WO2006025352A1 - 分画装置 - Google Patents

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WO2006025352A1
WO2006025352A1 PCT/JP2005/015704 JP2005015704W WO2006025352A1 WO 2006025352 A1 WO2006025352 A1 WO 2006025352A1 JP 2005015704 W JP2005015704 W JP 2005015704W WO 2006025352 A1 WO2006025352 A1 WO 2006025352A1
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WO
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protein
fractionation device
solution
peptide
membrane
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/015704
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuhiro Tanahashi
Hiroshi Takahashi
Hiroyuki Sugaya
Shigehisa Wada
Original Assignee
Toray Industries, Inc.
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Publication date
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Priority to JP2006532694A priority patent/JP4910700B2/ja
Priority to US11/658,894 priority patent/US20090191105A1/en
Priority to EP05781472.5A priority patent/EP1785431B1/en
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Publication of WO2006025352A1 publication Critical patent/WO2006025352A1/ja
Priority to US12/834,666 priority patent/US20110009503A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/04—Hollow or tubular parts of organs, e.g. bladders, tracheae, bronchi or bile ducts
    • A61F2/06—Blood vessels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/14—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis
    • A61M1/16—Dialysis systems; Artificial kidneys; Blood oxygenators ; Reciprocating systems for treatment of body fluids, e.g. single needle systems for hemofiltration or pheresis with membranes

Definitions

  • the present invention relates to a fractionation apparatus for preparing a solution for analysis by separating biological components such as protein and Z or peptide from a solution containing protein and Z or peptide, particularly body fluid such as blood and urine. About.
  • proteome analysis research has begun to attract attention as post-genomic research. Since protein, which is a gene product, is thought to be directly linked to the pathology of the disease rather than gene, research results of proteome analysis that comprehensively examines proteins are expected to be widely applicable to diagnosis and treatment. However, it is likely that many powerful etiological proteins and disease-related factors that cannot be discovered by genome analysis can be discovered.
  • proteome analysis is due to the fact that high-speed structural analysis using a mass spectrometer (MS) has become technically possible.
  • MS mass spectrometer
  • Assisted laser desorption ionization time—of—flight mass spectrometry enables high-throughput ultra-trace analysis of polypeptides, enabling identification of even minute amounts of proteins that could be detected conventionally. It has become a powerful tool for exploring disease-related factors.
  • proteome analysis The primary purpose of clinical application of proteome analysis is the discovery of biomarker proteins that are induced or lost by disease. Biomarkers behave in relation to pathological conditions, so they can be diagnostic markers and are likely to be drug discovery targets. In other words, the results of proteome analysis are likely to become diagnostic markers and drug discovery targets rather than specific genes, and thus become a biomarker technology for diagnosis and treatment in the post-genomic era. Since it directly leads to benefits that patients can enjoy, such as drug responsiveness evaluation and prediction of side effects, it can be said to play a major role in promoting so-called tailor-made medicine (order-made medicine). [0005] When proteomic analysis (clinical proteomics) is introduced into clinical research, it is required to analyze a large amount of samples quickly and reliably.
  • Mass specrometry was the main driving force, and it contributed greatly to the ultra-sensitive and high-throughput characteristics of mass spectrometers.
  • the methods and equipment have been improved rapidly, the situation where proteome analysis can be easily and quickly performed in clinical settings is still not possible.
  • Human 'protein is estimated to be more than 100,000 species It is said that the protein contained in serum alone is about 10,000 types, and the total serum concentration is about 60-80 mg / mL. is there.
  • Serum-rich proteins include albumin (molecular weight: 66 kDa), immunoglobin (150-1000 kDa), transferrin (80 kDa), haptoglobin (> 85 kDa), lipoprotein (several lOOkDa), etc. mg / mL).
  • albumin moleukins
  • cytokines that are considered to be pathological biomarkers and pathogenesis-related factors exist only in trace amounts (ng / mL).
  • the content ratio is actually nano to pico level compared to the high content component of the polymer.
  • 70% or more of all types of proteins have a molecular weight of 60 kDa or less, and most of the above-mentioned trace amounts of biomarker proteins are mostly contained in this region (for example, Non-patent Document 1). ). Since these proteins pass through the kidney and are partially excreted in the urine, it is possible to measure not only blood but also urine as a specimen.
  • Non-Patent Document 1 for example, Dara Dipore: “Gradiflow” system
  • traditional precipitation methods such as Cohn ethanol precipitation
  • chromatography There is a method of drawing (for example, Non-Patent Document 2). In general, these techniques have been performed as pretreatment operations for mass spectrometry.
  • the blocking agent is a solution of albumin or casein, and is a method for suppressing the adsorption of useful biological components by competitive adsorption. Because of the competitive adsorption, the concentration of the blocking agent is generally higher than the concentration of useful biological components.
  • a common non-adsorption treatment on the substrate surface is a hydrophilic treatment on the substrate surface.
  • Hydrophilic There are several methods for the conversion process.
  • Patent Document 2 describes a method of introducing a hydrophilic compound such as a 2-methacryloyloxychetyl phosphorylcholine copolymer (hereinafter abbreviated as MPC) into a base material by coating treatment.
  • Patent Documents 3 and 4 describe methods for introducing a hydrophilic compound by grafting.
  • There are methods that directly generate hydrophilic functional groups on the substrate surface such as reactive ion etching, plasma treatment, and ion cluster beam treatment.
  • the substrate treated by the conventional substrate surface treatment method has an effect of suppressing the adsorption of biological components when contacted with a high concentration protein or peptide solution.
  • a solution containing a large amount of biological components there was still a loss of biological components due to adsorption, which was still insufficient to solve the problem.
  • Hydrophilization by hydrophilic polymer grafting improves the hydrophilicity in proportion to the amount of grafting, but when the concentration of the hydrophilic polymer solution to be treated increases, the hydrophilic polymers crosslink three-dimensionally. As a result, the motility of the hydrophilic polymer is lowered! There is a problem that the effect of suppressing the adhesion of biological components is lowered.
  • reactive ion etching treatment, plasma treatment, and ion cluster beam treatment can be easily hydrophilized to the outer surface of the base material or one side of the plate-like base material. Since it is difficult to hydrophilize shadowed parts such as beams, it is suitable for hydrophilicizing multiple surfaces such as both sides of a plate-like substrate and inner and outer surfaces of a hollow substrate with a single treatment. Absent.
  • the adsorption characteristics of the biological component of the base material depend on the surface state of the part in contact with the biological component. In general, the higher the hydrophilicity of the surface, the more the movement of the hydrophilic molecules immobilized on the surface. The higher the property, the lower the adsorption of biological components to the substrate surface.
  • hydrophilic molecules with high mobility eliminate biological components such as proteins and platelets by their molecular motion. Hydrophilicity by reactive ion etching treatment, plasma treatment or ion cluster beam treatment is not As a result of the formation of hydrophilic functional groups such as groups, the mobility of hydrophilic molecules is low compared to hydrophilization by introducing hydrophilic polymers onto the substrate surface. The effect is low and undesirable. Furthermore, since the substrate may be denatured because it may become high temperature during the treatment, it is preferable.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-130882
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 58-40323
  • Patent Document 4 Japanese Patent No. 3297707
  • Non-Patent Literature 1 Anderson 'NL (Anderson NL), Anderson' NG (Anderson, NG), "The Human 'Plasma Plasma Proteome: History ⁇ ⁇ ⁇ Character ⁇ ⁇ ⁇ And' Diagnos Aitug 'Pros Hegu (Thehuman plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects)], Molecular & Cellular Prot eomics, (USA), The American American Society 1 Fo One Biochemistry 1 The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc., 2002, Vol. 1, p845-867.
  • Non-patent document 2 edited by the Japanese Biochemical Society, "Seminar of New Chemistry Experiment (Part 1) Protein (1) Separation, Purification, Properties", Tokyo Chemical Doujin, 1990
  • the present invention employs the following means.
  • Protein and Z or peptide fractionating apparatus wherein at least a partial force of the surface of the substrate in contact with the protein and Z or peptide is contacted with 1000 gZml of urine serum albumin solution Fractionation device with urine serum albumin adsorbed on the surface of 50 ng Zcm 2 or less.
  • a protein and Z or peptide fractionating device wherein at least a part of the substrate surface in contact with the protein and Z or peptide is separated from human j8 2-microglobulin at a concentration of 200 ng / ml on the substrate surface.
  • a fractionation apparatus wherein the amount of human j8 2-microglobulin adsorbed to the substrate is 3 ng / C m 2 or less when brought into contact with an aqueous protein solution having a concentration of 10 ⁇ g / ml ushi serum albumin.
  • Protein and Z or peptide fractionating device a supply means for supplying a solution containing the protein and Z or peptide, a means for separating the protein and Z or peptide from the solution, and the protein in the solution
  • a fractionation device having means for concentrating Z or peptide, wherein at least a part of the surface of the substrate in contact with the protein and Z or peptide in the fractionation device is grafted with a hydrophilic polymer.
  • FIG. 1 is a schematic view of a fractionation apparatus used in Example A1 of the present invention.
  • the meanings of the symbols in the figure are as follows.
  • the protein and Z or peptide fractionating device referred to in the present invention is a device for separating these according to molecular weight or according to the characteristics of the protein or peptide.
  • the apparatus includes a supply means for supplying a protein or peptide sample and a separation means for performing separation.
  • Specimens such as serum, plasma, urine, and other body fluids, artificially prepared solutions containing proteins or peptides, and culture supernatants generated by cell culture can be used at the same concentration or pH buffer.
  • the specimen When diluted with a solution or the like and introduced into the supply means, the specimen is transported by the mobile phase and separated by a separation means equipped with a membrane, gel, and adsorbent installed in the flow path of the mobile phase.
  • the solution containing the target protein or peptide separated by the fractionation apparatus of the present invention is quantified by ultraviolet absorption, fluorescence, colorimetry, or the like, or the water contained with the protein or peptide is removed as necessary. In this way, it is concentrated, or a certain amount is collected or collected.
  • the means for the quantification, concentration, fractionation, and collection steps do not necessarily have to be integrated with the separation step, but the separation means and at least one of the quantification, concentration, fractionation, and collection are at least one.
  • a device is preferred in which the means are further connected. If it is necessary to prepare a high concentration protein or peptide solution due to the requirements of the analytical device that is performed after separating and recovering the protein or peptide, the separation device is followed by a concentration device followed by a concentration device. Is preferred.
  • the means for transporting the protein or peptide using the mobile phase is not particularly limited, and examples thereof include a tube pump, a gear pump, a diaphragm pump, and a syringe pump as a flow path including tubes, pipes, and grooves.
  • the powerful apparatus has means for separating the protein, means for concentrating the protein, and means for selecting the means for collecting the protein obtained by fractionation, and further feeding the protein solution. It is preferable to have a means
  • proteins with molecular weight of 60,000 or more correspond to albumin, immunoglobulin, transferrin, etc. in the case of blood. In the case of blood, such proteins are present in a high content with respect to the entire protein component.
  • ushi serum albumin having a molecular weight close to 60,000 was used as an index.
  • a protein with a molecular weight of less than 150,000 is a protein with a relatively low molecular weight, and if it is blood, its presence is low relative to the total protein, but there are many types.
  • the fractionation device of the present invention has a separation means
  • a solution containing a protein or peptide is used.
  • the liquid may be diluted during the separation process. For example, if the sample is separated by a membrane, the solvent is usually reduced. As the concentration of protein or peptide increases, deposits accumulate on the membrane surface, causing clogging of the membrane pores and reducing separation efficiency. To avoid this, diluting solution may be added to prevent the protein concentration from increasing.
  • the main concentrating operations include solvent evaporation or lyophilization by heating or decompression, removal of solvent by filtration or dialysis using a separation membrane that preferentially permeates solvent molecules, and absorption of solvents such as water-absorbing gels.
  • fractionation device of the present invention has means for performing these operations!
  • the base material with which the protein or peptide of the present invention is contacted includes means for supplying a sample containing the protein or peptide, and any treatment of separation, adsorption, quantification, concentration, fractionation, and collection.
  • the means for performing the above are constituent materials that come into contact with a solution containing a protein or peptide at a slippage.
  • it is preferable that at least a part of the surface of the base material in contact with the specimen is hydrophilized, and it is most preferable that all the base material surfaces be hydrophilized as much as possible. .
  • the material constituting the substrate is not particularly limited, but a polymer material that is easy to chemically process and surface-modify and that can be mass-produced at low cost such as extrusion molding or injection molding is preferable.
  • high molecular weight materials include polypropylene, polyethylene, polystyrene, polycarbonate, polymethyl methacrylate, polysulfone, polyethersulfone, polyurethane, polychlorinated bur, polyvinylidene chloride, polyacrylonitrile, cellulose, cellulose acetate.
  • Cellulose triacetate, polyamide, polyimide, polytetrafluoroethylene, vinyl Examples include, but are not limited to, alcohol, ethylene copolymer, silicone rubber, epoxy resin, phenol resin, and the like.
  • the fractionation device of the present invention by providing a surface on which the protein or peptide is difficult to adsorb on at least a part of the surface of the base material that is in contact with the protein or peptide, not only the adsorption loss can be suppressed, but further It is important to be able to suppress a decrease in separation performance due to adsorption / deposition / clogging of protein or peptide as an action. As a result, a high recovery rate was achieved. Surface characteristics to achieve this, ⁇ shea serum albumin to 0.
  • 01cm 2 or more 10 cm 2 or less range to 1000 mu g / ml of ⁇ shea serum albumin solution and contacting the Kino the substrate surface of the substrate surface
  • the surface has an adsorption amount of 50 ngZcm 2 or less.
  • 8 2-microglobulin at a concentration of 200 ng / ml and ushi serum albumin at a concentration of 10 g / ml Surface with globulin adsorption of 3 ng / cm 2 or less.
  • Such surface properties are evaluated by the following method.
  • BSA ushi serum albumin
  • PBS water (-) powder from Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the surface in contact with the BSA solution is actually the surface in contact with the protein solution through the pretreatment of the protein.
  • the BSA is adsorbed to the cross section. Will not be evaluated.
  • the surface area if the substrate is not a separation membrane or a concentrated membrane, if the center line average roughness of the substrate surface is less than 0.1 m, the increase in the area due to surface irregularities is not taken into account. When the center line average roughness is 0.1 m or more The increase in area due to surface irregularities will be taken into account. Centerline average roughness is measured by the method described in Appendix 2 of JIS-B 0601. The surface area considering surface irregularities can be measured by a gas adsorption method such as the BET method or a three-dimensional shape measuring microscope such as Keyence's ultra-deep microscope “VK9500”.
