WO2006067862A1

WO2006067862A1 - 活性物質ｋ０３−０１３２及びその製造法

Info

Publication number: WO2006067862A1
Application number: PCT/JP2004/019720
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Tomoda; Yoko Takahashi; Satoshi Omura
Original assignee: The Kitasato Institute
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2006-06-29

Abstract

ストレプトマイセス　エスピー(Streptomyces　sp.)に属し、活性物質K03-0132A及び/又はK03-0132Bを生産する能力を有する微生物(Streptomyces　sp.　K03-0132、FERM　ABP-10148)を培地で培養し、培養物中に活性物質K03-0132A及び/又はK03-0132Bを蓄積せしめ、該培養物から活性物質K03-0132A及び/又はK03-0132Bを採取する。得られた活性物質は、アゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有することから、深在性真菌症をはじめとする多くの真菌感染症に対して、低濃度、短期間で作用し、耐性菌出現頻度の低減に有用である。また、耐性克服に対する有用性が期待される。

Description

明細書活性物質 K 03 - 0 1 32及びその製造法技術分野

本発明は、ァゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有する活性物質 Κ 03 - 0 1 32及びその製造法に関する。本活性物質 Κ 03 - 0 1 32は活性物質 Κ 03 - 0 1 32 Α及びノ又は活性物質 Κ 03 - 0 1 32 Bを総称したものである。背景技術

真菌感染症、特に深在性真菌症の治療に用いられるァゾール系化合物としては、例えば 1— [2— (2, 4-d i ch l o r ob en zy l oxy) - 2 - (2， 4-d i ch l o r ophe ny l) e t hy l] imi da z o l e ( 一般名：ミコナゾール、シグマ社製、米国）、 2, 4— d i f l u o r o—ひ， α - b i s ( 1 H - 1 , 2, 4— t r i a z o l— l _y lme t hy l) b e n z y 1 a l c oho l (一般名：フルコナゾ一ル、アイシーェヌファーマス —ティカルズ社製、米国）、および（土） — 1— s e c— bu t y l— 4— [p 一 [4— [p - [ [ (2R， 4 S) - 2 - (2, 4-d i ch l o r oph en y 1 ) - 2 - ( 1 H- 1 , 2, 4— t r i a z o 1— 1— y 1 m e t h y 1 ) - 1, 3-d i oxo l an-4-y l] me t hoxy] phen l] — 1— p i p e r a z i ny l] pheny l] —厶 ² — 1, 2， 4— t r i a z o l i η- 5-on e (一般名：ィトラコナゾール、協和発酵社製、日本国）等が知られていた。

これらのァゾール系化合物ミコナゾール、フルコナゾ一ルおよびイトラコナゾールは、同疾患に用いられるポリェン系のアムホテリシン B等と比較して安全性が高く（An a i s s i e E. 5, クリニカルインフエクシァスデイジーズ， 23巻、 964— 972、 1 996年）、最も高頻度に使用されている薬剤である。しかしながら最近、これらァゾール系抗菌剤の長期間または反復投与による耐性菌の出現が問題となっており、安全性が高く、耐性菌の出現頻度の低レ、薬剤の開発が社会的急務とされている。

発明の開示

H I V感染や血液疾患など、免疫力の低下を伴う疾患では易感染状態が惹起され、日和見感染症として真菌感染症の発生頻度が増加する。またこれら免疫力低下を伴う疾患の多くは重篤で治療期間も長期にわたる。このため、真菌感染症の化学療法も長期間におよぶ場合が多く、現在最も高頻度に使用されているァゾール系抗真菌剤は薬剤耐性の誘導が極めて起こりやすい状態と考えられる。

