WO2005095577A1 - 培養容器、軟骨細胞培養方法および軟骨細胞評価方法 - Google Patents

培養容器、軟骨細胞培養方法および軟骨細胞評価方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005095577A1
WO2005095577A1 PCT/JP2005/006707 JP2005006707W WO2005095577A1 WO 2005095577 A1 WO2005095577 A1 WO 2005095577A1 JP 2005006707 W JP2005006707 W JP 2005006707W WO 2005095577 A1 WO2005095577 A1 WO 2005095577A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
collagen
culture
chondrocytes
gel layer
layer
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/006707
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masahito Taya
Masahiro Kino-Oka
Original Assignee
Japan Tissue Engineering Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Tissue Engineering Co., Ltd. filed Critical Japan Tissue Engineering Co., Ltd.
Priority to JP2006511874A priority Critical patent/JP4825666B2/ja
Publication of WO2005095577A1 publication Critical patent/WO2005095577A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/24—Collagen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a culture vessel, a method for culturing chondrocytes, a method for evaluating chondrocytes, a method for producing a three-dimensional culture of chondrocytes, and a human implant.
  • chondrocytes grown in two-dimensional culture represented by planar culture (monolayer culture) into a joint in the form of a cell suspension.
  • planar culture monolayer culture
  • chondrocytes are dedifferentiated into fibroblast-like cells when continuous culture is continued, techniques for culturing chondrocytes while maintaining the characteristics of the chondrocytes have been studied.
  • chondrocytes are culturing chondrocytes on UV-crosslinked type II collagen-coated surfaces. Shakibaei et al, "Cell Biology International", 1997, 21, 2, p.115-125). Also disclosed is a method of regenerating chondrocytes by embedding in collagen gel and performing three-dimensional culture even on dedifferentiated chondrocytes (Japanese Translation of PCT International Publication No. 2003-534792). It is also known that chondrocytes can be supported on a scaffold composed of artificial materials or extracellular matrix components, and that the characteristics of chondrocytes can be maintained by three-dimensional culture.
  • wrap chondrocytes in collagen gel There is a technique for treating joint diseases by implanting cultured cartilage cultured in an implanted state into the joint (Mitsuo Ochi et al., "Nippon Medical Shinbun", 1998, 3875, p.33-36 ).
  • differentiation is promoted by culturing epithelial cells in a culture vessel having a culture surface covered with a cross-linked collagen film (Japanese Patent Application Laid-Open No. 08-038165). Disclosure of the invention
  • Still another object is to provide a method for efficiently producing a three-dimensional culture of chondrocytes.
  • the inventors of the present invention have repeatedly studied the above problems, and have found that culturing chondrocytes on the surface of a collagen gel layer can suppress dedifferentiation and proliferate while maintaining the characteristics well. Completed the invention. According to the present invention, the following means are provided.
  • a culture vessel comprising a collagen layer containing a collagen in an uncrosslinked or low crosslinked state.
  • the collagen layer preferably contains at least 0.5 mg of collagen per 1 cm 2 of the surface.
  • the collagen layer contains type I collagen.
  • Any of these culture vessels is preferably a culture vessel for culturing chondrocytes, and is preferably in a form for two-dimensional culture typified by planar culture (monolayer culture).
  • the collagen layer may be dried.
  • the collagen layer may be a layer that forms a network structure of a collagen fibrous body when a condition for gelling the collagen is given.
  • the collagen layer may be a collagen layer obtained by drying collagen in the collagen solution supplied to the culture surface of the culture vessel without completely crosslinking the collagen.
  • a culture container including a collagen gel layer containing collagen in an uncrosslinked or low crosslinked state.
  • the collagen in the collagen layer is preferably fibrillated, and the collagen gel layer preferably has a network structure of a collagen fibrous body.
  • the collagen layer containing uncrosslinked or low crosslinked collagen mainly contains an inert gas. It may be obtained by being gelled after being stored in an inert gas atmosphere.
  • a method for producing a culture vessel comprising a step of drying a collagen solution without completely crosslinking the collagen solution to form a collagen layer in the culture vessel.
  • a step of storing the collagen layer in an inert gas atmosphere mainly containing an inert gas may be provided.
  • the method may further include a step of gelling the collagen layer.
  • the collagen gel layer preferably contains 0.5 mg or more of collagen per cm 2 of the surface.
  • the collagen gel layer preferably contains type I collagen.
  • the collagen gel layer may have a network structure of a collagen fibrous body.
  • the collagen gel layer is a layer formed by supplying a liquid to a collagen layer obtained by drying without completely cross-linking the collagen in the collagen solution supplied to the culture surface of the culture vessel. Can be done.
  • a liquid may be supplied to the collagen layer of any of the culture vessels to form a collagen gel layer.
  • chondrocytes are seeded on the surface of a collagen gel layer containing uncrosslinked or low-crosslinked collagen on the surface. Sowing process,
  • a method for evaluating chondrocytes comprising the steps of:
  • the chondrocytes to be seeded in the seeding step can be cells cultured on a culture surface having no collagen gel layer.
  • the collagen gel layer contains at least 0.5 mg of collagen per cm 2 of the surface.
  • the evaluation step is a step of evaluating based on the circularity of the cells.
  • the circularity can be a value obtained by dividing the projected image perimeter of each cell by the circumference corresponding to the projected area circle.
  • cells having the circularity equal to or greater than a predetermined threshold value are expressed as chondrocyte traits. It is preferable to determine that it is maintained.
  • the circularity is preferably 0.8 or more.
  • the collagen gel layer may have a network structure of a collagen fibrous body.
  • the evaluation step may be a step of evaluating a ratio (%) of the number of cells having a circularity of 0.8 or more to the total number of measured cells.
  • a method for producing a three-dimensional culture of chondrocytes wherein the chondrocytes are formed on a collagen gel layer having uncrosslinked or lowly crosslinked collagen on the surface.
  • a production method comprising: In this production method, the two-dimensional culture step is preferably a subculture step.
  • these production methods include an evaluation step of evaluating the state of differentiation based on the individual cell shape on the surface of the collagen gel layer in the culturing step, and the three-dimensional culturing step is performed in the evaluation step.
  • the step may be a step of performing three-dimensional culture using cells determined to maintain chondrocyte traits.
  • an artificial implant including a collagen layer containing collagen in an uncrosslinked or low crosslinked state.
  • an artificial implant comprising: a collagen gel layer containing collagen in an uncrosslinked or low crosslinked state; and chondrocytes on the surface of the collagen gel layer.
  • a method for producing a surface-modified artificial transplant comprising: forming a collagen gel layer containing uncrosslinked or low-crosslinked collagen on the surface of the artificial implant; Culturing chondrocytes with
  • FIG. 1 is a view showing a production example of the culture vessel of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a cell observation device used in the method for evaluating chondrocytes of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing an SEM image of chondrocytes during two-dimensional culture in Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing an SEM image of chondrocytes during two-dimensional culture in Comparative Example 1.
  • FIG. 5 is a diagram showing a type II collagen immunostaining image of Example 1.
  • FIG. 6 is a diagram showing a type II collagen immunostaining image of Comparative Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing changes in cell numbers after 168 hours and 504 hours in the three-dimensional culture of Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 8 is a diagram showing changes in the number of cells after 168 hours and 504 hours in the three-dimensional culture of Example 2 and Comparative Example 2.
  • FIG. 9 is a diagram showing changes in cell numbers after 168 hours and 504 hours in the three-dimensional culture of Example 3 and Comparative Example 3.
  • FIG. 10 is a diagram ((a) to (c)) showing the state of culturing chondrocytes on collagen gels having different collagen concentrations.
  • FIG. 11 is a graph showing the amount of GAG production with respect to collagen concentration.
  • FIG. 12 is a graph showing the ratio of the number of chondrocytes having a predetermined circularity to the collagen concentration.
  • FIG. 13 is a diagram ((a), (b)) showing a histogram indicating the distribution of circularity.
  • FIG. 14 is a view showing a step of preserving a collagen gel layer in Example 6.
  • FIG. 15 is a graph showing the percentage of circular cells on the surface of the collagen gel stored under each storage condition.
  • FIG. 16 is an electron micrograph showing the state of collagen in a collagen gel under each storage condition.
  • 10 indicates a cell observation device
  • 11 indicates a support
  • 13 indicates an LED lamp
  • 15 indicates a CCD camera
  • 16 indicates a three-dimensional stage
  • 17 indicates an incubator
  • 19 indicates a control device
  • 20 indicates a culture vessel.
  • the culture vessel of the present invention includes a collagen layer containing uncrosslinked or lowly crosslinked collagen.
  • the collagen gel layer obtained by gelling the collagen layer can proliferate cells while maintaining the characteristics of the chondrocytes even when the chondrocytes are cultured in a plane. .
  • a collagen gel layer having a network structure of fibrous collagen can be formed.
  • this collagen layer in an inert gas atmosphere mainly composed of inert gas, it is possible to form a network structure of fibrous collagen by subsequent gelation.
  • an inert gas atmosphere mainly composed of inert gas
  • the culture container of the present invention will be described, and a method for producing the culture container, a method for culturing chondrocytes using the culture container of the present invention, a method for evaluating the same, and the like will be described.
  • the culture vessel of the present invention various conventionally known culture vessels can be used without particular limitation.
  • a plane or curved surface suitable for forming a collagen layer is provided as a portion corresponding to a culture surface.
  • examples of such a culture vessel include various kinds of vessels for flat culture (for monolayer culture), and specific examples include a T-shaped flask, a square flask, a ⁇ D-shaped flask, and a petri dish. it can.
  • the material used for the culture surface can be used without limitation.
  • the main culture vessel is preferably used for the growth of chondrocytes, it is preferably a culture vessel used for culturing chondrocytes.
  • the site of the culture vessel where the collagen layer is formed can be the surface inside the culture vessel that comes into contact with the culture solution and the cultured cells, but is preferably the site that forms the bottom surface of the culture cavity.
  • the main culture vessel has a collagen layer having uncrosslinked or low crosslinked collagen on the surface.
  • Collagen in an uncrosslinked state or a low crosslinked state means a state in which collagen constituent molecules (such as ⁇ chains) are not crosslinked with each other or are contained at a low degree of crosslinking. Therefore, collagen in an uncrosslinked or low crosslinked state includes collagen constituent molecules that are present without being crosslinked.
  • the cross-linked state of collagen is formed by cross-linking its constituent molecules with each other by an electron beam such as ultraviolet rays, heat or various cross-linking agents.
  • Such a collagen layer containing collagen in an uncrosslinked or low crosslinked state can be obtained by performing a collagen layer forming step without a crosslinking reaction or a collagen layer forming step with a crosslinking reaction with a limited degree of crosslinking.
  • the step of forming a collagen layer that does not involve a cross-linking reaction means not only performing no cross-linking reaction, either physical cross-linking or chemical cross-linking, but also using an ultraviolet ray Avoiding exposure to etc. can also be included.
  • the step of forming a collagen layer involving a crosslinking reaction with a limited degree of crosslinking involves performing a crosslinking reaction by adjusting the amount of electron beam irradiation and the amount of a crosslinking agent added so that uncrosslinked collagen constituent molecules can remain. Can be implemented. In the case of crosslinking, the crosslinking may be performed before, during, or after drying the collagen solution.
  • the collagen in the collagen layer is in an uncrosslinked or low crosslinked state that is effective in the present invention, that is, an effective amount of uncrosslinked collagen constituent molecules that allow culturing while maintaining the characteristics of the cultured cells remains.
  • a good culture of chondrocytes and fibroblast-like cells derived from chondrocytes can be formed.
  • chondrocyte traits in collagen gel-embedded cultures of chondrocyte-derived fibroblast-like cells observed to be dedifferentiated in a normal culture vessel with a polystyrene surface When cells capable of being cultured are cultured on the surface of a collagen gel layer obtained by gelling the collagen layer, preferably, 50% or more of the cell number can be observed as a spherical form.
  • the cells having recovered the characteristics of the chondrocytes and the surface of the collagen gel layer can be obtained.
  • the ratio of the number of cells having a spherical shape is more preferably 80% or more, and further preferably about 100%. Note that whether or not the cell has a spherical shape can be determined based on the circularity of the cell as described later.
  • collagen is not cross-linked or low-cross-linked, it is possible to maintain the differentiation state of chondrocytes and to cultivate or to realize the potential of differentiation. It is considered that as a result, it is possible to determine whether or not they have potential differentiation potential. It has been found that when the collagen layer of the culture vessel of the present invention is gelled, fibrosis proceeds even though collagen is not cross-linked or low-cross-linked, and a network structure of fibrous collagen is formed ( See Example 6.) Although not limiting the present invention, it is presumed that such a network structure of uncross-linked or low-cross-linked collagen can make the differentiation ability of cultured cells visible.
  • the collagen layer may be formed to such an extent that a uniform collagen gel layer can be formed on the culture surface by the moisture of the culture solution or the like during the culture.
  • the collagen layer uniformly covers the entire culture surface.
  • the thickness of the collagen layer is not particularly limited, but is preferably a thickness that does not hinder observation from below the culture vessel.
