WO2005088309A1

WO2005088309A1 - 親和性物質測定方法

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Publication number: WO2005088309A1
Application number: PCT/JP2005/004234
Authority: WO
Inventors: Keisuke Iwata; Yukihito Mizutani
Original assignee: Pulse-Immunotech Corporation
Priority date: 2004-03-12
Filing date: 2005-03-10
Publication date: 2005-09-22
Also published as: US20070298519A1; EP1724583A4; CA2573234A1; EP1724583A1

Abstract

　測定対象である親和性物質と、この親和性物質との結合親和性を有する結合パートナーとの結合反応が、凝集反応によって測定される。結合パートナーは担体粒子に結合されており、結合反応によって担体粒子が凝集する。本発明は、電場を印加する前に反応液をインキュベートすることによって、凝集反応を増強する。また本発明は、電界中に置かれた反応液の温度や粘度の調整によって、凝集反応を増強する。本発明は、測定感度の向上に貢献する。また、本発明は、凝集塊の計数の前に、単体粒子を含む反応液を希釈する工程を含む。本発明の希釈工程は、親和性物質と結合パートナーとの間の結合を強化する。その結果、凝集塊の崩壊が防止され、測定感度は高まる。また希釈された担体粒子と凝集塊は、高い精度で識別することができる。

Description

明細書

親和性物質測定方法

技術分野

[0001] 本発明は担体粒子の凝集反応を利用した親和性物質の測定方法、および装置に関する。

背景技術

[0002] 親和性物質の存在を検出または測定する方法としては、例えば、酵素免疫測定法、あるいは放射線免疫測定法などが従来力も用いられている。いずれの方法においても、親和性物質をその結合パートナーと結合させ、両者の結合レベルに基づいて、親和性物質が測定される。これらの方法は高感度であり精度も高い。し力酵素、あるいは放射性同位元素を標識として使用するため試薬が不安定である。また放射性同位元素の利用にあたっては、保管および保存上の規制があることから、測定において細かい配慮や技術を要求される。そのため、より簡便な測定方法が求められていた。またこれらの方法は測定に比較的長時間を要するため、緊急な検査に対応することが難しい。これらの背景のもとで、高感度且つ迅速な測定方法が盛んに研究されるようになった。

[0003] 1970年以降、親和性物質と結合パートナーとの結合を担体粒子の凝集を指標として測定する分析方法が実用化された。この方法は、担体粒子の凝集の程度を光学的に測定することによって、定量的な分析を可能とした。たとえば担体粒子としてラテックス粒子を利用した、免疫学的粒子凝集反応を光学的に測定する方法は、ラテックス凝集比濁法 (Latex Agglutination Turbidimetry)と呼ばれている。これらの分析方法における反応温度は、一般的には 37— 45°Cの範囲で行われ、撹拌翼などによって撹拌することにより特異的凝集反応が進行する。このとき測定 (反応）に要する時間は、およそ 10— 20分で、酵素免疫測定法、あるいは放射線免疫測定法に比べ迅速である。一方、測定感度、あるいは測定範囲については、酵素免疫測定法等に比べ劣るといわれている。

[0004] ラテックス凝集法における粒度分布測定法も公知である（非特許文献 1Zカムビアソら， J. Immunol. Methods 18, 33, 1977、非特許文献 2Z松沢ら,化学と工業，第 36卷 ,第 4号， 1982) oラテックス凝集比濁法が、粒子懸濁液の光の透過度を測定するのに対して、粒度分布測定法においては分散した個々の粒子の状態や数が測定される。カムビアソらの報告においては、粒子径 0. 8 mのラテックスに抗体を結合させた試薬と抗原とを 37°Cで 20分間反応させた。反応後の粒子数を計数し、凝集による粒子数の減少のレベルに基いて抗原を測定した。粒子数は、レーザー散乱光を原理とした計数機で測定した。

[0005] 一方、松沢らは、粒子径 1 μ mのラテックス粒子に抗体を結合させた試薬を抗原と 6 時間反応させた。反応後、電気抵抗法により平均粒子容積を計測して、抗原を測定した。しかし、実用化されて普及したのはシースフローによるレーザー散乱法を用いた PAMIAシステム（シスメッタス株式会社）のみである。 PAMIAでは、粒子径 0. 78 μ mのラテックス粒子が使用されている。 45°Cで 15分間の反応後にラテックス粒子を計数して免疫測定を行うものである。 PAMIAは、ラテックス凝集比濁法に比べ高感度化されて!/ヽるが、放射免疫測定法 (RIA)や酵素免疫測定法 (EIA)とヽつた高感度免疫測定に比べると感度は劣ると、われて、る。

[0006] ラテックス凝集比濁法にぉ、ては、一般に粒子径 0. 05-0. 6 μ mのラテックス粒子が用いられている。ラテックス凝集粒度分布解析法の場合、このように小さい粒子では、測定妨害物質の影響を受けやすい。たとえば、血液や尿などの体液中には、脂質、蛋白、血球成分などが共存する。これらの共存物質は担体粒子との識別が難しい。そのため担体粒子を正しく計数できない場合がある、これらの測定妨害物質の影響を避けるために、比較的大きい粒子が使用されてきた。一方で、松沢らのように 1 μ m程度の粒子径になると、凝集反応が起こりにくくなるため、 0. 8 m程度のラテックス粒子が用いられていた。また、松沢らが平均粒子容積を計測するのに使用したアパーチャ一（細孔）の口径は 30 μ mである。このサイズではアパーチャ一の詰まりの影響を受けやすい。し力し、これより大きい口径のアパーチャ一では 0. 8— の粒子の検出はできなくなる。

[0007] 更に、親和性物質と結合パートナーの結合に基づく担体粒子の凝集を促進し、また形成される凝集塊の検出を容易にするために、反応系に交流電圧を印加する方法が公知である（特開平 7-83928号 Z特許文献 1)。この方法は、担体粒子の凝集により親和性物質の存在を検出又は測定する方法であって、 10mM以上の塩の共存下に 5— 50V/mmの電界強度になるように交流電圧を該反応系に印加することを特徴とする。

[0008] 結合パートナーを保持した担体粒子は、電場に置かれると電場に沿って並ぶ (パールチェイン化)。その後電場を停止すると並んでいた担体粒子が再分散する。パールチェイン化の際に親和性物質が存在すると、結合パートナーが親和性物質と結合する。その結果、電場を停止後も担体粒子の再分散が起こらず、パールチェインィ匕した担体の存在がなおも認められる。前記測定方法は、この現象を利用している。すなわち、電場においては、親和性物質の反応が促進される。そして電場を停止後に担体粒子を再分散させれば、反応生成物である担体粒子の凝集塊を検出することができる。

[0009] 特許文献 1：特開平 7— 83928号

非特許文献 1 :カムビアソら， J. Immunol. Methods 18, 33, 1977

非特許文献 2 :松沢ら,化学と工業，第 36卷，第 4号， 1982

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 本発明は、親和性物質と結合パートナーとの結合によって担体粒子を凝集させる方法において、両者の結合を促進することができる方法の提供を課題とする。あるいは本発明の課題は、両者の結合の阻害要因の影響を抑制するための方法を提供することである。電場の印加を利用した親和性物質の測定方法においては、親和性物質の反応は、結合パートナーを保持した担体粒子のパールチェインィ匕の際に起こる。両者の反応によって凝集した担体粒子が、結合の指標として検出または測定される。したがって、両者の反応を促進することができれば、反応効率の向上を実現できると考えられる。あるいは、反応を阻害する要因を明らかにし、その影響を取り除く方法を提供することは有用である。

[0011] 本発明の別の課題は、パールチェイン化によって形成された凝集塊の検出にあたり、希釈の影響を受けにくい、親和性物質の測定方法と、そのための装置の提供である。上記のように、担体粒子の凝集を計数して親和性物質を測定する方法においては、凝集塊と凝集しな力た担体粒子の識別結果が、測定結果に大きな影響を与える。しカゝし担体粒子が凝集塊を形成していない場合でも、粒子同士が重なって見える位置関係にあると、凝集塊として計数されてしまう可能性がある。本発明者らは、粒子の三次元情報に基づいて、凝集粒子を計数することによって、粒子間の重なりの問題が解消できることを確認した。しかし、三次情報に基づく解析においてもなお、粒子濃度が濃い状態では複数の粒子が同時に検出されることがある。すなわち、凝集してヽな、複数の担体粒子が凝集塊として計数される場合があることが確認されている。

[0012] 予め粒子濃度を低く設定しておけば、凝集粒子の識別における粒子の重なりを避けられる力もしれない。しかし粒子濃度が低い条件下では、パールチェインィ匕が困難である。パールチェインィ匕による粒子凝集反応のためには、ある程度の粒子濃度が必要である。つまり、パールチェインの形成工程においては粒子濃度を高くし、次に凝集粒子の検出工程においては粒子濃度を低くすることができれば理想的である。粒子濃度を低くするためには、たとえば担体粒子を含む反応液を希釈すればょヽ。

[0013] しかし実際には、反応液の希釈によって、形成された凝集塊が崩壊する。その結果、凝集粒子の数が実際よりも低く計数される。つまり希釈によって負誤差が生じることになる。本発明により、パールチェインィ匕によって形成された凝集塊の検出にあたり、希釈の影響を受けにくい、親和性物質の測定方法と、そのための装置が提供される

課題を解決するための手段

[0014] 本発明者らは、親和性物質と結合パートナーとの結合の効率を向上させるための方法を明らかにし本発明を完成した。パールチェイン化された担体粒子が保持している結合パートナーが親和性物質と効率的に結合するためには、できるだけ多くの親和性物質が結合パートナーと接触する条件を与えればよ!、はずである。言、換えれば、結合パートナーとの接触の機会を逸した親和性物質が多い条件は、反応効率が低い条件であると言うことができる。このような条件下では、両者の結合を担体粒子の凝集によって検出する測定方法においては、測定感度の向上が妨げられる可能 '性がある。このような問題は、本発明によって解決される。

加えて、電圧を印加された反応液の温度は、ジュール熱によって上昇する。本発明者らは、反応液の温度が親和性物質結合パートナー間の反応に与える影響について解析した。その結果、反応液の温度の上昇が、両者の結合に対して阻害的に作用する可能性があることを確認した。そして、電場を印加している反応液の温度条件の制御によって、好適な反応条件を実現できることを明らかにし、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の測定方法、測定装置、あるいは結合パートナーを保持した担体粒子の親和性物質による凝集を促進させるための方法を提供する。

〔1〕次の工程を含む、親和性物質の測定方法。

(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液をインキュベートする工程、

(2)工程 (1)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、

(3)工程 (2)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子の、ずれかまたは両方を計数する工程、および

(4)工程 (3)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子のレベルのいずれ力、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定するェ程

〔2〕工程 (1)が、前記反応液を 37— 90°Cでインキュベートする工程である〔1〕に記載の方法。

〔3〕工程 (1)が、前記反応液を 40— 90°Cでインキュベートする工程である〔2〕に記載の方法。

〔4〕前記反応液中に水溶性高分子が含有されていることを特徴とする〔1〕に記載の方法。

〔5〕工程 (2)における反応液の粘度を 0. 8— 3mPa_Sに調整する〔1〕に記載の方法。〔6〕工程 (2)を 0— 20°Cで行うことを特徴とする〔1〕に記載の親和性物質の測定方法。〔7〕工程 (2)を 0— 10°Cで行うことを特徴とする〔6〕に記載の親和性物質の測定方法。〔8〕凝集塊および凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子のいずれか、または両方を、その三次元情報を指標として計数する〔1〕に記載の方法。

〔9〕親和性物質と結合パートナーの結合が、抗原抗体反応による結合である〔1〕に記載の方法。

〔10〕親和性物質が抗原であり、結合パートナーが抗体またはその抗原結合領域を含む断片である〔9〕に記載の方法。

〔11〕親和性物質が抗体またはその抗原結合領域を含む断片であり、結合パートナ一が抗原またはその抗原決定基を含む断片である〔9〕に記載の方法。

〔12〕電圧パルスが交流電圧パルスである〔1〕に記載の方法。

〔13〕次の工程を含む、親和性物質の測定方法。

(1')少なくとも測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを含む反応液を、凝集試薬成分と混合する前または後にインキュベートする工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集は阻害される工程

(2')凝集試薬成分の存在下で工程 (1')の反応液に、電圧パルスを印加する工程、

(3')工程 (2')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれカまたは両方を計数する工程、および

(4)工程 (3')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのヽずれか、または両方に基づ、て測定対象物質のレベルを決定する工程

〔14〕工程 (1')において、前記反応液をインキュベート後、工程 (2')の前に凝集試薬を混合する〔13〕に記載の方法。

〔15〕凝集試薬を混合後に、工程 (2')の前に更にインキュベートする工程を含む〔13〕に記載の方法。

〔16〕工程 (1')において、前記反応液を凝集試薬の存在下でインキュベートした後、工程 (2')を実施する〔13〕に記載の方法。

〔17〕特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、反応液の温度を 37°C— 90°Cに加熱するための手段を有することを特徴とする装置。

〔18〕特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む、担体粒子を凝集させるための方法において、電圧を印加している間の反応液の温度を 0°C— 20°Cとすることを特徴とする方法。

〔19〕結合パートナーと特定の物質との結合が、抗原抗体反応である〔18〕に記載の方法。

〔20〕電圧パルスが交流電圧パルスである〔18〕に記載の方法。

〔21〕反応液に水溶性高分子を添加する〔18〕に記載の方法。

〔22〕反応液の粘度を 0. 8— 3mPasに調整する〔18〕に記載の方法。

〔23〕前記担体粒子と特定の物質とを、電圧パルスを印加する前に 37°C— 90°Cでィンキュペートする工程を含む〔18〕に記載の方法。

〔24〕特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、電圧を印加している間の反応液の温度を 0°C— 20°Cにするための手段を有することを特徴とする装置。

〔25〕以下の要素を含む、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質との結合を、前記担体粒子の親和性物質または凝集試薬による凝集を指標として測定するための測定装置。

a:反応液を保持するための空間、

b:反応液の温度を 37°C— 90°Cでインキュベートするための手段、

c:反応液に電圧パルスを印加するための手段、

d:パルス電圧の印加時における反応液の温度を 0°C— 20°Cとするための手段、および

e:反応液に含まれる担体粒子と担体粒子の凝集塊の!/ヽずれか、または両方を計数するための手段

また、本発明者らは、担体粒子の凝集塊の検出工程について検討を重ねた。そして、パールチェインィ匕後の反応液を希釈する工程において、凝集塊を形成する結合を強化することができる手段を利用すれば、希釈にともなう不利益を解消できると考えた。更に、希釈による不利益の防止に有効な手段を明らかにして、その効果を確認し本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下の測定方法、および測定装置に関する。

〔26〕次の工程 (1)-(3)または (1')-(3')を含む、親和性物質の測定方法において、工程 (2)または (2')の前に、親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナ一との結合を強化する手段により反応液を希釈する工程を含む方法。

(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に、電圧パルスを印加する工程、

(2)工程 (1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子の、ずれかまたは両方を計数する工程、および

(3)工程 (2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子のレベルのいずれ力、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定するェ程、または

(1')測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを、凝集試薬成分と混合した反応液に電圧パルスを印加する工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集が阻害される工程、

(2')工程 (1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれカまたは両方を計数する工程、および、

(3')工程 (2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのヽずれか、または両方に基づ、て測定対象物質のレベルを決定する工程

[27]反応液を希釈する工程が、電圧パルスの印加条件下で反応液と希釈液を混合する工程である〔26〕に記載の方法。〔28〕電圧パルスが交流電圧である〔27〕に記載の方法。

〔29〕交流電圧が 2KHz— 20MHzの周波数である〔28〕に記載の方法。

〔30〕反応液を希釈する工程が、電圧パルスの印加条件下で反応液と希釈液を混合後、電場を停止後に更に付加的に担体粒子を希釈する工程を含む〔27〕に記載の方法。

〔31〕反応液を希釈する工程が、測定対象親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーの間の結合を強化する結合強化剤を反応液に添加した後に反応液と混合するか、あるいは前記結合強化剤を含む希釈液で反応液を希釈する工程である、〔27〕に記載の方法。

〔32〕反応液を希釈する工程が、測定対象親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーの間の結合を強化する結合強化剤を反応液に添加した後に反応液を希釈液と混合するか、ある!ヽは前記結合強化剤を含む希釈液で反応液を希釈する工程である、〔26〕に記載の方法。