ァゾ一ル系抗真菌剤に対する耐性機構としては、 Cand i da a 1 b i c an sにおいて標的酵素である P— 450 1 4— —デメチラ一ゼの過剰発現ゃァミノ酸変異による薬剤との親和性の低下（Vand en Bo s s che H. ら、アンチミクロビアル ·ェイジェントアンドケモセラピー、 36巻、 2602— 26 1 0頁、 1 992年； Sang l a r d D. ら、アンチミク口ビアル，ェイジェントアンドケモセラピ一、 42巻、 24 1— 253頁、 1 998年）、 MSF (Ma j o r Fa c i l i a t o r Sup e r f am i 1 y) や ABC (ATP B i nd i ng Ca s s e t t e) などの多剤排出トランスポー夕による細胞内薬剤濃度の低下（F i ng M. F. ら、 Mo l Gen Ge n e t、 227巻、 3 1 8— 329頁、 1 995年； Sang l a r d D. ら、ミクロビオロジ一、 1 4巻、 405— 4 1 6、 1 997年）が、 Sa c c ha r omyc e s c e r ev i s i a eでは、 MD R (Ma丄 t i p 1 e Dr ug R e s i s t a n t ) 遺伝子である P D R 1 6、 P D R 1 7により脂質代謝を変化させ、ァゾール系化合物に対する耐性を獲得していることが報告されている（H. Ba r t van d en Ha z e lら、ジャーナル 'ォブ ·バイオロジカルケミストリー、 274巻、 1 934— 1 94 1、 1 9 9 9年）。

これらのことから、ァゾ一ル系抗真菌剤の活性を上昇させる薬剤は、ァゾ一ル系抗真菌剤の投与量を減量し、投与期間を短縮させることにより耐性菌出現の頻度を低減させることが期待される。また同時に、骨格の異なる 2つの薬剤を併用することにより、ァゾ一ル系抗真菌剤に対する耐性を克服することが期待されかかる実情において、ァゾ一ル系抗真菌剤の活性増強作用を有する薬剤を提供することは、深在性真菌症をはじめとする多くの真菌感染症やァゾ一ル耐性真菌感染症の治療上有用であると考えられる。，

本発明者らは、微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、新たに土壌から分離した K 03— 0132菌株の培養物中に、ァゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有する物質が産生されることを見い出した。次いで、該培養物から活性物質を分離、精製した結果、後記の式 [I] 及び/又は [I] で示される化学構造を有する物質を見い出した。これらの式 [I]及び [I] で示される物質は従来まったく知られていないことから、本活性物質を K03— 01 32 A及び K 03 - 0132 Bと称することとし、その総称を活性物質 K 03-01 32と称することにした。

本発明はかかる知見にもとづいて完成されたものであって、下記式 [I]

で表される活性物質 K 03 - 01 32 Aを提供するものである。

本発明はまた下記式 [I]

で表される活性物質 K 03 - 01 32 Bを提供するものである,

本発明は更にまた下記式 [I]

で表される活性物質 K O 3— 0 1 32Α、及び下記式 [H]

で表される活性物質 Κ 0 3— 0 1 32 Βをの組成物を提供するものである。

本発明は更にストレブトマイセスエスピーに属し、式 [ I ] で示される活性物質 Κ 0 3 - 0 1 3 1 Αを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養物中に活性物質 K 0 3 - 0 1 3 1 Aを蓄積せしめ、該培養物から活性物質 K 0 3 - 0 1 3 1 Aを採取することからなる活性物質 K 0 3 - 0 1 3 1 Aの製造法を提供するものである。

本発明は更にストレブトマイセスエスピーに属し、式 [H] で示される活性物質 K 0 3 - 0 1 3 1 Bを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養物中に活性物質 K 0 3 - 0 1 3 1 Bを蓄積せしめ、該培養物から活性物質 K 0 3 - 0 1 3 1 Bを採取することからなる活性物質 K 0 3 - 0 1 3 1 Bの製造法を提供するものである。

本発明は更にストレブトマイセスエスピーに属し、式 [ I ] で示される活性物質 K 0 3 - 0 1 3 1 A及び式 [I] で示される活性物質 K 0 3 - 0 1 3 2 B を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中に活性物質 K 0 3 - 0 1 32 及ぴ1： () 3 - 0 1 32 Bを蓄積せしめ、該培養物から活性物質 K 0 3— 0 1 3 2 A及び K 0 3 - 0 1 3 2 Bを採取する組成物の製造法を提供するものである。

本発明は更に、ストレブトマイセスエスピーに属し、式 [I] で示される活性物質 K 03 - 0 1 32 A及び又は式 [I] で示される活性物質 K 03- 0 1 32 Bを生産する能力を有する微生物がストレブトマイセスエスピー（S ΐ r ep t omy c e s s p. ) K03-0 1 32 (FERM AB P - 1 0 1 48) である活性物質 K 03 - 0 1 32の製造法を提供するものである。

本発明は更に、ストレブトマイセスエスピー（S t r e p t omy c e s s p. ) K03- 0 1 32 (FERM ABP- 1 0 1 48) を提供するものである。