  • the membrane area when the base material is a hollow fiber separation membrane or a hollow fiber concentration membrane is calculated as follows. Filter using a module filled with 1.5 m 2 of the target membrane with a 5% by weight BSA aqueous solution adjusted to 37 ° C and pH 7.2 under the conditions of solution flow rate 200 ml Zmin and filtration flow rate 15 ml Zmin.
  • BSA sieving coefficient of BSA 30 minutes after the start of filtration is 0.1 or more
  • BSA touches the inner surface of the membrane, and after passing through the membrane, moves while contacting the outer surface of the membrane.
  • the inner surface and outer surface of the pores are also surface areas.
  • the sieving coefficient of BSA is less than 0.1, BSA hardly permeates the membrane and does not come into force contact with the inner surface of the membrane, so the inner surface of the membrane is the surface area.
  • the BSA sieve coefficient is calculated by the following equation.
  • (a) is the BSA sieving coefficient
  • (b) is the BSA concentration of the filtrate
  • (c) is the BSA concentration of the stock solution before membrane separation
  • (d) is the BSA concentration of the stock solution after membrane separation.
  • the contact time is too short, it may be before the adsorption equilibrium is reached. On the other hand, if it is too long, the protein may be denatured. Also, if the amount of BSA solution is too small, the absolute amount of protein will decrease, so it should be performed at 50 ⁇ 1 or more per lcm 2 membrane area. In addition, since the amount of adsorption is greatly affected by temperature, the BSA solution and substrate must be contacted at 25 ° C.
  • the following method is exemplified as a method of quantifying the amount of adsorbed BSA.
  • the substrate is immersed in 50 ml of PBS twice for 10 seconds, washed, then immersed in 50 vol% aqueous acetic acid in the range of 1 ml to 30 ml for 12 hours at room temperature, and the acetic acid aqueous solution is freeze-dried.
  • dry BSA is dissolved in an aqueous solution containing a blocking agent, and this solution is used for quantification. Quantification of BSA in solution is BETHYL Bovine
  • hydrophilic domains are present on the surface of the protein molecule. It exists and exists inside the hydrophobic domain protein. It is thought that when a protein comes into contact with a hydrophobic substrate, the hydrophobic domain inside is exposed on the surface and adsorbed on the substrate by hydrophobic interaction. Therefore, it is effective to make the substrate surface hydrophilic in order to suppress protein adsorption.
  • a hydrophilic polymer is grafted onto the substrate surface, protein adsorption due to the excluded volume effect due to the micro-Brownian motion of the hydrophilic polymer chain extended into the protein solution in addition to the hydrophilic effect due to the hydrophilic polymer. It is preferable because a suppression effect can be expected.
  • the hydrophilization treatment is a treatment for imparting hydrophilicity to the surface of the substrate.
  • a hydrophilic function is applied to the surface of the substrate by a method of mixing a hydrophilic compound into the raw material of the substrate, a chemical reaction or radiation irradiation.
  • the method of grafting the hydrophilic polymer by irradiation is preferable because it is easy to control the hydrophilicity by selecting the kind and molecular weight of the hydrophilic polymer, and there are few by-products and sterilization can be performed at the same time. .
  • the hydrophilic functional group is a functional group that generates a weak bond with a water molecule by electrostatic interaction or hydrogen bonding.
  • examples thereof include, but are not limited to, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, a nitro group, an aldehyde group, a thiol group, a sulfonic acid group, a sulfuric acid group, and an aminosulfuric acid group.
  • the hydroxyl group is preferred because it is a nonionic functional group that has a small interaction with a protein having a strong surface charge and a small acid-reducing ability, so that the denaturation of the protein is also small.
  • the hydrophilic polymer refers to a polymer that is soluble in water and a polymer that can weakly interact with water molecules by electrostatic interaction or hydrogen bonding even though it is insoluble in water.
  • other monomers such as a copolymer, a graft, and the like.
  • polyvinyl alcohol or polyvinyl alcohol copolymer is particularly preferable because of its high effect.
  • a polymer containing 10% or more and less than 100% of the butyl alcohol unit as the monomer repeating unit with respect to the total number of monomer repeating units is preferable.
  • the polyvinyl alcohol copolymer includes a copolymer having a monomer repeating unit represented by the chemical structural formula of formula (1) and a monomer repeating unit represented by the chemical structural formula of formula (2) in the molecule.
  • the other copolymerization component may be contained.
  • the Ken degree is a numerical value obtained by Equation (2).
  • the degree of keniness is low, the hydrophilicity tends to be low and the solubility in water tends to be low, so that it is difficult to surface-treat the base material as an aqueous solution, preferably 0.70 or more, more preferably 0.74 or more, more preferably 0.78 or more and less than 1.
  • the degree of saponification is 1, it becomes polybulal alcohol, which is also a preferred embodiment as described above.
  • the polymer may be a random copolymer, an alternating copolymer, a block copolymer, or a graft copolymer, or a combination thereof.
  • the molecular weight of the hydrophilic polymer is small, and the molecular mobility of the hydrophilic polymer is small.
  • the weight average molecular weight is preferably 1000 or more, more preferably 5000 or more, and further preferably 10,000 or more.
  • the substrate is brought into contact with a hydrophilic polymer solution having a hydroxyl group, preferably an aqueous solution, and grafted there by radiation.
  • a hydrophilic polymer solution having a hydroxyl group preferably an aqueous solution
  • radiation ⁇ rays, ⁇ 8 rays, ⁇ rays, X rays, ultraviolet rays, electron rays, etc. are used. If the fractionation device is stored for a long period of time, bacteria may be generated and the performance may be reduced.
  • the dose is preferably 15 kGy or more, but when sterilization is not required, it is preferable to perform the treatment within the range of 0.5 kGy or more and 200 kGy or less from the viewpoint of hydrophilization efficiency and prevention of deterioration of the substrate. More preferably, it is performed in the range of 1 kGy to lOOkGy.
  • a flat membrane type separation membrane such as a flat filter, a cartridge type filter, a hollow fiber or the like
  • Any hollow fiber separation membrane can be used, but in general, hollow fibers can be used most efficiently because they have a large membrane surface area per treatment liquid and can reduce pressure loss.
  • a smaller hollow fiber inner diameter is preferable.
  • the force S is preferably 1000 m or less, more preferably 500 m or less.
  • the flat filter has the advantage that it can be easily formed at a low cost.
  • Membrane materials include senorelose, cenololose acetate, polycarbonate, polysenolephone, polymethalate such as polymethylolate, polyacrylate, polyamide, poly (vinylidene fluoride), polyacrylonitrile, polyester, polyurethane, polystyrene, polyethylene and polypropylene. Examples thereof include materials selected from one or more kinds selected from the group consisting of these derivatives. Among these, polysulfone, which is often used in dialysis machines in recent years, is a fraction. The material is preferred because of its good characteristics.
  • a 1000 g / ml BSA solution was prepared by dissolving 100 mg of ALBUMIN, BOVINE (A-7906, Lot. 41kl270) manufactured by SIGMA in PBSlOOml. 2 ml of the BSA solution was placed in a collection container, capped so that the solution did not evaporate, and allowed to stand at 25 ° C. for 4 hours. At this time, the BSA solution contacts 4.0 cm 2 on the inner surface of the collection container, and the amount of BSA adsorption is calculated using this area. The BSA solution in the collection container was removed by suction with an aspirator and washed 5 times with 3 ml of PBS.
  • the mini-module has an inner diameter of about 5mm and a length of about 12cm.
  • a general hollow fiber membrane type dialyzer it has two ports (blood ports) connected to the inside of the hollow fiber membrane and two ports (dialysate ports) connected to the outside.
  • the hollow fiber membrane of the mini module and the inside of the module were washed with distilled water. Thereafter, PBS was injected from the dialysate port and then capped, and the outside of the hollow fiber was filled with PBS.
  • One of the blood ports was connected to a silicon tube, and a peristaltic pump was installed along the way.
  • a silicone tube was connected to the other blood port.
  • the open ends of these two silicon tubes were inserted into PP tubes (188261) manufactured by GreinerBio-One.
  • PP tubes (188261) manufactured by GreinerBio-One.
  • SIGMA ALBU MIN To the PP tube, SIGMA ALBU MIN,
  • BOVINE (A-7906, Lot. 41kl270) was dissolved in PBSlOOml, 10 ml of 1000 ⁇ gZml BSA solution was added, and circulated at 25 ° C for 4 hours at a flow rate of lml / min with a peristaltic pump. Thereafter, 300 ml of PBS was quickly fed by a peristaltic pump at a flow rate of lOml / min. At this time, the PBS from which the silicone tube was also discharged was discarded and not circulated.
  • PBS in the mini-module was removed.
  • the mini module was disassembled and the hollow fiber was taken out.
  • the length of the extracted hollow fiber was 15 cm.
  • the hollow fiber was cut to a length of lcm, and the entire amount was put into a PP tube (188261) manufactured by GreinerBio-One, 5 ml of 50% by volume acetic acid aqueous solution was added, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 12 hours. Thereafter, the hollow fiber was separated by filtration, and the acetic acid solution was lyophilized together with the collection container.
  • a polyvinyl alcohol copolymer aqueous solution was prepared. Production 50 ml of the polybulualcohol aqueous solution was added to a bag with a chuck made by Japan Co., Ltd. (U-Pack E-4), and a 5 ml polystyrene round tube (352054) made by BECTONDICKINSON was immersed therein and irradiated with ⁇ rays.
  • the absorbed dose of ⁇ rays was 26 kGy.
  • the polystyrene round tube was washed with 1 liter of ultrapure water and dried in an oven at 50 ° C for 3 hours to obtain a collection container (1).
  • a BECTON DICKINSON 5 ml polystyrene round tube (352054) was used as it was as a collection container (2).
  • the resin-bonded portions at both ends of the module of a dialyzer BSl. 8L (Lot. 20440312) manufactured by Toray Industries, Inc. were cut to obtain a hollow fiber membrane.
  • the resulting hollow fiber membrane has an inner diameter of 200 m. The thickness was 40 / zm.
  • 100 hollow fiber membranes were bundled, and both ends were fixed to a glass tube module case with an epoxy-based potting agent so as not to block the hollow portion of the hollow fiber membrane, and a mini module was prepared.
  • the mini-module has an inner diameter of about 5 mm and a length of about 17 cm.
  • a general hollow fiber membrane dialyzer it has two ports (blood ports) connected to the inside of the hollow fiber membrane and ports connected to the outside. 2 dialysate ports.
  • the hollow fiber membrane of the mini module and the inside of the module were washed with distilled water. Thereafter, PBS was filled to obtain a hollow fiber membrane minimodule (hereinafter abbreviated as minimodule (1)).
  • mini-module (2) 40 hollow fiber membranes cut from Toray's dialyzer BS1.8L are bundled, and both ends are fixed to the glass tube module case with an epoxy potting agent so that the hollow portion of the hollow fiber membrane is not blocked.
  • the mini-module has an inner diameter of about 5 mm and a length of about 17 cm.
  • two external ports blood ports
  • Polysulfone Solvay Udel (registered trademark) P-3500) 18 parts by weight and polybutyrrolidone (BASF K30) 9 parts by weight N, N, -dimethylacetamide 72 parts by weight and water 1 part by weight
  • This film-forming stock solution was discharged from an outer tube of an orifice type double cylindrical die having an outer diameter of 0.3 mm and an inner diameter of 0.2 mm.
  • As a core solution 58 parts by weight of N, ⁇ '-dimethylacetamide and 42 parts by weight of water were discharged from the inner tube.
  • the discharged membrane forming stock solution passed through a distance of 350 mm from the base to the coagulation bath liquid level, and was then introduced into a 100% water coagulation bath to obtain a hollow fiber membrane.
  • a hollow fiber membrane When the structure of the obtained hollow fiber membrane was confirmed with an electron microscope (Hitachi S800), it had an asymmetric structure. 10000 hollow fiber membranes obtained were inserted into a cylindrical plastic case having a dialysate inlet and a dialysate outlet in the same manner as a general dialyzer, and both ends were sealed with grease to obtain an effective membrane. Area 1.6 An m 2 hollow fiber membrane module was prepared. After washing this hollow fiber membrane module with water, 100 hollow fiber membranes were cut out from the module to prepare 100 pieces.
  • minimodule (3) a hollow fiber membrane minimodule for concentration
  • a mini module was manufactured in the same manner as the mini module (1). However, the hollow fiber membrane of the mini-module and the distilled water inside the module have not been cleaned until the BPS is filled.
  • the blood was inserted from one blood port on the inner side of the thread membrane, passed through the hollow thread, taken out from the other blood port, put into a dialysate port on the blood port side through the tube, and exited from the other dialysate port.
  • ⁇ -rays were irradiated with the polybulul alcohol filled inside and outside the hollow fiber of the mini-module, with the four ports sealed, and at this time the absorbed dose of ⁇ -rays was 26 kGy. .
  • the hollow fiber membrane of the mini module and the inside of the module were washed with 3 L of 40 ° C distilled water.
  • mini-module (4) a hollow fiber membrane mini-module (hereinafter abbreviated as mini-module (4)).
  • a mini module was manufactured in the same manner as the mini module (2). However, the hollow fiber membrane of the mini-module and the distilled water inside the module have not been cleaned until the BPS is filled.
  • a flow rate of 10 ml from one blood port inside the mini-module hollow fiber membrane, through the hollow fiber, from the other blood port, and through the tube to the dialysate port on the blood port side. From the dialysate port.
  • ⁇ -rays were irradiated with the polybulul alcohol filled inside and outside the hollow fiber of the mini-module, with the four ports sealed, and at this time the absorbed dose of ⁇ -rays was 26 kGy. .
  • the hollow fiber membrane of the mini module and the inside of the module were washed with 3 L of 40 ° C distilled water.
  • minimodule (5) a hollow fiber membrane minimodule
  • a mini module was manufactured in the same way as the mini module (3). However, the hollow fiber membrane of the mini-module and the distilled water inside the module have not been cleaned until the BPS is filled.
  • the blood was put in from one blood port on the inner side, passed through the hollow yarn, taken out from the other blood port, put into a dialysate port on the blood port side through a tube, and taken out from the other dialysate port. Then, ⁇ -rays were irradiated with the polybulal alcohol aqueous solution filled inside and outside the hollow fiber of the mini-module and the four ports were sealed. At this time, the absorbed dose of ⁇ -rays was 26 kGy. .
