WO2005080550A1 - ナイシン高生産乳酸菌とその選抜方法 - Google Patents

ナイシン高生産乳酸菌とその選抜方法 Download PDF

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WO2005080550A1
WO2005080550A1 PCT/JP2004/018241 JP2004018241W WO2005080550A1 WO 2005080550 A1 WO2005080550 A1 WO 2005080550A1 JP 2004018241 W JP2004018241 W JP 2004018241W WO 2005080550 A1 WO2005080550 A1 WO 2005080550A1
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lactic acid
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Naoko Tanaka
Hiroaki Nishiuchi
Akinori Uehara
Nobutoshi Matsumoto
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Ajinomoto Co., Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a lactic acid bacterium producing nisin, a method for selecting the lactic acid bacterium, and a food or feed using the lactic acid bacterium.
  • Lactococcus lactis a kind of lactic acid bacteria, produces lactic acid and a peptide antibacterial nisin from sugars by fermentation, and the cells and culture solution are bacteriostatic against microorganisms. It has a bactericidal effect, and in recent years, in particular, interest in the function of improving the preservability of food has been increasing. .
  • Nisin is composed of 34 amino acids and is an antibacterial peptide having a molecular weight of about 3.5 kDa and having in its molecule lanthonin, ⁇ -methyllactonine, dehydroalanine, and dehydrobutyrin.
  • nisin A, nisin Z, and nisin Q have been reported as natural amino acid substitutions. Its antibacterial spectrum is widely known to exhibit antibacterial effects not only on Gram-positive bacteria but also on Gram-negative bacteria (Gill A. O. et. Al. Adv. Int J Food Microbiol. 2003, Vol. 80, p25 9).
  • Nisin is the only bacteriocin that has been certified by the US FDA as a GRAS substance, and is a safe substance that is widely used in foods, feeds, pharmaceuticals, and so on.
  • Lactococcus lactis which produces nisin
  • its culture as a bacteriostatic agent examples include the use of a culture solution as a food additive (JP-A-5-268975) and the mixing of Lactococcus lactis with fresh or fermented food. (Japanese Patent Laid-Open No. 5-211859).
  • Examples of uses other than foods include mouthwashes and uses as pharmaceuticals (JP-A-9-077681).
  • Methods for obtaining nisin at a high concentration include a method of concentrating a culture solution of a lactic acid bacterium having a low nisin-producing ability on a membrane and a method of accumulating it in a medium by continuous culture (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-85083).
  • continuous culture requires complicated and expensive equipment, and the concentration method is not always efficient because the nisin activity decreases.
  • the present invention can produce a high concentration of nisin in a culture solution even in a simple batch culture.
  • An object of the present invention is to provide a lactic acid bacterium and a culture solution thereof, and to provide a method for easily selecting a lactic acid bacterium having a high nisin-producing ability.
  • the present inventors select bacteria that grow on a synthetic medium containing bacteriocins produced by lactic acid bacteria, using the resistance to bacteriocins produced by lactic acid bacteria, particularly enterocin and nisin as an index. As a result, it was found that lactic acid bacteria having a higher nisin-producing ability than previously reported can be obtained even in batch culture. That is, the present invention is as follows.
  • a lactic acid bacterium that produces 6,8001 U or more nisin per 1 mL of culture medium in a culture medium in a batch culture in a liquid culture medium.
  • liquid medium is a liquid medium containing 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, and 1.5% calcium carbonate.
  • a method for selecting a nisin-producing lactic acid bacterium which comprises selecting a bacterium that grows on a synthetic medium containing bacteriocin produced by a lactic acid bacterium.
  • a culture solution containing lactic acid bacteria obtained by culturing the lactic acid bacteria according to (1) to (7) in a medium, a dried product of the culture solution containing the lactic acid bacteria, or a culture solution from which the lactic acid bacteria have been removed. Clear or dried product of the culture supernatant.
  • the lactic acid bacterium of the present invention is resistant to bacteriocin produced by the lactic acid bacterium, and is used in a batch culture in a liquid medium containing 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, and 1.5% calcium carbonate. This strain produces 6,800 IU or more of nisin per 1 mL of the supernatant.
  • the method for obtaining a lactic acid bacteria culture is as follows.
  • the liquid medium to be used basically requires that lactic acid bacteria producing nisin can grow, and is generally a synthetic medium composed of an aqueous solution of a sugar source, a nitrogen source, inorganic salts and the like.
  • This synthetic medium contains at least one of sugars such as glucose, galactose, and other monosaccharides, lactose, and sucrose, and nitrogen sources include protein hydrolyzate, peptone, yeast extract, fish meat extract, and the like.
  • the medium is a liquid medium containing 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, and 1.5% calcium carbonate, and the pH of the medium is adjusted to 6.0 to 7.0. Cool and use. Adjusting the pH during culture to 6.0 to 7.0 is important for nisin production, and calcium carbonate is added for the purpose of adjusting the pH.
  • the prepared medium was inoculated with 10 5 to 10 9 lactic acid bacteria producing nisin to a ZmL of 25. C ⁇ 35 ° C, with preferably ⁇ until 27.5 ° C ⁇ 32.5 0 C, 5.0 ⁇ 6.5 the PHT, while undesirable f or 5.5
  • This preparation was stirred at low speed 0 (stationary) ⁇ 150 rpm, 15 to 35 hours Perform culture.
  • L-acid bacteria belong to Lactococcus lactis ssp. Lactis and include JCM7638, ATCC11454, NCD ⁇ 497, IFO12007 and the like.
  • the method for measuring the nisin activity of the culture solution follows the method of Ishizaki et al. (Ad v. J. Fac.
  • the obtained culture solution is measured by HPLC.
  • Nisin A preparation (Sigma) is used as a standard.
  • the activity value per 1 wg of nisin fi shall be 40 I ⁇ J / ng specified in international units.
  • Tween-20 is added to the sampled culture medium to a final concentration of 0.1%, mixed well, and then centrifuged. Remove lactic acid bacteria by a 2 m filter.
  • a lactic acid bacterium is cultured in a synthetic liquid medium that can grow, and then plantaricin S, hervetisin J, pediocin PA-1, and a liquid medium supplemented with bacteriocin such as enterocin, preferably plantaricin S,
  • bacteriocin such as enterocin, preferably plantaricin S
  • lantibiotics such as lactisin 481, ratatocin S, nisin, etc.