前記の式 [I] で表される活性物質 K 03 - 0 1 32 A及び式 [It] で表される活性物質 K 03 - 0 1 32 Bを生産する能力を有する微生物（以下「K 03 - 01 32物質生産菌 j と称する）は、ストレブトマイセス属に属するが、本発明の物質生産能を有するものであればよく、特に制限されることはない。

本発明の活性物質 K 03 - 0 1 32を生産するために使用される菌株の好ましい一例としては、本発明者らによって北海道の土壌より新たに分離されたストレプトマイセスエスピー（S t r ep t omy c e s s p, ) K 03 - 0 1 32株が挙げられる。

本菌株の菌学的性状を示すと以下の通りである。

1. 形態的特徵

栄養菌糸は各種寒天培地上でよく発達し、分断は観察されない。気菌糸はィースト ·麦芽エキス寒天培地やスターチ■無機塩寒天培地で豊富に着生し、茶褐色からグレーの色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸上に 20ケ以上の胞子の連鎖が認められ、その形態は螺旋状で、胞子の大きさは約 0. 7 X 1. 2 mの円筒状である。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のうおよび遊走子は見出されない。

2. 各種培地上での性状

ィ一 · ビー - シャ一リング（E. B. S h i r 1 i n g) とデ一 ·ゴットリ —ブ（D. Go t t l i eb) の方法（ィンターナショナル■ ジャーナル ·ォブ • システィマティック ■バクテリォロジ一、 1 6巻、 3 1 3頁、 1 96 6年）によって調べた本生産菌の培養性状を下記に示す。色調は標準色として、カラ一 · ハーモニー ·マニュアル第 4版（コンテナ一 · コーポレーション ·ォブ ·ァメリ力 · シカゴ、 1 958年）を用いて決定し、色票名とともに括弧内にそのコ一ドを併せて記した。以下は特記しない限り、 27で、 2週間目の各培地における観察の結果である。

培養性状シュクロース，硝酸塩寒天培地

生育良好に生育、パール（2 b a)

裏面シルバーグレー（ 3 f e)

気菌糸貧弱に着生、ベージュ（3 g e)

可溶性色素産生しないグルコース ·ァスパラギン寒天培地

生育中程度に生育、パール（2 b a)

裏面パール（2 b a)

気菌糸着生しない

可溶性色素産生しないロール■ァスパラギン寒天培地（ I SP)

生育良好に生育、キャメル（3 i e)

裏面ァドーブブラウン（31 g)

気菌糸豊富に着生、ベージュグレー（3 i h) 可溶性色素わずかに産生、マスタード（21 e) チ -無機塩寒天培地（I SP)

生育良好に生育、マスタード（21 e)

裏面ライトマスタ一ドタン（ 2 i e)

気菌糸豊富に着生、コバルトグレー（2 f e) 可溶性色素わずかに産生、ライトマスタードタン（2 i e) チロシン寒天培地（ I SP)

生育良好に生育、ライトマスタードタン（2 i e) 裏面マスタードタン（21 g)

気菌糸中程度に着生、シルバーグレー（3 f e) 可溶性色素わずかに産生、ライトマスタードタン（2 i e) ォートミール寒天培地（ I SP)

生育良好に生育、マスタード（21 e)

裏面ダークコバルトグレー（ 2 i h)

気菌糸中程度に着生、ベージュブラウン（3 i g) 可溶性色素産生しないイースト ·麦芽エキス寒天培地

生育良好に生育、イェローメープル（3ng) 裏面クローブブラウン（ 3 p 1 )

気菌糸豊富に着生、ダークコバルトグレー（2 i h) 可溶性色素わずかに産生、ゴールデンブラウン（3pg) 栄養寒天培地

生育良好に生育、クリーム（ 1 c a) 裏面クリーム（1 c a)

気菌糸貧弱に着生、ナチュラル（2 d c)

可溶性色素産生しないペプトン ·イースト ·鉄寒天培地（I SP)

生育良好に生育、バンブー（2 g c)

裏面ハニーゴールド（2 i c) 気菌糸着生しない

可溶性色素わずかに産生、ハニーゴールド（2 i c) グルコース ·硝酸塩寒天培地

生育中程度に生育、パール（2 b a)

裏面パール（2 b a)

気菌糸貧弱に着生、ベージュ（3 g e)

可溶性色素産生しないグルセロール · リンゴ酸カルシゥム寒天培地

生育良好に生育、パールピンク（3 c a) 裏面パールピンク（ 3 c a)