  • Collagen that forms the collagen layer is available without particular limitation Alternatively, a collagen that can be prepared can be used.
  • enzyme-soluble collagen such as acid-soluble collagen, neutral salt-soluble collagen, and atherocollagen, and alkali-solubilized collagen, and these collagens were chemically modified by succinylation, acylation, and methylation.
  • Chemically modified collagen can be used.
  • a synthetic peptide having a collagen motif artificial collagen
  • an enzyme-soluble collagen such as acid-soluble collagen or atelocollagen is used. Acid-soluble collagen is preferable from the viewpoint of safety, and enzyme-solubilized collagen is preferable from the viewpoint of easiness of operation for preparing a collagen layer.
  • the type of collagen constituting the collagen layer is not particularly limited, and it is possible to use type I, type II, type III, type IV and type V alone or in combination of two or more types.
  • type I collagen is collagen secreted by dedifferentiated chondrocytes
  • type II collagen is collagen secreted by chondrocytes that have maintained differentiation.
  • type I collagen is used. This is because type I collagen can not only maintain differentiation but also obtain sufficient cell proliferation ability. It is also preferable to use atelocollagen treated with an enzyme such as protease or pepsin.
  • acidic collagen it is preferable to use acidic collagen.
  • the collagen layer preferably has a collagen of 0.5 mg or more per lcm 2 of surface. If the collagen concentration is less than 0.0 Smg / cm 2 , chondrocyte traits (particularly morphological traits such as cell morphology, type II collagen production ability, glycosaminodalican production, etc.) in two-dimensional This is because it becomes difficult to maintain the ability to live. On the other hand, when it is not less than 0. SmgZ cm 2 , even a chondrocyte which has not exhibited the external trait of the chondrocyte by ordinary planar culture can be cultured with the external trait displayed. Collagen concentration is preferably, l mg Z cm 2 or more.
  • the collagen concentration it is preferable to increase the collagen concentration.
  • the collagen concentration is too high, it may be difficult to prepare the collagen layer or the cell growth rate may be low.Therefore, set the collagen concentration after conducting preliminary experiments in advance. Is preferred.
  • the collagen layer having collagen in an uncrosslinked or low crosslinked state may be formed, for example, without supplying a collagen solution to a culture surface, without gelling or after gelling, without crosslinking, or without crosslinking. It can be obtained by drying after removing water by suppressing ⁇ . Preferably, the collagen solution is dried without gelling in order to maintain uncrosslinked or low crosslinked.
  • FIG. 1 illustrates a process for producing a culture vessel having a collagen layer on the culture surface of the culture vessel.
  • a collagen solution adjusted to a predetermined concentration is supplied to and laid down on the bottom of the culture vessel so that the surface has a collagen concentration of 0.5 mgZcm 2 or more.
  • the required amount of the collagen solution was V (ml) for the required amount of collagen solution, A (cm 2 ) for the collagen-coated surface, C CL (mgZcm 2 ) for the desired collagen application concentration, and the collagen solution to be laid.
  • the drying method is not particularly limited.
  • the collagen layer (dry body) can be obtained by air-drying at room temperature for several days and finally drying by completely removing moisture by a vacuum dryer. By doing so, it is possible to obtain a culture vessel having a collagen layer at a concentration set on the culture surface.
  • air drying is not always necessary, the air drying period in the case of air drying depends on the collagen concentration. It is preferable that the higher the concentration, the longer the air drying period. Also, if the drying process is performed rapidly, Because of sponge formation, sponge formation is prevented by slow drying, that is, air drying over time. In addition, in these series of steps, in order to avoid crosslinking of collagen, light and heat are blocked.
  • the collagen layer may be composed of collagen alone, but may contain other components as long as the object of the present invention is not hindered.
  • biocompatible polymers bioabsorbable polymers, biodegradable polymers, and the like can be included.
  • saccharides such as hyaluronic acid, chitin, chitosan mucopolysaccharide, synthetic polymers such as polylactic acid and polyglycolic acid, high water-containing polymers such as hydroxyethyl ethyl methacrylate, and fibrin and albumin.
  • the proteins can be mixed.
  • a collagen gel layer suitable for culturing cultured cells such as chondrocytes can be formed by supplying a liquid to the collagen layer.
  • the collagen gel layer has a network structure of fibrous collagen while being uncrosslinked or lowly crosslinked.
  • a culture vessel provided with a collagen gel layer formed by gelling the collagen layer is also included in one embodiment of the present invention.
  • a neutral buffer such as PBS is supplied to the collagen layer to make the collagen layer neutral in the presence of water. This allows the collagen to gel.
  • the collagen layer can be stored until gelled. When preserving, it is preferable to preserve under an inert gas atmosphere mainly containing an inert gas.
  • the inert gas includes, for example, nitrogen, argon, helium, and a mixed gas thereof, and is preferably nitrogen.
  • the inert gas mainly contains an inert gas by 50% or more. It is more preferably at least 70%, further preferably at least 80%, and still more preferably at least 90%.
  • the storage period and temperature for the preferred collagen layer storage step are not particularly limited. It can be from a few days to a week, or about a few weeks.
  • the temperature can generally be about 20-30 ° C.
  • the gas atmosphere to be preserved is preferably dried, for example, at a humidity of 10% RH or less. More preferably, it is at most 5% RH. This is because moisture in the storage step may promote unintended collagen crosslinking and suppress fibrosis.
  • the storage step it is preferable to shield light as in the drying step. This is because light may promote crosslinking.
  • an artificial implant provided with a collagen layer containing collagen in an uncrosslinked or undercrosslinked state.
  • the collagen layer is synonymous with the collagen layer in the culture vessel of the present invention described above, and the collagen constituting the collagen layer is synonymous with the collagen constituting the collagen layer of the culture vessel.
  • the collagen layer included in the artificial implant gels to form a collagen gel when a liquid is supplied and given gelling conditions.
  • an artificial implant including a collagen gel layer in which the collagen layer is gelled is also included in one embodiment of the present invention.
  • the collagen layer or the collagen gel layer is preferably provided corresponding to the culture surface.
  • the surface of the collagen layer or collagen gel layer may form a uniform flat surface, Various shapes such as a shape, a column shape, a spherical shape, a cone shape, and a rectangular shape can be adopted.
  • the three-dimensional form of the artificial implant can include an external form of a body part to be replaced (for example, an artificial bone, an artificial joint, an artificial meniscus, etc.). It can be spherical, conical, or rectangular parallelepiped.
  • the artificial implant can be composed of, for example, a metal material, a ceramic material, a synthetic resin material, a biological material, and the like. Preferably, a material having excellent biocompatibility or biodegradability is used.
  • an artificial implant having a surface modified with a chondrocyte layer or a method for producing a surface-modified artificial implant (a method for modifying the surface of an artificial implant) is also provided. Is done.
  • the chondrocyte culture method of the present invention comprises a seeding step of seeding chondrocytes on the surface of a collagen gel layer containing uncrosslinked or low-crosslinked collagen, and a culture step of growing chondrocytes on the surface of the gel.
  • a collagen gel layer the collagen that can be used for the above-mentioned collagen layer can be used similarly, and the collagen that is preferably used for the above-mentioned collagen layer can also be used preferably.
  • the collagen gel layer is formed by adding a liquid (typically a culture solution, water, buffer solution, etc.) to collagen, and adding any of temperature, concentration, pH, salt concentration, etc., depending on the type of collagen, or a combination thereof. It can be obtained by gelling under gelling conditions consisting of: In addition, the collagen gel layer It can also be obtained by gelling by supplying a liquid to the lage layer and giving necessary gelling conditions. Therefore, prior to the seeding step, a collagen solution is supplied to the surface of the culture vessel or the artificial implant, dried without crosslinking to form a collagen layer, and then a liquid is supplied to the collagen layer. A collagen gel layer can be made. In addition, a collagen gel layer can be produced by supplying a liquid to a culture vessel or an artificial implant having the above-mentioned collagen layer on the culture surface in advance and gelling the collagen layer.
  • a liquid typically a culture solution, water, buffer solution, etc.
  • chondrocytes are cultured on the surface of the collagen gel layer.
  • it depends on the surface morphology of the collagen gel layer, it is basically a two-dimensional culture form on a flat or curved surface. Therefore, unlike three-dimensional culture such as so-called collagen gel embedding culture, it is possible to easily observe the morphology of the cultured cells and to obtain a favorable cell growth rate. From the viewpoint of ease of cell observation and the like, it is preferable to use planar culture.
  • chondrocytes maintain their characteristics by culturing chondrocytes on the surface of a collagen gel layer having uncrosslinked or low-crosslinked collagen on the surface.
  • GAG glycosaminoglycan
  • type I collagen it can be grown while presenting a spherical cell morphology (circular cell morphology in the projected image) as an indicator on the outer shape. Therefore, it is preferable for a method of culturing chondrocytes, and particularly preferable for a method of culturing by subculture.
  • chondrocytes (at least at least) that have lost the characteristic spherical cell morphology in appearance while maintaining the characteristics of chondrocytes by the conventional two-dimensional culture. Externally, it can be said to be a potential chondrocyte.) Can be proliferated while displaying its external trait again. (Chondrocyte evaluation method)
  • the method for evaluating chondrocytes of the present invention comprises a step of sowing chondrocytes on a surface of a collagen gel layer containing collagen in a low cross-linked state on the surface, a step of culturing chondrocytes on the surface of the gel, and a step of culturing the surface of the gel.
  • An evaluation step for evaluating the state of differentiation based on the shape of each cell is provided.
  • the present evaluation method includes a seeding step and a culture step in the above-described culture method, and these are also provided with an evaluation step.
  • the evaluation process that is characteristic of the present evaluation method will be described.
  • the evaluation step evaluates chondrocytes based on the circularity of the cells.
  • the circularity of a cell can be calculated from the aspect ratio of each cell or the like, but is preferably a value obtained by dividing the circumference of the projected image of each cell by the circumference corresponding to the projected area circle.
  • the projected image circumference means the circumference of the projected image of the cell
  • the projected area circle equivalent circumference means the circumference of a perfect circle corresponding to the area of the projected image of the cell. ing.
  • the projected image circumference of the cell and the circumference equivalent to the projected area circle are obtained by imaging the projected image of chondrocytes cultured on the surface of the collagen gel with an imaging device such as a CCD camera, and further from this captured image or from the captured image. It can be easily obtained by adding image processing.
  • JP-A-08-287261 describes a system for recognizing the shape of an individual cell and the concept of the circularity of a cell.
  • the chondrocyte trait is maintained when the circularity is equal to or greater than a predetermined threshold.
  • the predetermined threshold here refers to the degree of circularity with which it can be determined that chondrocytes maintain the trait, and can be set based on the resolution of an imaging device such as a CCD camera or the flow of image processing. , It is preferable to set based on a preliminary experiment performed in advance. For example, it is preferable to determine that the chondrocyte trait is maintained when the circularity is 0.8 or more.
  • the threshold value for determining the circularity is less than 0.8, cells that do not produce type II collagen, which is a characteristic product of chondrocytes, are included, which is not preferable.
  • the value is 0.8 or more, especially when the above-described projected image circumference and the projected area circle are made circular, the chondrocyte differentiation state (whether or not the chondrocyte-like trait is maintained) is highly accurate. Can be determined. More preferably, it is 0.9 or more.
  • the cell circularity can be, for example, 0.8 or more, and preferably 0.9 or more.
  • the cell observation device 10 includes a support 11 for supporting a culture vessel 20, an LED lamp 13 for illuminating the culture vessel 20, a CCD camera 15 for photographing the bottom surface of the culture vessel 20, and a predetermined temperature inside the enclosure. It has an incubator 17 for maintaining and a control device 19 for analyzing images taken by the CCD camera 15.
  • the support 11 supports the culture vessel 20 to which the chondrocytes adhere to the bottom surface, with the bottom surface visually exposed downward.
  • the support stand 11 supports only the bottom edge of the culture vessel 20 or makes a portion corresponding to the bottom face of the culture vessel 20 a transparent member so that photographing by the CCD camera 15 is not hindered. It is configured.
  • the LED lamp 13 projects individual cells in the culture container 20 onto the bottom surface of the culture container 20 by illuminating the culture container 20 supported by the support base 11 from above.
  • the CCD camera 15 is located below the culture vessel 20 so that the bottom of the culture vessel 20 can be photographed. It is installed in one. When the CCD camera 15 receives the command signal from the control device 19, the CCD camera 15 photographs the bottom of the culture vessel 20 illuminated from above by the LED lamp 13, and the individual cells in the culture vessel 20 are cultivated.
  • a projection image projected on the bottom surface is obtained, and data of the projection image is transmitted to the control device 19.
  • the CCD camera 15 is attached to the three-dimensional stage 16 and can move up, down, left, right, back and forth.
  • the three-dimensional stage 16 is operated by a command signal from a control device 19 to position the CCD camera 15 at a predetermined position.