  • minimodule (6) The hollow fiber membrane of the mini-module and the inside of the module were washed with 3 L of distilled water at 40 ° C. Thereafter, PBS was filled to obtain a hollow fiber membrane minimodule for concentration (hereinafter abbreviated as minimodule (6)).
  • one mini-module (1) was prepared, one of the outer ports was capped, and the other was connected with a silicone tube.
  • the stock solution inlet and outlet were connected by a silicone tube to form a solution circulation circuit, and a peristaltic pump was provided in the circuit so that the solution could be circulated.
  • a three-way valve in the middle of the solution circulation circuit An infusion pump was installed in one direction of the three-way valve. This was the first stage membrane separation unit.
  • one of the mini modules (2) was capped on one of the outer ports, and the other one was connected with a silicone tube.
  • One of the outer ports of the mini-module (3) was capped, and one was the filtrate outlet.
  • the liquid inside the hollow fiber membrane of this mini-module (3) was also connected to the module stock solution inlet and outlet with a silicone tube to form a solution circulation circuit so that the stock solution could be circulated using a peristaltic pump.
  • Two three-way nozzles were installed in the middle of the solution circulation circuit. This was used as the concentration membrane unit.
  • the treatment liquid recovery port of the third-stage mini-module and the three-way valve of the concentration membrane unit were joined with a silicone tube.
  • a treatment liquid recovery port of the concentration unit with a three-way pressure is provided, and only the solution circulation circuit is opened during the concentration operation.
  • a storage container (1) is provided at the tip of the treatment liquid recovery port. The entire system was filled with PBS, and a composite system was created in which a membrane separation unit that fractionated proteins above albumin by molecular sieving and a protein concentration unit were directly connected.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the separation system used in Example A1.
  • the liquid flow is indicated by arrows.
  • Serum and diluent (PBS) were injected into the first-stage solution circulation circuit 102 via the injection pump 100 and the three-way valve 101.
  • the clarified liquid is fed by the first-stage pump 103, injected into the first separation membrane module 105 (mini module (1)), and the first-stage solution circulation.
  • the circuit 102 was circulated.
  • the solution treated in the first membrane separation unit was obtained from the treatment liquid recovery port 104 of the first membrane separation unit of the membrane separation membrane unit.
  • this solution passes through the three-way valve 201 of the second-stage membrane separation unit, and is further fed into the second-stage solution circulation circuit 202 by the second-stage pump 203, so that the second separation membrane module 205 It was injected into (first minimodule (2)) and circulated through the second stage solution circulation circuit 202.
  • the solution treated by the second membrane separation unit was obtained from the treatment liquid collection port 204 of the second stage membrane separation unit of the second stage membrane separation unit of the treatment liquid collection port.
  • this solution passes through the three-way valve 301 of the third-stage membrane separation unit, and is further fed into the third-stage solution circulation circuit 302 by the third-stage pump 303, and the third separation membrane module 305 (second The mini-module (2)) was circulated through the solution circulation circuit 302.
  • the liquid treated in the third membrane separation unit was obtained from the treatment liquid recovery port 304 of the third stage membrane separation membrane unit. Further, this processing solution passes through the three-way valve 401 of the concentration membrane unit, and is further fed into the fourth-stage solution circulation circuit 402 by the fourth-stage pump 403, and the concentrated membrane module 405 (mini module (3)). The 4th stage solution circulation circuit 402 was circulated. At that time, the liquid that has permeated from the concentrated membrane module 405 is taken out from the filtrate outlet 404 of the concentrated membrane unit and discarded. After completion of the permeation and concentration operation, the solution remaining in the fourth stage solution circulation circuit 402 of the mini-module (3) is opened to the collection container 407 (collection container (1)) by opening the three-way nozzle 406 of the concentration unit. To be taken out.
  • the amount of albumin in the liquid obtained in the collection container 407 was 0.336 g
  • the amount of ⁇ 2 microglobulin was 0.853 g
  • the human used as the stock solution ⁇ albumin content in serum is 31200 ⁇ ⁇
  • ⁇ 2- Mikurogurobu While maintaining the amount of phosphorus, albumin could be significantly removed.
  • recovery container (1) is 16.6ng / cm 2
  • hollow fiber strength of mini-module (2) 3 ⁇ 478.4 ng / cm 2 and the hollow fiber of the minimodule (3) was 429.3 ng / cm 2 .
  • one mini-module (4) was prepared, one of the outer ports was capped, and the other was connected with a silicone tube.
  • the stock solution inlet and outlet were connected by a silicone tube to form a solution circulation circuit, and a peristaltic pump was provided in the circuit so that the solution could be circulated.
  • a three-way valve was provided in the middle of the solution circulation circuit, and an injection pump was attached in one direction of the three-way valve. This was the first stage membrane separation unit.
  • one of the mini modules (5) was capped on one of the outer ports, and the other one was connected with a silicone tube.
  • One of the outer ports of the mini-module (6) was capped, and one was the filtrate outlet.
  • the liquid inside the hollow fiber membrane of this mini module (6) was also connected to the module's stock solution inlet and outlet with a silicone tube to form a solution circulation circuit so that the stock solution could be circulated using a peristaltic pump.
  • Two three-way nozzles were installed in the middle of the solution circulation circuit. This was used as the concentration membrane unit.
  • the amount of albumin in the liquid obtained in the collection container (1) was 0.251 ⁇ g
  • the amount of ⁇ 2 immunoglobulin was 0.981 ⁇ g
  • albumin in human serum used as the stock solution The amount was 31,200 g
  • the amount of j82-microglobulin was 1.19 ⁇ g. While maintaining the amount of ⁇ 2-microglobulin, albumin could be removed significantly.
  • the collection container were identified amount of adsorbed BSA (1) is 17.6ng / cm 2, hollow fiber strength 3 ⁇ 45.6ng / cm 2 of mini-module (4), hollow fiber mini-module (5) The hollow fiber of 39.2 ng / cm 2 and mini-module (6) was 42.8 ng / cm 2 .
  • a filtration operation for 4 hours was carried out in the same manner as in Example A 1 except that the recovery container (2) was used instead of the recovery container (1) of Example A1.
  • Albumin amount in the resulting liquid in collection container (2) is 0.490 g
  • beta 2 microglobulin amount was 0.202 g
  • the amount of albumin in human serum was used as stock solution 31200 ⁇ ⁇
  • ⁇ 2- microglobulin amount was 1.19 ⁇ g and albumin could be removed, but the recovery of 13 2 -microglobulin was low.
  • the collection container (2) was 236.4 ng / cm 2 , mini-module
  • a polystyrene test tube (“5 ml Polystyren Round-B ottom made by BECTON DICKINSON”) is used to collect a solution containing fractionated trace proteins.
  • ushi serum albumin in the present invention is BovineAlbumin Powder, Product Number A7906 manufactured by SIGMA, or an equivalent thereof.
  • PBS Nasui Pharmaceutical Dulbecco PBS
  • protein solution A protein solution
  • the protein solution A prepared in the above was used for the adsorption experiment as follows. That is, as a control sample, a blocking agent (Dainippon Pharmaceutical Release Block Ace Cat.
  • the ⁇ 2-MG concentration was measured using the ⁇ 2-MG measurement kit (Darazym ⁇ 2-m icrogloblin EIA TEST, Code. 305-11011, released by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) according to the manual attached to the kit.
  • the amount of protein adsorbed was calculated by (Formula 5).
  • Polystyrene test tube (“5ml Polystyrene Round-Bottom Tubej from BECTON DICKINSON”) and vinyl alcohol vinyl acetate copolymer (weight average molecular weight 10,000, saponification degree 80%, Aldrich Cat
  • Example 2 The same polystyrene test tube initially prepared in Bl was immersed in 100 ml of Example Bl pobulle alcohol acetic acid butyl copolymer lOppm aqueous solution and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of y-ray was 26 kGy. The polystyrene test tube was removed from the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to a human ⁇ 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example 2 The same polystyrene test tube as that prepared first in Bl was immersed in 100 ml of polybulal alcohol (molecular weight 22000, Code No.28311-25, manufactured by Nacalai Tester) lOOOppm aqueous solution and irradiated with X-rays. The absorbed dose of gamma rays was 25 kGy.
  • the polystyrene test tube was taken out of the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to human j8 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example Bl The same polystyrene test tube as that initially prepared in Example Bl was immersed in 100 ml of a polyalcohol lOppm aqueous solution as in Example B3 and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of gamma rays was 27 kGy.
  • the polystyrene test tube was removed from the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with running water (500 ml), and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to human j8 2_microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Polypropylene alcohol (molecular weight 10000, Aldrich Cat) from a polypropylene test tube (BECTON DICKINSON “5ml Polypropyrene Round- Bottom Tube”)
  • No. 360627 It was immersed in 100 ml of lOOOOppm aqueous solution and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of gamma rays was 25 kGy.
  • the polystyrene test tube was removed from the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour. This test tube was subjected to human j8 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example B5 The same polypropylene test tube as initially prepared in Example B5 is the same as Example B5. It was immersed in 100 ml of lOppm aqueous solution of polybulal alcohol and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of ⁇ rays was 25 kGy. The polystyrene test tube was removed from the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to a human j82_microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example B5 The polypropylene test tube prepared first in Example B5 was immersed in 100 ml of polybulol alcohol (molecular weight 22000, Code No.28311-25, manufactured by Nacalai Testa) lOOOOppm and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of gamma rays was 26 kGy.
  • the polystyrene test tube was removed from the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to human j8 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example B8> The results are shown in Table 3.
  • Example B5 The same polypropylene test tube as that prepared in Example B5 at the beginning was immersed in 100 ml of an aqueous polybutyl alcohol solution of lOppm as in Example B7 and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of ⁇ rays was 27 kGy.
  • the polystyrene test tube was removed from the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to a human j82_microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example B1 The same polystyrene test tube initially prepared in Example B1 was washed with 500 ml of running water and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour. This test tube was subjected to human j8 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example B5 The same polypropylene test tube initially prepared in Example B5 was washed with 500 ml of running water and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour. This test tube was subjected to a human j8 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example B1 The same polystyrene test tube initially prepared in Example B1 was immersed in 100 ml of polybulolpyrrolidone (molecular weight 50000, BASF Kollidon 25) lOOOOppm aqueous solution and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of gamma rays was 25 kGy. Polystyrene pyrrolidone in water with polyvinylpyrrolidone The product was taken out from the solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to a human ⁇ 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example 2 The same polystyrene test tube initially prepared in Bl was immersed in 100 ml of polybulolpyrrolidone (molecular weight 3000, Kollidonl2PF, BASF) lOOOppm aqueous solution and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of gamma rays was 27 kGy.
  • the polystyrene test tube was taken out from the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to a human ⁇ 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example 2 The same polystyrene test tube initially prepared in Example Bl was immersed in 100 ml of polyethylene glycol (molecular weight 20000, polyethylene glycol 20000 manufactured by Katayama Chemical Co., Ltd.) 1000 ppm aqueous solution and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of gamma rays was 25 kGy.
  • the polystyrene test tube was taken out of the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to a human ⁇ 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example 2 The same polystyrene test tube initially prepared in Bl was immersed in 100 ml of polyethylene glycol (molecular weight 2000, polyethylene glycol 2000 manufactured by Wako Pure Chemical Industries) lOOOOppm aqueous solution and irradiated with ⁇ rays. The absorbed dose of gamma rays was 26 kGy.
  • the polystyrene test tube was removed from the polyvinyl alcohol aqueous solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to human j8 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • Example 2 The same polystyrene test tube prepared initially in Bl was immersed in 100 ml of polyethyleneimine (molecular weight 25000, Aldrich Cat. Code 40872-7) lOOOppm aqueous solution and ⁇ -irradiated. The absorbed dose of gamma rays was 26 kGy. The polystyrene test tube was removed from the aqueous polyvinyl alcohol solution, washed with 500 ml of running water, and dried in an oven at 70 ° C for 1 hour. This test tube was subjected to a human 13 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3. ⁇ Comparative Example B8>
  • Example B1 The inner wall of the same polystyrene test tube initially prepared in Example B1 was washed with 15 ml of methanol and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour.
  • the test tube was immersed in 100 ml of a 25000 ppm methanol solution of MPC and butyl methacrylate copolymer for 1 minute.
  • the test tube was taken out of the polyhydroxyethyl methacrylate solution, and the solution in the test tube was discharged and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour.
  • the test tube was washed with 500 ml of running water and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour.
  • This test tube was subjected to human j8 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3. Comparative Example 9>
  • the inner wall of the same polypropylene test tube prepared initially in Example B5 was washed with 15 ml of methanol and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour.
  • This test tube was immersed in 100 ml of a 25000 ppm methanol solution of MPC and butyl methacrylate copolymer for 1 minute.
  • the test tube was taken out of the polyhydroxyethyl methacrylate solution, and the solution in the test tube was discharged and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour.
  • the test tube was washed with 500 ml of running water and dried in an oven at 70 ° C. for 1 hour.
  • This test tube was subjected to human j8 2-microglobulin adsorption test. The results are shown in Table 3.
  • the fractionation device of the present invention is very useful in preparing a sample for performing proteome analysis, and can be used for the discovery of medicine, particularly human diseases.

