WO2006009209A1

WO2006009209A1 - 慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療する薬剤

Info

Publication number: WO2006009209A1
Application number: PCT/JP2005/013393
Authority: WO
Inventors: Toshiaki Okuda; Shigeo Kurokawa; Takahiko Murata; Masahiro Amakawa; Tsutomu Nakamura
Original assignee: Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2004-07-22
Filing date: 2005-07-21
Publication date: 2006-01-26
Also published as: JPWO2006009209A1; US20080249144A1; EP1782808A1; EP1782808A4

Abstract

　２－｛Ｎ－［４－（４－クロロベンゼンスルホニルアミノ）ブチル］－Ｎ－｛３－［（４－イソプロピル－２－チアゾリル）メトキシ］ベンジル｝｝スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩を、肺組織に吸入投与することにより、急性および慢性間質性肺炎または肺線維症や、肺気腫、慢性気管支炎などの慢性閉塞性肺疾患を有効に予防もしくは治療することができる。

Description

慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療する薬剤

技術分野

[0001] 本発明は、 2— {N— [4— (4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル]—N—{ 3

[ (4 イソプロピルー2 チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩を有効成分とする、間質性肺炎、肺線維症あるいは肺気腫、慢性気管支炎などの慢性閉塞性肺疾患等の慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療する薬剤に関する。

背景技術

[0002] 呼吸器疾患は、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患 (chronic obstructive pulmonary di sease, COPD)、呼吸器感染症、アレルギー性喘息、肺癌等に分類される。このうち、間質性肺炎と COPDは、マクロファージゃ好中球を主体とする慢性炎症性肺疾患と言えるものである。

間質性肺炎は、肺間質組織の炎症性病変が主体となる肺疾患で、臨床的分類において、急性および慢性間質性肺炎に分けられる。急性間質性肺炎（acute interstiti al pneumonia, AIP)は急激な呼吸不全を来たし、致死率の高い肺疾患である。

慢性間質性肺炎（chronic interstitial pneumonia, CIP)は、慢性に進行する咳、呼吸不全を特徴とし、進行性の肺線維症 (pulmonary fibrosis, PF)を伴う疾患である。何らかの起因物質が炎症性細胞やリンパ球を肺胞壁に動員することで急性炎症を誘発し、この炎症が持続すると肺胞壁ならびに肺胞が破壊して慢性炎症に移行する。その後、炎症の修復過程において、結合組織の過剰な増殖が起こり、肺線維症に進展すると考えられている。この間質性肺炎は、膠原病などの自己免疫疾患によるもの、感染症による反応、ブレオマイシン (Bleomycin, BLM)のような抗がん剤や放射線の副作用、また、異物吸入によるなど、原因の明確な二次性間質性肺炎と、殆どの場合が原因が明らかでない特発性 (idiopathic)間質性肺炎に分類される。

原因が明らかなものは、まずその要因を取り除く事で改善あるいは進行を抑える事が出来る。一方、特発性間質性肺炎の確立された治療法はないが、一時的に炎症を抑えるという点からステロイド剤や免疫抑制剤が使用されている。し力しながら、これらの薬剤はその副作用の問題や、また、病態の進行状態によっては十分な効果が得られて、な、のが現状である。

[0003] COPDは、慢性気管支炎、肺気腫または両者の併発により誘発される閉塞性換気障害を特徴とし、ゆっくり進行し、不可逆的で、世界的に羅患率および死亡率の高い疾患である。慢性気管支炎は、慢性または反復に喀出される気道分泌物の増加状態が少なくとも 2年以上継続する疾患である。肺気腫は、終末細気管支より末梢の気腔が異常に拡大し、肺胞壁の破壊を伴う疾患である。喫煙や大気汚染物質により活性化した気道上皮細胞やマクロファージから、サイトカインゃケモカインが産生 ·遊離され、マクロファージ、好中球や CD8陽性細胞などの炎症性細胞が肺に集積するとともに活性ィ匕し、種々のプロテアーゼ、オキシダントおよび脂質メディエーターを過剰に産生する結果、結合組織の破壊や粘液分泌の亢進が引き起こされると考えられている。

[0004] 現在、 COPDに対する薬物治療として、 β刺激薬、抗コリン薬およびテオフィリン製

2

剤等の気管支拡張作用を有する薬剤が、症状の一時的な予防または抑制のために用いられている。また、炎症を抑制する目的でステロイドが使用される。しかし、複数の大規模臨床試験で検討されたが、肺機能の低下を長期に亘つて改善できなかつたことが幾つ力の文献で報告されている (非特許文献 1、 2)。

[0005] このように、間質性肺炎や COPDは炎症性病態でありながら、炎症を抑制できる薬剤がない。ステロイドが効かない理由は、これらの病態が好中球性炎症である力もである。好中球やマクロファージは、異物、プロスタノイド、サイトカインゃケモカインなどの各種メディエーター刺激により活性ィ匕する。活性ィ匕することで、活性酸素を産生し、エラスターゼなどのタンパク分解酵素を放出するとともに、サイト力インを放出して炎症反応を増強する。そこで、インターロイキン (IL) -1、 IL-8、腫瘍壊死因子 (TNF) - α 、単球走ィ匕性因子 (MCP) - 1、ロイコトリェン (LT) Bなどの各種サイト力インや活性酵

4

素などの炎症性メディエーターに注目した予防治療剤の検討が行われて、る。肺線維症患者の末梢血液中や気管支肺胞洗浄液中には、脂質性メディエーターであるペプチドロイコトリェン (pLT)、プロスタグランディン（PG)やトロンボキサン B (T XB )等のァラキドン酸代謝物が多く含まれ、本疾患形成に関与していることが示唆さ