気菌糸着生しない

可溶性色素産生ないグルコース ·ぺプトン寒天培地

生育良好に生育、アイボリ— （2 db) 裏面マスタ一ド（21 e)

気菌糸着生しない

可溶性色素産生しない . 生理学的諸性質

(1) メラニン色素の生成

(ィ）チロシン寒天培地陽性

(口）ペプトン .イースト '鉄寒天培地陰性

(ハ）トリプトン ·ィースト液陰性

(二）単純ゼラチン培地（2 1〜23°C) 陰性

( 2 ) 硝酸塩の還元陽性

(3) ゼラチンの液化（21〜23°C) (単純ゼラチン培地) (4) スターチの加水分解陽性

( 5 ) 脱脂乳の凝固（ 3 7 °C) 陰性

(6) 脱脂乳のペプトン化（37°C) 陰性

( 7 ) 生育温度範囲 7〜 3 8 °C

( 8 ) 炭素源の利用生（プリドハム ·ゴトリーブ寒天培地）

利用する： D—グルコース、メリビオース、 L—ラムノースやや利用する： D—キシロース、ラフイノース、 D—フラクトース、シュ一クロース

利用しない： L—ァラビノース、 D—マンニトール、 my 0—イノシトール

( 9 ) セルロースの分解陰性

4. 細胞壁組成

細胞壁のジアミノピメリン酸は LL型、主要メナキノンは MK— 9 (H_s ) と MK— 9 (H₈ ) である。

5. 結論

以上、本菌の菌学的性状を要約すると次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸は LL型、主要メナキノンは MK— 9 (He ) と MK— 9 (H₈ ) である。胞子連鎖の形態は螺旋状で、長い胞子鎖を形成し、胞子の表面は平滑である。培養上の諸性質としては、栄養菌糸は褐色の色調を呈し、気菌糸は茶褐色からグレー系の色調を呈する。チロシン寒天培地でメラニン色素を産生する。

これらの結果から、バ一ジーズ ·マニュアル 'ォブ ' システマティック，バクテリオ口ジ一、 4巻、 1 9 8 9年に基づくストレブトマイセス属に属する菌種であると考えられる。

6. 微生物の国際寄託

上記 0 3 - 0 1 32株の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株はストレブトマイセス属に属するー菌株と同定し、ストレブトマイセスエスピー（S t r e p t omy c e s s p . ) K 0 3 - 0 1 3 2と命名した。なお、本菌株は、ストレブトマイセスエスピー（S t r e p t omy c e s s p. ) K 0 3— 0 1 3 2として、日本国茨城県つくぱ巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566 ) [A I ST Ts ukub a Cen t r a l 6， 1— 1， H i ga s h i 1— c home Ts ukub a— s h i, I b a r ak i— ken, 305 - 856 6 Jap an] に所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター [I n t e rna t i ona l Pa t en t Or gan i sm D e p o s i t a r y Na t i ona l I n s t i t u t e o f A d v a n c e d I ndu s t r i a l Sc i en c e and Te chno l ogy ] に寄託した。受託日は平成 1 6年（04) 1 0月 21日、受託番号は FERM ABP— 1 0 1 48である。

本発明で使用される K 03 - 0 1 32物質生産菌としては、前述のストレブトマイセスエスピー K 03 - 01 32菌株が挙げられるが、菌の一般的性状として菌学上の性状は極めて変異しやすく、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行われる紫外線照射、 X線照射または変異誘導体剤、例えば N—メチル -N' —ニトロ一 N—ニトロソグァ二ジン、 2—ァミノプリンなどを用いる人工的変異処理により取得できる人工的変異株は勿論、細胞融合株、遺伝子操作株を含め、ストレプトマイセスエスピー（S t r ep t omy c e s s p. ) に属し、前記式 [I] で表される活性物質 K03-0 1 32 A及び前記 [IT] で表される活性物質 K 03 - 0 1 32 Bを生産する菌株は、すべて本発明に使用することができる。

本発明を実施するに当たっては、先ずストレブトマイセスエスピーに属する K 03— 0 1 32物質生産菌を培地に培養することにより行われる。上記活性物質 K 03 - 0 1 32生産に適した栄養源としては、微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらには必要に応じて無機塩、ビタミン等を含有させた栄養培地が使用される。上記の同化し得る炭素源としては、グルコース、プラクトース、マルト一ス、ラクト一ス、ガラクトース、デキストリン、澱粉等の糖類、大豆油等の植物性油脂類が単独または組み合わせて用いられる。