〔33〕測定対象親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーとの結合が免疫学的な結合である〔32〕に記載の方法。

〔34〕抗原が蛋白質抗原であり、結合強化剤がダルタルアルデヒド、およびカルポジイミドから選択されるいずれか、または両方の化合物である〔33〕に記載の方法。〔35〕反応液を希釈する工程が、電圧パルスの印加条件下で反応液と希釈液を混合する工程である〔32〕に記載の方法。

〔36〕工程 (1)または (1')における電圧パルスが交流電圧パルスである〔26〕に記載の方法。

〔37〕工程 (1)または (1')において、電圧パルスを複数回与えることを特徴とする〔26〕に記載の方法。

〔38〕工程 (1)または (1')において、電圧パルスを印加後に、担体粒子を分散させてから次の電圧パルスを印加する工程を含む、〔37〕に記載の方法。

〔39〕複数回の電圧パルス力異なる方向の電圧パルスである〔37〕に記載の方法。

〔40〕担体粒子の平均粒子径が、 1 μ m以上である〔26〕に記載の方法。

〔41〕担体粒子の平均粒子径カ 1 μ m— 20 μ mである〔40〕に記載の方法。〔42〕工程 (2)または (2')において、凝集塊および凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子のいずれか、または両方を、その三次元情報を指標として計数する〔26〕に記載の方法

〔43〕工程 (2)または (2')において、凝集塊または担体粒子の三次元情報を、物理的に測定する〔42〕に記載の方法。

〔44〕三次元情報を物理的に測定するための方法が、電気抵抗法、レーザー回析散乱法、および三次元画像解析法力なる群力選択されたいずれかの方法である〔4 3〕に記載の方法。

〔45〕以下の要素を含む、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナ一を結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質との結合を、前記担体粒子の親和性物質または凝集試薬による凝集を指標として測定するための測定装置。

a:測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質を含む試料を含む反応液、または更に付加的に凝集試薬含む反応液を保持するための空間、

b:反応液に電圧パルスを印加するための手段、

c:反応液を希釈するための手段、および

d:反応液に含まれる担体粒子と担体粒子の凝集塊の!/ヽずれか、または両方を計数するための手段

〔46〕反応液を希釈するための手段力電圧パルスの印加条件下で反応液と希釈液を混合するための手段である〔45〕に記載の装置。

〔47〕反応液を希釈するための手段が、測定対象親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーの間の結合を強化する結合強化剤を反応液に添加するための手段を含む、 [45]に記載の装置。

発明の効果

本発明によって、電場を印力！]した反応液における、結合パートナーを保持した担体粒子の親和性物質との結合反応を促進するための方法、あるいはその反応を阻害する要因の影響を抑制するための方法が提供された。担体粒子の凝集を指標とする親和性物質の測定において、好適な反応条件を示した報告は多くない。本発明によつて、たとえば、担体粒子の凝集を指標とする免疫学的結合反応を利用した測定方法の感度の上昇、あるいは反応時間の短縮を実現することができる。本発明は、上記反応の最適化に貢献する。

[0018] また、本発明によって、たとえば、担体粒子の凝集を指標とする免疫学的結合反応を利用した測定方法の感度の上昇、あるいは再現性の向上を実現することができる。本発明は、上記反応の最適化に貢献する。電圧パルスを印加した反応液において、担体粒子に保持された結合パートナーと親和性物質 (あるいは凝集試薬)との結合反応によって凝集塊が形成される。本発明においては、凝集塊の検出にあたり、この結合反応を強化する手段によって反応液を希釈した後に、凝集塊が検出される。結合反応を強化する手段としては、電圧パルス印加条件下における反応液の希釈、あるいは結合強化剤を用いることができる。結合反応を強化する手段の採用によって、凝集塊の希釈に伴う種々の障害を避けることができる。すなわち、希釈された担体粒子は、互いに重なって検出される可能性が小さい。その結果、粒子の重なりを誤って凝集塊として検出する誤差を防ぐことができる。一方、凝集塊の構造は結合の強化によって維持される。そのため、希釈に伴って凝集塊が崩壊して検出できなくなる問題を避けることができる。こうして、本発明によって、再現性と感度の向上を実現することができる。

図面の簡単な説明

[0019] [図 1] (A)は、本発明に基づく装置の構成を示す図である。また）は、本発明に基づく装置を構成するパルス印加槽の断面を示す図である。

[図 2]図 1の構成を有する測定装置によって本発明の測定方法を実施したときに得られた測定結果 (前処理温度との関係)を示す図である。図中、縦軸は凝集率 (%)を、横軸は AFP濃度 (ng/mL)を示す。

[図 3]図 1の構成を有する測定装置によって本発明の測定方法を実施したときに得られた測定結果 (高温下における前処理時間との関係)を示す図である。

[図 4]図 1の構成を有する測定装置によって本発明の測定方法を実施したときに得られた測定結果 (反応促進剤との関係）を示す図である。図中のプロットはそれぞれ以下の結果を示す。白四角：抗原量 Ong/mL (ブランク値）白丸：抗原量 9.5ng/mL 黒丸：ブランク補正 (9.5-0ng/mL)

圆 5] (A)は、本発明に基づく装置の構成を示す図である。また）は、本発明に基づく装置を構成するパルス印加槽の断面を示す図である。図中の符号はそれぞれ符号の説明に記載した要素を示す。

[図 6]図 5の構成を有する測定装置によって、電圧パルスを印加中の反応液を低温に維持する本発明の測定方法を実施したときに得られた測定結果を示す図である。図中、縦軸は凝集率 (%)を、横軸は AFP濃度 (ng/mL)を示す。

[図 7]図 6の対照法 (電圧パルスを印加中の反応液の温度制御なし:室温)の結果を示す図である。図中、縦軸は凝集率 (%)を、横軸は AFP濃度 (ng/mL)を示す。

[図 8]図 6の対照法（電圧パルスを印加しな!、で、 37°Cで 20分間インキュベーション）の結果を示す図である。図中、縦軸は凝集率 (%)を、横軸は AFP濃度 (ng/mL)を示す圆 9]本発明による前立腺特異抗原 (PSA)の測定において、反応液に添加されたゥシ血清アルブミン (BSA)の担体粒子の凝集率に与える影響を示すグラフである。図中、縦軸は凝集率 (%)を、横軸は反応液における BSAの最終濃度を示す。各カラムは、左力順に PSA Ong/mL, 9.5ng/mL、および 32ng/mLの結果を示す。グラフ中には、各 BSA濃度における PSA Ong/mLにおける凝集率と、 9.5ng/mLにおける凝集率の差 (黒四角）、および 32ng/mLにおける凝集率の差（白丸）を合わせて示した。

[図 10]反応液の粘度に与える、反応液中のゥシ血清アルブミン (BSA)の濃度と温度の影響を示すグラフである。図中、縦軸は粘度 (mPas)を、横軸は温度 (°C)を示す。

[図 11]図 11 (A)は、担体の凝集状態を測定するための装置の概略を示す図である。図 11 (B)は、図 11(A)の希釈槽 5の概略を示す図である。

[図 12]AFPコントロール血清を検体液とし、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を担体として反応を行った場合の、担体の凝集率を示すグラフである。印加して希釈した場合の凝集率を黒菱形、印加せず希釈した場合の凝集率を白四角で示す。縦軸は凝集率を示し、横軸は AFPの濃度を示す。

[図 13]AFPコントロール血清を検体液とし、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を担体として反応を行った場合の、担体の凝集率を示すグラフである。印加して希釈した場合の凝集率を黒丸、印加せず希釈した場合の凝集率を白四角、予め印加しておいた希釈液で希釈した場合の凝集率を黒三角で示す。縦軸は凝集率を示し、横軸は AFPの濃度を示す。

[図 14]PSAコントロール血清を検体液とし、抗 PSA抗体感作ラテックス試薬を担体として、反応促進試薬を添加して反応を行った場合の担体の凝集率を示すグラフである。印加して希釈した場合の凝集率を黒菱形、印加せず希釈した場合の凝集率を黒四角、予め印加しておいた希釈液で希釈した場合の凝集率を白三角で示す。縦軸は凝集率を示し、横軸は PSAの濃度を示す。

[図 15]2.0 μ mの抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を担体として AFPコントロール血清と反応させた場合の、担体の凝集率を示すグラフである。印加して希釈した場合の凝集率を黒菱形、印加せず希釈した場合の凝集率を白四角で示す。縦軸は凝集率を示し、横軸は AFPの濃度を示す。

[図 16]3 μ mの抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を担体として AFPコントロール血清と反応させた場合の、担体の凝集率を示すグラフである。印力!]して希釈した場合の凝集率を黒菱形、印加せず希釈した場合の凝集率を白四角で示す。縦軸は凝集率を示し、横軸は AFPの濃度を示す。

[図 17]4.5 μ mの抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を担体として AFPコントロール血清と反応させた場合の、担体の凝集率を示すグラフである。印加して希釈した場合の凝集率を黒菱形、印加せず希釈した場合の凝集率を白四角で示す。縦軸は凝集率を示し、横軸は AFPの濃度を示す。

[図 18]AFPコントロール血清と抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を反応させた後、 0.25% 、 2.5%、または 25%のダルタルアルデヒドを加えて超音波処理を行った場合、およびダルタルアルデヒドを加えずに超音波処理を行った場合の担体の凝集率を示すダラフである。縦軸は凝集率を示し、横軸は超音波処理時間を示す。

[図 19]AFPコントロール血清と抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を反応させた後、グルタルアルデヒドをカ卩えて 0秒、 15秒、 30秒または 60秒間インキュベートしてから超音波処理を行った場合、およびダルタルアルデヒドをカ卩えずに超音波処理を行った場合の担体の凝集率を示すグラフである。縦軸は凝集率を示し、横軸は超音波処理時間を示す。

[図 20]2.0 μ mの抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を担体として AFPコントロール血清と反応させた後、ダルタルアルデヒドをカ卩えてインキュベートして力超音波処理を行つた場合、およびダルタルアルデヒドを加えずに超音波処理を行った場合の担体の凝集率を示すグラフである。縦軸は凝集率を示し、横軸は超音波処理時間を示す。

[図 21]2.8 μ mの抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を担体として AFPコントロール血清と反応させた後、ダルタルアルデヒドをカ卩えてインキュベートして力超音波処理を行つた場合、およびダルタルアルデヒドを加えずに超音波処理を行った場合の担体の凝集率を示すグラフである。縦軸は凝集率を示し、横軸は超音波処理時間を示す。

[図 22]1.7 μ mの抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を担体として AFPコントロール血清と反応させた後、ダルタルアルデヒドをカ卩えてインキュベートして力超音波処理を行つた場合、およびダルタルアルデヒドを加えずに超音波処理を行った場合の担体の凝集率を示すグラフである。縦軸は凝集率を示し、横軸は超音波処理時間を示す。発明を実施するための最良の形態

[0020] 本発明は、次の工程を含む、親和性物質の測定方法に関する。

(2)工程 (1)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、

[0021] 本発明の特徴は、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液を、電圧パルスを印加する前にインキュベートすることにある。本発明者らは電圧パルス印加前の反応液のインキュベートによって、電圧パルス印加後の凝集塊の形成が促進されることを明らかにした。すなわち、電圧ノルス印加前のインキュベートによって反応が促進される。

[0022] 本発明において、反応液のインキュベートは、たとえば室温以上の温度で実施される。インキュベートの温度は、反応液に含まれる各種の反応成分の活性を維持できる限り、できるだけ高温であることが望ましい。インキュベートのための時間は限定されない。すなわちインキュベートの温度において、反応成分の変性をもたらさない範囲でインキュベートすることができる。インキュベートの時間は長いほど促進効果も増強される。したがって、必要なレベルの促進効果を期待できる温度と時間の条件を予め設定することが望ましい。

[0023] 具体的には、たとえばインキュベートのための温度条件として、通常 37— 90°C、好ましくは 40— 90°C、あるいは 45— 80°Cを示すことができる。たとえば親和性物質である蛋白質抗原を、結合パートナーである抗体を用いて、本発明に基づいて測定することができる。抗体や抗原を構成する蛋白質は高温では変性することが知られている。しかし、たとえば血清の非動化のための一般的な条件である 56°C30分というインキュペート条件は、多くの蛋白質は変性しない。更に本発明者らは、ィムノアツセィのような低い蛋白質濃度条件で、短時間の処理であれば、 90°C程度の温度であっても蛋白質の変性は無視しうることを確認した。たとえば 45— 80°Cの範囲において、 5— 180秒のインキュベートは、ほぼ同じレベルの反応促進効果を得られることが確認された（図 3)。したがって、本発明における好ましいインキュベートの条件として、好ましくは 45— 80°C、より好ましくは 50— 65°Cで、 5秒以上、たとえば 5— 30秒を示すことができる。

[0024] 本発明においては、より長いインキュベート時間をも含まれることは言うまでもない。

しかし、反応時間の短縮が望まれる場合には、 5秒以上の短い時間を採用することによって、反応時間を犠牲にすることなく目的とする反応促進効果を期待することができる。また、たとえば 80°Cを越える高温条件においては、インキュベート時間を 5— 1 80秒とすることで、蛋白質の変性を避けることができる。

[0025] あるいは、本発明の方法を耐熱性の物質の反応に応用する場合には、高温条件は問題とならない。たとえば DNAは、高温条件下でもきわめて安定である。したがって DNA間の結合を担体粒子の凝集によって測定しょうとする場合には、インキュベートのための温度としてより高い温度を選択することもできる。

[0026] 本発明において、インキュベートによって反応が促進されるメカニズムは、次のように説明することができる。電圧パルスの印加によって整列した担体粒子は、その上に固定された結合パートナーが、親和性物質を介して別の担体粒子上の結合パートナ一と架橋されることによって凝集塊を構成する。一連の反応は、担体粒子が整列したときに起きると考えられていた。しかし本発明者が得た知見によると、電圧パルス印加前のインキュベートが反応の効率ィ匕に貢献することが確認された。またこのインキュべートの間に、担体粒子上の結合パートナーに親和性物質が結合した状態が形成されることも明らかにした。つまり、電圧ノルス印加によって担体粒子を整列させる前に、結合パートナーが親和性物質を捕捉した状態にしておくことが反応を効率化すると考えられる。

[0027] 電圧ノルスを印加されてヽな、条件下では、電圧パルス印加時と比べて、担体粒子の自由度ははるかに大きいと考えられる。したがって、担体粒子上の結合パートナ一と親和性物質は接触することができ、結合パートナーは親和性物質を捕捉することができる。ここに電圧パルスを印加すると、親和性物質を捕捉した結合パートナーを有する担体粒子は他の担体粒子とともに電場に整列する。このとき結合パートナーは既に親和性物質を捕捉しているので、接近した他の担体粒子の結合パートナーとの結合によって速やかに凝集塊が形成される。電場が断続的に印加され、担体粒子の整列と分散が繰り返されることにより接触の機会が増え、凝集塊の形成が促進される

[0028] つまり電圧パルスの印加の後に担体粒子の凝集を検出し、その凝集を指標として親和性物質を測定する方法においては、担体粒子の凝集塊は、以下の一次反応と二次反応を経て形成されると言ってょヽ。

一次反応：担体粒子上の結合パートナーが親和性物質を捕捉する反応。このとき、必ずしも親和性物質を介した担体粒子間の架橋構造は形成されなくても良い。二次反応:複数の担体粒子上の結合パートナーが親和性物質に結合する反応。その結果、親和性物質を介した担体粒子間の架橋構造 (すなわち凝集塊)が形成される。二次反応は電圧パルスの印加によって促進される。しかし、これまで一次反応を促進するための具体的な条件は明らかにされていな力つた。したがって本発明は、一次反応の促進のための条件を提供したと捉えることもできる。すなわち本発明における電圧パルスの印加前のインキュベート工程は、一次反応の促進のための工程であると言うことちでさる。

[0029] 本発明にお、ては、電圧パルスを印加する前の反応液中に水溶性高分子化合物を添加することができる。水溶性高分子化合物の存在下で、親和性物質と結合パートナーの結合を粒子凝集反応によって検出することによって、凝集反応の強化、あるいは安定ィ匕を達成することができる。反応液中の水溶性高分子化合物の濃度は、たとえば 0. 05— 5%から適宜選択することができる。より好ましくは 0. 1-3%,更に好ましくは 0. 3— 1 %である。凝集反応の強化作用が強い化合物は、 5%を超える濃度において、非特異的凝集反応の可能性を大きくする傾向がある。また、 0. 05%以下の低、濃度では、その効果が十分に期待できな、場合がある。

