verfahren in Fig. 5. Hier wird die Halterung (10) zunächst mit einer Membran (12) beschichtet. Diese Membran kann alternativ identische oder unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, als die Membran, die die Semipermeabilität und Funktionalität des Konzeptes sichert.
Auf die mit Membran beschichtete Halterung ((10), Fig. 6b) werden die Proben aufgetragen und -mit-emer-semipermeablen Membran,_wie inFig._5.beschrieben,_beschichtet.JNach Abtrejinung von der Halterung liegen die Proben in einer freien Membranstruktur vor (Fig. 6c).
Wenn die Anordnung der Proben in ein Array nicht gewünscht ist, können die Proben in schwebenden Zustand ebenfalls durch Gasphasenabscheidung beschichtet werden (Fig. 7). Hier werden die Proben (4) auf einen vibrierenden Tisch (19) (z.B. Rüttler, Lautsprecher) gelegt und ständig nach oben gestoßen. Durch die statistische Orientierung werden sie mit der Membran auf jeder Seite beschichtet.
Ebenfalls möglich ist eine freie Beschichtung von Proben in einer sich drehenden Trommel oder einem ähnlich funktionellen Aufbau, in dem die Proben statistisch orientiert werden und somit von allen Seiten für eine Beschichtung zugänglich sind.
Verschiedene Formen von individuellen Proben können mit der Sieb-/Maskendruck hergestellt werden (Fig. 8). Die Maske (20) wird auf eine Halterung (10) aufgelegt und die Probenmasse in die Maske geschmiert. Nach Entfernung der Maske bleibt die Probe auf der Halterung.
Fig. 9 demonstriert die Herstellung von 3D-Proben. Mit geeigneter Gießform (21) ist es möglich beliebige 3D-Formen bei tieferen Temperaturen herzustellen. Die festen Proben können anschließend mit der Methode in Fig. 7, mit einer semipermeablen Membran beschichtet werden.
Erfindungsgemäßes Ausfuhrungsbeispiel:
Eingesetzte Substanzen
• Poly(ethylenglycol) PEO mit Mw = 1500 g/mol (PEOl 500) und 2000 g/mol (PEO2000) von Fluka;
• Concanavalin A Lösung in wässrigem Puffer;
• Handelsübliches Dextran 40 Lösung in wässrigem Puffer;
• Poly(p-xylylen), abgeschieden durch CVD3 Monomer von Specialty Coating Systems (PPX);
• PBS= phosphatgepufferte Salzlösung (phosphat buffered saline)
Praktische Durchführung
Zur Erstellung des Matrixmaterials wurden 2,1 g PEO2000 und 1,4 g PEO1500 in 5 ml Farbstoff- und Enzymlösung gegeben und darin gelöst. Als fluoreszenzmarkiertes Enzym diente Concanavalin A und als Farbstoff wurde Dextran 40 verwendet. Das entspricht einer gesättigten Lösung von Polymer in Pufferlösung (ca. 41 Gw%).
Um die Mischung zu Verfestigen, wurde der zähflüssige Lösung in einem Exikkator schonend Wasser entzogen, bis sich das Gemisch verfestigte.
Die Formgebung der Matrixmischung erfolgte mit drei verschiedenen Methoden:
Zum einen wurde die Matrixmischung in einem Templat mit den Lochmaßen 8 mm x 8 mm x 1 mm bei 350C für 10 Minuten in einer Presse geformt. Anschließend wurden die erhaltenen Festkörper auf -78°C abgekühlt, aus dem Templat entfernt und bei Raumtemperatur mit PPX beschichtet.
Zum anderen wurde ein Extruder mit zwei Temperaturzonen verwendet. Die Matrixmischung wurde mit einer Flusstemperatur von 350C und einer Auswurftemperatur von 150C extrudiert. Bei der Abkühlung auf 150C zeigte die Matrixmischung eine gute Steifheit und wurde sofort mit einer Klinge in Stücke definierter Dimensionen zerteilt. Die so erhaltenen Palette hatten einen Durchmesser von 1 mm und eine Dicke von ca. 50 - 100 μm. Die Paletts wurden auf einen zuvor erstellten PPX-FiIm aufgebracht und bei Raumtemperatur mit PPX beschichtet. In einem letzten Verfahren wurde das Matrixmaterial bei 35°C verflüssigt und auf eine mit PPX vorbeschichtete Glasoberfläche in definierter Menge aufgetragen. Nach der Verfestigung bei Raumtemperatur wurde mit PPX beschichtet.