  • Incubator 17 is a support 11 and LED lamp 13 and the temperature-adjustable case containing therein a CCD camera 15, the line for supplying the 5% C0 2 containing culture container 20 which is supported air to support 11 And a line for discharging gas from the culture vessel 20.
  • the control device 19 includes a well-known CPU, ROM, RAM and the like.
  • the control device 19 outputs a command signal to the three-dimensional stage 16 to position the CCD camera 15 at a predetermined position, and then outputs a command signal to the CCD camera 15 to shoot a projection image, and project the projection image.
  • the image is input from the CCD camera 15 and subjected to image analysis processing, and the circularity, cell concentration, and the like are calculated based on the projected image after the image analysis processing.
  • the image processing can be performed, for example, as follows.
  • the control device 19 of the cell observation device 10 can clarify the individual cell image by performing a closing process and a filling hole process after binarizing the projected image of the bottom surface of the culture vessel 20.
  • binarization means that pixels with a gray level value below a certain threshold are set to a value of 1 and the other pixels are set to a value of 0 to partition the image into two regions, white and black. This is the process to be performed.
  • a black body of a predetermined size or more is regarded as a cell, and the black body is filled with small holes by closing processing to smooth the boundary, and further, by filling isolated holes by filling hole processing.
  • cell Image is regarded as a cell, and the black body is filled with small holes by closing processing to smooth the boundary, and further, by filling isolated holes by filling hole processing.
  • the method is suitable for the evaluation of chondrocytes, and a good growth state can be obtained.
  • evaluation based on continuous observation can be easily performed. It is known that when a chondrocyte maintains a trait, it maintains a substantially spherical shape.However, in this evaluation method, it is easy to observe the cell shape of the chondrocyte, Whether or not the trait is maintained can be easily evaluated.
  • chondrocytes by culturing chondrocytes on the surface of the collagen gel layer having collagen in a low cross-linked state on the surface, the appearance of chondrocytes maintaining their traits is The cells can be grown while presenting a spherical cell morphology (a circular cell morphology in the projected image) as an index. Therefore, the differentiation state of chondrocytes can be evaluated with high accuracy. Further, according to the present evaluation method, by culturing latent chondrocytes in two-dimensional culture such as ordinary planar culture, it is possible to present a spherical cell morphology unique to chondrocytes.
  • the cells can potentially retain the characteristics of chondrocytes. Can be determined. Therefore, according to this evaluation method, it is determined whether the cells exhibiting fibroblast-like morphology are potential chondrocytes or cells that have completely de-differentiated from chondrocytes by culturing the cells before seeding on the surface of the collagen gel layer. Regardless of the history, it can be easily determined. Conventionally, such a determination cannot be made without three-dimensional culture.
  • the potential chondrocytes in this specification are chondrocytes having a fibroblast-like morphology on a normal culture surface such as polystyrene, and have a high probability of becoming spheres after transition to three-dimensional culture. It refers to chondrocytes that can be expected or differentiated into chondrocytes of a specific shape.
  • the production method comprises a step of sowing chondrocytes on the surface of a collagen gel layer having uncrosslinked or low crosslinked collagen on the surface, and a two-dimensional culture step of growing chondrocytes on the surface of the collagen gel layer. And a three-dimensional culture step of performing three-dimensional culture using the chondrocytes grown in the culture step.
  • this production method in the two-dimensional culturing step, dedifferentiation of the cultured chondrocytes is suppressed and the chondrocytes are cultured at a sufficient growth rate, so that a three-dimensional culture can be obtained efficiently. .
  • the two-dimensional culture step it can be easily determined from the cell morphology whether or not the chondrocytes maintain their differentiation state, so that the chondrocytes can be surely proliferated.
  • the evaluation step is performed, and the three-dimensional culturing step is performed using the chondrocytes determined to maintain the trait of chondrocytes.
  • the three-dimensional culture in the three-dimensional culture step includes, for example, culture on a scaffold material having an arbitrary shape such as a collagen sponge, and embedding culture on a collagen gel-agarose gel having no arbitrary shape. . From the above, according to the present invention, three-dimensional images obtained by these production methods can be obtained. A culture is also provided.
  • the two-dimensional culture space of the present invention constitutes a pseudo three-dimensional culture space.
  • a 25 cm 2 T-shaped flask was used as a culture vessel to prepare a culture vessel having a collagen layer.
  • a culture vessel equipped with a collagen layer having an uncrosslinked collagen of 05 mgZcm 2 was prepared.
  • a cell suspension having a cell density of 2.5 ⁇ 10 6 cellsZml prepared using the cultured cells obtained in Examples 1 and 2 and a 3 wt% atelocollagen solution were prepared. : 4 volume ratio (collagen concentration after mixing: 0.4 wt%), and this mixed solution was seeded into a 48-well plate at 220 ⁇ in a dome shape (5 ⁇ 10 5 cells / ml). The thickness at this time was about 2 mm.
  • Example 1 After chondrocytes seeded, allowed to gel by 1 hour standing at 37 ° C, followed by addition of liquid medium, subjected to three-dimensional culture at 37 ° C, 5% C0 2 , of the actual Example 1 and 2 A three-dimensional culture was obtained. Furthermore, in Example 1, seeding was performed at a seeding density of 2 X IC cells / ml, and three-dimensional culture was performed in the same manner to obtain a three-dimensional culture of Example 3.
  • a three-dimensional culture by embedding collagen gel was performed using egosyn chondrocytes that were passaged three and five times by two-dimensional culture in the same manner as in Example except that the culture was performed on polystyrene. 1-3 three-dimensional cultures were obtained. Also, as a control, three-dimensional culture using collagen gel embedding was performed using primary rabbit heron chondrocytes. The results of the two-dimensional culture are shown in FIGS. 3 to 6, and the results of the three-dimensional culture are shown in FIGS.
  • Figures 3 and 4 show SEM images of Example 1 (chondrocytes cultured two-dimensionally on the collagen gel layer surface) and Comparative Example 1 (chondrocytes cultured two-dimensionally on polystyrene). Is shown.
  • Figures 5 and 6 show the immunostained images of type 1 collagen of Example 1 (chondrocytes cultured two-dimensionally on the collagen gel layer surface) and Comparative Example 1 (cultured on a polystyrene surface, respectively). 1 shows a type II collagen immunostaining image of chondrocytes). As is evident from Figs.
  • chondrocytes cultured two-dimensionally on the surface of the collagen gel layer maintain a spherical cell morphology, which is an indicator of the trait maintenance of soft cells, and produce type II collagen.
  • chondrocytes cultured on polystyrene showed a flat fibroblast-like morphology, and hardly produced type II collagen, an extracellular matrix produced by chondrocytes. From the above, it was found that by culturing chondrocytes on the surface of the collagen gel layer in an uncrosslinked state, dedifferentiation can be suppressed, the differentiated state can be well maintained, proliferated, and subcultured.
  • FIGS. 7 to 9 show changes in the cell numbers of Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 and the control example after 168 hours and 504 hours in the three-dimensional culture.
  • Table 1 shows the doubling time at this time. The doubling time was calculated from the cell number after 168 hours and 504 hours.
  • Example 1 + Comparative Example 1 Three passages during two-dimensional culture
  • Example 3 In Example 3 and Comparative Example 3 (the inoculation density during three-dimensional culture was 2 ⁇ lC ⁇ cells / ml), the doubling time of cells subcultured on collagen was 5.01 [day]. In contrast, the doubling time of cells passaged on polystyrene was 19.92 [day]. That is, when three-dimensional culture was performed by inoculating cells at a high concentration, in Example 3, no remarkable increase in the cell doubling time was observed, and the cells grew with sufficient proliferation ability. In No. 3, the cell doubling time was remarkably increased, and a decrease in the cell proliferation ability was evident.
  • a 25 cm 2 T-shaped flask was used as a culture vessel to prepare a culture vessel having a collagen layer.
  • 3 X 10 _3 mgZcm 2 (b) 1.
  • collagen concentration is 5. 3X 10- 4 mg / cm 2 , 5. 3 X 10 "3 mg / cm 2 5. 3 X 10" 2 mg / cm 1 ⁇ 05mgZcm 2
  • a culture vessel provided with a collagen layer having uncrosslinked collagen at four different concentrations was prepared, and perforated chondrocytes were prepared at a concentration of 1.OX 10 4 cells / cm 2 in the same manner as in Example 4. seeded, and cultured at 37 ° C, 5% Rei_0 2.
  • GAG glycosaminodalican
  • FIG. 11 shows the amount of GAG production with respect to the collagen gel concentration (C CL ). Specifically, the average GAG generation rate (V / v 0 ) on days 20-31 of culture is shown. GAG production rate can be used as an indicator of chondrocyte trait retention.
  • V is the amount of GAG produced when chondrocytes are cultured on the polystyrene surface. And the production volume V at each concentration is dimensionless.
  • collagen concentration of about Olmg / cm 2 in v / v. There be about 1, but is substantially the same GAG production amount and the culture conditions in polystyrene surface, the collagen concentration 0. 5mg / cm 2 ⁇ l.
  • FIG. 12 shows the ratio of the number of chondrocytes having a predetermined circularity to the collagen gel concentration (C CL ).
  • N r is the number of cells with a circularity of 0.9 or more. und , and the total cell number was N all .
  • the method of calculating the circularity will be described later.
  • FIG. 12 when the collagen concentration is low, the ratio of the number of cells having a circularity of 0.9 or more is extremely low, which supports the observation results of the cell morphology shown in FIG. 10 (a). In contrast, from the vicinity of about 0. Smg / cm 2 becomes remarkable increase of the cell number ratio, at about LmgZcm 2 has become the number of cells ratio is approximately 1, cell morphology observation shown in FIG. 10 (c) The results well supported the results.
  • Fig. 13 is a histogram showing the distribution of circularity with respect to collagen concentration.
  • Fig. 13 (a) shows the results obtained when cultivating egret chondrocytes in the same manner on the polystyrene surface
  • Fig. 13 (b) shows the results.
  • the results are for a culture surface with a collagen concentration of 1.05 gZcm 2 . Since the cells are of the same generation, the histogram should show the same tendency.
  • cells incubated on a high-concentration collagen gel have higher circularity (chondrocyte cells). Cells that maintained the phenotype). These cells were considered to be cells that proliferate while maintaining the characteristics of chondrocytes even after transition to collagen gel-embedded three-dimensional culture.
  • This example demonstrates the relationship between the collagen layer preservation step and chondrocyte culture. Is confirmed.
  • a preservation step was performed, and then the collagen layer was gelled to form a collagen gel layer, and chondrocytes were seeded.
  • the collagen layer For the collagen layer, apply 0.5 wt% of a 0.5 wt% acidic collagen solution (manufactured by Koken Co., Ltd.) to the bottom of a T-flask (25 ml) with a female pipette so that the collagen concentration is 1.05 mgZcm 2, and then shade It was dried at about 25 ° C for about 3 days under lOPa force and lOOPa in the reduced pressure drying apparatus thus formed to form a collagen layer. Then, immediately after adding PBS, gelation was carried out. In addition, a storage step was carried out under air atmosphere and nitrogen atmosphere for 4 days and 7 days, respectively, and then gelation was carried out similarly.
  • a 0.5 wt% acidic collagen solution manufactured by Koken Co., Ltd.
  • All storage steps were performed at 25 ° C and 10% RH or less in a light-shielded state.
  • After preparing each collagen gel layer immediately wash the collagen layer twice with PBS, and then subculture three times in a polystyrene culture vessel using DMEM medium containing fetal bovine serum. were seeded so that 10 4 concentration of cel lsZcm 2, and cultured at 37 ° C, 5% C0 2 .
  • the number of cells having a circularity of 0.9 or more was measured, and the ratio to the total number of cells was determined.
  • the measurement of the number of cells and the measurement of circularity were performed in the same manner as in the previous example.
  • a polystyrene T-flask without a collagen layer and a collagen gel layer was subjected to the same operation without a storage step. The results are shown in FIG.
  • the collagen layer derived from the collagen layer stored under a nitrogen atmosphere showed a better circular cell rate than the collagen gel layer derived from the collagen layer stored under an air atmosphere.
  • the fibrous body formed by twisting a plurality of filaments formed a network structure
  • the collagen gel layer of (b) In the collagen gel layer, although a filament-like one was observed, a flat, void-free surface was formed instead of a network structure.
  • the collagen gel layer obtained by gelation can no longer form a network structure with appropriate pores. It was thought that it was difficult to maintain the differentiation ability of chondrocytes and to maintain the potential differentiation ability of chondrocytes.