2

れている（非特許文献 3)。肺線維症患者の肺病態像が類似した BLM誘発肺線維症マウスでは、 LTB、ペプチドロイコトリェン（LTC、 LTDおよび LTE )の濃度が肺洗浄

4 4 4 4 液中では高くなり、その産生酵素であるリポキシゲナーゼ阻害剤が肺線維化を抑制することが示され、これらのメディエーターが発症に促進的に関与して、ることが明らかになつた (非特許文献 4)。また、ァラキドン酸カスケードの起点となるホスホリパーゼ A 遺伝子を破壊したマウスでは、 BLM誘発性肺線維症モデルにおいて、肺線維

2

症が抑制されることが報告されている（非特許文献 5)。さらに、トロンボキサン合成酵素阻害剤は、 BLM誘発性肺線維症モデルにおいて、コラーゲン mRNA発現を抑制することが報告されている（非特許文献 6)。しかし、 LTB、 pLTやァラギドン酸代謝物

4

の作用を直接阻害することが、間質性肺炎の予防治療効果を発揮するかどうかに関する報告は一切ない。

COPD患者の気管支肺胞洗浄液中には LTB、 IL-8が多く含まれ、血中の白血球で

4

有意に TNF- o;産生が増加する。 COPDの原因であるタバコ煙の抽出液は、肺線維芽細胞力も好中球やマクロファージの走ィ匕性因子の産生を促進させる。これらのメデイエ一ターは、炎症部位に好中球を遊走させ、炎症を促進させる。一方、 LTDや TX

4

Aの代謝物 TXBは気管支肺胞洗浄液中には見出されず、 COPDに関与していると

2 2

いう直接的な報告はない。今まで、 LTD受容体アンタゴニストであるモンテルカスト (m

4

ontelukast)やザフィルルカスト (zafirlukast)あるいは TXA受容体アンタゴ-ストである

2

セラトロダスト (seratrodast)が COPD患者の呼吸機能を改善し、 QOLを向上させることが報告されている (非特許文献 7、非特許文献 8、特許文献 1)。しかし、これらの薬剤は、 COPDにおける炎症性病態の予防または治療に対する有効性を証明するに至つていない。

LTDおよび TXAの両メディエーターの受容体に対し拮抗作用を持つ化合物として

4 2

、 2— {N— [4—（4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル]—N— {3— [ (4 イソプロピル 2—チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸などの 2—スルファモイル安息香酸誘導体が知られている（特許文献 2)。しカゝしながら、これらの化合物が、間質性肺炎や COPDなどの慢性炎症性肺疾患の予防もしくは治療剤となり得る力否かは全く不明である。

特許文献 1：国際公開第 00/30633号パンフレット

特許文献 2：国際公開第 98/57935号パンフレット

非特許文献 l : Pauwels RA. et al, N Engl J Med, 340: 1948-1953 (1999) 非特許文献 2 :Vestbo J. et al" Lancet, 353: 1819-1823 (1999)

非特許文献 3 :北村諭、他、日内学会誌、 80: 1508-1513 (1991)

非特許文献 4 : Nagase T. et al., Nature Medicine, 8: 480-484 (2002)

非特許文献 5 : Golden M. et al., Am J Respir Crit Care Med, 165: 229-235 (2002) 非特許文献 6 : Sato Y. et al., Biomed Pharmacother, 58: 381-387(2004)

非特許文献 7 : Rubinstein I. et al., Repir Med, 98: 134-138 (2004)

非特許文献 8 : Luis J. et al., Pulm Pharmacol Ther, 16: 305-311 (2003)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] そこで本発明は、上記のごとき従来技術に鑑みて、間質性肺炎、 COPDなどの慢性炎症性肺疾患の予防もしくは治療剤を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者は、間質性肺炎、 COPDなどの慢性炎症性肺疾患の予防もしくは治療剤を得ることを目的として鋭意研究した結果、 LTD /TXAの 2重アンタゴニスト（dual ant

4 2

agonist)として知られる 2— {N— [4—（4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル] — N— { 3— [ (4 イソプロピル— 2 -チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸が、慢性炎症性肺疾患の重要な促進因子である LTBによる好中球の遊走

4

を抑制すること、さらに間質性肺炎モデルおよび COPDモデルで病態を顕著に改善することを見出し、本発明を完成させた。

[0009] 従って、本発明は、 2— {N— [4一（4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル] N— { 3— [ (4 イソプロピル— 2 -チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する、慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療するための薬剤に関する。

更に、本発明は、慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療するための薬剤を製造するための、 2— {N— [4一（4一クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル]—N— {3— [ (4 イソプロピル 2 チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩の使用に関する。

更に、本発明は、ヒトを含む哺乳動物における慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療する方法であって、 2— {N— [4一（4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル] N— { 3— [ (4 イソプロピル— 2 -チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩を該哺乳動物に投与することを含む上記方法に関する。

発明の効果

[0010] 以後に記載する実施例に示されるように、 LTB 誘発ヒト好中球遊走に対して、本発

4

明の薬剤の有効成分である 2— {N— [4一（4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル]—N— {3— [ (4 イソプロピルー2 チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモィル安息香酸 (以下、 KP-496と略記することもある）は、濃度依存的な抑制作用を示した。