[0030] 水溶性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、カルボキシメチルセルロース等を用いることができる。ポリエチレングリコールの分子量は、 6000 一 2000000力 S好ましい。これらの水溶性高分子化合物は 1種類でも良いし、 2種類以上を組み合わせてもよい。水溶性高分子化合物を反応液に添加するためには、粒子担体を含む試薬中に予め必要量を添加しておくことができる。あるいは水溶性高分子化合物を粒子担体とは異なる試薬として混合することもできる。たとえば、サンプルの希釈液中に水溶性高分子化合物を添加しておくことができる。更に、混合される複数の試薬、並びに希釈液中に添加しておくこともできる。

[0031] 好ましくは、 2試薬系とし、緩衝液などの第一試薬に含有させておき、担体を含む第二試薬と混合して測定に使用する。このとき、第一試薬中には異好性抗体

(heterophile antibody)などの非特異物質を吸収する非特異吸収剤やリウマチ因子を吸収するための物質を添加することができる。

[0032] 本発明に基づぐ電圧パルスの印加前のインキュベートによる反応効率の向上は、凝集阻止反応に応用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、親和性物質の測定方法を提供する。インキュベートの条件は、前記の条件と同様である。また凝集阻止反応系にお！ヽても、反応液に水溶性高分子化合物を添加することができる。

(2')凝集試薬成分の存在下で工程 (1')の反応液に、電圧パルスを印加する工程、 (3')工程 (2')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれカまたは両方を計数する工程、および

[0033] 上記のように、電圧パルスの印加前の反応液のインキュベートは、担体粒子の凝集反応の促進に有効である。このとき、インキュベートの温度は、高いほうがより効果が大きいことは既に述べた。一方、電圧パルスを印加された反応液の温度は、ジュール熱のために上昇する。導体を電流が流れるときに、導体において発生する熱がジュール熱である。本発明者は、インキュベートにおける高温条件が凝集反応に促進的に作用するのに対して、電圧パルス印加時の温度上昇が凝集反応に対して阻害的に作用することを見出した。したがって、電圧印加時には、反応液の温度を低く維持することが有禾 IJである。

[0034] すなわち本発明は、特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む、担体粒子を凝集させるための方法にぉ、て、電圧を印加して、る間の反応液の温度を 0°C— 20°Cとすることを特徴とする方法を提供する。

[0035] 本発明の方法は、たとえば担体粒子の凝集を指標として親和性物質を測定する方法に利用することができる。より具体的には、次の工程を含む、親和性物質の測定方法が本発明によって提供される。 (1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に、 0°C— 20°Cの条件下で電圧パルスを印加する工程、

(3)工程 (2)の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子のレベルのいずれ力、または両方に基づいて測定対象物質のレベルを決定するェ程

[0036] あるいは本発明は、次の工程を含む、親和性物質の測定方法を提供する。

(1')少なくとも測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質および凝集試薬成分を含む反応液に、 0°C— 2

0°Cの条件下で電圧パルスを印加する工程、

(2')工程 (1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれカまたは両方を計数する工程、および

(3)工程 (2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのヽずれか、または両方に基づ、て測定対象物質のレベルを決定する工程

[0037] 本発明において、電圧パルス印加時の温度は、通常 0— 20°C、たとえば 0— 15°C 、好ましくは 1一 8°C、あるいは 2— 4°Cである。電圧パルスの印加によって反応液の温度は上昇する。したがって反応液の温度を低く保っためには、冷却手段を利用するのが有利である。局所的に低温環境を作り出すための好適な冷却手段として、たとえばペルチェ素子を示すことができる。ペルチェ素子とは、ペルチェ（Jean Charles A. Peltier)によって見出されたペルチェ効果を利用した半導体で構成される電子素子である。 N型と P型の半導体に直流電流を流すと、半導体の片方で温度が吸収され、他方で放熱が起きる (熱交換現象)。温度が吸収される側の温度は低下し、冷却される。市販のペルチェ素子は、通常、—10°C前後の冷却能力を有している。ペルチェ素子の冷却能力は、半導体に供給する電流によって自由に制御することができる。したがって、電圧パルスを印加している間、温度センサーで反応液の温度を監視し、必要に応じてペルチヱ素子を作動させることによって、所定の温度範囲に反応液の温度を維持することができる。

[0038] あるいはまた、電圧パルス印加時に反応液を十分に冷却し、電圧パルスの印加後も反応液の温度が所定の範囲にある場合には、電圧パルス印加時の冷却は必ずしも必要ではな、。たとえば電圧パルスの印加終了時の反応液の温度が 20°C以下であれば、印加の間の冷却無しでも、必要な温度条件を満たすことができる。予め十分に反応液を冷却し、更に必要に応じて、反応液がおかれる環境の温度上昇を抑制することができれば、電圧ノルス印加の間の積極的な冷却は必須ではな!/、。

[0039] 本発明にお、て、電圧パルスを印加する反応液は、予めインキュベートすることができる。インキュベートのための条件は先に述べたとおりである。反応液が 37— 90°C の高温でインキュベートされた場合には、電圧パルスを印加する前に十分に冷却する。通常、反応液の体積は lmL以下なので、反応液はきわめて短時間で冷却することができる。高温でインキュベートした反応液を冷却し、 0— 20°Cにおいて電圧ノルスを印加すると、う条件は、本発明における好ま、条件である。

[0040] 電圧パルス印加時の温度上昇が凝集反応に阻害的に作用するメカニズムは、次のように考えることができる。電圧パルスを印加された反応液中では、担体粒子の整列と分散が繰り返されている。担体粒子上の結合パートナーと反応液中の親和性物質 (または凝集試薬成分)との接触の機会を増やすためには、担体粒子の分散が有効である。同時に、複数の担体粒子を親和性物質 (または凝集試薬成分)との結合によつて架橋し、凝集塊を形成するためには、担体粒子の整列が有効である。しかし反応液における担体粒子の動きが激しい場合には、担体粒子が十分に整列できない可能性がある。反応液の温度が上昇した状態は、反応液に含まれる担体粒子のブラゥン運動が激しくなつて、電圧印加時の担体粒子の整列が難しくなつて!、る状態であると言える。その結果、電圧の印加による担体粒子の整列が阻害され、凝集反応が阻害される。本発明に基づ！ヽて電圧パルス印加時の反応液の温度が制御された場合には、電圧印加による担体粒子の整列効果が十分に得られ、温度上昇による凝集反応の阻害を抑制することができる。

[0041] 電圧パルスを印加された反応液における担体粒子の動きを抑制するために、反応液の粘度を高めることも有効である。一般的な凝集反応の反応液は、 0. 75mPas未満である。このような粘度においては、担体粒子の動きは抑制されず、凝集反応が阻害される場合がある。これに対して本発明者は、 0. 8mPas以上の粘度において、凝集反応を効率的に進められることを確認した。すなわち本発明は、特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む、担体粒子を凝集させるための方法にお！、て、電圧を印加している間の反応液の粘度を 0. 8mPas以上とすることを特徴とする方法を提供する。

[0042] より具体的には、次の工程を含む親和性物質の測定方法であって、反応液の粘度が 0. 8mPas以上である方法が本発明によって提供される。

(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した反応液に電圧パルスを印加する工程、

[0043] あるいは本発明は、次の工程を含む親和性物質の測定方法であって、反応液の粘度が 0. 8mPas以上である方法が本発明によって提供される。

(1')少なくとも測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質および凝集試薬成分を含む反応液に電圧パルスを印加する工程、

(2')工程 (1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれカまたは両方を計数する工程、および (3)工程 (2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルのヽずれか、または両方に基づ、て測定対象物質のレベルを決定する工程

[0044] 本発明において、反応液の粘度は、通常 0. 8mPas以上、たとえば 1一 3mPas、好ましくは 1一 2mPasである。反応液の粘度は、粘度を調節することができる化合物の添加によって調節することができる。粘度を調節することができる化合物としては、親和性物質と結合パートナーとの結合に干渉しない任意の化合物を利用することができる。たとえば、牛血清アルブミン、カゼイン、グリセリン、スクロース、あるいは塩ィ匕コリン等を添加することによって、反応液の粘度を高めることができる。これらの化合物の添加量は、たとえば 0. 05— 5%から適宜選択することができる。より好ましくは 0. 1— 3 %、更に好ましくは 0. 3— 1%である。また、反応液の組成が同じであっても、反応液の温度が低下すれば、一般に、粘度は高まる。したがって、反応液の粘度を高めると V、う意味でも、低温条件下での電圧パルスの印加は有効である。

[0045] 当業者は、これらの化合物を反応液に添加し、電圧パルスを印加する温度条件下でその粘度を測定することにより、適当な添加量を設定することができる。液体の粘度を決定する方法は公知である。一般的には回転式粘度計、超音波式粘度計、または振動式粘度計などが用いられる。

[0046] また、本発明は、次の工程 (1)-(3)または (1')-(3')を含む、親和性物質の測定方法において、工程 (2)または (2')の前に、親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーとの結合を強化する手段により反応液を希釈する工程を含む方法である。

[0047] 本発明における反応液の希釈工程は、前記工程 (2)または (2')の前に、親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーとの結合を強化することができる任意の手段によって実施することができる。たとえば、反応液を電圧パルスの印加条件下で希釈する方法は、本発明における好ましい希釈方法である。より具体的には、電圧パルスを印加した希釈液に、反応液を添加することにより、希釈が行われる。希釈液は電極の間に配置され、電圧パルスが印加される。言い換えれば、対向する電極間に希釈液が配置される。

[0048] 本発明の希釈工程は、反応液に電圧パルスが印加された条件下で希釈される限り、電極の大きさや電極の間隔は特に限定はされない。すなわちパールチェインィ匕後の反応液と希釈液との初期の接触が対向電極を挟む電界の中で行われることを特徴とする。例えば、図 6 (B)に示す希釈方式では、電極の大きさは（幅） 2— 12mm X ( 長さ） 10— 50mm X (厚さ） 0.01— 0.04mm、電極間距離は 5— 20mmでほぼ同等の効果が確認されている。

[0049] また、電圧パルスは交流電圧が好ま、。電圧パルスの印加条件は、反応液および希釈液の電気分解を誘発しな!、任意の条件とすることができる。電圧パルスの電圧は、例えば 0. IV力ら 1. 2V、より好ましくは 0. 3力ら 0. 9Vである。電圧パルスの周波数はたとえば 2KHzから 20MHz、より好ましくは ΙΟΚΗζから 500KHzである。電圧パルスには、任意の波形を用いることができる。具体的には、方形波、正弦波、三角波などを示すことができる。より好ましい電圧パルスは、方形波である。本発明においては、少なくとも反応液と希釈液が接触する瞬間を含む時間帯において、電圧パルスが印加されていることが望ましい。印加時間はごく短時間であっても希釈における結合の強化作用を期待することができる。より具体的には、 0. 5— 30秒、通常 1一 10 秒、たとえば 1一 5秒である。

[0050] 希釈液には、塩を含む溶液を用いることができる。具体的には、 50mM— 600mM の塩が添加された、生理食塩水、グリシン緩衝液、りん酸緩衝液などを用いることができる。塩としては、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウムなどを示すことができる。希釈液には、アジィ匕ナトリウムなどの防腐剤や Triton X-100などの界面活性剤、グリセリン、ショ糖などが含まれていてもよい。

[0051] 本発明におヽては、凝集塊を構成する親和性物質 (または凝集試薬)と結合パートナ一の結合反応は強化される。これは、電圧パルスによってもたらされた電界によるダイポールモーメント効果力両者の結合を強化するためと考えられる。いずれにせよ、電圧パルス印加条件下での希釈により、凝集塊の崩壊は抑制され、凝集塊を維持したまま反応液の希釈を実現できることが確認された。

[0052] あるいは、親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーとの結合を強化することができる希釈手段として、両者の結合を強化しうる結合強化剤を利用することができる。本発明において結合強化剤とは、反応液への添カ卩によって、両者の結合を強化することができる成分を言う。たとえば、蛋白質間の結合は、グルタルアルデヒドあるいはカルボジイミドなどの化合物の添カ卩によって強化される。したがつて、蛋白質抗原と抗体との免疫学的な結合は、ダルタルアルデヒドあるいはカルボジイミドなどによって強化することができる。これらの化合物は、本発明における結合強化剤として好ましい。

[0053] 結合強化剤は、親和性物質と結合パートナーの官能基に作用して両者をィ匕学的に結合する。あるいは凝集阻止反応系においては、凝集試薬と結合パートナーの間の結合を強化する。その結果、両者の結合によって形成された凝集塊が、物理的に高度な安定性を獲得する。例えば、親和性物質あるいは凝集試薬、および結合パートナ一が蛋白質であれば、分子内にはアミノ基ゃカルボシキル基がある。これらの官能基は、ダルタルアルデヒドやカルボジイミドなどの化学物質で架橋される。

[0054] 反応液中における結合強化剤の濃度は、結合強化剤の種類に応じて適宜設定することができる。より具体的には、例えばダルタルアルデヒドの場合、反応液における終濃度は、通常 0. 1— 25%、好ましくは 0. 2— 18%である。結合強化剤は、親和性物質と結合パートナーとの結合体を含む反応液の希釈前に、反応液に添加すればよい。結合強化剤の添加後の反応液は、好ましくは 37°Cで数秒一 20秒程度、好ましくは 2— 10秒、あるいは 2— 5秒のインキュベート後、希釈することができる。結合強化剤にダルタルアルデヒドあるいはカルポジイミドを用いた場合には、反応液に添加後、直ちに希釈することもできる。

[0055] 結合強化剤の添加は、本発明における希釈工程として有効である。本発明におヽては、更に、先に述べた電圧ノルス印加条件下での希釈工程に、結合強化剤を組み合わせることもできる。すなわち、反応液に結合強化剤を添加した後に、先に述べた条件に従って、電圧パルス印加条件下で、反応液を希釈することができる。あるいは、結合強化剤を添加された希釈液を利用して、先に述べた条件に従って、電圧パルス印加条件下で、反応液を希釈することもできる。両者を組み合わせることによつて、結合の強化作用が強められる。

[0056] 本発明において、反応液の希釈とは、反応液と希釈液との混合によって、反応液中における担体粒子の濃度を低下させることを言う。反応液における担体粒子の濃度は、試料の量と試薬として供給される担体粒子の量によって決定される。更に本発明においては、反応液における担体粒子の濃度は、通常、パールチェインィ匕によって担体粒子の凝集を促進することができる範囲に設定される。具体的には、反応液における担体粒子の濃度は、通常 0. 01— 5重量％、より好ましくは 0. 1— 2重量％である。これに対して、たとえば 100倍以上、通常 1000倍以上、具体的には 1000—1 00000倍、好ましくは 2000— 40000倍に希釈することができる。希釈後の担体粒子の濃度 ίま 0. 1 Χ 10—⁵—0. 005重量⁰ /₀、好ましく ίま 0. 00001— 0. 001重量⁰ /₀である

[0057] 本発明にお、て親和性物質、および親和性物質との結合活性を有する結合パートナ一とは、結合反応を構成することができるあらゆる物質の組み合わせを含む。すなわち、ある物質とある物質とが結合するとき、一方が親和性物質であり、他方は結合パートナーである。本発明における親和性物質および結合パートナーは、天然の物質であることもできるし、人工的に合成されたィ匕合物であってもよい。また親和性物質および結合パートナーは、精製された物質であることもできるし、不純物の共存も許容される。更に、親和性物質および結合パートナーは、細胞やウィルスの表面に存在していてもよい。

[0058] 本発明において、親和性物質と結合パートナーとの結合反応の例として、たとえば次のような反応を示すことができる。これらの反応を構成する物質は、いずれも本発明における親和性物質または結合パートナーとすることができる。

抗原またはハプテンと抗体との反応 (免疫反応）

相補的な塩基配列を有する核酸間のハイブリダィゼーシヨン

レクチンとそのレセプターとの反応

レクチンと糖鎖の反応

リガンドとレセプターの反応

DNAと転写調節因子の反応

[0059] 上記結合反応の中で、本発明における好ましい結合反応として、たとえば免疫反応を示すことができる。免疫反応を構成する抗原として、次のような物質を示すことができる。