  • the collagen gel layer obtained by storing for 7 days was also observed, and showed the same structure as that of each stored for 4 days.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

本発明は、軟骨細胞の形質を維持した状態で細胞増殖が可能な培養容器を提供することを目的とする。このため、培養容器を、表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲン層を備えるように構成する。この培養容器にて細胞を培養することにより、軟骨細胞の形質を維持させあるいは潜在的に軟骨細胞を有する細胞の形質を発現させることができる。

Description

明細書 培養容器、軟骨細胞培養方法および軟骨細胞評価方法 技術分野
本発明は培養容器、軟骨細胞培養方法、軟骨細胞評価方法、軟 骨細胞の三次元培養体の生産方法および人ェ移植物に関する。
背景技術
イン'ビトロにおいて細胞を培養し、医療や研究に利用する技術が知ら れている。 例えば、平面培養（単層培養）に代表される二次元培養によ つて増殖させた軟骨細胞を細胞懸濁液の状態で関節内に注入すること によって、 関節部の疾患を治療する技術が開示されている（Brittberg M. Lindahl A. Nilsson A. Ohlsson C . Isaksson O . Peterson L. , 1'he New England Journal of Medicine", 1994, 331, 14, p.889- 895)。し力 しながら、軟骨細胞は平面培養を継続すると線維芽様細胞に脱分化し てしまうことが知られているため、軟骨細胞の形質を維持したまま培養す る技術が研究されている。
このような技術の 1つとして、 UV (紫外線）架橋した II 型コラーゲン塗 布面上で軟骨細胞を培養することによって、軟骨細胞の形質を維持でき ること力 S 開 示 されてレヽる （ M. Shakibaei et al, " Cell Biology International", 1997， 21, 2, p.115- 125)。また、ー且脱分化した軟骨 細胞であっても、コラーゲンゲルに包埋して三次元培養することによって、 軟骨細胞を再分化させる方法も開示されている（特表 2003— 534792 号）。また、人工材料や細胞外マトリクス成分などで構成された足場材料 に軟骨細胞を担持させ、三次元培養することによって軟骨細胞の形質 を維持できることも知られている。例えば、コラーゲンゲルに軟骨細胞を包 埋させた状態で培養した培養軟骨を関節内に移植することによって、 関 節部の疾患を治療する技術がある（越智光夫ら， "日 本醫事新報"， 1998， 3875, p.33- 36)。その一方で、上皮細胞を架橋コラーゲンフィルム で被覆した培養面を有する培養容器で培養すると分化が促進されること が開示されている（特開平 08— 038165号公報）。 発明の開示
しかしながら、！^. Shakibaei et alには、 Π型コラーゲン塗布面上の培 養では、軟骨細胞の形質は維持されるものの、細胞増殖が期待できない ことが開示されている。一方、本発明者らによれば、特開平 08— 03816 5号公報に記載の架橋コラーゲンフィルム上で軟骨細胞を培養しても軟 骨細胞の形質を維持できないこと、すなわち分化を維持することができな いことを確認するに至った。また、特表 2003— 534792号に記載された 技術に関しては、脱分化したすべての軟骨細胞がコラーゲンゲル内で再 分化するとはいえず、完全に脱分化した細胞ではコラーゲンゲルに包埋 して培養しても再分化しないことも確認した。 したがって、現在までのとこ ろ、脱分化した細胞の内、再分化する細胞と再分化しない細胞との判断 は三次元培養して確認するしかなく、三次元培養することなく予め再分 ィ匕が可能な細胞であるか否かを評価する方法は確立されていない。なお、 ゲル包埋による三次元培養では、平面培養に比ベて細胞増殖が遅いた め、効率的に三次元培養体を得ることが困難であるとともに、細胞が再 分化するか否かを判断する手法としては採用することは困難であった。 本発明は上述の背景技術を鑑み、軟骨細胞の形質を維持した状態 で細胞増殖が可能な培養容器および軟骨細胞培養方法を提供するこ とを一つの課題とする。また、軟骨細胞の形質を潜在的に具備する細胞 であるか否かを評価することのできる軟骨細胞評価方法を提供することも 他の一つの課題とする。 さらにまた、効率的に軟骨細胞の三次元培養 体を生産する方法を提供することも他の一つの課題とする。
課題を解決するための手段
本発明者らは、上記課題につき検討を重ねた結果、コラーゲンゲル層 表面で軟骨細胞を培養することで脱分化を抑制しその形質をよく維持し て増殖させることができるという知見を得て本発明を完成した。本発明に よれば、以下の手段が提供される。
本発明の一つの態様によれば、未架橋または低架橋の状態のコラー ゲンを含有するコラーゲン層を備える、培養容器が提供される。この培養 容器において、前記コラーゲン層は前記表面 l cm2あたり 0 . 5 mg以上の コラーゲンを含有することが好ましい形態である。これらの培養容器にお いて、前記コラーゲン層は I型コラーゲンを含むことが好ましい形態である。 これらのいずれかの培養容器は、軟骨細胞を培養するための培養容器 であることが好ましく、また平面培養（単層培養）に代表される二次元培 養用であることが好ましい形態である。さらに、前記コラーゲン層は乾燥し ていてもよい。さらにまた、前記コラーゲン層は、コラーゲンがゲル化する条 件が付与されるときコラーゲンの繊維状体によるネットワーク構造を形成 する層とすることができる。前記コラーゲン層は、培養容器の培養面に供 給したコラーゲン溶液中のコラーゲンを完全に架橋させることなく乾燥し て得たコラーゲン層とすることもできる。
また、本発明の他の一つの態様によれば、未架橋又は低架橋の状態 のコラーゲンを含有するコラーゲンゲル層を備える、培養容器も提供され る。前記コラーゲン層におけるコラーゲンは、繊維化されていることが好ま しく、前記コラーゲンゲル層は、コラーゲンの繊維状体によるネットワーク 構造を有することが好ましい。また、前記コラ一ゲンゲル層は、未架橋又 は低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲン層が不活性ガスを主 体とする不活性ガス雰囲気下で保存された後にゲル化されて得られるも のであってもよい。
また、本発明の他の一つの態様によれば、培養容器の製造方法であ つて、コラーゲン溶液を完全に架橋させることなく乾燥させて培養容器に コラーゲン層を形成する工程を備える、製造方法が提供される。また、こ の態様において、前記コラーゲン層を不活性ガスを主体とする不活性ガ ス雰囲気下で保存する工程を備えることもできる。さらに、前記コラーゲン 層をゲル化させる工程を備えることもできる。
また、本発明の他の一つの態様によれば、軟骨細胞の培養方法であ つて、表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラー ゲンゲル層の該表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、該表面上で軟 骨細胞を増殖させる培養工程と、を具備する培養方法が提供される。こ の培養方法においては、コラーゲンゲル層は前記表面 1 cm 2あたり 0 . 5 m g以上のコラーゲンを含有することが好ましい形態である。また、前記コラ 一ゲンゲル層は I型コラーゲンを含むことが好ましい形態である。さらにま た、前記コラーゲンゲル層は、コラーゲンの繊維状体によるネットワーク構 造を有していてもよい。 さらに、前記コラーゲンゲル層は、培養容器の培 養面に供給したコラーゲン溶液中のコラーゲンを完全に架橋させることな く乾燥して得たコラーゲン層に液体を供給して形成される層とすることが できる。さらにまた、上記いずれかの培養容器のコラーゲン層に液体を供 給してコラーゲンゲル層を形成してもよい。
さらに、本発明の他の一つの態様によれば、軟骨細胞を評価する方 法であって、表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有する コラーゲンゲル層の該表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、
該コラーゲンゲル層表面で軟骨細胞を増殖させる培養工程と、該コラ 一ゲンゲル層表面の個々の細胞形状に基づいて分化の状態を評価する 評価工程と、を具備する軟骨細胞評価方法が提供される。この軟骨細 胞評価方法においては、播種工程において播種される軟骨細胞は、コラ 一ゲンゲル層を有しない培養面で培養した細胞とすることができる。また、 前記コラーゲンゲル層は前記表面 1 c m 2あたり 0 . 5 mg以上のコラーゲン を含有することが好ましい形態である。さらに、これらの軟骨細胞評価方 法においては、前記評価工程は細胞の円形度に基づいて評価するェ 程であることが好ましい。前記円形度は個々の細胞の投影像周長を投 影面積円相当周で除算した値とすることができ、この形態において、前 記円形度が所定の閾値以上の細胞を軟骨細胞の形質を維持している と判定することが好ましい。具体的には、 円形度が 0 . 8以上であることが 好ましい。なお、前記コラーゲンゲル層は、コラーゲンの繊維状体によるネ ットワーク構造を有していてもよい。 さらに、前記評価工程は、前記円形 度が 0 . 8以上の細胞数の測定した全細胞数に対する割合（％)を評価 する工程としてもよい。
本発明の他の一つの態様によれば、軟骨細胞の三次元培養体の生 産方法であって、表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含 有するコラーゲンゲル層の該表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、 該コラーゲンゲル層表面で軟骨細胞を増殖させる二次元培養工程と、 前記培養工程において増殖された軟骨細胞を用いて三次元培養を実 施する三次元培養工程と、を具備する生産方法が提供される。 この生 産方法においては、前記二次元培養工程は継代培養工程であることが 好ましい。また、これらの生産方法においては、前記培養工程における前 記コラーゲンゲル層表面の個々の細胞形状に基づいて分化の状態を評 価する評価工程を備え、前記三次元培養工程は前記評価工程におい て軟骨細胞の形質を維持していると判定された細胞を用いて三次元培 養を実施する工程とすることができる。 また、本発明の他の一つの態様によれば、未架橋または低架橋の状 態のコラーゲンを含有するコラーゲン層を備えた人工移植物も提供され る。さらに、本発明によれば、未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを 含有するコラーゲンゲル層と、 当該コラーゲンゲル層表面の軟骨細胞と、 を備える人工移植物も提供される。さらにまた、表面改質された人工移 植物の製造方法であって、人工移植物の表面に未架橋または低架橋 の状態のコラーゲンを含有するコラーゲンゲル層を形成する工程と、前記 コラーゲンゲル層表面で軟骨細胞を培養する工程と、
を備える、製造方法も提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明の培養容器の作製例を示す図である。
図 2は、本発明の軟骨細胞評価方法に用いる細胞観察装置の一例 を示す図である。
図 3は、 実施例 1の二次元培養時の軟骨細胞の S E M像を示す図で ある。
図 4は、比較例 1の二次元培養時の軟骨細胞の S E M像を示す図で ある。
図 5は、実施例 1の II型コラーゲン免疫染色像を示す図である。
図 6は、比較例 1の II型コラーゲン免疫染色像を示す図である。
図 7は、実施例 1および比較例 1の三次元培養における 1 68時間およ び 504時間後の細胞数の変化を示す図である。
図 8実施例 2および比較例 2の三次元培養における 1 68時間および 5 04時間後の細胞数の変化を示す図。
図 9は、実施例 3および比較例 3の三次元培養における 1 68時間およ び 504時間後の細胞数の変化を示す図である。 図 10は、コラーゲン濃度の異なるコラーゲンゲルにおける軟骨細胞の 培養状態を示す図（（a)〜（c))である。
図 11は、コラーゲン濃度に対する GAG産生量を示す図である。
図 12は、コラーゲン濃度に対して所定の円形度を有する軟骨細胞数 比率を示す図である。
図 13は、 円形度の分布を示すヒストグラムを示す図 （（a)、 （b))であ る。
図 14は、実施例 6におけるコラーゲンゲル層の保存工程を示す図であ る。
図 15は、各保存条件で保存したコラーゲンゲル面での円形細胞率を 示すグラフである。
図 16は、各保存条件下におけるコラーゲンゲルにおけるコラーゲンの 状態を示す電子顕微鏡写真である。
なお、以上の図面において、 10は細胞観察装置を示し、 11は支持台 を示し、 13は LEDランプを示し、 15は CCDカメラを示し、 16は三次元ス テージを示し、 17はインキュベータを示し、 19は制御装置を示し、 20は 培養容器を示している。 発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の各種形態について詳細に説明する。
本発明の培養容器は、未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含 有するコラーゲン層を備えている。この培養容器によれば、このコラーゲン 層をゲル化して得たコラーゲンゲル層は、軟骨細胞を平面培養した場合 であっても、軟骨細胞の形質を維持した状態のまま、細胞増殖させること ができる。また、潜在的に軟骨細胞の形質を有した細胞であるか否かを 容易に判定することができる。また、このコラーゲン層をゲル化したときには、 繊維状態のコラーゲンによるネットワーク構造を有するコラーゲンゲル層を 形成することができる。
さらに、このコラーゲン層を不活性ガスを主体とする不活性ガス雰囲気 下で保存することにより、その後のゲル化によりコラーゲンの繊維状体の ネットワーク構造を形成させることができ、保存後においても軟骨細胞の 形質を維持しまたは潜在的な軟骨細胞における軟骨細胞の形質を顕 在化させる培養状態を提供できるものとなっている。