消化し得る窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆粉、綿実粉、コーン ·スティ一プ ' リカー、麦芽エキス、カゼイン、アミノ酸、尿素、アンモニゥム塩類、硝酸塩類等が単独または組み合わせて用いられる。その他必要に応じてリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩類、鉄塩、マンガン塩、銅塩、コバルト塩、亜鉛塩等の重金属塩類やビ夕ミン類、その他本活性物質 K 0 3 - 0 1 3 2の生産に好適なものが適宜添加される。

培養するに当たり、発泡の激しいときには、必要に応じて液体パラフィン、動物油、植物油、シリコン等、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。上記の培養は、上記栄養源を含有すれば、培地は液体でも固体でもよいが、通常は液体培地を用い、培養するのがよい。少量生産の場合にはフラスコを用いる培養が好適である。目的物質を大量に工業生産するには、他の発酵生産物と同様に、通気攪拌培養するのが好ましい。

培養を大きなタンクで行う場合は、生産工程において、菌の生遅延を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、次に培養物を大きなタンクに移して、そこで生産培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培地および生産培養に使用する培地の組成は、両者とも同一であつてもよいし、必要があれば両者を変えてもよい。

培養を通気攪拌条件で行う場合は、例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファメーターの回転または振とう、ポンプ処理、空気の吹き込み等、既知の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを使用する。

培養温度は、本 K 0 3 - 0 1 3 2物質生産菌が本活性物質 K 0 3 - 0 1 3 2 を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通常は 2 0〜3 0 °C、好ましくは 2 7 °C 前後で培養するのがよい。培養 p Hは通常は 5〜8、好ましくは 7前後で培養するのがよい。培養時間は培養条件によっても異なるが、通常は 4〜7日程度である

このようにして得られた本活性物質 K 0 3 - 0 1 3 2は、培養菌体および培養濾液に存在する。培養物から目的とする活性物質 K 0 3 - 0 1 3 2物質を採取するには、全培養物をアセトンなどの水混和性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧下有機溶媒で留去後、続いて残渣を酢酸ェチル等の水不混和性有機溶媒で抽出することによって行われる。

上記の抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組み合わせ、あるいは繰り返すことにより、活性物質 K 0 3 - 0 1 3 2人及び1： 0 3 - 0 1 3 2 Bの各成分に分離、精製することができる。

次に、本発明の活性物質 K 0 3 - 0 1 3 2 Aおよび K 0 3 - 0 1 3 2 Bの理化学的性状について述べる。

活性物質 K 0 3 - 0 1 3 2 A

( 1 ) 性状：白色針状結晶

(2) 分子量： 2 9 3 (高速原子衝撃質量分析による）

(3) 分子式： C₁₅H₁₉N0₅

(4) 比旋光度： [<¾] 。 ²⁶ = + 2. 5° (c = 0. 1、メタノール）

(5) 紫外部吸収スぺクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スぺクトルは、 2 1 7 ηπι (ε = 1 2 5 0 0) 、 2 6 2 ηπι (ε = 6 7 0 0) , 3 4 5 ( ε = 2 3 0 0) 付近に極大吸収を有する

( 6 ) 赤外部吸収スぺクトル：臭化力リゥム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺクトルは、 3 4 4 0、 3 2 1 2、 3 1 3 7、 1 7 1 2、 1 6 6 0、 1 6 3 3 cm 一¹に特徴的な極大吸収を有する、

(7) プロトン核磁気共鳴スぺクトル： Va r i a n J a p a n社製、核磁気共鳴スぺクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スぺクトル（重クロロホルム中で測定）の化学シフト（p pm) は、 7. 0 9 ( 1 H, b r . s)

、 7. 4 3 ( 1 H, b r . s) 、 3. 1 2 ( 2 H, d， J= 6. 5 Hz) 、 2. 8 6 ( 1 H， d d d, J= 6. 7， 6. 7, 6. 5 Hz) 、 2. 4 5 ( 2 H, d ， J= 6. 7 Hz) 、 2. 3 2 (2 H， d， J= 6. 7Hz) 、 2. 1 4 ( 3 H ， s) 、 2. 2 0 ( 3 H, s) 、 5. 6 4， 6. 3 9 ( 2 H, b r . s) 、 1 2 . 3 0 ( 1 H， s)