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Abstract

　本発明では以下いずれかの特徴を特徴を有するのタンパク質および／またはペプチドの分画装置を開示する。 １）タンパク質等が接触する基材表面の少なくとも一部が、ウシ血清アルブミン溶液を接触させたときの該基材表面へのウシ血清アルブミンの吸着量が５０ｎｇ／ｃｍ２以下であるもの、 ２）タンパク質等が接触する基材表面の少なくとも一部が、該基材表面にヒトβ２-ミクログロブリンとウシ血清アルブミンとからなるタンパク質水溶液に接触させたとき、該基材に対するヒトβ２-ミクログロブリン吸着量が３ng/cm2以下であるもの、 ３）タンパク質等を含有する溶液を供給する供給手段、溶液からタンパク質等を分離する手段、ならびに溶液の中のタンパク質等を濃縮する手段を有し、分画装置におけるタンパク質等が接触する基材表面の少なくとも一部が、親水性高分子によってグラフトされているもの。　上記構成の装置により、基材へのタンパク質の非特異吸着が少なく、高分子量のタンパク質が除去された分析に有利な試料が容易に得られる。

Description

明 細 書
分画装置
技術分野
[oooi] 本発明はタンパク質および Zまたはペプチドを含有する溶液、特に血液、尿等の 体液から、タンパク質および Zまたはペプチドなどの生体成分を分離して分析用溶 液を調製するための分画装置に関する。
背景技術
[0002] 近年、ポストゲノム研究として、プロテオーム解析研究 (プロテオミタス）が注目され 始めた。遺伝子産物であるタンパク質は遺伝子よりも疾患の病態に直接リンクしてい ると考えられることから、タンパク質を網羅的に調べるプロテオーム解析の研究成果 は診断と治療に広く応用できると期待されている。し力も、ゲノム解析では発見できな 力つた病因タンパク質や疾患関連因子を多く発見できる可能性が高い。
[0003] プロテオーム解析の急速に進展しだしたのは、技術的には質量分析装置 (mass sp ectrometer: MS)による高速構造分析が可能となってきたことが大きぐ MALDI-TOF -MS(matnx
assisted laser desorption ionization time— of— flight mass spectrometry)等の^!用ィ匕に よって、ポリペプチドのハイスルースループット超微量分析が可能となり、従来検出し 得な力つた微量タンパク質までが同定可能となり、疾患関連因子の探索に強力なッ 一ノレとなってきている。
[0004] プロテオーム解析の臨床応用の第一目的は、疾患によって誘導あるいは消失する バイオマーカータンパク質の発見である。バイオマーカーは、病態に関連して挙動す るため、診断のマーカーとなり得るほか、創薬ターゲットとなる可能性も高い。すなわ ち、プロテオーム解析の成果は、特定遺伝子よりも診断マーカーや創薬ターゲットと なる可能性が高 、ため、ポストゲノム時代の診断と治療の切り札 (ェビデンス)技術と なり、同定されたバイオマーカーは患者の薬剤応答性評価や副作用発現予測という 直接的に患者が享受しえる利益につながることから、いわゆるテーラーメード医療 (ォ ーダーメード医療)の推進に大きな役割を果たすといえる。 [0005] 臨床研究にプロテオーム解析（臨床プロテオミタス）を導入する場合には、大量の 検体を迅速、確実に解析することが求められており、し力も臨床検体は微量で貴重な ために高分解能 ·高感度 ·高機能測定を迅速に行う必要がある。この大きな推進力と なったのは質量分析 (massspectrometry)であり、質量分析装置のもつ超高感度でノ、 イスループットの特性の貢献するところが大きい。しかしながら、その手法や機器が急 速に改良されてきてはいるものの、プロテオーム解析が臨床現場で簡便かつ迅速に 実施できる状況にはまだな 、。
[0006] ヒト 'タンパク質は 10万種以上とも推定されている力 血清中に含まれるタンパク質 だけでも約 1万種類にものぼるといわれ、総量としての血清中濃度は約 60〜80mg/m Lである。血清中の高含量のタンパク質は、アルブミン (分子量 66kDa)、免疫グロブリ ン (150〜1000kDa)、トランスフェリン (80kDa)、ハプトグロビン (〉85kDa)、リポタンパク質 ( 数 lOOkDa)等であり、いずれも大量 (〉mg/mL)に存在する。一方、病態のバイオマーカ 一や病因関連因子と考えられているペプチドホルモン、インターロイキン、サイトカイ ン等の生理活性タンパク質の多くは、極微量 (く ng/mL)にしか存在せず。その含有量 比は高分子の高含量成分に比べて、実に nanoから picoレベルである。タンパク質の 大きさという点では、タンパク質全種類の 70%以上は分子量 60kDa以下であり、上記 の極微量なバイオマーカータンパク質はいずれもこの領域に含まれる場合がほとん どである (例えば非特許文献 1)。これらのタンパク質は腎臓を通過して尿中に一部排 泄されるため、血液のみならず尿を検体として測定することも可能である。
[0007] 一般的な血清中のタンパクのプロテオーム解析において、病因関連の微量成分検 出の妨害となる分子量 6万以上の高分子成分を除外することがまず必須となる。さら に、分子量 6万未満の成分についてはできるだけ多く回収することが必須となる。
[0008] この高分子量タンパク質の分離手段として、高速液体クロマトグラフィー (liquid chro matography: LC)や二次元電気泳動
(2dimensional-polyacrylamide gel electrophoresis: 2D— PAGE)力あ 。また、ァノレブミ ンを主な対象物質として、すでに実用化されている製品、あるいは開示されている技 術としては、ブルー色素などのァフィユティーリガンドを固定ィ匕した担体 (たとえば、日 本ミリポア社：" MontageAlbumin Deplete Kit",日本バイオ.ラッド社: AffiGel Blueゲル）、高分子量成分を遠心分離ろ 過によって分画する遠心管形式の装置 (たとえば、日本ミリポア社: "アミコンウルトデ )、特表 2002— 542163号公報 (特許文献 1)に開示されている電気泳動原理によつ て分画する方法（たとえば、ダラディポア社：" Gradiflow"システム）、 Cohnのエタノー ル沈澱などの伝統的な沈殿法やクロマトグラフィーによって分画する方法 (例えば非 特許文献 2)などがある。一般的にこれらの技術が質量分析の前処理操作として行わ れてきた。
[0009] タンパク質を取り扱う場合、常に基材表面へのタンパク質の非特異吸着が問題とな る。この基材表面への非特異吸着は、タンパク質の減少による分析結果のバラツキを 引き起こすだけではなぐ分析対象タンパク質のロスといった重大な問題を引き起こ すので、非特異吸着を防ぐ必要がある。一般的にタンパク質の非特異吸着によるタン パク質の減少率は溶液中のタンパク質の総濃度に依存し、タンパク質の総濃度が低 V、ほどタンパク質の減少率が大きくなる。特に上述のようにプロテオーム解析にお ヽ て病因関連の微量成分を質量分析で分析する場合、既存の前処理装置には非特 異吸着を抑制する処理が施したものがないために、検出を阻害する成分を除外して 得られる分画液のタンパク質の総濃度は極めて低く、微量バイオマーカータンパク質 の非特異吸着による減少 ·ロスが問題となって!/、る。
このようなタンパクやペプチドの付着によるロスの問題に対して、大きく分けて二通り の対策がある。一つは吸着を抑制する化合物を生体成分溶液に添加する方法、もう ひとつは基材表面の生体成分非吸着処理である。前者の代表的な方法として、プロ ッキング剤を添加する方法がある。ブロッキング剤はアルブミンやカゼインの溶液であ り競争吸着により有用生体成分の吸着を抑制する方法である。競争吸着であるため にブロッキング剤濃度は有用生体成分の濃度より高くするのが一般的である。したが つて、分析用途ではブロッキング剤が分析を阻害したり、少量の添加でも生体成分が 構造変化する危険性がある。ブロッキングの他に界面活性剤や有機溶媒を添加する 方法もあるが、これもブロッキング剤と同様に分析系の阻害や生体成分の構造変化 に伴う変'性が問題となる。
[0010] 基材表面の非吸着処理として一般的なのは基材表面の親水化処理である。親水 化処理にはいくつかの方法がある。例えば基材へ親水性化合物、例えば 2-メタクリロ ィルォキシェチルホスホリルコリン共重合体（以下 MPCと略記）をコーティング処理に より導入する方法が特許文献 2に記載されている。親水性化合物をグラフト処理によ り導入する方法が特許文献 3、特許文献 4に記載されている。リアクティブイオンエツ チング処理、プラズマ処理やイオンクラスタービーム処理のように、基材表面へ親水 性の官能基を直接生成する方法がある。
[0011] し力しながら、従来の基材表面処理方法で処理した基材は、高濃度のタンパクや ペプチドの溶液と接触した場合には生体成分の吸着抑制効果は認められるが、低濃 度の生体成分を含有する溶液と接触した場合は依然として吸着による生体成分の減 少ゃロスが発生し、課題解決には未だ十分と 、えるレベルのものではな力つた。
[0012] さらに親水性高分子によるコーティング処理による手法は、処理された基材に対し て、さらに親水性高分子溶液に用いた溶媒が接触した場合、コーティングが剥離す るなどして親水性が低下することが懸念される。また、分析や分離等の処理装置にお いては、溶出した親水性高分子が後の分析の阻害因子となりうることが懸念される。
[0013] 親水性高分子グラフトによる親水化はグラフト量に比例して親水性が向上するが 、処理する親水性高分子溶液の濃度が高くなると親水性高分子同士で三次元的に 架橋してしまうために親水性高分子の運動性が低下してしま!、、生体成分の付着抑 制効果が低くなるという問題がある。
[0014] また、リアクティブイオンエッチング処理、プラズマ処理やイオンクラスタービーム処 理は基材の外表面や板状基材の片面などへは簡便に親水化を行うことができるが、 プラズマやイオンクラスタービームなどの影になる部分を親水化することが難しいの で、板状の基材の両面や中空形状の基材内外表面などの多面を 1回の処理で親水 ィ匕するのには適していない。また、基材の生体成分の吸着特性は、生体成分と接触 する部分の表面状態に依存し、一般的には、表面の親水性が高いほど、さらに表面 に固定化された親水性分子の運動性が高いほど、生体成分の基材表面への吸着は 抑制される。運動性の高い親水性分子は、その分子運動によって、タンパク質や血 小板などの生体成分を排除して 、ると考えられて 、る。リアクティブイオンエッチング 処理、プラズマ処理やイオンクラスタービーム処理による親水化は基材表面に水酸 基などの親水性官能基が生成することによる、したがって親水性高分子の基材表面 への導入による親水化と比較して親水性分子の運動性は低 1、ので、生体成分の付 着抑制効果は低く好ましくない。さらに、処理中に高温になる場合があるので基材が 変性することもあるため好ましくな 、。
[0015] このように、吸着抑制処理の技術が確立されて!、な 、ために、タンパクおよび Zま たはペプチドを分画する装置にお!、ても吸着抑制処理が施されて!/、る装置はな!/、。 特許文献 1：特表 2002— 542163号公報
特許文献 2 :特開 2003— 130882号公報
特許文献 3：特開昭 58—40323号公報
特許文献 4：特許第 3297707号公報
非特許文献 1：アンダーソン 'NL(Anderson NL),アンダーソン 'NG( Anderson, NG)著 , 「ザ ·ヒューマン'プラズマ ·プロテオーム：ヒストリ^ ~ ·キャラクタ^ ~ ·アンド'ダイァグノス アイツグ'プロスへグッ (Thehuman plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects)] ,モレキュラー 'アンド'セノレラー ·プロテオミクス (Molecular&Cellular Prot eomics), (米国），ザ'アメリカン 'ソサエティ一'フォ一'バイオケミストリ一'アンド'モレ キュフー'ノ ィォロシ一 'インコーポレーアッド (TheAmericanSociety for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.), 2002年，第 1卷， p845- 867.