以下、本発明の培養容器について説明するとともに、培養容器の製 造方法、本発明の培養容器を用いた軟骨細胞の培養方法、その評価 方法等について説明する。
(培養容器）
本発明の培養容器としては、特に限定しないで従来公知の各種の培 養容器を用いることができる。本発明においてはコラーゲン層を形成する のに適した平面または曲面の面を培養面相当部位として備えていること が好ましい。このような培養容器としては、各種の平面培養用（単層培養 用）容器を挙げることができ、具体的には、 T型フラスコ、角型フラスコ、 τ D型フラスコ、シャーレ等を挙げることができる。培養表面の材質も限定し ないで用レヽることができる。本培養容器は軟骨細胞の増殖に好ましく用■ いられるため、軟骨細胞を培養するのに用いられる培養容器であることが 好ましい。
コラーゲン層を形成する培養容器の部位は、培養液および培養細胞 と接触する培養容器内の表面とすることができるが、培養キヤビティの底 面を構成する部位であることが好ましい。
本培養容器は、表面に未架橋または低架橋状態のコラーゲンを有す るコラーゲン層を有している。表面に未架橋または低架橋の状態のコラー ゲン層を有することにより、培養細胞、特に軟骨細胞の分化を維持して、 すなわち、脱分化を抑制して細胞増殖させることができる。
未架橋または低架橋の状態のコラーゲンとは、 コラーゲン構成分子 ( α鎖など）が互いに架橋しないかあるいは低い架橋度で含まれている状 態を意味している。 したがって、未架橋または低架橋状態のコラーゲンと は、架橋しないで存在するコラーゲン構成分子を含んでいる。なお、コラ 一ゲンの架橋状態は、その構成分子が紫外線などの電子線のほか熱や 各種の架橋剤によって相互に架橋することによって形成される。
このような未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含むコラーゲン層 は、架橋反応を伴わないコラーゲン層形成工程あるいは架橋程度を制 限した架橋反応を伴ったコラーゲン層形成工程を実施することによって 得ることができる。ここで架橋反応を伴わないコラーゲン層の形成工程と は、物理的架橋あるいは化学的架橋のいずれの架橋反応も行わないこ とに加えて、意図しない架橋を回避するため、一連の操作において紫外 線等への曝露を回避することも含めることができる。 また、架橋程度を制 限した架橋反応を伴ったコラーゲン層形成工程とは、未架橋のコラーゲ ン構成分子を残存可能に電子線照射量や架橋剤添加量を調整して架 橋反応を行なうことによって実施することができる。なお、架橋させる場合 には、架橋はコラーゲン溶液の乾燥前、乾燥中および乾燥後のいずれで あってもよレヽ。
コラーゲン層におけるコラーゲンが本発明において有効な未架橋また は低架橋の状態であるとき、すなわち、培養細胞の形質を維持して培養 可能とする有効量の未架橋のコラーゲン構成分子が残留しているときに は、軟骨細胞や軟骨細胞に由来する線維芽細胞様の細胞の良好な培 養状態を形成することができる。例えば、ポリスチレン面を有する通常の 培養容器で脱分化したように観察される軟骨細胞由来の線維芽様細 胞であってコラーゲンゲル包理培養にて軟骨細胞の形質を取り戻すこと のできる細胞を、 当該コラーゲン層をゲル化して得たコラーゲンゲル層表 面において培養したとき、好ましくはその細胞数の 50 %以上が球形状の 形態として観察可能となっている。例えば、上記軟骨細胞由来の線維 芽様細胞につき、コラーゲンゲル包理培養とコラーゲンゲル層表面にお ける培養とを並行して行なうことにより、軟骨細胞の形質を取り戻した細 胞とコラーゲンゲル層表面で球形状の形態で観察可能となる細胞との関 係を知ることができる。なお、球形状を呈する細胞数の比率は、より好まし くは 80 %以上、さらに好ましくは約 1 00 %である。なお、球形状の形態を 有しているか否かは、後述するように細胞の円形度に基づいて判断する ことができる。
以上のことから、本発明の培養容器によれば、コラーゲンが未架橋ま たは低架橋であるために、軟骨細胞の分化状態を維持して培養可能又 は潜在的な分化能を顕在化させることができるものとなっており、この結 果、潜在的な分化能を有しているか否かを判断可能となっていると考え られる。本発明の培養容器のコラーゲン層をゲル化すると、コラーゲンが 未架橋または低架橋であるにもかかわらず繊維化が進み繊維状体のコラ 一ゲンによるネットワーク構造が形成されることがわかっている（実施例 6 参照）。本発明を拘束するものではないが、こうした未架橋または低架橋 コラーゲンによるネットワーク構造が培養細胞の分化能を顕在化等させる ことができると推測される。
コラーゲン層は、培養時に培養液等の水分により培養表面に均一な コラーゲンゲル層を形成できる程度に形成されていればよいが、好ましく は、コラーゲン層は培養表面の全体を均一に被覆する。コラーゲン層の 厚みは特に限定しないが、培養容器下方からの観察を妨げない程度の 厚さとすることが好ましい。
コラーゲン層を形成するコラーゲンとしては、特に限定しないで入手ある いは調製可能なコラーゲンを用いることができる。例えば、酸可溶性コラ —ゲン、 中性塩可溶性コラーゲン、ァテロコラーゲンなどの酵素可溶化コ ラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲンおよびこれらのコラーゲンに対してスク シニル化、ァシル化、メチル化などの化学修飾をした化学修飾コラーゲン を用いることができる。また， コラーゲンのモチーフを有する合成ペプチド (人工コラーゲン）を用いることができる。好ましくは、酸可溶性コラーゲン や、ァテロコラーゲンなどの酵素可溶化コラーゲンを用いる。酸可溶性コ ラーゲンは、コラーゲン層を作製する操作の容易性から、酵素可溶化コラ 一ゲンは安全性の観点からそれぞれ好ましい。また、コラーゲン層を構成 するコラーゲンの種類は特に限定しないで、 I型、 II型、 III型、 IVおよび V 型等を単独であるいは 2種以上を組み合わせて用いることができる。この うち、 I型コラーゲンは、脱分化した軟骨細胞が分泌するコラーゲンであり、 II 型コラーゲンは分化を維持した軟骨細胞が分泌するコラーゲンである 力 好ましくは I型コラーゲンを用いる。 I型コラーゲンであると分化維持だ けでなく、十分な細胞増殖能を得ることができるからである。また、プロテ ァーゼやペプシン等の酵素で処理したァテロコラーゲンを用いることが好 ましい。また、コラーゲン層を形成する操作を考慮すると酸性コラーゲンを 用いることが好ましい。コラーゲン層は表面 l c m2あたり 0 . 5 m g以上のコ ラーゲンを有することが好ましい。コラーゲン濃度が 0 . Smg/ cm2未満で あると、平面培養等の二次元培養では軟骨細胞の形質（特に、細胞形 態などの外形上の形質や II 型コラーゲン産生能、グリコサミノダリカン産 生能）を維持することが困難となるからである。一方、 0. SmgZ cm2以上 であると、通常の平面培養によって軟骨細胞の外形的形質を提示しなく なった軟骨細胞であってもその外形的形質を提示させて培養することが できる。コラーゲン濃度は、好ましくは、 l mg Z cm 2以上である。また、軟 骨細胞の形質維持の観点からは、コラーゲン濃度を高くすることが好まし いが、コラーゲン濃度を高くし過ぎるとコラーゲン層の作製が困難になつ たり、細胞の増殖率が低くなつたりする可能性も考えられるため、予め予 備実験などを行った上でコラーゲン濃度を設定することが好ましい。
なお、こうした未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを有するコラー ゲン層は、例えば、コラーゲン溶液を培養面に対して供給した後、ゲル化 させないであるいはゲル化させた後、架橋させることなくあるいは架撟を抑 制して水分を留去し乾燥することによって得ることができる。なお、コラー ゲン溶液は未架橋あるいは低架橋を維持するためにゲル化させることなく 乾燥することが好ましい。
培養容器の培養表面にコラーゲン層を有する培養容器の作製工程 を図 1に例示する。 図 1に示すように、表面が 0. 5mgZcm2以上の濃度 のコラーゲン濃度となるように、所定の濃度に調製されたコラーゲン溶液 を培養容器底面に供給し敷設する。このときのコラーゲン溶液の必要量 は、必要とするコラーゲン溶液量を V (ml)、コラーゲン塗布面を A (cm2)、 目的とするコラーゲン塗布濃度を CCL(mgZcm2)、敷設するコラーゲン 溶液の濃度を Cliquid(wt%)とし、 目的とするコラーゲン塗布量 W(g)と必 要とするコラーゲン溶液量 V (ml)がほぼ同じと考えて算出した。 具体的 には、 W = Vと、 WX Cliquid = AXCcし X 10— 3力 ら¥= (AX CCLX 10"3)
Figure imgf000014_0001
出すればよい。
乾燥方法についても特に限定しない。例えば、敷設後、室温で数日 間風乾し、最後に減圧乾燥機によって完全に水分を飛ばして乾燥させ ることによってコラーゲン層（乾燥体）を得ることができる。こうすることで、 培養表面に対して設定した濃度のコラーゲン層を備える培養容器を得る ことができる。なお、風乾は必ずしも必要でないが、風乾を行う場合の風 乾を行う期間に関しては、コラーゲン濃度により異なり、濃度が高いほど 風乾実施期間を長くすることが好ましい。また、急速に乾燥処理を行うと スポンジ化してしまうため、徐乾、すなわち時間をかけて風乾することによ つてスポンジ化を防いでいる。なお、これらの一連の工程においては、コラ 一ゲンの架橋を回避するため光や熱を遮断して実施される。
なお、コラーゲン層は、コラーゲンのみで構成することもできるが、本発明 の目 的を妨げない範囲で他の成分を含めることができる。例えば、生体 適合性のある高分子や、生体内吸収高分子、生体分解性高分子等を 含めることも可能である。具体的には、ヒアルロン酸、キチン、キトサンゃム コ多糖のような糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の合成高分子、ポリメ タクリル酸ヒドロキシェチルなどの高含水高分子、フイブリンやアルブミン 等のタンパク質を混合することができる。
本培養容器によれば、コラーゲン層に液体を供給することで軟骨細胞 などの培養細胞の培養に適したコラーゲンゲル層を形成することができる。 このコラーゲンゲル層は、既に説明したように、未架橋または低架橋なが ら繊維状体のコラーゲンによるネットワーク構造を有している。なお、前記 コラーゲン層がゲル化して形成されたコラーゲンゲル層を備える培養容器 も本発明の一形態に含まれる。コラーゲン層から、コラーゲンゲル層を形 成するには、後段にて詳述するが、 P B Sなど中性の緩衝液などをコラー ゲン層に供給して水の存在下コラーゲン層を中性状態とすることでコラー ゲンをゲル化できる。コラーゲン層は、ゲル化するまで保存することもできる。 保存する場合には、好ましくは、不活性ガスを主体とする不活性ガス雰 囲気下で保存する。不活性ガスとは、例えば、窒素、アルゴン、ヘリウム 及びこれらの混合気体が挙げられるが、好ましくは窒素である。また、不 活性ガスを主体とするとは、 不活性ガスを 50 %以上含有していることが 好ましい。より好ましくは、 70 %以上であり、さらに好ましくは 80 %以上で あり、一層好ましくは 90 %以上である。
空気若しくは酸素の存在下で保存すると、ゲル化してもコラーゲンの 繊維状体によるネットワーク構造を形成しにくくなるか又は形成できなくな る。 こうした繊維化の抑制は、架橋の進行によるものと推測される。こうし たコラーゲンゲル層においては、軟骨細胞の分化能を維持した状態の培 養が困難になるとともに潜在的分化能を顕在化することができにくくなる 傾向がある。
好ましいコラーゲン層の保存工程についての保存期間及び温度は特 に限定しない。数日から 1週間、若しくは数週間程度とすることができる。 温度は、一般的には 20〜30 °C程度とすることができる。保存するガス雰 囲気は、 乾燥された、例えば、 1 0 % R . H . 以下の湿度であることが好ま しい。より好ましくは、 5 % R . H . 以下である。保存工程における水分は、 意図しないコラーゲンの架橋を促進して繊維化を抑制する可能性がある からである。
また、保存工程では、乾燥工程と同様に遮光することが好ましい。 光 は架橋を促進するおそれがあるからである。
(人工移植物）
本発明によれば、未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有する コラーゲン層を備えた人工移植物も提供される。ここでいうコラーゲン層は、 上記した本発明の培養容器におけるコラーゲン層と同義であり、また、コ ラーゲン層を構成するコラーゲンは、上記培養容器のコラーゲン層を構 成するコラーゲンと同義である。人工移植物が備えるコラーゲン層は、液 体を供給して所定のゲル化条件を与えるとゲル化してコラーゲンゲルとな る。 なお、コラーゲン層がゲル化したコラーゲンゲル層を備える人工移植 物も本発明の一形態に含まれる。
人工移植物において、コラーゲン層またはコラーゲンゲル層は、培養 表面に対応して備えられていることが好ましい。また、コラーゲン層または コラーゲンゲル層の表面は一様な平坦面を構成していてもよいが、半球 形状、柱形状、球形状、錐形状、方体形状などの種々の形状を採ること ができる。また、 人工移植物の三次元形態は、代替しょうとする身体部 位の外形形態（例えば、人工骨、人工関節、人工半月板など）を備える ことができる他、例えば、シート状、柱形状、球形状、錐形状、直方体状 とすることができる。人工移植物は、例えば、金属材料、セラミック材料、 合成樹脂材料、生体由来材料などで構成することができる。好ましくは、 生体適合性ないし生体内分解性に優れる材料を用いる。
この人工移植物によれば、生体外においてそのコラーゲンゲル層表面 にて軟骨細胞を増殖させるとき、軟骨細胞の形質を維持させることができ る。このため、人工移植物の表面に分化状態を維持した軟骨細胞層を 容易に形成させることができる。この結果、生体内への移植後の生体親 和性を向上させることができる。すなわち、この実施形態によれば、軟骨 細胞層を表面に備えて表面改質された人工移植物あるいは表面改質さ れた人工移植物の製造方法（人工移植物の表面改質方法）も提供さ れる。
(軟骨細胞培養方法）