腫瘍マーカー：

AFPゝ CEA、 CA19— 9、 PSA等

凝固線溶糸マーカー：

プロテイン C、プロテイン S、アンチトロンビン（AT) III、 FDP、 FDP— D—ダイマー等感染症マーカー：

CRPゝ ASO、 HBs抗原等

ホノレモン：

甲状腺刺激ホルモン (TSH)、プロラクチン、インシュリン等

組織成分：ミオグロビン、ミオシン、ヘモグロビン等

その他：

DNA等の核酸など

[0060] これらの抗原は、抗原分子そのもののみならず、その断片や、細胞表面に存在した状態であっても良い。なおこれらの物質は抗原物質の例であり、これら以外の抗原物質に本発明を応用できることは言うまでも無い。たとえば、ラテックス、血球等を担体として使用する免疫学的凝集反応に基づく測定が可能な抗原性物質は、いずれも本発明における親和性物質とすることができる。

[0061] 抗原性物質とそれを認識する抗体は、 V、ずれかを親和性物質として、そして他方を結合パートナーとして利用することができる。本発明において親和性物質とは、当該物質を測定対象とするときに、親和性物質と呼ぶ。他方、結合パートナーとは、親和性物質を測定するためにプローブとして利用することができる、当該親和性物質に対する結合活性を有する物質を言う。したがって、抗原を測定するときには、抗体を結合パートナーとして利用することができる。逆に、抗体を測定するときには、該抗体が認識する抗原を結合パートナーとして利用することができる。たとえば、ラテックス、血球等を担体として使用する免疫学的凝集反応に基づく測定が可能な抗体は、いずれも本発明における親和性物質とすることができる。 HBs (B型肝炎ウィルス表面抗原）、 HBc (B型肝炎ウィルスコア抗原）、 HCV (C型肝炎）、 HIV (AIDSウィルス）、 T P (梅毒)等に対する抗体が、免疫学的凝集反応によって測定されて、る。

[0062] 親和性物質と結合パートナーとの反応を担体粒子の凝集を指標として測定するためのいくつかの反応原理が公知である。これらの反応原理は、いずれも本発明に応用することができる。以下に担体粒子の凝集を指標とする、親和性物質と結合パートナ一との反応を利用した測定原理を例示する。

[0063] 直接凝集反応：

測定対象物質と担体粒子上の結合パートナーとの反応による、担体粒子の凝集が検出される。たとえば、抗原分子を結合パートナーである抗体によって測定する場合力この原理に含まれる。あるいは逆に、抗原を結合した担体粒子の凝集を指標として、親和性物質である抗体を測定する場合も、この原理に含まれる。直接凝集反応においては、通常、凝集粒子のレベルと測定対象物質である親和性物質の量は正比例する。直接凝集反応においては、通常、凝集のレベルと測定対象物質である親和性物質の量は正比例する。すなわち、凝集塊の形成レベルが高いときには、親和性物質のレベル (すなわち濃度）が高い。逆に、凝集塊を形成しな力つた担体粒子のレベルが高いときには、親和性物質のレベル (すなわち濃度）は低い。

[0064] 凝集阻止反応：

ハプテンと呼ばれる低分子抗原は、担体粒子の凝集に必要な抗原を介した架橋構造を作りにくい。そのため、直接凝集反応の原理ではハプテンを検出することができない。そこで、複数分子のハプテンまたはそのェピトープを含む断片を担体に結合したポリハプテンと、担体粒子上の抗体との結合による凝集反応が利用される。ポリノヽプテンは、複数の抗体分子を架橋することができるので、担体粒子を凝集させる。しかしノヽプテンが存在すると、ポリハプテンと抗体との反応が阻止され、担体粒子の凝集が阻止される。凝集阻止のレベルは、ハプテンの存在と正比例する。言い換えれば、測定対象物質の量と、凝集反応のレベルは逆比例する。すなわち、凝集塊の形成レベルが高いときには、親和性物質のレベル (すなわち濃度）が低い。逆に、凝集塊を形成しな力つた担体粒子のレベルが高いときには、親和性物質のレベル (すなわち濃度）は高い。

[0065] ハプテンに分類される測定対象抗原には、以下のような成分が挙げられる。

ホノレモン：

エストロゲン、ェストラジオ一ノレ

薬剤：

テオフィリン

[0066] 本発明にお、てハプテンを凝集阻止反応の原理に基づ!/、て測定するためには、ハプテンに対する抗体を結合した担体粒子を凝集させることができる成分が必要である。ハプテンに対する抗体を結合した担体粒子を凝集させることができる成分を、本発明においては凝集試薬と言う。凝集試薬は、抗体との特異的な親和性を有し、かつ抗体との結合によって担体粒子を架橋する作用を有する試薬と定義される。先に述べたポリハプテンは、ハプテンの測定において凝集試薬として用いることができる。

[0067] 直接凝集反応であれ、凝集阻止反応であれ、予め一定量の親和性物質を含む標準試料にっヽて同じ反応系で測定して、凝集塊ある!/、は凝集しなカゝつた担体粒子のレベルを測定して標準曲線、または回帰式を作成しておくことができる。試料の測定によって得られた凝集塊の形成レベルおよび凝集しなかった担体粒子のレベルのいずれかを、標準曲線あるいは回帰式に適用すれば、試料中の親和性物質のレベルを決定することができる。

[0068] 本発明において、結合パートナーは、担体粒子に結合して用いられる。本発明の担体粒子としては、ラテックス粒子、カオリン、金コロイド、赤血球細胞、ゼラチン、リポソーム等が挙げられる。ラテックス粒子としては、凝集反応において一般に用いられているものが使用できる。ポリスチレン系ラテックス、ポリビュルトルエン系ラテックス、ポリメタタリレート系のラテックス粒子が公知である。好ましい粒子担体はポリスチレン系ラテックス粒子である。官能基を有するモノマーの共重合によって、ラテックス粒子表面に官能基を導入したラテックス粒子を用いることもできる。たとえば、カルボキシル基ー COOH、水酸基 OH、アミノ基ー NH 、スルホン基 SO等の官能基を有する

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ラテックス粒子が公知である。官能基を有するラテックス粒子には、結合パートナーを化学的〖こ結合させることができる。

[0069] 担体粒子の平均粒径は、例えばラテックス粒子の場合、具体的には 0. 5— 10 m 、さらに好ましくは 1一 10 mであり、最も好ましくは 2— 5 mである。また、誘電分極が大きい楕円形粒子を用いることにより、より小さい担体粒子を使用することもできる

[0070] このように、公知のラテックス凝集比濁法における担体粒子が 0. 05-0. 6 μ mであるのと比べ、本発明の方法においては 1 μ m以上の大きなサイズの粒子を利用することができる。電圧パルスを印加する工程の利用によって凝集反応が促進される結果、大きなサイズの粒子であっても短時間で十分な反応が進行するためである。担体粒子が大きいことは、以下のような利点につながる。まず、粒子を計測するためのアバ一チヤ一サイズを大きくすることができる。その結果、アパーチャ一が詰まりに《なる。また、担体粒子が大きくなることによって、体液に含まれる測定妨害物質との識別が容易になる。その結果、測定精度が向上する。一方、画像情報を取り込む計数手段を用いる方法など、その他の計数手段にぉ、ても装置設計が容易になる。

[0071] 本発明において、担体粒子としてラテックス粒子に代えて他の粒子を用いる場合にも、ラテックス粒子と同様のサイズの粒子を利用することができる。たとえば、カオリン、金コロイド、ゼラチン、あるいはリボソーム等の粒子を担体粒子に用いる場合に、担体粒子の平均粒径は好ましくは 0. 3— 20 mである。

[0072] 結合パートナーと粒子担体は、それぞれの素材に応じた方法によって結合させることができる。当業者は、両者の結合方法を適宜選択することができる。たとえばラテツタス粒子には、抗原や抗体、あるいはそれらの断片などの蛋白質を物理吸着することができる。表面に官能基を有するラテックス粒子においては、当該官能基との共有結合が可能な置換基をィ匕学的に結合させることができる。たとえば、カルボキシル基 C OOHを有するラテックスには、蛋白質のアミノ基ー NHを結合させることができる。

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[0073] 結合パートナーを結合させた担体粒子は、必要に応じてブロッキングすることができる。具体的には、担体粒子表面を不活性蛋白質で処理することによって、担体粒子表面に対する非特異的な蛋白質の結合を防止することができる。不活性蛋白質としては、ゥシ血清アルブミンや脱脂粉乳などを用いることができる。更に、担体粒子の分散性を向上させるために、分散媒に界面活性剤や糖類を加えることができる。また、微生物の繁殖を防ぐために、粒子担体に抗菌剤を添加することもできる。

[0074] 本発明は、親和性物質と結合パートナーを結合した担体粒子を含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む。反応液に電圧パルスを印加して、凝集反応を行わせる方法は公知である（特開平 7-83928号)。電圧パルスの印加によって担体粒子が電界に沿って整列し、親和性物質と担体粒子上の結合パートナーとの結合反応が促進される。

[0075] このとき、凝集阻止反応の原理を利用する場合には、親和性物質と担体粒子は、凝集試薬の共存下で整列させられる。凝集試薬は、担体粒子と測定対象親和性物質との接触の後に接触させることができる。あるいは予め測定対象親和性物質と凝集試薬を混合した後に担体粒子を添加することによって、 3つの成分を同時に接触させることができる。そして、凝集試薬と結合パートナーとの反応によって凝集塊が形成され、親和性物質は両者の結合を阻害する。

[0076] 電圧パルスには交流成分、または直流成分を利用することができる。両者を任意に組み合わせることもできる。反応液は電気分解を起こしやす！、ので交流電圧が好ましい。交流電圧には、方形波、矩形波、あるいは正弦波等を用いることができる。反応液 (試薬)のイオン強度により、交流電圧の電源周波数を任意に設定することができる。交流電圧は波高値で示したとき、 5— 50V/mmの電解強度が得られるように印加する。電解強度が 5V/mmよりも小さいと担体のパールチェインィ匕が起こりにくぐした力て凝集反応の促進が不十分となる。電解強度が 50V/mmを超えると反応液の電気分解が起こりやすぐ凝集反応の測定が困難となる。より好ましくは 10— 20V/mm の電界強度が得られるように印加する。交流の周波数は ΙΟΚΗζ— 10MHzの周波数が好まし!/、。より好ましくは 50KHz— 1MHzの周波数である。

[0077] 本発明にお、て、電圧パルスとは通常、定常状態力も振幅が遷移し、有限の時間だけ持続してもとの状態にもどる波または波形を有する電圧をいう。交流電圧は、代表的な電圧ノルスである。交流電圧は電圧の平均値が 0であるような時間の周期関数である。たとえば正弦波、矩形波、方形波、あるいはのこぎり波などを有する電圧は明らかに振幅が周期的であり、交流電圧に含まれる。一般に、交流電圧においては、任意の 1周期において、正電位側の面積と負電位側の面積は等しぐ両者の合計は 0となる。各面積は、横軸 (電位差が 0)と上側の曲線、あるいは下側の曲線によつて規定される面積である。本発明においては、反応液の電気分解を防ぐために、電圧パルスが印加される。したがって、反応液の電気分解が起こらない、あるいは起きたとしても実質的に反応に干渉しないレベルに抑制できる場合には、正電位と負電位の合計が 0でな!/、電圧パルスを用いることもできる。

[0078] 本発明にお、て、方形波、あるいは矩形波の電圧ノルスは、正電位 Z電位差 OZ 負電位を繰り返し、かつ正電位および負電位の少なくとも一方は、電圧が一定の状態を含む電源を言う。そして方形波、あるいは矩形波の、電位差が 0の状態から次の 0の状態に至る間の時間がパルス幅である。なお方形波とは、縦軸を電圧、横軸を時間とするグラフに電圧の変化を描いたときに、ほぼ四角形の形状となる電圧ノルスを言う。四角形には、正方形と長方形が含まれる。これに対して矩形波は、正方形を含まない長方形の形状の電圧パルスである。したがって、矩形波は方形波に含まれる。本発明において、好ましいパルス幅は、通常 50 sec以下である。好ましいパルス幅として、 0. 1— 10 μ secを例示することができる。

[0079] 方形波あるいは矩形波を構成する電位差力^の状態の時間は、制限されない。一般的には電位差が 0となるのは、正電位と負電位の間の移行の瞬間である。しかし、電位差が 0の状態がより長、時間継続するような電圧パルスを本発明に用いることもできる。たとえば、 0. 1一 10 secのパルス幅を有する正電位 Z負電位の繰り返しの間に、 0. 1— 100 secの電位差が 0の状態を含むことができる。

[0080] 本発明において、工程 (1)または (1')の反応液に電圧パルスを印加する回数は制限されない。すなわち、 1回以上、たとえば 1一 20回、通常 1一 10回、あるいは 1一 5回、断続的に電圧パルスを印加することができる。断続的な印加によって、担体粒子の分散と整列が繰り返される。その結果、担体粒子上の結合パートナーと親和性物質、あるいは凝集試薬との接触の機会が増える。すなわち、断続的な電圧パルスの印加によって反応促進効果が期待できる。本発明において、電圧パルスを複数回印加するとき、反応液に対して異なる方向から電圧パルスを印加することができる。具体的には、複数組の電極を反応液内に配置し、通電する電極を変えることによって、反応液に対して異なる方向の電圧パルスを与えることができる。あるいは、反応液内の電極を移動させ、電圧パルスの方向を変化させることもできる。電極を固定し、反応液を収容した空間を動かすことによって、同様の効果を得ることもできる。

[0081] 更に複数回の電圧パルスの印加の間に、担体粒子を分散させることもできる。分散工程を介在させることによって、結合パートナーと親和性物質、あるいは凝集試薬との接触の機会を、更に増カロさせる効果が期待できる。反応液の攪拌、振とう、あるいは反応液に振動を与えることにより、電圧パルスの印加の間に担体粒子を分散させることがでさる。

[0082] 一般に、反応系中の担体粒子の濃度が高、ほどパールチェインが形成されやす!/ヽので凝集が促進される。しかし一方で、担体粒子の濃度の上昇に伴って、生物学的特異的反応性物質が存在しなヽ場合に再分散したときの担体粒子の凝集率 (バックグラウンド)が大きくなる傾向があった。 2次元の情報に基づいて凝集粒子を観察してした公知の方法 (特開平 7— 83928号）においては、担体粒子濃度が高いほど、凝集して、な、粒子を誤って凝集粒子として捉えてしまう可能性が高まる。粒子濃度が高い場合には、粒子が接近するためため、単なる粒子の重なりと、凝集によって形成された粒子塊との識別が困難となるのである。したがって凝集塊を特異的に識別するためには、粒子濃度を低く保つ必要がある。具体的には、特開平 7— 83928号に開示された反応系中の担体粒子の濃度は、例えばラテックス粒子の場合、好ましくは 0 . 01— 1重量％、より好ましくは 0. 025-0. 5重量％、最も好ましい濃度は 0. 05— 0. 1重量％である。このような粒子濃度は、パールチェインィ匕においては、必ずしも最適な条件とは言えない。すなわち 2次元の情報に基づいて凝集塊を計数する手法においては、粒子濃度を犠牲にすることによって、凝集塊の特異的な識別を実現していた。

[0083] 本発明は、三次元の情報に基づいて凝集粒子が計測されるため、粒子濃度とは無関係に凝集塊を特異的に識別することができる。その結果、パールチェインの形成に最適な条件を与えることができる。すなわち、測定対象親和性物質と結合活性を有する結合パートナーとのノ《ランスを考慮して担体粒子の濃度を決定することができる。たとえ高い担体粒子濃度が選択されても、凝集塊は特異的に検出される。本発明においては、通常、反応系中の担体粒子の濃度は、例えばラテックス粒子の場合、好ましくは 0. 01— 5重量％、より好ましくは 0. 1— 2重量％である。この濃度範囲は、 2次元の情報に基づく方法の、 2倍一 10倍である。最適な担体粒子の濃度は、担体粒子の大きさや測定対象親和性物質の測定感度等に合わせて適宜調節することができる。

[0084] 本発明にお、て、反応液には凝集反応を促進する塩を添加することができる。たとえば、 lOmM以上の比較的高い濃度で塩を添加することにより、凝集反応を促進することができる。ただし塩の濃度が反応系中に 600mM以上の濃度で存在すると反応液の電気分解が起こり易くなるので好ましくない。より好ましい塩の濃度は 10— 300mM 、最も好ましい塩の濃度は 25— 150mMである。生体試料自身が凝集反応を促進する塩を含有している可能性がある場合には、反応液中の最終塩濃度が上記の範囲に入るように試薬の塩濃度を調整すると良ヽ。なお電圧パルスとして直流成分を用いる場合では約 6mMの塩濃度の反応液でも電気分解が起こるため、塩の存在下では生物学的特異的凝集反応の測定は困難である。