  • Nisin which is classified into lantibiotics, more preferably in a liquid medium supplemented with Class II-type bacteriocin (a type of bacteriocin produced by lactic acid bacteria) such as bacteriocin (a class of bacteriocin) or diiocin PA-1, enterocin, etc. Or in a liquid medium supplemented with enterocin classified as Class II-type bacteriocin Particularly preferably, a part of the culture solution of lactic acid bacteria is inoculated in a liquid medium supplemented with nisin in an amount not less than that produced by the parent strain, grown at 30 ° C, and spontaneously or suddenly induced with a mutagenic agent, ultraviolet light, etc.
  • Class II-type bacteriocin a type of bacteriocin produced by lactic acid bacteria
  • enterocin classified as Class II-type bacteriocin a liquid medium supplemented with enterocin classified as Class II-type bacteriocin
  • mutagenic agents include N-methyl-1-N'-nitro-1-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl methanesulfonic acid (EMS), and sodium dimethylaminobenzenediazosulfonate (DAPA) And the like.
  • the mutant strain is applied to a synthetic agar medium containing a bacteriocin such as nisin, and the nisin concentration of the synthetic agar medium is 11, 000-90, OOOIUZmL, preferably 20,000-80,000 IU / mL. It is.
  • a bacteriocin other than nisin apply a runbiotics other than nisin or a Class II-type bacteriocin.
  • the application amount is at least an amount that can suppress the growth of the parent strain, preferably 2 to 200 times, more preferably 5 to 200 times. For example, in the case of enterocin, the strength varies depending on the parent strain.
  • Fujita et al.'S report (Bacteriocin produced by Enterococcus faecium TUA 1344LJ, published in 2004 by the Japan Lactic Acid Society) showed that the amount of 0.5 g / mL or more, 1 to 100 g / mL, 2.5 to 100 ⁇ g / mL, 10 to 100 ⁇ g / mL. Specifically, the number is preferably about 100 to 300 colonies per plate. In order to efficiently select mutant strains having improved nisin-producing ability, from among the strains grown on the above medium, Select a strain with good growth from the parent strain, and determine whether this growth is good or not by visual inspection.
  • the selected strain is cultured according to the method for obtaining a lactic acid bacteria culture solution described above.
  • a microplate assay was performed using the same culture solution, and strains with antibacterial activity against the indicator bacterium that were higher than the parent strain were selected. Unplug.
  • the microplate assay method will be described below. First, in a microplate well, a serial dilution of the culture solution of each lactic acid bacteria strain from which the cells have been removed and a culture solution of gram-positive bacteria sensitive to nisin are used as indicator bacterial liquids, and the number of cells is determined. but to pour in addition to the jar by a 10 2 to 10 5 ZmL.
  • indicator bacteria used at this time include Bacillus subtilis JCM1465T, Lactobacillus sakei JCM1157T and the like.
  • the strain selected above is cultured, and the amount of nisin in the culture is determined by HPLC to confirm that the nisin activity in the culture, that is, the ability of lactic acid bacteria to produce nisin has increased.
  • lactic acid bacteria capable of producing a sufficiently high concentration of nisin in a culture solution even in batch culture can be efficiently obtained.
  • the highest nisin production reported to date is 6,750 IU / mL (De Vuyst et.al.), but 0.54% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, 1.A lactic acid bacterium having a higher nisin-producing ability than a known lactic acid bacterium having the highest nisin-producing ability by culturing in a liquid medium consisting of 5% calcium carbonate under optimal conditions while maintaining pH, that is, It is possible to obtain lactic acid bacteria having a nisin-producing ability of 6,800 IU or more per mL of supernatant.
  • a lactic acid bacterium producing 7,425 IU / mL or more of nisin per mL of supernatant, which has a nisin-producing ability 1.1 times higher than that of lactic acid bacterium having the highest nisin-producing ability is known.
  • Lactic acid bacterium with the highest nisin-producing ability 1.
  • a lactic acid bacterium having a nisin-producing ability is further cultured in an appropriate medium such as supplemented with serine and cysteine, thereby obtaining a maximum of 20,000 IU of nycin per 1 mL of supernatant. It is thought that it is possible to obtain Shin.
  • a lactic acid bacterium having a high nisin-producing ability obtained by the above method was used in a YDCS medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3% glucose, 0.67 mg Zdl serine, 0.67 mg /
  • a medium in which lactic acid bacteria easily grow such as dl cysteine and 1.5% calcium carbonate
  • a lactic acid bacterium having a high nisin-producing ability and a culture solution containing lactic acid bacterium can be efficiently produced.
  • the culture solution containing lactic acid bacteria can be produced, for example, by spray-drying or drum-drying the culture solution containing lactic acid bacteria.
  • a culture supernatant from which lactic acid bacteria have been removed can be produced by chilling treatment, and the culture supernatant is subjected to culture, for example, by spray drying or drum drying.
  • a dried product of the liquid supernatant can be produced, and the culture obtained by the above method can be added to food, drink and feed at 0.01 to 10% to enhance the preservability.
  • the culture may be any of a culture broth itself, a sterilized culture broth, a culture broth from which cells have been removed, and a concentrate or dried product thereof. Products, meat products, pickles, fermented food seasonings such as miso, soy sauce, etc. Feeds include silage, etc.
  • a culture solution containing nisin By spraying a culture solution containing nisin, the contamination of undesirable microorganisms such as Bacillus bacteria can be suppressed more effectively than before.
  • the use of the culture solution as described above for koji makes it possible to suppress the microbial contamination of koji, and to degrade the koji without salt and to degrade the protein to a high degree. It is also possible to produce flavors.
  • nisin-producing lactic acid bacteria are inoculated as a starter in order to suppress the growth of Clostridium bacteria that form porosity in cheese. -Its bacteriostatic effect is increased, so that the desired cheese can be produced more reliably.
  • a nisin Z-producing bacterium isolated from the natural world was prepared in an M17 medium (Difco) prepared at a nisin concentration of 1,000, 2,000, 5,000, 10,000 IU / mL. And cultured at 30 ° C for 2 days. Poma nisin grew in 17 mediums at 1,000 and 2,000 IU / mL, but did not grow in M17 medium at 5,000 and 10,000 IU / mL. From these results, it was confirmed that the minimum growth inhibitory concentration (MIC) of this strain against nisin was 5,000 IU / mL.
  • M17 medium Difco
  • Nisin Z-producing lactic acid bacteria isolated from the natural world were pre-cultured in M17 medium, and the grown bacteria were treated with 500 / z g / mL of NTG to induce mutation.