Die aufgebrachten PPX - Schichten hatten eine Dicke von 1,6 μm und 2,4 μm.
Ergebnisse
Die erstellten Proben wurden in PBS - Lösung eingelegt und das Vorhandensein des Proteins und des Farbstoffes in der Waschlösung detektiert. Es zeigte sich, dass das PEO und der Farbstoff aus den Proben austraten und das Protein zum größten Teil im inneren der Probe verblieb (siehe Fig. 10). In Figur 10, in der die Intensität von 0 bis 800 a.u. gegen die Zeit von 0 bis 80 Minuten aufgetragen ist, stellt die untere mit Punkten versehene Kurve das Protein und die obere mit Rechtecken markierte stellt Kurve den Farbstoff dar.
Was ist a.u. ?????????
Es wurde bis zu 75 Minuten gewaschen. Das in den Proben verbliebene Protein entfaltete dort seine uneingeschränkte seine Wirkung.
Bezugszeichenliste:
1 Lösung mit Biomolekülen
2 Trägermedium
3 Probenflüssigkeit (Trägersubstanz+Biomoleküle)
4 Probe
5 Extruder
6 Semipermeable Membran
7 Waschlösung
8 "Waschlösung mit Trägersubstanz
9 Lösung mit eingekapselten Biomolekülen
10 Halterung
11 Messer
12 Semipermeable Membran
13 Proben eingeschlossen in Membran
14 Düsenkopf
15 Probenschicht
16 Halterung fürs Schneiden
17 Quelle der Membranmoleküle
18 Membranmoleküle in Gasphase
19 Vibrierender Tisch (z.B. Lautsprecher)
20 Sieb/Maske
21 Gießform

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Einkapselung von Sensormolekülen, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensormoleküle in ein Matrixmaterial eingebracht werden,
anschließend dieses in definierte Einheiten zerteilt wird,
diese Einheiten mit einer semipermeablen Membran überzogen werden, anschließend das
Matrixmaterial gelöst oder abgebaut und selektiv durch die semipermeable Membran entfernt und gegen ein fluides Medium ausgetauscht wird, so dass die Sensormoleküle innerhalb des von der Membran umschlossenen Volumens trei beweglich werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Sensormolekül Proteine, Enzyme und / oder Polysaccharide eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Sensormolekül fluoreszenzmarkiertes Concanavalin A und Dextran eingesetzt wird.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3 dadurch gekennzeichnet, dass als semipermeable Membran Polystyrol, Polyurethan, Polyharnstoff, Polycarbonate, PoIy- carbonate, Polylaktide, Polyglykolide, Polysulfone, Polyethersulfone, Polyester, Polyamide, Polyesteramide, Polyvinylchlorid, Polynorbornen, Polyethylen, Polypropylen Polybutadien, Polysiloxane, Polyanhydride, Polyacrylate, Polymethacrylate, Polyether, Polylactid, und/ oder Polycaprolacton, Blends, statistische Copolymere, Pfropf- oder Blockcopolymere, Dendrimere, oder hochverzweigte Polymere eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die semipermeable Polymerschicht durch Gasphasenabscheidung, durch Plasmabe- schichtung, durch Spincoating, durch Dipcoating oder durch Sprühcoating aufgebracht wird.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Entfernung des Matrixmaterials durch Extraktion mit Wasser, organischen Lösungsmitteln oder überkritischen Kohlendioxid erfolgt.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Matrixmaterial und Sensormolekül unterhalb oder oberhalb des Schmelzpunktes der Probe oder mittels Sieb- oder Maskendruck oder Spritzguss bearbeitet werden.
8. Verwendung der gemäß dem Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7 eingekapselten Sensormoleküle zur Detektion von Analyten invitro oder invivo.
9. Verwendung von gemäß Anspruch 1 eingekapseltem fluoreszenzmarkiertem Concanavalin A und Dextran zum Nachweis von Glukose mittels Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET).
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