[0085] 本発明における塩は、生物学的特異的凝集反応を促進するものの中から選択され得る。例えば、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、塩化アンモニゥムが挙げられるがこれに限定されるものではない。モル電気伝導度が 10mM、

25°Cの水溶液において 100«η²/( Ω 'πιοΐ)以上の値を示す塩は、本発明に用いる塩として好ましい。より具体的には、例えば塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、および塩化ァンモニゥム等を好まし、塩として示すことができる。

[0086] 測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合した該反応液に電圧パルスを印加してパールチエイン化することにより、特異的な反応によって凝集塊が形成され、電圧パルスを停止してもこれらの再分散はおこらない。しかし、比較的強度の物理的な外力が加わると凝集塊が崩壊することがあり、正確な測定ができない。本発明はまた、この特異的な反応により形成された凝集塊を安定化するため、これを形成する担体粒子に付着するタンパクの官能基に対して、更にこれらをィ匕学的な結合で補強することを特徴とする。本発明による操作は担体粒子を希釈する前の工程で実施することが好ま Uヽ。

[0087] 本発明において、親和性物質を含む検体は制限されない。すなわち、測定対象である親和性物質を含む任意の試料を検体として利用することができる。たとえば、血液試料、咽頭などの局所力採取された試料、唾液、喀痰、尿、あるいは便は代表的な生体試料である。その他、生体カゝら採取されるあらゆる生体材料は、生体物質測定用の検体として本発明に利用することができる。更に、これらの生体試料を培養すること〖こよって得ることができる培養物も、本発明の検体として利用することができる。生体材料は、そのまま、あるいは必要に応じて処理した後に、検体とすることができる。たとえば、生体材料は分画、希釈、溶解、抽出などの処理を経て、検体とすることができる。

[0088] 本発明において検体は原液でもよぐ又は自動希釈して測定に使用される。希釈倍率は任意に設定することが可能である。反応に必要な試薬が複数種類となるときには、 2試薬以上を順次に添加することも可能である。 [0089] ここで言う 2試薬を構成する試薬としては、たとえば以下のような試薬を示すことができる。

[0090] 本発明において、非特異反応の原因となる物質を、予め分解、および Zまたは吸収するための試薬を用いることができる。このような試薬は、非特異抑制剤を含む試薬として有用である。非特異抑制剤を含む試薬は、担体粒子を含む試薬と組み合わされて、 2試薬を構成する。非特異抑制剤を含む試薬は、たとえば、予め検体と混合することができる。非特異抑制剤は、例えば、従来周知のものを使用することができる

[0091] ィムノアッセィにおいて、非特異反応の原因となるさまざまな物質が試料中に含まれることが明らかにされている。たとえば、リュウマチ因子などのグロブリン類は、ィムノアツセィを構成する免疫反応に干渉することがある。グロブリン類のィムノアツセィへの干渉を防止するために非特異抑制剤が用いられる。たとえば、グロブリン類を認識する抗体によって、その非特異作用を吸収することができる。リュウマチ因子は IgGや IgM由来のグロブリンである。したがって、抗ヒト IgG抗体、あるいは抗ヒト IgM抗体を使用して、リュウマチ因子を吸収することができる。また、非特異原因物質の分解によつて干渉を防ぐ方法も公知である。具体的には、グロブリン類を還元によって分解し、その干渉作用を抑制できることが知られている。グロブリン類は、ジチオスレィトール、あるいは 2-メルカプトエタノールなどによって還元される。

[0092] また、異なる結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子を含む試薬を 2 種類以上組み合わせることができる。このような構成によって、異なる種類の測定対象親和性物質を同時に測定することができる。各試薬は、それぞれ個別に添加することができる。あるいは、予め複数の試薬を混合した後に、検体と混合することもできる。

[0093] 検体と試薬は電圧を印加する前に予め混合しておくことが望ましい。攪拌子を使つて物理的に両者を混合することができる。あるいは電気的な方法によって、両者を混合することもできる。電気的な手法としては、異なる方向の電圧ノルスの断続的な印加によって、担体粒子の位置を物理的に動かす方法を例示することができる。

[0094] 本発明の測定方法を構成する各工程を以下に具体的に説明する。試料とともに必要な成分を混合した反応液は、電極配置した槽に移動して、電圧パルスを印加される。電圧パルスの印加前に、予め反応液をインキュベートする場合には、電極を備えた槽に移動後、および移動前の両方、またはいずれかの段階で、インキュベートされる。電場をかけると担体粒子は誘電分極を起こして静電的に引き合い直鎖状に並ぶ。この現象は、パールチェインィ匕と呼ばれている。その後電場を停止すると直鎖に並んで!、た担体粒子は瞬時に再分散する。一方パールチェインィ匕の際に親和性物質を介して結合パートナー同士が結合すると、担体粒子は電場を停止後も分散せずに凝集塊を形成したままの状態で存在する。こうして形成された凝集塊および凝集しな力つた担体粒子の両方、またはいずれかを測定することにより親和性物質の存在を検出又は測定することができる。

[0095] 本発明の測定方法は、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しな力つた担体粒子のいずれかまたは両方を、指標として計数することを特徴とする。本発明において、粒子は電場を停止後に測定することができる。あるいは電場に置かれた粒子を、電場を停止することなく測定することもできる。たとえば、電場に置かれた粒子は、電場の中力も取り出すことによって計数することができる。更に、粒子の計数前に、粒子を分散させる工程を実施することができる。計数前の分散工程によって、非特異的な要因によって凝集した粒子を分散させることができる。その結果、測定精度の向上が期待できる。粒子は、攪拌や反応液の希釈によって分散させられる。

[0096] 凝集した単体粒子を計数するために、公知の方法を利用することができる。たとえば二次元情報に基づ、て凝集のレベルを決定する方法が公知である。すなわち反応液の顕微鏡画像をスキャンし、単位面積あたりに占める凝集塊と非凝集粒子のヽずれか、または両方が計数される。

[0097] あるいは本発明におヽては、担体粒子を、三次元情報を指標として計数することもできる。本発明において、三次元情報を指標とする計数とは、粒子および Zまたは凝集塊の三次元情報を測定し、その結果に基づ、て粒子および Zまたは凝集塊を計数することを言う。三次元情報に基づく担体粒子の計数は、本発明における計数方法として好ましい。 [0098] 三次元情報を測定するための方法は限定されな!、。また、本発明における計数とは、粒子および Zまたは凝集塊の数を求めることを言う。粒子および Zまたは凝集塊の数は、単に数のみを測定することもできる。あるいは凝集した粒子を、凝集していない粒子と区別して測定することもできる。更に、凝集した粒子については、凝集した粒子の数ごとに、その凝集塊の数を測定することもできる。三次元情報を指標として粒子を計数するためのいくつかの方法が公知である。

[0099] 本発明に利用することができる粒子の計数方法は、物理的な原理に基づく測定方法が有利である。本発明において物理的な測定方法とは、粒子または凝集塊に固有の物理的な情報を評価することができる測定方法を言う。粒子または凝集塊に固有の物理的な情報は、真の測定結果と言い換えることもできる。これに対して画像情報力取得される二次元情報を解析する方法は、実際には凝集していない粒子の重なりを凝集塊として検出してしまう。このような検出結果は、粒子に固有の物理的な情報とは言えない。

[0100] 粒子または凝集塊を物理的に測定するには、フローシステムの利用が有利である。

フローシステムは、微細なフローセル中を通過する粒子の物理的な情報を解析することができるシステムである。フローシステムを利用することにより、容易に物理的な測定を実施することができる。すなわち本発明における物理的な測定とは、フローシステムによって粒子および凝集塊のいずれかまたは両方の三次元情報を測定し計数する工程を含む。三次元情報を指標として粒子を物理的に計数するための方法として、たとえば、コールター原理またはレーザー回析散乱法を示すことができる。

[0101] コールター原理（USPA2656508, 1953年）とは、アパーチャ一（細孔）の両側に電極を置き、アパーチャ一内を通過する粒子による電気抵抗の変化に基づいて粒子の体積を検出する解析方法である。電解液を通して両電極間に微小電流を流したとき、電解液中に懸濁した粒子が吸引されてアパーチャ一を通過すると、粒子体積に相当する電解液が粒子によって置換される。その結果、両電極間の電気抵抗に変化を生じるので、この変化を測定することにより、粒子の計数とサイズ (体積)を測定することができる。体積を検出する方法として静電容量法があるが、実用化されているものは電気抵抗法がほとんどである。 [0102] アパーチャ一サイズは、解析対象となる粒子に合わせて適宜調節することができる。一般的な免疫学的な粒子凝集反反応に用いられる担体粒子の凝集を検出する場合、アパーチャ一サイズとしては、通常 30— 1000 μ m、好ましくは 50— 200 μ mを示すことができる。

[0103] アパーチャ一サイズは、担体粒子の平均粒径に対して数倍一数百倍、たとえば数倍一 100倍、好ましくは 5倍一 50倍とするのが有利である。この場合、体積に比例したシグナルが検出でき、精度のよい高感度な測定が実現できる。粒子径に対してァパーチヤーサイズの倍率は小さい方が感度はよくなるが、小さすぎると粒子が詰まりやすくなり、大きすぎると粒子の検出感度が低下するので好ましくな、。

[0104] より具体的には、たとえば粒子径が 1一 5 μ m、特に 2— 3 μ mの担体粒子を計数する場合、アパーチャ一サイズは 30— 100 μ m、好ましくは 50— 80 μ m、たとえば 65— 75 μ mの範囲力も選択することができる。 2-3 μ mの担体粒子は、本発明による親和性物質の測定方法にぉ、て、特に好ま、粒子サイズとして挙げることができる。すなわち本発明は、以下の工程を含む親和性物質の測定方法を提供する。

(1)測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した平均粒径 2— 3 μ mを有する担体粒子と、測定対象親和性物質とを混合し、電圧パルスを印加する工程、または

(1')測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した平均粒径 2— 3 μ mを有する担体粒子と、測定対象親和性物質とを、凝集試薬成分と混合し、電圧ノルスを印加する工程であって、前記担体粒子は凝集試薬によって凝集し、かつ測定対象親和性物質によってその凝集は阻害される工程

(2)工程 (1)の後に、測定対象である親和性物質との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質と結合せず凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子のいずれかまたは両方を、 50— 80 μ mのアパーチャ一サイズを有するコールター原理によって、その三次元情報を指標として計数する工程、または

(2')工程 (1')の後に、凝集試薬との結合によって形成された担体粒子の凝集塊、および測定対象である親和性物質との結合によって凝集を阻害された担体粒子のいずれかまたは両方を、 50— 80 μ mのアパーチャ一サイズを有するコールター原理によつて、その三次元情報を指標として計数する工程、および

(3)工程 (2)または (2')の後に、凝集塊の形成レベル、および凝集塊を形成しなかつた担体粒子のレベルの、ずれか、または両方に基づ!/、て測定対象物質のレベルを決定する工程

[0105] 一般にアパーチャ一サイズが小さ、方が、非凝集粒子をより正確に計数することができる。反対にアパーチャ一サイズを大きくすることによって、凝集粒子がアパーチャ一に詰まりに《なる。アパーチャ一の詰まりは解析効率の低下の原因となる。詰まる頻度を低くすることが、解析効率の向上につながる。たとえば、凝集粒子が多量に生成することが予測される場合には、アパーチャ一サイズを大きめに設定することによつて、アパーチャ一の詰まりを防止することができる。あるいは、粒子径の小さい担体粒子を用いることで同様の効果を期待することができる。更に、試料の希釈によって凝集粒子の割合を低下させ、アパーチャ一の詰まりを防止することもできる。通常は、期待される検出感度、予想される検出対象物質の濃度、そして機器構成 (特にァパーチヤ一サイズ）に応じて、それぞれ適切な条件を選択すればよい。

[0106] このようにして凝集粒子を計数することによって、凝集粒子の割合を知ることができる。凝集粒子の割合とは、計数した全粒子に占める凝集した粒子の割合を言う。また凝集粒子の割合を、凝集率 (agglutination ratio)と言う。更に、予め濃度がわ力つている標準試料について、凝集率を求め、両者の関係をグラフにプロットすることによって、標準曲線を得ることができる。これに対して、検体の凝集率を照合すれば、検体に含まれる測定対象親和性物質の濃度を明らかにすることができる。

[0107] あるいは前記標準曲線を回帰式として表すこともできる。回帰式が得られれば、凝集率を回帰式に代入することによって、測定対象親和性物質の濃度を算出することちでさる。

[0108] 一方レーザー回析散乱法とは、粒子にレーザーを照射した際に生じる揺らぎを検出することにより粒子の計数と平均径を測定するものである。いずれの場合も、測定精度を高めるために、粒子の誤測定を抑制する目的として、反応粒子を希釈、超音波の印加又は Z及びシースフォロー方式などを用いることが好ましい。

[0109] その他にも以下のような方法を、粒子体積の測定方法として示すことができる。遠心沈降法:液中における粒子の沈降速度と粒径の関係を示すスト一タスの式により粒径分布を測定する方法。（光透過式遠心沈降法では、スト一タスの法則を適用し、同じ比重の粒子ならば大粒のものの方が小粒のものよりも早く沈降することを利用する。その時の粒子濃度を光透過による濁度変化として解析し、粒度分布を求めることができる。 )

キヤピラリー方式:キヤビラリ一中を流れる粘性流体のレイノルズ数力 S小さい場合、そこにはポアズイユの流体が発生する。この流れはキヤピラリー中央ほど速ぐ管壁ほど遅いため、大きな粒子は平均的に速い流束中を、小さい粒子は平均的に遅い流束中を流れて行くことになる。つまり粒子は一定長のキヤビラリ一中を流れる際、この移動速度の違いにより、サイズ別に分離され検出される。

三次元的画像解析:異なる方向から撮影した複数の画像情報を解析し、粒子の三次元情報を求めることができる。あるいは xy平面の画像情報を z軸方向へスキャンすることにより、粒子の三次元情報を求めることができる。

[0110] 本発明の測定方法においては、凝集した (またはしな力つた)担体粒子が計数される。計数の結果によって、測定対象である親和性物質が定性的に、または定量的に測定される。定性的な測定においては、凝集粒子の存在は、測定対象である親和性物質の存在を意味する。あるいは凝集阻止反応の場合には、凝集の阻止が検出されたときに、測定対象の存在が証明される。

[0111] また定量的な測定においては、凝集のレベルを測定対象である親和性物質の量と関連付けることができる。より具体的には、予め親和性物質の量が明らかな試料について本発明の測定方法を行い、凝集粒子の検出結果と親和性物質の量の関係を明らかにしておく。次に、試料について同様の測定を行い、堆積に基づく凝集粒子の検出結果から、親和性物質の量を明らかにすることができる。凝集阻止反応の場合であっても、同様にして定量的な測定が可能である。

[0112] 粒子および Zまたは凝集塊の計数方法としては、一定の粒子数をカウントする手段においては、 2個以上に凝集した粒子数 Z総粒子数や単粒子数 Z総粒子数など目的に合わせて演算式を選ぶことができる。総粒子数とは、ある計測時間内に計測された全ての粒子の数であっても良いし、反応液の全量を解析の対象とする場合には、文字どおり、反応液に含まれる粒子の総数とすることもできる。反応液に含まれる粒子の総数は、反応液の全容量が明らかな場合には、その一部を計数することによつて、近似的に算出することもできる。

[0113] あるいは、電気抵抗法やレーザー回析散乱法などによって、一定時間あたりに検出された粒子および Zまたは凝集塊の数に基づ、て、親和性物質を検出または測定することができる。つまり、凝集反応により単粒子は凝集して凝集塊を形成することから、時間当たりに計数される粒子数が少なくなる。または、所定数の粒子および Z または凝集塊を計数するに要する時間を指標とすることもできる。このような計数方法を本発明に適用する場合には、それぞれ粒子および Zまたは凝集塊の数と、親和性物質の量との間の関係を、回帰式として表すことができる。抗体が感作された粒子は

、抗原の濃度に応じて、 2個以上の粒子力なる凝集塊の割合が多くなる。そして 2 個以上に凝集した粒子数 Z総粒子数で表される凝集率は、 1. 00 (100%)に収束する。