非特許文献 2 :日本生化学会編， 「新生化学実験講座 (第 1卷)タンパク質 (1)分離，精 製，性質」，東京化学同人， 1990年
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0016] 上述のとおり、臨床プロテオーム解析をする際に、質量分析を妨害する高分子量タ ンパク質を除去する前処理操作が必要である。プロテオーム解析で分析対象となりう るタンパク質は微量であり、かつ前処理により総タンパク質濃度が低下するので、基 材に対する非特異吸着によって分析対象タンパク質をロスし、安定したプロテオーム 解析ができないという問題がある。安定したプロテオーム解析を行うために、上述の 前処理におけるタンパク質の非特異吸着を抑制することが重要であり、基材へのタン パク質の非特異吸着が少なぐ高分子量のタンパク質が除去された有利な分析用溶 液を容易に調製できる装置を提供することが課題である。
課題を解決するための手段
[0017] 上記課題を解決するために、本発明では以下の手段を採用する。
1)タンパク質および Zまたはペプチドの分画装置であって、タンパク質および Zまた はペプチドが接触する基材表面の少なくとも一部力 1000 gZmlのゥシ血清アル ブミン溶液を接触させたときの該基材表面へのゥシ血清アルブミンの吸着量が 50ng Zcm2以下である分画装置。
2)タンパク質および Zまたはペプチドの分画装置であって、タンパク質および Zまた はペプチドが接触する基材表面の少なくとも一部が、該基材表面に濃度 200ng/ml のヒト j8 2-ミクログロブリンと濃度 10 μ g/mlのゥシ血清アルブミン力もなるタンパク質 水溶液に接触させたとき、該基材に対するヒト j8 2-ミクログロブリン吸着量が 3ng/Cm2 以下である分画装置。
3)タンパク質および Zまたはペプチドの分画装置であって、タンパク質および Zまた はペプチドを含有する溶液を供給する供給手段、溶液からタンパク質および Zまた はペプチドを分離する手段、ならびに溶液の中のタンパク質および Zまたはペプチド を濃縮する手段を有し、分画装置におけるタンパク質および Zまたはペプチドが接 触する基材表面の少なくとも一部が、親水性高分子によってグラフトされている分画 装置。
[0018] 以上の構成をとることによって、 分画操作によっても分析の目的とするタンパク質 の損失を少なく回収できるものである。
図面の簡単な説明
[0019] [図 1]本発明の実施例 A1で用いた分画装置の概略図である。また図における符号の 意味は以下のとおりである。
符号の説明
[0020] 100注入ポンプ
101三方バルブ
102 1段目溶液循環回路 (チューブ回路） 103 1段目ポンプ
104 1段目の膜分離ユニットの処理液回収口
105第 1分離膜モジュール
201三方バルブ
202 2段目溶液循環回路 (チューブ回路）
203 2段目ポンプ
204 2段目の膜分離ユニットの処理液回収口
205第 2分離膜モジュール
301三方バルブ
302 3段目溶液循環回路 (チューブ回路）
303 3段目ポンプ
304 3段目の膜分離ユニットの処理液回収口
305第 3分離膜モジュール
401三方バノレブ
402 4段目溶液循環回路 (チューブ回路）
403 4段巨ポンプ
404濃縮膜ユニットの処理液回収口
405濃縮膜モジュール
406回収用三方バルブ
407回収容器
発明を実施するための最良の形態
本発明でいうタンパク質および Zまたはペプチドの分画装置とは、分子量別または タンパク質もしくはペプチドが有する特性別にこれらを分離する装置である。その手 法としては、分子量、イオン相互作用、疎水性相互作用、抗体に代表される生物学 的相互作用などが使用できる。一般的には、タンパク質またはペプチド試料を供給 するする供給手段と、分離を行う分離手段を備える装置である。血清、血漿、尿など に代表される体液や、人為的に調製したタンパク質またはペプチドを含む溶液や、 細胞培養によって生じた培養上清などの検体をそのままの濃度で、あるいは pH緩衝 溶液などで希釈して供給手段に投入すると、検体が移動相によって搬送され、移動 相の流路に設置された、膜、ゲル、吸着体を備えた分離手段で分離される。本発明 の分画装置によって分離された目的とするタンパク質またはペプチド含む溶液は、必 要に応じて紫外線吸収、蛍光、比色などによって定量されたり、タンパク質またはべ プチドと共に含まれる水分を除去されることにより濃縮されたり、一定量ずつ分取また は回収される。定量、濃縮、分取、回収の工程の為の手段は必ずしも分離工程の手 段と一体化されていなくてもよいが、分離手段と、定量、濃縮、分取、回収の少なくと も一つの手段がさらに連結されて 、る装置が好まし 、。タンパク質またはペプチドを 分離し、さらに回収した後行われる分析装置の要求により、高い濃度のタンパクまた はペプチド溶液を調製する必要がある場合には、分離手段の後濃縮手段が続いて V、る装置が好まし 、。移動相を用いてタンパク質またはペプチドをを搬送せしめる手 段は特に限定されず、例えばチューブ、パイプ、溝などからなる流路をチューブボン プ、ギヤポンプ、ダイヤフラムポンプ、シリンジポンプなどが例示される。
[0022] 特にプロテオーム解析の前処理用の試料を得るための装置として用いる場合には 、生体由来の溶液から分析の目的とする微量成分を多く含む溶液へ調製すること〖こ なる。その機能は、分子量の高い (例えば分子量 6万以上)のタンパク質を除去し、一 方、プロテオーム解析の対象となりうる分子量の低い（例えば分子量 1. 5万未満）の タンパク質を回収することである。また、力 うな目的の装置は、タンパク質を分離す る手段、タンパク質を濃縮する手段、および分画により得られたタンパク質を回収す る手段力も選ばれる手段を有し、さらにタンパク質溶液を送液する手段を有すること が好ましい
ここで!/、う分子量 6万以上のタンパク質とは、血液であればアルブミンや免疫グロブ リン、トランスフェリンなどが該当する。このようなタンパク質は血液の場合にはタンパ ク質成分全体に対し高含有率で存在する。本発明の分画装置の機能評価としてここ では分子量が 6万に近いゥシ血清アルブミンを指標にした。また、分子量 1. 5万未満 のタンパク質とはタンパク質の中でも比較的分子量が小さいタンパク質であり、血液 であれば総タンパク質に対して存在割合が低いが、種類は非常に多い。
[0023] 本発明の分画装置が分離手段を有する場合、タンパク質またはペプチドを含む溶 液は分離工程の際に希釈される場合がある。たとえば、検体を膜によって分離した場 合、通常は溶媒も減少する。タンパク質またはペプチドの濃度が高くなつていくと膜 表面に堆積物が積層し膜孔が目詰まりを起こし分離効率が低下する。それを回避す るために希釈液を加えてタンパク質濃度が増加しな 、ようにすることがある。
[0024] し力しながら、分析の障害となるタンパク質を除去しても目的とするタンパク質の濃 度が低い場合、分析装置の検出限界以下となってしまう恐れがある。したがって、分 離の後目的成分を含む溶液の濃度が低い場合は、分離手段の後に濃縮手段を有し 、濃縮操作をすることが好ましい。また、溶媒のみを除去してしまうと、溶液中の塩濃 度が増加しすぎてタンパク質が変性してしまう恐れがあるので、溶媒と同時に塩も除 去することが好ましい。主な濃縮操作として、加熱や減圧による溶媒の蒸発や凍結乾 燥による方法、溶媒分子を優先的に透過する分離膜を用いて濾過や透析により溶媒 を除去する方法、吸水ゲルなどの溶媒を吸収除去する方法、分子ふるい効果、ィォ ン的相互作用、疎水的相互作用、水素結合、ァフィ二ティーによる特異的結合などを 利用したクロマトグラフィーにより濃縮する方法、電気泳動、遠心分離などが挙げられ 、これら操作を組み合わせることも可能である。本発明の分画装置ではこれらの操作 の!、ずれかを行える手段を有して 、ることが好ま 、。
[0025] 本発明のタンパク質またはペプチドが接触する基材としては、タンパク質またはべ プチドを含有する試料を供給する手段、ならびに分離、吸着、定量、濃縮、分取、回 収の 、ずれかの処理を行う手段の 、ずれかでタンパク質またはペプチドを含有する 溶液が接触する構成素材が例示される。本発明の装置においては、検体が接触す る基材表面の少なくとも一部に親水化処理されて 、ることが好ましく、なるべく全ての 基材表面に親水化処理されて ヽることが最も好ま ヽ。
[0026] 基材を構成する素材は特に限定されないが、化学的な加工や表面修飾が容易で、 押し出し成形や射出成形など安価に大量生産が可能な高分子材料が好ましい。高 分子材料の例としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート 、ポリメチルメタタリレート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリウレタン、ポリ塩 化ビュル、ポリ塩化ビ-リデン、ポリアクリロニトリル、セルロース、セルロースァセテ一 ト、セルローストリアセテート、ポリアミド、ポリイミド、ポリテトラフルォロエチレン、ビ- ルアルコール.エチレン共重合体、シリコンゴム、エポキシ榭脂、フエノール榭脂等が あげられるがこれらに限定されるものではない。
[0027] 本発明の分画装置においては、タンパク質またはペプチドが接触する基材表面の 少なくとも一部にタンパクまたはペプチドが吸着しにくい表面を設けることにより、吸 着ロスを抑えるだけでなく、更なる作用としてタンパク質またはペプチドの吸着 ·堆積 · 目詰まりによる分離性能の低下を抑えることを可能にした点が重要である。その結果 として、高い回収率を達成した。これを達成する表面特性は、基材表面の 0. 01cm2 以上 10cm2以下の範囲に 1000 μ g/mlのゥシ血清アルブミン溶液を接触させたと きの該基材表面へのゥシ血清アルブミンの吸着量が 50ngZcm2以下の表面である 。または、基材表面に濃度 200ng/mlのヒト |8 2-ミクログロブリンと濃度 10 g/mlのゥ シ血清アルブミンカゝらなるタンパク質水溶液に接触させたとき、該基材に対するヒト β 2-ミクログロブリン吸着量が 3ng/cm2以下の表面である。このような表面特性は以下 の方法で評価される。
[0028] 基材表面に対するタンパク質の吸着評価について、比較的安価で汎用的なタンパ ク質であるゥシ血清アルブミン (以下 BSAと略す)の溶液で行う場合にっ 、て説明する 。 BSA溶液とは不純物などによる吸着のばらつきを抑えるために BSA (SIGMA製 ALB UMIN,BOVINE(A-7906)をリン酸緩衝生理食塩水（日水製薬 (株）製 PBS (-)粉末 (162 -21112)9. 6gを大塚製薬発売注射用水 (2069)に溶解して 1リットルとなるよう調製した 溶液、以下 PBSと略す）に 1000 gZmlとなるよう溶解したものを使用する。また基 材に対する BSA溶液を接触させる面積は小さすぎると正確な分析ができなるおそれ 力 Sあること、逆に大きすぎると使用するタンパク質量が多くなつてしま 、効率が悪くな つてしまうので 0. 01cm2以上 10cm2以下の範囲で行うこととする。 0. 1cm2以上 5c m2以下の範囲で行うことがより好ま U、。
[0029] BSA溶液と接触させる面は実際にタンパク質の前処理にぉ ヽてタンパク質溶液と接 触する面で行うこととし、例えば基材の断片などを含む場合は断面などへの BSAの吸 着は評価しないこととする。表面積について、基材が分離膜もしくは濃縮膜ではない 場合、基材表面の中心線平均粗さが 0. 1 m未満であるときは表面の凹凸による面 積の増加は勘案しないが、基材表面の中心線平均粗さが 0. 1 m以上であるときは 表面の凹凸による面積の増加を勘案することにする。中心線平均粗さの測定は JIS-B 0601付属書 2記載の方法で行うこととする。表面の凹凸を勘案した表面積は、 B.E.T. 法などでのガス吸着法やキーエンス社の超深度顕微鏡「VK9500」などによる三次元 形状測定顕微鏡により測定することが可能である。
[0030] 一方、基材が中空糸分離膜もしくは中空糸濃縮膜の場合の膜面積は以下のとおり に算出される。 37°C、 pH7. 2に調整した 5重量％の BSA水溶液で溶液流量 200ml Zmin、濾過流量 15mlZminの使用条件で、対象となる膜 1. 5m2を充填したモジュ ールを用いて濾過し、濾過開始から 30分後の BSAのふるい係数が 0. 1以上であると き、 BSAは膜の内表面に接し、膜を透過した後に膜の外表面にも接触しながら移動 するので、膜の細孔内表面および外表面も表面積とする。一方、 BSAのふるい係数 が 0. 1未満であるときは BSAはほとんど膜を透過できず、膜内表面にし力接触しない ため、膜の内表面を表面積とする。
[0031] BSAのふるい係数は以下の数式で算出される。
[0032] (a) = 2 X (b) / ( (c) + (d) )
ここで (a)は BSAのふるい係数、（b)は濾過液の BSA濃度であり、（c)は膜分離前の 原液側 BSA濃度、（d)は膜分離後の原液側 BSA濃度である。
[0033] 接触させる時間は、短すぎると吸着平衡に達する前であるおそれがあり、一方長す ぎるとタンパク質が変性する危険性があるので 2時間で行うこととする。また、 BSA溶 液量は少なすぎるとタンパク質の絶対量が少なくなるので膜面積 lcm2あたり 50 μ 1 以上で行うこととする。また、吸着量は温度の影響を大きく受けるので、 BSA溶液と基 材と接触させる際は 25°Cで行う必要がある。
[0034] 吸着した BSAの吸着量の定量の仕方として以下の方法が例示される。基材を 50ml の PBSに 10秒間 2回浸積し洗浄した後、 1ml以上 30ml以下の範囲の 50体積％の酢 酸水溶液に室温 12時間浸積し、酢酸水溶液を凍結乾燥することで行う。乾燥 BSAが 再び壁に吸着しないように、ブロッキング剤を含む水溶液に乾燥 BSAを溶解し、該溶 液を定量に用いることとする。溶液中の BSAの定量は BETHYL社 Bovine
Albumin ELISA Quantitation Kit (ElO-113)もしくはその同等品で行うことができる。
[0035] タンパク質が水に溶解しているときは、親水性のドメインがタンパク質分子の表面に 存在し、疎水性ドメインタンパクの内部に存在している。タンパク質が疎水性の基材 に接触すると内部の疎水性ドメインが表面に露出し疎水性相互作用により基材に吸 着すると考えられる。したがって、タンパク質の吸着を抑制するためには基材表面の 親水化が有効である。特に、親水性高分子を基材表面にグラフトすると親水性高分 子による親水化の効果に加えて、タンパク質溶液中に伸展した親水性高分子鎖のミ クロブラウン運動による排除体積効果によるタンパク質吸着抑制効果も期待できるの で好ましい。
[0036] 親水化処理とは基材表面に親水性を付与する処理であり、基材の原料に親水性の 化合物を混入させる方法、化学反応や放射線照射などで基材表面に親水性の官能 基を生成させる方法、化学反応や放射線照射により親水性高分子をグラフトする方 法などがあり、中でも親水性高分子をグラフトする方法が好ましい。その中でも親水 性高分子を放射線照射によりグラフトする方法は親水性高分子の種類や分子量など を選択することで親水性をコントロールすることが容易でかつ、副生成物も少なく滅菌 も同時にできることから好ましい。
[0037] 親水性の官能基とは静電相互作用や水素結合などによって水分子と弱い結合を 生成する官能基である。例えば水酸基、カルボキシル基、アミノ基、ニトロ基、アルデ ヒド基、チオール基、スルホン酸基、硫酸基、アミノ硫酸基などがあげられるがこれら に限定されるものではない。このうち、水酸基は、非イオン性の官能基であり強い表 面電荷を有するタンパク質との相互作用が小さぐかつ酸ィ匕還元力も小さいのでタン ノ ク質の変性も小さ 、ので好ま ヽ。
[0038] 親水性高分子とは水に可溶な高分子および水に不溶でも静電相互作用や水素結 合で水分子と弱い相互作用をしうる高分子を指す。例えば、ポリビニルアルコール、 ポリアリルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリプロピレング リコール、ポリエチレンィミン、ポリアリルァミン、ポリビュルァミン、ポリ酢酸ビュル、ポリ アクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリルアミド、糖ィ匕合物などやこれらと他のモノマ 一との共重合体や、グラフト体などが挙げられる力 これらに限定されるものではない 。中でもポリビニルアルコールまたはポリビニルアルコール共重合体が効果が高く特 に好ましい。ポリビニルアルコールの共重合体としては、重合体を構成する分子中の モノマー繰り返し単位としてビュルアルコール単位数が全モノマー繰り返し単位数に 対して 10%以上 100%未満含有する重合体であることが好ましい。