(8) ¹³C核磁気共鳴スぺクトル： Va r i a n J a p a n社製、核磁気共鳴スぺクトロメータを用いて測定した核磁気共鳴スぺクトル（重ク π口ホルム中で測定）の化学シフト（P pm) は、 1 5 9. 0、 1 2 7. 2、 1 3 8. 6、 1 2 7. 5、 1 2 7. 3、 1 1 8. 5、 2 0 6. 0、 4 2. 0、 2 9. 2、 3 8. 1、 1 74. 2、 39. 3、 1 74. 4、 1 5. 3、 20. 4

(9) 溶剤に対する溶解性：メタノール、クロ口ホルム、酢酸ェチルに可溶。水、へキサンに難溶

(1 0) 呈色反応：リンモリブデン酸に陽性

(1 1) 酸性、中性、塩基性の区別：中性物質

以上、活性物質 K 03 - 0 1 32 Aの各種理化学的性状やスぺクトルデ一夕を詳細に検討した結果、本活性物質 K 03 - 0 1 32 Aは式 [ I ] で表される化学構造であることが決定された。

活性物質 K 03 - 0 1 32 B

( 1 ) 性状：白色針状結晶

(2) 分子量： 292 (高速原子衝撃質量分析による）、

(3) 分子式： C₁₅H₁₆O_e

(4) 比旋光度： [ ] _D ²⁶ = - 2. 2° (c = 0. 1、メタノール）

(5) 紫外部吸収スぺクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スぺクトルは、 21 7nm (£ = 8900) 、 267nm (£ = 6 1 00) 、 355 (ε = 1 900) 付近に極大吸収を有する

( 6 ) 赤外部吸収スぺクトル：臭化力リゥム錠剤法で測定した赤外部吸収スぺクトルは、 3 1 00、 3037、 1 78 1、 1 708、 1 637 cm ¹に特徴的な極大吸収を有する、

(7) プ πトン核磁気共鳴スぺクトル： Va r i an J a p a n社製、核磁気共鳴スぺクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スぺクトル（重クロロホルム中で測定）の化学シフト（ppm) は、 7. 20 (1 H， b r . s)

、 7. 52 (1 H， b r . s) 、 5. 70 ( 1 H, d， J= 3. 0Hz) 、 3. 07 ( 1 H, m)、 2. 52 ( 1 H, d d, J=l . 0, 1 7. 0Hz) 、 2. 65 (1 H, d d, J = 8. 0, 1 7. 0Hz) 、 2. 3 1 ( 2 H, dd, J = 3. 5, 1 7. 5Hz) 、 2. 82 ( 2 H, dd, J= 8. 5, 1 7. 5 Hz)

、 2. 1 9 (3H, s )、 2. 25 ( 3 H, s )、 1 1. 80 ( 1 H, s)

(8) ¹³ C核磁気共鳴スぺクトル： Va r i an Jap an社製、核磁気共鳴スぺクトロメータを用いて測定した核磁気共鳴スぺクトル（重クロ口ホルム中で測定）の化学シフト（ppm) は、 1 59. 9、 1 28. 0、 1 39. 8、 1 29. 0、 1 26. 9、 1 14. 0、 1 98. 5、 80. 7、 34. 7、 37. 0、 1 72. 2、 39. 0、 1 75. 0、 1 5. 4、 20. 4

(9) 溶剤に対する溶解性：メタノール、クロ口ホルム、酢酸ェチルに可溶、水、へキサンに難溶

(1 0) 呈色反応：リンモリブデン酸に陽性

(1 1) 酸性、中性、塩基性の区別：中性物質。

以上、活性物質 K 03 - 0 1 32 Bの各種理化学的性状やスぺクトルデ一夕を詳細に検討した結果、本活性物質 K 03 - 0 1 32 Bは式 [H] で表される化学構造であることが決定された。