[0114] コールター原理にしろレーザー回析散乱法にしろ、粒子の三次元情報を計測する方法は、二次元的な画像データを解析する方法と比較して、簡単な機器構成によつて、高精度な解析が期待できる。既に述べたように、二次元的な画像データの解析においては、反応液の容積が制限される。これに対して三次元情報を計測する方法は、フロー式の解析手法を応用できるため、反応液の容積は制限されない。また反応空間の物理的な形状も制限されない。これらの理由により、機器構成はシンプルとなる。力!]えて、反応液量を自由に設定できることが、再現性や検出感度の向上に貢献する。

[0115] あるいは本発明は、凝集阻止反応系に応用することもできる。凝集試薬を利用する、凝集阻止反応に基づく免疫学的粒子凝集反応法の原理は既に述べた。上記工程によって、免疫学的粒子凝集反応に本発明を応用することができる。上記工程を構成する電圧パルスの印加や凝集塊の形成レベル、あるいは凝集塊を形成しなかった担体粒子のレベルの解析は、先に具体的に述べたような方法によって実施することができる。

[0116] なお凝集阻止反応の原理に基づいて本発明を実施する場合には、 2個以上の粒子が凝集した凝集塊がより多く生成される条件を選択することが望ましい。あるいは、単粒子 Z総粒子数を指標として凝集レベルを評価する方法が好ましヽ。凝集阻止反応の原理に基づく場合には、このような演算式を利用したほうが、 2個以上に凝集した粒子数 z総粒子数の演算式に基づく解析よりも、高、感度を期待できる。

[0117] 加えて本発明は、上記測定方法を実施するための装置を提供する。すなわち本発明は、特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、反応液の温度を 37°C— 90°Cに加熱するための手段を有することを特徴とする装置を提供する。

[0118] あるいは本発明は、以下の要素を含む、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質との結合を、前記担体粒子の親和性物質または凝集試薬による凝集を指標として測定するための測定装置を提供する。

la:反応液を保持するための空間、

lb:反応液の温度を 37°C— 90°Cでインキュベートするための手段、

lc:反応液に電圧パルスを印加するための手段、

Id:パルス電圧の印加時における反応液の温度を 0°C— 20°Cとするための手段、および

le:反応液に含まれる担体粒子と担体粒子の凝集塊のずれか、または両方を計数するための手段

上記要素を含む、本発明の測定装置の構成例を図 1、あるいは図 5に示した。

[0119] また本発明は、以下の要素を含む、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質との結合を、前記担体粒子の親和性物質または凝集試薬による凝集を指標として測定するための測定装置を提供する。

2 測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質を含む試料を含む反応液、または更に付加的に凝集試薬を含む反応液を保持するための空間、 2b:反応液に電圧パルスを印加するための手段、

2c:反応液を希釈するための手段、および

2d:反応液に含まれる担体粒子と担体粒子の凝集塊のヽずれか、または両方を計数するための手段

上記要素を含む、本発明の測定装置の構成例を図 11に示した。

[0120] 本発明において、要素 la及び 2a:反応液を保持するための空間は、反応液を保持するための任意の空間を利用することができる。微量の試料を反応させるためには、小容量の空間であることが有利である。たとえば 1 μ L一 10mL、好ましくは 10— 500 μ L程度の空間を利用することができる。この空間は、必要に応じて、試料や試薬の供給手段、あるいは後に述べる担体粒子の計測手段を装備することもできる。空間に収容される反応液は、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定対象である親和性物質を含む試料で構成される。あるいは凝集阻止反応系におヽては、更に凝集試薬成分が添加される。

[0121] 本発明において、要素 la:反応液を保持するための空間には、 lb:反応液の温度を 37°C— 90°Cでインキュベートするための手段が装備される。反応液を所定の温度に保持するためには、たとえば温度センサーと加熱手段を利用することができる。加熱手段としては、ヒーターやペルチェ素子を利用することができる。

[0122] 次に本発明における要素 lc及び 2b:反応液に電圧パルスを印加するための手段について説明する。電圧パルスは、反応液に接触した電極を通じて印加される。担体粒子を電場に整列されるための電極は、たとえば先に記載した先行技術文献にぉ、ても利用されている。これら公知の電極を、本発明に利用することができる。本発明の装置には、電極に電圧を供給するための電源を装備することができる。

[0123] 本発明の装置における電圧パルスを印加するための電極は、少なくとも 1組（2つ）の電極で構成される。複数の異なる方向の電圧パルスを与えるために、 3以上の電極を備えることもできる。たとえば、 3つの電極 A、 B、 Cを配置し、 A-B間、 B-C間、および A— C間の 3つの方向の電圧パルスを印加することができる。この他、 2組 (4つ )の電極を配置し、直交する電圧パルスを印加することもできる。

[0124] 更に、異なる方向の電圧パルスを印加するために、電極を駆動する機構を備えることができる。たとえば、反応液の中で電極を回転させることにより、複数の異なる方向力も電圧パルスを印加することができる。更に本発明の装置は、反応液を攪拌する手段、反応液を振とうする手段、あるいは反応液に振動を与える手段を備えることができる。これらの手段は、いずれも、複数回の電圧ノルスの間に担体粒子を分散させるための手段として有用である。

[0125] 本発明の装置は、要素 2c:反応液を希釈するための手段を有する。本発明において、反応液を希釈する手段を、以下、希釈手段と記載することがある。希釈手段は、たとえば、希釈液を保持し、反応液の少なくとも一部を採取して、希釈液と混合するための機構によって構成される。また希釈手段は、所定の希釈倍数を与える希釈液を収容できる空間から構成される。本発明における希釈倍数は、たとえば 100倍以上、通常 1000倍以上、具体的には 1000— 100000倍、好まし <は 2000— 40000倍である。

[0126] 本発明の希釈手段は、好ましくは、凝集塊を形成している結合を強化することができる機構を備えることが望ましい。具体的には、電圧パルス印加条件下で、反応液と希釈液を混合できる希釈手段は、本発明において好ましい希釈手段である。たとえば、前記希釈液を保持する空間に、希釈液に対して電圧パルスを印加するための電極を配置することができる。あるいは本発明における希釈手段は、反応液に結合強ィ匕剤を添加するための機構を含むことができる。これらの凝集塊を形成して、る結合を強化するための構成は、単独で、あるいは両者を組み合わせて装備することができる。

[0127] 本発明の装置は、 Id:パルス電圧の印加時における反応液の温度を 0°C— 20°Cとするための手段を備える。反応液を 0°C— 20°Cに保っための好ましい手段として、温度センサーとペルチェ素子を用いることができる。

[0128] 更に本発明の装置は、要素 le及び 2d:反応液に含まれる担体粒子と担体粒子の凝集塊のいずれか、または両方を計数するための手段を含む。該計数手段は、前記空間に装備することができる。あるいは前記空間に保持された反応液を前記空間から取り出して計数手段に導入した後に、計数することもできる。また、該計数手段は、たとえば、希釈された反応液に含まれる担体粒子を解析するための機構を含む。あるいは希釈液を保持する空間から希釈された反応液を取り出して計数手段に導入した後に、粒子を計数することもできる。担体粒子あるいは凝集塊は、二次元的な画像情報、あるいは三次元的な物理的な情報に基づいて解析することができる。

[0129] 三次元情報を指標として凝集した、またはしなかった担体粒子を計数する手段としては、コールター原理、あるいはレーザー回析散乱法を利用した計測手段を利用することができる。コールター原理のためには、たとえば前記空間内の反応液を、コールター原理のための電極を備えたアパーチャ一に導入して、必要な解析が行われる。アパーチャ一のサイズは、先に述べたような基準に基づいて、適宜調節することができる。試薬に用いる粒子径、あるいは予測される凝集粒子の割合に応じて、異なるサイズを有する複数のアパーチャ一を切り替えて利用する機構を採用することもできる。たとえば、本発明の装置は、複数のアパーチャ一に反応液を導くための流路切り替え機構を備えることができる。更に、試薬の種類や、予測される凝集粒子の割合などに基づいて、流路を自動的に選択する機構を組み合わせることもできる。あるいは、本発明の装置は、アパーチャ一サイズの切り替えによって、自動的に検出感度を調節する機構を備えることができる。検出感度の調節機構として、たとえば、まず比較的大き、アパーチャ一サイズで解析し、凝集粒子の割合が小さ 1、と予測された場合に、より小さいアパーチャ一に切り替える機構を示すことができる。レーザー回析散乱法を利用する場合も同様に、解析のための光学セルに反応液を導入して解析すればよい。三次元情報を指標とする担体粒子および Zまたは凝集塊の解析機構は、本発明における計数手段として好ま U、。

[0130] 本発明において、電場においてパールチェインィ匕された担体粒子は、必要に応じて再分散させた後に、計数することができる。本発明の装置には、担体粒子の再分散のための機構を装備することができる。担体粒子は、希釈や超音波処理によって再分散することができる。

[0131] 本発明の装置を構成する上記 (la)- (le)の要素、あるいは (2a)-(2d)の要素は、 1つの連続する流路内に配置することができる。あるいは、各要素を不連続な空間として構成し、各要素の間を反応液を移動させることによって、本発明の測定方法を実施することちでさる。 [0132] 本発明の装置には、上記測定方法を実施するための付加的な機構を組み合わせることができる。本発明の装置に組み合わせることができる付加的な機構を、以下に例示する。

試料の分取機構

試料の希釈機構

測定結果の記録機構

測定結果の表示機構

測定結果の印刷機構

なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。実施例

[0133] 実施例 1 抗原抗体反応の促進化

( 1) AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

O.lmgの抗 aフエトプロテイン (AFP)抗体（ダコ社製）を ImLのグリシン緩衝液 (50mM グリシン、 50mM塩ィ匕ナトリウム、 0.09%アジ化ナトリウム含有、以下 GBSと略す）に溶解し、 2.0 mのラテックス (積水化学工業製、固形分 1%懸濁液） ImLを加えて 37°Cで 2時間攪拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清を除去した。沈殿を 0.5% 牛血清アルブミンのグリシン緩衝液（0.5%BSA-GBS) ImLに懸濁させ、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0134] (2)測定装置

図 1 (A)の装置を使用して、親和性物質 (AFP)を抗原抗体反応によって測定した。図 1の装置は、検体と試薬 1 (緩衝液)を分注して混合し、更に試薬 2 (ラテックス試薬 )を分注して混合し、反応液とするための分注'攪拌槽 1及び温度コントロール機構 2 を備える。ただし実際には、 1試薬系の場合には試薬 1 (緩衝液)の分注は省略できる。次に反応槽 3 (パルス印加槽）に反応液を移動させ、電極 4を介して反応液に電圧パルスを数秒力も数十秒間印カロさせる。電場に置かれた担体粒子は、パールチェイン化される。電圧パルスを印加された反応液は、希釈槽 5で希釈され、粒度分布計 6を用いて担体の凝集状態が測定される。パルス印加槽の断面は、図 1 (B)に示される。電極間の距離は 0.8mm、電極の厚さは 0.03mm、電極の長さは 20mmである。

[0135] (3)検体の測定

0.5%BSA- GBSを用いて、 AFP抗原液を希釈して濃度 0、 0.0075及び 0.015ng/mLの検体液を調製した。これらの検体 3 μ Lと前述した抗 AFP抗体感作ラテックス試薬 3 μ Lを試験管にとり、混和した。 20秒間、 45°C、 62°C、 80°Cのいずれかでインキュベーシヨンした後、直ちに電極付き反応セルに注入した。（2)の装置を用いて、周波数 200KHzの交流電圧（矩形波） ± 12V/mmの電解強度で 30秒間、電圧パルスを印加した。 30秒間の印加後、直ちに電場を切り、反応液を生理食塩水に希釈してコールター ·マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

[0136] (4)対照の測定

対照 1： (3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬 3 μ Lずつを試験管にとり、 25°Cで 20秒間インキュベーションした後、電極付き反応セルに注入して、（3)と同様に高周波電圧を印加した。 25°Cのインキュベーション以外の操作は（3)の操作に従った。結果を図 2の「比較例 1」として示した。

対照 2 : (3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬 3 Lずつを試験管にとり、 37°Cで 20分間インキュベーションした。この反応液 0.5 μ Lを 20mLの生理食塩水 20mLに希釈して、（3)のようにコールター'マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定して、同様に凝集率を算出した。結果を図 2の「比較例 2」として示した。

[0137] (5)結果

各検体及び各対照の測定結果を図 2に示した。電圧パルスを印加する前の反応液を高温下 (45°C、 62°C、または 80°C)で 20秒間インキュベートした本発明の条件においては、電圧パルスを印加する前の反応液は室温 (25°C)で調製し、高温処理をしな力つた従来法 (対照 1、図 2の「比較例 1」）に比べて高い凝集率が確認された。また、パルス電圧を印加しな、一般的なラテックス凝集法にぉ、て、 37°C20分間のインキュベートを行った対照 2 (図 2の「比較例 2」 )では、 0.015pg/mLの低濃度域の反応は認められな力つた。この結果より、本発明の方法は、従来法 (パルス電圧を印加する前の温度処理なし)よりも更に高感度に測定できることが示された。

[0138] 実施例 2 抗原抗体反応の促進

( 1) AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

実施例 1と同様にして、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0139] (2)測定装置

図 1の装置を使用して、親和性物質 (抗原抗体反応)を測定した。

[0140] (3)検体の測定

0.5%BSA- GBSを用いて、 AFP抗原液を希釈して濃度 0、 0.0075及び 0.015ng/mLの検体液を調製した。これらの検体 3 μ Lと前述した抗 AFP抗体感作ラテックス試薬 3 μ Lを試験管にとり、混和した。 62°Cで 5秒、 20秒、または 180秒のいずれかの時間のィンキュベーシヨンを行った後、直ちに電極付き反応セルに注入して、前述の装置を用いて、周波数 200KHzの交流電圧（矩形波） ± 12V/mmの電解強度で 30秒間印加しパールチェインを形成させた。この 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈してコールター 'マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

[0141] (4)対照の測定

電圧パルスを印加する前に高温処理をしな、(0秒)以外は、（3)のようにして測定した

[0142] (5)結果

結果を図 3に示した。「5sec」、「20sec」、または「180sec」として示される本発明の条件 (電圧パルスを印加する前の反応液を高温下 (62°C)で 5秒、 20秒、または 180秒ィンキュペート）にお、ては、「0sec」として示される従来法 (電圧パルスを印加する前の高温処理なし）に比べて凝集率が高くなつた。すなわち本発明によって、従来法よりも更に高感度に測定できることが示された。

[0143] 実施例 3 抗原抗体反応の促進化

(1) PSA抗体感作ラテックス試薬 (試薬 2)の調製 O.lmgの抗 PSA抗体（ダコ社製）を lmLのグリシン緩衝液（50mMグリシン、 50mM塩化ナトリウム、 0.09%アジィ匕ナトリウム含有、以下 GBSと略す）に溶解し、 2.0 mのラテツタス (積水化学工業製、固形分 1%懸濁液) lmLを加えて 37°Cで 2時間攪拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清を除去した。沈殿を 0.5%牛血清アルブミンのグリシン緩衝液 (0.5%BSA-GBS) lmLに懸濁させ、抗 PSA抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0144] (2) PEG20000を含有する Tris塩酸緩衝液 (試薬 1)の調製

0.5%牛血清アルブミンの 50mM - Tris塩酸緩衝液（50mM Tris, 50mM塩化ナトリウム、 0.09%アジ化ナトリウム含有、 pH8. 4)にポリエチレングリコール（分子量 20000、以下 PEG20000と略す)を 0.1— 1.0%含有する反応促進試薬を調製した。

[0145] (3)対照の Tris塩酸緩衝液の調製

対照として、 PEG20000を含まない以外は（2)に記載の試薬と同成分の試薬を調製した。

[0146] (4)測定装置

図 1の装置を使用して、親和性物質 (抗原抗体反応)を測定した。温度コントロール機構 2は室温に設定した。

[0147] (5)検体及び対照の測定

0.5%BSA-GBSを用いて PSA抗原液を希釈して、濃度 0、及び 9.5ng/mLの検体液を調製した。これらの検体 1 μ Lと PEG20000を 0— 1.0%含有する 0.5%BSA- Tris塩酸緩衝液 3 μ Lを混和した後、前述した抗 PSA抗体感作ラテックス試薬 3 μ Lを試験管にとり、混和後、直ちに電極付き反応セルに注入した。前述の装置を用いて、周波数 200ΚΗζの交流電圧（矩形波） ± 12V/mmの電解強度で電圧パルスを 30秒間印加した。 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈してコールター •マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