ポリビニルアルコール共重合体としては、分子中に式（1)の化学構造式で表される モノマー繰り返し単位と式（2)の化学構造式で表されるモノマー繰り返し単位を有す る共重合体が好ましく使用される。またその他の共重合成分を含有していてもよい。 またケンィ匕度とは数式 (2)で求められる数値である。ケンィ匕度が低 、と親水性が低く なり水に対する溶解性が低下する傾向にあるので、水溶液として基材に対して表面 処理することが困難となるので好ましくは 0. 70以上、より好ましくは 0. 74以上、さら に好ましくは 0. 78以上で 1未満である。ケン化度が 1の場合はポリビュルアルコール となるが、上述のとおりこれも好ましい態様である。
[0039] [化 1]
Figure imgf000015_0001
式 （1 )
[0040] [化 2]
Figure imgf000015_0002
式 （2 )
[0041] (k) = (m)/ ((n) + (m))数式 (1)
(数式 1)中の記号は以下の通り。
(k) :ケン化度
(m)：ポリビュルアルコール共重合体中の式（1)で表されるモノマー繰り返し単位数 (n)：ポリビニルアルコール共重合体中の式（2)で表されるモノマー繰り返し単位数 なお共重合体はランダム共重合、交互共重合体、ブロック共重合、グラフト共重合 のいずれでも良ぐこれらの組み合わせでも良い。
[0042] 親水性高分子の分子量は、小さ!、と親水性高分子の分子運動性が小さくなるので 、重量平均分子量が好ましくは 1000以上、より好ましくは 5000以上、さらに好ましく は 10000以上であるとよい。
親水性高分子を基材へ導入する方法としては表面へのコーティングも用いることが できるが、基材へのグラフトが溶出も少なく好ましい。特に放射線を用いたグラフトは 副生成物も少なく好ましい。また、基材を水酸基を有する親水性高分子溶液、好まし くは水溶液に接触させて、そこで放射線によってグラフトするのがよい。 放射線は α 線、 ι8線、 γ線、 X線、紫外線、電子線などが用いられる。分画装置を長期間保存を する場合、菌が発生して性能低下を引き起こすおそれがある。特に分離または濃縮 する手段を有する分画装置では、これらの手段中に水をすでに含ませていることが できるが、含水状態では菌が増殖するリスクが大きくなるので滅菌することが好ましい 。近年は簡便さの点から、放射線滅菌法が多用されており、特に、 γ線などの電磁波 線や電子線が好適に用いられている。すなわち、放射線による方法を用いることによ り、滅菌と親水化処理が同時に達成できるので好ましい。線量は滅菌が必要な場合 は 15kGy以上で行うことが好ましいが、滅菌が必要ない場合は親水化処理の効率と 基材の劣化防止の点から 0. 5kGy以上 200kGy以下の範囲で行うことが好ましぐ 1 kGy以上 lOOkGy以下の範囲で行うことがより好ましい。
本発明の分画装置において、膜を用いて分離あるいは濃縮を行う場合には、平面 フィルター、カートリッジ式フィルタ一等の平膜型分離膜 (以下「平膜」という。）、中空 糸等の中空状分離膜（中空糸膜)のいずれも用いることができるが、一般に、中空糸 は処理液量あたりの膜表面積が大きぐ圧損も少なくできるため、最も効率よく用いる ことができる。処理液量あたりの膜表面積を大きくするためには、中空糸内径は小さ い方が好ましぐ 1000 m以下力 S好ましく、 500 m以下がより好ましい。また、平面 フィルタ一は製膜が容易で安価に作成することができると言う利点がある。膜素材とし ては、セノレロース、セノレロースアセテート、ポリカーボネート、ポリスノレホン、ポリメチノレ メタタリレート等のポリメタタリレート、ポリアタリレート、ポリアミド、ポリ弗化ビ-リデン、 ポリアクリロニトリル、ポリエステル、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリエチレンおよびポリ プロピレンおよびこれらの誘導体からなる群より 1種類以上選択される素材を例示す ることができる。この中でも近年透析器などに良く用いられているポリスルホンは分画 特性が良好であるために好まし 、素材である。
実施例
[0044] 以下実施例にて本発明を詳細に説明する力 本発明の範囲がこれらの実施例に のみ限定されるものではな 、。
くく実施例 A》
く回収容器の BSA吸着量測定〉
SIGMA製 ALBUMIN, BOVINE(A- 7906, Lot.41kl270)100mgを PBSlOOmlに溶解し て 1000 g/mlの BSA溶液を調製した。該 BSA溶液を回収容器に 2mlカ卩え、溶液が 蒸発しないようにキャップをし、 25°C、 4時間静置させた。このとき、 BSA溶液は回収 容器内表面の 4.0cm2に接触し、この面積を用いて BSA吸着量を計算することとする。 回収容器中の BSA溶液をァスピレーターで吸引して取り除き、 PBS3mlで 5回洗浄した 。回収容器に 50体積％の酢酸水溶液 3mlカ卩えて 25°Cで 12時間静置し、回収容器ご と凍結乾燥した。回収したい BSAが回収容器表面に吸着するのを抑制するために、 回収容器に大日本製薬製ブロックエース粉末（UK- B40,lot.STK084206) 40gを水 1リ ットルに溶解させた液を lmlカ卩え、ボルテックスミキサーにかけて回収容器内壁に付 着して 、る BSAを溶解し BSA定量分析サンプルとした。 BSAの定量は BETHYL社 Bovi ne
Albumin ELISA Quantitation Kit (E10- 113,lotE10- 113- 11)を用い、キット付属の説 明書にしたがって分析を行った。吸着量は数式 (2)で計算した。
[0045] A=B/C 数式（2)
式（2)中の記号
A: BSA吸着量 (ng/cm2)
B： BSA定量分析で得られた BSA量 (ng)
C： BSA溶液と回収容器の接触面積 (cm2)
く中空糸膜の BSA吸着量測定〉
ミニモジュールに使用した中空糸膜を 30本束ね、中空糸膜中空部を閉塞しないよ うにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュールケースに固定し、ミニモ ジュールを作成した。該ミニモジュールの内直径は約 5mm、長さは約 12cmであり、 一般的な中空糸膜型透析器同様に中空糸膜の内側につながるポート (血液ポート） を 2個と、外側につながるポート (透析液ポート）を 2個有している。該ミニモジュール の中空糸膜およびモジュール内部を蒸留水にて洗浄した。その後、透析液ポートか ら PBSを注入後キャップをして、中空糸の外側を PBSで満たした。血液ポートのひと つをシリコンチューブについないで途中にペリスタポンプを設けた。もう一方の血液ポ ートにもシリコンチューブをつないだ。これら 2本のシリコンチューブの開放端を Grein erBio-One社製 PPチューブ（188261)に差し込んだ。該 PPチューブに SIGMA製 ALBU MIN,
BOVINE(A- 7906,Lot.41kl270)100mgを PBSlOOmlに溶解して 1000 μ gZmlの BSA溶 液を 10ml入れ、ペリスタポンプで lml/minの流速で 25°C、 4時間循環した。その後速 やかに PBSをペリスタポンプで lOml/minの流速で 300ml送液した。このとき、シリコンチ ユーブカも排出された PBSは廃棄し、循環はしなかった。
[0046] その後、ミニモジュール内の PBSを取り除いた。ミニモジュールを解体し中空糸を取 り出した。取り出した中空糸の長さは 15cmであった。該中空糸を lcmの長さに切断し 全量を GreinerBio-One社製 PPチューブ（188261)に入れ、 50体積％の酢酸水溶液 5 ml加えて 25°Cで 12時間静置した。その後、中空糸を濾別し、酢酸溶液を回収容器 ごと凍結乾燥した。回収容器に大日本製薬製ブロックエース粉末 (UK-B40,lot.STK0 84206) 40gを水 1リットルに溶解させた液を 2mlカ卩え、ボルテックスミキサーにかけて回 収容器内壁に付着して ヽる BSAを溶解し BSA定量分析サンプルとした。 BSAの定量 は BETHYL社 Bovine
Albumin ELISA Quantitation Kit (E10- 113,lotE10- 113- 11)を用い、キット付属の説 明書にしたがって分析を行った。吸着量は式 (3)で計算した。また中空糸内表面積 は数式 (4)で計算した。
[0047] D = E/F 数式（3)
数式（3)中の記号
D: BSA吸着量 (ng/cm2)
E： BSA定量分析で得られた BSA量 (ng)
F:中空糸内表面積 (cm2) F= (G/2) 2P-H-I 数式 (4)
数式 (4)中の記号
F:中空糸内表面積 (cm2)
G :中空糸内径
P :円周率
H：モジユーノレから取り出した中空糸 1本あたりの長さ（cm)
I：中空糸本数
く液中に存在する β 2ミクログロブリンの測定〉
和光純薬工業株式会社発売グラザィム j8 2— Microglobulin- EIA TEST (Code 305- 11011)を用いて、キット付属の説明書に従って分析を行った。
〈血清および回収液のアルブミンの測定〉
BETHYL社 Human Albumin ELISA Quantitation Kit (E80- 129,lotE80- 129- 9)を用 い、キット付属の説明書にしたがって分析を行った。
く回収容器（1)の製造〉
超純水にナカライテスタ社製ポリビュルアルコール (28311-25, (実際にはビュルァ ルコール 酢酸ビュルの共重合体であり、ケンカ度 86.5-89.0%)、 LotNo.M2B1968) を溶解して濃度 lOOOppmのポリビニルアルコール共重合体水溶液を調製した。生産 日本社製チャック付き袋（ュ-パック E-4)に該ポリビュルアルコール水溶液 50mlを加 え、そこに BECTONDICKINSON社製 5mlポリスチレンラウンドチューブ (352054)を浸 積し、 γ線を照射した。このとき γ線の吸収線量は 26kGyであった。 γ線照射後ポリ スチレンラウンドチューブを超純水 1リットルで洗浄し、オーブンで 50°Cで 3時間乾燥 し、回収容器（1)を得た。
く回収容器 (2)の準備〉
BECTON DICKINSON社製 5mlポリスチレンラウンドチューブ (352054)を回収容器（ 2)としてそのまま使用した。
〈ミニモジュール（1)の製造〉
東レ株式会社製透析器 BSl. 8L (Lot. 20440312 )のモジュールの両端の榭脂 接着部分を切り、中空糸膜を得た。得られた中空糸膜の寸法は、内直径 200 m膜 厚 40 /z mであった。該中空糸膜を 100本束ね、中空糸膜の中空部を閉塞しないよう にエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュールケースに固定し、ミニモジ ユールを作成した。該ミニモジュールの内直径は約 5mm、長さは約 17cmであり、一 般的な中空糸膜型透析器同様に中空糸膜の内側につながるポート (血液ポート)を 2 個と外側につながるポート（透析液ポート）を 2個有している。該ミニモジュールの中 空糸膜およびモジュール内部を蒸留水にて洗浄した。その後、 PBSを充填し、中空 糸膜ミニモジュール (以降、ミニモジュール (1)と略す)を得た。
〈ミニモジュール（2)の製造〉
同じく東レ株式会社製透析器 BS1. 8Lから切り出した中空糸膜を 40本束ね、中空 糸膜中空部を閉塞しな 、ようにエポキシ系ポッティング剤で両末端をガラス管モジュ ールケースに固定し、ミニモジュールを作成した。該ミニモジュールの内直径は約 5m m、長さは約 17cmであり、一般的な中空糸膜型透析器同様に中空糸膜の内側につ ながるポート (血液ポート）を 2個と外側につながるポート (透析液ポート）を 2個有して いる。該ミニモジュールの中空糸膜およびモジュール内部を蒸留水にて洗浄した。そ の後、 PBSを充填し、中空糸膜ミニモジュール (以降、ミニモジュール（2)と略す)を 得た。
〈ミニモジュール（3)の製造〉
ポリスルホン（ソルベー社製ユーデル (登録商標） P— 3500) 18重量部およびポリ ビュルピロリドン（BASF社製 K30) 9重量部を N, N，—ジメチルァセトアミド 72重量 部および水 1重量部の混合溶媒に加え、 90°Cで 14時間加熱して溶解し、製膜原液 を得た。この製膜原液を外径 0. 3mm、内径 0. 2mmのオリフィス型二重円筒型口金 の外側の管より吐出した。芯液として N, Ν'—ジメチルァセトアミド 58重量部および 水 42重量部力もなる溶液を内側の管より吐出した。
吐出された製膜原液は、 口金カゝら凝固浴液面までの距離 350mmを通過した後、 水 100%の凝固浴に導かれ、中空糸膜が得られた。得たれた中空糸膜の構造を電 子顕微鏡（日立社製 S800)にて確認したところ非対称構造を有していた。得られた 中空糸膜を 10000本、一般の透析器と同様に透析液入口および透析液出口を有す る円筒状のプラスチックケースに挿入し、両端部を榭脂で封止して、有効膜面積 1. 6 m2の中空糸膜モジュールを作成した。この中空糸膜モジュールを水で洗浄した後、 該モジュールから中空糸膜を切り出し、 100本準備した。 50°C、相対湿度 13%の雰 囲気下で 24時間乾燥させた。この中空糸膜を実施例 A4と同様にエポキシ系ポッテ イング剤で両末端をガラス管モジュールケースに固定し、ミニモジュールを作成した。 該ミニモジュールの中空糸膜およびモジュール内部を蒸留水にて洗浄した。その後 、 PBSを充填し、濃縮用中空糸膜ミニモジュール (以降、ミニモジュール（3)と略す） を得た。
〈ミニモジュール（4)の製造〉
ミニモジュール（1)と同様にミニモジュールを製造した。ただし、ミニモジュールの中 空糸膜およびモジュール内部の蒸留水洗浄は行った力 BPSの充填までは行って いない。
[0049] 超純水にナカライテスタ製ポリビュルアルコール（28311-25,LotNo.M2B1968)溶解 して濃度 lOOOppmのポリビュルアルコール水溶液を調製し、ペリスタポンプで lml/min の流速で 10mlを該ミニモジュール中空糸膜の内側の一方の血液ポートから入れて中 空糸内を経由しもう一方の血液ポートから出しチューブを介し該血液ポート側の透析 液ポートに入れもう一方の透析液ポートから出した。
その後、ミニモジュールの中空糸内側と外側に該ポリビュルアルコールを充填した状 態で、 4ケ所のポートを密栓した状態で γ線を照射した、このとき γ線の吸収線量は 2 6kGyであった。該ミニモジュールの中空糸膜およびモジュール内部を 40°Cの蒸留 水 3Lで洗浄した。
その後、 PBSを充填し、中空糸膜ミニモジュール (以降、ミニモジュール (4)と略す） を得た。
〈ミニモジュール（5)の製造〉
ミニモジュール（2)と同様にミニモジュールを製造した。ただし、ミニモジュールの中 空糸膜およびモジュール内部の蒸留水洗浄は行った力 BPSの充填までは行って いない。
[0050] 超純水にナカライテスタ製ポリビュルアルコール（28311-25,LotNo.M2B1968)溶解 して濃度 lOOOppmのポリビュルアルコール水溶液を調製し、ペリスタポンプで lml/min の流速で 10mlを該ミニモジュール中空糸膜の内側の一方の血液ポートから入れて中 空糸内を経由しもう一方の血液ポートから出しチューブを介し該血液ポート側の透析 液ポートに入れもう一方の透析液ポートから出した。
その後、ミニモジュールの中空糸内側と外側に該ポリビュルアルコールを充填した状 態で、 4ケ所のポートを密栓した状態で γ線を照射した、このとき γ線の吸収線量は 2 6kGyであった。該ミニモジュールの中空糸膜およびモジュール内部を 40°Cの蒸留 水 3Lで洗浄した。
その後、 PBSを充填し、中空糸膜ミニモジュール（以降、ミニモジュール (5)と略す） を得た。
〈ミニモジユーノレ (6)の製造〉
ミニモジュール（3)と同様にミニモジュールを製造した。ただし、ミニモジュールの中 空糸膜およびモジュール内部の蒸留水洗浄は行った力 BPSの充填までは行って いない。
超純水にナカライテスタ製ポリビュルアルコール（28311-25,LotNo.M2B1968)溶解し て濃度 lOOOppmのポリビュルアルコール水溶液を調製し、ペリスタポンプで lml/min の流速で 10mlを該ミニモジュール中空糸膜の内側の一方の血液ポートから入れて中 空糸内を経由しもう一方の血液ポートから出しチューブを介し該血液ポート側の透析 液ポートに入れもう一方の透析液ポートから出した。その後、ミニモジュールの中空糸 内側と外側に該ポリビュルアルコール水溶液を充填した状態で、 4ケ所のポートを密 栓した状態で γ線を照射した、このとき γ線の吸収線量は 26kGyであった。該ミニモ ジュールの中空糸膜およびモジュール内部を 40°Cの蒸留水 3Lで洗浄した。その後 、 PBSを充填し、濃縮用中空糸膜ミニモジュール (以降、ミニモジュール (6)と略す） を得た。
〈実施例 Al〉