[0011] 以後に記載する実施例に示されるように、マウス BLM誘発性肺線維症モデルに対して、本発明の薬剤の有効成分である KP-496は、 BLM惹起による好中球、好酸球およびリンパ球等の炎症性細胞の浸潤を有意に抑制した。また、 BLMで惹起された肺組織の病理組織学的変化に対し、本発明の上記有効成分は、急性炎症ならびに慢性炎症を明らかに軽減し、本疾患モデルの最終的な病態像である線維化への進展も明らかに抑制した。さらに、線維成分の特異的なマーカーであるヒドロキシプロリンが肺組織中において、明らかに減少した。これらの結果から、本発明の上記有効成分は、 BLM惹起による肺組織における初期の急性炎症を軽減し、その後の慢性炎症さらには線維化を抑制でき、従って、急性および慢性間質性肺炎または肺線維症の予防もしくは治療剤として極めて有効である。

[0012] また、以後に記載する実施例に示されるように、ブタ脾臓エラスターゼ (PPE)誘発マウス肺気腫モデルにおいて、本発明の有効成分である KP-496は、肺気腫形成に対して改善作用を示した。投与開始時期を変えた実験においても、本発明の上記有効成分は、肺気腫形成に対して改善作用を示した。さらに、五酸化バナジウム誘発マウス気管支炎モデルにおいて、本発明の上記有効成分は、肺内気管支 (葉気管支）における炎症に伴う粘液過剰分泌を軽減した。

これらの結果から、本発明の上記有効成分は、 PPE惹起による肺気腫形成を改善し、五酸ィ匕バナジウム惹起による気管支における粘液産生を抑制でき、従って、 COPD の予防もしくは治療剤として極めて有用である。

図面の簡単な説明

[図 1]LTB誘発ヒト好中球遊走に及ぼす KP-496、モンテルカスト、プランルカストおよ

4

びセラトロダストの影響を示す。

[図 2]マウス BLM誘発性肺線維症モデルの BALF中総細胞数に及ぼす ΚΡ-496の影響を示す。

[図 3]マウス BLM誘発性肺線維症モデルの BALF中肺胞マクロファージ数に及ぼす Κ Ρ-496の影響を示す。

[図 4]マウス BLM誘発性肺線維症モデルの BALF中好中球数に及ぼす ΚΡ-496の影響を示す。

[図 5]マウス BLM誘発性肺線維症モデルの BALF中好酸球数に及ぼす KP-496の影響を示す。

[図 6]マウス BLM誘発性肺線維症モデルの BALF中リンパ球数に及ぼす KP-496の影響を示す。

[図 7]マウス BLM誘発性肺線維症モデルの肺臓中ヒドロキシプロリン含量に及ぼす KP -496の影響を示す。

[図 8]マウス BLM誘発性肺線維症モデルの肺傷害スコアに及ぼす KP-496の影響を示す。図 Aは、 BLM投与 7日目における急性炎症性病変に対する KP-496の影響を示す。図 Bは、 BLM投与 21日目における慢性炎症性病変に対する KP-496の影響を示す。図 Cは、 BLM投与 21日目における線維化病変に対する KP-496の影響を示す

[図 9]マウス PPE誘発肺気腫モデルの体重推移に及ぼす KP-496の影響を示す。

[図 10]マウス PPE誘発肺気腫モデルの BALF中総細胞数に及ぼす KP-496の影響を示す。 [図 11]マウス PPE誘発肺気腫モデルの BALF中マクロファージ数に及ぼす KP- 496の影響を示す。

[図 12]マウス ΡΡΕ誘発肺気腫モデルの BALF中好中球数に及ぼす ΚΡ-496の影響を示す。

[図 13]マウス ΡΡΕ誘発肺気腫モデルの BALF中好酸球数に及ぼす ΚΡ-496の影響を示す。

[図 14]マウス PPE誘発肺気腫モデルの肺重量に及ぼす KP-496の影響を示す。

[図 15]マウス PPE誘発肺気腫モデルの肺傷害スコアに及ぼす KP-496の影響を示す。

[図 16]マウス PPE誘発肺気腫モデルの肺胞腔平均面積に及ぼす KP-496の影響を示す。

[図 17]マウス PPE誘発肺気腫モデルの肝臓、脾臓および胸腺の臓器重量に及ぼす K P-496の影響を示す。図 A、 Bおよび Cはそれぞれ肝臓、脾臓および胸腺である。

[図 18]マウス五酸ィ匕バナジウム誘発気管支炎モデルの肺組織内気管支上皮における粘液産生に及ぼす KP-496の影響を示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明の慢性炎症性肺疾患の予防もしくは治療のための薬剤における有効成分は、 2— {N— [4一（4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル]—N—{3—[ (4—ィソプロピル 2 チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸（KP-496) またはその薬学的に許容し得る塩である。これらの塩としては、例えば、ナトリウム、力リウム、マグネシウム、カルシウム等の金属塩；トリメチルァミン、トリェチルァミン、ピリジン、ピコリン、 N-メチルピロリジン、 N-メチルビペリジン、 N-メチルモルホリン等の有機塩が挙げられる。これらの有効成分は水和物であってもよ、。

これらの有効成分は、国際公開第 98/57935号パンフレットに記載される化学合成法により製造することができる。

本発明の薬剤が対象とする慢性炎症性疾患である間質性肺炎としては、より具体的には、急性または慢性の間質性肺炎が挙げられる。また、膠原病などの自己免疫疾患、感染症、放射線、ブレオマイシンなどの薬剤または異物吸入などの原因が明確である二次性の間質性肺炎、または原因が明らかでない特発性の間質性肺炎が挙げられる。