本発明の軟骨細胞培養方法は、未架橋又は低架橋状態のコラーゲ ンを含有するコラーゲンゲル層表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、 該ゲル表面上で軟骨細胞を増殖させる培養工程と、を具備している。コ ラーゲンゲル層を構成するコラーゲンとしては、上記したコラーゲン層に使 用できるコラーゲンを同様に用いることができ、上記したコラーゲン層に好 ましく用いられるコラーゲンを同様に好ましく用いることができる。
コラーゲンゲル層は、コラーゲンに液体（典型的には培養液、水、緩衝 液等）を加えて、コラーゲンの種類等に応じた温度、濃度、 p H、塩濃度 等のいずれかあるいはこれらの組み合わせからなるゲル化条件によりゲル ィ匕させることにより得ることができる。また、コラーゲンゲル層は、上記したコ ラーゲン層に液体を供給して必要なゲル化条件を付与することによって ゲル化することによつても得ることができる。 したがって、播種工程に先立 つて、培養容器あるいは人工移植物の表面にコラーゲンの溶液を供給し て、架橋させることなく乾燥してコラーゲン層を形成し、その後このコラー ゲン層に液体を供給してコラーゲンゲル層を作製することができる。また、 培養表面に上記コラーゲン層を予め備える培養容器あるいは人工移植 物に液体を供給してそのコラーゲン層をゲル化してコラーゲンゲル層を作 製することもできる。
本培養方法は、コラーゲンゲル層表面において軟骨細胞を培養する ものである。このため、コラーゲンゲル層の表面形態にもよるが、基本的に は平面ないし曲面における二次元での培養形態となる。したがって、いわ ゆるコラーゲンゲル包理培養などの三次元培養とは異なり、培養細胞の 形態観察を容易に行うことができるとともに、 良好な細胞増殖率を得るこ ともできる。細胞観察の容易さ等の観点からは好ましくは平面培養であ る。
本培養方法によれば、表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲ ンを有するコラーゲンゲル層表面にて軟骨細胞を培養することで、軟骨 細胞がその形質を維持していることの指標である GAG (グリコサミノグリカ ン）や Π 型コラーゲン産生能はもとより、外形上での指標となる球形の細 胞形態（投影像では円形の細胞形態）を提示させながら増殖させること ができる。 したがって、軟骨細胞の培養方法に好ましく、特に継代培養に よる培養方法に好ましい。また、本培養方法によれば、従来の二次元培 養により本来的には軟骨細胞の形質を維持しながらも外観上はその特 有の球状の細胞形態を喪失してしまった軟骨細胞（少なくとも外形的に は潜在的軟骨細胞といえる。）を、その外形的形質を再び提示させなが ら増殖させることができる。 (軟骨細胞評価方法）
本発明の軟骨細胞評価方法は、表面に低架橋状態のコラーゲンを 含有するコラーゲンゲル層表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、該 ゲル表面で軟骨細胞を増殖させる培養工程と、該ゲル表面の個々の細 胞形状に基づいて分化の状態を評価する評価工程を具備している。本 評価方法は、上記培養方法における播種工程と培養工程とを備えてお り、これらに評価工程を備えている。 以下、本評価方法について特徴的 である評価工程について説明する。
本評価方法においては、前記評価ェ程は細胞の円形度に基づいて 軟骨細胞を評価することが好ましい。細胞の円形度は、軟骨細胞が球 形形状を有しているか否かの有効な指標だからである。細胞の円形度は、 個々の細胞のアスペクト比等から算出することもできるが、個々の細胞の 投影像周長を投影面積円相当周で除算した値であることが好ましい。こ こで、投影像周長とは、細胞の投影像の周囲の長さを意味し、投影面 積円相当周とは、細胞の投影像の面積に相当する正円の円周を意味 している。細胞の投影像周長と投影面積円相当周とは、コラーゲンゲル 表面で培養されている軟骨細胞の投影像を C C Dカメラなどの撮像機器 で撮像し、 さらに、この撮影像からあるいは撮影像に対して画像処理を 加えることで容易に得ることができる。なお、特開平 08— 28 7 26 1号には、 個々の細胞の形状を認識するシステムおよび細胞の円形度の概念が記 載されている。
さらに、 円形度を用いた軟骨細胞の分化状態の評価にあたっては、 円形度が所定の閾値以上であるときに軟骨細胞の形質を維持している と判定することが好ましい。ここでいう所定の閾値とは、軟骨細胞が形質 を維持していると判定することができる円形度をいい、 C C Dカメラなどの 撮像機器の解像度や画像処理のフローに基づいて設定することができ、 予め実施した予備実験に基づいて設定することが好ましい。例えば、 円 形度が 0. 8以上であるときに軟骨細胞の形質を維持していると判定する ことが好ましい。 円形度判定の閾値を 0. 8未満とすると、軟骨細胞の特 徴的な産生物質である II 型コラーゲンを生成しない細胞が含まれること になるため、好ましくない。 0. 8以上とすると、特に、上記した投影像周長 投影面積円相当周を円形度とするときにおいて、高い精度で軟骨細 胞の分化状態（軟骨細胞様形質を維持しているか否力 ）を判定すること ができる。より好ましくは 0. 9以上である。
さらに、細胞円形度が一定以上の細胞数の測定した全細胞数に対 する割合（％)を評価することもできる。細胞円形度は、例えば、 0. 8以上 とすることができ、好ましくは 0. 9以上である。こうした一定以上の円形度 を有する細胞数の割合を指標とすることで、軟骨細胞の培養状態の良 好性やコラーゲンゲル層の特性等を容易に把握することができる。
なお、細胞の投影像を得るには、例えば、図 2に示す細胞観察装置を 使用することができる。この細胞観察装置 10は、培養容器 20を支持す る支持台 11と、培養容器 20を照らし出す LEDランプ 13と、培養容器 20 の底面を撮影する CCDカメラ 15と、これらを内包し所定温度を維持する インキュベータ 17と、 CCDカメラ 15によって撮影した画像を解析する制 御装置 19とを備えている。支持台 11は、軟骨細胞が底面に接着してい る培養容器 20を、その底面が下方に視覚的に露出した状態で支持して いる。即ち、支持台 11は、培養容器 20の底面縁部のみを支持したり、 培養容器 20の底面部分に相当する箇所を透明部材としたりすることで、 CCDカメラ 15による撮影が妨げられないように構成されている。 LEDラン プ 13は、支持台 11に支持された培養容器 20を上方から照らすことによ り培養容器 20内の個々の細胞を培養容器 20の底面に投影させる。 CC Dカメラ 15は、培養容器 20の底面を撮影できるように培養容器 20の下 方に設置されている。この CCDカメラ 15は、制御装置 19からの指令信 号を受信すると、 LEDランプ 13によって上方から照らされた培養容器 20 の下方から底面を撮影し、培養容器 20内の個々の細胞が培養容器 20 の底面に投影された投影画像を得て、その投影画像のデータを制御装 置 19に送信する。また、 CCDカメラ 15は、三次元ステージ 16に取り付け られ、上下 ·左右 '前後に移動可能である。この三次元ステージ 16は制 御装置 19からの指令信号によって作動して所定の位置に CCDカメラ 15 を位置決めする。インキュベータ 17は、支持台 11と LEDランプ 13と CCD カメラ 15とを内包した温度調節が可能なケースであり、 5%C02含有エア を支持台 11に支持されている培養容器 20に供給するラインと培養容器 20からガスを排出するラインとを備えている。制御装置 19は、周知の CP U、 ROM、 RAM等で構成されている。この制御装置 19は、三次元ステ ージ 16に指令信号を出力して CCDカメラ 15を所定の位置に位置決め したあと、 CCDカメラ 15に指令信号を出力して投影画像を撮影させ、そ の投影画像を CCDカメラ 15から入力して画像解析処理を施し、画像解 析処理後の投影画像に基づいて上記円形度や細胞濃度等を算出す る。
また、画像処理に関しては、例えば以下のようにして処理することがで きる。 細胞観察装置 10の制御装置 19は、培養容器 20の底面の投影 画像を二値化したあとクロージング処理ゃフィリングホール処理を施すこ とにより個々の細胞像を明確化することができる。ここで、二値化とは、あ る閾値以下のグレイレベル値をもつピクセルを値 1に設定しそれ以外のピ クセルを値 0に設定して画像を白と黒の 2つの領域に区画分離する処理 である。 二値化後、所定の大きさ以上の黒色体を細胞とみなし、その黒 色体についてクロージング処理により小さな穴を埋めて境界の平滑化を 行い、更にフィリングホール処理により孤立した穴を埋めることにより細胞 像とする。
本評価方法によれば、コラーゲンゲル層表面で培養している軟骨細 胞の個々の細胞形状を容易に把握できるため、軟骨細胞の評価に適し ているといえ、また、 良好な増殖状態が得られ、継代も可能であることから 継続的な観察に基づく評価も容易に行うことができる。軟骨細胞が形質 を維持している場合には略球形状を維持していることが知られているが、 本評価方法においては、軟骨細胞の細胞形状の観察が容易であるため、 軟骨細胞がその形質を維持しているかどうかを容易に評価できる。
また、本評価方法によれば、表面に低架橋状態のコラーゲンを有する コラーゲンゲル層の当該表面にて軟骨細胞を培養することで、軟骨細胞 がその形質を維持していることの外観上での指標となる球形の細胞形態 (投影像では円形の細胞形態）を提示させながら増殖させることができる。 したがって、軟骨細胞の分化状態を高い精度で評価することができる。 また、本評価方法によれば、通常の平面培養などの二次元培養にお ける潜在的軟骨細胞を培養することで、軟骨細胞特有の球状細胞形態 を提示させることができる。すなわち、通常の培養容器のポリスチレンなど からなる培養面などのコラーゲンゲル層を有しない面で培養した球形状 を呈していない細胞であっても、 当該細胞が軟骨細胞の形質を潜在的 に保持しているかどうかを判定することができる。 したがって、本評価方法 によれば、線維芽様形態を呈している細胞が潜在的軟骨細胞かあるレヽ は完全に軟骨細胞から脱分化した細胞かを、コラーゲンゲル層表面に 播種前の細胞の培養履歴にかかわらず、容易に判定することができる。 従来、このような判定は、三次元培養しないと行なうことができなかった。 三次元培養は操作も煩雑でありしかも増殖速度が遅いため、上記のよう な分化状態の判断を速やかにしかも正確に判断することが困難であった。 しかしながら、本評価方法によれば、三次元培養をすることなく、速やか にかつ精度よく軟骨細胞、特に潜在的軟骨細胞の分化状態を判断す ることができる。なお、本明細書における潜在的軟骨細胞とは、ポリスチレ ンなどの通常の培養面では線維芽様の形態を呈している軟骨細胞であ つて、三次元培養へ移行した後には、高い確率で球形状の軟骨細胞へ の分化が期待できる又は分化する軟骨細胞をいう。
(軟骨細胞の三次元培養体の生産方法）
本生産方法は、表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含 有するコラーゲンゲル層の該表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、 該コラーゲンゲル層表面で軟骨細胞を増殖させる二次元培養工程と、 前記培養工程において増殖された軟骨細胞を用いて三次元培養を実 施する三次元培養工程とを備えている。この生産方法によれば、二次元 培養工程において、培養される軟骨細胞の脱分化が抑制され十分な増 殖率で軟骨細胞が培養されるため、効率的に三次元培養体を得ること ができる。また、 二次元培養工程では、軟骨細胞がその分化状態を維 持しているか否かをその細胞形態から容易に判断できるため、確実に軟 骨細胞を増殖させることができる。 二次元培養工程では、継代培養を行 なっても十分な分化状態と増殖率とが維持されるため、継代培養とする ことが好ましい。
また、前記二次元培養工程の後、あるいは前記二次元培養工程に 伴って前記評価工程を実施して、軟骨細胞の形質を維持していると判 断された軟骨細胞を用いて三次元培養工程を実施することもできる。こう することで確実に軟骨細胞の三次元培養体を得ることができる。なお、三 次元培養工程における三次元培養とは、例えば、コラーゲンスポンジなど の任意形状を有する足場材料での培養や、任意形状を有しないコラー ゲンゲルゃァガロースゲルでの包理培養などを挙げることができる。以上 のこと力 ら、本発明によれば、これらの生産方法によって得られる三次元 培養体も提供される。
以上説明したように、本発明では、軟骨細胞の形質維持や潜在的軟 骨細胞の評価という本来三次元培養でのみ可能であったことを二次元 培養空間で行うことを可能とした。すなわち、本発明の二次元培養空間 は、擬似三次元培養空間を構成しているということができる。 実施例
以下、本発明の具体例を、実施例を挙げて説明するが、本発明は以 下の実施例に限定されるものではない。
(実施例：!〜 3)
(培養容器の作製）
培養容器として、 25cm2の T型フラスコを使用し、コラーゲン層を有す る培養容器を作製した。培養容器底面（培養面）に、 0. 5wt%の酸性 I 型コラーゲン溶液（高研株式会社製）を 5. 25mlを注いで塗布し、この培 養容器をアルミホイルで包み、室温で 3日 間風乾した後、減圧乾燥装置 にて lOPa力、ら lOOPa常温で約二日 間乾燥し、コラーゲン濃度が CCL =
1. 05mgZcm2の未架橋の状態のコラーゲンを有するコラーゲン層を備 える培養容器を作製した。
(二次元培養）
作製した培養容器のコラーゲン層を PBSで 2回洗浄した後、ゥシ胎児 血清含有 DMEM培地を用いてポリスチレン製培養容器にて 3回継代し たゥサギ軟骨細胞を 1. OX lC^cellsZcm2の濃度となるように播種し、 3 7°C、 5%じ02で培養した。なお、培養液を培養容器のコラーゲン層に供 給することにより、コラーゲン層は膨潤しゲル化してコラーゲンゲル層となり、 その表面にゥサギ軟骨細胞が存在する状態となった。継代実験に対して は、初代細胞からコラーゲン層上で上記と同様の条件で培養を行い、 7 0 %コンフルェント状態を目安に 3回継代および 5回継代した上、コラーゲ ンゲル包埋による三次元培養を行った。 なお、二次元培養の段階で、 3 回継代したものを実施例 1とし、 5回継代したものを実施例 2とした。
(三次元培養）