  • Ml prepared from the above-mentioned mutant-treated strain so as to have a nisin concentration of 1,000, 2,000, 4,000, 8,000, 10,000, 20,000, 40,000, 80,000, 100,000 IUZmL. 7 medium was spread and incubated at 30 ° C:! ⁇ 3 days.
  • Table 1 shows the number of strains that grew in the medium having each nisin concentration.
  • Table 1 shows the number of strains that grew in the medium having each nisin concentration.
  • the number of bacteria that can grow on the plate began to decrease when the nisin concentration was 8, OOOIUZmL or more. Therefore, it is thought that it is possible to narrow down lactic acid bacteria that produce high nisin with a synthetic medium containing nisin of 8, OOOIUZmL or more and 100, OOOIUZmL or less, and 300 strains are selected from each plate, and the nisin is compared with the parent strain by microplate assay. Strains with improved productivity were selected.
  • Each of the selected lactic acid bacteria is cultured in a Tioglycolate without glucose medium (manufactured by Difco) at 37 ° C for 24 hours, and the resulting culture is diluted with 50 mL of a YD medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3.%). 0% glucose, 1.5% calcium carbonate (pH 7.0, Sakaguchi flask) were seeded, shaken at 100 rpm, and batch-cultured.
  • Table 2 shows the number of nisin producing at least 6,800 IU / mL of medium, and nisin activity of the mutant strain obtained on each plate. See Figure 3. Table 2. Number of high nisin-producing stocks acquired Table 3. Nisin activity of the obtained strain
  • L. lactis # N84 Strain selected with 80, OOOII mL of nisin plate As a result, the production of nisin is 6,800 IU / mL or more in a medium containing nisin of 20, OOOIU / mL-80, OOOIUZmL It was found that the strain to be used could be efficiently selected.
  • L. lactis AJ110212 strain with the highest nisin-producing ability was obtained from the strains selected on the 40, OOOIUZmL nisin-containing plate.
  • L. lactis AJl 10212 strain Pama parent strain 3.0 times, general It was found to have about 3.4 times the nisin-producing ability of L. lactis JCM7638, a typical nisin Z strain. In addition, it has the ability to produce nisin approximately 1.8 times that of 6,750 IUZmL described in the literature of De Vuyst et.al., which is the highest nisin production amount reported so far. It has been found.
  • the L. lactis AJ110102 strain was deposited on November 19, 2003 with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary under the accession number FERM BP-8552.
  • the enterocin-containing solution was prepared as follows. Enterotesin producing bacteria
  • the antibacterial activity before and after concentration was determined by the spot-on-lawn method using the nisin Z-producing lactic acid bacteria isolated from nature used in Example 1 and confirmed by the spot-on-lawn method.
  • ) was pre-cultured in M17 medium (manufactured by Difco), and the grown cells were treated with SOO ⁇ gZmL of NTG to induce mutation.
  • the mutated strain was applied to an M17 medium and an M17 medium prepared so that the concentration of enterocin was about 20 g / mL, and incubated at 30 ° C for 1 to 3 days.
  • the number of colonies growing on the plate was 1/100 in the M17 medium containing enterocin compared to the M17 medium.
  • nisin-containing M17 medium it is thought that it is possible to narrow down lactic acid bacteria that produce high nisin in the enterocin-containing M17 medium at this concentration, and 108 strains were selected and compared with the parent strain in the microplate assay. Also selected strains with improved nisin productivity.
  • Each of the selected lactic acid bacteria was cultured in a Tioglycolate without glucose medium (manufactured by Difco) at 37 ° C for 24 hours, and the resulting culture was diluted with 50 mL of YD medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride, 3.%). 0% glucose, 1.5% calcium carbonate (pH 7.0, Sakaguchi flask) were seeded and shaken at 100 rpm to perform batch culture.
  • L. lactis AJ 110376 strain (Nisin activity 10,802 IU / mL) was obtained.
  • the L. lactis AJ 110376 strain was found to have about 2.7 times the nisin producing ability of the parent strain, and about 3.4 times the L. lactis JCM7638 strain, which is a common nisin Z strain.
  • it has the ability to produce nisin about 1.6 times as much as 6,750 IUZmL described in the document of De Vuyst et.al., which is the highest nisin production amount reported so far. It has been found.
  • L. lactis # N43 described in Example 1 was applied to an M17 medium prepared to have an erythromycin concentration of 0.01 to 0.2 gZmL, and incubated at 30 ° C for 1 to 3 days. Thereafter, each of the grown lactic acid bacteria was cultured in a Tioglycolate without glucose medium (manufactured by Difco) at 37 ° C for 24 hours, and the resulting culture was diluted with 50 mL of a YD medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride). , 3.0% glucose, 1.5% calcium carbonate (pH 7.0, Sakaguchi flask) and cultured with shaking at 100 rpm. Table 4 shows the results of HPLC measurement of the amount of nisin produced by each strain in the culture supernatant. Table 4. Selection of nisin-producing bacteria using Erythromycin resistance as an index
  • the nisin Z-producing lactic acid bacterium (parent strain in Table 3) isolated from nature described in Example 1 was precultured in M17 medium (manufactured by Difco), and the grown bacterium was treated with 500 g ZmL of NTG to mutate. Provoked.
  • the mutated strain was applied to an M17. Medium prepared to have an erythromycin concentration of 0.2 igZniL, and incubated at 30 ° C for 1 to 3 days. After that, randomly selected 20 strains from the growing lactic acid bacteria. Each was cultured in a Tioglycolate without glucose medium (manufactured by Difco) at 37 ° C for 24 hours, and the culture solution was added to 50 mL of YD medium (0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride sodium, 3.0% glucose). , 1.5% calcium carbonate pH 7.0, Sakaguchi flask), and cultured at 100 rpm with shaking. When the amount of nisin produced in the culture supernatant of each strain was measured by HPLC, a strain having nisin activity higher than that of the parent strain could not be obtained.
  • a lactic acid bacterium having a high nisin-producing ability can be obtained by the method for selecting a lactic acid bacterium of the present invention, and a lactic acid bacterium of the present invention can produce a high concentration of nisin.
  • a liquid can be obtained.
  • This culture solution can be used for various foods and drinks and feeds to improve the preservability of foods and drinks and feeds. Therefore, the present invention is extremely useful industrially, particularly in the food and feed fields.