生物学的性状

次に、本発明の活性物質 K 03 - 0 1 32 Aおよび K 03 - 0 1 32 Bの生物学的性状について以下に述べる。

(1) ァゾール系抗真菌剤の活性増強作用

ァゾ一ル系抗真菌剤の活性増強作用は以下のように測定した。

試験菌としては、 Cand i da a l b i c an s KF 1を用いて、 C and i d a a l b i c an s KF 1は" W aksman b r o t h (G 1 u c o s e 2. 0%、 Pep t on e 0. 5%、 Dr y y e a s t 0. 3 Me a t Ex t r a c t 0. 5 %、 N a C 1 0. 5%、 CaC0₃ 0. 3%、 pH7. 0) で27で、 40時間種培養後、 GY寒天培地（G 1 u c o s e 1. 0%、 Ye a s t Ex t r a c t 0. 5%、 Aga r 0. 8 %、 pH6. 0) に 0. 3%植菌し、本プレートをプレート Aとし、ァゾ一ル系抗真菌剤としてミコナゾ一ル（シグマ社製、米国）を使用し、 GY寒天培地への添加濃度は、試験菌の生育に影響を与えない 0. 06 / M (終濃度）としてプレート Bとした。活性はペーパーディスク法（厚手、 8mm： ADVANTEC社製により評価し、試験菌 27°C、 24時間培養後に阻止円を測定した。その結果は下記の第 1表に示した通りである。第 1表化合物阻止円径 mm

in g/d i s k) プレート A プレート B

K 03 - 0 1 32 A 1 0 ― ―

25 ―

50 ― 1 2

K 03 - 0 1 32 B 1 0 一 ―

25 一 1 1

50 ― 14

( 2 ) 各種試験菌に対する抗菌作用

試験菌としては、 B a c i 1 l_u s s u b t i 1 i s P C I 2 1 9、 t aphy l o c o c cu s au r eu s FDA209 P-, Mi c r o c o e c u s l u t eu s PC I 1 00 1、 My c ob a c t e r i um s m e gm a t i s ATC C 607. E s_c_h e r i c h i a c o 1 i N I H J、 P s e u d omona s a e r ug i no s a P— 3、 Xan t hom ona s o r yz a e KB 88^ Ba c t e r o i d e s f r a 1 i s ATCC 23745, Acho l ep l a sma 1 a i d 1 a i i P G 8、 Py r i c u l a r i a o r yz a e KF 1 80 As p e r g i 1 1 u s n i ge r ATCC 6275、 Mu c o r r a c emo s u s I F 0458 K C_a n d i d a a l b i c an s ATCC 64548、 Sa c cha r omy c e s c e r ev i s i a eの 1 4種類を用いた。活性はぺーパーディスク法（薄手， 6mm： ADVANTECH社製）により評価し、 27 °Cまたは 37°Cで 1 24時間または 48時間培養後の阻止円を測定した。その結果は下記の第 2表に示した通りである。 4019720 第 2表阻止円径（mm)

試験菌 K03 - 0 1 32A K 03 - 0 1 32 B

Bacillus subtilis PCI 219 ― 1 0

Staphylococcus aureus FDA 209P 一 8

Micrococcus luteus PCI 1001 ―

Mycobacterium smegmatis ATCC607 ― ―

Escherichia coli匪 J ―

Pseudomonas aeruginosa P - 3 一

Xanthomonas oryzae KB 88 ― ―

Bacteroides fraglis ATCC 23745 ― 1 3

Acholeplasma laidlawii PG 8 ― 1 2

Pyricularia oryzae KF 180 ―

Aspergillus niger ATCC 6275 ― 一

Mucor racemosus IFO 4581 ―

Candida albicans ATCC 64548 ― ―

Saccharomyces cerevisiae ― ― 発明を実施するための最良の形態

次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。

実施例

50 Om 1容三角フラスコ 1本にグルコース 0. 1 %、スターチ 2. 4 %、ペプトン 0. 3%、ミートエキストラクト 0. 3 %、イーストエキストラクト 0 . 5%、炭酸カルシウム 0. 4% (pH7. 0に調整）を 1 00ml仕込み、綿栓後、蒸気滅菌し、寒天培地上に生育させたストレブトマイセスエスピー K 03 - 0 1 32菌株（S t r ep t omy c e s s p. K03— 0 1 32、 F ERM ABP— 1 0 1 4 8) を白金耳にて無菌的に接種し、 27 °Cで 9 6時間振とう培養した。

そして、それを種培養液として、グルコース 0. 1 %、スターチ 2. 4%、ペプトン 0. 3%、ミートエキスラクト 0. 3%、イーストエキストラクト 0. 5%、炭酸カルシウム 0. 4 %、トレース 5m l (ρΗ 7. 0に調整） 5 0 0 m 1容三角フラスコ 1 0 0m l、 1 0本仕込み、蒸気滅菌後、種培養した培養液 1 m lを無菌的に移植し、 27°Cで 6日間培養した。得られた全培養液に 1 Lのェ夕ノールを加えよく攪拌し、減圧濃縮し、これを酢酸ェチルで抽出後、減圧濃縮して粗物質 3 6 2. l mgを得た。