コラーゲンゲル包埋による三次元培養は、実施例 1および 2として得ら れた培養細胞を用いて調製した 2.5 X 106cellsZmlの細胞密度の細 胞懸濁液と 3wt%ァテロコラーゲン溶液とを 1:4の体積比で混合（混合 後のコラーゲン濃度：0. 4wt%)し、この混合液を 48穴プレートに 220 μ ΐ ずつドーム状に播種した（5 X 105cells/ml)。このときの厚さはおよそ 2 mmであった。軟骨細胞播種後、 37°Cで 1時間静置することでゲル化さ せ、その後液体培地を加えて、 37°C、 5%C02で三次元培養を行い、実 施例 1および 2の三次元培養体を得た。さらに、実施例 1については播種 密度を 2X lC^cells/mlとして播種して同様に三次元培養を行って、 実施例 3の三次元培養体を得た。
なお、ポリスチレン上にて培養する以外は実施例と同様にして二次元 培養にて 3回継代および 5回継代したゥサギ軟骨細胞を用いてコラーゲ ンゲル包埋による三次元培養を行い、比較例 1〜3の三次元培養体を 得た。また、対照例として初代ゥサギ軟骨細胞を用いてコラーゲンゲル包 理による三次元培養を行った。 二次元培養の結果を図 3〜図 6に示し、 三次元培養の結果を図 7〜図 9に示す。
(結果）
図 3および図 4には、それぞれ実施例 1 (コラーゲンゲル層表面で二次 元培養した軟骨細胞）の SEM観察写真と比較例 1 (ポリスチレン面で二 次元培養した軟骨細胞）の SEM観察写真とを示す。 図 5および図 6には、 それぞれ実施例 1 (コラーゲンゲル層表面で二次元培養した軟骨細胞） の Π型コラーゲン免疫染色像および比較例 1 (ポリスチレン面で培養した 軟骨細胞）の II型コラーゲン免疫染色像を示す。図 3〜図 6から明らかな ように、コラーゲンゲル層表面で二次元培養した軟骨細胞は、軟質細胞 の形質維持の指標である球形状の細胞形態を維持しているとともに II 型コラーゲンを産生していることが観察できた。一方、ポリスチレン面で培 養した軟骨細胞は、偏平した線維芽様細胞形態を示し、軟骨細胞の産 生する細胞外マトリクスである I I 型コラーゲンをほとんど産生していなかつ た。以上のことから、未架橋状態のコラーゲンゲル層表面において軟骨 細胞を培養することにより、その脱分化を抑制し分化状態をよく維持して 増殖させ、継代培養することができることがわかった。
図 7〜図 9には、実施例 1〜3および比較例 1〜3および対照例の三次 元培養における 1 6 8時間および 504時間後の細胞数の変化を示す。ま た、このときの倍加時間を表 1に示す。倍加時間は 1 68時間および 504 時間後の細胞数から算出した。
表 1
Figure imgf000026_0001
<実施例および比較例の説明〉
，実施例 1 +比較例 1：二次元培養時に 3回継代
•実施例 2 +比較例 2：二次元培養時に 5回継代
•実施例 3 +比較例 3：二次元培養時に 3回継代、三次元培養時の接 種密度 2 X 106c ells /ml 図 7〜図 9および表 1から、コラーゲンゲル上で継代した軟骨細胞は、 コラーゲンゲル包理培養による三次元培養時においてポリスチレン上で 継代した細胞よりもよく増殖していた。また、二次元培養の形態にかかわ らず継代培養を重ねることによって脱分化し、コラーゲンゲルに包埋して 培養しても三次元培養組織内における増殖能が低下する傾向は認めら れたが、コラーゲンゲル上で継代培養した軟骨細胞では、初代細胞には 劣るものの十分な増殖能が得られていることが確認された。また、実施例 3および比較例 3(三次元培養時の接種密度を 2X lC^cells/mlとし た）において、コラーゲン上で継代した細胞の倍加時間は 5. 01〔 day〕で あつたのに対し、ポリスチレン上で継代した細胞の倍加時間は 19. 92[d ay〕であった。すなわち、高濃度に細胞を接種して三次元培養を行なつ た場合、実施例 3では顕著な細胞倍加時間の増大は見られず十分な増 殖能をもって増殖していたのに対し、比較例 3では顕著に細胞倍加時間 が増大しており細胞の増殖能の低下が明らかであった。
(実施例 4)
培養容器として、 25cm2の T型フラスコを使用し、コラーゲン層を有す る培養容器を作製した。培養容器底面（培養面）に、 0. 5wt%の酸性 I 型コラーゲン溶液（高研株式会社製）を 5. 25mlを注いて塗布し、この培 養容器をアルミホイルで包み、室温で 3日 間風乾した後、減圧乾燥装置 にて 10Pa力 ら lOOPa常温で約二 日 間乾燥し、コラーゲン濃度 (CCL) 力 a)5. 3 X 10_3mgZcm2、 (b) 1. 6 X 10一2 mg,cm2、 (c) 1. 05mg Zcm2の各濃度の未架橋の状態のコラーゲンを有するコラーゲン層を備 える培養容器を作製した。作製した培養容器のコラ一ゲン層を PBSで 2 回洗浄した後、ゥシ胎児血清含有 DMEM培地を用いてポリスチレン製 培養容器にて 2回継代したゥサギ軟骨細胞を 1. 0 X 104cells/cm2の 濃度となるように播種し、 37°C、 5%C02で培養した。これらの培養に伴 つて、異なるコラーゲン濃度の培養面における軟骨細胞の細胞状態を観 察した。結果を図 10に示す。
図 10 (a)は、コラーゲンゲル濃度 CCLが 5. 3 X 10— 3mg/cm2、 同 (b)は 1. 6 X 10 2mgZcm2、 同（c)は、 1. 05mgZcm2の各培養表面 上にて軟骨細胞を 120時間培養したときの細胞画像を示す。 図 10から 明らかなように、コラーゲン濃度の希薄な（a)および（b)では細胞の形態 が線維芽様を示しているのに対し、 （c)においては軟骨細胞の形態は球 形を示している。後述するように軟骨細胞の平面培養における細胞円形 度は軟骨細胞の外形的形質の一つであって、軟骨細胞がその形質を 維持していることを示す指標である。したがって、所定濃度以上のコラー ゲン濃度のコラーゲンゲル表面における軟骨細胞の培養が軟骨細胞の 形質維持に有効であることがわかった。
(実施例 5)
実施例 4と同様にして、コラーゲン濃度（CCL)が 5. 3X 10— 4mg/cm 2、 5. 3 X 10"3mg/cm2 5. 3 X 10"2mg/cm 1 · 05mgZcm2の 4種 の濃度の未架橋の状態のコラーゲンを有するコラーゲン層を備える培養 容器を作製して、実施例 4と同様にゥサギ軟骨細胞を 1. OX 104cells/ cm2の濃度となるように播種し、 37°C、 5%〇02で培養した。これらの培養 に伴って、グリコサミノダリカン（GAG)生産速度、細胞円形度が 0. 9以 上の細胞比率およびコラーゲン濃度における円形度を測定した。結果を 図 11〜図 13に示す。
図 11はコラーゲンゲル濃度（CCL)に対する GAG産生量を示している。 詳しくは、培養 20— 31日 目の平均 GAG生成速度（V / v 0)を示している。 GAG生産速度は軟骨細胞形質保持の一つの指標とすることができる。 ここでは、ポリスチレン面で軟骨細胞を培養した場合の GAG産生量を V 。とし、各濃度での産生量 Vを無次元化している。 図 11から明らかなよう に、コラーゲン濃度が約 Olmg/cm2では v / v。が約 1であって、ポリ スチレン面での培養状態とほぼ同様の GAG産生量であるが、コラーゲン 濃度が 0. 5mg/cm2〜l. OmgZcm2近傍において GAG生産速度が 顕著に上昇していることがわかった。以上のことから、約 0. SmgZcm2以 上のコラーゲン濃度のコラーゲンゲル表面での軟骨細胞の培養がその形 質維持に有効であることがわかった。
図 12はコラーゲンゲル濃度（CCL)に対して所定の円形度を有する軟 骨細胞数比率を示している。ここでは、 円形度が 0. 9以上の細胞数を N r。undとし、総細胞数を Nallとした。 円形度の算出方法は後述する。 図 12 から明らかなように、コラーゲン濃度が低い場合には、 円形度 0· 9以上の 細胞数比率は極めて低く、 図 10 (a)に示す細胞形態観察結果を支持 したものとなっている。これに対し、約 0. Smg/cm2付近から当該細胞数 比率の上昇が顕著となり、約 lmgZcm2においては当該細胞数比率が ほぼ 1となっており、 図 10 (c)に示す細胞形態観察結果をよく支持する 結果であった。
図 13は、コラーゲン濃度に対する円形度の分布を示すヒストグラムであ る図 13 (a)は、ポリスチレン面で同様にしてゥサギ軟骨細胞を培養した場 合の結果であり、図 13(b)は、コラーゲン濃度が 1. 05gZcm2の培養面 での結果である。 同世代の細胞なので、そのヒストグラムは同じ傾向が示 されるはずであるが、 図 13に示すように、高濃度コラーゲンゲル上でイン キュペートした細胞の方が円形度の値の高いもの（軟骨細胞の形質を維 持した細胞）が多く観察された。これらの細胞は、コラーゲンゲル包埋三 次元培養に移行した後も軟骨細胞の形質を維持したまま増殖する細胞 と考えられた。
(実施例 6)
本実施例は、コラーゲン層の保存工程と軟骨細胞の培養との関係と を確認したものである。本実施例では、 図 14に示すように、コラーゲン層 を形成した後、保存工程を実施し、その後コラーゲン層をゲル化してコラ 一ゲンゲル層を形成して軟骨細胞を播種した。
コラーゲン層は、コラーゲン濃度が 1. 05mgZcm2となるように、メスピ ペットで 0. 5wt%酸性コラーゲン溶液（高研株式会社製）を 5. 25mlを T フラスコ（25ml)底面に注いだ後、遮光された減圧乾燥装置にて lOPa 力、ら lOOPa下、約 25°Cで約 3日 間乾燥し、コラーゲン層を形成した。そ の後、直ちに PBSを加えてゲル化するほか、 4日 間及び 7日 間それぞれ 空気雰囲気下及び窒素雰囲気下で保存工程を実施し、その後に同様 にゲル化を行った。保存工程は、いずれも、遮光した状態で、 10%R. H. 以下、 25°Cで行った。各コラーゲンゲル層調製後は、速やかにコラーゲン 層を PBSで 2回洗浄した後、ゥシ胎児血清含有 DMEM培地を用いてポ リスチレン製培養容器にて 3回継代したゥサギ軟骨細胞を 1. OX 104cel lsZcm2の濃度となるように播種し、 37°C、 5%C02で培養した。適宜、 円形度が 0. 9以上の細胞数を測定し測定した全細胞数に対する割合 を求めた。なお、細胞数の測定及び円形度の測定については、先の実 施例と同様に行った。対称例としてコラーゲン層及びコラーゲンゲル層を 有しないポリスチレン製の Tフラスコについて保存工程なしで同様の操作 を行った。結果を図 15に示す。
図 15に示すように、保存工程を実施せずにコラーゲン層をゲル化した 場合において最も良好な円形細胞率を示し、対照例において最も低い 円形細胞率を示した。また、窒素雰囲気下で保存したコラーゲン層由来 のコラーゲンゲル層が空気雰囲気下で保存したコラーゲン層に由来する コラーゲンゲル層よりも良好な円形細胞率を示していた。
以上の結果から、コラーゲン層をコラーゲンゲル層の形成に先立って保 存する場合には、酸素などが排除され窒素など不活性ガスを主体とする 不活性ガス雰囲気下で保存することが好ましいことがわかった。
さらに、コラーゲン層について保存工程を実施しなかったコラーゲンゲ ル層（a )、酸素雰囲気下で 4日 間保存工程を実施して得たコラーゲンゲ ル層（b )及び窒素雰囲気下で 4日 間保存工程を実施して得たコラーゲ ンゲル層（c )の各ゲル層表面の電子顕微鏡写真を図 1 6に示す。
図 1 6に示すように、 （a )及び（c )のコラーゲンゲル層では、複数本のフ イラメントが撚れて形成された繊維状体がネットワーク構造を形成したの に対し、 （b )のコラーゲンゲル層では、フィラメント様のものが観察されるも のの、ネットワーク構造ではなく平坦で空孔のない表面が形成されてい た。
以上のことから、酸素雰囲気下でコラーゲン層を保存することにより、 ゲル化して得られるコラーゲンゲル層はもはや適度な空孔を有するネット ワーク構造を形成できず、このような構造の相違が円形細胞率の差、す なわち、軟骨細胞の分化能維持及び潜在的分化能の保持を困難にし ていると考えられた。
なお、空気及び窒素雰囲気下のそれぞれについて、 7日 間保存して 得たコラーゲンゲル層も併せて観察したが、それぞれ 4日 間保存したもの と同様の構造を示していた。

Claims

請求の範囲
1. 未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲン層を備 える、培養容器。
2. 前記コラーゲン層は前記表面 lcm2あたり 0. 5mg以上のコラーゲンを 含有する、培養容器。
3. 前記コラーゲン層は I型コラーゲンを含む、請求項 1または 2に記載の 培養容器。
4. 軟骨細胞を培養するための培養容器である、請求項 1〜3のいずれ かに記載の培養容器。
5. 二次元培養用である、請求項 1〜4のいずれかに記載の培養容器。
6. 前記コラーゲン層は乾燥している、請求項 1〜5のいずれかに記載の 培養容器。
7. 前記コラーゲン層は、コラーゲンがゲル化する条件が付与されるときコ ラーゲンの繊維状体によるネットワーク構造を形成する、請求項 1〜6の いずれかに記載の培養容器。
8. 未架橋又は低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲンゲル層 を備える、培養容器。
9. 前記コラーゲンゲル層は、コラーゲンの繊維状体によるネットワーク構 造を有している、請求項 8に記載の培養容器。
10. 前記コラーゲンゲル層は、未架橋又は低架橋の状態のコラーゲンを 含有するコラーゲン層が不活性ガスを主体とする不活性ガス雰囲気下で 保存された後にゲル化されて得られる、請求項 8又は 9に記載の培養容 on
11. 培養容器の製造方法であって、培養容器にコラーゲンを含有するコ ラーゲン溶液を完全に架橋させることなく乾燥させて培養容器にコラーゲ ン層を形成する工程を備える、製造方法。
12. 前記コラーゲン層を不活性ガスを主体とする不活性ガス雰囲気下 で保存する工程を備える、請求項 11に記載の製造方法。
13. 前記コラーゲン層をゲル化させる工程を備える、請求項 11又は 12 に記載の製造方法。
14. 軟骨細胞の培養方法であって、
表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲン ゲル層の該表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、
該表面上で軟骨細胞を増殖させる培養工程と、
を具備する培養方法。