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Abstract

乳酸菌の生産する或はナイシン以外のバクテリオシンに対する乳酸菌の耐性を指標とし、或はナバクテリオシンを含有する合成培地上で生育する菌を選抜することで、バッチ培養においても、液体培地で増殖させた場合、培地上清１ｍＬあたり６，８００ＩＵ以上のナイシン生産能を有する乳酸菌を取得することができ、該培養物を食品又は飼料に用いることで食品又は飼料の保存性を高めることができる。

Description

明細書 ナイシン高生産乳酸菌とその選抜方法 技術分野
本発明はナイシンを生産する乳酸菌とその選抜方法、及び同乳酸菌を利用した食品 又は飼料に関するものである。 背景技術
乳酸菌の一種であるラタトコッカス'ラクテイス（以下、 Lactococcus lactisと記す）の 一部は、発酵により糖類から乳酸ならびにペプチド性の抗菌物質ナイシンを生産し、そ の菌体並びに培養液は微生物に対する静菌、殺菌効果があり、近年特に食品の保存 性向上機能に対する関心が高まっている。 .
ナイシンは 34個のアミノ酸より構成されており分子内にランチォニン、 β一メチルランチ ォニン、デヒドロアラニン、及びデヒドロブチリンを有する分子量約 3. 5kDaの抗菌性ぺプ チドである。現在までに、ナイシンには天然のアミノ酸置換体として、ナイシン A、ナイシン Z、ナイシン Qが報告されている。また、その抗菌スペクトルは広くグラム陽性菌のみならず グラム陰性菌に対しても抗菌効果を示すことが知られている（Gill A. O . et. al. Adv. Int J Food Microbiol. 2003, Vol. 80， p25ト 9·)。
また、ナイシンはバクテリオシンの中で唯一米国 FDAに GRAS物質として認定されてお り、食品や飼料、医薬品などに幅広く利用されている安全な物質である。
ナイシンを生産する Lactococcus lactis及びその培養物の静菌剤としての利用例 として、培養液の食品添加剤としての利用（特開平 5— 268975号公報）や、生鮮食品 または発酵食品に Lactococcus lactisを混合することによる食品の保存方法（特開平 5— 211859号公報）が挙げられる。
また、 食品以外での利用法としては口腔洗诤剤ゃ医薬品としての利用法 （特開 平 9— 077681号公報） などが挙げられる。
ナイシンを生産する能力の高い菌株として Lactococcus lactisに属する乳酸菌が培 養液 lmLあたり 6， 750IUのナイシンを生産するとの報告がある（De Vuyst et . al. Blackie Academic and Professional, 1994, p i 51— 221 )。但し、具体的な培 養条件についての開示はなレ、。また、 Lactococcus lactis UL71 9をバッチ培養した 際に、培養液 lmLあたり 4， 100IUのナイシンを生産するとの報告がある（Amiali et. al. Adv. World J. Microbiol. Biotecnoly, 1998， p 887— 894)。
ナイシンを生産する能力の高い菌株の選抜方法として、エリスロマイシン耐性を指標と した選抜により、 5000IU/mLのナイシンに対し耐性を持つようになり、親株として利用し た Lactococcus lactis N8株に対し、菌数あたりの最高ナイシン生産能が 10倍にな つたとレ、う幸艮告; ^ある（Qiao et. al. Adv. Biotechnol. Let. , 1997, p l 99— 20 2)。但し、最高 2. 8 X 10 5IUZcfuとあるが、培養液あたりの菌数が記載されておらず、 具体的なナイシン生産能すなわち培養液 lmLあたり何 IUのナイシンを生産するかは示 されていない。 Qiao et. al. の文献以外に、ナイシンを生産する能力の高い菌株の選 抜方法に関する報告はなぐナイシン耐性を指標とするナイシンを生産する能力の高い 菌株の選抜方法についての報告もない。
ナイシンを高濃度で取得する方法として、ナイシン生産能の低い乳酸菌の培養液を膜 濃縮する方法や、連続培養などにより培地中に蓄積する方法（特開 2002— 85083号 公報）などが挙げられるが、連続培養では複雑で高価な装置が必要であること、また濃 縮法ではナイシン活性が低下することから必ずしも効率の良い方法とはいえない。
また、ナイシン生産乳酸菌培養物の微生物に対する静菌効果は乳酸菌体込みの方 が高いという報告もあり（米国特許第 5， 965 , 178号公報）、実際に味噌の製造法（特 開 2001— 224359号公報）や煮豆の製造法（特開 2003— 1 16477号公報）では菌体 とナイシン溶液の両者を併用して静菌効果を上げてレ、る。
一方、上述した濃縮や連続培養による高濃度のナイシン溶液の調製法では菌体が除 去されるという問題があることから、バッチ培養のような簡便な方法で高濃度ナイシン、及 び乳酸菌体を含む培養液を調製することが望まれる。そのためには、ナイシンを高生産 する乳酸菌を育種、選抜する方法を開発し、ナイシン生産能の高い乳酸菌が開発する ことが有効であり、ナイシン生産能の高い乳酸菌が開発されれば、その培養物を飲食品 や飼料に利用することにより、それら飲食品や飼料の保存性を効率よく向上させることが できる。 発明の開示
本発明は、簡便なバッチ培養においても高濃度のナイシンを培養液中に生産可能な 乳酸菌及びその培養液を提供すること及びナイシン生産能の高い乳酸菌を簡便に選抜 する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために、乳酸菌の生産するバクテリオシン、特にェ ンテロシンやナイシンに対する耐性を指標とし、乳酸菌の生産するバクテリオシンを含有 する合成培地上で生育する菌を選抜することで、バッチ培養においても、これまで報告さ れているより高いナイシン生産能を有する乳酸菌を取得できることを見出した。すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 )液体培地によるバッチ培養において培地の上清 1 m Lあたり 6 , 8001 U以上のナイシ ンを培地中に生産する乳酸菌。
(2)乳酸菌が上清 lmLあたり 8, 100IU以上のナイシンを培地中に生産するものである ( 1)記載の乳酸菌。
(3)乳酸菌が上清 lmLあたり 10, 125IU以上のナイシンを培地中に生産するものであ る（1)記載の乳酸菌。
(4)液体培地が 0. 5%の酵母エキス、 0. 5%の塩化ナトリウム、 3%のグルコース、 1. 5%の炭酸カルシウムを含有する液体培地である（1 )記載の乳酸菌。