[0148] (6)結果

結果を図 4に示した。図 4から、水溶性高分子化合物である PEGを用いることにより、凝集率が増加することが示された。このことから、本発明は対照法に比べ更に高感度に測定できることが示された。

[0149] 実施例 4 凝集反応の促進

(1)抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

[0150] (2)測定装置

図 5 (A)の装置を使用して、 AFPを抗原抗体反応により測定した。図 5 (A)の装置は、検体と試薬 1 (緩衝液)を分注して混合し、更に試薬 2 (ラテックス試薬)を分注して混合し、反応液とするための分注'攪拌槽及び温度コントロール機構を備える。ただし実際には、 1試薬系の場合には緩衝液の分注を省略できる。次に反応槽 2 (パルス印加槽）に反応液を移動させ、電極 3を介して電圧パルスを数秒カゝら数十秒間印加する。このとき反応槽は温度コントロールユニットにより 4°Cに冷却される。電圧パルスを印加された反応液は、希釈槽 5で希釈され、粒度分布計 6を用いて担体の凝集状態が測定される。図 5 (B)は、パルス印加槽の断面を示す図である。電極間の距離は 0.8mm、電極の厚さは 0.03mm、電極の長さは 20mmである。

[0151] (3)検体の測定

0.5%BSA- GBSを用いて、 AFP抗原液を希釈して濃度 0及び 0.0075ng/mLの検体液を調製した。これらの検体 3 μ Lと前述した抗 AFP抗体感作ラテックス試薬 3 μ Lを試験管にとり、混和し直ちに電極付き反応セルに注入した。前述の装置を用いて、周波数 200ΚΗζの交流電圧（矩形波） ± 12V/mmの電解強度で反応液に電圧パルスを 30秒間印加した。このとき、反応セルの温度は 4°Cに維持した。 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈してコ一ルター ·マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

前述の操作を同様に 5回繰り返して測定を行い、測定結果の平均値および平均値 ±2.6SDを求め、図 6に示した。

[0152] (4)対照の測定対照 1：の（3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を用いて、反応セルの温度を 22 °Cとするほかは全て (3)の操作にしたがった。結果を図 7に示した。

対照 2 : (3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬 3 Lずつを試験管にとり、 37°Cで 20分間インキュベーションした。この反応液 0.5 μ Lを 20mLの生理食塩水 20mLに希釈して、（3)のようにコールター 'マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定して、同様に凝集率を算出した。また、（3)と同様に 5回繰り返し測定を行い、その結果を図 8に示した。

[0153] (5)結果

抗原濃度が 0 ng/mLの場合の測定値 (バックグランドシグナル）が、ある濃度の抗原を測定したときの値と識別できれば、この濃度の抗原を測定することができる。測定可能な抗原濃度の最小値が、検出限界である。たとえば、次の値 Aと Bの重なりがなければ、 0.0075 ng/mL以上の抗原を検出することができる。

測定値 A：抗原量 0 ng/mLと 0.0075 ng/mLを繰り返し測定したとき、「0 ng/mLを測定した凝集率の平均値 +2.6SD

測定値 B： 0.0075 ng/mLを測定した凝集率の平均値- 2.6SD

[0154] 図 6、図 7、および図 8から各条件における検出限界を比較した。本発明の方法（図 6)の検出限界は 0.0075ng/mLであることが示された。一方、対照とした従来法（図 7 および図 8)においては、この濃度は検出できないことが示された。このことから、電圧パルスを印加中の反応液を低温に維持する本発明は、従来法に比べ非常に短時間で更に高感度に測定できることが示された。

[0155] 実施例 5 凝集反応の促進化

(1)抗 PSA抗体感作ラテックス試薬 (試薬 2)の調製

実施例 3と同様にして、抗 PSA抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0156] (2) Tris塩酸緩衝液 (試薬 1)の調製

Tris塩酸緩衝液（50mM Tris, 50mM塩化ナトリウム、 0.09%アジ化ナトリウム、 0.25% PEG20000を含有、 pH8. 4)に牛血清アルブミン（以下、 BSAと略す）を 0.5%、 2.5% 、 5%、 7.5%及び 10%含有する試薬 1をそれぞれ調製した。

[0157] (3)測定装置図 1の装置を使用して、親和性物質 (抗原抗体反応)を測定した。温度コントロール機構 2は室温に設定した。

[0158] (4)測定

0.5%BSA-GBSを用いて、 PSA抗原液を希釈して濃度 0、 9.5及び 32ng/mLの検体液を調製した。これらの検体 1 μ Lと、 0.5%、 2.5%、 5%、 7.5%、又は 10%の BSAを含む Tris緩衝液 3 μ Lを混和した後、前述した抗 PSA抗体感作ラテックス試薬 3 μ Lを加え、混和後、直ちに電極付き反応セルに注入した。前述の装置を用いて、周波数 200ΚΗζの交流電圧（矩形波） ± 12V/mmの電解強度で電圧パルスを 30秒間印加した。 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈してコールター •マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (Agglutination Ratio;AR;%)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

なお、最終反応液中の BSA濃度は、 0.5%、 1.4%、 2.4%、 3.5%、 4.6%である。ここで最終反応液中の BSA濃度 0.5%は対照として比較した。

[0159] (5)反応液の温度測定

前述の測定方法により、パールチェインを形成させたときの反応液の温度変化を測し 7こ。

[0160] (6)最終反応液の粘度測定

前述の最終反応液 (BSA濃度 0.5%— 4.6%)、 BSA濃度 0.3%及び 6.8%の反応液の 4一 52°Cでの粘度を、振動式粘度計 (ピスコメイト）を使用して測定した。

[0161] (7)結果

表 1 最終反応液中の BSA濃度印加前遮断直前

0.5% 24°C 37°C

1.4% 24°C 38°C

2.4% 25°C 37°C

3.5% 25°C 38°C 4.6% 24°C 37°C

[0162] 結果を図 9および図 10、ならびに表 1に示した。図 9に示すように、最終反応液中の BSA濃度を 0.5%から 2.4%に増加させるにつれて、各濃度の凝集率が大きくなつた。 PSA Ong/mL (ブランク）においても凝集率が上昇する傾向であったため、ブランク補正した凝集率を比較した。その結果、最終反応液中の BSA濃度を 0.5%から 2.4%に増加させることによって、顕著に凝集率が上昇することが確認された。すなわち本発明により、更に高感度化できることが示された。

[0163] 図 10から、最終反応液中の BSA濃度と粘度の関係、並びに反応液中の温度と粘度の関係が示された。まず、図 9および図 10から、パールチェイン形成中の温度制御を行わない条件下では、最終反応液中の BSA濃度を 0.5%から 2.4%に増カロさせることにより凝集率が上昇することが明らかとなった。このとき、最終反応液中の粘度は 0. 7 5力ら 0. 9mPasに増加した。すなわち、最終反応液中の粘度を 0. 75力ら 0. 9mPas に調整することによって、高感度化できることが示された。

[0164] 表 1は交流電圧を印加してパールチェインを形成させたときの反応液の温度変化を測定した結果である。印加前の反応液の温度は室温 (約 25°C)であった力印加後は約 37°Cに上昇した。一方、従来法では最終反応液中の BSA濃度は 0.5%程度であつたが、電圧パルスの印加による温度上昇により反応液の粘度は、 0. 8 mPas未満（ 0. 6—0. 75mPas)であった。以上のことから、反応液の粘度を 0. 8—0. 9mPasの条件下で交流電圧を印加することにより、更に高感度に測定できることが示された。

[0165] 更に実施例 4で示した電圧パルスを印加中の反応液の温度を低温に維持する該発明に関わる反応液の粘度は表 1から 1. 4mPasであることがわかる。これらのことから、反応液中の粘度を 0. 8— 3mPasの条件下で交流電圧を印加することにより、更に高感度に測定できることがわかる。以上の結果により、感度の向上のための好ましい粘度は 1一 3mPas、より好ましくは 1一 2mPasであることが確認された。

[0166] 実施例 6

(1)抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

O.lmgの抗 AFP抗体（ダコ社製）を lmLのグリシン緩衝液（50mMグリシン、 50mM塩化ナトリウム、 0.09%アジィ匕ナトリウム含有、以下 GBSと略す）に溶解し、 2.06 μ mのラテツタス (ポリサイエンス社製、固形分 1.0%懸濁液） ImLをカ卩えて 37°Cで 2時間攪拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清を除去した。沈殿を 0.5%牛血清アルブミンのグリシン緩衝液（0.5%BSA- GBS) ImLに懸濁させ、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0167] (2)測定装置

図 11 (A)の装置を使用して、生物学的特異的凝集反応 (抗原抗体反応)を測定した。図 11 (A)の装置は、検体と試薬 1 (緩衝液: 2試薬系の場合に適用。 1試薬系 Zラテックス試薬のみの場合は不要)を分注して混合し、更に試薬 2 (ラテックス試薬)を分注して混合するための分注 ·攪拌槽温度コントロール機構 1を備える。分注 ·攪拌槽温度コントロール機構 1にお、て反応液が混合された後、次に反応槽 (パルス印加槽 ) 3に反応液を移動させ、電極 4を介して電圧パルスを数秒カゝら数十秒間印加して、パールチェイン化させた。反応液はパールチェイン化された後、希釈 (希釈槽 5)され、粒度分布計 6を用いて担体の凝集状態を測定した。（温度コントロール機構 1及び 2は OFF設定とした。 )

希釈槽 5の概略は、図 11 (B)に示される。希釈容器 103に希釈液が分注され、対向電極 101の間に反応液が分注される。

[0168] (3)検体の測定

AFPコントロール血清 L (15.6ng/mL)、 M (125ng/mL)、 H (1000ng/mL)及びフリー血清 (Ong/mL)を検体液として測定した。検体 3 μ Lと前述した抗 AFP抗体感作ラテツタス試薬 3 Lを試験管にとり、混和し、直ちに電極付き反応セルに注入して、前述の装置を用いて、周波数 200KHzの交流電圧 (矩形波） ± 12VZmmの電解強度で 30秒間印加しパールチェインを形成させた。この 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水に希釈した。希釈は、図 1 (B)に示す装置を用いて、希釈液に電極を介して周波数 200KHzの交流電圧 (矩形波） ±0. 7Vを印加しながら反応液をカロえた後、コールター 'マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (AR)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%) [0169] (4)対照の測定

(2)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を使用した。パールチェイン形成後に反応液を希釈する工程において電場は印加せずに希釈した以外は、 (3)と同様に行つた。結果を図 12の「対照法」として示した。

[0170] (5)結果

結果を図 12に示した。 AFP lOOOng/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 53.4%に対して対照である従来法は 40.9%であった。つまり本発明の方法においては、従来法に比ベ、反応液を希釈するときに崩壊する凝集塊、すなわち特異的に凝集した担体粒子の凝集塊の崩壊を約 20%軽減することができた。また AFP Ong/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 7.4%に対して対照として従来法は 10.6%であった。 Ong/mLの試料を測定したときの凝集率は、非特異的な凝集に伴うバックグラウンドと考えることができる。つまり、本発明の方法によれば、非特異的な凝集が抑制される。以上の結果から、本発明の測定方法は、凝集率の傾きが大きく直線性が良好であることが示された。したがって、本発明によって、高感度に、かつ広い濃度範囲の測定が可能である。

[0171] 実施例 7

(1)抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

実施例 6と同様にして、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0172] (2)測定装置

図 11の装置を使用して、親和性物質 (抗原抗体反応)を測定した。

[0173] (3)検体の測定

AFPコントロール血清 L (15.6ng/mL)及びフリー血清（Ong/mL)を検体液として測定した。検体 3 μ Lと前述した抗 AFP抗体感作ラテックス試薬 3 μ Lを試験管にとり、混和し、直ちに電極付き反応セルに注入して、前述の装置を用いて、周波数 200ΚΗζの交流電圧 (矩形波） ± 12VZmmの電解強度で 30秒間印加しパールチェインを形成させた。この 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を生理食塩水 20mLに希釈した。希釈は、図 11 (B)に示す装置を用いて、希釈液に電極を介して周波数 200KHzの交流電圧 (矩形波） ±0. 7Vを印加しながら反応液を加えた後、コールター'マルチサィザーを使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (AR)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

前述の操作を同様に 5回繰り返して測定を行い、測定結果の平均値および平均値士 2SDを求めた。

[0174] (4)対照の測定

対照 1 : (3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を使用した。パールチェイン形成後に反応液を希釈する工程において電場は印加せずに希釈した以外は、（3)と同様に行った。結果を図 13の「対照法 1」として示した。

対照 2 : (3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を使用した。反応液の希釈液に予め（3)と同じ条件の電場を印カロしたものを希釈液として使用した以外は、 (3)と同様に行った。結果を図 13の「対照法 2」として示した。

[0175] (5)結果

結果を図 13に示した。 AFP 15.6ng/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 35.7%に対して対照である従来法は 32.6%であった。つまり本発明の方法においては、従来法に比ベ、反応液を希釈するときに崩壊する凝集塊、すなわち特異的に凝集した担体粒子の凝集塊の崩壊を約 10%軽減することができた。また AFP Ong/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 5.6%に対して従来法は 11.1%であった。 Ong/mLの試料を測定したときの凝集率は、非特異的な凝集に伴うバックグランドと考えることができる。つまり、本発明の方法によれば、非特異的な凝集が抑制される。さらに AFP 15.6ng/mLを 5重測定したときの CV値は、本法 1.16%に対して従来法は 4.28%であり、測定の再現性も著しく向上した。したがって、本発明によって高感度かつ高精度な測定が可能であることが示された。

[0176] 実施例 8 抗原抗体反応の促進化

(1)抗 PSA抗体感作ラテックス試薬 (試薬 2)の調製

O.lmgの抗 PSA抗体（ダコ社製）を lmLのグリシン緩衝液（50mMグリシン、 50mM塩化ナトリウム、 0.09%アジィ匕ナトリウム含有、以下 GBSと略す）に溶解し、 2.06 μ mのラテツタス (ポリサイエンス社製、固形分 1%懸濁液） lmLをカ卩えて 37°Cで 2時間攪拌した後、感作したラテックスを遠心分離して上清を除去した。沈殿を 0.5%牛血清アルブミンのグリシン緩衝液（0.5%BSA-GBS) lmLに懸濁させ、抗 PSA抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0177] (2) Tris塩酸緩衝液 (試薬 1)の調製

0.5%牛血清アルブミンの 50mM— Tris塩酸緩衝液（50mM Tris, 50mM塩化ナトリウム、 0.09%アジ化ナトリウム含有、 pH8.4)にポリエチレングリコール（分子量 20000、以下 PEG20000と略す)を 0.25%含有する反応促進試薬を調製した。

[0178] (3)測定装置

[0179] (4)検体の測定

PSAコントロール血清 L (9.5ng/mL)、 M (32ng/mL)及びフリー血清（Ong/mL)を検体液として測定した。検体 1 μ Lと前述した Tris塩酸緩衝液及び抗 PSA抗体感作ラテックス試薬 3 Lを試験管にとり、混和し、直ちに電極付き反応セルに注入して、前述の装置を用いて、周波数 200KHzの交流電圧 (矩形波） ± 12VZmmの電解強度で 30秒間印加しパールチェインを形成させた。この 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液を GBS 20mLに希釈した。このときの希釈倍率は、約 3300倍である。希釈は、図 1 KB)に示す装置を用いて、希釈液に電極を介して周波数 200KHzの交流電圧 (矩形波） ±0. 7Vを印加しながら反応液を加えた後、コールター 'マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (AR)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

[0180] (5)対照の測定

対照 1 : (4)の各検体と Tris緩衝液及び抗 PSA感作ラテックス試薬を使用した。パールチェイン形成後に反応液を希釈する工程において電場は印加せずに希釈した以外は、（4)と同様に行った。結果を図 14の「対照法 1」として示した。

対照 2 : (4)の各検体と Tris緩衝液及び抗 PSA感作ラテックス試薬を使用した。反応液の希釈液に予め（4)と同じ条件の電場を印加したものを希釈液として使用した以外は、（4)と同様に行った。結果を図 14の「対照法 2」として示した。