慢性炎症性肺疾患である COPDとしては、肺気腫または慢性気管支炎が挙げられる。 COPDは、喫煙または大気汚染物質によって引き起こされるものであり、大気汚染物質としては、喫煙ガス、排ガス、無機粉塵、煤煙などが挙げられる。

[0015] 本発明の有効成分は、それ自体単独あるいは公知の製剤方法を利用して各種の剤型にして投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ剤などの経口剤や、注射剤、点鼻剤、点滴剤、吸入剤、経皮吸収剤、貼付剤などの非経口剤の剤型にして投与することができる。特に、本発明の有効成分は、吸入剤の剤型で鼻腔もしくは口腔内から吸入投与するのが好ましい。吸入剤は、例えば、有効成分を通常の方法により散剤、細粒剤、顆粒剤などに成型し、力プセルに充填してカプセル製剤とし、通常用いられる吸入デバイスから吸入する投与方法が好ましぐ特に、エリスリトールやトレハロースなどの担体粒子の表面に、本発明の有効成分を微細化したものを付着させて粉末剤とし、これをカプセルに充填して

、吸入デバイスから吸入投与するのが好ましい (例えば、国際公開第 01/026630号パンフレット参照）。あるいは、エアロゾル剤とする力、または、有効成分の液剤をネブライザ一を用いて霧状にして吸入投与するのが好まし、。本発明の有効成分のヒトへの投与量は患者の症状、年齢、体重、治療効果、投与方法、投与期間により異なる力例えば、経口投与の場合、成人 1日当り、 lmg〜： Lg の範囲で投与するのが好適である。吸入投与する場合には、成人 1日当り、 0.1mg〜 50mgの範囲で投与するのが好適である。

[0016] 以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に解説するが、以下の記載は本発明の範囲を何ら限定するものでな、。

[0017] 実施例 1

ヒト好中球游走に対する KP-496の抑制効果

1.雄

a)ヒト白血球の調製

ヒト末梢血液中の白血球は、予め試験の目的など十分なインフォームド 'コンセントを行い、本人の承諾を得た健常人 (男性) 4名から、医師により 20mLの静脈採血を行った。得られたへパリン加血に等量の 3%デキストラン (M.W.208000)生理食塩液を混和し、 1時間、静置した。その後、上清を回収し、 4°C、 150gで 5分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿に赤血球の溶血操作を 2回繰り返した。すなわち、氷冷した 0.2 %NaCl溶液 4mLをカ卩ぇ素早く懸濁し、 20秒〜 30秒放置した後、氷冷した 1.6%NaCl 溶液 4mLを加えて混和し、等張に戻した。その後 4°C、 150gで 5分間遠心した後、同様の操作を繰り返し、最終的に得られた細胞の沈殿を緩衝液 (0.1% FBS含有 Hank' s 液）に浮遊させ、試験に用いた。

[0018] b)游走の誘発

48ゥエル改変式ボイデンチヤンバー（Neuro Probe)を用いて行った。すなわち、チヤンバーの下層ゥエルには LTB 10nmol/Lを含む溶媒液を 25 μ Lを満たし、その上

4

にポリカーボネートフィルター（PVP- free、ポアサイズ 3 μ m)を置いた。チャンバ一の上層部分を装着し、上層ゥエルには緩衝液で調製した白血球懸濁液（1.0 X 10⁶ cells /mL)をそれぞれ 45 L分注した。その後、直ちに試験物質 (最終濃度の 10倍濃度液）5 /z Lを上層側ゥエルに添カ卩した。チャンバ一は、培養インキュベ-ター（37°C、 5 %CO—95%空気）内で 1.5時間、インキュベートした。終了後、フィルターの上層側

2

にある非遊走細胞を削り取り、下層側に遊走した細胞をメタノールで 5分間、固定した。遊走細胞は、 Diff-Quick染色液で染色し、スライドガラス上で風乾後、ェンテラン- ユーで封入した。フィルターを完全に通り抜けた細胞を、 1ゥエルあたり高出力顕微鏡下視野（X 400倍)で 4視野カウントし、その平均値を遊走細胞数とした。各試験物質は、それぞれ 3ゥエルで行い、その平均値を算出し個体値とした。

[0019] c)統龍析

各群の平均値と標準偏差を算出した。無処置対照群と LTB処置対照群の比較は、

4

まず等分散検定を Levene法で行い、その後 t検定を行った。 LTB処置対照群およ

4

び各試験物質処置群の比較を行うため、まず Levene法で等分散性を確認した後、一元分散分析を行い、群間の有意水準 (P)値が 0.05未満の場合に、 Dunnett法により多重比較を行った。有意水準値は 0.05%とした。

[0020] 2.結果

調製したヒト末梢血液中の白血球は、平均で好中球 78.3±9.7%、好酸球 6.5±2.7 %、リンパ球 9.8±6.6%および単球 5.6±2.6%であった。顕微鏡観察では、 LTB処

4 置により遊走した細胞は、好中球のみであった。この遊走を、 KP-496は濃度依存的に抑制し、 1 μ mol/Lでは有意であった。 LTD受容体アンタゴ-ストであるモンテル

4

カストおよびプランルカストも 10 μ mol/Lでは抑制したが、 1 μ mol/Lでは全く抑制しなかった。 TXA 受容体アンタゴ-ストであるセラトロダストは、 10 μ mol/Lでも全く抑