(5)生産するナイシンがナイシン A又はナイシン Zである（1)記載の乳酸菌。
(6)乳酸菌がラクトコッカス属に属するものである（1 )記載の乳酸菌。
(7)乳酸菌がラタトコッカス ·ラクテイス AJ110212 (FERM BP— 8552)である（6)記載 の乳酸菌。
(8)乳酸菌の生産するバクテリオシンを含有する合成培地上で生育する菌を選抜するこ とを特徴とするナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
(9)バクテリオシンがェンテロシン又はナイシンである（8)記載のナイシン生産乳酸菌の 選抜方法。
(10)バクテリオシンが培地 lmLあたり 11 , 000〜90, 000IUのナイシンである（8)記載 のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
( 11)バクテリオシンが培地 lmLあたり 20, 000— 80, 000IUのナイシンである（8)記載 のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
( 12) (1)乃至（7)記載の乳酸菌を培地中で培養することにより得られる乳酸菌を含有 する培養液又は該乳酸菌を含有する培養液の乾燥物又は該乳酸菌の除去された培養 液上清又は該培養液上清の乾燥物。 (13) (12)記載の乳酸菌を含有する培養液又は該乳酸菌を含有する培養液の乾燥物 又は該乳酸菌を除去した培養液上清又は該培養液上清の乾燥物を含有する保存性 が向上した飲食品又は飼料。
本発明の乳酸菌は乳酸菌の生産するバクテリオシンに対する耐性を有し、かつ 0.5% の酵母エキス、 0.5%の塩化ナトリウム、 3%のグルコース、 1.5%の炭酸カルシウムを含 有する液体培地によるバッチ培養において培地の上清 lmLあたり、 6,800IU以上のナ イシンを生産する株である。
乳酸菌培養物の取得方法は、次の通りである。
使用する液体培地は、基本的にはナイシンを生産する乳酸菌が増殖可能であること が要件であり、一般的に糖源、窒素源、無機塩類等の水溶液より構成される合成培地 である。この合成培地には、糖源としてはブドウ糖、ガラクトース等の単糖類、乳糖、蔗糖 のうち少なくとも 1種が含まれており、窒素源としては蛋白質分解物、ペプトン、酵母ェキ ス、魚肉エキス、カザミノ酸、麦芽汁等のうち少なくとも 1種が含まれている。無機塩類とし ては、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム等を含有している。好ましくは、 0.5%の酵母ェキ ス、 0.5%の塩化ナトリウム、 3%のグルコース、 1.5%の炭酸カルシウムを含有する液体 培地であり、培地の pHは 6· 0〜7.0に調整し、殺菌後冷却し使角する。培養中の p H を 6.0〜7.0に調整することはナイシンの生産に重要であり、炭酸カルシウムはこの p H 調整の目的で添加している。
調製した培地に、ナイシンを生産する乳酸菌を 105〜109個 ZmLとなるよう接種し、 2 5。C〜35°C、望ましく ίま 27.5°C〜32.50Cで、 pHtを 5.0〜6.5、望ましく fま 5.5こ調製 しながら、 0(静置）〜 150rpmの低速で攪拌し、 15〜35時間培養をおこなう。ナイシンを 生産する？ L酸菌は Lactococcus lactis ssp. lactisに属し、 JCM7638、 ATCC114 54、 NCD〇497、 IFO12007などを例示することができる。
培養液のナイシン活性測定法は石崎らの方法に従う （Ad v. J . F a c .
A g r . , Ky u s h u Un i v. , 40, p 7 3— 8 5) 。 即ち取得した培 養液を、 HP L Cにて測定する。 スタンダードにはナイシン A製剤 （シグマ社） を 利用する。 このとき、 ナイシン fi 1 w gあたりの活性値は国際単位で定められてい る 40 I \J/ n gとする。
ナイシン活性測定用のサンプル調製の際は、 サンプリングした培 ¾液に終濃度 0. 1 %となるよう Tw e e n— 2 0を加えてよく混合した後、 遠心分離もしくは 0. 2 2 mのフィルター処理にて乳酸菌体を除去する。
次に、ナイシン高生産乳酸菌の取得法について述べるが、菌株の突然変異を利用す る。まず、増殖可能な合成液体培地にて乳酸菌を培養後、プランタリシン S、ヘルべティ シン J、ぺディオシン PA- 1、ェンテロシン等のバクテリオシンを添加した液体培地中に、 好ましくはプランタリシン S、ヘルべティシン J、ぺディオシン PA-1、ェンテロシン等乳酸菌 の生産するバクテリオシンを添加した液体培地中に、より好ましくはラクティシン 481、ラタ トシン S、ナイシン等ランティビォテイクス（lantibiotics ;乳酸菌の生産するバクテリオシン の一分類）或はぺディオシン PA- 1、ェンテロシン等 ClassII- typeバクテリオシン（乳酸菌 の生産するバクテリオシンの一分類）を添加した液体培地中に、更に好ましくはランティビ ォテイクスに分類されるナイシン又は ClassII- typeバクテリオシンに分類されるェンテロシ ンを添加した液体培地中に、特に好ましくは親株が生産する量以上のナイシンを添加し た液体培地中に、乳酸菌培養液の一部を接種し 30°Cで増殖させ、 自然変異若しくは突 然変異誘発剤、紫外線等にて変異を誘導する。突然変異誘発剤の例としては N—メチ ル一 N '—ニトロ一N—二トロソグァニヂン（NTG)やェチルメタンスルホン酸（EMS)、 4一 ジメチルァミノベンゼンジァゾスルホン酸ナトリウム（DAPA)などが挙げられる。
突然変異を誘発した株をナイシン等のバクテリオシンを含む合成寒天培地に塗布する, その際の合成寒天培地のナイシン濃度は 11 , 000- 90, OOOIUZmL、好ましくは 20， 000〜80, 000IU/mLである。ナイシン以外のバクテリオシンとしてはナイシン以外のラ ンティビォテイクスや ClassII- typeバクテリオシンを塗布する。塗布量は、親株の生育を 抑制可能な量以上、好ましくは 2〜200倍量、より好ましくは 5〜200倍量である。例えば. ェンテロシンの場合は、親株によっても異なる力 藤田らの報告結果（2004年度日本乳 酸囷ギ会発表「Bacteriocin produced by Enterococcus faecium TUA 1344LJ )力り考 えて、一殳的に 0 · 5 g/mL以上、 1 ~ 100 g/mL, 2. 5 ~ 100 μ g/mL, 10~ 100 μ g/mLと例示することができる。培地に播く乳酸菌数は出現するコロニーが互いに接触し ないような数であることが好ましぐ具体的には 1プレートあたり 100〜300コロニー程度が 好ましい。ナイシン生産能の向上した突然変異種を効率よく選抜するために、上記培地 上で生育した株の中から親株より生育の良い株を選抜する。この生育の良し悪しは目視 で行なう。