まず、 1個のミニモジュール（1)を準備し、外側のポートのうちひとつをキャップし、も うひとつはシリコーンチューブをつないだ。中空糸膜内側の液については、原液入口 と出口とをシリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路とし、当該回路にペリスターボン プを設け、溶液を循環できるようにした。前記溶液循環回路の途中に三方バルブを 設け、三方バルブの一方向には注入ポンプを取り付けた。これを 1段目の膜分離ュ ニットとした。さらに、ミニモジュール（2)のうち 1個のミニモジュールについて、外側の ポートのうちひとつをキャップし、ほかのひとつはシリコーンチューブを接続した。ミニ モジュール (2)の中空糸膜内側の液にっ 、ても、モジュールの原液入口と出口をシ リコーンチューブでつなぎ溶液循環回路とし、当該回路にペリスターポンプを設けて 溶液を循環できるようにした。さらに前記溶液循環回路の途中に三方バルブを設け た。これを 2段目の膜分離ユニットとした。さらに、もう 1個のミニモジュール (2)の外側 のポートのうちひとつをキャップし、のこりの一つはシリコーンチューブを接続した。 2 個目のミニモジュール（2)の中空糸膜内側の液についても、モジュールの原液入口 と出口をシリコーンチューブでつなぎ、溶液循環回路となし、回路の途中にペリスタ 一ポンプを設けて溶液を循環できるようにした。さらに前記溶液循環回路の途中に三 方バルブを設けた。これを 3段目の膜分離ユニットとした。
[0052] ミニモジュール（3)の外側のポートのうちひとつをキャップし、一方は濾液出口とし た。このミニモジュール（3)の中空糸膜内側の液も、モジュールの原液入口と出口を シリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路となし、ペリスターポンプを用いて原液を 循環できるようにした。また溶液循環回路の途中には三方ノ レブを 2個設けた。これ を濃縮膜ユニットとした。
[0053] 分離膜ユニット 3段目のミニモジュールの処理液回収口と濃縮膜ユニットの三方バ ルブとをシリコーンチューブで接合した。また濃縮膜ユニットの溶液循環回路の途中 には、三方ノ レブ力 なる濃縮ユニットの処理液回収口が設けられており、濃縮の操 作中は溶液循環回路のみが開通するようにしている。該処理液回収口の先には回 収容器（1)が設けてある。システム全体に PBSを充填し、アルブミン以上のタンパク 質を分子ふるいにより分画する膜分離ユニットとタンパク質を濃縮するユニットが直結 された複合システムを作成した。
[0054] 図 1は、この実施例 A1で用いた分離システムの概略図である。液の流れを矢印で 示してある。血清及び希釈液（PBS)は注入ポンプ 100、三方バルブ 101を経て、 1 段目溶液循環回路 102の中に注入された。さら〖こ液は、 1段目ポンプ 103によって送 液され、第 1分離膜モジュール 105 (ミニモジュール（1) )に注入され、 1段目溶液循 環回路 102を循環した。第 1の膜分離ユニットで処理された溶液は、膜分離膜ュ-ッ トの 1段目の膜分離ユニットの処理液回収口 104から得られた。次に、この溶液は、 2 段目の膜分離ユニットの三方バルブ 201を経て、 2段目溶液循環回路 202の中にさ らに 2段目ポンプ 203によって送液され、第 2分離膜モジュール 205 (第 1のミニモジ ユール (2) )に注入され、 2段目溶液循環回路 202を循環した。第 2の膜分離ユニット で処理された溶液は、処理液回収口 2段目の膜分離ユニットの 2段目の膜分離ュ- ットの処理液回収口 204から得られた。さらに、この溶液は、 3段目の膜分離ユニット の三方バルブ 301を経て、 3段目溶液循環回路 302の中にさらに 3段目ポンプ 303 によって送液され、第 3分離膜モジュール 305 (第 2のミニモジュール (2) )に注入さ れ、溶液循環回路 302を循環した。第 3の膜分離ユニットで処理された液は、 3段目 の膜分離膜ユニットの処理液回収口 304から得られた。さらに、この処理液は、濃縮 膜ユニットの三方バルブ 401を経て、 4段目溶液循環回路 402の中にさらに 4段目ポ ンプ 403によって送液され、濃縮膜モジュール 405 (ミニモジュール（3) )に注入され 、 4段目溶液循環回路 402を循環した。その際、濃縮膜モジュール 405から透過した 液は濃縮膜ユニットの濾液出口 404から取り出され、廃棄される。透過、濃縮の操作 終了後、ミニモジュール（3)の 4段目溶液循環回路 402に残っている溶液は濃縮ュ ニットの三方ノ レブ 406を開放することにより回収容器 407 (回収容器（1) )に取り出 される。
[0055] 具体的条件は以下のとおりである。 1mlのヒト血清（Sigma社製、 H1388 (Lot 073K44 5))を 0. 2mlZminで 1段目の膜分離ユニットに加えた後、 1段目の膜分離ユニット、 2段目の膜分離ユニット、 3段目の膜分離ユニット共に流量 5. OmLZminの条件で 各溶液循環回路を循環し、各モジュールの濾過流量 0. 2mLZminの流速で 20°C、 4時間濾過を実施した。この時、濾過された容量分の PBSを 0. 2mlZminで注入ポ ンプ 100から加えて、各分離ユニットおよび濃縮ユニットを循環する液量を一定に保 つた o
[0056] 4時間の運転後、回収容器 407 (回収容器（1) )に得られた液中のアルブミン量は 0 .336 g、 β 2ミクログロブリン量は 0.853 gであり、原液として用いたヒト血清中のァ ルブミン量は 31200 μ ξ、 β 2—ミクログロブリン量は 1.19 μ gであり、 β 2—ミクログロブ リン量を維持しながら、アルブミンを大幅に除去することができた。
[0057] 別途、 BSAの吸着量を特定したところ、回収容器（1)が 16.6ng/cm2、ミニモジユー ル（1)の中空糸が 397.9ng/cm2、ミニモジュール（2)の中空糸力 ¾78.4ng/cm2、ミニモ ジュール（3)の中空糸が 429.3ng/cm2であった。
〈実施例 A2〉
まず、 1個のミニモジュール（4)を準備し、外側のポートのうちひとつをキャップし、も うひとつはシリコーンチューブをつないだ。中空糸膜内側の液については、原液入口 と出口とをシリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路とし、当該回路にペリスターボン プを設け、溶液を循環できるようにした。前記溶液循環回路の途中に三方バルブを 設け、三方バルブの一方向には注入ポンプを取り付けた。これを 1段目の膜分離ュ ニットとした。さらに、ミニモジュール（5)のうち 1個のミニモジュールについて、外側の ポートのうちひとつをキャップし、ほかのひとつはシリコーンチューブを接続した。ミニ モジュール (5)の中空糸膜内側の液にっ 、ても、モジュールの原液入口と出口をシ リコーンチューブでつなぎ溶液循環回路とし、当該回路にペリスターポンプを設けて 溶液を循環できるようにした。さらに前記溶液循環回路の途中に三方バルブを設け た。これを 2段目の膜分離ユニットとした。さらに、もう 1個のミニモジュール (5)の外側 のポートのうちひとつをキャップし、のこりの一つはシリコーンチューブを接続した。 2 個目のミニモジュール（5)の中空糸膜内側の液についても、モジュールの原液入口 と出口をシリコーンチューブでつなぎ、溶液循環回路となし、回路の途中にペリスタ 一ポンプを設けて溶液を循環できるようにした。さらに前記溶液循環回路の途中に三 方バルブを設けた。これを 3段目の膜分離ユニットとした。
[0058] ミニモジュール（6)の外側のポートのうちひとつをキャップし、一方は濾液出口とし た。このミニモジュール（6)の中空糸膜内側の液も、モジュールの原液入口と出口を シリコーンチューブでつなぎ溶液循環回路となし、ペリスターポンプを用いて原液を 循環できるようにした。また溶液循環回路の途中には三方ノ レブを 2個設けた。これ を濃縮膜ユニットとした。
[0059] 分離膜ユニット 3段目のミニモジュールの処理液回収口と濃縮膜ユニットの三方バ ルブとをシリコーンチューブで接合した。また濃縮膜ユニットの溶液循環回路の途中 には、三方ノ レブ力 なる濃縮ユニットの処理液回収口が設けられており、濃縮の操 作中は溶液循環回路のみが開通するようにしている。該処理液回収口の先には回 収容器（1)が設けてある。システム全体に PBSを充填し、実施例 1と同様のアルブミ ン以上のタンパク質を分子ふるいにより分画する膜分離ユニットとタンパク質を濃縮 するユニットが直結された複合システムを作成した。
[0060] 実施例 1と同様に注入、分離、濃縮および回収の操作を行った。具体的条件は以 下のとおりである。 1mlの血清を 0. 2mlZminで 1段目の膜分離ユニットにカ卩えた後 、 1段目の膜分離ユニット、 2段目の膜分離ユニット、 3段目の膜分離ユニット共に流 量 5. OmLZminの条件で各溶液循環回路を循環し、各モジュールの濾過流量 0. 2 mLZminの流速で 20°C、 4時間濾過を実施した。この時、濾過された容量分の PB Sを 0. 2mlZminで注入ポンプから加えて、各分離ユニットおよび濃縮ユニットを循 環する液量を一定に保った。
[0061] 4時間の運転後、回収容器（1)に得られた液中のアルブミン量は 0.251 μ g、 β 2ミク ログロブリン量は 0.981 μ gであり、原液として用いたヒト血清中のアルブミン量は 3120 0 g、 j8 2—ミクログロブリン量は 1.19 μ gであり、 β 2—ミクログロブリン量を維持しな がら、アルブミンを大幅に除去することができた。
[0062] 別途、 BSAの吸着量を特定したところ回収容器（1)が 17.6ng/cm2、ミニモジュール（ 4)の中空糸力 ¾5.6ng/cm2、ミニモジュール（5)の中空糸が 39.2ng/cm2、ミニモジユー ル（ 6 )の中空糸が 42.8ng/cm2であつた。
〈比較例 Al〉
実施例 A1の回収容器（1)に代えて、回収容器（2)を使用した以外には、実施例 A 1と同様に 4時間の濾過の運転を行った。回収容器（2)に得られた液中のアルブミン 量は 0.490 g、 β 2ミクログロブリン量は 0.202 gであり、原液として用いたヒト血清中 のアルブミン量は 31200 μ §、 β 2—ミクログロブリン量は 1.19 μ gであり、アルブミンを 除去することができたが、 13 2—ミクログロブリンの回収率が低かった。
[0063] 別途、 BSAの吸着量を特定したところ回収容器 (2)が 236.4ng/cm2、ミニモジュール
( 1)の中空糸が 377.1ng/cm2、ミニモジュール（2)の中空糸力 ¾94.5ng/cm2ミニモジュ ール（ 3 )の中空糸が 429.3ng/cm2であつた。 以上の結果を表 1, 2にまとめた。表 1は BSAの吸着量を、表には |8 2-ミクログロブリ ンの回収量を示す。吸着量が 50 ng/cm2以下の回収容器または中空糸を使用した実 施例 Al, A2では j8 2-ミクログロブリンの回収量が高かったのに対し、 50ng/cm2よりも 多い吸着量の回収容器と中空糸の膜を使用した比較例 A1では β 2-ミクログロブリン の回収量が低力つた。このように低吸着の表面を一部に導入した装置では j8 2-ミクロ グロブリンの高い回収率が達成された。膜表面でのアルブミンの堆積'目詰まりが抑 えられ、 j8 2-ミクログロブリンが良好に膜を透過できただけでなぐ透過した /3 2-ミクロ グロブリンの吸着ロスも抑えられて高率に回収されたことを示している。
くく実施例 B》
本発明の分画装置において、分画された微量タンパク質を含む溶液を回収するた めに用いるポリスチレン製試験管（BECTON DICKINSON製「5mlPolystyrenRound-B ottom
Tube」）およびポリプロピレン製試験管（BECTON DICKINSON製「5mlPolypropyrene Round-Bottom Tube」）について、吸着および回収性能を比較した。
くヒト β 2-ミクログロブリンの吸着試験〉 基材表面に対するタンパク質の吸着評価に ついて、ヒト j8 2-ミクログロブリンの溶液で行う場合について説明する。実施例で使用 したヒト 13 2-ミクログロブリン（以下 13 2-MGと略記）とは、 ORIENTALYEAST
CO., LTD製 Recombinant Human β 2- microgloblin, Cat.Code 47194000もしくは、そ の同等品である。また、本発明中のゥシ血清アルブミンとは SIGMA製 BovineAlbumin Powder, Product Number A7906もしくは、その同等品である。
β 2-MG (ORIENTAL YEAST CO., LTD製 Recombinant Human β 2- microgloblin
Cat.Code47194000)を 200ng/ml、ゥシ血清アルブミン（SIGMA製 Bovine Albumin Pow der, Product
Number A7906) (以下 BSAと略記）を 10 μ g/mlに調整した PBS (日水製薬社製ダル べッコ PBS)水溶液 (以下、 PBS水溶液と略記）をタンパク質溶液 (以下、タンパク質 溶液 Aとする）として用いた。タンパク質溶液 A中のタンパク質は調製に使用した容器 にも吸着するので調製後 5分以内に吸着実験を開始しなければならない。上記のよう に調製したタンパク質溶液 Aを以下のように吸着実験に用いた。すなわち、コントロー ルサンプルとして、ブロッキング剤（大日本製薬発売ブロックエース Cat.Code
UK-B25)を 100 μ 1カ卩えてお!/、た容器（エツペンドルフ社製セィフーロックチューブ商 品 No.0030 120,086)にタンパク質溶液 Aを 500 1カ卩え、 j8 2— MG濃度測定直前ま で— 70°Cにて凍結保管した。吸着評価サンプルとして、タンパク質溶液 Aを評価する 基材に接触させ 25°Cで 1時間静置した後に、ブロッキング剤（大日本製薬発売ブロッ クエース Cat.Code
UK-B25)を 100 μ 1カ卩えてお!/、た容器（エツペンドルフ社製セィフーロックチューブ商 品 No.0030 120,086)に 500 1加え、 j8 2-MG濃度測定直前まで- 70°Cにて凍結保管 する。なお、評価する基材表面積に対するタンパク質溶液 Aの添加量は、 2ml/cm2 以上 8mlZcm2以下とした。
β 2-MG濃度の測定は β 2-MG測定キット (和光純薬工業発売 ダラザィム β 2-m icrogloblin EIA TEST, Code.305- 11011)にて、キット添付のマニュアルに従って行つ た。タンパク質の吸着量は (数式 5)により算出した。
[0065] (a) = ((b)-(c))/(d) (数式 5)
(数式 5)中の記号は以下の通り。
[0066] (a)：プラスチック試験管タンパク質吸着量 (ng/cm2)
(b)：コントロールサンプル中 13 2- MG量（ng)
(c)：吸着評価サンプル中 β 2-MG量 (ng)
(d)：プラスチック試験管とタンパク質溶液 Aとの接触面積 (cm2)
く実施例 B l〉
ポリスチレン製試験管（BECTON DICKINSON製「5mlPolystyrene Round-Bottom T ubej )をビニルアルコール 酢酸ビニル共重合体（重量平均分子量 10000、ケン化度 80%、 Aldrich製 Cat
No.360627) lOOOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照射した。 γ線の吸収線量は 25k Gyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルアルコール水溶液から取り出して流水 5 00mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブ リン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。 〈実施例 B2〉
実施例 Blで最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管を実施例 Blポビュル アルコール 酢酸ビュル共重合体 lOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照射した。 y 線の吸収線量は 26kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルアルコール水溶液 から取り出して流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管を ヒト β 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。
〈実施例 Β3〉
実施例 Blで最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管をポリビュルアルコー ル（分子量 22000、ナカライテスタ製 Code No.28311-25) lOOOppm水溶液 100mlに浸 漬し、 Ύ線照射した。 γ線の吸収線量は 25kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビ -ルアルコール水溶液から取り出して流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間 乾燥した。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示 す。
く実施例 B4〉
実施例 Blで最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管を実施例 B3と同じポ リビュルアルコールの lOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照射した。 γ線の吸収線量 は 27kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルアルコール水溶液から取り出して 流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト j8 2_ミクロ グロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。
〈実施例 B5〉
ポリプロピレン製試験管（BECTON DICKINSON製「5mlPolypropyrene Round- Bott om Tube」）をポリビュルアルコール（分子量 10000、 Aldrich製 Cat
No.360627) lOOOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照射した。 γ線の吸収線量は 25k Gyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルアルコール水溶液から取り出して流水 5 00mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブ リン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。
く実施例 B6〉
実施例 B5で最初に準備したものと同じポリプロピレン製試験管を実施例 B5と同じ ポリビュルアルコールの lOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照射した。 γ線の吸収線 量は 25kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルアルコール水溶液から取り出し て流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト j8 2_ミク ログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。
〈実施例 B7〉
実施例 B5で最初に準備したポリプロピレン製試験管をポリビュルアルコール (分子 量 22000、ナカライテスタ製 Code No.28311-25) lOOOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ 線照射した。 γ線の吸収線量は 26kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルァ ルコール水溶液から取り出して流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥し た。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。 く実施例 B8〉
実施例 B5で最初に準備したものと同じポリプロピレン製試験管を実施例 B7と同じ ポリビュルアルコールの lOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照射した。 γ線の吸収線 量は 27kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルアルコール水溶液から取り出し て流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト j8 2_ミク ログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。
〈比較例 Bl〉
実施例 B1で最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管を流水 500mlで洗浄し 、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブリン吸着試験 に供した。結果を表 3に示す。
〈比較例 B2〉
実施例 B5で最初に準備したものと同じポリプロピレン製試験管を流水 500mlで洗浄 し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブリン吸着試 験に供した。結果を表 3に示す。
〈比較例 B3〉
実施例 B1で最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管をポリビュルピロリドン (分子量 50000、 BASF製 Kollidon25) lOOOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照射した 。 γ線の吸収線量は 25kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルピロリドン水溶 液から取り出して流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験 管をヒト β 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。
〈比較例 Β4〉
実施例 Blで最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管をポリビュルピロリドン (分子量 3000、 BASF製 Kollidonl2PF) lOOOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照射し た。 γ線の吸収線量は 27kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルアルコール 水溶液から取り出して流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この 試験管をヒト β 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。
〈比較例 Β5〉
実施例 Blで最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管をポリエチレングリコ ール（分子量 20000、片山化学工業製ポリエチレングリコール 20000) 1000ppm水溶 液 100mlに浸漬し、 γ線照射した。 γ線の吸収線量は 25kGyであった。ポリスチレン 試験管をポリビニルアルコール水溶液から取り出して流水 500mlで洗浄し、 70°Cのォ 一ブンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト β 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。 結果を表 3に示す。
〈比較例 Β6〉
実施例 Blで最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管をポリエチレングリコ ール（分子量 2000、和光純薬工業製ポリエチレングリコール 2000) lOOOppm水溶液 1 00mlに浸漬し、 γ線照射した。 γ線の吸収線量は 26kGyであった。ポリスチレン試験 管をポリビニルアルコール水溶液から取り出して流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブ ンで 1時間乾燥した。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を 表 3に示す。
〈比較例 B7〉
実施例 Blで最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管をポリェチレイミン (分 子量 25000、 Aldrich製 Cat.Code 40872-7) lOOOppm水溶液 100mlに浸漬し、 γ線照 射した。 γ線の吸収線量は 26kGyであった。ポリスチレン試験管をポリビニルアルコ ール水溶液から取り出して流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。 この試験管をヒト 13 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。 〈比較例 B8〉
実施例 B1で最初に準備したものと同じポリスチレン製試験管の内壁を 15mlのメタノ ールで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。該の試験管に MPCとブチルメタ タリレート共重合体 25000ppmメタノール溶液 100mlに 1分間浸漬した。該試験管をポリ ヒドロキシェチルメタタリレート溶液力も取り出し、試験管内の液を排出し 70°Cのォー ブンで 1時間乾燥した。該試験管を流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾 燥した。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。 く比較例 9〉
実施例 B5で最初に準備したものと同じポリプロピレン製試験管の内壁を 15mlのメタ ノールで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾燥した。この試験管に MPCとブチルメタ タリレート共重合体 25000ppmメタノール溶液 100mlに 1分間浸漬した。該試験管をポリ ヒドロキシェチルメタタリレート溶液力も取り出し、試験管内の液を排出し 70°Cのォー ブンで 1時間乾燥した。該試験管を流水 500mlで洗浄し、 70°Cのオーブンで 1時間乾 燥した。この試験管をヒト j8 2-ミクログロブリン吸着試験に供した。結果を表 3に示す。
[0067] 表 3から明らかなように、ヒト β 2-ミクログロブリン吸着試験 (濃度 200ng/mlのヒト β 2 -ミクログロブリンと濃度 10 μ g/mlのゥシ血清アルブミン力もなるタンパク質水溶液を 使用）の結果、本発明の場合 (実施例 1〜9)は比較例 1〜9に比して |8 2-MG吸着 量 (ヒト β 2-ミクログロブリン吸着量)が少なぐ微量生体成分の吸着抑制、高率回収 に効果的である。
[0068] [表 1]
表 1 . BSA吸着量
Figure imgf000032_0001
[0069] [表 2] 表 2 .分画前後のアルフ'ミン量および 2—ミクログロプリン量
Figure imgf000033_0001
] 表 3
β 2-MG吸着量 kng/cm2) 実施例 B 1 1.03
実施例 B 2 1.23
実施例 B 3 1.21
実施例 B 4 2.05
実施例 B 5 1.64
実施例 B 6 1.63
実施例 B 7 1.03
実施例 B 8 1.23
実施例 B 9 1.05
比較例 B 1 5.13
比較例 B 2 8.61
比較例 B 3 4.17
比較例 B 4 4.01
比較例 B 5 4.91
比較例 B 6 4.94
比較例 B 7 4.09
比較例 B 8 6.35
比較例 B 9 6.38 産業上の利用可能性
本発明の分画装置は、プロテオーム解析を行う際の試料の作成において非常に有 用なものであり、医学、特にヒトの病気の発見に利用可能となる。

Claims

請求の範囲
[I] タンパク質および Zまたはペプチドの分画装置であって、タンパク質および Zまたは ペプチドが接触する基材表面の少なくとも一部が、 1000 gZmlのゥシ血清アルブ ミン溶液を接触させたときの該基材表面へのゥシ血清アルブミンの吸着量が 50ngZ cm2以下である分画装置。
[2] タンパク質および Zまたはペプチドと接触する基材表面の少なくとも一部が親水化処 理されてなる請求項 1に記載の分画装置。
[3] 親水性高分子が基材表面に付与されて親水化処理されている請求項 2に記載の分 画装置。
[4] 親水性高分子が水酸基を含有するものである請求項 3に記載の分画装置。
[5] 親水性高分子の少なくとも一部力 ポリビュルアルコールまたはポリビニルアルコー ルの共重合体である請求項 4に記載の分画装置。
[6] ポリビュルアルコールの共重合体力 ポリビュルアルコール ポリ酢酸ビュル共重合 体である請求項 5に記載の分画装置。
[7] ポリビニルアルコール ポリ酢酸ビュル共重合体のケンィ匕度が 0. 70以上 1未満であ る請求項 6に記載の分画装置。
[8] 親水性高分子を基材表面にグラフトすることによって基材表面が親水化されてなる請 求項 3に記載の分画装置。
[9] 親水性高分子のグラフトが放射線照射によるものである請求項 8に記載の分画装置
[10] ゥシ血清アルブミンの吸着量が 50ngZcm2以下である基材が膜である請求項 9に記 載の分画装置。
[II] 当該膜の形状が中空糸である請求項 10に記載の分画装置。
[12] タンパク質および Zまたはペプチドを含有する溶液を供給する手段、溶液からタンパ ク質および Zまたはペプチドを分離する手段、ならびに溶液の中のタンパク質および Zまたはペプチドを濃縮する手段を有することを特徴とする請求項 11に記載の分画 装置。
[13] タンパク質および Zまたはペプチドの質量分析のための試料を作成する前処理装置 である請求項 12に記載の分画装置。
[14] タンパク質および Zまたはペプチドが血液、血清、血漿などの血液由来物、尿、腹水
、唾液、涙液、房水、脳脊髄液、羊水、胸水もしくは細胞抽出液に含有されていたも のである請求項 13に記載の分画装置。
[15] タンパク質および Zまたはペプチドの分画装置であって、タンパク質および Zまたは ペプチドが接触する基材表面の少なくとも一部力 該基材表面に濃度 200ng/mlのヒ ト β 2-ミクログロブリンと濃度 10 g/mlのゥシ血清アルブミン力もなるタンパク質水溶 液に接触させたとき、該基材に対するヒト j8 2-ミクログロブリン吸着量が 3ng/cm2以下 である分画装置。
[16] タンパク質および Zまたはペプチドと接触する基材表面の少なくとも一部が親水化処 理されてなる請求項 15に記載の分画装置。
[17] 親水性高分子が基材表面に付与されて親水化処理されている請求項 16に記載の 分画装置。
[18] 親水性高分子が水酸基を含有するものである請求項 17に記載の分画装置。
[19] 親水性高分子の少なくとも一部力 ポリビュルアルコールまたはポリビニルアルコー ルの共重合体である請求項 18に記載の分画装置。
[20] ポリビュルアルコールの共重合体力 ポリビュルアルコール ポリ酢酸ビュル共重合 体である請求項 19に記載の分画装置。
[21] ポリビニルアルコール ポリ酢酸ビュル共重合体のケンィ匕度が 0. 70以上 1未満であ る請求項 20に記載の分画装置。
[22] 親水性高分子を基材表面にグラフトすることによって基材表面が親水化されてなる請 求項 17に記載の分画装置。
[23] 親水性高分子のグラフトが放射線照射によるものである請求項 22に記載の分画装 置。
[24] ヒト /3 2-ミクログロブリン吸着量が 3ng/cm2以下である基材が膜を含むものである請求 項 22に記載の分画装置。
[25] 当該膜の形状が中空糸である請求項 24に記載の分画装置。
[26] タンパク質および Zまたはペプチドを含有する溶液を供給する手段、溶液からタンパ ク質および zまたはペプチドを分離する手段、ならびに溶液の中のタンパク質および
Zまたはペプチドを濃縮する手段を有する請求項 24に記載の分画装置。
[27] タンパク質および Zまたはペプチドの質量分析のための試料を作成する前処理装置 である請求項 26に記載の分画装置。
[28] タンパク質および Zまたはペプチドが血液、血清、血漿などの血液由来物、尿、腹水 、唾液、涙液、房水、脳脊髄液、羊水、胸水もしくは細胞抽出液に含有されていたも のである請求項 27に記載の分画装置。
[29] タンパク質および Zまたはペプチドの分画装置であって、タンパク質および Zまたは ペプチドを含有する溶液を供給する供給手段、溶液カゝらタンパク質および Zまたは ペプチドを分離する手段、ならびに溶液の中のタンパク質および Zまたはペプチドを 濃縮する手段を有し、分画装置におけるタンパク質および Zまたはペプチドが接触 する基材表面の少なくとも一部が、親水性高分子によってグラフトされている分画装 置。
[30] 親水性高分子がポリビュルアルコールまたはポリビニルアルコール共重合体であつ て、グラフトが放射線によるものである請求項 29に記載の分画装置。
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