次に、この粗物質 3 6 2. 1 mgをシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィ一にチャージし、クロ口ホルムとメタノールで溶出するカラムクロマトグラフィ一を行った。クロ口ホルム：メタノール = 1 ： 1で溶出するフラクションを減圧乾固し粗物質 4 0. 7mg得た。次にこの 4 0. 7mgの粗物質を高速液体クロマトグラフィ一により分離精製した。装置は SSC 34 6 1 (センシユウ科学社製、日本国）を用い、カラムは PEGAS I L-ODS (ODS系樹脂、センシユウ科学社製、日本国）を用い、溶媒系は 0. 0 5 %TFA含有の 3 0分間のァセトニトリル 1 0 %から 5 0 %のグラジェントを用い、検出は UV 2 1 0 η m、流速 1. 0m lノ分で行った。

その結果、 20. 0分に溶出したフラクションを減圧乾固し K 0 3— 0 1 3 2Aを 4. Omg単離した。またクロ口ホルム：メタノール = 5 ： 1で溶出するフラクションを減圧乾固し粗物質 4 1. Omg得た。次にこの 4 1. Omgの粗物質を高速液体クロマトグラフィーにより分離精製した。装置は SSC 34 6 1 (センシユウ科学社製、日本国）を用い、カラムは PEGAS I L-ODS (0 DS系樹脂、センシユウ科学社製、日本国）を用い、溶媒系は 0. 0 5 %TFA 含有の 30分間のァセトニトリル 1 0 %から 5 0 %のグラジェントを用い、検出は UV 2 1 0 nm、流速 1. 0 m 1 /分で行った。その結果、 2 8. 0分に溶出したフラクションを減圧乾固し K 0 3— 0 1 32 Bを 4. Omg単離した。

産業上の利用分野

以上のことから、本発明による活性物質 K 0 3 - 0 1 3？八及ぴ又はり 3 - 0 1 3 2 Bはァゾール系抗真菌剤の活性増強作用を有することから、深在性真菌症をはじめとする多くの真菌感染症に対して、低濃度、短期間で作用し、耐性菌出現頻度の低減に有用である。また耐性克服に対する有用性が期待される。

Claims

1. 下記式 [ I ] 青

の

で表される活性物質 K 03 - 0132 Ac

2. 下記式 [I]

で表される活性物質 K 03 - 0132 B,

3. 下記式 [I] 及び

で表される活性物質 KO 3— 0132 Α、及び下記式 [互」

で表される活性物質 K 03 - 0 1 32 Βの組成物。

4. ストレブトマイセスエスピーに属し、式 [ I] で示される活性物質 Κ 03 - 0 1 3 1 Αを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養物中に活性物質 K 03- 0 1 31 Aを蓄積せしめ、該培養物から活性物質 K 03- 0 1 3 1 Aを採取する活性物質 K 03- 0 1 3 1 Aの製造法。

5. ストレブトマイセスエスピーに属し、式 [I] で示される活性物質 K03- 0 1 3 1 Bを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、該培養物中に活性物質 K 03- 0 1 31 Bを蓄積せしめ、該培養物から活性物質 K 03- 0 1 3 1 Bを採取する活性物質 K 03-0 1 31 Bの製造法。

6. ストレブトマイセスエスピーに属し、式 [I] で示される活性物質 K 03 - 0 1 3 1 A及び式 [I] で示される活性物質 K 03 - 0 1 32 Bを生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養物中に活性物質 K 03- 0 1 32 A及び K 03 - 0 1 32 Bを蓄積せしめ、該培養物から活性物質 K 03- 0 1 3 2 A及び K 0 3 - 0 1 32 Bを採取する組成物の製造法。，

7. ストレブトマイセスエスピーに属し、式 [I] で示される活性物質 K 03 - 0 1 32 A及びノ又は式 [I] で示される活性物質 K 03 - 0 1 32 B を生産する能力を有する微生物がストレブトマイセスエスピー（S t r e p t omy c e s s p. ) K03-01 32 (FERM ABP— 1 0 1 48) である活性物質 K 03 - 0 1 32の製造法。

8. ストレプトマイセスエスピー（S t r ep t omy c e s s p. ) K 03 - 0 1 32 (FERM ABP— 1 0 1 48) 。