選抜した株を前述の乳酸菌培養液の取得法に従って培養する。同培養液を使用し て、マイクロプレートアツセィを行レ、、指標菌に対する抗菌活性が親株以上の菌株を選 抜する。マイクロプレートアツセィ法を以下に説明する。まず、マイクロプレートのゥエル中 にそれぞれ、菌体を除いた各乳酸菌株の培養液を段階希釈した液と、ナイシンに感受 性.のあるグラム陽性菌の培養液を指標菌液として、菌体数が 102〜105個 ZmLとなるよ うに加えて混釈する。このとき使用する指標菌の例として、 Bacillus subtilis JCM14 65T, Lactobacillus sakei JCM1157Tなどが挙げられる。次に、このマイクロプレー トを 37°Cで 4〜24時間、好ましくは 12〜21時間インキュベートし、指標菌の生育度合い で抗菌活性、即ち培養液中のナイシン活性を測定する。生育度合いは、ゥエル中の濁 度（Abs = 595nm)の高低にて、判断する。培養液中のナイシン活性が高く指標菌の生 育が阻害されると、ゥエル中の濁度は上昇しない。ゥエルの濁度が上昇する培養液上清 の最大希釈率を親株と変異株とで比較し、この希釈率が親株以上になった株は親株以 上のナイシンを生産している可能性があるものとして選抜する。
最後に上記で選抜した株を培養して、培養液中のナイシン量を HPLCにて定量する ことにより培養液中のナイシン活性すなわち乳酸菌のナイシン生産能が上昇したことを確 認する。
上記の方法により、バッチ培養でも十分に高濃度のナイシンを培養液中に生産可能 な乳酸菌を効率よく取得することが可能である。これまでの報告の中で最高ナイシン生 産量は 6, 750IU/mL (De Vuyst et. al. )であるが、 0. 54%の酵母エキス、 0. 5% の塩化ナトリウム、 3%のグルコース、 1. 5%炭酸カルシウムからなる液体培地で最適な 条件下で、 pHを維持しながら培養することにより、公知の中で最高ナイシン生産能を有 する乳酸菌よりも高いナイシン生産能を有する乳酸菌、すなわち上清 lmLあたり 6， 800 IU以上のナイシン生産能を有する乳酸菌を取得することが可能である。具体的には、公 知の中で最高ナイシン生産能を有する乳酸菌の 1. 1倍のナイシン生産能である上清 1 mLあたり 7, 425IU/mL以上のナイシンを生産する乳酸菌、公知の中で最高ナイシン 生産能を有する乳酸菌の 1. 2倍のナイシン生産能である上清 lmLあたり 8, lOOIU/m L以上のナイシンを生産する乳酸菌、公知の中で最高ナイシン生産能を有する乳酸菌 の 1. 5倍のナイシン生産能である上清 lmLあたり 10, I SSIUZmL以上のナイシンを生 産する乳酸菌、公知の中で最高ナイシン生産能を有する乳酸菌の 1. 8倍のナイシン生 産能である上清 lmLあたり 12, 150IU/mL以上のナイシンを生産する乳酸菌を得るこ とが可能である。また、ナイシン生産能を有する乳酸菌を例えばセリン、システィンを添カロ する等さらに適当な培地にて培養することにより上清 lmLあたり最高 20, 000IUのナイ シンを得ることが可能であると考えられる。
また、上記の方法により取得したナイシン生産能の高い乳酸菌を YDCS培地（0. 5 4%の酵母エキス、 0. 5%の塩化ナトリウム、 3 %のグルコース、 0. 67mgZdlのセリン、 0. 67mg/dlのシスティン、 1. 5 %炭酸カルシウムのような乳酸菌の生育しやすい培地での バッチ培養することにより、ナイシン生産能の高い乳酸菌及び乳酸菌を含有する培養液 を効率よく製造することができる。その乳酸菌を含有する培養液を例えば噴霧乾燥ある いはドラム乾燥することにより乳酸菌を含有する培養液の乾燥物を製造することができる。 また、乳酸菌を含有する培養液を例えばフィルタ一処理あるいはデカンテーシヨン処理す ることにより乳酸菌の除去された培養液上清を製造することができ、その培養液上清を 例えば噴霧乾燥あるいはドラム乾燥することにより培養液上清の乾燥物を製造すること ができる。上記の方法により得られた培養物は、飲食品や飼料に 0· 01〜： 10%添加する ことにより保存性を高めることができる。このときの培養物とは、培養液そのものや、殺菌し た培養液、菌体を除去した培養液、これらの濃縮物又は乾燥物のいずれかでかまわな レ、。更に飲食品としては、ジュースや乳製品、肉製品、漬物又は味噌や醤油などの発酵 食品調味料などが挙げられる。また、飼料としてはサイレージなどがある。例えば、味噌、 醤油製造における製麹工程で該ナイシン生産乳酸菌及ぴ高濃度のナイシンを含む培 養液を撒水することにより、バチルス属細菌など望ましくない微生物の汚染をこれまでより 効果的に抑えることが出来るようになるため、官能に優れ、微生物汚染の少ない製品を 作ることが容易となる。さらに上記のような培養液を麹に使用することにより麹の微生物汚 染を抑制することができ、麹を無塩分解し、タンパクを高度に分解することにより新しい調 味料の製造することも可能となる。
ナイシンを含む培養液を食品用静菌剤として利用する際には、培地成分の官能が使 用する食品に悪影響を及ぼすことも考えられる力 該ナイシン生産乳酸菌を使った高濃 度のナイシンを含む培養液を利用することで、培養液の添加量が少量で済むため、この ような培地成分による官能上の悪影響はなくなる。また、チーズの製造においては、チー ズに多孔を形成するクロストリジゥム属細菌の増殖を抑えるためナイシン生産乳酸菌をス ターターとして接種している例がある力 S、該ナイシン高生産乳酸菌を使用した場合当然 - その静菌効果は高くなるため、より確実に目的のチーズを製造できるようになる。 発明を実施するための最良の形態 以下、実施例により本発明を詳しく説明する。もちろん、本発明の技術的範囲はこれ らの実施例に限定されるものではない。
実施例 1
まず、 自然界から分離したナイシン Z生産菌（表 3記載の親株）をナイシン濃度 1， 00 0、 2, 000、 5, 000、 10, 000 IU/mLとなるように調製した M 17培地（Difco製）に塗 布し、 30°Cで 2 日培養した。本株 ίまナイシン濃度 1， 000、 2, 000 IU/mLの 17培地 では生育したが、 5， 000、 10， 000 IU/mLの M 17培地では生育しなかった。この結果 より、本株のナイシンに対する最小生育阻止濃度（MIC)は、 5, 000 IU/mLであることが 確認された。
この自然界から分離したナイシン Z生産乳酸菌を M17培地で前培養し、生育した菌を 500 /z g/mLの NTGにて処理し、突然変異を誘発した。
上記の変異処理した株をナイシン濃度 1 , 000、 2， 000、 4, 000、 8, 000、 10， 000 20, 000、 40, 000、 80， 000、 100， 000 IUZmLとなるよう調製した Ml 7培地に塗 布し、 30°Cで：!〜 3日インキュベートした。
その結果、各ナイシン濃度の培地で生育していた株数を表 1に示す。 表 1.ナイシン含有培地におけるナイシン Z生産乳酸菌生育株数
Figure imgf000009_0001
表 1のように、ナイシン濃度 8, OOOIUZmL以上より、プレート上に生育可能な菌数が 減少し始めた。そこで、 8， OOOIUZmL以上 100, OOOIUZmL以下のナイシンを含有 する合成培地で、ナイシンを高生産する乳酸菌の絞込みが可能と考え、各プレートから 3 00株ずつ選抜しマイクロプレートアツセィによって親株よりもナイシン生産能の向上した 株を選抜した。
選抜した乳酸菌をそれぞれ Tioglycolate without glucose培地（Difco製）にて 3 7°Cで 24時間培養し、その培養液を 50mLの YD培地（0. 5 %酵母エキス， 0. 5%塩化 ナトリウム， 3. 0%グルコース， 1 · 5%炭酸カルシウム pH 7. 0、坂口フラスコ）にシードし て l OOrpmで振とうし、バッチ培養を行った。 各菌株の生産するナイシン量を HPLCにて測定した結果、培地 ImLあたり 6，800 IU 以上のナイシンを生産する菌株数を表 2に、それぞれのプレートで得られた変異株のナイ シン活性を表 3に示す。 表 2.高ナイシン生産株取得数
Figure imgf000010_0001
表 3.取得した株のナイシン活性
Figure imgf000010_0002
L. lactis JCM7638 ：一般的なナイシン Z株
L. lactis #404 ： 20, 000IU/mLのナイシンプレートで選抜した株
L. lactis AJ110212 :40, OOOIUZmLのナイシンプレ、ートで選抜した株
L. lactis #N139 :40， OOOIUZmLのナイシンプレ'ートで選抜した株
L. lactis #N43 :40, OOOIUZmLのナイシ 'ンプレ'ートで選抜した株
L. lactis #N113 :40, OOOIUZmLのナイシンプレ、ートで選抜した株
L. lactis #N84 :80, OOOII mLのナイシンプレ'ートで選抜した株 結果、 20， OOOIU/mL-80, OOOIUZmLのナイシンを含有する培地にて、ナイシ ン生産量が 6, 800IU/mL以上となる株を効率的に選抜可能であることが判明した。
40， OOOIUZmLのナイシン含有プレートで選抜した株より、最もナイシン生産能の高 レヽ： L. lactis AJ110212株を得た。 L. lactis AJl 10212株 ίま親株の糸勺 3. 0倍、一般 的なナイシン Z株である L . lactis JCM7638株の約 3. 4倍のナイシン生産能を有する ことが判明した。また、これまでの報告の中での最高ナイシン生産量である De Vuyst et. al.の文献に記載された 6 , 750IUZmLと比較しても約 1 . 8倍のナイシンを生産す る能力を有することが判明した。なお、 L. lactis AJ 1 10212株は 2003年 11月 19日に 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに FERM BP— 8552 の受託番号で寄託されている。
実施例 2
ェンテロシン含有溶液を次のようにして調整した。ェンテロシン生産菌である
Enterococcus faecium JCM 580 を MRS培地（D co製）にて 37。Cで 22時間振とう培 養した。培養液を遠心分離後、上清液をフィルター濾過（ADVANTEC製 Disposable Syringe Filter Unit, Dismic - 25cs, Cellulose Acetate 0.45 μ πι)した。限外爐過 B莫を用 いて前述の上清液の粗精製を行った。即ち、遠心分離を行って、限外濾過（脱塩）を行 い、上清画分を採取した。本工程によって、培養液中のェンテロシンを濃縮し、ェンテロ シンを約 200 g/mL含む溶液を調製した。濃縮前後の抗菌活性は、実施例 1で使用し た自然界より単離したナイシン Z生産乳酸菌を用いて、 spot- on- lawn法により確認した 自然界から分離したナイシン Z生産乳酸菌（表 3記載の親株）を M17培地（Difco製） で前培養し、生育した菌を SOO ^ gZmLの NTGにて処理し、突然変異を誘発した。 上記の変異処理した株を M 17培地及ぴェンテロシン含有濃度が約 20 g/mLにな るように調製した M 17培地に塗布し、 30°Cで 1〜3日インキュベートした。プレート上に生 育してきたコロニー数は、ェンテロシンを含有する M17培地では M 17培地に比べて 1/100であった。よって、ナイシン含有 M 17培地での結果から考えて、本濃度でのェン テロシン含有 M17培地でナイシンを高生産する乳酸菌の絞込みが可能と考え、 108株 選抜しマイクロプレートアツセィにて親株よりもナイシン生産能の向上した株を選抜した。 選抜した乳酸菌をそれぞれ Tioglycolate without glucose培地（Difco製）にて 3 7°Cで 24時間培養し、その培養液を 50mLの YD培地（0. 5 %酵母エキス， 0. 5 %塩化 ナトリウム， 3. 0 %グルコース， 1. 5%炭酸カルシウム pH 7. 0、坂口フラスコ）にシードし て l OOrpmで振とうし、バッチ培養を行った。
各菌株の生産するナイシン量を HPLCにて測定した結果、培地 lmLあたり 6 , 800 IU 以上のナイシンを生産する菌株を 24株取得した。
このようにしてェンテロシン含有プレートで選抜した株より、最もナイシン生産能の高い L.lactis AJ 110376株（ナイシン活性 10,802 IU/mL)を得た。 L.lactis AJ 110376株 は親株の約 2. 7倍、一般的なナイシン Z株である L. lactis JCM7638株の約 3.4倍 のナイシン生産能を有することが判明した。また、これまでの報告の中での最髙ナイシン 生産量である De Vuyst et. al. の文献に記載された 6, 750IUZmLと比較しても約 1. 6倍のナイシンを生産する能力を有することが判明した。
比較例 1
実施例 1記載の L. lactis #N43をエリスロマイシン濃度 0. 01〜0. 2 gZmLとな るよう調製した M17培地に塗布し、 30°Cで 1〜3日インキュベートした。その後、生育して いた乳酸菌をそれぞれ Tioglycolate without glucose培地（Difco製）にて 37°Cで 24時間培養し、その培養液を 50mLの YD培地（0. 5%酵母エキス， 0. 5%塩化ナトリウ ム， 3. 0%グルコース， 1. 5%炭酸カルシウム pH 7. 0、坂口フラスコ）にシードして 100r pmで振とう培養を行った。各菌株が培地上清中に生産するナイシン量を HPLCにて測 定した結果を表 4に示す。 表 4. エリス口マイシン耐性を指標としたナイシン生産菌の選抜
ナイシン活性 消費ゲルコ-ス
(IU/mL) 乳酸濃度（％) 濃度（％)
Parent strain(#N43) 8198 0.00 1.99
し. lactis E1 7096 2.99 2.55
し .lactis E2 3954 3.00 2.46
し. lactis E3 4713 3.00 2.25
L.lactis E4 5070 2.96 2.21
し. lactis E5 5637 3.00 2.47
し. lactis ED 6804 3.00 2.41
L.lactis E7 4446 2.88 1.31
し. lactis E8 5340 2.84 1.56
L.lactis E9 5979 2.93 1.87
し. lactis E10 4174 2.84 1.33
L.lactis E11 5386 3.00 2.68
L.lactis E12 4613 2.97 2.25
し. lactis E13 4348 3.00 2.30
L.lactis E14 5594 2.99 2.44
L.lactis E15 5147 2.87 1.45
L.lactis E16 4854 2.89 1.70
L.lactis E17 4645 2.86 1.31
L.lactis E18 5042 2.99 1.84
し. lactis E19 7442 3.00 2.50
し .lactis E20 4369 2.87 1.28 表 4のように親株よりナイシン生産能が向上した菌株は得られず、 Qiao et. al.の文 献にあるようなエリスロマイシン耐性を指標とした選抜により、ナイシン生産能を向上させ ることはできなかった。よって、エリスロマイシン耐性を指標とする選抜方法と比較し、ナイ シンを指標とする選抜方法がはるかに効率的であると考えられる。
比較例 2
実施例 1記載の自然界から分離したナイシン Z生産乳酸菌（表 3中の親株）を M 17培 地（Difco製）で前培養し、生育した菌を 500 gZmLの NTGにて処理し、突然変異を 誘発した。
上記の変異処理した株をエリスロマイシン濃度 0. 2 i gZniLとなるよう調製した M1 7 . 培地に塗布し、 30°Cで 1〜3日インキュベートした。その後、生育していた乳酸菌からラン ダムに 20株選抜した。それぞれ Tioglycolate without glucose培地（Difco製）にて 37°Cで 24時間培養し、その培養液を 50mLの YD培地（0. 5 %酵母エキス， 0. 5%塩 ィ匕ナトリウム， 3. 0 %グルコース， 1. 5 %炭酸カルシウム pH 7. 0、坂口フラスコ）にシード して l OOrpmで振とう培養を行った。各菌株が培地上清中に生産するナイシン量を HPL Cにて測定したところ、親株以上のナイシン活性を有する菌株を取得できなかった。
このように親株よりナイシン生産能が向上した菌株は得られず、 Qiao et. al. の文献 にあるようなエリスロマイシン耐性を指標とした選抜により、ナイシン生産能を向上させるこ とはできなかった。よって、エリス口.マイシン耐性を指標とする選抜方法と比較し、ナイシン やナイシン以外のバクテリオシンを指標とする選抜方法がはるかに効率的であると考えら れる。 産業上の利用可能性
本発明の乳酸菌の選抜方法によりナイシン生産能の高い乳酸菌を得ることができ、本 発明の乳酸菌は高濃度のナイシンを生産することができるので、簡便なバッチ培養にお いてもナイシン活性の高い培養液を得ることができる。この培養液はさまざまな飲食品、 飼料に使用されることで、飲食品、飼料の保存性を向上させることができる。従って、本 発明は工業上、特に食品分野、飼料分野において極めて有用である。

Claims

1 .液体培地によるバッチ培養において培地の上清 lmLあたり 6 , 800IU以上のナイシ ンを培地中に生産する乳酸菌。
2.乳酸菌が上清 lmLあたり 8 , 100IU以上のナイシンを培地中に生産するものである 請求の範囲第 1項記載の乳酸菌。
3.乳酸菌が上清 lmLあたり 10 , 125IU以上のナイシンを培地中に生産するものである 請求の範囲第 1記載の乳酸菌。
4.液体培地が 0. 5 %の酵母エキス青、 0. 5 %の塩化ナトリウム、 3 %のグルコース、 1. 5 % の炭酸カルシウムを含有する液体培地である請求の範囲第 1項記載の乳酸菌。
5.生産するナイシンがナイシン A又はナイシン Zである請求の範囲第 1項記載の乳酸菌。
車
6.乳酸菌がラクトコッカス属に属するものである請求囲の範囲第 1項記載の乳酸菌。
7.乳酸菌がラタトコッカス'ラクテイス AJ110212 (F RM BP— 8552)である請求の範 囲第 6項記載の乳酸菌。
8.乳酸菌の生産するバクテリオシンを含有する合成培地上で生育する菌を選抜するこ とを特徴とするナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
9.バクテリオシンがェンテロシン又はナイシンである請求の範囲第 8項記載のナイシン生 産乳酸菌の選抜方法。
10.バクテリオシンが培地 lmLあたり 11 , 000- 90, 000IUのナイシンである請求の範 囲第 8項記載のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
11 .バクテリオシンが培地 lmLあたり 20, 000〜80， 000IUのナイシンである請求の範 囲第 8項記載のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
12.請求の範囲第 1項乃至第 7項記載の乳酸菌を培地中で培養することにより得られる 乳酸菌を含有する培養液又は該乳酸菌を含有する培養液の乾燥物又は該乳酸菌の 除去された培養液上清又は該培養液上清の乾燥物。
13.請求の範囲第 12項記載の乳酸菌を含有する培養液又は該乳酸菌を含有する培 養液の乾燥物又は該乳酸菌'を除去した培養液上清又は該培養液上清の乾燥物を含 有する保存性が向上した飲食品又は飼料。
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