15. 前記コラーゲンゲル層は前記表面 1cm2あたり 0. 5mg以上のコラー ゲンを含有する、請求項 14に記載の培養方法。
16. 前記コラーゲンゲル層は I型コラーゲンを含む、請求項 14または 15 に記載の培養方法。
17. 前記コラーゲンゲル層は、コラーゲンの繊維状体によるネットワーク構 造を有している、請求項 14〜 16のいずれかに記載の培養方法。
18. 軟骨細胞を評価する方法であって、
表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲン ゲル層の該表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、
該コラーゲンゲル層表面で軟骨細胞を増殖させる培養工程と、 該コラーゲンゲル層表面の個々の細胞形状に基づいて分化の状態を 評価する評価工程と、
を具備する軟骨細胞評価方法。
19. 播種工程において播種される軟骨細胞は、コラーゲンゲル層を有し ない培養面で培養した細胞である、請求項 18に記載の軟骨細胞評価 方法。
20. 前記コラーゲンゲル層は前記表面 lcm2あたり 0. 5mg以上のコラー ゲンを含有する、請求項 18または 19に記載の軟骨細胞評価方法。
21. 前記評価工程は細胞の円形度に基づいて評価するェ程である、請 求項 18〜20のいずれかに記載の軟骨細胞評価方法。
22. 前記円形度は個々の細胞の投影像周長を投影面積円相当周で 除算した値である、請求項 21に記載の軟骨細胞評価方法。
23. 前記円形度が所定の閾値以上の細胞を軟骨細胞の形質を維持し ていると判定する、請求項 22に記載の軟骨細胞評価方法。
24. 前記コラーゲンゲル層は、コラーゲンの繊維状体によるネットワーク構 造を有している、請求項 18〜 23いずれかに記載の軟骨細胞評価方 法。
25. 前記評価工程は、前記円形度が 0. 8以上の細胞数の測定した全 細胞数に対する割合（％)を評価する工程である、請求項 21〜24のい ずれかに記載の軟骨細胞評価方法。
26. 軟骨細胞の三次元培養体の生産方法であって、
表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲン ゲル層の該表面に軟骨細胞を播種する播種工程と、
該コラーゲンゲル層表面で軟骨細胞を増殖させる二次元培養工程 と、
前記培養工程において増殖された軟骨細胞を用いて三次元培養を 実施する三次元培養工程と、
を具備する生産方法。
27. 前記二次元培養工程は継代培養工程である、請求項 26に記載 の生産方法。
28. 前記培養工程における前記コラーゲンゲル層表面の個々の細胞 形状に基づいて分化の状態を評価する評価工程を備え、 前記三次元培養工程は前記評価工程において軟骨細胞の形質を 維持していると判定された細胞を用いて三次元培養を実施する工程で ある、請求項 26または 27に記載の生産方法。
2 9 . 未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲン層を 備えた人工移植物。
30 . 未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有するコラーゲンゲ ノレ層と、
当該コラーゲンゲル層表面の軟骨細胞と、
を備える、人工移植物。
3 1 . 表面改質された人工移植物の製造方法であって、
人工移植物の表面に未架橋または低架橋の状態のコラーゲンを含有 するコラーゲンゲル層を形成する工程と、
前記コラーゲンゲル層表面で軟骨細胞を培養する工程と、
を備える、製造方法。
PCT/JP2005/006707 2004-03-31 2005-03-30 培養容器、軟骨細胞培養方法および軟骨細胞評価方法 WO2005095577A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006511874A JP4825666B2 (ja) 2004-03-31 2005-03-30 培養容器製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-105951 2004-03-31
JP2004105951 2004-03-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005095577A1 true WO2005095577A1 (ja) 2005-10-13

Family

ID=35063770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/006707 WO2005095577A1 (ja) 2004-03-31 2005-03-30 培養容器、軟骨細胞培養方法および軟骨細胞評価方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP4825666B2 (ja)
WO (1) WO2005095577A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015213515A (ja) * 2006-07-28 2015-12-03 ド クレシー, ウッドDE CRECY, Eudes より適切な細胞変異体を選択可能であり、継続的に培養液を製造する移動型容器を備える連続培養装置
WO2018021362A1 (ja) * 2016-07-25 2018-02-01 宇部興産株式会社 脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法、当該細胞の調製方法、及び物質の産生方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06292565A (ja) * 1993-03-15 1994-10-21 Bio Material Kenkyusho:Kk 細胞培養用基質材料
JPH08163979A (ja) * 1994-10-12 1996-06-25 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞培養器の包装方法
JPH09500298A (ja) * 1993-07-07 1997-01-14 スミス アンド ネフュー ピーエルシー 埋込型プロステーシス、キットおよびそれを製造するための装置
JP2002142752A (ja) * 2000-11-13 2002-05-21 Asahi Techno Glass Corp コラーゲンコート細胞培養容器及びその製造方法
JP2002233567A (ja) * 2000-12-06 2002-08-20 Mitsuo Ochi 移植用組織等価物及びその製造方法
JP2003135056A (ja) * 2001-10-30 2003-05-13 Mitsuo Ochi 移植用組織等価物の製造方法及びその製造用器具

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06292565A (ja) * 1993-03-15 1994-10-21 Bio Material Kenkyusho:Kk 細胞培養用基質材料
JPH09500298A (ja) * 1993-07-07 1997-01-14 スミス アンド ネフュー ピーエルシー 埋込型プロステーシス、キットおよびそれを製造するための装置
JPH08163979A (ja) * 1994-10-12 1996-06-25 Sumitomo Bakelite Co Ltd 細胞培養器の包装方法
JP2002142752A (ja) * 2000-11-13 2002-05-21 Asahi Techno Glass Corp コラーゲンコート細胞培養容器及びその製造方法
JP2002233567A (ja) * 2000-12-06 2002-08-20 Mitsuo Ochi 移植用組織等価物及びその製造方法
JP2003135056A (ja) * 2001-10-30 2003-05-13 Mitsuo Ochi 移植用組織等価物の製造方法及びその製造用器具

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALBERTS B. ET AL.: "Saibo no Bunshi Seibutsugaku.", 3RD EDITION, KABUSHIKI KAISHA NYUTON PURESU, 20 July 1995 (1995-07-20), pages 1180 - 1181, XP002997059 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015213515A (ja) * 2006-07-28 2015-12-03 ド クレシー, ウッドDE CRECY, Eudes より適切な細胞変異体を選択可能であり、継続的に培養液を製造する移動型容器を備える連続培養装置
WO2018021362A1 (ja) * 2016-07-25 2018-02-01 宇部興産株式会社 脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法、当該細胞の調製方法、及び物質の産生方法
CN109477069A (zh) * 2016-07-25 2019-03-15 宇部兴产株式会社 抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法、所述细胞的调制方法、及物质的产生方法
JPWO2018021362A1 (ja) * 2016-07-25 2019-05-23 宇部興産株式会社 脱分化しやすい細胞の脱分化を抑制する方法、当該細胞の調製方法、及び物質の産生方法
CN109477069B (zh) * 2016-07-25 2022-04-15 宇部兴产株式会社 抑制易脱分化的细胞的脱分化的方法、所述细胞的调制方法、及物质的产生方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP4825666B2 (ja) 2011-11-30
JPWO2005095577A1 (ja) 2008-02-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6773713B2 (en) Injection molding of living tissues
US6027744A (en) Guided development and support of hydrogel-cell compositions
JP3543869B2 (ja) 培養皮膚およびその製造法
JP5199866B2 (ja) 細胞及び薬物送達用の光架橋性オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）ヒドロゲル
CN1897890B (zh) 用藻酸盐基质控制细胞生长
US20150104872A1 (en) Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof
US20080260801A1 (en) Composite material, especially for medical use, and method for producing the material
US20020151974A1 (en) Tympanic membrane patch
AU2004305574B2 (en) Methods and composition for soft tissue feature reconstruction
CN101020082B (zh) 一种骨修复材料及其制备方法和用途
JP2004535425A (ja) ｉｎｖｉｖｏバイオリアクタ
US20200324021A1 (en) 3D Printed Scaffold Structures and Methods of Fabrication
RU148729U1 (ru) Имплантат для хирургического лечения дефектов костной и хрящевой тканей
WO2002045766A1 (fr) Equivalent tissulaire pour transplantation et son procede de production
Varoni et al. Hierarchic micro-patterned porous scaffolds via electrochemical replica-deposition enhance neo-vascularization
TWI400100B (zh) Medical equipment and manufacturing methods thereof
Lee et al. Laser sintered porous polycaprolacone scaffolds loaded with hyaluronic acid and gelatin-grafted thermoresponsive hydrogel for cartilage tissue engineering
KR101862885B1 (ko) 배양 연골 조직 재료
US20050123520A1 (en) Generation of living tissue in vivo using a mold
US20100136645A1 (en) Method for preparing a cell-derived extracellular matrix scaffold
Kim et al. Effect of acellular dermal matrix as a delivery carrier of adipose‐derived mesenchymal stem cells on bone regeneration
EP3169268B1 (en) Dental ring
WO2005095577A1 (ja) 培養容器、軟骨細胞培養方法および軟骨細胞評価方法
JP4084275B2 (ja) 細胞培養担体
JP5935181B2 (ja) 創傷治癒用の生体材料およびその調製

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006511874

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase