WO2005021574A2 - Induktion antiviraler neutralisierender antikörper beim menschen und beim tier - Google Patents

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Joachim Denner
Reinhardt Kurth
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    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the invention relates to immunogenic constructs and a pharmaceutical agent for inducing humoral neutralizing immune responses to virus infections and to kits for the detection of antibodies and virus antigens on the basis of these immunogenic constructs and the induced antibodies.
  • the invention further relates to a method for inducing an antibody response and a method for passive immunization of an organism using neutralizing antibodies which have been obtained with the aforementioned immunogenic constructs and a bioassay for the detection of infection with viruses.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • AIDS acquired human deficiency syndrome
  • Artificial active immunization involves the application of defined antigens, which leads to actively acquired immunity through the formation of antibodies or cellular immunity. In passive immunization, the antibodies or immune cells are applied directly, which lead to passively acquired immunity.
  • Artificial active immunization of an organism against viruses can be carried out, for example, by inactivated viruses, viral proteins or peptides derived from viruses, which, for example, induce neutralizing antibodies. Neutralizing antibodies have been described for various viral diseases and can be induced in the organism by the administration of certain antigens, in particular virus proteins. Such an activation or induction of an immune response is called vaccination.
  • a human monoclonal antibody (2F5) described in 1993 shows that 20 can be induced in HIV-infected persons and that could be obtained from an HIV-positive patient via a cell culture.
  • This antibody has a virus-neutralizing spectrum that encompasses almost all subtypes of HIV; the antibodies bind to an epitope located at the N-terminal of the transmembrane passage of the transmembrane coat protein gp41. It could
  • gp41 In addition to the neutralizing antibodies that can be used for the therapy, a further therapy was developed which is directed against gp41.
  • T-20 One of these peptides, T-20, contains the ELDKWA sequence already described.
  • a major disadvantage of the vaccination strategies presented, especially against gp120, o is that the vaccines used are not able to prevent the emergence of new virus variants or modifications in the course of the virus disease (escape mutants).
  • the neutralizing antibodies formed against the original virus are unable to interact with the mutated virus in such a way that successful preventive protection or effective therapeutic treatment of the infected organism is possible.
  • the object of the invention was therefore to produce a vaccine which can be used in the prevention, diagnosis and therapy of viral diseases, in particular retroviral diseases.
  • an immunogenic construct comprising amino acid sequences selected from a viral transmembrane coat protein which is associated with the virus membrane via at least one membrane passage, comprises at least one fusion domain and at least two alpha-helical structures, the amino acid sequences being selected from ( i) a first region of the protein located between the membrane passage and a first alpha-helical structure as well
  • a construct is also suitable which comprises the DNA coding the respective amino acid sequence, the presence of both regions in turn being important in the coding sequence.
  • An immunogenic construct is thus claimed, which consists of different amino acid sequences.
  • the claimed amino acid sequences are to be selected from a viral transmembrane coat protein.
  • This coat protein has to fulfill the requirement that it is associated with the virus membrane via at least one membrane passage and that it has at least one fusion domain and at least two alpha-helical structures.
  • the skilled worker is aware that several coat proteins meet these requirements, such as. B.GP2, gp20, gp30, gp37, gp160, p15E, HA2, F2 and others
  • Each of these coat proteins is a viral transmembrane coat protein which has at least one membrane passage, a fusion domain and two alpha-helical structures.
  • the person skilled in the art has to select two regions of amino acid sequences from the viral transmembrane coat proteins mentioned.
  • the first region is a freely selectable segment of the coat protein between the membrane passage of this coat protein and the first alpha-helical structure which this coat protein has.
  • the second area to be selected from the above-mentioned coat protein is the Section that lies between the fusion domain of the transmembral coat protein and the second alpha-helical structure of this coat protein, wherein the alpha-helical structure, the membrane passage and / or the fusion domain can be part of the immunogenic construct. The combination of both areas leads to the induction of the neutralizing antibodies.
  • the immunogenic construct comprises two amino acid sequences, wherein these two amino acid sequences can be selected from very specific regions of viral transmembrane envelope proteins.
  • an immunogenic construct which comprises at least two amino acid sequences, can induce neutralizing antibodies in an organism and can thus optionally be used as vaccine together with auxiliaries known to the person skilled in the art.
  • an immunogenic construct is any agent which is suitable for inducing neutralizing antibodies.
  • Such an antibody response provides antibodies in the organism that have a neutralizing effect on the respective retrovirus or another virus.
  • the neutralization of a virus is understood to mean any mechanism which prevents viruses from infection in vivo or in vitro and prevents their multiplication in the preventive sense or inhibits the further multiplication of the viruses in the therapeutic sense or a Combination therapy can be more effective.
  • the construct according to the invention activates the immune system and induces the formation of neutralizing antibodies.
  • the neutralizing antibodies are advantageously directed, in particular, against the viral structures by which they were induced, cross-reacting antibodies not being excluded according to the invention.
  • transmembrane envelope proteins When infected with enveloped viruses, including retroviruses including HIV, there are interactions between the surface envelope proteins and cellular receptors, which then lead to changes in the conformation of the transmembrane envelope protein and to fusion with the cell membrane (Fig. 1, Fig. 2).
  • the transmembrane envelope proteins contain highly conserved domains that play an important role in the infection process and are therefore excellent targets for the induction of broadly neutralizing antibodies.
  • Envelope proteins have, among other things, a component that is anchored in the membrane and a component that at least partially and temporarily protrudes outwards from the membrane.
  • the selected amino acid sequences preferably originate from the part protruding from the membrane.
  • This transmembrane coat protein comprises an ectodomain, an anchor and a cytoplasmic part, the ectodomain having a fusion domain, a first alpha-helical structure, a cysteine ioop and a second alpha-helical structure. Following the second alpha-helical structure, the C-terminal is followed by an anchor domain that anchors the transmembrane coat protein gp41 in the virus membrane.
  • the selected amino acid sequences which can be, for example, domains, peptides or recombinant proteins or fragments thereof, can be obtained in various ways by the person skilled in the art, preferably by peptide synthesis or genetic engineering. Of course, it is also possible not to use the amino acid sequences, but rather the DNA encoding them. For example, the DNA can be packaged in a vector. The corresponding amino acid sequence is then encoded in the cells. Such methods are known to the person skilled in the art from gene therapy.
  • a region which can also be referred to as a peptide section, is selected between the fusion domain and the first alpha- helical structure.
  • a second peptide is selected from the area between the membrane and an alpha-helical structure facing it. In the sense of the invention means choose between two areas that the flanking areas such.
  • B. membrane passage, alpha-helical structure and / or fusion domain can be at least partially components of the selected section.
  • amino acid sequences selected according to the invention between the membrane passage and one alpha-helical structure and between the fusion domain and the other alpha-helical structure are only used in combination and regions of the membrane passage, the fusion domain and / or partially or completely include the alpha-helical structure or structures.
  • the alpha-helical structure facing the membrane has a smaller spatial distance from the membrane if the coat protein is represented or assumed as a linear, non-folded structure. Accordingly, the structure facing is spatially closer to the membrane passage of the linear protein. It is of course possible that the position of individual components of the coat protein is changed by natural or artificial folding processes.
  • amino acid sequences selected from the coat protein e.g. Peptides or protein domains that correspond to the regions in the vicinity of the alpha-helical structures can be removed from the total protein or, after their natural sequence sequence is known, can be obtained synthetically or by genetic engineering.
  • the peptides, recombinant or viral proteins thus obtained are used as an immunogenic construct by being applied to an organism.
  • the person skilled in the art can determine the size of the selected amino acid sequences by routine experiments, e.g. measure antibody production or response.
  • two amino acid sequences are selected from the area of an ectodomain of a transmembrane coat protein of a virus, the first amino acid sequence from the area between the fusion domain and a subsequent alpha-helical structure flanking or offset therefrom and the second amino acid sequence from the area between the Membrane of the virus and the next alpha-helical structure is selected.
  • Synthetic peptides, recombinant proteins or a DNA which codes these amino acid sequences are produced according to these amino acid sequences. The selection can be made in such a way that the amino acid sequences still encompass regions of the alpha-helical structure or the anchor structure that anchors the coat protein to the membrane.
  • enveloped viruses including retroviruses
  • retroviruses can also be used to obtain immunogenic constructs according to the invention, further preferred are: FeLV, MuLV, BIV, CAEV, EIAV1, FIV, OMVV, SIVmac, SIVcpz, VILV, RSV, ALV, JSRV, SMRV, SRV, GALV, BLV, HTLV-1, HTLV-2, Marburg Virus, Ebola, SARS virus, influenza
  • Virus, measles virus, mumps virus and / or HPV-1 All amino acid sequences, peptides or recombinant proteins or viral proteins obtained in this way can be used as an immunogenic construct in order to generate neutralizing antibodies against these viruses, although it cannot be ruled out according to the invention that cross-reactivities occur, so that, for example, an immunogenic construct which is used for Example from MuLV or complete artificially obtained, can also have an effect against, for example, HIV or FeLV.
  • the neutralizing antibodies induced by the immunogenic construct are directed against the viruses from which the respective peptides are obtained.
  • the immunogenic constructs can also be recombinant proteins which consist of parts of the transmembrane envelope protein of one virus and the two domains of another virus according to the invention, so-called hybrids.
  • DNA is used for the immunization, which corresponds to these peptides or recombinant proteins of these viruses.
  • a combination between DNA immunization and subsequent immunization with peptides or recombinant proteins or in a multiple sequence is also preferred.
  • the neutralizing effect of the antibodies on enveloped viruses, including the retroviruses, with regard to their prophylactic potential, is shown, for example, as an inhibition of virus infection, an inhibition of syncytium formation, an inhibition of the fusion between virus and target membrane, and a reduction or stabilization of the rate of virus multiplication in one Organism or otherwise.
  • the neutralizing effect with regard to its therapeutic effect can consist, for example, in that certain antiviral drugs work better, for example as a desired side effect, through the induction or application of the antibodies, or the number of side effects of these drugs is reduced by reducing the dose. This means that the effect of the antibodies in the sense of the invention is not limited to eliminating the viruses, but rather encompasses the entire spectrum of advantageous effects in therapy or prophylaxis.
  • the at least two peptides or recombinant proteins or their corresponding DNA can be used alone or in combination, if appropriate, with other antigens of interest.
  • they can be used with other antigens as physical mixtures or chemically bound to one another with or without a spacer molecule.
  • the two peptides or recombinant proteins according to the invention can be chemically or physically linked to one another.
  • carrier peptides, proteins or carrier substances can be, for example, albumins, the KLH, the MAP and other proteins which are known to the person skilled in the art for their immunogenic capacity; as
  • Carrier substances are furthermore preferably thyroglobulin or BSA. These proteins can be bound by non-peptide bonds, such as a disulfide bridge or calcium ion bonds, but it is also possible that they are linked by a peptide bond.
  • the peptides can of course be substitution, deletion and addition analogs of the peptides according to the invention.
  • the viruses can be all viruses which have a membrane with which envelope proteins or similar structures are associated, these structures having to have at least one ectodomain which contains a fusion domain and / or an alphachical structure.
  • the membrane of the virus can be any structure that includes lipids, as long as this enables a connection to proteins.
  • the introduction of the immunogenic construct into an organism can take place in any way which enables the immune system to be brought into contact with the construct in such a way that an antibody response is induced.
  • This can be done, for example, by ingesting the immunogenic construct orally or rectally, enterally or parenterally, or by injecting it directly into the body, for example into selected organs such as the spleen or into blood vessels Vaccination by injection.
  • Preferred injections are intradermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous injection.
  • DE 198 51 282 A1 describes a method for applying antigens to mucous membranes, which is included in the disclosure of the present invention. Further applications are shown below in connection with the method according to the invention.
  • the application of the DNA used for the immunization happens e.g. with the help of so-called vaccination pistols, which insert the DNA into the skin using gold balls or with syringes, which can insert the DNA under the skin or into the muscle.
  • Amino acid sequences e.g. two peptides or recombinant proteins - which are parts of defined domains and are positioned between other defined domains - from a coat protein of a virus can be used as a simple and effective immunogen to be provided.
  • two peptides or recombinant proteins or the corresponding DNA Through the interaction of the two peptides or recombinant proteins or the corresponding DNA, at least one epitope is presented to the immune system so effectively that neutralizing antibodies against viruses are generated.
  • the construct according to the invention is artificial in the sense that it does not represent a complete coat protein which occurs naturally, ie the natural complete coat proteins are not encompassed by the teaching according to the invention.
  • the construct When used as a vaccine naturally occurring transmembrane coat proteins isolated from the virus, or corresponding soluble ectodomains of the transmembrane coat proteins (except HIV) are used.
  • the construct consists of two amino acid sequences that are not chemically or otherwise linked. However, it can be advantageous if the amino acid sequences are present directly or in association with one another via a linker or a support. It is further preferred that the selected amino acid sequences from one coat protein are introduced into another viral coat protein or fragments thereof by addition or substitution or other methods known to the person skilled in the art. Accordingly, the carrier of the selected amino acid sequences of one virus can be the transmembrane coat protein of another virus.
  • adjuvants can be added to the immunogenic construct or to all means which can be produced therefrom, in particular the vaccine, the vaccine become.
  • Known adjuvants for human vaccines are, for example, aluminum compounds such as aluminum hydroxide or aluminum phosphate.
  • Aluminum hydroxide is a component of numerous inactivated or subunit vaccines, inter alia in the case of hepatitis B virus vaccines, and is therefore well known to the person skilled in the art.
  • Other known adjuvants are, for example, MF 59 in the Fluad.
  • peptides or proteins enables a specific immune response against these, enhances or modifies an adjuvant in the sense of the invention.
  • an adjuvant in the sense of the invention.
  • the co-application of egg albumin in complete Freund's adjuvant can, under certain circumstances, cause an increased formation of cell-mediated immunity and thus support the effect of neutralizing antibodies.
  • Other adjuvants of interest are, for example, saponins, such as, for example, QS 21, muramyl dipeptide, muramyl tripeptide and compounds with a muramyl peptide nucleus, proteins such as, for example, gamma interferon and TNF or phosphate dibylcholine, squalene or the polyols known to those skilled in the art.
  • DNA which itself has an immunostimulatory property, or a protein can
  • Adjuvant effect including encoding cytokines, applied in parallel or in a construct.
  • immunogenic constructs which are present either as a recombinant protein or as a synthetic peptide with the above-mentioned modifications, can also be used in combination with others Vaccines, including those that are already commercially available, can be used regardless of whether the other vaccine is directed against the same virus or against other viruses (combination vaccination).
  • antigen refers to a compound containing one or more domains against which an immune response is desired.
  • the binding sites of the antibodies in these domains are called epitopes.
  • Complex mixtures of antigens are also included in this definition, such as killed cells, bacteria or viruses or fractions thereof, in each case in connection with the peptides according to the invention, recombinant proteins or the DNA used for immunization.
  • admixing denotes the addition of an excipient to the peptides according to the invention, recombinant proteins, complex mixtures and / or adjuvant of interest, for example by mixing dry reagents or mixing a dry reagent with a reagent in solution or suspension, or mixtures aqueous formulations of reagents.
  • excipient refers to a pharmaceutical
  • Non-therapeutic carrier added to the composition which is pharmaceutically acceptable, i.e. non-toxic to recipients at the dosages and concentrations used.
  • Suitable excipients and their formulations are known to the person skilled in the art, for example from Remington's pharmaceutical science, 16th edition, 1980.
  • Vaccine refers to a formulation of the peptides or recombinant proteins of the invention or the DNA useful for immunization, optionally in combination with another antigen or other DNA which is intended to provide a prophylactic, therapeutic or diagnostic response in or outside of one Provide host when the host is exposed to the antigens.
  • exemplary vaccines include
  • Vaccines against diseases such as HIV / AIDS, SARS, FeLV and others.
  • therapeutic amount refers to an amount that prevents or ameliorates symptoms of a disorder or responsive, pathologically physiological condition.
  • the amount of immunogenic construct to be used by a healthy person in the case of prophylaxis or to a patient in the case of therapy is formulated and the dose is determined in accordance with customary medical practice, the disorder to be treated, the condition of the individual patient, the administration site, the administration method and other factors known to treating physicians.
  • the dose of vaccines administered will depend on the properties of the antigen used, that of the immunogen, for example its binding activity and in vivo plasma half-life, as well as the concentration of the antigen in the formulation, route of administration, site and location Rate of dosage, the clinical tolerance of the individual (human and animal), the pathological affection of the patient and the like, as is known to doctors or other experts.
  • dosages of about 0.1 to 1000 mg per individual per administration are preferred.
  • Different doses can also be used during a sequence of successive vaccinations; the attending physician can administer a first vaccination and then boost (boost) with relatively low doses of adjuvants; here the options protein-protein, peptide-peptide, protein-peptide or vice versa, DNA-protein / peptide are preferred.
  • boost boost
  • injections are a preferred route for the therapeutic administration of the vaccines, such as the encapsulated or carrier-bound vaccines, although aerosol delivery via catheters or surgical tubing is also can be applied.
  • Alternative routes include suspensions, tablets, capsules and the like for oral administration, commercially available nebulizers for liquid formulations and inhalations of lyophilized or aerolyzed compounds and suppositories for rectal or vaginal administration.
  • Liquid formulations can be used, for example, from powder formulations. Proteins, peptides and DNA are injected for prophylactic immunization.
  • the suitability of the chosen vaccination parameters can be determined by taking serum aliquots from the patient - that is to say from humans or animals - and testing for antibody titers in the course of the immunization protocol.
  • the amount of T cells or other immune system cells can be determined in a conventional manner in order to obtain an overview of the patient's immunological constitution.
  • the clinical condition of the patient can be observed for the desired effect, for example the anti-infectious effect. Since, for example, HIV or other diseases can be associated with other infections, it is also possible to follow them up.
  • the patient can be boosted with further vaccinations and the vaccination parameters can be modified in a way that an improvement in the immune response can be expected, preferably an increase in the amount of peptide or antigen and / or adjuvant, complexation of the peptides with a carrier or its conjugation to an immunogenic protein or variation of the route of administration.
  • both an aqueous formulation and dry peptides or adjuvants can be mixed with an excipient in order to ensure a stabilizing effect before the treatment, for example with a solvent.
  • An aqueous solution of a peptide can be a peptide in suspension or a solution.
  • the recombinant protein according to the invention, the DNA construct and / or the peptide can be introduced in a solution with a preservative.
  • suitable preservatives of the suspension or solutions include phenol, benzyl alcohol, m-cresol,
  • the formulations of the peptides or the antigen constructs can contain components in amounts which are not detrimental to the production of stable forms and in amounts which are suitable for effective, safe pharmaceutical administrations.
  • other pharmaceutically acceptable excipients known to those skilled in the art may form part of the vaccines or formulations of the invention. These include, for example, salts, various fillers, additional buffering agents, chelating agents, antioxidants, cosolvents and the like.
  • the immunogenic construct is associated with a liposomal formulation. This can be done, for example, in such a way that the immunogenic construct is enclosed in a liposome or anchored on the liposome surface. It is known to the person skilled in the art that artificial or natural membranes of liposomes can have an immunostimulating effect, in particular if the antigenic components are coupled to the surface of the liposomes or inside of the liposomes are enclosed or simply mixed together with the liposomes. It is preferred that the immunostimulating effect is increased in that the liposomes are "spiked" with transmembrane or fusiogenic glycoproteins. Such formulations of liposomes can be applied parentrally.
  • a mucosal immune response that can be induced with the spray is preferably suitable for the treatment of SARS.
  • the antigenic component or the immunogenic construct must be applied to the mucous membrane in such a state that it is able to penetrate the mucous membrane or to be absorbed by it. Therefore, the vesicle must be biocompatible with the mucus and have a certain degree of hydrophilicity. Structures of this type are known to the person skilled in the art, for example from EP 0682528, the teaching of which is included in the disclosure content of the invention.
  • the liposomal composition can comprise one or more additional pharmaceutical carriers which are selected from surface-active substances and absorption promoters such as, for example, polyoxyethylene alcohol ether, bile salts and their derivatives, fusidic acid and their derivatives, oleic acid, lecithin, lysolecithins, Tween® 21 to 85, etc.
  • additional pharmaceutical carriers which are selected from surface-active substances and absorption promoters such as, for example, polyoxyethylene alcohol ether, bile salts and their derivatives, fusidic acid and their derivatives, oleic acid, lecithin, lysolecithins, Tween® 21 to 85, etc.
  • water absorbing polymers such as glycofurol, polyethylene glycol 200 to 7500, polyvinyl pyrrolidone, propylene glycol or polyacrylic acid, gelatin, cellulose and derivatives, etc .
  • Substances that inhibit enzymatic degradation, such as aprotinin, etc . organic solvents such as alcohols such as ethanol, glycerol, benzyl alcohol, etc .; or ethyl acetate, etc .
  • hydrophobic agents such as vegetable oil, soybean oil, peanut oil, coconut oil, corn oil, olive oil, sunflower oil, "miglyols" or mixtures thereof, etc .
  • pH regulators such as nitric acid, phosphoric acid, acetic acid, citrates, etc .
  • Preservatives and osmotic pressure regulators such as
  • Glycerol sodium chloride, methyl paraoxybenzoate, benzoic acid, etc .
  • Liposome and / or emulsion formulations such as lecithins, etc .
  • microencapsulated formulations Blowing agents such as butane.
  • the peptide segments are optionally associated with one another or enclosed in liposomes connected to a carrier, the inclusion in liposomes in the sense of the invention not necessarily meaning that the peptides are present inside the liposomes
  • inclusion in the sense of the invention can also mean that the peptides are associated with the membrane of the liposomes, for example in such a way that they are anchored on the outer membrane.
  • Such Representation of the peptides according to the invention in or on the liposomes is advantageous if the person skilled in the art selects the liposomes in such a way that they have an immunostimulating effect.
  • the lipids can be simple lipids such as esters and amides or complex lipids such as glycolipids such as cerebrosides or gangliosides, sphingolipids or phospholipids.
  • the first helical structure is a C-terminal helix and the second alpha-helical structure is an N-terminal helix of the viral coat protein.
  • the person skilled in the art can preferably choose a region between the fusion domain and the N-terminal helix and a region between the transmembrane passage and the C-terminal helical structure, the fusion domain, the region of the Transmembrane passage and / or the alpha-helical structure, if it is one, or the alpha-helical structures can be wholly or partly involved in the immunogenic construct.
  • the peptides according to the invention are obtained from HI viruses, they are preferably peptides or recombinant proteins or DNA which have the amino acids 519 to 564 (N-terminal sequence) and 650 to 683 (C-terminal sequence) of the HIV-1 reference Genome (NCBI database: K03455, HIV HXB2 CG) correspond, or fragments or subunits thereof, which are functionally analogous to the above-mentioned domains, that is to say which are able to induce neutralizing antibodies and, in the particularly preferred case, to give protection against infection , It is of course known to the person skilled in the art that, because of the variability in different subtypes of HIV-1, there are sequence variations within these sequences; Such sequence variations are also covered by the invention. This also applies to partial sequences of the consensus sequences 519 to 564 and 650 to 683, including chemical modifications of individual amino acids, the linking of the sequences by means of linkers and sequences with additional amino acids added for the purpose of multimerization of the sequences.
  • N-terminal sequences are:
  • Preferred C-terminal sequences are:
  • a peptide is selected in each case from the group of the N-terminal sequences and the C-terminal sequences, it being possible to provide the immunogenic construct according to the invention by combining at least two sequences. It can also be applied as a recombinant protein or DNA (vaccine, vaccine).
  • the vaccine is a fragment of coat proteins selected from the group comprising GP2, gp20, gp21, gp30, gp36, gp37, gp40, gp41, gp45, gp160, p15E, E2, HA2 and / or F2.
  • GP2 gp20, gp21, gp30, gp36, gp37, gp40, gp41, gp45, gp160, p15E, E2, HA2 and / or F2.
  • the at least two peptide sections, recombinant proteins or corresponding DNA are selected from the group (where N stands for N-terminal sequences and C for C-terminal sequences):
  • N AVGLAIFLLVLAIMAITSSLVAATTLVNQHTTAKV
  • C SLSDTQDTFGLETSIFDHLVQLFDWTSWKDWIK, preferred for BIV (transmembrane coat protein gp40);
  • N GVGLVIMLVIMAIVAAAGASLGVANAIQQSYTKAAVQTLAN C: AMTQLAEEQARRIPEVWESLKDVFDWSGWFSWLKYI, preferred for CAEV (transmembrane coat protein); N: FGISAIVAAIVAATAIARSATMSYVALTEVNKIMEVQNH C: LAQSMITFNTPDSIAQFGKDLWSHIGNWIPGLGASIIKY, preferred for EIAV1 (transmembrane coat protein gp45); N: SSSYSGTKMACPSNRGILRNWYNPVAGLRQSLEQYQVVKQPDYLLVPE C: MDIEQNNVQGKIGIQQLQKWEDWVRWIGNIPQYLK, preferred for FIV (transmembrane coat protein gp36); N: GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSSYTRTAVQSLANATAAQQN C: QVQIAQRDAQRIPDVWKALQEAFD
  • N LGALGFLGAAGSTMGAAAVTLTVQARQLLSGIVQQQNNLL
  • C EEAQSQQEKNERDLLELDQWASLWNWFDITKWLWYIK, preferred for SIVcpz (transmembrane protein gp41);
  • N FLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQ FLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQQNNLLRAIEAQQHLL FLGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHML
  • C SQNQQEKNEQELLELDKWAGLWSWFSITNWLWY SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWY SQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWY preferably HIV-1 (gp41 transmembrane envelope protein);
  • N GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSYTRTAVGSLANATAAQQE C: EAALQVHIAQRDARRIPDAWKAIQEAFNNWSSWFSWLKY, preferred for Visna virus (transmembrane coat protein gp41); N: LGFLGFLATAGSAMGARSLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLL C: EEAQIQEKNMYELQKLNSWDILGNWFDUSWVKYIQ, preferred for HIV-2 (transmembrane coat protein gp36); N: WGPTARIFASILAPGVAAAQALREIERLACWSVKQANLTTSLL C: KFQLMKKHVNKIGVDSDPIGSWLRGIFGGIGEWAVH, preferred for RSV (transmembrane coat protein gp37); N: SVSHLSSDCNDEVQLWSVTARIFASFFAOGVAAQALKEIERLA C: ALQAMKEHTEKIRVEDDOIGDWFTRTFGGLGGWL
  • N TAALITGPQQLEKGLSNLHRIVTEDLQALEKSVSNL
  • C DHSGAIRDSMSKLRERLERRRREREADQGWFEGWFNRS preferred for PERV (transmembrane coat protein p15E);
  • N TALIKGPIDLQQGLTSLQIAMDTDLRALQDSISKLED
  • C SMRRLKERLDKRQLEHQKNLSWYEGWFNRSPWLTT preferred at KoRV (transmembrane coat protein p15E);
  • N SPVAALTLGLALSVGLTGINVAVSALSHQRLTSLIHVLEQDQQ
  • C PLSQRVSTDWQWPWNWDLGLTAWVRET, preferred for BLV (transmembrane coat protein gp30);
  • N AVPVAWLVSALAMGAGVAGGITGSMSLASGKSLLHEV
  • C PILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQ, preferred for HTLV-1 (transmembrane coat protein gp21);
  • N AVPIAVWSVSALAAGTGIAGGVTGSLSLASSKSLLLEVD
  • C SVLQERPPLEKRVITGWGLNWDLGLSQWAREALQ, preferred for HTLV-2 (transmembrane coat protein gp30);
  • N FPNINENTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGI
  • C KNISEQIDQIKKDEQKIGRGWGLGGKWWTSDWG, preferred for the Marburg virus (transmembrane glycoprotein gp36);
  • N LITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTQDEGAAIGLAWIPYFGPAA
  • C KNITDKIDQHHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWI, preferred for Ebola (transmembrane protein GP2);
  • N LITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDF C: DRLNEVAKNLNESLIDLQELKYEQYEKWPWYVW, preferred for SARS virus (E2, transmembrane glycoprotein gp36);
  • C HDVYRDEALNNRFQ
  • N FAGIAIGIAALGVATAAQVTAAVSLVQAQTNARAAAMKNSIQTNRA
  • C TELSKVNASLQNAVKQIKESNHQLQSVSVSSK, preferred for the mumps virus (fusion glycoprotein F2)
  • N FFGAVIGTIALGVATAAQ1TAGIALAEAREARKDIALIKDSIVKTH
  • C TNFLEESKTELMKARAIISVGGWHNTESTQ, preferred for HPV-1 (F2 glycoprotein)
  • BIV Bovine Immunodeficiency Virus
  • CAEV Caprines Arthritis Encephalitis Virus
  • EIAV1 Equine Infectious Anemia Virus
  • FIV Fine Immunodeficiency Virus
  • OMVV Outdoor Maedi-Visna Virus
  • SIVmac Simian Virus Makeficiency
  • SIVcpz Simian chimpanzee immunodeficiency virus
  • HIV-1 human immunodeficiency virus type 1
  • HIV-2 human immunodeficiency virus type 2
  • RSV rous sarcoma virus
  • ALV avian leukosis virus
  • JSRV Jaagsiezte sheep retrovirus
  • SMRV Simrrel Monkey Retrovirus
  • SRV Ses Retrovirus
  • GALV Gabbon monkey leukemia virus
  • MuLV MuLV
  • FeLV fine leukemia virus
  • KoRV kos Retrovirus
  • FLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLS FLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLS, FLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQARQLLS, LLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLS, FLGFLGAAGSTMGAASITLTVQVRQLLS, FLGVLSAAGSTMGAAATALTVQTHTLMK, FLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLLSG1VQQQNNLLRAIEAQQ FLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQQNNLLRAIEAQQHLL FLGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSGIVQQQQNNLLRAIEAQQHML
  • AVGLAIFLLVLAIMAITSSLVAATTLVNQHTTAKV GVGLVIMLVIMAIVAAAGASLGVANAIQQSYTKAAVQTLAN, FGISAIVAAIVAATAIARSATMSYVALTEVNKIMEVQNH, SSSYSGTKMACPSNRGILRNWYNPVAGLRQSLEQYQVVKQPDYLLVPE, GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSSYTRTAVQSLANATAAQQN,
  • LGFLGFLATAGSAMGAASLVTAQSRTLLAVIVQQQQQLLDVV LGALGFLGAAGSTMGAAAVTLTVQARQLLSGIVQQQNNLL
  • GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSYTRTAVGSLANATAAQQE LGFLGFLATAGSAMGARSLTLSAQSRTLLAGIVQQQQLL
  • WGPTARIFASILAPGVAAAQALREIERLACWSVKQANLTTSLL SVSHLSSDCNDEVQLWSVTARIFASFFAOGVAAQALKEIERLA
  • GLSLIILGIVSLITLIATAVTACCSLAQSIQAAHTVDLSSQNVTKVMGT AVTLIPLLVGLGVSTAVATGTAGLGVAVQSYTKLSHQLINDVQALSSTI, AIQFIPLVIGLGITTAVSTGTAGLGVSLTWYTKLSHQLISDBQAISSTI, DPVSLTVALLLGGLTMGSLAAGIGTGTAALIETNQFKQLQ, DP
  • NEQDLLALDKWANLWNWFDISNWLWYIK NEQDLLALDKWANLWNWFDITNWLWYIR
  • NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIK NEKDLLALDSWQNLWNWFDITNWLWYIK
  • NEQELLELDKWASLWNWFSITQWLWYIK NEQELLALDKWASLWNWFDISNWLWYIK
  • NEQDLLALDKWDNLWSWFSITNWLWYIK NEQDLLALDKWASLWNWFDITKWLWYIK
  • NEQDLLALDKWASLWNWFSITNWLWYIK NEKKLLELDEWASIWNWLDITKWLWYIK
  • TNFLEESKTELMKARAIISVGGWHNTESTQ these are preferably C-terminal sequences.
  • amino acids have analogous physicochemical properties which advantageously result in these amino acids being able to be exchanged with one another.
  • amino acids include, for example, the group of amino acids (a) glycine, alanine, valine, leucine and / or isoleucine; or the amino acids (b) serine and threonine, the amino acids (c) asparagine and glutamine, the amino acids (d) aspartic acid and glutamic acid; the amino acids (e) lysine and arginine and the group of aromatic amino acids (f) phenylalanine, tyrosine and / or tryptophan.
  • Amino acids within one and the same group (a-f) can be interchanged. It is also possible for amino acids to be replaced by modified amino acids or specific enantiomers. Further modifications are possible according to the teaching according to WO 99/62933 or WO 02/38592.
  • the peptide comprises a linker and / or a spacer which is selected from the group comprising: ⁇ -aminocarboxylic acids and their homo- and heterooligomers, ⁇ , ⁇ -aminocarboxylic acids and their branched homo- or heterooligomers, other amino acids and the linear and branched homo- or heterooligomers (peptides); Amino-oligoalkoxy-alkylamines; Maleimidocarboxylic acid derivatives; Oligomers of alkyl amines; 4-alkylphenyl derivatives; 4-oligoalkoxyphenyl or 4-oligoalkoxyphenoxy derivatives; 4-oligoalkyl mercaptophenyl or 4-oligoalkyl mercaptophenoxy derivatives; 4-oligoalkylaminphenyl or 4-oligoalkylaminyphenoxy derivatives; (Oligoalkylbenzyl) phenyl or 4-oligoalkylbenzyl) phenoxy derivatives;
  • Synthetic peptides which correspond to the N-terminal and / or C-terminal sequences or are fragments thereof can preferably be multimerized by chemical crosslinkers or coupled to a carrier molecule such as BSA, dextran, KLH or others.
  • a carrier molecule such as BSA, dextran, KLH or others.
  • Preferred crosslinkers are homobifunctional crosslinkers, preferably: NHS esters, such as DSP, DTSSP, DSS, BS, DST, sulfo-DST, BSOCOES, sulfo-BSOCOES, EGS, sulfo-EGS, DSG or DSC, homobifunctional imidoesters, such as DMA, DMP , DMS or DTBP, homobifunctional sulfhydryl-reactive crosslinkers, such as DPDPB, BMH or BMOE, difuorobenzene derivatives, such as DFDNB or DFDNPS, homobifunctional photoreactive crosslinkers, such as BASED, homobifunctional aldehydes, such as formaldehyde or glutaraldehyde, 1-epoxydyl ether, such as 1-epoxides, such as 1-epoxides , homobifunctional hydrazides, such as adipic dihydrazi
  • Heterobifunctional crosslinkers in particular amine-reactive and sulfhydryl-reactive crosslinkers, such as SPDP, LC-SPDP, sulfo-LC-SPDP, SMPT, sulfo-LC-SMPT, SMCC, sulfo-SMCC, MBS, sulfo-MBS, SIAB, sulfo-SIAB, are also preferred , SMPB, sulfo-SMBP, GMBS, sulfo-GMBS, SIAX, SIAXX, SIAC, SIACX or NPIA, carbonyl-reactive and sulfhydryl-reactive crosslinkers such as MPBH, M 2 C 2 H or PDPH, amine-reactive and photoreactive crosslinkers such as NHS-ASA, sulfo -NHS-ASA, sulfo-NHS-LC-ASA, SASD, HSAB, sulfo-HSAB, SANPAH,
  • the peptides according to the invention and recombinantly produced structures are linked by peptide bridges with a length of 0 to 50 amino acids.
  • This also includes recombinant proteins consisting of two N-terminal and one C-terminal sequence or hexamers consisting of three N-terminal sequences and three C-terminal sequences, or multimers of the recombinant structures listed above, with the N- and the C-terminal sequences one each Peptide bridge from 0 to 50 amino acids can be present.
  • the peptides can be provided with specific fusion fractions either at the N- or at the C-terminus, such as, for example, CBP (calmodulin binding protein), His-Tag and / or others. Similar constructs can also be encoded by DNA used for immunization.
  • the peptide mixture and protein mixture is selected from the group comprising: a) at least two peptides or recombinant proteins comprising an amino acid sequence according to SEQ ID No 1 to 104, b) peptides or recombinant proteins comprising an amino acid sequence which a has sufficient homology to be functionally analogous to an amino acid sequence according to a), c) peptides or recombinant proteins according to an amino acid sequence a) or b) which are modified by deletions, additions, substitutions, translocations, inversions and / or insertions and functionally analogous to one Amino acid sequence according to a) or b).
  • amino acid sequence e.g. the peptide or recombinant protein, which has sufficient homology to be functionally analogous to one of the amino acid sequences according to SEQ ID No 1 to 104, at least 40% homologous to these.
  • these amino acid sequences are at least 60%, preferably 70%, preferably 80%, very particularly preferably 90%, homologous to one of the amino acid sequences according to SEQ ID No 1 to 104.
  • the peptide or recombinant protein essentially consists of the amino acid sequence
  • the peptide consists of modifications of these sequences which were obtained according to WO 99/62933 and WO 02/38592, these peptides naturally generating and binding antibodies in the sense of the invention.
  • the peptide sections of the immunogenic construct are associated with one another at other peptides or proteins or with a carrier.
  • the at least two peptides according to the invention of the immunogenic construct are linked to one another via peptide or non-peptide bonds.
  • the non-peptide bonds are known to the person skilled in the art and include, for example, imino, ester, azo, hydrazite, semicarbacite and other bonds.
  • the carriers in the sense of the invention can be proteins which stimulate the antibody response due to their immunogenic behavior, but also pharmaceutical auxiliaries known to the person skilled in the art, such as QS21, GPI-0100 or other saponins, water-oil emulsions such as, for example Montanide, polylysine, polyagenin compounds or others such as phosphate buffered saline, water, various types of detergents, sterile solutions and the like.
  • pharmaceutical auxiliaries known to the person skilled in the art, such as QS21, GPI-0100 or other saponins, water-oil emulsions such as, for example Montanide, polylysine, polyagenin compounds or others such as phosphate buffered saline, water, various types of detergents, sterile solutions and the like.
  • the invention also includes antibodies which are produced or induced by the peptides according to the invention or by the immunogenic construct according to the invention.
  • the peptides or proteins can be produced chemically or by recombinant DNA technology or otherwise.
  • at least one immunogenic construct according to the invention is brought into contact with an organism in such a way that it is able to produce antibodies against this construct which can be obtained and isolated by the person skilled in the art using the known methods.
  • the invention also relates to anti-idiotype antibodies.
  • Antibodies carry idiotypes, areas near their antigen recognition sites that are themselves antigenic and able to stimulate antibody production. Antibodies that are specific for the antigen binding sites are called paratope-specific anti-idiotype antibodies. These antibodies carry the same recognition site as the antigen that initially stimulated antibody production; Marx, "Making Antibodies without Antigens", 1986.
  • paratope-specific anti-idiotypic antibodies with partially the same structure as HIV, SARS or other viruses can be obtained by immunizing an animal with a monoclonal HIV-1, SARS- or FeLV antibodies to the viruses mentioned.
  • These paratope-specific anti-idiotypic antibodies which have a certain structure identical to that of the immunogenic parts of the viruses mentioned, are suitable for triggering an immune response and can accordingly also be used as a vaccine.
  • the invention also includes pharmaceutical compositions which comprise at least one of the immunogenic constructs according to the invention, optionally together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical agent in the sense of the invention is any agent in the field of medicine which can be used in the prophylaxis, diagnosis, therapy, follow-up or follow-up treatment of patients who have come into contact with enveloped viruses, including retroviruses, in such a way that at least temporarily could establish pathogenic modification of the overall condition or the condition of individual parts of the organism.
  • the pharmaceutical agent it is possible for the pharmaceutical agent to be a vaccine or an immunotherapeutic in the sense of the invention.
  • the pharmaceutical agent in the sense of the invention can comprise, for example, an acceptable salt or components thereof. These can be, for example, salts of inorganic acids, such as, for example, phosphoric acid or salts of organic acids.
  • the salts are free of carboxyl groups and have been derived from inorganic bases such as sodium, potassium, ammonium, calcium or iron hydroxides or from organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, 2-ethyl aminoethanol, histidine and others.
  • inorganic bases such as sodium, potassium, ammonium, calcium or iron hydroxides
  • organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, 2-ethyl aminoethanol, histidine and others.
  • liquid carriers are sterile aqueous solutions which do not comprise any further materials or active ingredients and for example water or those which comprise a buffer such as sodium phosphate with a physiological pH or a physiological saline solution or both, such as phosphate-buffered sodium chloride solution.
  • Other liquid carriers may include more than just a buffer salt, such as sodium and potassium chloride, dextrose, propylene glycol, polyethylene glycol, or others.
  • Liquid compositions of the pharmaceutical compositions can additionally comprise a liquid phase, but with the exclusion of water.
  • additional liquid phases are glycerol, vegetable oils, organic esters or water-oil emulsions.
  • the pharmaceutical composition or the pharmaceutical composition typically contains at least 0.1% by weight of the peptides according to the invention, based on the total pharmaceutical composition.
  • the respective dose or the dose range for the administration of the pharmaceutical agent according to the invention is large enough to achieve the desired prophylactic or therapeutic effect of the formation of neutralizing antibodies.
  • the dose should not be chosen so that undesirable side effects dominate. In general, the dose will vary with the age, constitution, gender of the patient and, of course, the severity of the disease.
  • the individual dose can be set in relation to the primary illness as well as in relation to the occurrence of additional complications.
  • the exact dose can be determined by a person skilled in the art using known means and methods, for example by determining the antibody titer depending on the dose or depending on the vaccination schedule or the pharmaceutical carrier and the like.
  • the dose can be selected individually depending on the patient.
  • a dose of the pharmaceutical agent that is still tolerated by the patient can be one whose range in the plasma or in individual organs is locally in the range from 0.1 to 10000 ⁇ M, preferably between 1 and 100 ⁇ M.
  • the dose can also be calculated in relation to the patient's body weight.
  • a typical dose of the pharmaceutical agent would have to be set in a range between 0.1 ⁇ g to 100 ⁇ g per kg body weight, preferably between 1 and 50 ⁇ g / kg.
  • Organs to determine This would be the case, for example, if the pharmaceutical agent according to the invention is placed, for example in a biopolymer, introduced into the respective patient, near certain organs by means of an operation.
  • a biopolymer Several biopolymers are known to the person skilled in the art which can release peptides or recombinant proteins in a desired manner.
  • Such a gel can, for example, 1 to 1000 ⁇ g the amino acid sequences according to the invention, for example peptides or recombinant proteins or the pharmaceutical composition per ml of gel composition, preferably between 5 to 500 ⁇ g / ml and particularly preferably between 10 and 100 mg / ml.
  • the therapeutic agent is administered as a solid, gel-like or liquid composition.
  • the pharmaceutical agent is preferably used as a vaccine after infection or as a preventive vaccination.
  • the vaccination is advantageously carried out in such a way that active vaccination protection develops after application in the organism.
  • the vaccination it is also possible for the vaccination to be carried out immediately before or shortly after the infection or to be administered several times as therapy. It is known to the person skilled in the art that induction of a response of neutralizing antibodies can be advantageous at almost any time, even after infection, so that vaccination in the sense of the invention also results in the application of the pharmaceutical agent according to the invention weeks, months, years or decades later infection with the respective virus.
  • the pharmaceutical agent may be preferred
  • embodiment of the invention comprise further immunogenic components, in particular selected from the group consisting of Bordetella, Haemophilus, Borrelia, Pseudomonas, Corynebacteria, Mycobacteria, Streptococci, Salmonella, Pneumococci, Staphylococci and / or Clostridia. It is known that the sole administration of antigens often does not lead to an adequate formation of antibodies. Because epitopes under certain conditions
  • the immunogenic component can also be derived from another virus, preferably selected from the family of Hepadnaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Retroviridae, Togaviridae or Flaviviridae; the virus can be, for example, an HIV, herpes simplex virus, influenza virus, hepatitis virus.
  • the modifications already shown for the peptides can also be applied to the pharmaceutical agent.
  • the immunogenic component can be a protein of these viruses or a fragment - ie a peptide - of these.
  • the immunogenic component in the pharmaceutical agent with both peptides according to the invention or recombinant proteins, that is to say the construct according to the invention.
  • Such a combination in the sense of the invention is preferably carried out by a covalent bond.
  • the immunogenic component and the peptides according to the invention to be adsorbed together on a carrier, this carrier being for example an albumin, a KLH or another pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention accordingly also comprises a method for producing an immunogenic construct which consists of the (a) peptides according to the invention or recombinant proteins or (b) the pharmaceutical composition according to the invention and microorganisms used as (c) additional immunogens, such as bacteria or viruses ,
  • a preferred method comprises the steps of treating the peptides according to the invention and / or the immunogenic microbial structures with an activator suitable for the covalent binding, optionally removing excess activator, incubating the solution thus obtained and purifying it.
  • Homo-, hetero-, bifunctional cross-linkers such as, for example, N-hydroxysuccinimide esters, imido esters, maleimido derivatives, N-hydroxysuccinimides, pyridyl disulfides or compounds containing keto groups can preferably be used as activators for the covalent bond.
  • The. Purification can be done by centrifugation, filtration, precipitation, dialysis or a chromatographic method. Gel filtration, affinity-chromatographic purification or ion-exchange chromatography are preferred as the chromatographic method. If the peptides according to the invention in the pharmaceutical composition are applied together with an immunogenic microorganism component on an absorbable carrier material, these carriers can be
  • Gold or platinum or metals such as aluminum or iron are preferred for the metals; among the insoluble or colloidal metal compounds, adjuvants such as aluminum, zinc and / or iron hydroxide are preferred.
  • Both All resorbable or biodegradable materials can be used in polymer compounds. Of course, it is also possible to use non-degradable polymer compounds if they are physiologically accepted, such as latex.
  • nucleic acids can of course also be used to enhance an immune response to the peptides according to the invention.
  • the pharmaceutical compositions also comprise cytokines, in particular interleukin-2 and / or CSF.
  • cytokines in particular interleukin-2 and / or CSF.
  • Such substances can be used to increase the activity, preferably for immune stimulation.
  • the invention also relates to the amino acid sequences according to SEQ ID No. 1-104, in particular for use in medicine. These sequences represent a selection from known larger amino acid sequence regions, the selection leading to the surprising result of the induction of neutralizing antibodies, especially if at least two of the amino acid sequences are used together.
  • the amino acid sequences are particularly preferred in the context of a medical indication, ie. H. as therapeutically assigned amino acid sequences.
  • a medical indication ie. H. as therapeutically assigned amino acid sequences.
  • ELDKWA and other sequences disclosed in the references mentioned are not claimed.
  • the invention also relates to the neutralizing antibodies which are produced with the immunogenic construct according to the invention.
  • the invention also relates to a diagnostic kit which comprises a pharmaceutical agent according to the invention.
  • This kit can be used, for example, to diagnose and monitor the course and / or therapy of viral diseases, the following viruses being preferred:
  • BIV Bovine Immunodeficiency Virus
  • CAEV Caprines Arthritis Encephalitis Virus
  • EIAV1 Equine Infectious Anemia Virus
  • FIV Fine Immunodeficiency Virus
  • OMVV Green Maedi-Visna Virus
  • SIVmac Seimian Immunodeficiency Virus from Macaque
  • SIVc immunocytosis (SIV) virus HIV-1 Human Immunodeficiency Virus Type 1
  • HIV-2 Human Immunodeficiency Virus Type 2
  • RSV Rat Sarcoma Virus
  • JSRV Japanese leukosis virus
  • JSRV Jaagsiekte sheep retrovirus
  • GALV Gallbon monkey leukemia virus
  • BLV Bovine Leukemia Virus
  • HTLV-1 Human T-cell leukemia virus type 1
  • HTLV-2 Human T-cell leukemia virus type 2
  • SARS virus pathogen of severe acute respiratory syndrome
  • HPV-1 Human Parainfluenza Virus
  • the diagnostic kit is used for the detection of antiviral antibodies against epitopes on the immunogenic construct, for the detection of neutralizing antibodies against the immunogenic construct and / or for the detection of the virus.
  • the kit may include instructions or information on pharmaceutical delivery or therapeutic treatment procedures.
  • the information can be, for example, an instruction leaflet or another medium which gives the user information about the therapeutic method or vaccination schedule with which the substances mentioned, ie in particular the peptides according to the invention or the pharmaceutical agents according to the invention, in particular vaccines, are to be used .
  • the package insert contains in particular detailed and / or essential information about the healing process. Of course, it is not absolutely necessary for this information to be formulated on a package insert, it is also possible for this information to be communicated, for example, via the Internet.
  • the diagnostic kit relates on the one hand to an immunoassay for the detection of antibodies which are directed against the enveloped viruses, including the retroviruses, and on the other hand to detection of the virus load (virus antigens) in the organism.
  • Appropriate samples are taken in which antibodies or virus antigens are to be detected.
  • a sample In the sense of the invention, the term for a biological or chemical good or a part or a small amount of it, which is to be tested chemically, biologically, clinically or similarly, by sampling, in particular the presence of neutralizing antibodies.
  • Sampling takes place in such a way that the partial quantity taken corresponds to an average of the total quantity. Of course, it can also be preferred that the partial quantity removed should not correspond to the average of a larger quantity.
  • the features determined by examining the sample are used to assess the amount recorded by the sample, which allows conclusions to be drawn about the total amount, for example the blood in an organism or the lymph.
  • the samples can be pretreated by mixing, adding enzymes or markers or otherwise.
  • a sample can in particular be all biological materials, such as biological tissues and fluids, for example blood, lymph, urine, brain fluid and others.
  • a sample refers to any substance that contains or is believed to contain neutralizing antibodies and includes a sample of tissue or fluid that has been isolated from an individual or individuals, including, but not limited to, for example, skin, Plasma, serum, lymph, urine, tears, smears, tissue samples, organs, tumors and also on samples of components of cell cultures.
  • Such a sample can be examined, for example, for the presence of binding antibodies as follows: a) coating a solid phase with the immunogenic construct according to the invention, b) incubating the solid phase with the biological sample, c) incubating the solid phase with an anti human antibody which can detect the classes IgA, IgM, IgG, which is labeled with a detectable label and d) detection of the label to determine the presence of the binding antibodies against the viruses mentioned in the sample.
  • the sample can have different concentrations of urea but also no urea (avidity test). Since neutralizing antibodies can only be detected with difficulty and not quantitatively in this way, they are detected in an infection assay in which the inhibition of the infection of unified cells by the respective virus from the list above is detected by the neutralizing antibodies.
  • the proportion of antibodies against the epitopes on the immunogenic construct can be determined quantitatively from the amount of neutralizing antibodies. Since a correlation was found between the amount of antibodies found binding the immunogenic construct and the amount of neutralizing antibodies, a new rapid test can be carried out in which many sera for neutralizing antibodies can be tested for the first time in a short time. This test allows statements about the success of the immunization in the case of prophylactic application as well as about the progression of the infection. Monitoring the success of therapy in the case of therapeutic application is also possible.
  • kits for the detection of neutralizing antibodies against the immunogenic construct on the basis of a neutralization assay with corresponding competition analyzes and a novel rapid method for the detection of neutralizing antibodies on the basis of an ELISA with the complete immunogenic construct can also be provided.
  • the diagnostic kit also includes the detection of viral antigen for determining the viral load in the samples listed above as follows: a) coating a solid phase with antibodies against the sought-after viral antigens, which in an animal or a human after immunization with the invention were obtained according to the immunogenic construct, b) incubating the solid phase with the biological sample, c) incubating the solid phase with a second, different from the first, antibody against the sought-after viral antigens, which is also in an animal or a human after immunization with the immunogenic construct according to the invention were obtained, d) detection of the coupled second antibody so as to determine the amount of bound antigen.
  • the invention also relates to an amino acid sequence selected from the group comprising the sequences SEQ ID No 1 to 104 for use in the field of therapeutic treatment and diagnostic methods on the human or animal body.
  • the invention accordingly relates to peptides, peptide fragments, recombinant proteins or their fragments, the membrane-associated proteins of certain viruses for certain therapeutic or diagnostic applications. Preference is given to using a mixture of at least two peptides or recombinant proteins from the sequence sequence of an o viral coat protein in accordance with the selection described according to the invention.
  • the invention also relates to a method for inducing an antibody response, the immunogenic construct according to the invention and / or the pharmaceutical agent according to the invention being brought into contact5 with an organism, preferably a human or an animal.
  • This method preferably comprises the formulation of the neutralizing antibody with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the disclosure of the peptides according to the invention makes it possible for the person skilled in the art to use them as an antigen for inducing neutralizing antibodies. It is known to the person skilled in the art that he can apply the peptides according to the invention, which can of course also be used as the pharmaceutical agent 0 according to the invention, in different dosages to an organism, in particular a human patient. The application should be carried out in such a way that the largest possible amount of neutralizing antibodies is generated.
  • the concentration and the type of application can be determined by a person skilled in the art through routine tests.
  • the following applications are possible: orally in the form of powder, tablets, juice, drops, capsules and the like; rectally in the form of suppositories, solutions and the like; parentral in the form of injections, infusions of solutions, inhalations of vapors, aerosols, dusts and plasters as well as locally in the form of ointments, plasters, envelopes, rinses and the like.
  • the immunogenic construct and / or the pharmaceutical agent can preferably be brought into contact prophylactically or therapeutically.
  • the infection with the viruses mentioned should at least be prevented in such a way that, after individual viruses have penetrated, for example into a wound, further multiplication thereof is greatly reduced or that viruses which have penetrated are almost completely killed.
  • therapeutic induction of an immune response the patient is already infected and the induction of the neutralizing antibodies takes place in order to kill the viruses already in the body or to inhibit their replication.
  • the invention also relates to a method for generating an antibody, preferably a neutralizing antibody against a disease with enveloped viruses including retroviruses, an organism in contact with an immunogenic construct, optionally together with an immunogenic component and / or a pharmaceutical agent according to the invention is brought and thus a humoral immune response is induced by the formation of antibodies and subsequently the antibodies are obtained from the organism.
  • the neutralizing antibodies obtained in this way can preferably be used for passive immunization.
  • Monoclonal antibodies can also be obtained, which u. a. be used after appropriate humanization.
  • Antibody-producing cells can also be obtained from vaccinated or infected individuals, who produce neutralizing antibodies, which are directed against the immunogenic construct according to the invention, and are applied in the form of monoclonal antibodies during passive immunization.
  • passive immunization In the case of passive immunization, there is no own immune reaction in the patient's body or essentially no own immune reaction to certain viruses, but the antibodies are introduced into the patient, for example in the form of healing sera. In contrast to active immunization, passive immunization essentially has the task of curing an infection that has already occurred as quickly as possible or of immediately protecting it against infection with viruses.
  • Various immunization schemes for passive immunization are known to the person skilled in the art, for example, from passive immunization against hepatitis A, hepatitis B and the TBE.
  • Such vaccination schedules can be adapted to specific viruses such as HIV, feline leukemia virus and others through routine experimentation.
  • the antibodies used for passive immunization can preferably be monoclonal antibodies.
  • the immunogenic components according to the invention or the pharmaceutical agent according to the invention or the kit according to the invention are used for diagnosis, prophylaxis, therapy, follow-up and / or aftertreatment of retroviral diseases.
  • the invention is to be explained in more detail below with the aid of examples, without being restricted to these examples.
  • Hybrid I and II consisting of a PERV-p15E ectodomain backbone5 with HIV epitopes inserted, were generated using a two-stage mutagenesis PCR (27).
  • the coding area for HybridII is based on that of HybridI, it was only expanded on both sides by HIV sequences.
  • the coding regions for constructs which consist of the epitopes E1 and E2 of gp41 (hereinafter referred to as loop I) of HIV-1 and are connected by a short peptide bridge, were generated by hybridization of 80mer oligonucleotides (Sigma-ARK) and a filling reaction generated by PCR.
  • the PCR product was ligated into the multiple cloning site of the expression vector pCal-n (Stratagene) via a BamHI interface at the 5 ' end and an Xhol interface at the 3rd end of the coding strand.
  • E.coli BL21 DE3 (Stratagene) were transformed with these constructs.5 DNA from feline embryonic fibroblasts FEA that produce FeLV-A was isolated with a Qiagen DNA Isolation Kit. A sequence which corresponds to the ectodomain of p15E was amplified by means of PCR with the specific primers, then cloned in the pCal-n vector and expressed in E. coli BL21 DE3.
  • CBP calmodulin binding protein
  • rgp41 Xhol rev cac ccg ata ctc gag ata cca cag cca att tgt tat g
  • Hybrid I BamHI fw cgc cca tcc cta atc aca caa gcg aga cag ctg
  • Hybrid I Xhol rev cac ccg ata ctc gag tca gtt gaa cca gtt cca aag
  • Hybrid I E1 mut fw caa gcg aga cag ctg agt gat att gtt cag caa caa cga att gta acg gaa gat ctc caa gcc c
  • Hybrid I E1 mut rev ttg ttg ctg aac aat atc act cag cag ctg tct cgc ttg tgt gat tag gga tcc acg egg
  • Hybrid I E2mut fw gaa ctg gat aag tgg gcg tcg ctt tgg aac tgg ttc aac tga gaa ttc aga ctc cag ggg tcg act cga gc
  • Hybrid I E2mut rev gtt cca aag cca cgc cca ctt atc cag ttc ttc cet tcg acg cet ctc taa cet ttc tc
  • Hybrid II BamHI fw cg gga tcc gga gca tca gta acg ctg acgta cag egg aga caa ta ttg tgt gat ata 9
  • Hybrid II Xhol rev cg ctc gag cta ata cca cag cca att tct tat gtt aaa cca att cca caa act tgc cca tt 5 Loop I BamHI fw: ggg gat cec agc ca ttg gag atg tcg aac cagttc cac aa gaa gec cat ttg tcc agt tcc agc agt tcc tgt tcg tta gaa gac gga gaa gaa gaa gac a
  • Loop I Xhol rev ccg gat cec tgg gtg ctg ctg gtt cta cca tgg gtg ctg ctt ctg tta cec tga ccg ttc agg ctc l o gtc tgc tgc tgt ctt ctt ctc cgt cta acg a
  • the purification was carried out according to the Stratagene protocol for the CBP-fused proteins.
  • the purity of the recombinant proteins was checked by SDS-PAGE and Western blot analysis using the monoclonal gp41 -specific antibody 2F5 or a serum against p15E from FeLV.
  • E1 and E2 Synthetic peptides corresponding to the sequences of the epitopes E1 and E2 of HIV (E1 (LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS) and E2 (NEQELLELDKWASLWNWFDIT NWL) were produced by the Jerini company and purified by HPLC. E1 and E2 were free antigen
  • dextran-peptide conjugates were carried out either via direct binding, the carboxyl groups contained in the activated dextran, to primary amino groups of the peptides (28) or via a heterobifunctional crosslinker (3- (2-pyridyldithio) propionyl hydrazide, PDPH, Pierce) , which enables targeted coupling via the cysteines attached to the C- or N-terminal end of the peptides (29), overlapping synthetic peptides that correspond to the entire Env (gp120 and gp41) of HIV have been developed by NIH, USA (HIV- Env peptide set derived from HIV-1 isolate MN, Cat # 6451) was obtained. Overlapping and immobilized peptides that correspond to FeLV's gp41 and p15E were produced by Jerine.
  • Wistar rats (BfR, female 54-58 days old), goats, Balb / c mice (female, 10-20 g) were treated with 500 ⁇ g-1mg protein, peptide or peptide conjugate in 800 ⁇ l PBS / Freund 's incomplete adjuvant mixture ( 1: 1) immunized, 200 ⁇ l of which were applied in each hind leg and 400 ⁇ l sc in the neck.
  • Three animals were immunized with the same antigen. The animals were boosted after 4 weeks with the same injection schedule and the same antigens.
  • the blood was drawn from the rats and mice by means of retrobulbar puncture, that of the goats from the jugular vein.
  • the blood was separated after 20 h storage at 4 ° C. by centrifugation into serum and cellular components.
  • the complement factors contained in the serum were inactivated by incubation at 56 ° C. for 30 min.
  • the serum was stored at -20 ° C until used.
  • the epitope mapping was carried out on a Pepspot membrane (Jerini, Berlin), on which peptides overlapping by 11 amino acids, which correspond to the sequence of gp41 and p15E from FeLV, were applied point by point, according to the manufacturer. 1.8 ELISA
  • mAb 2F5 50-100 ng peptides of the N-terminal region of the ectodomain of gp41 from an overlapping HIV-Env peptide set were applied in each case in combination with Dp 178 or peptide P6373 to Probind ELISA plates (NUNC ).
  • the mAb 2F5 was incubated in a dilution of 1: 25000 in the presence of 0-8M urea for 2 h at 37 ° C.
  • the detection was carried out using a polyclonal goat anti-human serum (1: 2000) conjugated to horseradish peroxidase (Sigma). It was measured with an OD 92 / 56o. All values were measured as triplicates.
  • the medium supernatant was removed and the cells were disrupted by freezing and thawing three times.
  • Interfering proteins were removed from the genomic DNA by adding Proteinase K (Invitrogen) in 100 ⁇ l IxPCR buffer (Röche) and 3 h incubation at 56 ° C. Proteinase K was inactivated by incubation at 95 ° C. for 30 min.
  • Real-time PCR was carried out on the basis of the cell lysate using HIV-env-specific primers and an env-specific, dabcyl-labeled probe (TIB MOLBIOL, Berlin) and PCR master mix (Stratagene).
  • the linear serum-specific inhibition was determined using the formula 2 ⁇ ct , where ⁇ ct is the difference between ct (immune serum) and ct (pre-immune serum). These linearized values were then converted into a percentage inhibition. All values were measured as triplicates.
  • a virus stock of the FeLV-A (Glasgow strain) was titrated on uninfected FEA cells, the titer was 10 4 - 76 TCIDso / ml.
  • 6000 FEA cells were seeded per well of a 96-well microtiter plate. Preimmunes and Immunsera were heat inactivated at 56 ° C for 30 min. 50 ul virus were added to 1: 2 dilutions of the serum or purified immunoglobulin, incubated at 37 ° C for 30 min and added to the cells. Alternatively, the serum concentration was kept constant at 1: 5 and the virus was diluted. After 3 The cells were broken open and lysed for days (20 mg / ml Proteinase K in PCR buffer, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 10 mM Tris-HCl, pH 8.4). The cells were incubated at 56 ° C. for 3 hours, then at 95 ° C. for another 10 minutes in order to inhibit the activity of proteinase K. Provirus integration was quantified using PCR.
  • the human, monoclonal antibody (mAb) 2F5 has a broad neutralization spectrum against laboratory strains and various primary isolates.
  • Various research groups were able to show that the antibody binds to a linear sequence (ELDKWA) within the ectodomain of the transmembrane envelope protein gp41 of HIV-1. This sequence is located a few amino acids N-terminal of the transmembrane passage. With the help of an epitope mapping method based on a Pepspot membrane, this sequence could be confirmed as a binding site for 2F5 (Fig.3).
  • peptide P6373 (NEQELLEJJDKWASLW) with modified peptides (P6342 mut 1-5) was applied to ELISA plates and at a concentration of 3M urea incubated with 2F5.
  • Fig. 6 shows the evaluation of the ELISA after deducting the absorption of 2F5 on P6373 alone. It was found that amino acid exchanges in at least 4 positions of the peptide P6342 reduce the binding of the monoclonal antibody 2F50.
  • a stoichiometric ratio of 2: 1 shows a greater o inhibition of the neutralizing activity of 2F5 than a ratio of 1: 1, similar to that in the ELISA (Fig. ⁇ B).
  • the sequence of gp41 amplified on the basis of the NIH-HIV molecular clone pNL4-3 with the specific primers 1 and 2 in the PCR was ligated via the restriction sites of BamHI and Xhol into the vector pCal-n (Stratagene) opened via the same restriction enzymes ,
  • the closed vector (pCal-n rgp41) was transformed into BL21 Codon Plus (Stratagene) and there expressed IPTG dependent.
  • the amino acid sequence of the fusion protein produced is listed in section 2.1. This sequence was successfully expressed as a recombinant fusion protein. However, the fusion protein was not soluble and was therefore used as an aggregate after 8M urea precipitation to remove the soluble bacterial proteins.
  • sequences of gp41 from HIV-1 were inserted into the PERV-p15E sequence with specific primers and thereby the corresponding domains of p15E eliminated (substitution).
  • sequences of gp41 were inserted, at the N-terminal end and at the C-terminal end.
  • the respective substitutes were used in two different lengths (Hybrid I and Hybrid II).
  • the resulting PCR products were ligated via the restriction sites of BamHI and Xhol into the vector pCal-n (Stratagene) opened via the same restriction enzymes.
  • the closed vector (pCal-n rgp41) was transformed into BL21 Codon Plus (Stratagene) and there expressed IPTG dependent.
  • the amino acid sequence of the viral portions (p15E and gp41) of the fusion proteins Hybrid I and II produced are listed in section 2.1. These fusion proteins were also insoluble and were therefore used as an aggregate after 8M urea precipitation to remove the soluble bacterial proteins.
  • the coding sequences for the peptide E1 and E2 were connected through the coding region for a five amino acid long peptide bridge.
  • the resulting PCR product was ligated via the restriction sites of BamHI and Xhol into the vector pCal-n (Stratagene) opened via the same restriction enzymes.
  • the closed vector (pCal-n rgp41) was transformed into BL21 Codon Plus (Stratagene) and there expressed IPTG dependent.
  • the amino acid sequence of the loop 1 fusion protein produced is listed in section 2.1. These fusion proteins were also insoluble and were therefore used as an aggregate after 8M urea precipitation to remove the soluble bacterial proteins.
  • the immune sera were examined in a Western blot and in an ELISA for binding antibodies against gp41.
  • the sera were also examined for neutralizing antibodies in the neutralization assay.
  • Fig. 9 shows the percentage inhibition of the virus infection converted from the ⁇ ct of the inhibitory effect of
  • the recombinant gP41 which is actually not suitable as an antigen for immunization because it is insoluble, was unable to raise neutralizing antibodies (group N).
  • Fig. 1 Spatial structure of gp41 with the gp120 above it (Zwick et al. 2001 (5)).
  • Fig. 2 A Scheme of the ectodomain of gp41: Simplified representation of monomeric gp41. The fusion peptide at the N-terminus, the N-terminal helix region (NHR), the cysteine-cysteine loop, the C-terminal helix region (CHR) and the transmembrane passage are highlighted.
  • Hexamer gp41 The NHR and CHR are shown under supervision. Three N-helices are trimers consisting of three parallel ⁇ -helices with three external C-helices arranged on the outside. The interacting amino acids between the helices are entered.
  • Fig. 3 Epitope mapping for mAb 2F5 using a Pepspot membrane: 13 mer peptides were covalently bound to a nitrocellulose membrane using an acetyl linker. From spot to spot, these peptides overlap by 11 amino acids and cover the entire sequence of the gp41.
  • the mAb 2F5 was used in a concentration of 250 ng / ml.
  • the secondary antibody conjugate (anti-human POD) was used 1: 5000.
  • the epitope in the sequence of gp41 is underlined.
  • Fig. 4 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) of Dp178 (lane 1) and recombinantly expressed CBP-rgp41 (lane 2): Although more Dpi 78, which corresponds to the C helix of the ectodomain of gp41, was applied , it is poorly detected in the Western blot than the recombinant CBP-rgp41, which contains the entire ectodomain of the gp41. 2F5 was used in the Western blot at a concentration of 500ng / ml. Fig.
  • the NIH peptide set consists of 15 mer peptides, each overlapping by 11 amino acids and which comprise the entire protein sequence of the coat protein complex. All peptides were tested in combination with Dpi 78, only the results for 10 peptides from the N-terminal region of the ectodomain of gp41 are shown here.
  • the peptide P6342 but not all others, increases the binding of 2F5 to Dpi 78.
  • the 2F5 binding is increased synergistically, since the mAb 2F5 does not recognize the P6342 alone, and can also be seen in 3M and 5M urea ,
  • the diagram shows the mean values from triplicates.
  • Fig. 7 ELISA with varying stoichiometric combinations P6342 / P6343 at four different concentrations of urea:
  • the ELISA shows that 2F5 binds particularly well to a 2: 1 ratio of P6342 / P6373.
  • a larger excess of P6342 means no increase in binding, while a 1: 1 ratio results in a significantly weaker binding of the mAb 2F ⁇ to the two peptides.
  • the diagram shows the mean values from triplicates.
  • the graphic shows the ct values when using cell lysate after treatment with different amounts of E1 (LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS) and E2 (NEQELLELDKWASLWNWFDIT. NWL) during infection with HIV.
  • E1 LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS
  • E2 NEQELLELDKWASLWNWFDIT. NWL
  • 2F5 was used in a concentration of 2.5 ⁇ g / ml.
  • Fig. 9 HIV neutralization by rat sera The columns show the percentage inhibition of HIV-1 IIIB provirus integration in C8166 in the presence of various rat sera or 2F5.
  • the rat sera were prediluted 1: 4. 2F5 was used in a concentration of 2.5 ⁇ g / ml. The conversion of the ct values into percentage inhibition is described under 2.9.
  • Fig. 10 Recombinant constructs derived from gp41 A): A recombinant protein was derived from gp41 of HIV-1, which contains only parts of the exodomain. (B) A recombinant protein was derived from the transmembrane coat protein p15E of the porcine endogenous retrovirus and in this protein the E1 and E2 domains of gp41 (gray) of HIV-1 were inserted at topographically identical positions (substitution of the corresponding epitopes of p15E). Different sized E1 and E2 domains were chosen.
  • Fig. 11 Recombinant loop protein derived from gp41 and free peptides as well as conjugates to a carrier molecule
  • the gray-colored E1 and E2 domains were produced (A) as a recombinant protein with an amino acid linker or (B) as free synthetic peptides or coupled to the carrier material dextran.
  • Goat 27 was immunized with the recombinant ectodomain, the antiserum inhibited the infection of FEA cells with the feline leukemia virus FeLV.
  • the infection was measured by PCR (detection of provirus infection).
  • A titration of the virus with preimmune serum
  • B titration of the virus with immune serum.
  • Immunizations with the recombinant ectodomain of p15 from FeLV were mapped as described in Fig. 3. Overlapping peptides that correspond to the ectodomain of p15 of FeLV, were used.
  • IgG Prot G-purified antibodies, pl ⁇ E - pl ⁇ E-purified antibodies. The four main epitope domains are boxed.
  • Fig. 14 Effect of joint immunization with the recombinant protein p15E from FeLV and the commercial anti-FeLV vaccine leucogen
  • Rats were immunized with the commercial vaccine leucogen (animals 56.1, 56.2, 56.3) or with the commercial vaccine leucogen and the recombinant protein p15E from FelV. Neutralization was measured using quantitative real time PCR and presented as a percentage of provirus integration. It is clear that group 54 sera neutralize FeLV (leucogen and p15E) than group 56 sera (leucogen) alone.

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Abstract

Die Erfindung betrifft immunogene Konstrukte die grundsätzlich zwei verschiedene Bereiche des transmembranen Hüllproteins umhüllter Viren einschließlich der Retroviren einschließlich HIV beinhalten und ein pharmazeutisches Mittel zur Induktion von humoralen neutralisierenden Immunantworten gegen Virusinfektionen sowie ein Kit zum Nachweis von Antikörpern und Virusantigenen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Induktion einer Antikörperantwort und ein Verfahren zur passiven Immunisierung eines Organismus unter Verwendung neutralisierender Antikörper, die mit den genannten immunogenen Konstrukten gewonnen wurden und einen Bioassay zum Nachweis der Infektion mit Viren und zum Nachweis der Bildung von neutralisierenden Antikörpern.

Description

Induktion antiviraler neutralisierender Antikörper beim Menschen und beim Tier
Beschreibung
Die Erfindung betrifft immunogene Konstrukte und ein pharmazeutisches Mittel zur Induktion von humoralen neutralisierenden Immunantworten gegen Virusinfektionen sowie Kits zum Nachweis von Antikörpern und Virusantigenen auf der Basis dieser immunogenen Konstrukte und der induzierten Antikörper. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Induktion einer Antikörperantwort und ein Verfahren zur passiven Immunisierung eines Organismus unter Verwendung neutralisierender Antikörper, die mit den genannten immunogenen Konstrukten gewonnen wurden und einen Bioassay zum Nachweis der Infektion mit Viren.
Die Infektion mit dem menschlichen Immundefizienzvirus HIV (human immune deficiency virus) und das daraus resultierende erworbene menschliche Immundefizienz Syndrom (AIDS: acquired immune deficiency syndrome) hat sich seit seiner Erstbeschreibung in den frühen achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts zu einer der größten globalen Virus-Epidemien entwickelt. Allein im Jahr 2002 infizierten sich weltweit fünf Millionen Menschen mit HIV, davon 800000 Kinder unter 15 Jahren, 3,1 Millionen Menschen starben in Folge der HIV-Infektion und/oder AIDS. Die Anzahl der HlV-Infizierten beläuft sich damit insgesamt auf über 42 Millionen (1). Insgesamt sind heute mehr als 20 Millionen Menschen an HIV/AIDS gestorben. Schätzungen gehen davon aus, dass ohne effektive Gegenmaßnahmen im Jahr 2010 45 Millionen Neuinfektionen zu erwarten sind und im Jahr 2020 etwa 70 Millionen Tote (2).
Im Stand der Technik sind mehrere Therapien von Viruserkrankungen wie HIV-Infektionen bzw. AIDS bekannt. Beschrieben sind beispielsweise Monotherapien mit Hemmern der Reversen Transkriptase wie AZT, Kombinationstherapien, insbesondere mit Reverse-Transkriptase- inhibitoren und Proteaseninhibitoren wie zum Beispiel AZT und Nevirapin oder die Kombinationstherapie von antiretroviralen Substanzen mit Immunmodulatoren und anderen Substanzen wie zum Beispiel Interferon, Interleukinen und/oder Thymostimulin. Diese Therapien ermöglichen es, den physiologischen Zustand des HlV-Infizierten zu stabilisieren. Eine Heilung im klassischen Sinne, das heißt die Eliminierung des Virus, ist jedoch nicht möglich. Aus diesem Grunde gab es immer wieder Bestrebungen, neue und effektive pharmazeutische Mittel bereitzustellen, die als Prophylaxe bzw. Therapie die humorale bzw. zelluläre Immunantwort in einem infizierten Organismus so aktivieren, dass Viren neutralisiert bzw. abgetötet werden.
Es ist dem Fachmann bekannt, dass er eine Immunisierung sowohl aktiv als auch passiv herbeiführen kann. Bei der künstlichen aktiven Immunisierung erfolgt eine Applikation definierter Antigene, die zu einer aktiv erworbenen Immunität durch die Bildung von Antikörpern oder zellulärer Immunität führt. Bei der passiven Immunisierung werden die Antikörper oder die Immunzellen direkt appliziert, die zu einer passiv erworbenen Immunität führen. Eine künstliche aktive Immunisierung eines Organismus gegen Viren kann beispielsweise durch inaktivierte Viren, virale Proteine oder von Viren abgeleitete Peptide erfolgen, die zum Beispiel neutralisierende Antikörper induzieren. Neutralisierende Antikörper sind für verschiedene Viruserkrankungen beschrieben worden und können durch die Gabe bestimmter Antigene, insbesondere Virusproteine im Organismus, induziert werden. Eine derartige Aktivierung bzw. Induktion einer Immunantwort nennt man Impfen, Dem Fachmann ist dies beispielsweise für Impfstoffe gegen Influenza-Virus, Pockenvirus, Masernvirus und Poliovirus bekannt. Auch gegen porcine endogene Retroviren (PERVs) konnten neutralisierende Antikörper induziert werden (Fiebig et al., 2003), da allerdings kein Tiermodell vorhanden ist, in dem sich PERVs vermehren, konnte die Wirksamkeit dieser Impfstrategie nicht festgestellt werden. Zur Immunisierung wurde die vollständige Ectodomäne des transmembranen Hüllproteins dieser Viren appliziert. Auf andere Viren - zum Beispiel HIV - ist diese Immunisierungsstrategie, auch bei Verwendung analoger Hüllproteine oder Bindungsstrukturen, nicht mit Erfolg übertragbar.
Zunächst ging man bei der Bekämpfung von HIV-Infektionen davon aus, dass durch die Gabe von abgeschwächten oder abgetöteten Viren, gegebenenfalls im Zusammenhang mit Zusatzstoffen, eine humorale - beispielsweise über Antikörper bzw. eine zelluläre - beispielsweise über T-Zellen - Immunantwort im Organismus ausgelöst werden kann. Die Versuche zur Induktion einer Immunantwort über die Gabe bzw. die Impfung mit einem abgetöteten oder abgeschwächten Virus bzw. mit Hüllproteinen dieser wurden insbesondere kurz nach Bekannt- werden der Krankheit AIDS stark forciert, da mit dieser Technik bei anderen Virus-Krankheiten gute Resultate erzielbar waren. Es zeigte sich jedoch sehr schnell, dass es mit dieser Methode nicht möglich ist, eine gewünschte Antikörperantwort zu induzieren, da die zum Testen verwendeten Viren auf Fremdzellen wuchsen und die Abstoßung dieser Viren auf zellulären Fremdantigenen in der Virushülle beruhte. Insbesondere Ganzvirus-Vakzinen gegen HIV können neben zellulären Antigenen auch Strukturen enthalten, die von dem Virus zur Hemmung des Immunsystems entwickelt wurden, wie immunsuppressive Domänen oder maskierende Kohlenhydrate, wodurch die entwickelten Impfstoffe nicht optimal wirken können.
Es gibt derzeit keinen Impfstoff, der eine effektive Immunantwort gegen eine HIV-Infektion 5 induzieren kann (3). Generell kann man zwei Strategien zur Induktion einer Immunantwort unterscheiden. Peptid-/Protein-Vakzine, aber auch DNA-Vakzine induzieren eine humorale Immunantwort (4), das heißt die Produktion von Antikörpern zum Schutz vor infektiösen Agenzien. Attenuierte Viren, aber auch DNA- und Lipopeptid-Vakzine bewirken die Produktion von erregerspezifischen Protein-/Peptidsequenzen innerhalb der Wirtszellen, die dann als CTL- l o Epitope im MHC präsentiert werden (3,4), was zu einer zellulären Immunantwort vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten führt. Bis heute verweisen führende Wissenschaftler darauf, dass nur ein Impfstoff, der in der Lage ist, zytotoxische T-Zellen zu induzieren, für die Prävention einer HIV-Infektion geeignet sei (3).
15 Auch wenn die Entwicklung der Suche nach einem Impfstoff in den letzten Jahren in diese Richtung ging, sind im Stand der Technik einige Versuche beschrieben, eine humorale Immunantwort, das heißt eine Antikörperbildung, zu induzieren. Dabei kommt es darauf an, nicht nur sogenannte bindende Antikörper, sondern neutralisierende Antikörper zu induzieren, d.h. Antikörper, die die Infektion verhindern können. Dass prinzipell neutralisierende Antikörper im Menschen und sogar
20 in HlV-Infizierten induziert werden können, zeigt ein im Jahre 1993 beschriebener humaner, monoklonaler Antikörper (2F5), der über eine Zellkultur von einem HIV-positiven Patienten gewonnen werden konnte. Dieser Antikörper besitzt ein Virus-neutralisierendes Spektrum, das nahezu alle Subtypen von HIV umfasst; die Antikörper binden an ein Epitop, das N-terminal des Transmembrandurchganges des transmembranen Hüllproteins gp41 lokalisiert ist. Es konnte
25 gezeigt werden, dass die Antikörper mit dem Epitop ELDKWA interagieren. Daher lag es nahe, dieses Epitop in Form eines Peptides bzw. eines modifizierten Peptides - zum Beispiel zyklisiert - in den Organismus zu injizieren, um eine Antikörperantwort gegen das Epitop und demgemäß gegen das Virus auszulösen. So schlugen J. Tian et al. (2002) lineare Nonapeptide vor, die eine hohe Affinität zum Antikörper 2F5 aufweisen. Nach Immunisierung mit unzähligen Formen und
30 Modifikationen des ELDKWA-Epitopes wurden jedoch immer nur bindende, aber niemals neutralisierende Antikörper induziert. In der Fachwelt herrscht weitestgehende Einigkeit, dass die Induktion antiviraler neutralisierender Antikörper kein erfolgversprechender Weg einer HIV- Prävention ist. Weiterhin ist versucht worden, einzelne gp41 Epitope mit anderen Peptiden, zum Teil chemisch miteinander verbunden, zu injizieren, in der Annahme, dass die Anwesenheit weiterer peptidartiger Strukturen zu einer aktiven Bildung neutralisierender Antikörper im Organismus führt. Parker et al. (2001) schlugen beispielsweise vor, die injizierte Domäne des Peptides um die 5 flankierenden Bereiche im natürlichen Zustand dieses Epitopes im gp41 so zu erweitern, dass ein 16-Aminosäurepeptid entsteht, da dieses aufgrund der höheren Komplexität immunogener als das eigentliche Epitop sein sollte. Ho (2002) vermutet, dass das native Epitop mehr eine ß-turn- ähnliche als eine helikale Konformation aufweist und dass deshalb das Epitop dem lebenden Organismus als Impfstoff in Form einer ß-tum-ähnlichen Konfiguration bereitgestellt werden o muss, um aktiv Antikörper zu produzieren. Aber auch derartige Versuche induzierten im lebenden Organismus unter Laborbedingungen immer nur bindende Antikörper, niemals neutralisierende.
Dass derartige neutralisierende Antiköper wie der 2F5-Antikörper nicht nur zur Prävention geeignet sind, sondern auch für eine Therapie, zeigten die Untersuchungen von Ferrantelli et al.5 (2003), die neutralisierende Antikörper zur passiven Immunisierung verwendeten, wobei die Autoren neben 2F5 weitere Antikörper zur passiven Immunisierung offenbarten, wie zum Beispiel lgG1b12, 2G12 und 4E10. Die V3-Schleife des HlV-Oberflächenproteins gp120 gilt aufgrund ihrer außerordentlichen Immunogenität als erfolgversprechendes Agens, um neutralisierende Antikörper zu induzieren und die neutralisierenden Antikörper 1 b12 und 2G12 sind gegen gp120 0 gerichtet. Andere Oberflächenproteine wie das erwähnte gp41 gelten als wenig erfolgversprechend, da die Fusion mit der Zielzelle über dieses Protein so schnell erfolgt, dass es einem Antikörper nicht möglich ist, schnell genug mit diesem Protein zu interagieren. Neben den für die Therapie einsetzbaren neutralisierenden Antikörpern wurde eine weitere Therapie entwickelt, die gegen gp41 gerichtet ist. Dabei handelt es sich um Peptide, die als sehr kleine5 Moleküle effektiv mit den für die Infektion verantwortlichen Strukturen von gp41 interagieren können (Weiss et al. 2003). Eines dieser Peptide, T-20, enthält die bereits beschriebene ELDKWA-Sequenz.
Ein wesentlicher Nachteil der dargestellten Vakzinierungsstrategien, vor allem der gegen gp120, o besteht darin, dass die eingesetzten Vakzinen nicht in der Lage sind, die Entstehung neuer Virusvarianten bzw. Modifikationen im Laufe der Viruserkrankung zu verhindern (Fluchtmutanten). Die gegen das ursprüngliche Virus gebildeten neutralisierenden Antikörper sind nicht in der Lage, mit dem mutierten Virus so zu interagieren, dass ein erfolgreicher präventiver Schutz oder eine effektive therapeutische Behandlung des infizierten Organismus möglich ist. Aufgabe der Erfindung war es daher, einen Impfstoff herzustellen, der in Prävention, Diagnose und Therapie von viralen Erkrankungen, insbesondere retroviralen Erkrankungen eingesetzt werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Bereitstellung eines immunogenen Konstruktes umfassend Aminosäuresequenzen ausgewählt aus einem viralen transmembranen Hüllprotein, das mindestens über einen Membrandurchgang mit der Virusmembran assoziiert ist, mindestens eine Fusionsdomäne und mindestens zwei alpha-helikale Strukturen umfasst, wobei die Aminosäuresequenzen ausgewählt sind aus (i) einem ersten Bereich des Proteins lokalisiert zwischen dem Membrandurchgang und einer ersten alpha-helikalen Struktur sowie
(ii) aus einem zweiten Bereich, lokalisiert zwischen der Fusionsdomäne und einer zweiten alpha-helikalen Struktur.
Wichtig ist zu vermerken, dass es auf die Kombination beider Bereiche ankommt.
Geeignet ist auch ein Konstrukt, das die die jeweilige Aminosäuresequenz codierende DNA umfasst, wobei es wiederum auf die Präsenz beider Bereiche in der kodierenden Sequenz ankommt.
Beansprucht wird also ein immunogenes Konstrukt, welches aus verschiedenen Aminosäuresequenzen besteht. Die beanspruchten Aminosäuresequenzen sind aus einem viralen transmembranen Hüllprotein auszuwählen. Dieses Hüllprotein hat die Voraussetzung zu erfüllen, dass es über mindestens einen Membrandurchgang mit der Virusmembran assoziiert ist und dass es mindestens eine Fusionsdomäne und mindestens zwei alpha-helikale Strukturen aufweist. Dem Fachmann ist bekannt, dass mehrere Hüllproteine diese Voraussetzungen erfüllen, wie z. B.GP2, gp20, gp30, gp37, gp160, p15E, HA2, F2 u.a. Jedes dieser genannten Hüllproteine ist ein virales transmembranes Hüllprotein, das mindestens einen Membrandurchgang, eine Fusionsdomäne und zwei alpha-helikale Strukturen aufweist.
Erfindungsgemäß hat der Fachmann aus den genannten viralen transmembranen Hüllproteinen zwei Bereiche von Aminosäuresequenzen auszuwählen. Bei dem ersten Bereich handelt es sich um ein frei auszuwählendes Segment des Hüllproteins zwischen dem Membrandurchgang dieses Hüllproteins sowie der ersten alpha-helikalen Struktur, die dieses Hüllprotein aufweist. Bei dem zweiten Bereich, der aus dem genannten Hüllprotein auszuwählen ist, handelt es sich um den Abschnitt, der zwischen der Fusionsdomäne des transmembralen Hüllproteins liegt und der zweiten alpha-helikalen Struktur dieses Hüllproteins, wobei die alpha-helikale Struktur, der Membrandurchgang und/oder die Fusionsdomäne ein Teil des immunogenen Konstruktes sein können. Die Kombination beider Bereiche führt zur Induktion der neutralisierenden Antikörper. Von allen genannten und beanspruchten Hüllproteinen liegen bereits Sekundär- und Tertiärstruktur-Untersuchungen vor, so dass der Fachmann die genannten Bereiche, aus denen die Aminosäuresequenzen auszuwählen sind, genau bestimmen kann. Er ist hierbei nicht auf bestimmte Bereiche beschränkt. Erfindungswesentlich ist, dass das immunogene Konstrukt zwei Aminosäuresequenzen umfasst, wobei diese beiden Aminosäuresequenzen aus ganz bestimmten Bereichen von viralen transmembranen Hüllproteinen auszuwählen sind.
Überraschend wurde gefunden, dass ein immunogenes Konstrukt, welches mindestens zwei Aminosäuresequenzen umfasst, in einem Organismus neutralisierende Antikörper induzieren kann und so gegebenenfalls zusammen mit dem Fachmann bekannten Hilfsstoffen als Vakzine eingesetzt werden kann. Ein immunogenes Konstrukt im Sinne der Erfindung ist jedes Mittel, das geeignet ist, neutralisierende Antikörper, zu induzieren. Durch eine solche Antikörperantwort werden Antikörper im Organismus bereitgestellt, die eine neutralisierende Wirkung auf das jeweilige Retrovirus oder ein anderes Viren haben. Unter Berücksichtigung der Komplexität der beteiligten Mechanismen wird unter der Neutralisation eines Virus jeder Mechanismus ver- standen, der in vivo bzw. in vitro Viren an der Infektion hindert und ihre Vermehrung im präventiven Sinne verhindert beziehungsweise im therapeutischen Sinne die weitere Vermehrung der Viren hemmt oder eine Kombinationstherapie effektiver werden lässt. Das heißt, durch das erfindungsgemäße Konstrukt wird das Immunsystem aktiviert und die Bildung neutralisierender Antikörper induziert. Vorteilhafterweise sind die neutralisierenden Antikörper insbesondere gegen die viralen Strukturen gerichtet, durch die sie induziert wurden, wobei kreuzreagierende Antikörper erfindungsgemäß nicht ausgeschlossen sind.
Bei der Infektion mit umhüllten Viren einschließlich der Retroviren einschließlich HIV finden Interaktionen zwischen den Oberflächenhüllproteinen und zellulären Rezeptoren statt, die dann zu Konformationsveränderungen im transmembranen Hüllprotein führen und zur Fusion mit der Zellmembran (Abb.1 , Abb.2). Die transmembranen Hüllproteinen enthalten hochkonservierte Domänen, die eine wichtige Rolle beim Infektionsprozess spielen und deshalb exzellente Targets für die Induktion breit neutralisierender Antikörper darstellen. Es ist im Sinne der Erfindung beispielsweise möglich, das mit der Membran assoziierte virale Protein bzw. transmembrane Hüllprotein direkt aus einem Virus für die weitere Verwendung zu gewinnen. Hierbei kann es sich beispielsweise insbesondere um das virale Hüllprotein gp41 von HIV handeln. Hüllproteine besitzen unter anderem einen Bestandteil, der in der Membran verankert ist und einen Bestandteil, der zumindest teil- und zeitweise nach außen aus der Membran herausragt. Erfindungsgemäß stammen die ausgewählten Aminosäuresequenzen bevorzugt aus dem aus der Membran herausragenden Teil. Dieses transmembrane Hüllprotein umfasst eine Ectodomäne, einen Anker und einen zytoplasmatischen Teil, wobei die Ectodomäne eine Fusionsdomäne, eine erste alpha-helikale Struktur, einen Cystein-Ioop und eine zweite alpha-helikale Struktur aufweist. C-terminal folgt nach der zweiten alpha-helikalen Struktur eine Ankerdomäne, die das transmembrane Hüllprotein gp41 in der Virusmembran verankert. Die ausgewählten Aminosäuresequenzen, die z.B. Domäne, Peptide oder rekombinante Proteine oder Fragmente hiervon sein können, können auf verschiedene Weise durch den Fachmann gewonnen werden, bevorzugt durch Peptidsynthese oder gentechnische Herstellungen. Selbstverständlich ist auch möglich nicht die Aminosäuresequenzen zu verwenden, sondern die sie codierende DNA. Beispielsweise kann die DNA in einen Vektor verpackt werden. In den Zellen wird dann die entsprechende Aminosäuresequenz codiert. Derartige Verfahren sind dem Fachmann aus der Gentherapie bekannt.
Erfindungsgemäß wird beispielsweise bei gp41 von HIV N-terminal ein Bereich, der auch als Peptidabschnitt bezeichnet werden kann, zwischen der Fusionsdomäne und der ersten alpha- helikalen Struktur ausgewählt. Ein zweites Peptid wird aus dem Bereich zwischen der Membran und einer dieser zugewandten alpha-helikalen Struktur ausgewählt. Im Sinne der Erfindung heißt zwischen zwei Bereiche auswählen, dass die flankierenden Bereiche wie z. B. Membrandurchgang, alpha-helikalen Struktur und/oder Fusionsdomäne zumindest teilweise Bestandteile des ausgewählten Abschnitts sein können. Es ist wichtig, dass die Aminosäuresequenzen, die im Sinne der Erfindung zwischen dem Membrandurchgang und einer alpha-helikalen Struktur und zwischen der Fusionsdomäne und der anderen alpha-helikalen Struktur ausgewählt wurden, nur in Kombination verwendet werden und Bereiche des Membrandurchgangs, der Fusionsdomäne und/oder der alpha-helikalen Struktur oder Strukturen teilweise oder vollständig umfassen können.
Der Begriff der der Membran zugewandten alpha-helikalen Struktur beschreibt nicht die
Ausrichtung dieser alpha-helikalen Struktur, sondern lediglich das Verhältnis der mindestens zwei alpha-helikalen Strukturen zur Membran; die der Membran zugewandte alpha-helikale Struktur besitzt eine geringere räumliche Distanz zur Membran, sofern das Hüllprotein als lineare nicht gefaltete Struktur dargestellt oder angenommen wird. Demgemäß liegt die zugewandte Struktur räumlich näher am Membrandurchgang des linear gedachten Hüllproteins. Selbstverständlich ist es möglich, dass durch natürliche oder artifizielle Faltungsvorgänge die Position einzelner Bestandteile des Hüllproteins geändert wird.
Die aus dem Hüllprotein ausgewählten Aminosäuresequenzen, z.B. Peptide oder Proteindomänen, die den Bereichen in der Nähe der alpha-helikalen Strukturen entsprechen, können aus dem Gesamtprotein entnommen werden bzw. nachdem ihre natürliche Sequenz- abfolge bekannt ist, synthetisch bzw. gentechnisch gewonnen werden. Die so erhaltenen Peptide, rekombinante oder virale Proteine werden als immunogenes Konstrukt verwendet, indem sie in einen Organismus appliziert werden. Die Größe der ausgewählten Aminosäuresequenzen kann der Fachmann durch Routineversuche, indem er z.B. die Antikörperproduktion oder-antwort misst, bestimmen.
Erfindungswesentlich ist, dass aus dem Bereich einer Ectodomäne eines insbesondere transmembranen Hüllproteins eines Virus zwei Aminosäuresequenzen ausgewählt werden, wobei die erste Aminosäuresequenz aus dem Bereich zwischen Fusionsdomäne und einer hieran flankierenden oder räumlich versetzten folgenden alpha-helikalen Struktur und die zweite Aminosäuresequenz aus dem Bereich zwischen der Membran des Virus und der nächsten alpha-helikalen Struktur ausgewählt wird. Nach diesen Aminosäuresequenzen werden synthetische Peptide, rekombinante Proteine hergestellt bzw. eine DNA, die diese Aminosäuresequenzen codiert. Die Auswahl kann hierbei so erfolgen, dass die Aminosäuresequenzen noch Bereiche der alpha-helikalen Struktur bzw. der Ankerstruktur, die das Hüllprotein mit der Membran verankert, umfassen.
Selbstverständlich können neben dem HIV auch aus allen anderen umhüllten Viren einschließlich der Retroviren erfindungsgemäße immunogene Konstrukte gewonnen werden, weiterhin bevorzugt sind: FeLV, MuLV, BIV, CAEV, EIAV1, FIV, OMVV, SIVmac, SIVcpz, VILV, RSV, ALV, JSRV, SMRV, SRV, GALV, BLV, HTLV-1 , HTLV-2, Marburg Virus, Ebola, SARS-Virus, Influenza-
Virus, Masernvirus, Mumpsvirus und/oder HPV-1. Alle so gewonnenen Aminosäuresequenzen, Peptide oder rekombinante Proteine oder virale Proteine können als immunogenes Konstrukt verwendet werden, um neutralisierende Antikörper gegen diese Viren zu generieren, wobei erfindungsgemäß nicht ausgeschlossen werden kann, dass es zu Kreuzreaktivitäten kommt, so dass beispielsweise ein immunogenes Konstrukt, welches zum Beispiel aus MuLV oder vollständig artifiziell gewonnen wird, auch eine Wirkung gegen zum Beispiel HIV oder FeLV zeigen kann. Bevorzugt ist es jedoch, dass die durch das immunogene Konstrukt induzierten neutralisierenden Antikörper gegen die Viren gerichtet sind, aus denen die jeweiligen Peptide gewonnen werden. Die immunogenen Konstrukte können auch rekombinante Proteine sein, die aus Teilen des transmembranen Hüllproteins eines Virus und den zwei erfinungsgemäßen Domänen eines anderen Virus bestehen, sogenannte Hybride. Des Weiteren wird für die Immunisierung auch DNA verwandt, die diesen Peptiden oder rekombinanten Proteinen dieser Viren entspricht. Auch eine Kombination zwischen DNA-Immunisierung und nachfolgender Immunisierung mit Peptiden oder rekombinanten Proteinen oder in Mehrfachabfolge ist bevorzugt. Die neutralisierende Wirkung der Antikörper auf umhüllte Viren einschliesslich der Retroviren in Hinsicht auf ihr prophylaktisches Potential zeigt sich zum Beispiel als Inhibition der Virusinfektion, als Inhibition der Syncytiumbildung, als Inhibition der Fusion zwischen Virus und Targetmembran, als Verminderung oder Stabilisierung der Vermehrungsrate der Viren in einem Organismus oder anders. Die neutralisierende Wirkung in Hinsicht auf ihre therapeutische Wirkung kann beispielsweise darin bestehen, dass durch die Induktion oder Applikation der Antikörper beispielsweise als erwünschter Nebeneffekt bestimmte antivirale Medikamente besser wirken oder durch Verminderung der Dosis die Anzahl der Nebenwirkungen dieser Medikamente reduziert wird. Das heißt, die Wirkung der Antikörper im Sinne der Erfindung ist nicht auf eine Eliminierung der Viren beschränkt, sondern umfasst das gesamte Spektrum vorteilhafter Wir- kungen in einer Therapie bzw. Prophylaxe.
Die mindestens zwei Peptide oder rekombinanten Proteine oder deren entsprechende DNA können für sich allein oder in Kombination gegebenenfalls mit anderen Antigenen, die von Interesse sind, verwendet werden. Beispielsweise können sie mit anderen Antigenen als physikalische Mischungen oder miteinander chemisch gebunden mit oder ohne Spacermolekül verwendet werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass die beiden erfindungsgemäßen Peptide oder rekombinanten Proteine miteinander chemisch oder physikalisch verbunden werden. Es ist auch möglich, die Peptide mit Trägerpeptiden, Proteinen oder Trägersubstanzen zu koppeln. Hierbei kann es sich beispielsweise um Albumine, das KLH, das MAP und andere Proteine handeln, die dem Fachmann für ihr immunogenes Vermögen bekannt sind; als
Trägersubstanzen sind weiterhin bevorzugt Thyroglobulin oder BSA. Diese Proteine können durch Nicht-Peptidbindungen gebunden werden, wie zum Beispiel über eine Disulfidbrücke oder Bindungen durch Kalzium-Ionen, aber es ist ebenso möglich, dass sie über eine Peptidbindung miteinander verbunden werden. Die Peptide können selbstverständlich Substitutions-, Deletions- und Additionsanaloge der erfindungsgemäßen Peptide sein. Erfindungsgemäß kann es sich bei den Viren um sämtliche Viren handeln, die eine Membran aufweisen, mit der Hüllproteine bzw. ähnliche Strukturen assoziiert sind, wobei diese Strukturen zumindest eine Ectodomäne aufweisen müssen, die eine Fusionsdomäne und/oder eine alpha- helikale Struktur enthält. Bei der Membran der Viren kann es sich um jede Struktur, die Lipide umfasst, handeln, sofern diese es ermöglicht, mit Proteinen eine Verbindung einzugehen.
Das Einbringen des immunogenen Konstruktes in einen Organismus kann erfindungsgemäß auf jede Art und Weise geschehen, die es ermöglicht, dass das Immunsystem so mit dem Konstrukt in Kontakt gebracht wird, dass eine Antikörperantwort induziert wird. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass das immunogene Konstrukt oral oder rektal, enteral bzw. parenteral, aufgenommen wird oder in den Körper direkt - zum Beispiel in ausgewählte Organe wie zum Beispiel die Milz oder in Blutgefäße - injiziert wird Bevorzugt ist weiterhin die Schluckimpfung oder die Impfung durch Injektion. Bevorzugte Injektionen sind die intradermale, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion. Selbstverständlich ist es auch möglich, das immunogene Konstrukt als Aerosol bereitzustellen, welches von dem Organismus, bevorzugt einem humanen Patienten, inhaliert wird. So ist zum Beispiel in der DE 198 51 282 A1 ein Verfahren zum Aufbringen von Antigenen auf Schleimhäute beschrieben, welches in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung mit aufgenommen ist. Weitere Applikationen werden im Folgenden im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren dargestellt. Die Applikation der für die Immunisierung verwendeten DNA geschieht z.B. mit Hilfe sogenannter Impfpistolen, die die DNA mittels Goldkugeln in die Haut einbringen oder mittels Spritzen, die die DNA unter die Haut oder in den Muskel einbringen können.
Es wurde überraschend gefunden, dass das Zusammenwirken von mindestens zwei
Aminosäuresequenzen, z.B. zwei Peptiden oder rekombinanten Proteinen - die Teile von definierten Domänen sind und zwischen anderen definierten Domänen positioniert sind - aus einem Hüllprotein eines Virus als einfaches und effektiv bereitzustellendes Immunogen verwendet werden können. Durch das Zusammenwirken der beiden Peptide oder rekombinanten Proteine bzw. der entsprechenden DNA wird zumindest ein Epitop dem Immunsystem so effektiv präsentiert, dass neutralisierende Antikörper gegen Viren generiert werden.
Das erfindungsgemäße Konstrukt ist in dem Sinne artifiziell, dass es kein natürlicher Weise vorkommendes vollständiges Hüllprotein darstellt, d. h. die natürlichen vollständigen Hüllproteine sind nicht durch die erfindungsgemäße Lehre umfasst. Bei der Verwendung als Vakzin können natürlich vorkommende transmembrane Hüllproteine, isoliert aus dem Virus, oder entsprechende lösliche Ektodomänen der transmembranen Hüllproteine (außer HIV) eingesetzt werden. Im einfachsten Fall besteht das Konstrukt aus zwei Aminosäuresequenzen, die nicht chemisch oder anders miteinander verbunden sind. Es kann jedoch vorteilhaft sein, wenn die Aminosäuresequenzen direkt oder über einen Linker oder einen Träger miteinander assoziiert vorliegen. Weiterhin ist es bevorzugt, dass die ausgewählten Aminosäuresequenzen aus einem Hüllproteinen in ein anderes virales Hüllprotein oder Fragmente hiervon durch Addition oder Substitution oder andere, dem Fachmann bekannte Methoden eingebracht werden. Demgemäß kann der Träger der ausgewählten Aminosäuresequenzen eines Virus das transmembrane Hüllprotein eines anderen Virus sein.
Um die protektive oder therapeutische Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide oder rekombinanten Proteine, das heißt im Wesentlichen die Induktion von neutralisierenden Antikörpern zu erhöhen, können dem immunogenen Konstrukt bzw. allen Mitteln, die aus diesem hergestellt werden können, insbesondere dem Impfstoff, der Vakzine, Adjuvantien zugesetzt werden. Bekannte Adjuvantien für Humanvakzinen sind zum Beispiel Aluminiumverbindungen wie Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat. Aluminiumhydroxid ist Bestandteil zahlreicher inaktivierter oder Subunit-Vakzinen unter anderem bei Hepatitis-B-Virusimpfstoffen und daher dem Fachmann gut bekannt. Weitere bekannte Adjuvantien sind beispielsweise MF 59 im Fluad. Im Sinne der Erfindung ist aber jede Substanz, die bei gleichzeitiger, zeitnaher oder zeitversetzter
Verabreichung mit den erfindungsgemäßen Peptiden oder Proteinen eine spezifische Immunantwort gegen diese ermöglicht, verstärkt oder modifiziert ein Adjuvanz im Sinne der Erfindung. So kann beispielsweise die Coapplikation von Ei-Albumin in komplettem Freund'schen Adjuvanz unter Umständen eine gesteigerte Ausbildung einer zeilvermittelten Immunität hervor- rufen und somit die Wirkung neutralisierender Antikörper unterstützen. Weitere Adjuvantien von Interesse sind zum Beispiel Saponine, wie zum Beispiel QS 21 , Muramyldipeptid, Muramyl- tripeptid und Verbindungen mit einem Muramylpeptidkern, Proteine wie zum Beispiel Gammainterferon und TNF oder Phosphatdibylcholin, Squalen bzw. die dem Fachmann bekannten Polyole. Dasselbe trifft für die für die Immunisierung verwendete DNA zu. Auch hier können DNA, die selbst eine immunstimulatorische Eigenschaft haben, oder ein Protein mit
Adjuvanzeffekt darunter auch Zytokine kodieren, parallel oder in einem Konstrukt appliziert werden.
Die immunogenen Konstrukte, die entweder als rekombinantes Protein oder als synthetisches Peptid mit obengenannten Modifikationen vorliegen, können auch in Kombination mit anderen Impfstoffen, darunter auch kommerziell bereits vertriebenen Impfstoffen angewendet werden können, ungeachtet dessen, ob der andere Impfstoff gegen dasselbe Virus gerichtet ist oder gegen andere Viren (Kombinationsimpfung).
Im Folgenden sollen einige Begriffe im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Lehre erläutert und definiert werden:
Der Begriff Antigen bezeichnet wie hierin verwendet eine Verbindung, die ein oder mehrere Domänen enthält, gegen die eine Immunantwort erwünscht sind. Die Bindungsorte der Antikörper in diesen Domänen werden Epitope genannt. Komplexe Mischungen von Antigenen sind in dieser Definition ebenfalls umfasst, wie zum Beispiel abgetötete Zellen, Bakterien oder Viren bzw. Fraktionen hiervon, jeweils in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Peptiden, rekombinanten Proteinen oder der zur Immunisierung verwendeten DNA.
Der Begriff Beimischen bezeichnet wie hierin verwendet den Zusatz eines Exzepienten zu den erfindungsgemäßen Peptiden.rekombinanten Proteinen, komplexen Mischungen und/oder Adjuvanz von Interesse wie zum Beispiel durch Mischung von trockenen Reagenzien oder Mischung eines trockenen Reagens mit einem Reagens in Lösung oder Suspension, oder Mischungen wässriger Formulierungen von Reagenzien.
Der Begriff Exzipient bezeichnet wie hierin verwendet einen einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zugesetzten, nicht therapeutischen Träger, der pharmazeutisch annehmbar, das heißt für Rezipienten bei angewendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist. Geeignete Exzipienten und ihre Formulierungen sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise aus Remington's pharmaceutical science, 16. Auflage, 1980.
Vakzine bezieht sich wie hierin verwendet auf eine Formulierung der erfindungsgemäßen Peptide oder rekombinanten Proteine oder der zur Immunisierung verwendbaren DNA, gegebenenfalls in Kombination mit einem anderen Antigen oder einer anderen DNA, von der beabsichtigt ist, eine prophylaktische, therapeutische oder diagnostische Reaktion in oder außerhalb eines Wirts bereitzustellen, wenn der Wirt den Antigenen ausgesetzt wird. Beispielhafte Vakzinen umfassen
Vakzinen gegen Krankheiten wie HIV/AIDS, SARS, FeLV und andere.
Der Ausdruck therapeutische Menge bezeichnet wie hierin verwendet eine Menge, die Symptome einer Störung oder responsiven, pathologisch physiologischen Kondition verhindert oder verbessert. In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die verabreichte Menge ausreichend, eine Immunantwort auszulösen, die im Wesentlichen die Infektion oder Ausbreitung eines infektiösen Agens - wie SARS, HIV oder FeLV - im Rezipienten verhindert oder hemmt.
Die einen Gesunden im Falle der Prophylaxe bzw. an einen Patienten im Falle der Therapie zu verwendende Menge an immunogenem Konstrukt wird formuliert und die Dosis gemäß üblicher medizinischer Praxis festgesetzt, wobei die zu behandelnde Störung, der Zustand des einzelnen Patienten, die Verabreichungsstelle, das Verabreichungsverfahren und andere, den behandelnden Ärzten bekannte Faktoren berücksichtigt werden. In ähnlicher Weise hängt die Dosis der verabreichten Vakzinen von den Eigenschaften des verwendeten Antigens ab, das von dem Immunogen, beispielsweise von dessen Bindungsaktivität und in vivo Halbwertszeit im Plasma wie auch von der Konzentration des Antigens in der Formulierung, dem Verabreichungsweg, der Stelle und der Rate der Dosierung, der klinischen Toleranz des jeweiligen Individuums (Mensch und Tier), der pathologischen Affektion des Patienten und dergleichen, wie es Ärzten bzw. anderen Fachleuten bekannt ist. Im Allgemeinen werden Dosierungen von etwa 0,1 bis 1000 mg pro Individuum und Verabreichung bevorzugt. Es können während einer Abfolge aufeinander folgender Impfungen auch unterschiedliche Dosierungen eingesetzt werden; der behandelnde Arzt kann eine erste Impfung verabreichen und dann mit relativ geringen Dosen an Adjuvantien auffrischen (boosten); hier sind die Möglichkeiten Protein-Protein, Peptid-Peptid, Protein-Peptid oder umgekehrt, DNA-Protein/Peptid bevorzugt. Es wird weiterhin auf die folgenden Ausführungen zum erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen.
Es ist zum Beispiel vorgesehen, dass Injektionen (intramuskulär oder subkutan oder in die Blutgefäße) ein bevorzugter Weg für die therapeutische Verabreichung der Vakzinen, beispielsweise der eingekapselten oder an Träger gebundenen Vakzinen, sind, obgleich die Zufuhr als Aerosol, über Katheter oder chirurgische Schläuche auch angewendet werden kann. Alternative Wege umfassen Suspensionen, Tabletten, Kapseln und dergleichen für die orale Verabreichung, im Handel erhältliche Vernebler für flüssige Formulierungen und Inhalationen von lyophilisierten oder aerolysierten Verbindungen und Suppositorien für rektale oder vaginale Verabreichung. Flüssige Formulierungen können beispielsweise aus Pulverformulierungen angewendet werden. Für die prophylaktische Immunisierung sind Injektionen der Proteine, Peptide und DNA vorgesehen. Die Eignung der gewählten Impfparameter, zum Beispiel Dosis, Schema, Adjuvanzwahl und dergleichen kann durch Entnahme von Serum-Aliquoten aus dem Patienten - das heißt dem Mensch oder dem Tier - und Testen auf Antikörpertiter im Verlauf des Immunisierungsprotokolls bestimmt werden. Alternativ und begleitend dazu kann die Menge von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems auf herkömmliche Weise bestimmt werden, um einen Gesamtüberblick über die immunologische Konstitution des Patienten zu erhalten. Zusätzlich kann der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung, zum Beispiel die antiinfektiöse Wirkung hin beobachtet werden. Da beispielsweise HIV oder andere Erkran- kungen mit weiteren Infektionen assoziiert sein können, ist es auch möglich, diese zusätzlich mit zu verfolgen. Wenn unzureichende Immunisierung erzielt wird, dann kann der Patient mit weiteren Impfungen geboostet und die Impfparameter in einer Weise modifiziert werden, von der eine Verbesserung der Immunantwort erwartet werden kann, bevorzugt eine Erhöhung der Peptid- oder Antigen- und/oder Adjuvanzmenge, Komplexierung der Peptide mit einem Träger oder dessen Konjugation an ein immunogenes Protein oder Variierung des Verabreichungsweges.
Im Allgemeinen können sowohl wässrige Formulierung als auch trockene Peptide oder Adjuvantien mit einem Exzipienten vermengt werden, um für eine stabilisierende Wirkung vor der Behandlung beispielsweise mit einem Lösungsmittel zu sorgen. Eine wässrige Lösung eines Peptides kann ein Peptid in Suspension oder eine Lösung sein.
Das erfindungsgemäße rekombinante Protein, das DNA-Konstrukt und/oder das Peptid können in einer Lösung mit einem Konservierungsmittel eingebracht sein. Beispiele für geeignete Konservierungsmittel der Suspension bzw. Lösungen umfassen Phenol, Benzylalkohol, m-Kresol,
Metylparaben, Propylparaben, Benzalkoniumchlorid und Benzethoniumchlorid. Im Allgemeinen können die Formulierungen der Peptide bzw. der Antigenkonstrukte Komponente in Mengen enthalten, die der Herstellung stabiler Formen nicht abträglich sind und Mengen, die für wirksame, sichere pharmazeutische Verabreichungen geeignet sind. Beispielsweise können andere pharmazeutisch annehmbare, dem Fachkundigen bekannte Exzipienten einen Teil der erfindungsgemäßen Vakzinen oder Formulierungen bilden. Diese umfassen beispielsweise Salze, verschiedene Füller, zusätzliche Pufferagenzien, Chelatbildner, Antioxydanzien, Co- Lösungsmittel und dergleichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das immunogene Konstrukt mit einer liposomalen Formulierung assoziiert. Dies kann beispielsweise so erfolgen, dass das immunogene Konstrukt in einem Liposom eingeschlossen oder auf der Liposomenoberfläche verankert vorliegt. Dem Fachmann ist bekannt, dass künstliche bzw. natürliche Membranen von Liposomen eine immunstimulierende Wirkung haben können, insbesondere dann, wenn die antigenen Komponenten auf die Oberfläche der Liposomen gekoppelt werden oder im Inneren der Liposomen eingeschlossen sind oder einfach nur mit den Liposomen zusammen vermischt werden. Bevorzugt ist, dass die immunstimulierende Wirkung erhöht wird, indem die Liposomen mit transmembranen oder fusiogenen Glycoproteinen "gespiked" sind. Derartige Formulierungen von Liposomen können parentral appliziert werden. Es ist möglich, derartige Formulierungen mit bekannten Methoden, wie zum Beispiel einem Spray, nasal auf die Schleimhäute der Nasenhöhlen zu applizieren. Eine mit dem Spray induzierbare mukosale Immunantwort ist bevorzugt für die Behandlung von SARS geeignet. Insbesondere bei der nasalen Verabreichung muss die antigene Komponente bzw. das immunogene Konstrukt in einem solchen Zustand auf die Schleimhaut aufgetragen werden, das es in der Lage ist, die Schleimhaut zu durchdringen oder durch diese absorbiert zu werden. Daher muss das Vesikel mit dem Schleim biokompatibel sein und ein gewisses Maß an Hydrophilie aufweisen. Dem Fachmann sind derartige Strukturen beispielsweise aus der EP 0682528 bekannt, deren Lehre mit in den Offenbarungsgehalt der Erfindung aufgenommen ist. Die liposomale Zusammensetzung kann einen oder mehrere zusätzliche pharmazeutische Träger umfassen, die ausgewählt sind aus oberflächenaktiven Stof- fen und Absorptionsförderern wie zum Beispiel Polyoxyethylenalkoholethem, Gallensalzen und deren Derivaten, Fusidinsäure und deren Derivaten, Oleinsäure, Lecithin, Lysolecithinen, Tween® 21 bis 85, usw., wasserabsorbierenden Polymeren wie zum Beispiel Glycofurol, Polyethylenglycol 200 bis 7500, Polyvinylpyrrolidon, Propylenglycol oder Polyacrylsäure, Gelatine, Cellulose und Derivaten usw.; Substanzen, welche den enzymatischen Abbau hemmen, wie zum Beispiel Aprotinin usw.; organischen Lösungsmitteln wie zum Beispiel Alkoholen, zum Beispiel Ethanol, Glycerol, Benzylalkohol usw.; oder Ethylacetat usw.; hydrophoben Mitteln wie zum Beispiel pflanzlichem Öl, Sojabohnenöl, Erdnussöl, Kokosnussöl, Maisöl, Olivenöl, Sonnenblumenöl, "Miglyolen" oder deren Mischungen usw.; pH-regulierenden Mitteln wie zum Beispiel Salpetersäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Citraten usw.; Konservierungsmitteln und den osmotischen Druck regulierenden Mitteln wie zum Beispiel
Glycerol, Natriumchlorid, Methylparaoxybenzoat, Benzoesäure usw.; Liposomen- und/oder Emulsionsformulierungen wie zum Beispiel Lecithinen usw.; mikroverkapselten Formulierungen; Treibmitteln wie zum Beispiel Butan.
Bevorzugt ist es in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, dass die Peptidabschnitte gegebenenfalls miteinander assoziiert oder mit einem Träger verbunden in Liposomen eingeschlossen sind, wobei der Einschluss in Liposomen im Sinne der Erfindung nicht zwingend bedeuten muss, dass die Peptide im Inneren der Liposomen vorliegen, ein Einschluss im Sinne der Erfindung kann auch bedeuten, dass die Peptide mit der Membran der Liposomen assoziiert sind, beispielsweise so, dass diese auf der äußeren Membran verankert sind. Eine solche Darstellung der erfindungsgemäßen Peptide in oder auf den Liposomen ist vorteilhaft, wenn der Fachmann die Liposomen so auswählt, dass sie eine immunstimulierende Wirkung haben. Dem Fachmann sind aus der DE 198 51 282 verschiedene Möglichkeiten bekannt, die immunstimulierende Wirkung von Liposomen zu modifizieren. Bei den Lipiden kann es sich um einfache Lipide handeln, wie beispielsweise Ester und Amide oder um komplexe Lipide wie zum Beispiel um Glycolipide wie Cerebroside oder Ganglioside, um Sphingolipide oder um Phospholipide.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die erste helikale Struktur eine C-terminale Helix und die zweite alpha-helikale Struktur ist eine N-terminale Helix des viralen Hüllproteins. Sofern zur Generierung eines immunogenen Konstruktes beispielsweise gp41 des HIV gewählt wird, kann der Fachmann bevorzugt einen Bereich zwischen der Fusionsdomäne und der N-terminalen Helix und einen Bereich zwischen dem Transmembrandurchgang und der C-terminalen helikalen Struktur wählen, wobei die Fusionsdomäne, der Bereich des Transmembrandurchganges und/oder die alpha-helikale Struktur, sofern es sich um eine handelt, oder die alpha-helikale Strukturen an dem immunogenen Konstrukt ganz oder teilweise beteiligt sein können. Sofern die erfindungsgemäßen Peptide aus HI-Viren gewonnen werden, handelt es sich bevorzugt um Peptide oder rekombinante Proteine oder DNA, die den Aminosäuren 519 bis 564 (N-terminale Sequenz) und 650 bis 683 (C-terminale Sequenz) des HIV-1 Referenz Genoms (NCBI Datenbank: K03455, HIV HXB2 CG) entsprechen, oder Fragmenten bzw. Untereinheiten hiervon, die funktionsanalog zu den oben genannten Domänen sind, das heißt, die in der Lage sind, neutralisierende Antikörper zu induzieren und im besonders bevorzugten Falle einen Infektionsschutz hervorzurufen. Dem Fachmann ist selbstverständlich bekannt, dass aufgrund der Variabilität bei unterschiedlichen Subtypen von HIV-1 Sequenzvariationen innerhalb dieser Sequenzen vorliegen; derartige Sequenzvariationen sind von der Erfindung mit erfasst. Dies trifft auch für Teilsequenzen der Konsensussequenzen 519 bis 564 und 650 bis 683 zu einschließlich chemischer Modifikationen einzelner Aminosäuren, der Verknüpfung der Sequenzen mittels Linker und Sequenzen mit zusätzlichen angefügten Aminosäuren zum Zwecke der Multimerisierung der Sequenzen.
Bevorzugte N-terminale Sequenzen sind:
FLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQ FLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLL FLGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHML FLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLS FLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLS FLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQARQLLS LLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLS FLGFLGAAGSTMGAASITLTVQVRQLLS FLGVLSAAGSTMGAAATALTVQTHTLMK
Bevorzugte C-terminale Sequenzen sind:
SQNQQEKNEQELLELDKWAGLWSWFSITNWLWY SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWY SQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWY NEQDLLALDKWASLWNWFDITNWLWY1K NEQDLLALDKWANLWNWFDISNWLWYIK NEQDLLALDKWANLWNWFDITNWLWYIR NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWY1K NEKDLLALDSWQNLWNWFDITNWLWYIK NEQELLELDKWASLWNWFSITQWLWYIK NEQELLALDKWASLWNWFDISNWLWYIK NEQDLLALDKWDNLWSWFSITNWLWYIK NEQDLLALDKWASLWNWFDITKWLWYIK NEQDLLALDKWASLWNWFSITNWLWYIK NEKKLLELDEWASIWNWLDITKWLWYIK
Abkürzungen: Ein BuchstabenCode für Aminosäuren:
A Alanin
C Cystein
D Asparaginsäure
E Glutaminsäure
F Phenylalanin
G Glycin
H Histidin
1 Isoleucin
K Lysin L Leucin
M Methionin
N Asparagin
P Prolin
Q Glutamin
R Arginin
S Serin
T Threonin
V Valin
W Tryptophan
Y Tyrosin
Erfindungsgemäß wird jeweils aus der Gruppe der N-terminalen Sequenzen und der C- terminalen Sequenzen ein Peptid ausgewählt, wobei durch die Kombination von mindestens zwei Sequenzen das erfindungsgemäße immunogene Konstrukt bereitgestellt werden kann. Es kann auch als rekombinantes Protein oder DNA (Vakzin, Impfstoff) appliziert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Impfstoff (Vakzin) ein Fragment aus Hüllproteinen, ausgewählt aus der Gruppe umfassend GP2, gp20, gp21 , gp30, gp36, gp37, gp40, gp41 , gp45, gp160, p15E, E2, HA2 und/oder F2. Die Zuordnung dieser zu einzelnen Viren ist im Folgenden dargestellt:
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die jeweils mindestens zwei Peptidabschnitte, rekombinante Proteine oder entsprechende DNA ausgewählt aus der Gruppe umfassend (wobei N für N-terminale Sequenzen und C für C-terminale Sequenzen steht):
N: AVGLAIFLLVLAIMAITSSLVAATTLVNQHTTAKV C: SLSDTQDTFGLETSIFDHLVQLFDWTSWKDWIK, bevorzugt bei BIV (transmembranes Hüllprotein gp40);
N: GVGLVIMLVIMAIVAAAGASLGVANAIQQSYTKAAVQTLAN C: AMTQLAEEQARRIPEVWESLKDVFDWSGWFSWLKYI, bevorzugt bei CAEV(transmembranes Hüllprotein); N: FGISAIVAAIVAATAIARSATMSYVALTEVNKIMEVQNH C: LAQSMITFNTPDSIAQFGKDLWSHIGNWIPGLGASIIKY, bevorzugt bei EIAV1 (transmembranes Hüllprotein gp45); N: SSSYSGTKMACPSNRGILRNWYNPVAGLRQSLEQYQVVKQPDYLLVPE C: MDIEQNNVQGKIGIQQLQKWEDWVRWIGNIPQYLK, bevorzugt bei FIV (transmembranes Hüllprotein gp36); N: GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSSYTRTAVQSLANATAAQQN C: QVQIAQRDAQRIPDVWKALQEAFDWSGWFSWLKYIPW, bevorzugt bei OMVV (transmembranes Hüllprotein gp41); N: LGFLGFLATAGSAMGAASLVTAQSRTLLAVIVQQQQQLLDVV C: EEAQIQQEKNMYELWKLNWWDVFGNWFDLTSWDLTSWIKY, bevorzugt bei SIVmac (transmembranes Hüllprotein gp41);
N: LGALGFLGAAGSTMGAAAVTLTVQARQLLSGIVQQQNNLL C: EEAQSQQEKNERDLLELDQWASLWNWFDITKWLWYIK, bevorzugt bei SIVcpz (transmembranes Protein gp41); N: FLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQ FLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLL FLGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHML C: SQNQQEKNEQELLELDKWAGLWSWFSITNWLWY SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWY SQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWY bevorzugt bei HIV-1 (transmembranes Hüllprotein gp41);
N: GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSYTRTAVGSLANATAAQQE C: EAALQVHIAQRDARRIPDAWKAIQEAFNNWSSWFSWLKY, bevorzugt bei Visnavirus (transmembranes Hüllprotein gp41); N: LGFLGFLATAGSAMGARSLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLL C: EEAQIQEKNMYELQKLNSWDILGNWFDUSWVKYIQ, bevorzugt bei HIV-2 (transmembranes Hüllprotein gp36); N: WGPTARIFASILAPGVAAAQALREIERLACWSVKQANLTTSLL C: KFQLMKKHVNKIGVDSDPIGSWLRGIFGGIGEWAVH, bevorzugt bei RSV (transmembranes Hüllprotein gp37); N: SVSHLSSDCNDEVQLWSVTARIFASFFAOGVAAQALKEIERLA C: ALQAMKEHTEKIRVEDDOIGDWFTRTFGGLGGWLAK, bevorzugt bei ALV (transmembranes Hüllprotein gp37); N: GLSLIILGIVSLITLIATAVTACCSLAQSIQAAHTVDLSSQNVTKVMGT C: IENSPKATLNIADTVDNFLQNLFSNFPSLHSLNKTL, bevorzugt bei JSRV (transmembranes Hüllprotein gp36); N: AVTLIPLLVGLGVSTAVATGTAGLGVAVQSYTKLSHQLINDVQALSSTI C: KIKNLQEDLEKRRKALADNLFLTGLNGLLPYLLP, bevorzugt bei SMRV (transmembranes Hüllprotein gp20); N: AIQFIPLVIGLGITTAVSTGTAGLGVSLTWYTKLSHQLISDBQAISSTI C: KIKNLQDDLEKRRKQLIDNPFWTGFHLLPYVMPL, bevorzugt bei SRV (transmembranes Hüllprotein gp20); N: AVSLTLAVLLGLGITAGIGGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDAD C: SMKKLKEKLDKRQLERQDSQNWYEGWFNNWPWFTT, bevorzugt bei GALV (transmembranes Hüllprotein p15E); N: EPVSLTLALLLGGLTMGGIAGVGTGTTALVATQQFQQLQAAMHD C: SMAKLRERLSQRQKLFESQQGWFEGLFNKSPWFTT, bevorzugt bei MuLV (transmembranes Hüllprotein p15E); N : KALLEAQFRLQLQMQMHTDIQALEESISALEKSL C: NMAKLRERLKQRQQLFDSQQGWFEGWFNRSPWFTT, bevorzugt bei FeLV (transmembranes Hüllprotein p15E);
N: TAALITGPQQLEKGLSNLHRIVTEDLQALEKSVSNL C: DHSGAIRDSMSKLRERLERRRREREADQGWFEGWFNRS bevorzugt bei PERV (transmembranes Hüllprotein p15E); N: TALIKGPIDLQQGLTSLQIAMDTDLRALQDSISKLED C: SMRRLKERLDKRQLEHQKNLSWYEGWFNRSPWLTT bevorzugt bei KoRV (transmembranes Hüllprotein p15E); N: SPVAALTLGLALSVGLTGINVAVSALSHQRLTSLIHVLEQDQQ C: PLSQRVSTDWQWPWNWDLGLTAWVRET, bevorzugt bei BLV (transmembranes Hüllprotein gp30); N: AVPVAWLVSALAMGAGVAGGITGSMSLASGKSLLHEV
C: PILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQ, bevorzugt bei HTLV-1 (transmembranes Hüllprotein gp21); N: AVPIAVWSVSALAAGTGIAGGVTGSLSLASSKSLLLEVD C: SVLQERPPLEKRVITGWGLNWDLGLSQWAREALQ, bevorzugt bei HTLV-2 (transmembranes Hüllprotein gp30);
N: FPNINENTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGI C: KNISEQIDQIKKDEQKIGRGWGLGGKWWTSDWG, bevorzugt beim Marburg Virus (transmembranes Glykoprotein gp36); N: LITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTQDEGAAIGLAWIPYFGPAA C: KNITDKIDQHHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWI, bevorzugt bei Ebola (transmembranes Protein GP2); N: LITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDF C: DRLNEVAKNLNESLIDLQELKYEQYEKWPWYVW, bevorzugt beim SARS- Virus (E2, transmembranes Glykoprotein gp36); N: GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAA C: HDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILISFA, bevorzugt beim Influenza-Virus (Hämagglutinin2, HA2); N: FAGVVLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLSSQAIDNLRASLETT C: IAKLEDAKELLESSKQILRSMKGLSSTS1VY, bevorzugt beim Masernvirus (Fusionsprotein F2);
N: FAGIAIGIAALGVATAAQVTAAVSLVQAQTNARAAAMKNSIQTNRA C: TELSKVNASLQNAVKQIKESNHQLQSVSVSSK, bevorzugt beim Mumpsvirus (Fusionsglykoprotein F2); N: FFGAVIGTIALGVATAAQ1TAGIALAEAREARKDIALIKDSIVKTH C: TNFLEESKTELMKARAIISVGGWHNTESTQ, bevorzugt bei HPV-1 (F2 Glykoprotein),
wobei die Viren wie folgt abgekürzt sind: BIV (Bovines Immundefizienzvirus), CAEV (Caprines Arthritis Enzephalitis Virus), EIAV1 (Equines infektiöses Anämievirus), FIV (Feiines Immundefizienzvirus), OMVV (Ovines Maedi-Visna Virus), SIVmac (Simianes Immundefizienzvirus aus Makaken), SIVcpz (Simianes Immundefizienzvirus aus Schimpansen), HIV-1 (Humanes Immundefizienzvirus Typ 1), HIV-2 (Humanes Immundefizienzvirus Typ 2), RSV (Rous Sarkom Virus), ALV (Aviäres Leukosevirus), JSRV (Jaagsiekte Schaf Retrovirus), SMRV (Squirrel Monkey Retrovirus), SRV (Simianes Retrovirus), GALV (Gibbonaffen Leukämievirus), MuLV (Murines Leukämievirus), FeLV (Feiines Leukämievirus), KoRV (Koala Retrovirus) PERV (Porcines endogenes Retrovirus) BLV (Bovines Leukämievirus), HTLV-1 (Humanes T-Zell Leukämievirus Typ 1), HTLV-2 (Humanes T-Zell Leukämievirus Typ 2), SARS-Virus (Erreger des Schweren Akuten Respiratorischen Syndroms) und HPV-1 (Humanes Parainfluenza Virus).
Durch die Offenbarung der erfindungsgemäßen jeweils mindestens zwei Peptide, Proteindomänen und deren entsprechende DNA und ihrem Vermögen, spezifische Antikörper zum einen zumindest im Fall der Peptide und Proteindomänen zu binden und zum anderen zu induzieren, sind dem Fachmann verschiedene Möglichkeiten offenbart, weitere Peptide zu generieren. Der Fachmann kann durch die Offenbarung der erfindungsgemäßen Lehre weitere äquivalente Peptide generieren, die funktionsanalog zu Peptiden sind mit der Sequenzabfolge:
FLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLS, FLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLS, FLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQARQLLS, LLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLS, FLGFLGAAGSTMGAASITLTVQVRQLLS, FLGVLSAAGSTMGAAATALTVQTHTLMK, FLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLLSG1VQQQNNLLRAIEAQQ FLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLL FLGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHML
AVGLAIFLLVLAIMAITSSLVAATTLVNQHTTAKV, GVGLVIMLVIMAIVAAAGASLGVANAIQQSYTKAAVQTLAN, FGISAIVAAIVAATAIARSATMSYVALTEVNKIMEVQNH, SSSYSGTKMACPSNRGILRNWYNPVAGLRQSLEQYQVVKQPDYLLVPE, GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSSYTRTAVQSLANATAAQQN,
LGFLGFLATAGSAMGAASLVTAQSRTLLAVIVQQQQQLLDVV, LGALGFLGAAGSTMGAAAVTLTVQARQLLSGIVQQQNNLL, GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSYTRTAVGSLANATAAQQE, LGFLGFLATAGSAMGARSLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLL, WGPTARIFASILAPGVAAAQALREIERLACWSVKQANLTTSLL, SVSHLSSDCNDEVQLWSVTARIFASFFAOGVAAQALKEIERLA, GLSLIILGIVSLITLIATAVTACCSLAQSIQAAHTVDLSSQNVTKVMGT, AVTLIPLLVGLGVSTAVATGTAGLGVAVQSYTKLSHQLINDVQALSSTI, AIQFIPLVIGLGITTAVSTGTAGLGVSLTWYTKLSHQLISDBQAISSTI, DPVSLTVALLLGGLTMGSLAAGIGTGTAALIETNQFKQLQ, AVSLTLAVLLGLGITAGIGGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDAD, EPVSLTLALLLGGLTMGGIAGVGTGTTALVATQQFQQLQAAMHD, EPISLTVALMLGLTVGG1AAGCGTGTKALLEAQFLQLQMQMHTD, SPVAALTLGLALSVGLTGINVAVSALSHQRLTSLIHVLEQDQQ, AVPVAWLVSALAMGAGVAGGITGSMSLASGKSLLHEV,
AVPIAVWSVSALAAGTGIAGGVTGSLSLASSKSLLLEVD, FPNINENTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGI, LITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTQDEGAAIGLAWIPYFGPAA, LITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDF, GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAA, FAGVVLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLSSQAIDNLRASLETT, FAGIAIGIAALGVATAAQVTAAVSLVQAQTNARAAAMKNSIQTNRA, FFGAVIGTIALGVATAAQITAGIALAEAREARKDIALIKDSIVKTH, wobei es sich hierbei bevorzugt um N-terminale Sequenzen handelt und NEQDLLALDKWASLWNWFDITNWLWYIK,
NEQDLLALDKWANLWNWFDISNWLWYIK, NEQDLLALDKWANLWNWFDITNWLWYIR, NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIK, NEKDLLALDSWQNLWNWFDITNWLWYIK, NEQELLELDKWASLWNWFSITQWLWYIK, NEQELLALDKWASLWNWFDISNWLWYIK, NEQDLLALDKWDNLWSWFSITNWLWYIK, NEQDLLALDKWASLWNWFDITKWLWYIK, NEQDLLALDKWASLWNWFSITNWLWYIK, NEKKLLELDEWASIWNWLDITKWLWYIK,
SQNQQEKNEQELLELDKWAGLWSWFSITNWLWY SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWY SQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWY SLSDTQDTFGLETSIFDHLVQLFDWTSWKDWIK, AMTQLAEEQARRIPEVWESLKDVFDWSGWFSWLKYI, LAQSMITFNTPDSIAQFGKDLWSHIGNW1PGLGASIIKY,
MDIEQNNVQGKIGIQQLQKWEDWVRWIGNIPQYLK,
QVQIAQRDAQRIPDVWKALQEAFDWSGWFSWLKYIPW,
EEAQIQQEKNMYELWKLNWWDVFGNWFDLTSWDLTSWIKY, EEAQSQQEKNERDLLELDQWASLWNWFDITKWLWYIK,
EAALQVHIAQRDARRIPDAWKAIQEAFNNWSSWFSWLKY,
EEAQIQEKNMYELQKLNSWDILGNWFDLISWVKYIQ,
KFQLMKKHVNKIGVDSDPIGSWLRGIFGGIGEWAVH,
ALQAMKEHTEKIRVEDDOIGDWFTRTFGGLGGWLAK, IENSPKATLNIADTVDNFLQNLFSNFPSLHSLNKTL,
KIKNLQEDLEKRRKALADNLFLTGLNGLLPYLLP,
KIKNLQDDLEKRRKQLIDNPFWTGFHLLPYVMPL,
SMAKLRERFKQRQKLFESQQGQFEGWYNKSPWETT,
SMKKLKEKLDKRQLERQDSQNWYEGWFNNWPWFTT, SMAKLRERLSQRQKLFESQQGWFEGLFNKSPWFTT,
NMAKLRERLKQRQQLFDSQQGWFEGWFNRSPWFTT,
PLSQRVSTDWQWPWNWDLGLTAWVRET,
PILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQ,
SVLQERPPLEKRVITGWGLNWDLGLSQWAREALQ, KNISEQIDQIKKDEQKIGRGWGLGGKWWTSDWG,
KNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWI,
DRLNEVAKNLNESLIDLQELKYEQYEKWPWYVW,
HDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILISFA,
IAKLEDAKELLESSKQILRSMKGLSSTSIVY, TELSKVNASLQNAVKQIKESNHQLQSVSVSSK,
TNFLEESKTELMKARAIISVGGWHNTESTQ, bevorzugt handelt es sich hierbei um C-terminale Sequenzen.
Beispielsweise ist es möglich, einzelne oder Gruppen von Aminosäuren auszutauschen, ohne dass die Aktivität der Peptide in Bezug auf die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe nachteilig beeinflusst wird. Für den Austausch derartiger Aminosäuren sei auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Genetik verwiesen.
Im Stand der Technik sind verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung von Peptiden offenbart. Peptide, die von den erfindungsgemäßen Peptiden ausgehend mit solchen Verfahren entwickelt werden, sind von der erfindungemäßen Lehre mit erfasst. Eine Möglichkeit des Generierens von funktionsanalogen Peptiden ist beispielsweise in PNAS USA 1998, Oct. 13; 9521 :12179-84, WO 99/6293 und/oder WO 02/38592 beschrieben; diese Lehren sind in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen. Das heißt, sämtliche Peptide, Peptidfragmente oder Strukturen, die Peptide umfassen, die mit den genannten Verfahren - von den erfindungsgemäßen Peptiden ausgehend - generiert werden, sind Peptide im Sinne der Erfindung, sofern sie die erfindungsgemäße Aufgabe lösen, insbesondere neutralisierende Antikörper zu generieren.
Dem Fachmann ist weiterhin bekannt, dass einzelne Aminosäuren analoge physikochemische Eigenschaften aufweisen, die mit Vorteil dazu führen, dass diese Aminosäuren untereinander ausgetauscht werden können. Hierzu gehören beispielsweise die Gruppe der Aminosäuren (a) Glycin, Alanin, Valin, Leucin und/oder Isoleucin; bzw. die Aminosäuren (b) Serin und Threonin, die Aminosäuren (c) Asparagin und Glutamin, die Aminosäuren (d) Asparaginsäure und Glutaminsäure; die Aminosäuren (e) Lysin und Arginin sowie die Gruppe der aromatischen Aminosäuren (f) Phenylalanin, Tyrosin und/oder Tryptophan. Aminosäuren innerhalb ein und derselben Gruppe (a-f) können untereinander ausgetauscht werden. Weiterhin ist es möglich, dass Aminosäuren durch modifizierte Aminosäuren oder spezifische Enantiomere ausgetauscht werden. Weitere Modifikationen sind gemäß der Lehre nach der WO 99/62933 oder WO 02/38592 möglich.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid einen Linker und/oder einen Spacer, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: α-Aminocarbonsäuren sowie deren Homo- und Heterooligomere, α,ω-Aminocarbonsäuren sowie deren verzweigte Homo- oder Heterooligomere, sonstige Aminosäuren sowie die linearen und verzweigten Homo- oder Heterooligomere (Peptide); Amino-oligoalkoxy-alkylamine; Maleinimidocarbonsäure-Derivate; Oligomere von Alkylaminen; 4-Alkylphenyl-Derivate; 4-Oligoalkoxyphenyl- oder 4-Oligoalkoxy- phenoxy-Derivate; 4-Oligoalkylmercaptophenyl- oder 4-Oligoalkylmercaptophenoxy-Derivate; 4-Oligoalkylaminphenyl- oder 4-Oligoalkylaminyphenoxy-Derivate; (Oligoalkylbenzyl)-phenyl- oder 4-Oligoalkylbenzyl)-phenoxy-Derivate sowie 4-Oligoalkoxybenzyl)-phenyl- oder 4-Oligo- alkoxybenzyl)-phenoxy-Derivate; Trityl-Derivate; Benzyloxyaryl- oder Benzyloxyalkyl-Derivate; Xanthen-3-yl-oxyalkyl-Derivate; (4-Alkylphenyl)- oder ω-(4-Alkylphenoxy)-alkansäure-Derivate; Oligoalkyl-Phenoxyalkyl- oder Oligoalkoxy-phenoxyalkyl-Derivate; Carbamat-Derivate; Amine; Trialkylsilyl- oder Dialkyl-alkoxysilyl-Derivate; Alkyl- oder Aryl-Derivate und/oder Kombinationen davon; weitere mögliche Strukturen werden in der EP 1 214 350 beschrieben, die in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen sind. Bevorzugt können synthetische Peptide, die den N-terminalen und/oder C-terminalen Sequenzen entsprechen oder Fragmente hiervon sind, durch chemische Crosslinker multimerisiert werden oder an ein Trägermolekül wie BSA, Dextran, KLH oder andere gekoppelt werden. Die hierzu verwendeten chemischen Crosslinker sind in "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996 aufgelistet, die in den Offenbarungsgehalt der erfindungsgemäßen Lehre mit aufgenommen sind. Bevorzugte Crosslinker sind homobifunktionale Crosslinker, bevorzugt: NHS-Ester, wie DSP, DTSSP, DSS, BS, DST, Sulfo-DST, BSOCOES, Sulfo-BSOCOES, EGS, Sulfo-EGS, DSG oder DSC, homobifunktionale Imidoester, wie DMA, DMP, DMS oder DTBP, homobifunktionale Sulfhydryl-reaktive Crosslinker, wie DPDPB, BMH oder BMOE, Difuorobenzenderivate, wie DFDNB oder DFDNPS, homobifunktionale photoreaktive Crosslinker, wie BASED, homobifunktionale Aldehyde, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd, Bis-Epoxide, wie 1 ,4-Butandioldiglycidylether, homobifunktionale Hydrazide, wie Adipinsäuredihydrazide oder Carbohydrazide, Bis-diazoniumderivate, wie o-Tolidin, bisdiazotisiert.es Benzidin oder Bisallkylhaloid.
Bevorzugt sind auch heterobifunktionale Crosslinker, insbesondere aminreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie SPDP, LC-SPDP, Sulfo-LC-SPDP, SMPT, Sulfo-LC-SMPT, SMCC, Sulfo- SMCC, MBS, Sulfo-MBS, SIAB, Sulfo-SIAB, SMPB, Sulfo-SMBP, GMBS, Sulfo- GMBS, SIAX, SIAXX, SIAC, SIACX oder NPIA, carbonylreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie MPBH, M2C2H oder PDPH, aminreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie NHS-ASA, Sulfo-NHS-ASA, Sulfo-NHS-LC-ASA, SASD, HSAB, Sulfo-HSAB, SANPAH, Sulfo- SANPAH, ANB-NOS, SAND, SADP, Sulfo-SADP, Sulfo-SAPB, SAED, Sulfo-SAMCA, p-Nitrophenyldiazopyruvat oder PNP-DTP, Sulfhydryl und photoreaktive Crosslinker, wie ASIB, APDP, Benzophenon-4-iodoacetamid oder Benzophenon-4-maleimid, carbonylreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ABH, carboxylatreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ASBA, argininreaktive Crosslinker, wie APG, trifunktionale Crosslinker, wie 4-Azido-2- nitrophenylbiozytin-4-nitrophenylester, Sulfo-SEBD, TSAT und/oder TMEA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide und rekombinant hergestellte Strukturen durch Peptidbrücken mit einer Länge von 0 bis 50 Aminosäuren verbunden. Dies beinhaltet auch rekombinante Proteine, die aus zwei N- terminalen und einer C-terminalen Sequenz bestehen oder Hexamere bestehend aus drei N- terminalen Sequenzen und drei C-terminalen Sequenzen, oder Multimere der zuvor aufgeführten rekombinanten Strukturen, wobei zwischen den N- und den C-terminalen Sequenzen je eine Peptidbrücke von 0 bis 50 Aminosäuren vorhanden sein kann. Die Peptide können zum Zwecke der Aufreinigung, Solubilisierung bzw. der Konformationsveränderung mit spezifischen Fusionsanteilen entweder am N- oder am C-Terminus versehen sein, wie zum Beispiel CBP (Calmodulin-Bindungsprotein), His-Tag und/oder andere. Ähnliche Konstrukte können auch von DNA, die zum Immunisieren verwendet wird, kodiert werden.
Nach einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Peptidgemisch und Proteingemisch ausgewählt aus der Gruppe umfassend: a) mindestens zwei Peptide oder rekombinante Proteine umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No 1 bis 104, b) Peptide oder rekombinante Proteine umfassend eine Aminosäuresequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Aminosäuresequenz gemäß a) funktionsanalog zu sein, c) Peptide oder rekombinante Proteine gemäß einer Aminosäuresequenz a) oder b), welche durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Aminosäuresequenz gemäß a) oder b) ist.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist die Aminosäuresequenz, z.B. das Peptid oder rekombinante Protein, was eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID No 1 bis 104 funktionsanalog zu sein, zu diesen zumindest 40 % homolog.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind diese Aminosäuresequenzen mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt 90 %, homolog zu einer der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID No 1 bis 104.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht das Peptid oder rekombinante Protein im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz
a) Synthetische Peptide E1 (LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS, FLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLL und E2 (NEQELLELDKWASLWNWFDITNWL oder SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWY)
b) Hybrid I (HIV-Sequenzen unterstrichen)
LITQARQLLSDIVQQQRIVTEDLQALEKSVSNLEESLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKKEGLCVALKE ECCFYVDHSGAIRDSMSKLRERLERRRREELDKWASLWNWFN
c) Hybrid II (HIV-Sequenzen unterstrichen)
LITGASVTLTVQARQLLSDIVQQQRIVTEDLQALEKSVSNLEESLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKKE GLCVALKEECCFYVDHSGA1RDSMSKLRERLERRRREELDKWASLWNWFN1TNWLWY
d) Loop I: (HIV-Sequenzen unterstrichen)
LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSSSPSSNEQELLELDKWASLWNWFDITNWL
Insbesondere besteht das Peptid aus Abwandlungen dieser Sequenzen, die nach der WO 99/62933 und der WO 02/38592 gewonnen wurden, wobei diese Peptide selbstverständlich Antikörper im Sinne der Erfindung generieren und binden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Peptidabschnitte des immunogenen Konstruktes, wie bereits allgemein ausgeführt, untereinander an andere Peptide oder Proteine oder mit einem Träger assoziiert. Es kann beispielsweise vorgesehen sein, dass die mindestens zwei erfindungsgemäßen Peptide des immunogenen Konstruktes über Peptid- oder nichtpeptidische Bindungen miteinander verbunden sind. Die nichtpeptidischen Bindungen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise Imino-, Ester-, Azo-, Hydrazit-, Semikarbazit- und andere Bindungen. Bei den Trägern im Sinne der Erfindung kann es sich um Proteine handeln, die aufgrund ihres immunogenen Verhaltens die Antikörperantwort stimulieren, aber auch um den Fachmann bekannte pharmazeutische Hilfsstoffe wie zum Beispiel QS21 , GPI- 0100 oder andere Saponine, Wasser-Öl-Emulsionen wie beispielsweise Montanide, Polylysin, Polyagenin-Verbindungen oder andere, wie zum Beispiel phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Wasser, verschiedene Arten von Detergenzien, sterile Lösungen und dergleichen mehr.
Die Erfindung umfasst auch Antikörper, die durch die erfindungsgemäßen Peptide bzw. durch das erfindungsgemäße immunogene Konstrukt hergestellt oder induziert werden. Die Peptide bzw. Proteine können hierbei chemisch hergestellt sein oder durch rekombinante DNA- Technologie oder anders. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Antikörper wird mindestens ein erfindungsgemäßes immunogenes Konstrukt so mit einem Organismus in Kontakt gebracht, dass dieser in der Lage ist, gegen dieses Konstrukt Antikörper herzustellen, die durch den Fachmann mit den bekannten Methoden gewonnen und isoliert werden können.
Die Erfindung betrifft aber auch anti-ldiotyp-Antikörper. Antikörper tragen Idiotypen, Bereiche in der Nähe ihrer Antigen-Erkennungsstellen, die selbst antigen und in der Lage sind, die Antikörperproduktion zu stimulieren. Antikörper, die spezifisch für die Antigen-Bindungsstellen sind, werden Paratop-spezifische anti-ldiotyp-Antikörper genannt. Diese Antikörper tragen die gleiche Erkennungsstelle wie das Antigen, das anfangs die Antikörperproduktion stimulierte; Marx, "Making Antibodies without Antigens", 1986. So können im Sinne der Erfindung Paratop- spezifische anti-idiotypische Antikörper mit teilweise der gleichen Struktur wie HIV, SARS oder andere Viren durch Immunisierung eines Tieres mit einem monoclonalen HIV-1-, SARS- oder FeLV-Antikörper zu den genannten Viren hergestellt werden. Diese Paratop-spezifischen anti- idiotypischen Antikörper, die eine bestimmte gleiche Struktur wie die immunogenen Teile der genannten Viren tragen, sind geeignet, eine Immunantwort auszulösen und können demgemäß ebenfalls als Impfstoff verwendet werden.
Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Mittel, die mindestens eines der erfindungsgemäßen immunogenen Konstrukte umfassen, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Ein pharmazeutisches Mittel im Sinne der Erfindung ist jedes Mittel im Bereich der Medizin, welches in der Prophylaxe, Diagnose, Therapie, Verlaufskontrolle oder Nachbehandlung von Patienten eingesetzt werden kann, die mit umhüllten Viren einschließlich Retroviren so in Kontakt gekommen sind, dass sich zumindest zeitweise eine pathogene Modifikation des Gesamtzustandes bzw. des Zustandes einzelner Teile des Organismus etablieren konnte. So ist es beispielsweise möglich, dass das pharmazeutische Mittel im Sinne der Erfindung eine Vakzine oder ein Immuntherapeutikum ist. Das pharmazeutische Mittel im Sinne der Erfindung kann neben dem immunogenen Konstrukt beispielsweise ein akzeptables Salz oder Komponenten dieser umfassen. Hierbei kann es sich beispielsweise um Salze anorganischer Säuren handeln wie zum Beispiel der Phosphorsäure bzw. um Salze organischer Säuren.
Weiterhin ist es möglich, dass die Salze frei von Carboxylgruppen sind und von anorganischen Basen abgeleitet wurden wie zum Beispiel Natrium, Kalium, Ammonium, Kalzium oder Eisenhydroxyde oder auch von organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethyl- aminoethanol, Histidin und andere. Beispiele für flüssige Träger sind sterile wässrige Lösungen, die keine weiteren Materialien oder aktiven Ingredienzien umfassen und beispielsweise Wasser oder solche, die einen Puffer wie zum Beispiel Natriumphosphat mit einem physiologischen pH umfassen oder eine physiologische Salzlösung bzw. beides, wie zum Beispiel phosphatgepufferte Natriumchloridlösung. Weitere flüssige Träger können mehr als nur ein Puffersalz, wie zum Beispiel Natrium- und Kaliumchlorid, Dextrose, Propylenglycol, Polyethylenglycol oder andere umfassen. Flüssige Zusammensetzungen der pharmazeutischen Mittel können zusätzlich eine flüssige Phase, jedoch unter dem Ausschluss von Wasser, umfassen. Beispiele solcher zusätzlichen flüssigen Phasen sind Glycerin, Pflanzenöle, orga- nische Ester oder Wasser-Öl-Emulsionen. Die pharmazeutische Zusammensetzung bzw. das pharmazeutische Mittel enthält typischerweise einen Gehalt von mindestens 0,1 Gew% der erfindungsgemäßen Peptide bezogen auf die gesamte pharmazeutische Zusammensetzung. Die jeweilige Dosis bzw. der Dosisbereich für die Gabe des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels ist groß genug, um den gewünschten prophylaktischen oder therapeutischen Effekt der Bildung von neutralisierenden Antikörpern zu erreichen. Hierbei sollte die Dosis nicht so gewählt werden, dass unerwünschte Nebeneffekte dominieren. Im Allgemeinen wird die Dosis mit dem Alter, der Konstitution, dem Geschlecht des Patienten variieren sowie selbstverständlich auch in Bezug auf die Schwere der Erkrankung. Die individuelle Dosis kann sowohl in Bezug auf die primäre Erkrankung als auch in Bezug auf Eintreten zusätzlicher Komplikationen eingestellt werden. Die exakte Dosis ist durch einen Fachmann mit bekannten Mitteln und Methoden feststellbar, beispielsweise durch die Feststellung des Antikörpertiters in Abhängigkeit der Dosis bzw. in Abhängigkeit des Impfschemas oder der pharmazeutischen Träger und ähnlichem. Die Dosis kann hierbei je nach Patient individuell gewählt werden. Beispielsweise kann eine vom Patienten noch tolerierte Dosis des pharmazeutischen Mittels eine solche sein, deren Bereich im Plasma oder in einzelnen Organen lokal im Bereich von 0,1 bis 10000 μM liegt, bevorzugt zwischen 1 und 100 μM. Alternativ kann die Dosis auch in Bezug auf das Körpergewicht des Patienten bezogen berechnet werden. In einem solchen Fall wäre beispielsweise eine typische Dosis des pharmazeutischen Mittels in einem Bereich zwischen 0,1 μg bis 100 μg per kg Körpergewicht einzustellen, bevorzugt zwischen 1 und 50 μg/kg. Weiterhin ist es jedoch auch möglich, die Dosis nicht in Bezug auf den gesamten Patienten, sondern in Bezug auf einzelne
Organe zu bestimmen. Dies wäre beispielsweise dann der Fall, wenn das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel beispielsweise in einem Biopolymer, eingebracht in den jeweiligen Patienten, in der Nähe bestimmter Organe mittels einer Operation platziert wird. Dem Fachmann sind mehrere Biopolymere bekannt, die Peptide oder rekombinante Proteine in einer ge- wünschten Art und Weise freisetzen können. Ein solches Gel kann beispielsweise 1 bis 1000 μg der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen, z.B. Peptide oder rekombinanten Proteine bzw. des pharmazeutischen Mittels pro ml Gelkomposition beinhalten, bevorzugt zwischen 5 bis 500 μg/ml und besonders bevorzugt zwischen 10 und 100 mg/ml. In solch einem Fall wird das therapeutische Mittel als feste, gelartige oder als flüssige Komposition verabreicht.
5 Bevorzugt wird das pharmazeutische Mittel als Vakzine nach der Infektion oder als vorbeugende Impfung eingesetzt. Die Impfung erfolgt vorteilhafterweise so, dass es nach der Applikation im Organismus zur Entwicklung eines aktiven Impfschutzes kommt. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass die Impfung unmittelbar vor oder zeitnah nach der Infektion erfolgt oder als Therapie mehrfach appliziert wird. Dem Fachmann ist bekannt, dass die Induktion einer Antwort l o neutralisierender Antikörper zu nahezu jedem Zeitpunkt auch nach der Infektion von Vorteil sein kann, so dass eine Impfung im Sinne der Erfindung auch eine Applikation des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels Wochen, Monate, Jahre bzw. Jahrzehnte nach der Infektion mit dem jeweiligen Virus sein kann.
Zur Unterstützung der Immunantwort kann das pharmazeutische Mittel in einer bevorzugten
15 Ausführungsform der Erfindung weitere immunogene Komponenten umfassen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bordetella, Haemophilus, Borrelia, Pseudomonas, Corynebakterien, Mycobakterien, Streptokokken, Salmonellen, Pneumokokken, Staphylokokken und/oder Clostridien. Es ist bekannt, dass die alleinige Gabe von Antigenen häufig nicht zu einer ausreichenden Bildung von Antikörpern führt. Da Epitope unter bestimmten Voraussetzungen
20 und Bedingungen nur schwach immunogen sein können, kann eine entsprechende Immunantwort, wie beispielsweise die Bildung der Antikörper, gesteigert werden, wenn schwach immunogene Substanzen in ihrer Immunogenität erhöht werden. Neben den bekannten Aluminiumverbindungen, lipidhaltigen Verbindungen oder auch KLH und anderen ist es im Sinne der Erfindung möglich, die Immunantwort durch gemeinsame oder parallele Verabreichung
25 bestimmter Strukturen aus Mikroorganismen zu erhöhen. Der Wirkmechanismus dieser zusätzlich gegebenen, stark immunogenen Strukturen ist im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Lehre nicht relevant, entscheidend ist, dass es zu einer gewünschten Immunantwort kommt. Diese Immunantwort kann beispielsweise durch die Gabe der genannten immunogenen Teile von Mikroorganismen beispielsweise auch dadurch erfolgen, dass diese Strukturen
3 o zunächst eine so genannte innate Immunreaktion im Körper aktivieren und hierdurch im weiteren Verlauf die Induktion einer Antikörperantwort im Sinne von Fearon, 1997 ermöglichen. Eine gegebenenfalls erforderliche Inaktivierung der genannten mikrobiellen Immunogene kann durch chemische oder physikalische Behandlung erfolgen, beispielsweise durch eine Behandlung mit Formaldehyd, durch Hitzebehandlung, durch UV-Bestrahlung oder durch Ultraschallbehandlung. Selbstverständlich kann die immunogene Komponente auch von einem anderen Virus abgeleitet sein, bevorzugt ausgewählt aus der Familie der Hepadnaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Retroviridae, Togaviridae oder Flaviviridae; das Virus kann zum Beispiel ein HIV, Herpes Simplex Virus, Influenza Virus, Hepatitis-Virus sein. Die für die Peptide bereits dargestellten Modifikationen sind auch auf das pharmazeutische Mittel anwendbar.
Die immunogene Komponente kann in diesem Falle ein Protein dieser Viren oder ein Fragment - also ein Peptid - dieser sein. Es ist beispielsweise möglich, die immunogene Komponente in dem pharmazeutischen Mittel mit beiden erfindungsgemäßen Peptiden oder rekombinanten Proteinen, das heißt dem erfindungsgemäßen Konstrukt, zu kombinieren. Eine derartige Kombination im Sinne der Erfindung erfolgt bevorzugt durch eine kovalente Bindung. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass die immunogene Komponente und die erfindungsgemäßen Peptide zusammen an einen Träger adsorbiert werden, wobei dieser Träger beispielsweise ein Albumin, ein KLH oder ein anderer pharmazeutisch verträglicher Träger sein kann.
Die Erfindung umfasst demgemäß auch ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Konstruktes, welches aus den (a) erfindungsgemäßen Peptiden oder rekombinanten Proteinen bzw. (b) dem erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel und als (c) zusätzliche Immunogene verwendete Mikroorganismen, wie beispielsweise Bakterien oder Viren, besteht. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst die Schritte des Behandeins der erfindungsgemäßen Peptide und/oder der immunogenen mikrobiellen Strukturen mit einem für die kovalente Bindung geeigneten Aktivator, gegebenenfalls das Abtrennen von überschüssigem Aktivator, das Inkubieren der so erhaltenen Lösung und die Reinigung dieser. Als Aktivator für die kovalente Bindung können bevorzugt homo-, hetero-, bifunktionelle Cross-Linker verwendet werden wie zum Beispiel N-Hydroxysuccinimid-Ester, Imido-Ester, Maleinimido-Derivate, N-Hydroxysuccinimide, Pyridyl- disulfide oder Ketogruppen enthaltende Verbindungen. Die. Reinigung kann mittels Zentrifugation, Filtration, Fällung, Dialyse oder einem chromatographischen Verfahren erfolgen. Als chromatographische Verfahren sind die Gelfiltration, die affinitätschromatographische Reinigung oder die Ionenaustauscher-Chromatographie bevorzugt. Wenn die erfindungsgemäßen Peptide in dem pharmazeutischen Mittel mit einer immunogenen Mikroorganismuskomponente zusammen auf einem absorbierbaren Trägermaterial aufgebracht werden, kann es sich bei diesen Trägern um
Metalle, unlösliche oder kolloidale Metallverbindungen oder Polymerverbindungen und auch um Lipidvesikel handeln. Bei den Metallen sind Gold oder Platin oder Metalle wie Aluminium oder Eisen bevorzugt; bei den unlöslichen oder kolloidalen Metallverbindungen sind unter anderem Adjuvantien wie beispielsweise Aluminium-, Zink- und/oder Eisenhydroxid bevorzugt. Bei den Polymerverbindungen können alle resorbierbaren bzw. biologisch abbaubaren Materialien verwendet werden. Selbstverständlich ist es auch möglich, nicht abbaubare Polymerverbindungen zu verwenden, wenn diese physiologisch akzeptiert werden, wie zum Beispiel Latex. Neben den Mikroorganismen oder Teilen hiervon bzw. anderen Viren als Immunogen können selbstverständlich auch Nukleinsäuren verwendet werden, um eine Immunantwort auf die erfindungsgemäßen Peptide zu verstärken.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die pharmazeutischen Mittel auch Zytokine, insbesondere lnterleukin-2 und/oder CSF. Derartige Stoffe sind zur Wirkungsverstärkung, vorzugsweise zur Immunstimulation, verwendbar. Diese werden in bekannten Methoden mit den erfindungsgemäßen Peptiden oder dem pharmazeutischen Mittel gemischt und in einer geeigneten Formulierung und Dosierung verabreicht. Formulierung, Dosierung und geeignete Komponenten sind dem Fachmann bekannt.
Die Erfindung betrifft auch die Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1-104 insbesondere zur Verwendung in der Medizin. Diese Sequenzen stellen eine Auswahl aus bekannten größeren Aminosäuresequenzbereichen dar, wobei die Auswahl zu dem überraschenden Ergebnis der Induktion neutralisierender Antikörper führt, vor allem, wenn mindestens zwei der Aminosäuresequenzen zusammen eingesetzt werden. Insbesondere bevorzugt sind die Aminosäuresequenzen im Rahmen einer medizinischen Indikation, d. h. als therapeutisch zweckgebundene Aminosäuresequenzen. Selbstverständlich nicht beansprucht ist die bekannte Sequenz ELDKWA und andere in den genannten Referenzen offenbarte Sequenzen. Die Erfindung betrifft auch die neutralisierenden Antikörper, die mit dem erfindungsgemäßen immunogenen Konstrukt hergestellt werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Diagnose-Kit, der ein erfindungsgemäßes pharmazeutisches Mittel umfasst. Dieser Kit kann beispielsweise zur Diagnose und zum Monitoring des Verlaufs und/oder der Therapie von Viruserkrankungen eingesetzt werden, wobei folgende Viren bevorzugt ausgewählt sind:
BIV (Bovines Immundefizienzvirus) CAEV (Caprines Arthritis Enzephalitis Virus) EIAV1 (Equines infektiöses Anämievirus) FIV (Feiines Immundefizienzvirus) OMVV (Ovines Maedi-Visna Virus) SIVmac (Simianes Immundefizienzvirus aus Makaken) SIVcpz (Simianes Immundefizienzvirus aus Schimpansen) HIV-1 (Humanes Immundefizienzvirus Typ 1)
HIV-2 (Humanes Immundefizienzvirus Typ 2)
RSV (Rous Sarkom Virus)
ALV (Aviäres Leukosevirus) JSRV (Jaagsiekte Schaf Retrovirus)
SMRV (Squirrel Monkey Retrovirus)
SRV (Simianes Retrovirus)
GALV (Gibbonaffen Leukämievirus)
MuLV (Murines Leukämievirus) FeLV (Feiines Leukämievirus)
BLV (Bovines Leukämievirus)
HTLV-1 (Humanes T-Zell Leukämievirus Typ 1)
HTLV-2 (Humanes T-Zell Leukämievirus Typ 2)
SARS-Virus (Erreger des Schweren Akuten Respiratorischen Syndroms) HPV-1 (Humanes Parainfluenza Virus) und andere umhüllte Viren.
Der Diagnostik-Kit dient zum Nachweis antiviraler Antikörper gegen Epitope auf dem immunogenen Konstrukt, zum Nachweis neutralisierender Antikörper gegen das immunogene Konstrukt und/oder zum Nachweis des Virus.
Der Kit kann gegebenenfalls eine Anleitung oder Informationen zur pharmazeutischen Bereitstellung bzw. zu therapeutischen Behandlungsverfahren beinhalten. Die Information kann beispielsweise ein Beipackzettel sein oder ein anderes Medium, welches dem Anwender Informationen darüber gibt, mit welchem therapeutischen Verfahren bzw. mit welchem Impfschema die genannten Substanzen, das heißt insbesondere die erfindungsgemäßen Peptide bzw. das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel, insbesondere Vakzine, einzusetzen sind. Der Beipackzettel enthält insbesondere detaillierte und/oder wesentliche Informationen über das Heilverfahren. Selbstverständlich ist es nicht zwingend erforderlich, dass diese Information auf einem Beipackzettel formuliert ist, es ist auch möglich, dass diese Information beispielsweise über das Internet mitgeteilt wird.
Der Diagnose-Kit betrifft zum einen einen Immunoassay für den Nachweis von Antikörpern, die gegen die umhüllten Viren einschliesslich der Retroviren gerichtet sind, zum anderen einen Nachweis der Virusbelastung (Virusantigene) im Organismus. Dazu werden entsprechende Proben genommen, in denen Antikörper oder Virenantigene detektiert werden sollen. Eine Probe im Sinne der Erfindung ist die Bezeichnung für ein durch Probenentnahme entnommenes biologisches oder chemisches Gut oder eines Teiles bzw. einer kleinen Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden soll, insbesondere auf das Vorhandensein von neutralisierenden Antikörpern.
Die Probenentnahme erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Selbstverständlich kann es auch bevorzugt sein, dass die entnommene Teilmenge nicht dem Durchschnitt einer größeren Menge entsprechen soll. Die durch Untersuchung der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch die Probe erfassten Menge, die Rückschlüsse auf die Gesamtmenge, beispielsweise das Blut in einem Organismus bzw. die Lymphe, zulässt. Für die Untersuchung können die Proben durch Mischen, Zugabe von Enzymen oder Markern bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung von Proben bekannt. Eine Probe können insbesondere alle biologischen Materialien sein, wie biologische Gewebe und Flüssigkeiten, zum Beispiel Blut, Lymphe, Urin, Gehirnflüssigkeit und andere. Wie hier verwendet, bezieht sich eine Probe demgemäß auf jede Substanz, die neutralisierende Antikörper enthält oder vermutlich enthält, und umfasst eine Probe von Gewebe oder Flüssigkeit, die von einem Individuum oder Individuen isoliert worden ist, einschließlich, aber nicht beschränkt auf zum Beispiel Haut, Plasma, Serum, Lymphe, Urin, Tränen, Abstriche, Gewebeproben, Organe, Tumoren und auch auf Proben von Bestandteilen von Zellkulturen. Eine solche Probe kann zum Beispiel wie folgt auf das Vorhandensein von bindenden Antikörpern untersucht werden: a) Beschichten einer festen Phase mit dem erfindungsgemäßen immunogenen Konstrukt, b) Inkubieren der festen Phase mit der biologischen Probe, c) Inkubieren der festen Phase mit einem anti-humanen Antikörper, der die Klassen IgA, IgM, IgG nachweisen kann, der mit einer nachweisbaren Kennzeichnung markiert ist und d) Nachweis der Kennzeichnung, um die Anwesenheit der bindenden Antikörper gegen die genannten Viren in der Probe zu bestimmen.
Die Probe kann verschiedene Konzentration von Harnstoff aber auch keinen Harnstoff aufweisen (Aviditätsbestimmung). Da neutralisierende Antikörper auf diese Art nur schwer und nicht quantitativ nachgewiesen werden können, erfolgt deren Nachweis in einem Infektionsassay, in dem die Hemmung der Infektion von unifizierten Zellen durch das jeweilige Virus aus der obigen Liste durch die neutralisierenden Antikörper nachgewiesen wird.
Durch Kompetitionsanalysen mit dem immunogenen Konstrukt kann aus der Menge der neutralisierende Antikörper der Anteil der spezifisch gegen die Epitope auf dem immunogenen Konstrukt quantitativ bestimmt werden. Da eine Korrelation zwischen der Menge der im obigen Text gefundenen, das immunogene Konstrukt bindenden Antikörper, und der Menge der neutralisierenden Antikörper gefunden wurde, kann ein neuer Schnelltest durchgeführt werden, in dem erstmals in kurzer Zeit viele Seren auf neutralisierende Antikörper getestet werden können. Dieser Test erlaubt Aussagen über den Erfolg der Immunisierung im Fall einer prophylaktischen Applikation wie auch über die Progression der Infektion. Auch ein Monitoring des Therapieerfolges im Fall der therapeutischen Applikation ist möglich. Demgemäß kann auch ein Kit zum Nachweis von neutralisierenden Antikörpern gegen das immunogene Konstrukt auf der Basis eines Neutralisationsassays mit entsprechenden Kompetitionsanalysen und ein neuartiges Schnell-Verfahren zum Nachweis neutralisierender Antikörper auf der Basis eines ELISAs mit dem vollständigen immunogenen Konstrukt bereitgestellt werden.
Der Diagnose-Kit umfasst auch den Nachweis von viralem Antigen zur Bestimmung der Viruslast in den oben aufgelisteten Proben wie folgt: a) Beschichten einer festen Phase mit Antikörpern gegen die gesuchten viralen Antigene, die in einem Tier oder einem Menschen nach Immunisierung mit dem erfindungs- gemäßen immunogenen Konstrukt gewonnen wurden, b) Inkubieren der festen Phase mit der biologischen Probe, c) Inkubieren der festen Phase mit einem zweiten, unterschiedlichen vom ersten, Antikörper gegen die gesuchten viralen Antigene, der ebenfalls in einem Tier oder einem Menschen nach Immunisierung mit dem erfindungsgemäßen immunogenen Konstrukt gewonnen wurden, d) Nachweis des gekoppelten zweiten Antikörpers um so die Menge des gebundenen Antigens zu bestimmen. Die Erfindung betrifft auch eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Sequenzen SEQ ID No 1 bis 104 zur Verwendung auf dem Gebiet der therapeutischen Behandlung sowie der Diagnostizierverfahren am menschlichen oder tierischen Körper. 5 Die Erfindung betrifft demgemäß Peptide, Peptidfragmente, rekombinante Proteine bzw. deren Fragmente, die membranassoziierten Proteinen von bestimmten Viren für bestimmte therapeutische bzw. diagnostische Anwendungen. Bevorzugt ist die Verwendung einer Mischung aus mindestens zwei Peptiden oder rekombinanten Proteinen aus der Sequenzabfolge eines o viralen Hüllproteins gemäß der erfindungsgemäß beschriebenen Auswahl.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Induktion einer Antikörperantwort, wobei das erfindungsgemäße immunogene Konstrukt und/oder das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel mit einem Organismus, bevorzugt einem Menschen oder einem Tier, in Kontakt gebracht5 werden. Bevorzugt umfasst dieses Verfahren die Formulierung des neutralisierenden Antikörpers mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger. Durch die Offenbarung der erfindungsgemäßen Peptide ist es dem Fachmann möglich, diese als Antigen zur Induktion von neutralisierenden Antikörpern zu verwenden. Dem Fachmann ist hierbei bekannt, dass er die erfindungsgemäßen Peptide, die selbstverständlich auch als das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel 0 verwendet werden können, in verschiedenen Dosierungen einem Organismus, insbesondere einem humanen Patienten, applizieren kann. Die Applikation sollte hierbei so erfolgen, dass eine möglichst große Menge neutralisierender Antikörper generiert wird. Die Konzentration und die Art der Applikation kann vom Fachmann durch Routineversuche eruiert werden. Möglich sind folgende Applikationen: oral in Form von Pulver, Tabletten, Saft, Tropfen, Kapseln und5 ähnlichem; rektal in Form von Zäpfchen, Lösungen und ähnlichem; parentral in Form von Injektionen, Infusionen von Lösungen, Inhalationen von Dämpfen, Aerosolen, Stäuben und Pflastern sowie lokal in Form von Salben, Pflastern, Umschlägen, Spülungen und ähnlichem.
Bevorzugt kann das In-Kontakt-Bringen des immunogenen Konstruktes und/oder des o pharmazeutischen Mittels prophylaktisch oder therapeutisch erfolgen. Bei einer prophylaktischen Impfung soll die Infektion mit den genannten Viren zumindest dergestalt verhindert werden, dass nach Eindringen einzelner Viren, beispielsweise in eine Wunde, eine weitere Vermehrung dieser stark vermindert wird oder dass eingedrungene Viren nahezu vollständig abgetötet werden. Bei einer therapeutischen Induktion einer Immunantwort liegt bereits eine Infektion des Patienten vor und die Induktion der neutralisierenden Antikörper erfolgt, um die bereits im Körper befindlichen Viren abzutöten bzw. in ihrer Vermehrung zu hemmen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Generierung eines Antikörpers, bevorzugt eines neutralisierenden Antikörpers gegen eine Erkrankung mit umhüllten Viren einschliesslich der Retroviren, wobei ein Organismus mit einem immunogenen Konstrukt, gegebenenfalls zusammen mit einer immunogenen Komponente und/oder einem pharmazeutischen Mittel gemäß der Erfindung in Kontakt gebracht wird und so eine humorale Immunantwort durch Bildung von Antikörpern induziert wird und folgend die Antikörper aus dem Organismus gewonnen werden. Bevorzugt können die so gewonnenen neutralisierenden Antikörper zur passiven Immunisierung verwendet werden.
Dabei können auch monoklonale Antikörper gewonnen werden, die u. a. nach entsprechender Humanisierung eingesetzt werden. Dabei können auch Antikörper-produzierende Zellen aus geimpften bzw. infizierten Individuen gewonnen werden, die neutralisierende Antikörper produzieren, die gegen das erfindungsgemäße immunoge Konstrukt gerichtet sind, und in Form monoklonaler Antikörper bei der passiven Immunisierung appliziert werden.
Bei der passiven Immunisierung erfolgt im Körper des Patienten keine eigene Immunreaktion bzw. im Wesentlichen keine eigene Immunreaktion auf bestimmte Viren, sondern die Antikörper werden beispielsweise in Form von Heilseren in den Patienten eingebracht. Passive Immunisierung hat im Gegensatz zur aktiven Immunisierung im Wesentlichen die Aufgabe, eine bereits erfolgte Infektion möglichst schnell zu heilen oder aber sofort gegen eine Infektion mit Viren zu schützen. Dem Fachmann sind beispielsweise aus der passiven Immunisierung gegen Hepatitis A, Hepatitis B und der FSME verschiedene Impfschemata zur passiven Immunisierung bekannt. Derartige Impfschemata können durch Routineversuche auf spezifische Viren wie zum Beispiel HIV, den Katzenleukämievirus und andere adaptiert werden. Die Antikörper, die zur passiven Immunisierung verwendet werden, können bevorzugt monoklonale Antikörper sein.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfindungsgemäßen immunogenen Komponenten bzw. das erfindungsgemäße pharmazeutische Mittel oder der erfindungsgemäße Kit zur Diagnose, Prophylaxe, Therapie, Verlaufskontrolle und/oder Nachbehandlung von retroviralen Erkrankungen verwendet. Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
5 Beispiel
1. Material und Methoden
1.1 Klonierunq0 Die rekombinanten gp41 Konstrukte wurden auf Basis des HIV-1 Molekularklons pNL4-3 (NIH, #114) generiert. Mit spezifischen Primern (Sigma ARK) wurde der codierende Bereich für die Ectodomäne mittels PCR amplifiziert. Die codierenden Bereiche der Hybridkonstrukte (im Folgenden Hybrid I und II genannt), bestehend aus einem PERV-p15E-Ectodomänen-Rückgrat5 mit eingesetzten HIV-Epitopen, wurden mit Hilfe einer zweistufigen Mutagenese-PCR generiert (27). Der codierende Bereich für Hybridll basiert auf dem von Hybridl, er wurde lediglich auf beiden Seiten durch HIV-Sequenzen erweitert. Die codierenden Bereiche für Konstrukte, die aus den Epitopen E1 und E2 von gp41 (im Folgenden Loop I genannt) von HIV-1 bestehen und durch eine kurze Peptidbrücke verbunden sind, wurden durch Hybridisierung von 80mer o Oligonucleotiden (Sigma-ARK) und eine Auffüllreaktion mittels PCR generiert. Über eine BamHI- Schnittstelle am 5'Ende und eine Xhol-Schnittstelle am 3Εnde des codierenden Stranges wurde das PCR-Produkt in die Multiple Cloning Site des Expressionsvektors pCal-n (Stratagene) ligiert. Chemokompetente, codonoptimierte E.coli BL21 DE3 (Stratagene) wurden mit diesen Konstrukten transformiert.5 DNA von felinen embryonalen Fibroblasten FEA, die FeLV-A produzieren, wurde mit einem Qiagen DNA Isolation Kit isoliert. Mit den spezifischen Primern wurde eine Sequenz, die der Ektodomäne von p15E entspricht, mittels PCR amplifiziert, dann im pCal-n Vector kloniert und in E. coli BL21 DE3 exprimiert. Das rekombinante p15E, N-terminal an das 4 kDa Calmodulin- Bindingsprotein (CBP) gekoppet, wurde mittels Affinitätschromatographie gereinigt.0 Rekombinante CBP-Fusionsproteine rgp41 : MGCTSMTLTVQARQLLSDIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLG IWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ5 ELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK Hybrid I (HIV-Sequenzen unterstrichen):
LITQARQLLSDIVQQQRIVTEDLQALEKSVSNLEESLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKKEGLCVALKE
ECCFYVDHSGAIRDSMSKLRERLERRRREELDKWASLWNWFN
Hybrid II (HIV-Sequenzen unterstrichen):
LITGASVTLTVQARQLLSDIVQQQRIVTEDLQALEKSVSNLEESLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKKE
GLCVALKEECCFYVDHSGAIRDSMSKLRERLERRRREELDKWASLWNWFNITNWLWY
Loop I: (HIV-Sequenzen unterstrichen):
LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSSSPSSNEQELLELDKWASLWNWFDITNWL
Ektodomäne von p15E von FeLV (Aminosäure 476-583):
LETAQFRQLQMAMHTDIQALEESISALEKSLTSLSEVVLQNRRGLDILFLQEGGLCAALKEECCFY ADHTGLVRDNMAKLRERLKQRQQLFDSQQGWFEGWFNKSPW
Primer: rgp41 BamHI fw: cgc gga tcc atg ggc tgc acg tca atg acg ctg
rgp41 Xhol rev: cac ccg ata ctc gag ata cca cag cca att tgt tat g
Hybrid I BamHI fw: cgc cca tcc cta atc aca caa gcg aga cag ctg
Hybrid I Xhol rev: cac ccg ata ctc gag tca gtt gaa cca gtt cca aag
Hybrid I E1 mut fw: caa gcg aga cag ctg agt gat att gtt cag caa caa cga att gta acg gaa gat ctc caa gcc c
Hybrid I E1 mut rev: ttg ttg ctg aac aat atc act cag cag ctg tct cgc ttg tgt gat tag gga tcc acg egg
Hybrid I E2mut fw: gaa ctg gat aag tgg gcg tcg ctt tgg aac tgg ttc aac tga gaa ttc aga ctc cag ggg tcg act cga gc
Hybrid I E2mut rev: gtt cca aag cca cgc cca ctt atc cag ttc ttc cet tcg acg cet ctc taa cet ttc tc Hybrid II BamHI fw: cg gga tcc gga gca tca gta acg ctg acg gta cag egg aga caa ta ttg tgt gat ata 9
Hybrid II Xhol rev: cg ctc gag cta ata cca cag cca att tct tat gtt aaa cca att cca caa act tgc cca tt 5 Loop I BamHI fw: ggg gat cec agc ca ttg gag atg tcg aac cagttc cac aa gaa gec cat ttg tcc agt tcc agc agt tcc tgt tcg tta gaa gac gga gaa gaa gac a
Loop I Xhol rev: ccg gat cec tgg gtg ctg ctg gtt cta cca tgg gtg ctg ctt ctg tta cec tga ccg ttc agg ctc l o gtc tgc tgc tgt ctt ctt ctc cgt ctt cta acg a
P15E FeLV fw:gcg gat cec ttg aaa cag cec agt tca gac aa p15E FeLV rev:cgg aat tcc cag ggg gac ttg ttg aac cat cc
15 1.2 Expression der rekombinanten Proteine
Zur Expression wurde 1 1 37 °C warmes LB-Amp (LB-Medium mit 100μg/ml Ampicillin) mit 1 ml Vorkultur angeimpft und bei 37 °C und 225rpm inkubiert. Bei einer optischen Dichte (ODβoo) von
2 o 0,5 wurden die Expressionskulturen durch Zugabe von 1 mM (Endkonzentration) IPTG (Sigma) für 4 h induziert (37 °C und 225rpm).
1 ,3 Aufreinigung der rekombinanten Proteine
25 Die Aufreinigung erfolgte nach dem Protokoll der Firma Stratagene für die CBP-fusionierten Proteine. Die Reinheit der rekombinanten Proteine wurde mittels SDS-PAGE und Western Blot Analyse unter Verwendung des monoklonalen gp41 -spezifischen Antikörpers 2F5 bzw. eines Serums gegen p15E von FeLV überprüft.
30 1.4 Synthetische Peptide und Biokonjugate
Synthetische Peptide, die den Sequenzen der Epitope E1 und E2 von HIV entsprechen (E1 (LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS) und E2 (NEQELLELDKWASLWNWFDIT NWL), wurden von der Firma Jerini hergestellt und mittels HPLC gereinigt. E1 und E2 wurden als freies Antigen
35 (in Kombination oder einzeln) oder an Dextran (MW 6 KDa, Sigma) eingesetzt. Die Herstellung von Dextran-Peptid-Konjugaten erfolgte entweder über die direkte Bindung, der im aktiviertem Dextran enthaltenen Carboxylgruppen, an primäre Aminogruppen der Peptide (28) oder über einen heterobifunktionalen Crosslinker (3-(2-Pyridyldithio)-Propionyl-Hydrazid, PDPH, Pierce), der eine zielgerichtete Kopplung über die am C- bzw. N-terminalen Ende der Peptide angefügten Cysteine ermöglicht (29), überlappende synthetische Peptide, die dem gesamten Env (gp120 und gp41) von HIV entsprechen, wurden von NIH, USA (HIV-Env-Peptidset abgeleitet vom HIV-1 Isolat MN, Cat#6451) erhalten. Überlappende und immobilisierte Peptide, die dem gp41 bzw. dem p15E von FeLV netsprechen, wurden von Jerine hergestellt.
1.5 Immunisierung von Ratten, Ziegen und Mäusen
Wistar Ratten (BfR, weiblich 54-58 Tage alt), Ziegen, Balb/c-Mäuse (weiblich, 10-20 g) wurden mit 500μg-1mg Protein, Peptid oder Peptidkonjugat in 800μl PBS/Freund's inkompletten Aduvant-Gemisch (1 :1) immunisiert, 200μl davon wurden i.m. in jeden Hinterlauf und 400μl s.c. im Nacken appliziert. Jeweils drei Tiere wurden mit demselben Antigen immunisiert. Die Tiere wurden nach 4 Wochen mit dem gleichen Injektionsschema und den gleichen Antigenen geboostert.
1.6 Serumgewinnung
Die Blutabnahme der Ratten und Mäuse erfolgte mittels retrobulbärer Punktion, das der Ziegen aus der Halsvene, Das Blut wurde nach 20 h Lagerung bei 4 °C durch Zentrifugation in Serum und zelluläre Bestandteile getrennt. Die im Serum enthaltenen Komplementfaktoren wurden durch 30 min Inkubation bei 56 °C inaktiviert. Das Serum wurde bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
1.7 Epitopmapping
Das Epitopmapping erfolgte auf einer Pepspot-Membran (Jerini, Berlin), auf der um 11 Aminosäuren überlappende Peptide, die der Sequenz von gp41 und p15E von FeLV entsprechen, punktweise aufgetragen waren, nach Angaben des Herstellers. 1.8 ELISA
Zur Bestimmung der Veränderung der Avidität des mAb 2F5 wurden 50-100 ng Peptide des N- terminalen Bereichs der Ectodomäne von gp41 aus einem überlappend angeordneten HIV-Env- Peptidset jeweils in Kombination mit Dp 178 oder Peptid P6373 auf Probind ELISA-Platten aufgebracht (NUNC). Der mAb 2F5 wurde in einer Verdünnung von 1 :25000 in Anwesenheit von 0-8M Harnstoff 2 h bei 37 °C inkubiert. Die Detektion erfolgte mittels eines polyklonalen Ziege- anti-Human-Serums (1 :2000) konjugiert an Meerettich-Peroxidase (Sigma). Gemessen wurde bei einer OD 92/56o. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen.
1.9 Neutralisierungsassay
Um die Seren auf HlV-neutralisierende Wirkung zu testen, wurden 5x104 C8166-Zellen (humane T-Zelllinie) in 100 μl RPMI-Medium auf 96well-Rundbodenplatten ausgesät. Dazu wurden 50 μl HIV-IIIB-Stock (entspricht einer TCID50 von 2 x 103) und 50 μl 1 :4 mit Medium vorverdünntes Rattenserum gegeben. Die Platten wurden für 65 h bei 37 °C, 95 % Luftfeuchte und 5 % CO2 inkubiert.
Der Medium-Überstand wurde entfernt und die Zellen wurden durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen aufgebrochen. Durch Zugabe von Proteinase K (Invitrogen) in 100 μl IxPCR-Puffer (Röche) und 3 h Inkubation bei 56 °C wurden störende Proteine von der genomischen DNA entfernt. Die Proteinase K wurde durch 30 min Inkubation bei 95 °C inaktiviert.
Auf Basis des Zelllysats wurde mit HlV-env-spezifischen Primern und einer env-spezifischen, Dabcyl-markierten Sonde (TIB MOLBIOL, Berlin) und PCR-Mastermix (Stratagene) eine Realtime-PCR durchgeführt. Die lineare serumspezifische Hemmung wurde über die Formel 2Δct ermittelt, wobei Δct die Differenz aus ct(lmmunserum) und ct(Praeimmunserum) ist. Diese linearisierten Werte wurden dann in eine prozentuale Hemmung umgerechnet. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen. Ein Virusstock des FeLV-A (Glasgow strain) wurde auf uninfizierten FEA-Zellen titriert, der Titer betrug 104-76 TCIDso/ml. Für den Neutralisationstest wurden 6000 FEA-Zellen per well einer 96- well Microtiter-Platte ausgesät. Präimmunes and Immunsera wurden bei 56°C für 30 min hitzinaktiviert. 50μl Virus wurden zu 1 :2 Verdünnungen des Serums or gereinigtem Immunoglobulin gegeben, bei 37°C für 30 min inkubiert und zu den Zellen addiert. Alternativ wurde die Serumkonzentration konstant bei 1 :5 gehalten, und das Virus wurde verdünnt. Nach 3 Tagen wurden die Zellen aufgebrochen und lysiert (20 mg/ml Proteinase K in PCR buffer, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2, 10 mM Tris-HCL, pH 8.4). Die Zellen wurden bei 56°C für 3h inkubiert, danach noch 10 min bei 95°C um die Aktivität der Proteinase K zu inhibieren. Die Provirusintegration wurde mittels PCR quantitativ erfasst.
2. Ergebnisse
2.1 Epitopmapping des HIV-1 neutralisierenden monoklonalen Antikörpers 2F5
Der humane, monoklonale Antikörper (mAb) 2F5 weist ein breites Neutralisationsspektrum gegenüber Laborstämmen und verschiedenen Primärisolaten auf. Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass der Antikörper an eine lineare Sequenz (ELDKWA) innerhalb der Ectodomäne des transmembranen Hüllproteins gp41 von HIV-1 bindet. Diese Sequenz ist wenige Aminosäuren N-terminal des Transmembrandurchgangs lokalisiert. Mit Hilfe eines Epitopmappingverfahrens, basierend auf einer Pepspot Membran konnte diese Sequenz als Bindungsstelle für 2F5 bestätigt werden (Abb.3).
2.2 Bindung des monoklonalen Antikörpers 2F5 an Dpi 78 und CBP-rgp41
In Western Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass der mAb 2F5 besser an die gesamte Ectodomäne von gp41 bindet als an das 34mer Peptid (Dp178), das das in der Literatur beschriebenen Epitop ELDKWA beinhaltet (Abb.4).
2,3 ELISA mit 2F5 auf überlappenden Peptiden der Ectodomäne von gp41 in Kombination mit
Dpi 78
Um festzustellen, ob das vollständige Epitop von 2F5 einen weiteren Anteil im Bereich der Ectodomäne von gp41 besitzt, wurden überlappende 15mere, die die gesamte Ectodomäne ab- decken, in Kombination mit Dp178 auf ELISA-Platten aufgebracht. 2F5 wurde auf diesen
Peptidkombinationen in verschiedenen Konzentrationen Harnstoff inkubiert (Abb. 5). Nur das Peptid P6342 bewirkt eine synergistische Steigerung der Bindung von 2F5 an Dpi 78. Die Verstärkung der Bindung bei hohen Konzentration von Harnstoff bei gleichzeitiger Applikation beider Domänen des erfindungsgemäßen immunogenen Konstruktes ist die Grundlage für einen Schelltest zum- Nachweis neutralisierender Antikörper mit Hilfe eine ELISAs. 2.4 Bindung von 2F5 an P6373 und verschiedene vom Peptid 6342 abgeleitete Peptide mit Aminosäureaustaυschen
Um zur testen, inwieweit Aminosäureaustausche im Peptid P6342 die gesteigerte Bindung von 5 2F5 an die Sequenz ELDKWA beeinflussen, wurde das Peptid P6373 (NEQELLEJJDKWASLW) mit abgewandelten Peptiden (P6342 mut 1-5) auf ELISA-Platten aufgebracht und bei einer Konzentration von 3M Harnstoff mit 2F5 inkubiert. Abb. 6 zeigt die Auswertung des ELISA nach Abzug der Absorption von 2F5 an P6373 allein. Dabei zeigte sich, dass Aminosäureaustausche in mindestens 4 Positionen des Peptids P6342 die Bindung des monoklonalen Antikörpers 2F50 verringern.
2.5 Stöchiometrie der Peptide P6342 und P6373 bei der Bindung des mAb 2F5
Um zu überprüfen, unter welchen stöchiometrischen Verhältnissen die gesteigerte Bindung von5 2F5 an das Peptid P6373 und P6342 beeinflusst wird, wurden unterschiedliche stöchiometrische Verhältnisse von P6342 und P6373 im ELISA aufgebracht und mit 2F5 unter steigenden Harnstoffkonzentrationen inkubiert (Abb.7).
Dabei wurde gezeigt, dass ein 2 : 1 Verhältnis von P6342 zu P6373 eine deutlich gesteigerte o Bindung von 2F5 an ELDKWA bewirkt als ein Verhältnis von 1 : 1 , was impliziert, dass ELDKWA durch zwei P6342 Peptide besser stabilisiert wird als durch eins.
2.6 Hemmung der 2F5-vermittelten Virusneutralisation durch die Peptide E1 und E2 5 Im Neutralisierungsassay hemmt die Kombination aus E1 und E2 (auf 25mere verlängerte Versionen von P6342 und P6373) die virusneutralisierende Wirkung von 2F5 besser als E2 alleine (Abb.8A).
Darüber hinaus zeigt auch ein stöchiometrisches Verhältnis von 2 : 1 (E1/E2) eine stärkere o Hemmung der neutralisierenden Aktivität von 2F5 als ein Verhältnis von 1 : 1, ähnlich wie im ELISA (Abb.δB).
Diese Daten untermauern die EUSA-Experimente, in denen gezeigt wurde, dass die von 2F5 erkannte Sequenz ELDKWA durch zwei N-terminale Sequenzen der Ectodomäne von gp41 besser stabilisiert wird als nur durch eine und zeigt, dass diese Konformation auch wichtig ist für die Hemmung der Neutralisation.
2.7 Immunisierungsversuche mit rekombinanten Antigenen und synthetischen Peptiden
2.7.1 Gewinnung und Charakterisierung von rekombinantem gp41
Die auf der Basis des NIH-HIV-Molekularklons pNL4-3 mit den spezifischen Primern 1 und 2 in der PCR amplifizierte Sequenz von gp41 wurde über die Restriktionsschnittstellen von BamHI und Xhol in den über die gleichen Restriktionsenzyme geöffneten Vektor pCal-n (Stratagene) ligiert. Der geschlossene Vektor (pCal-n rgp41) wurde in BL21 Codon Plus (Stratagene) transformiert und dort IPTG abhängig exprimiert. Die Aminosäuresequenz des produzierten Fusionsproteins ist unter Abschnitt 2.1 aufgelistet. Es gelang, diese Sequenz als rekombinantes Fusionsprotein zu exprimieren. Allerdings war das Fusionsprotein nicht löslich und wurde deshalb als Aggregat nach 8M Harnstoffpräzipitation zur Entfernung der löslichen bakteriellen Proteine verwendet.
2.7.2 Gewinnung und Charakterisierung von rekombinanten Hybridkonstrukten bestehend aus einem PERV-Transmembranprotein-Rückgrat mit eingesetzten HIV-Epitopen
Ausgehend vom Vektor pCal-n rp15E, der die Sequenz der Ectodomaine des transmembranen Hüllproteins p15E des porcinen endogene Retrovirus PERV-A enthält (26), wurden mit spezifischen Primern Sequenzen von gp41 von HIV-1 in die PERV-p15E Sequenz eingefügt und dadurch die entsprechenden Domänen von p15E elinimiert (Substitution). Dazu wurden zwei verschiedene Sequenzen von gp41 eingefügt, am N-terminalen Ende und am C-terminalen Ende. Außerdem wurden die jeweilige Substitute in zwei verschiedenen Längen verwendet (Hybrid I und Hybrid II). Die entstandenen PCR-Produkte wurden über die Restriktionsschnittstellen von BamHI und Xhol in den über die gleichen Restriktionsenzyme geöffneten Vektor pCal-n (Stratagene) ligiert. Der geschlossene Vektor (pCal-n rgp41) wurde in BL21 Codon Plus (Stratagene) transformiert und dort IPTG abhängig exprimiert. Die Aminosäuresequenz der viralen Anteile (p15E und gp41) der produzierten Fusionsproteine Hybrid I und II sind in Abschnitt 2.1 aufgelistet. Auch diese Fusionsproteine waren nicht löslich und wurden deshalb als Aggregat nach 8M Harnstoffpräzipitation zur Entfernung der löslichen bakteriellen Proteine verwendet. 2.7.3 Gewinnung und Charakterisierung von rekombinanten E1-E2 Konstrukten verbunden über eine Peptidbrücke
Durch Hybridisierung von Oligonucleotiden mit anschließender PCR-Auffüllreaktion wurden die codierenden Sequenzen für das Peptid E1 und E2 verbunden durch den codierenden Bereich für eine fünf Aminosäuren lange Peptidbrücke hergestellt. Das entstandene PCR-Produkt wurde über die Restriktionsschnittstellen von BamHI und Xhol in den über die gleichen Restriktionsenzyme geöffneten Vektor pCal-n (Stratagene) ligiert. Der geschlossene Vektor (pCal-n rgp41) wurde in BL21 Codon Plus (Stratagene) transformiert und dort IPTG abhängig exprimiert. Die Aminosäuresequenz des produzierten Fusionsproteins Loop 1 ist in Abschnitt 2.1 aufgelistet. Auch diese Fusionsproteine waren nicht löslich und wurden deshalb als Aggregat nach 8M Harnstoffpräzipitation zur Entfernung der löslichen bakteriellen Proteine verwendet.
2.7.4 Immunisierung von Ratten und Analyse der Immunseren
Ratten in Gruppen von mindestens je drei Tieren wurden mit den gereinigten rekombinanten Proteinen, aber auch mit den synthetischen Peptiden, die den Domänen E1 und E2 des gp41 von HIV-1 entsprechen, immunisiert und geboostert, wie in Material und Methoden beschrieben. Die Immunseren wurden im Western blot und im ELISA auf bindende Antikörper gegen gp41 untersucht. Die Seren wurden weiterhin im Neutralisationsassay auf neutralisierende Antikörper untersucht.
Um die Rattenseren auf virusneutralisierenden Eigenschaften zu testen, wurden 5x104 C8166 mit
2x103 TCID50 HIVIIIB in Anwesenheit der Rattenseren infiziert. Abb. 9 zeigt die prozentuale Hemmung der Virusinfektion umgerechnet aus dem Δct der hemmenden Wirkung von
Praeimmun- und Boostserum. Als Positivkontrolle wurde die Infektion bei 2,5μg/ml 2F5 durchgeführt.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tab. 1 zusammengefasst. Obwohl alle Seren im ELISA und Western blot mit gp41 reagierten, waren nur Seren von einigen Tieren, die entweder beide Peptide E1 und E1 in Kombination (Tiere Q2-4), nicht aber einzeln (Tiere), von Tieren, die die Peptide in Kombination (E1 und E2) an Dextran 6000 direkt gekoppelt (Tiere R1 , R2), von Tieren, die die Peptide in Kombination (E1 und E2) an Dextran 6000 mittels eines Linkers gekoppelt (Tiere S1-3) und von Tieren, die das Hybrid I und das Hybrid II (p15E von PERV mit substituierten E1 und E2 Domänen unterschiedlicher Länge) (Q4, P2-4, Q1 und U2-3) appliziert bekamen, virusneutralisierend.
Besonders die Ratten 04 und P4, beide immunisiert mit Hybrid II, und Q3 und S3, immunisiert mit E1 und E2 Peptiden (frei oder an Dextran gebunden), zeigen bei einer Verdünnung von 1 :16 ähnlich gute neutralisierende Eigenschaften wie 2,5 μg/ml mAb 2F5.
Das rekombinante gP41 , das eigentlich als Antigen für die Immunisierung nicht geeignet ist, da es unlöslich vorliegt, war nicht in der Lage, neutralisierende Antikörper hervorzurufen (Gruppe N).
Diese Ergebnisse zeigen, im Falle von HIV auf unlängst erhobene Befunde, die zeigten, dass nach der Immunisierung der rekombinanten Ectodomäne von p15E von PERV (30) neutralisierende Antikörper induziert werden konnten, nicht zurückgegriffen werden kann. Das entsprechende Antigen war zum einen nicht löslich, zum anderen induzierte es, selbst als unlösliches Aggregat für die Immunisierung verwendet, keine neutralisierenden Antikörper. Die Unfähigkeit neutralisierende Antikörper zu induzieren, kann nicht nur auf die Unlöslichkeit zurückgeführt werden, da in einer parallelen Studie, in der durch entsprechende Fusionsproteine eine Löslichkeit induziert wurde, auch keine neutralisierenden Antikörper hervorgerufen wurden (Daten nicht gezeigt). Hinzu kommt, dass das Hybrid II (p15E von PERV mit substituierten E1 und E2 Domänen der längeren Variante) auch nicht löslich war, aber neutralisierende Antikörper hervorrief.
Tabelle 1:
Figure imgf000050_0001
ERSAEBβßffZlBI(Aff{EEBBδEL 26) Legenden:
Abb. 1 Raumstruktur von gp41 mit dem darüber liegenden gp120 (Zwick et al. 2001 (5)).
Abb. 2 A) Schema der Ectodomäne von gp41 : Vereinfachte Darstellung von monomerem gp41. Hervorgehoben sind das Fusionpeptid am N-Terminus, die N-terminale Helix-Region (NHR), der Cystein-Cystein-Loop, die C-terminale Helix-Region (CHR) und der Transmembran- durchgang.
B) Hexamer gp41 : Dargestellt sind die NHR und CHR in der Aufsicht. Drei N-Helices sind als Trimer bestehend aus drei parallelen α-Helices mit drei außen liegenden antiparallel angeordneten C-Helices. Die wechselwirkenden Aminosäuren zwischen den Helices sind eingetragen.
C) Klappmechanismus von gp41 bei der Infektion. Gp210 gibt nach der Bindung von CD4 und Korezeptor (CCR5/CXCR4) das darunter liegende gp41 frei. Dieses dringt mit dem Fusions- peptid in die Wirtszellmembran ein. Durch hydrophobe Wechselwirkung klappen die NHR und die CHR zusammen und ziehen dabei die Wirtszellmembran und die Virusmembran zueinander, was zur Fusion beider Membranen führt.
Abb. 3 Epitopmapping für den mAb 2F5 mittels Pepspot Membran: 13mere Peptide wurden über einen Acetyl-Linker an eine Nitrozellulosemembran kovalent gebunden. Von Spot zu Spot überlappen diese Peptide um 11 Aminosäuren und decken dabei die gesamte Sequenz des gp41 ab. Der mAb 2F5 wurde in einer Konzentration von 250 ng/ml eingesetzt. Das Sekundär- antikörperkonjugat (anti-human-POD) wurde 1 :5000 einge-setzt. Das Epitop in der Sequenz von gp41 ist unterstrichen.
Abb. 4 SDS-PAGE (A) und Western Blot (B) von Dp178 (Spur 1) und rekombinant exprimiertem CBP-rgp41 (Spur 2): Obwohl mehr Dpi 78, das der C-Helix der Ectodomäne des gp41 entspricht, aufgetragen wurde, wird es schlechter im Western Blot detektiert als das rekombinante CBP-rgp41 , das die gesamte Ectodomäne des gp41 beinhaltet. 2F5 wurde im Western Blot in einer Konzentration von 500ng/ml eingesetzt. Abb. 5 ELISA-Untersuchungen zur Bindung des mAb 2F5 mit Dpi 78 in Kombination mit überlappenden Peptiden der Ectodomäne von gp41: Das NIH Peptidset besteht aus 15meren Peptiden, die jeweils um 11 Aminosäuren überlappen und die die gesamte Proteinsequenz des Hüllproteinkomplexes umfassen. Es wurden alle Peptide in Kombination mit Dpi 78 getestet, hier sind nur die Ergebnisse für 10 Peptide aus dem N-terminalen Bereich der Ectodomäne von gp41 gezeigt. (A) Das Peptid P6342, aber nicht alle anderen, steigert die Bindung von 2F5 an Dpi 78. Die Steigerung der 2F5 Bindung erfolgt synergistisch, da der mAb 2F5 das P6342 alleine nicht erkennt, und ist auch noch bei 3M und 5M Harnstoff zu erkennen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte aus Triplikaten. (B) Sequenz der eingesetzten Peptide. DP107 entspricht der N-Helix der Ectodomäne von gp41 und wurde als Kontrolle mitgeführt.
Abb. 6 Einfluss von Aminosäureaustauschen im Peptid P6342 auf die gesteigerte Bindung von 2F5 an P6373: In der Sequenz von P6342 wurden je zwei aufeinanderfolgende Aminosäuren gegen Alanin ausgetauscht. Dabei haben sich besonders die Austausche im C-terminalen Bereich (P6342 mut4 und mutδ) als entscheidend schlechter in der synergistischen Steigerung der Bindung von 2F5 an P6373 gezeigt.
P6342: AASVTLTVQARLLLS
P6342 mutl AAAATLTVQARLLLS P6342 mut2 AASVAATVQARLLLS P6342 mut3 AASVTLAAQARLLLS P6342 mut4 AASVTLTVAARLLLS P6342 mutδ AASVTLTVQAAALLS
Abb. 7 ELISA mit variierenden stöchiometrischen Kombinationen P6342/P6343 bei vier verschiedenen Konzentrationen Harnstoff: Der ELISA zeigt, dass 2F5 besonders gut an ein 2:1 Verhältnis von P6342/P6373 bindet. Ein größerer Überschuss von P6342 bedeutet keine Steigerung der Bindung, während ein 1 :1 Verhältnis eine deutlich schwächere Bindung des mAb 2Fδ an die beiden Peptide bewirkt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte aus Triplikaten.
Abb. 8 Realtime PCR, (A) Inhibierung der 2F5-abhängigen Virusneutralisation durch die Peptide E1 und E2.
Die Grafik zeigt die ct-Werte bei der Verwendung von Zelllysat nach Behandlung mit unterschiedlichen Mengen E1 (LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS) und E2 (NEQELLELDKWASLWNWFDIT. NWL) während der Infektion mit HIV. 2F5 wurde in einer Konzentration von 2,5 μg/ml eingesetzt.
(B) Auch im Neutralisierungsassay wirkt ein stöchiometrisches Verhältnis von 2:1 E1/E2 stärker hemmend auf die virusneutralisierende Wirkung als ein 1 :1 Verhältnis. Alle Werte wurden als Triplikate gemessen.
Abb. 9 HIV-Neutralisierung durch Rattenseren: Die Säulen zeigen die prozentuale Hemmung der HIV-1 IIIB Provirusintegration in C8166 in Anwesenheit von verschiedenen Rattenseren bzw. 2F5. Die Rattenseren wurden 1 :4 vorverdünnt. 2F5 wurde in einer Konzentration von 2,5 μg/ml eingesetzt. Die Umrechnung der ct-Werte in prozentuale Hemmung ist unter 2.9 beschrieben.
Abb. 10 Rekombinante von gp41 abgeleitete Konstrukte: A): Von gp41 von HIV-1 wurde ein rekombinantes protein abgeleitet, das nur noch Teile der Exodomäne enthält. (B) Vom transmembranen Hüllprotein p15E des porcinen endogenen Retrovirus wurde ein rekombinantes Protein abgeleitet ind in dieses Protein wurden an topographisch identischen Positionen die E1 und E2 Domänen von gp41 (grau) von HIV-1 eingesetzt (Substitution der entsprechenden Epitope von p15E). Verschieden große E1 und E2 Domänen wurden gewählt.
Abb. 11 Rekombinantes von gp41 abgeleitetes Loop-Protein und freie Peptide sowie Konjugate an ein Trägermolekül
Die grau gezeichneten E1 und E2 Domänen wurden (A) als rekombinantes Protein mit einem Aminosäurelinker bzw. (B) als freie synthetische Peptide oder gekoppelt an das Trägermaterial Dextran hergestellt.
Abb. 12 Neutralisierende Antikörper nach Immunisierung mit der rekombinanten Ektodomäne von p15E von FeLV
Ziege 27 wurde mit der rekombinanten Ektodomäne immunisiert, das Antiserum hemmte die Infektion von FEA-Zellen mit dem felinen Leukämievirus FeLV. Die Infektion wurde mittels PCR (Nachweis der Provirus-Infektion gemessen). (A) Titration des Virus mit präimmunem Serum, (B) Titration des Virus mit Immunserum.
Abb. 13 Epitopmapping von FeLV-neutralisierenden Seren
Ziegeserum 27, 10 Rattenseren und affinitäts-chromatographisch gereinigte Antikörper nach
Immunisierung mit der rekombinanten Ektodomäne von p15 von FeLV wurden kartiert wie in Abb. 3 beschrieben. Überlappende Peptide, die der Ektodomäne von p15 von FeLV enstprechen, wurden verwendet. IgG: Prot G-gereinigte Antikörper, plδE - plδE-gereinigte Antikörper. Die vier wichtigsten Epitop-Domänen sind eingerahmt.
Abb. 14 Effekt der gemeinsamen Immunisierung mit dem rekombinanten Protein p15E von FeLV und dem kommerziellen Anti-FeLV-lmpfstoff Leucogen
Ratten wurden immunisiert mit dem kommerziellen Impfstoff Leucogen (Tiere 56.1, 56.2. 56.3)oder mit dem kommerziellen Impfstoff Leucogen und dem rekombinanten Protein p15E von FelV. Die Neutralisation wurde mittels quantitativer real time PCR gemessen und als Prozent der Provirus-Integration dargestellt. Es ist deutlich, dass Seren der Gruppe 54 FeLV (Leucogen und p15E) neutralisieren als Seren der Gruppe 56 (Leucogen) allein.
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Claims

Patentansprüche
1. Immunogenes Konstrukt umfassend Aminosäuresequenzen ausgewählt aus einem viralen transmembranen Hüllprotein, das mindestens über einen Membrandurchgang, mit der Virusmembran assoziiert ist, mindestens eine Fusionsdomäne und mindestens zwei alpha- helikale Strukturen umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenzen ausgewählt sind (i) aus einem ersten Bereich des Hüllproteins, lokalisiert zwischen dem Membrandurchgang und einer ersten alpha-helikalen Struktur sowie
(ii) aus einem zweiten Bereich, lokalisiert zwischen der Fusionsdomäne und einer zweiten alpha-helikalen Struktur und/oder das Konstrukt, die die jeweilige Aminosäuresequenzen codierende DNA umfasst.
2. Immunogenes Konstrukt nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die ausgewählten Aminosäuresequenzen ein synthetisches Peptid, ein rekombinantes Protein, eine durch eine korrespondierende DNA codierende Sequenz für die jeweilige Aminosäuresequenz und/oder eine Kombination dieser sind.
3. Immunogenes Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die erste alpha-helikale Struktur eine C-terminale Helix und die zweite alpha-helikale Struktur eine N-terminale Helix des Hüllproteins ist.
4. Immunogenes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Hüllprotein um dasjenige eines Virus ausgewählt aus der Gruppe BIV, CEAV, EIAV1 , FIV, OMVV, SIVmac, SIVcpz, VILV, HIV-1 , HIV-2, RSV, ALV, JSRV, SRV, GALV, MLV, FeLV, BLV, HTLV-1 , HTLV-2, KoRV, SARS-Virus und/oder HPV-1 handelt.
5. Immunogenes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Hüllprotein GP2, gp20, gp21 , gp30, gp36, gp37, gp40, gp41 , gp45, gp160, p15E, E2, HA2 und/oder F2 ist.
6. Immunogenes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei Aminosäuresequenzen ausgewählt sind aus der Gruppe der N- terminalen und der C-terminalen Sequenzen mindestens umfassend eine Sequenz gemäß No 1 bis No 104 und/oder die sie codierende DNA.
7. Immunogenes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass . die Aminosäuresequenzen untereinander und/oder die diese codierende DNA verbunden oder assoziiert sind.
8. Immunogenes Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenzen und/oder die diese codierende DNA mit Liposomen assoziiert sind, insbesondere eingeschlossen und/oder auf einer Liposomenmembran verankert sind.
9. Pharmazeutisches Mittel umfassend mindestens eines der immunogenen Konstrukte nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen.
10. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 9, zur Verwendung als Immuntherapeutikum oder-prophylaktikum.
11. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens eine weitere immunogene Komponente desselben Virus oder anderer Pathogene umfasst, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bordetella, Haemophilus, Borrelia, Pseudomonas, Corynebakterien, Mycobakterien, Streptokokken, Salmonellen, Pneumokokken, Staphylokokken und/oder Clostridien.
12. Pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es Zytokine oder deren DNA umfasst, insbesondere lnterleukin-2, 4, 12 und/oder GM-CSF.
13. Pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Aminosäuresequenz an ein Trägersystem geknüpft ist.
14. Pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfsstoffe oder das Trägersystem aus einem oder mehreren Proteinfragmenten bestehen, die durch eine Peptidbindung an das äußere N- oder C-terminale Ende der Aminosäuresequenz geknüpft sind.
15. Pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfsstoffe oder das Trägersystem ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Albumine, KLH und/oder Dextrane.
16. Pharmazeutisches Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass es darüber hinaus mindestens ein nicht-spezifisches Immunadjuvanz umfasst.
17. Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID No 1 bis No 104 und/oder die sie codierende DNA zur Verwendung in der Medizin.
18. Neutralisierender Antikörper, hergestellt durch Immunisierung mit dem immunogenen Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
19. Kit zum Nachweis von Antikörpern umfassend das immunogene Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Diagnose, Verlaufs- und/oder Therapiekontrolle viraler Erkrankungen.
20. Kit zum Nachweis von Virusantigenen umfassend einen neutralisierenden Antikörper nach Anspruch 18 zur Diagnose, Verlaufs- und/oder Therapiekontrolle viraler Erkrankungen.
21. Verfahren zur Induktion einer Antikörperantwort, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder das pharmazeutische Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 16 mit einem Organismus in Kontakt gebracht werden.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das In-Kontakt-Bringen oral, anal, rektal, vaginal, intravenös, intradermal, subkutan und/oder intramuskulär durchgeführt wird.0
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Induktion einer Antikörperantwort prophylaktisch oder therapeutisch erfolgt.5
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper nach Anspruch 18 zur Therapie einer viralen Erkrankung, insbesondere o einer retroviralen Erkrankung, bevorzugt HIV eingesetzt werden.
2δ. Verwendung des immunogenen Konstruktes nach einem der Ansprüche 1 bis 8, des pharmazeutischen Mittels nach einem der Ansprüche 9 bis 16, mindestens einer5 Aminsosäuresequenz nach Anspruch 17 und/oder des neutralisierenden Antikörpers nach Anspruch 18 zur Diagnose, Prophylaxe, Therapie und/oder Verlaufskontrolle von viralen Erkrankungen, insbesondere retroviralen Erkrankungen.
0 26. Verwendung des Kits nach Anspruch 19 oder 20 zur Diagnose und/oder Verlaufskontrolle von viralen Erkrankungen, insbesondere retroviralen Erkrankungen.
27. Verwendung nach Anspruch 2δ oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die virale Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend BIV, CEAV, EIAV1 , FIV, OMVV, SlVmac, SIVcpz, VILV, HIV-1 , HIV-2, RSV, ALV, JSRV, SRV, GALV, MLV, FeLV, BLV, HTLV-1 , HTLV-2, KoRV, SARS- Virus und/oder HPV-1.
28. Verwendung des immunogenen Konstruktes nach einem der Ansprüche 1-8 in einem0 Neutralisationsassay.
29. Verfahren zur Generierung eines Antikörpers gegen eine retrovirale Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass5 ein Organismus mit dem immunogenen Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dem pharmazeutischen Mittel nach einem der Ansprüche 9 bis 16, mindestens einer Aminsosäuresequenz nach Anspruch 17 und/oder dem neutralisierenden Antikörper nach Anspruch 18 in Kontakt gebracht werden und so eine humorale Immunantwort durch die Bildung von Antikörpern induziert wird und anschließend die Antikörper aus dem o Organismus gewonnen werden.
30. Verfahren zur passiven Immunisierung eines Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass5 die nach dem Verfahren nach Anspruch 29 gewonnenen Antikörper mit einem Organismus in Kontakt gebracht werden.
31. Immunoassay für den Nachweis von BIV-, CEAV-, EIAV1-, FIV-, OMVV-, SlVmac-,0 SIVcpz-, VILV-, HIV-1-, HIV-2-, RSV-, ALV-, JSRV-, SRV-, GALV-, MLV-, FeLV-, BLV-, HTLV-1-, HTLV-2-, KoRV, SARS-Virus- und/oder HPV-1 -Antikörpern in einer biologischen Probe umfassend a) Beschichten einer festen Phase mit dem immunogenen Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8; b) Inkubieren der festen Phase mit der biologischen Probe; c) Inkubieren der festen Phase mit einem anti-humanen Antikörper, der die Klassen IgA, IgM, IgG nachweisen kann, der mit einer nachweisbaren Kennzeichnung markiert ist und d) Nachweis der Kennzeichnung, um die Anwesenheit der bindenden Antikörper gegen die genannten Viren in der Probe zu bestimmen.0
32. Immunoassay für den Nachweis von Virusantigenen in einer biologischen Probe umfassend a) Beschichten einer festen Phase mit dem neutralisierenden Antikörper gemäß5 Anspruch 18; b) Inkubieren der festen Phase mit der biologischen Probe, c) Inkubieren der festen Phase mit einem zweiten, unterschiedlichen vom ersten, Antikörper gegen die gesuchten viralen Antigene, der in einem Tier oder einem Menschen nach Immunisierung mit dem immunogenen Konstrukt nach einem o der Ansprüche 1 bis 8 gewonnen wurden und d) Nachweis des gekoppelten zweiten Antikörpers, um so die Menge des gebundenen Antigens zu bestimmen.
Referenzliste für die Aminosäuresequenzen
SEQ ID No 1 QARQLLSDIVQQQ,
SEQ ID No 2 ELDKWASLWNWFN, SEQ ID No 3 GASVTLTVQARQLLSDIVQQQ,
SEQ ID No 4 ELDKWASLWNWFN ITNWLWY,
SEQ ID No 5 LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS,
SEQ ID No 6 NEQELLELDKWASLWNWFDITNWL,
SEQ ID No 7 FLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLS, SEQ ID No 8 FLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLS,
SEQ ID No 9 FLGFLGAAGSTMGAASLTLTVQARQLLS,
SEQ ID No 10 LLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLS,
SEQ ID No 11 FLGFLGAAGSTMGAASITLTVQVRQLLS,
SEQ ID No 12 FLGVLSAAGSTMGAAATALTVQTHTLMK, SEQ ID No 13 NEQDLLALDKWASLWNWFDITNWLWYIK,
SEQ ID No 14 NEQDLLALDKWANLWNWFDISNWLWYIK,
SEQ ID No 15 NEQDLLALDKWANLWNWFDITNWLWYIR,
SEQ ID No 16 NEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWYIK,
SEQ ID No 17 NEKDLLALDSWQNLWNWFDITNWLWYIK, SEQ ID No 18 NEQELLELDKWASLWNWFSITQWLWYIK,
SEQ ID No 19 NEQELLALDKWASLWNWFDISNWLWYIK,
SEQ ID No 20 NEQDLLALDKWDNLWSWFSITNWLWYIK,
SEQ ID No 21 NEQDLLALDKWASLWNWFDITKWLWYIK,
SEQ ID No 22 NEQDLLALDKWASLWNWFSITNWLWYIK, SEQ ID No 23 NEKKLLELDEWASIWNWLDITKWLWYIK,
SEQ ID No 24 AVGLAIFLLVLAIMAITSSLVAATTLVNQHTTAKV,
SEQ ID No 25 SLSDTQDTFGLETSIFDHLVQLFDWTSWKDWIK,
SEQ ID No 26 GVGLVIMLVIMAIVAAAGASLGVANAIQQSYTKAAVQTLAN,
SEQ ID No 27 AMTQLAEEQARRIPEVWESLKDVFDWSGWFSWLKYI, SEQ ID No 28 FGISAIVAAIVAATAIARSATMSYVALTEVNKIMEVQNH,
SEQ ID No 29 LAQSMITFNTPDSIAQFGKDLWSHIGNWIPGLGASIIKY, SEQ ID No 30 SSSYSGTKMACPSNRGILRNWYNPVAGLRQSLEQYQVVKQPDYLLVPE, SEQ ID No 31 MDIEQNNVQGKIGIQQLQKWEDWVRWIGNIPQYLK, SEQ ID No 32 GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSSYTRTAVQSLANATAAQQN, SEQ ID No 33 QVQIAQRDAQRIPDVWKALQEAFDWSGWFSWLKYIPW, SEQ ID No 34 LGFLGFLATAGSAMGAASLVTAQSRTLLAVIVQQQQQLLDVV, SEQ ID No 35 EEAQIQQEKNMYELWKLNWWDVFGNWFDLTSWDLTSWIKY, SEQ ID No 36 LGALGFLGAAGSTMGAAAVTLTVQARQLLSGIVQQQNNLL, SEQ ID No 37 EEAQSQQEKNERDLLELDQWASLWNWFDITKWLWYIK, SEQ ID No 38 GIGLVIVLAIMAIIAAAGAGLGVANAVQQSYTRTAVGSLANATAAQQE, SEQ ID No 39 EAALQVHIAQRDARRIPDAWKAIQEAFNNWSSWFSWLKY, SEQ ID No 40 LGFLGFLATAGSAMGARSLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLL SEQ ID No 41 EEAQIQEKNMYELQKLNSWDILGNWFDLISWVKYIQ, SEQ ID No 42 WGPTARIFASILAPGVAAAQALREIERLACWSVKQANLTTSLL, SEQ ID No 43 KFQLMKKHVNKIGVDSDPIGSWLRGIFGGIGEWAVH,.
SEQ ID No 44 SVSHLSSDCNDEVQLWSVTARIFASFFAOGVAAQALKEIERLA, SEQ ID No 4δ ALQAMKEHTEKIRVEDDOIGDWFTRTFGGLGGWLAK, SEQ ID No 46 GLSLIILGIVSLITLIATAVTACCSLAQSIQAAHTVDLSSQNVTKVMGT, SEQ ID No 47 IENSPKATLNIADTVDNFLQNLFSNFPSLHSLNKTL, SEQ ID No 48 AVTLIPLLVGLGVSTAVATGTAGLGVAVQSYTKLSHQLINDVQALSSTI, SEQ ID No 49 KIKNLQEDLEKRRKALADNLFLTGLNGLLPYLLP, SEQ ID No δO AIQFIPLVIGLGITTAVSTGTAGLGVSLTWYTKLSHQLISDBQAISSTI, SEQ ID No δ1 KIKNLQDDLEKRRKQLIDNPFWTGFHLLPYVMPL, SEQ ID No δ2 DPVSLTVALLLGGLTMGSLAAGIGTGTAAUETNQFKQLQ, SEQ ID No 53 SMAKLRERFKQRQKLFESQQGQFEGWYNKSPWETT,
SEQ ID No 54 AVSLTLAVLLGLGITAGIGGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDAD, SEQ ID No δδ SMKKLKEKLDKRQLERQDSQNWYEGWFNNWPWFTT, SEQ ID No δ6 EPVSLTLALLLGGLTMGGIAGVGTGTTALVATQQFQQLQAAMHD, SEQ ID No δ7 SMAKLRERLSQRQKLFESQQGWFEGLFNKSPWFTT, SEQ ID No δ8 EPISLTVALMLGLTVGGIAAGCGTGTKALLEAQFLQLQMQMHTD, SEQ ID No δ9 NMAKLRERLKQRQQLFDSQQGWFEGWFNRSPWFTT, SEQ ID No 60 SPVAALTLGLALSVGLTGINVAVSALSHQRLTSLIHVLEQDQQ, SEQ ID No 61 PLSQRVSTDWQWPWNWDLGLTAWVRET, SEQ ID No 62 AVPVAWLVSALAMGAGVAGGITGSMSLASGKSLLHEV, SEQ ID No 63 PILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAREALQ,
SEQ ID No 64 AVPIAVWSVSALAAGTGIAGGVTGSLSLASSKSLLLEVD, SEQ ID No 6δ SVLQERPPLEKRVITGWGLNWDLGLSQWAREALQ, SEQ ID No 66 FPNINENTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGI, SEQ ID No 67 KNISEQIDQIKKDEQKIGRGWGLGGKWWTSDWG, SEQ ID No 68 LITGGRRTRREAIVNAQPKCNPNLHYWTQDEGAAIGLAWIPYFGPAA, SEQ ID No 69 KNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWI, SEQ ID No 70 LITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDF, SEQ ID No 71 DRLNEVAKNLNESLIDLQELKYEQYEKWPWYVW, SEQ ID No 72 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAA, 5 SEQ ID No 73 HDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILISFA, SEQ ID No 74 FAGVVLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLSSQAIDNLRASLETT, SEQ ID No 7δ IAKLEDAKELLESSKQILRSMKGLSSTSIVY, SEQ ID No 76 FAGIAIGIAALGVATAAQVTAAVSLVQAQTNARAAAMKNSIQTNRA, SEQ ID No 77 TELSKVNASLQNAVKQIKESNHQLQSVSVSSK, l o SEQ ID No 78 FFGAVIGTIALGVATAAQITAGIALAEAREARKDIALIKDSIVKTH, SEQ ID No 79 TNFLEESKTELMKARAIISVGGWHNTESTQ. SEQ ID No 80 LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS) und SEQ ID No 81 NEQELLELDKWASLWNWFDIT NWL SEQ ID No 82 15 LITQARQLLSDIVQQQRIVTEDLQALEKSVSNLEESLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKKEGLC VALKEECCFYVDHSGAIRDSMSKLRERLERRRREELDKWASLWNWFN SEQ ID No 83 LITGASVTLTVQARQLLSDIVQQQRIVTEDLQALEKSVSNLEESLTSLSEVVLQNRRGLDLL FLKKEGLCVALKEECCFYVDHSGAIRDSMSKLRERLERRRREELDKWASLWNWFNITNW 20 LWY SEQ ID No 84 LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSSSPSSNEQELLELDKWASLWNWFDITNWL SEQ ID No 8δ MGCTSMTLTVQARQLLSDIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ QLLGIWGCSGKUCTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQ 25 NQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK SEQ ID No'86 AASVTLTVQARLLLS SEQ ID No 87 AAAATLTVQARLLLS SEQ ID No 88 AASVAATVQARLLLS SEQ ID No 89 AASVTLAAQARLLLS 30 SEQ ID No 90 AASVTLTVAARLLLS SEQ ID No 91 AASVTLTVQAAALLS SEQ ID No 92 LGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLS SEQ ID No 93 NEQELLELDKWASLWNWFDITNWL SEQ ID No 94 FLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQ 35 SEQ ID No 9δ FLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLL SEQ ID No 96 FLGAAGSTMGAASVTLTVQARLLLSG1VQQQNNLLRAIEAQQHML
SEQ ID No 97 SQNQQEKNEQELLELDKWAGLWSWFSITNWLWY
SEQ ID No 98 SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWY
SEQ ID No 99 SQTQQEKNEQELLELDKWASLWNWFDITNWLWY Seq lD No lOO LETAQFRQLQMAMHTDIQALEESISALEKSLTSLSEVVLQNRRGLDILFLQEGGLCAALKE ECCFYADHTGLVRDNMAKLRERLKQRQQLFDSQQGWFEGWFNKSPW
Seq ID No 101 TAALITGPQQLEKGLSNLHRIVTEDLQALEKSVSNL
Seq ID No 102 DHSGAIRDSMSKLRERLERRRREREADQGWFEGWFNR Seq ID No 103 TALIKGPIDLQQGLTSLQIAMDTDLRALQDSISKLED
Seq ID No 104 SMRRLKERLDKRQLEHQKNLSWYEGWFNRSPWLTT
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