[0181] (6)結果結果を図 14に示した。 PSA 32ng/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 35.7%に対して対照である従来法は 30.3%であった。つまり本発明の方法においては、従来法に比べ、反応液を希釈するときに崩壊する凝集塊、すなわち特異的に凝集した担体粒子の凝集塊の崩壊を約 20%軽減することができた。また PSA Ong/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 1.73%に対して従来法は 2.45%であった。 Ong/mLの試料を測定したときの凝集率は、非特異的な凝集に伴うバックグランドと考えることができる。つまり、本発明の方法によれば、非特異的な凝集が抑制される。以上の結果から、本発明の測定方法は、凝集率の傾きが大きく直線性が良好である。したがって、本発明によって、高感度に、かつ広い濃度範囲の測定が可能であることが示された。

[0182] 実施例 9

(1)抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

実施例 6と同様にして、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。但し、 2.0 mのラテックス (積水化学工業社製)、 3 m (ポリサイエンス社製)及び 4.5 μ m (ポリサイエンス社製)を固形分 1.0%懸濁液として使用して、 3種類の抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0183] (2)測定装置

[0184] (3)検体の測定

前述した 3種類のラテックス試薬を使用して、実施例 6と同様に測定した。

[0185] (4)対照の測定

(3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を使用した。パールチェイン形成後に反応液を希釈する工程において電場は印加せずに希釈した以外は、 (3)と同様に行つた。結果を図 15、図 16、及び図 17の「対照法」として示した。

[0186] (5)結果

2.0 m、 3 m、及び 4.5 mを含むラテックス試薬を用いた結果を、それぞれ図 15 、図 16及び図 17に示した。

[0187] 2.0 mのラテックス試薬を用いた場合の AFP 15.6ng/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 35.8%に対して対照である従来法は 24.1%であり、特異的に凝集した凝集塊の崩壊を 30%軽減することができた（図 15)。また図 15において、 AFP Ong/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 5.3%に対して従来法は 8.0%であった。

[0188] 3 μ mのラテックス試薬を用いた場合の AFP 15.6ng/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 29.5%に対して対照である従来法は 23.6%であり、特異的に凝集した凝集塊の崩壊を 20%軽減することができた（図 16)。また、図 16において、 AFP Ong/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 13.6%に対して従来法は 17.8%であった。

[0189] さらに 4.5 μ mのラテックス試薬を用いた場合の AFP 15.6ng/mLの測定結果 (凝集率）は、本法 11.5%に対して対照である従来法は 3.0%であり、特異的に凝集した凝集塊の崩壊を 70%軽減することができた（図 17)。また、図 17において、 AFP Ong/mL の測定結果 (凝集率）は、本法 4.1%に対して従来法は 2.5%であった。

[0190] すなわち、本発明は従来法に比べ特異的に凝集した担体粒子の凝集塊の崩壊を軽減できることが明らかとなった。さらに、希釈の際に生じる非特異的な凝集も抑制することができた。したがって、本発明によって高感度な測定が可能であることが示された。

[0191] 実施例 10

(1)抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

2.2mgの抗 AFP抗体（ダコ社製） O.lmLと 1.716 μ mのラテックス（ポリサイエンス社製、固形分 2.5%懸濁液) 0.5mL及びカルポジイミドキット（ポリサイエンス社製）を使用し、キットのマニュアルに従って操作を行、、抗 AFP抗体とラテックス粒子とをィ匕学結合させて抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0192] (2)測定装置

[0193] (3)検体の測定

(3)検体の測定

AFPコントロール血清 H (lOOOng/mL)を検体液として測定した。検体 3 μ Lと前述した抗 AFP抗体感作ラテックス試薬 3 Lを試験管にとり、混和し、直ちに電極付き反応セルに注入して、前述の装置を用いて、周波数 200ΚΗζの交流電圧 (矩形波） ± 12V Zmmの電解強度で 30秒間印加しパールチェインを形成させた。この 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液に 0.25%— 25%ダルタルアルデヒド液（以下 GA液と略す

) 16 μ Lを加え、 37°Cで 60秒間インキュベーションした後、生理食塩水 20mLに希釈した。この反応希釈液について、コールター'マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (AR)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

次に反応希釈液の残りに超音波を 30秒、 60秒と印加した後、同様に操作して粒度分布を測定した (崩壊性過酷試験)。

[0194] (4)対照の測定

(3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を使用した。 GAを含まない生理食塩水に希釈した以外は、（3)と同様に行った。結果を図 18の「0% GA」として示した。

[0195] (5)結果

結果を図 18に示した。希釈直後の凝集率を比較すると、 GA処理を行ってから希釈したものは 21%の凝集率であったのに対し、 GA未処理では 16%と、 5%の崩壊が認められた。更に崩壊性過酷試験では、 25%GA処理では顕著に崩壊性が改善されたことが明ら力となった。以上のことから、本発明は従来法に比べ特異的に凝集した担体粒子の凝集塊の崩壊を軽減でき、高感度に測定できることが示された。

[0196] 実施例 11

(1)抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

実施例 10と同様にして、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0197] (2)測定装置

[0198] (3)検体の測定

AFPコントロール血清 H (lOOOng/mL)を検体液として測定した。検体 3 μ Lと前述した抗 AFP抗体感作ラテックス試薬 3 Lを試験管にとり、混和し、直ちに電極付き反応セルに注入して、前述の装置を用いて、周波数 200ΚΗζの交流電圧 (矩形波） ± 12V Zmmの電解強度で 30秒間印加しパールチェインを形成させた。この 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液に 25%ダルタルアルデヒド液（以下 GA液と略す） 16 L を加え、 37°Cで 0— 60秒間インキュベーションした後、生理食塩水に希釈した。この反応希釈液について、コールター'マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (AR)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

[0199] (4)対照の測定

(3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を使用した。 GAを含まない生理食塩水に希釈した以外は、（3)と同様に行った。結果を図 19の「GAなし」として示した。

[0200] (5)結果

結果を図 19に示した。希釈直後の凝集率を比較すると、 25%GA処理を行ってから希釈したものは処理時間（15秒、 30秒、 60秒）に関わらず 21%の凝集率であつたのに対し、処理時間 0秒 (混ぜた直後に希釈)では 18%、 GA未添加のものは 16%の凝集率であった。更に崩壊性過酷試験においても、 25%GA処理 (処理時間 15— 60秒）ではほぼ同等に崩壊性が改善されたことが明ら力となった。以上のことから、本発明は従来法に比べ特異的に凝集した担体粒子の凝集塊の崩壊を軽減でき、高感度に測定できることが示された。

[0201] 実施例 12

(1)抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

実施例 6と同様にして、抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。但し、 2.0 mのラテックス (積水化学工業社製)、 2.8 m (ポリサイエンス社製)及び 1. m (ポリサイエンス社製)を固形分 1.0%懸濁液として使用して、 3種類の抗 AFP抗体感作ラテックス試薬を調製した。

[0202] (2)測定装置

[0203] (3)検体の測定

前述した 3種類のラテックス試薬を使用して、実施例 11と同様に測定した。

[0204] (4)対照の測定

(3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を使用した。 GAを含まない生理食塩水に希釈した以外は、（3)と同様に行った。結果を図 20、図 21及び図 22の「対照法」として示した。

[0205] (5)結果

2.0 m、 2.8 m、及び 1.7 mを含むラテックス試薬を用いた結果を、それぞれ図 2 0、図 21及び図 22に示した。以上、図 20、図 21及び図 22から、本発明は従来法（結合強化剤を含まない希釈液）に比べ、ラテックスの粒子径を問わず、特異的に凝集した担体粒子の凝集塊の崩壊を軽減でき、高感度に測定することができることが示された。

[0206] 実施例 13 同時再現性試験

(1)抗 AFP抗体感作ラテックス試薬の調製

[0207] (2)測定装置

[0208] (3)測定方法

AFPコントロール血清 L及び Mを検体液として測定した。検体 3 /z Lと前述した抗 AFP 抗体感作ラテックス試薬 3 Lを試験管にとり、混和し、直ちに電極付き反応セルに注入して、前述の装置を用いて、周波数 200KHzの交流電圧（矩形波） ± 12VZmmの電解強度で 30秒間印加しパールチェインを形成させた。この 30秒間の印加後、直ちに電場を切り反応液にダルタルアルデヒド 25%液（以下 GA液と略す） 16 Lに加え、 37°Cで 0— 60秒間インキュベーションした後、生理食塩水に希釈した。この反応希釈液について、コールター'マルチサイザ一を使用してラテックス粒子の粒度分布を測定し、ラテックスの凝集率 (AR)を、以下の式により求めた。

AR= (2個以上に凝集した粒子数) Z (総粒子数） X 100 (%)

前述の操作を 10回繰り返して測定し再現性試験を行った。

[0209] (4)対照の測定

(3)の各検体と抗 AFP感作ラテックス試薬を使用した。 GAを含まない生理食塩水に希釈した以外は、（3)と同様に行った。結果を表 2の「対照法」として示した。

[0210] (5)結果結果を表 2に示した。本発明では同時再現性の CV値は 2%前後であつたが、対照法の CV値は 7— 11%とばらつきが大きいことが明ら力となった。以上のことから、本発明は対照法に比べ再現性良く測定することができることが示された。

[表 2]

産業上の利用可能性

本発明の測定方法、あるいは測定装置は、親和性を有するあらゆる物質の測定に有用である。具体的には、生体から採取された試料の解析によって、様々な疾患の診断に有用な情報を得ることができる。より具体的には、ホルモン、腫瘍マーカー、酵素、薬剤、感染性病原体、あるいはそれらに対する抗体は、医療機関において、日常的に測定されている。これらの測定対象成分は、いずれも本発明における親和性物質に含まれる。あるいは生体試料や食品、あるいは環境カゝら採取された試料に含まれる微生物や薬剤などを本発明によって測定、あるいは検出することもできる。

Claims

請求の範囲 [1] 次の工程を含む、親和性物質の測定方法。

(2)工程 (1)の反応液に、電圧パルスを印加する工程、

[2] 工程 (1)が、前記反応液を 37— 90°Cでインキュベートする工程である請求項 1に記載の方法。

[3] 工程 (1)が、前記反応液を 40— 90°Cでインキュベートする工程である請求項 2に記載の方法。

[4] 前記反応液中に水溶性高分子が含有されて！ヽることを特徴とする請求項 1に記載の方法。

[5] 工程 (2)における反応液の粘度を 0. 8— 3mPasに調整する請求項 1に記載の方法。

[6] 工程 (2)を 0— 20°Cで行うことを特徴とする請求項 1に記載の親和性物質の測定方法

[7] 工程 (2)を 0— 10°Cで行うことを特徴とする請求項 6に記載の親和性物質の測定方法

[8] 凝集塊および凝集塊を形成しなカゝつた担体粒子のヽずれか、または両方を、その三次元情報を指標として計数する請求項 1に記載の方法。

[9] 親和性物質と結合パートナーの結合が、抗原抗体反応による結合である請求項 1に記載の方法。

[10] 親和性物質が抗原であり、結合パートナーが抗体またはその抗原結合領域を含む断片である請求項 9に記載の方法。

[11] 親和性物質が抗体またはその抗原結合領域を含む断片であり、結合パートナーが抗原またはその抗原決定基を含む断片である請求項 9に記載の方法。

[12] 電圧パルスが交流電圧パルスである請求項 1に記載の方法。

[13] 次の工程を含む、親和性物質の測定方法。

[14] 工程 (1')において、前記反応液をインキュベート後、工程 (2')の前に凝集試薬を混合する請求項 13に記載の方法。

[15] 凝集試薬を混合後に、工程 (2')の前に更にインキュベートする工程を含む請求項 13 に記載の方法。

[16] 工程 (1')において、前記反応液を凝集試薬の存在下でインキュベートした後、工程

(2')を実施する請求項 13に記載の方法。

[17] 特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、反応液の温度を 37°C— 90°Cに加熱するための手段を有することを特徴とする装置。

[18] 特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する工程を含む、担体粒子を凝集させるための方法において、電圧を印加している間の反応液の温度を 0°C— 20°Cとすることを特徴とする方法。

[19] 結合パートナーと特定の物質との結合が、抗原抗体反応である請求項 18に記載の方法。

[20] 電圧パルスが交流電圧パルスである請求項 18に記載の方法。

[21] 反応液に水溶性高分子を添加する請求項 18に記載の方法。

[22] 反応液の粘度を 0. 8— 3mPasに調整する請求項 18に記載の方法。

[23] 前記担体粒子と特定の物質とを、電圧パルスを印加する前に 37°C— 90°Cでインキュペートする工程を含む請求項 18に記載の方法。

[24] 特定の物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、前記特定物質とを含む反応液に電圧パルスを印加する手段を含む、担体粒子を凝集させるための装置において、電圧を印加している間の反応液の温度を 0°C— 20°Cにするための手段を有することを特徴とする装置。

[25] 以下の要素を含む、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質との結合を、前記担体粒子の親和性物質または凝集試薬による凝集を指標として測定するための測定装置。

a:反応液を保持するための空間、

c:反応液に電圧パルスを印加するための手段、

[26] 次の工程 (1)-(3)または (1')- (3')を含む、親和性物質の測定方法において、工程 (2)または (2')の前に、親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーとの結合を強化する手段により反応液を希釈する工程を含む方法。

[27] 反応液を希釈する工程が、電圧パルスの印加条件下で反応液と希釈液を混合する工程である請求項 26に記載の方法。

[28] 電圧パルスが交流電圧である請求項 27に記載の方法。

[29] 交流電圧が 2KHz— 20MHzの周波数である請求項 28に記載の方法。

[30] 反応液を希釈する工程が、電圧パルスの印加条件下で反応液と希釈液を混合後、電場を停止後に更に付加的に担体粒子を希釈する工程を含む請求項 27に記載の方法。

[31] 反応液を希釈する工程が、測定対象親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーの間の結合を強化する結合強化剤を反応液に添加した後に反応液と混合するか、ある!ヽは前記結合強化剤を含む希釈液で反応液を希釈する工程である、請求項 27に記載の方法。

[32] 反応液を希釈する工程が、測定対象親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーの間の結合を強化する結合強化剤を反応液に添加した後に反応液を希釈液と混合するか、あるいは前記結合強化剤を含む希釈液で反応液を希釈する工程である、請求項 26に記載の方法。

[33] 測定対象親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーとの結合が免疫学的な結合である請求項 32に記載の方法。

[34] 抗原が蛋白質抗原であり、結合強化剤がダルタルアルデヒド、およびカルポジイミドから選択されるいずれか、または両方の化合物である請求項 33に記載の方法。

[35] 反応液を希釈する工程が、電圧パルスの印加条件下で反応液と希釈液を混合する工程である請求項 32に記載の方法。

[36] 工程 (1)または (1')における電圧パルスが交流電圧パルスである請求項 26に記載の方法。

[37] 工程 (1)または (1')において、電圧パルスを複数回与えることを特徴とする請求項 26 に記載の方法。

[38] 工程 (1)または (1 ')にお、て、電圧パルスを印加後に、担体粒子を分散させて力も次の電圧パルスを印加する工程を含む、請求項 37に記載の方法。

[39] 複数回の電圧パルス力異なる方向の電圧パルスである請求項 37に記載の方法。

[40] 担体粒子の平均粒子径が、： L m以上である請求項 26に記載の方法。

[41] 担体粒子の平均粒子径が、 1 μ m— 20 μ mである請求項 40に記載の方法。

[42] 工程 (2)または (2')において、凝集塊および凝集塊を形成しな力つた担体粒子のいずれ力、または両方を、その三次元情報を指標として計数する請求項 26に記載の方法

[43] 工程 (2)または (2')において、凝集塊または担体粒子の三次元情報を、物理的に測定する請求項 42に記載の方法。

[44] 三次元情報を物理的に測定するための方法が、電気抵抗法、レーザー回析散乱法

、および三次元画像解析法からなる群から選択された!、ずれかの方法である請求項

43に記載の方法。

[45] 以下の要素を含む、測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質との結合を、前記担体粒子の親和性物質または凝集試薬による凝集を指標として測定するための測定装置。 a:測定対象親和性物質との結合活性を有する結合パートナーを結合した担体粒子と、測定すべき親和性物質を含む試料を含む反応液、または更に付加的に凝集試薬含む反応液を保持するための空間、

b:反応液に電圧パルスを印加するための手段、

c:反応液を希釈するための手段、および

[46] 反応液を希釈するための手段が、電圧パルスの印加条件下で反応液と希釈液を混合するための手段である請求項 45に記載の装置。

[47] 反応液を希釈するための手段が、測定対象親和性物質と結合パートナー、または凝集試薬と結合パートナーの間の結合を強化する結合強化剤を反応液に添加するための手段を含む、請求項 45に記載の装置。