2

制しなかった（図 1)。

[0021] 3.者察および結論

KP-496はヒト白血球を用いた遊走試験で、好中球の LTB誘発性遊走を濃度依存

4

的に抑制した。抗 LTD剤の効果は低濃度は観察されず、抗 TXA剤は高濃度でも観

4 2

察されないことから、 KP-496は、抗 LTDゃ抗 TXA以外のメカニズムを介して、炎症

4 2

性細胞の活性化及び浸潤を抑制する事が示唆された。

[0022] 実施例 2

間皙件肺炎および肺線維症に針する KP-4 の靠¾効

1·マウス BLM謙発件肺線維症モデル験の法塩酸ブレオマイシン (BLM)を生理食塩液 (生食)で溶解した。 10週齢の雄性 ICR系マウスに BLMを 150mg/10mL/kgの用量で 1回静脈内投与し、病態を誘発した。 BLM 非投与群には生食を代わりに投与した。 KP-496の投与は、 BLM投与日より剖検前日まで 1日 2回、吸入投与した。簡潔に述べると、ポリエチレン容器に無拘束状態で収容したマウスに、ネブライザ一を用いて噴霧した KP-496溶液 (0.5 w/v%)を 30分間自発吸入させた。また、対照として KP-496の溶媒 (生食)を同様に吸入投与した。 1 群の動物数は 8例とした。

[0023] b)気管支 flrtf朐洗浄 (以下 BAL 略す)液評価

BLM投与後、 7日目または 21日目に、マウスをペントバルビタール麻酔下で、放血致死させ、直ちに右肺のみに BALを行った。 BAL液 (BALF)は、遠心分離して上層を除去後、沈殿した細胞を生食に再浮遊させた。粒子計数分析装置を用いて総細胞数を測定した。さらに、残った細胞浮遊液を用いて、細胞塗末標本を作製し、ギムザ染色を施し、細胞を型別に分類して、その百分率から型別細胞数を算出した。 [0024] c)肺臓中ヒドロキシプロリン含量測定

BAL終了後、右肺を凍結乾燥し、肺組織中のヒドロキシプロリン含量をクロラミン T を用いた KISO法に準じて測定した（Inayama et al.， Keio J. Med., 27: 43(1978))。

[0025] d) fl制蔵病組織平

BAL終了後、左肺は 10 vol %中性緩衝ホルマリン液に固定後、常法に従いバラフイン切片を作製し、 H.E.染色およびァザン染色を施して、肺臓の病理組織学的検査を実施した。観察された異常所見については、その程度を盲検下で主観的に 4段階にスコア付けして評価した。

0 :異常所見は全くみられない。 1 :病変が標本の限局性に観察される。 2 :病変が標本の約 1/3領域に観察される。 3 :病変が標本の約 1/2領域に観察される。 4 :病変が標本のほぼ全域に観察される。

[0026] e)統脑析

各群の平均値と標準偏差を求め、 BLM投与溶媒群と BLM投与 KP-496群あるいは生食投与溶媒群の 2群間比較を Studentの t検定で実施した。また、病理組織傷害スコアでは、 Mann-Whitney検定を用いた。有意水準（P)は 0.05 %とした。

[0027] 2.

BLM投与溶媒群および生食投与溶媒群の投与 7日目の BALF中総細胞数は、それぞれ 1.1 士 0.31 X 10⁵ cellsおよび 0.4士 0.06 x 10⁵ cellsで、生食投与溶媒群に比べて BLM投与溶媒群が有意な増加を示した。 BLM投与 KP-496群は、 0.6士 0.29 X 10⁵ cellsで、 BLM投与溶媒群に比べて有意な減少を示した (図 2)。また、細胞型別で見ると、生食投与溶媒群では、 0.4士 0.05 X 10⁵ cellsと大部分が肺胞マク口ファージであり、その他に好中球 0.01 士 0.02 X 10⁴ cellsおよびリンパ球 0.01 士 0. 01 X 10⁴ cellsが僅か〖こ認められた。 BLM投与溶媒群では、肺胞マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球がそれぞれ 0.9士 0.25 xlO⁵ cells, 0.9士 0.57 x 10⁴ cell s、 1.4 ± 0.93 x 10³ cellsおよび 0.5 ± 0.31 x 10⁴ cellsであり、生食投与溶媒群に比べていずれの細胞も有意な増加を示した。 BLM投与 KP-496群では、肺胞マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球がそれぞれ 0.6士 0.27 X 10⁵ cells, 0.2士 0.11 x 10⁴ cellsゝ 0.3 ± 0.68 x 10³ cellsおよび 0.1 ± 0.09 xlO⁴ cellsであり、 BLM投与溶媒群に比べていずれの細胞も有意な減少を示した (図 3、 4、 5および 6)。

[0028] 21 日目における BLM投与溶媒群および生食投与溶媒群の BALF中総細胞数は、それぞれ 1.2 ± 0.42 X 10⁵ cellsおよび 0.3 ± 0.12 x 10⁵ cellsで、生食投与溶媒群に比べて BLM投与溶媒群が有意な増加を示した。 BLM投与 KP-496群は、 0. 8士 0.24 X 10⁵ cellsで、 BLM投与溶媒群に比べて有意な減少を示した (図 2)。また、細胞型に分類すると、生食投与溶媒群では、大部分が肺胞マクロファージ 0.3 士 0 .11 X 10⁵ cellsであり、その他にも好中球 0.01 ± 0.01 x 10⁴ cellsおよびリンパ球 0.1 士 0.02 X 10⁴ cellsが僅かに認められた。 BLM投与溶媒群では、肺胞マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球がそれぞれ 1.2 ± 0.40 X 10⁵ cellsゝ 0.2 ± 0.10 x 10 4 cellsゝ 0.5 ± 0.35 x 10³ cellsおよび 0.4 ± 0.22 x 10⁴ cellsを示し、生食投与溶媒群に比べていずれの細胞も有意な増加を示した。 BLM投与 KP-496群では、肺胞マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球がそれぞれ 0.7士 0.23 X 10⁵ cells, 0 .02士 0.02 X 10⁴ cells, 0.1 士 0.21 x 10³ cellsおよび 0.3士 O.lOx 10⁴ cellsで、 BLM 投与溶媒群に比べて肺胞マクロファージ、好中球および好酸球が有意な減少を示した (図 3、 4、 5、および 6)。

[0029] b)肺朧右中ヒドロキシプロリン含畺

BLM投与溶媒群および生食投与溶媒群の投与 7日目のヒドロキシプロリン含量は、それぞれ 125.6士 10.81 μ gおよび 132.3士 9.54 μ gで、両群間に差は認められなかった。 BLM投与 KP-496群は、 129.9士 11.35 μ gで、 BLM投与溶媒群に比べて差は認められな力つた (図 7)。

21日目における BLM投与溶媒群および生食投与溶媒群のヒドロキシプロリン含量は、それぞれ 171.6±26.37 μ gおよび 125.5±9.25 gで、生食投与溶媒群に比べて BLM投与溶媒群が有意な増加を示した。これに対し、 BLM投与 KP-496群は、 13 8.0±9.93 μ gで、 BLM投与溶媒群に比べて有意な減少を示した (図 7)。

[0030] c) fl制蔵左病理組織学的評価

生食投与溶媒群の投与 Ί日目および 21 日目で、いずれもの肺臓も病理組織学的に異常所見は認められな力つた。一方、 BLM投与溶媒群では、投与 7日目で肺胞中隔や肺胞腔内に好中球や肺胞マクロファージの浸潤およびうつ血や出血等の急性炎症性変化が観察され、そのスコアは 2.1士 0.83であった（図 8)。投与 21 日目において、急性炎症は消失し、代わって肺胞上皮細胞の腫大 '増生やリンパ球集簇等の慢性炎症性変化に移行し、そのスコアは 2.4士 0.92であった（図 8)。さらに、肺胞中隔や肺胞腔内において、線維増生がみられ、そのスコアは 1.8士 1.04であつた。これに対し、 BLM投与 KP-496群における急性炎症、慢性炎症および線維増生のスコアは、それぞれ 1.0士 0.76、 1.0士 0.76および 0.6士 0.52で BLM投与溶媒群に比べて!/、ずれのスコアも有意に軽減した（図 8)。

[0031] d)者察および結論

本発明者らは、マウス BLM静脈内単回投与誘発性肺線維症モデルを用いて、 KP -496の吸入投与が間質性肺炎および肺線維症に有効性を示すのかを検討した。投与経路に吸入投与を選んだ理由は、 BLM投与によって炎症が誘発される肺組織に直接作用させるためである。その結果、 BLM投与後 7 日目および 21 日目で確認された BALF中総細胞数の有意な増加を、 KP-496は、ずれの時点にぉ、ても明らかに抑制した。 BALF中細胞の型別分類では、 BLM投与によりマクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球等の炎症性細胞の浸潤が顕著にみられ、 KP-496は、この細胞浸潤を有意に抑制した。ステロイドが抑制しにくい好中球の浸潤を KP-496が抑制したことは特記に値する。

[0032] 肺臓の病理組織学的所見では、 BLM投与によって、肺胞中隔や肺胞腔内に好中球や肺胞マクロファージの浸潤およびうつ血や出血等が投与後 7 日目で顕著に観察され、急性間質性肺炎像を呈していた。その後、 21 日目では、急性間質性肺炎は消失し、代わって肺胞上皮細胞の腫大 '増生やリンパ球集簇等の慢性炎症へ移行すると共に、肺胞中隔および肺胞腔内に線維増生が生じて、肺組織は明らかに線維化に進展した。さらに、線維成分の特異的なマーカーであるヒドロキシプロリンが肺糸且織中において、明らかな増加を示した。これらの BLMによる肺組織の病理組織学的変化に対し、 KP-496は、急性炎症ならびに慢性炎症を明らかに軽減し、本疾患モデルの最終的な病態像である線維化への進展も明らかに抑制した。さらに、 KP-496 吸入投与で肺組織中のヒドロキシプロリン含量が明らかに減少した。この結果は、 BL M投与により肺毛細血管内皮細胞や肺胞上皮細胞が刺激され炎症反応によって産生される pLTや TXA等の脂質メディエーターの活性に対して、 KP-496が拮抗作用を

2

示したことで、初期の急性炎症を軽減し、その後の慢性炎症さらには線維化を抑制したものと推察した。

以上の結果から、肺局所への KP-496の吸入投与は、急性および慢性間質性肺炎または肺線維症の予防治療剤として有効であることが示された。

[0033] 実施例 3

flrtf気瞎に針する KP-496の効

1.マウス PPE誘発肺気腈モデル実験の方法

8週齢の雄性 C57BL系マウスをイソフルラン麻酔した。咽喉頭部から気管内に挿入した力-ユーレを介して PPEの 25 gを肺に 1回投与し、肺傷害を誘発した。 PPE 非投与群 (正常群）には、生食を代わりに投与した。 KP-496の予防的投与実験 (以下、予防実験)では、 PPE投与 2日後の BALF中の炎症性細胞と、 10日後の肺病理検查で薬効を評価した。 KP-496の治療的投与実験 (以下、治療実験)では、 PPE投与 14日後に肺病理検査と臓器重量で薬効を評価した。

[0034] 薬物投与期間は、予防実験では、 PPE投与当日より剖検前日まで、治療実験では決められた日（KP-496A群 ,ΡΡΕ投与日； ΚΡ-496Β群 ,ΡΡΕ投与 3日後； KP-496C群 ,ΡΡ Ε投与 7日後）から剖検前日までとした。 ΚΡ-496の吸入投与は実施例 2と同様に行つた。また、正常群および対照群には、代わりに生食を同様に自発吸入させた。比較対照薬のプレドニゾロンは 5mg/kgの用量で 1日 2回経口投与した。 1群の例数は 10 匹とした。

[0035] b) BALと薬効評価

動物をペントバルビタール麻酔し、放血致死させ、直ちに左右の肺に生食 2mlで B ALを行った。実施例 2と同様に、 BALF中総細胞数と型別細胞数を測定した。

[0036] c)肺病理組織学的評価

前項と同様に放血致死させた動物から、肺を摘出して、重量測定した。肺臓は、 10 vol%中性緩衝ホルマリン液に固定後、常法に従って病理組織標本を作製し、観察された肺組織傷害の程度を実施例 2と同様にスコア付けして評価した。また、肺組織標本全体の肺胞腔平均面積を、画像処理ソフトを用いて計測した。

[0037] d)統龍析

各群の平均値と標準偏差を算出した。正常群と対照群の比較は、まず等分散検定を Levene法で行い、結果に応じた t検定を行った。対照群と試験物質投与群との比較を行うため、まず Levene法で等分散性を確認した後、 Dunnett法により多重比較を行った。但し、等分散性が認められない評価項目および肺組織傷害スコアに関しては、 Mann-Whitney法によるノンパラメトリック解析を行った。有意水準として 0.05% を採用した。

[0038] 2. 予防実験で、正常群は、生食投与翌日に僅かな体重減少がみられたが、 2日以降は穏ゃ力な増加推移を示した。一方、対照群は、 PPE投与翌日に顕著な体重減少を示し、 4日後まで正常群に比して有意な増加抑制を示した。その後、 5日以降は正常群とほぼ同様の増加推移を示し、 10日後の体重は正常群と同程度であった。 KP-49 6群は、対照群とほぼ同様の体重推移を示した。プレドニゾロン群は、投与 3日以降に体重増加の強い抑制がみられ、 6日後から 10日後にかけて対照群に比して有意に減少した（図 9)。

[0039]

投与 2日後の正常群および対照群の総細胞数は、 0.7±0.1xl0⁵cellsおよび 4.8± 1 .2xl0⁵cellsであり、対照群は正常群に比して有意に増加した。 KP-496群は、 3.1 ±0. 8xl0⁵cellsであり、対照群に比して有意に低力つた。一方、プレドニゾロン群は、 4.3士 2. lxl 0⁵cellsであり、対照群と同等であった（図 10)。

細胞型別で見ると、正常群はマクロファージがその殆どを占め、好中球および好酸球は極めてわずかであった (図 11、 12、 13)。対照群は、マクロファージ、好中球および好酸球が正常群に比していずれも有意に増加した。これに対し、 KP-496群は、いずれの細胞も対照群に比して低値を示し、マクロファージおよび好酸球では有意に低下した。一方、プレドニゾロン群では、好酸球のみが対照群と比して有意に低下した [0040] c)mm . flrt?病理組織評価および肺傷害スコア

予防実験において、対照群の肺重量が正常群に比して有意に増力!]した。これに対し、 KP-496およびプレドニゾロンは、いずれも肺重量の増加を有意に抑制した。治療実験では、 KP-496群は、投与開始日の違いにかかわらず、対照群に比して低値を示した。特に、 PPE投与当日から KP-496投与を開始した群は、対照群との間に有意な差が認められた (図 14)。

予防実験における投与 10日後の正常群の肺には、異常所見は全く認められなかつた。一方、対照群では、末梢気道や肺胞腔が著しく拡大し、肺組織は気腫様変化を呈した。これに対し、 KP-496群では、気腫像は観察されるものの、病変は限局的で軽度であった。また、対照群では、肺胞壁にマクロファージゃ小円形細胞の浸潤および肺胞上皮細胞の増生等の慢性炎症像が観察され、その肺傷害スコアは正常群に比して有意に増加した。これに対し、 KP-496およびプレドニゾロンは、いずれも肺傷害スコアを有意に低下させた。さらに、治療実験においても、 KP-496は、いずれの群でも肺傷害スコアを有意に低下させた（図 15)。

予防実験において、対照群の肺胞腔平均面積は正常群に比して有意に増力 tlした。これに対し、 KP-496およびプレドニゾロンは、いずれも肺胞腔平均面積の増加を有意に抑制した。さらに、治療実験においても、 KP-496は、いずれの群でも肺胞腔平均面積の有意な増加抑制を示した (図 16)。

[0042] f)臓器重量

KP-496群では、臓器重量に影響が認められなかった。しかし、プレドニゾロン群では、肝臓、脾臓および胸腺が、対照群に比して有意に減少していた (図 17)。

[0043] 3.者察および結論

KP-496は、 PPEにより誘発される急性炎症を抑制し、肺気腫病変の進展に対して明らかな改善作用を示した。 PPE投与 2日後に肺気腫病変は生じていな力つたので、 PPEは酵素作用により直接的に肺気腫病変をもたらすのではなぐおそらく浸潤させた炎症性細胞が肺気腫病変をもたらすと考えられる。 KP-496の肺気腫病変改善効果は急性炎症期以降の投与においても認められた。つまり、 KP-496は、浸潤した炎症性細胞の活性化を抑制することで、肺気腫病変の進展抑制効果を示すと考えられる。これらの効果は、プレドニゾロンで認められるような胸腺や脾臓の免疫臓器の抑制によるものではなぐ末梢炎症性細胞の抑制であることが強く示唆された。 KP-496 は、肝臓重量や体重推移にも影響なぐ安全性の高い薬剤であると推察される。

[0044] 実施例 4

粘液産牛.に針する KP-496の効

1.マウス五酸化バナジウム誘発気管支炎モデル実験の方法

a)謂乍籠

7週齢の雄性 C57BL系マウスを用いた。イソフルラン麻酔下に、咽喉頭部から気管内に挿入した力-ユーレを介し、五酸ィ匕バナジウム 20 gを肺に 1回投与し、病態を誘発させた。五酸ィ匕バナジウム非投与群 (正常群）には、生食を代わりに投与した。 K P-496は、実施例 2と同様に、五酸化バナジウム投与当日より剖検前日まで 1日 2回、吸入投与した。また、正常群および対照群には、生食を同様に自発吸入させた。比較対照薬のプレドニゾロンは 5mg/kgの経口投与で、五酸化バナジウム投与当日から剖検前日まで 1日 2回投与した。なお、正常群は 6例、他の群は 1群 10例とした。

[0045] b) mim^, ^m ^ M^

五酸化バナジウム投与 7日後にマウスをペントバルビタール麻酔下で腹大動静脈から放血致死させた。肺を摘出し、 10vol%中性緩衝ホルマリン液で固定後、常法に従って病理組織標本を作製した。 PAS染色を施して、肺内気管支上皮細胞の粘液産生領域の面積を、画像解析ソフトを用いて計測した。計測された値を気管支内腔周囲長 (粘膜基底膜で求めた)で割り、その商を気管支 lmmあたりの粘液産生領域面積として表現した。

[0046] c)統計解析

実施例 3と同様に、統計解析を行った。

[0047] 2. S

ト.皮粘液 i¾牛盲

対照群の PAS陽性面積は、正常群に比して有意に増加した。これに対し、 KP-496 群およびプレドニゾロン群では、いずれも PAS陽性面積の有意な増加抑制が認められた (図 18)。

[0048] 3.者察および結論

KP-496は、五酸ィ匕バナジウムにより誘発される、肺内気管支上皮細胞における粘液過剰分泌を明らかに抑制した。気管支上皮の粘液産生亢進は、 COPD病態である慢性気管支炎の一つの特徴である。したがって、 KP-496は COPD治療剤として極めて有用であると考える。

[0049] 実施例 5

マウスの肺組織中 KP-496濃度

1.旌

7週齢の雄性 C57BL系マウスを用いた。 KP-496は、実施例 2と同様に、 30分間噴霧して鼻腔より肺組織に自発吸入させた。吸入終了後、ベントバルピタール麻酔下で放血致死させ、直ちに、肺を摘出して重量測定後、 80°Cに凍結保存した。肺重量の 4倍量のリン酸緩衝液をカ卩えてホモジネートし、 LC-MSを用いて測定した。動物数は 5例とした。

2.腿

マウス肺の KP- 496含量は、 418 ± 114ngであった。

[0050] 3.者および結論

KP-496の吸入投与量は、約 0.4 g/マウスであった。マウスの体重は 20gであり、体重換算すると、 20 g/kgとなる。ヒト体重を 60kgとすると lmg/ヒトであり、この用量で慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療できる可能性が示唆された。

産業上の利用可能性

[0051] 2— {N— [4一（4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル]—N— {3— [ (4 イソプロピル 2—チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する本発明の薬剤は、急性および慢性の間質性肺炎または肺線維症の予防もしくは治療剤として極めて有効である。また、肺気腫や慢性気管支炎などの慢性閉塞性肺疾患の予防もしくは治療剤としても極めて有効である。

Claims

請求の範囲

[1] 2- {N- [4一（4一クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル]—N— {3— [ (4一イソプロピル 2—チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する、慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療するための薬剤。

[2] 慢性炎症性肺疾患が、間質性肺炎または肺線維症である請求項 1の薬剤。

[3] 間質性肺炎または肺線維症が、化学療法を行った際の副作用として発症したものである請求項 2の薬剤。

[4] 慢性炎症性肺疾患が、慢性閉塞性肺疾患である請求項 1の薬剤。

[5] 有効成分を肺組織内に吸入投与するための請求項 1から 4のいずれかに記載の薬剤。

[6] 慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療するための薬剤を製造するための、 2- {N 一 [4一（4一クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル]一 N— {3— [ (4一イソプロピル 2—チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩の使用。

[7] ヒトを含む哺乳動物における慢性炎症性肺疾患を予防もしくは治療する方法であつて、 2— {N— [4一（4 クロ口ベンゼンスルホ -ルァミノ）ブチル] N— {3— [ (4ーィソプロピル 2—チアゾリル)メトキシ]ベンジル } }スルファモイル安息香酸またはその薬学的に許容し得る塩を該哺乳動物に投与することを含む上記方法。