FR2832424A1

FR2832424A1 - Plasmide chimere comprenant un genome retroviral replicatif et utilisations

Info

Publication number: FR2832424A1
Application number: FR0114976A
Authority: FR
Inventors: Muriel Audit; Francois Loic Cosset
Original assignee: Genethon III
Current assignee: Genethon III
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2001-11-20
Publication date: 2003-05-23
Anticipated expiration: 2021-11-20
Also published as: WO2003044202A1; US20040096972A1; EP1446490A1; CA2445078A1; JP2005509438A; FR2832424B1

Abstract

Plasmide chimère comprenant un génome rétroviral réplicatif caractérisé en ce qu'il contient : - des séquences gag et pol provenant du génome d'un virus MLV, - une séquence env chimère comprenant une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus MLV et une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus GaLV.

Description

PLASMIDE CHIMERE COMPRENANT UN GENOME RETROVIRAL REPLICATIF ET UTILISATIONS

L'invention concerne un plasmide chimère comprenant un génome rétroviral réplicatif contenant des séquences nucléotidiques gag, pol et env provenant de rétrovirus d'espèces distinctes. Elle se rapporte également à un rétrovirus de type MLV (Murine Leukemia Virus) et de type GaLV (Gibbon Ape Leukemia Virus) produit par une lignée cellulaire exprimant ledit plasmide. Elle concerne aussi une bactérie productrice du plasmide. Elle a par ailleurs pour objet un virion contenant un génome rétroviral réplicatif provenant de rétrovirus d'espèces distinctes. L'invention a également pour objet l'utilisation du virion comme témoin positif dans un test destiné à détecter la capacité réplicative d'un vecteur rétroviral du type MLV GaLV, en particulier un test de mobilisation.

L'invention concerne enfin un kit pour la mise en oeuvre dudit test.

La thérapie génique a pour principal objectif d'introduire in vitro, in vivo ou ex vivo, un gène d'intérêt dans des cellules pour produire par exemple une protéine ou un peptide recombinant. L'introduction du gène d'intérêt dans la cellule est effectuée par le biais de vecteurs soit viraux (en pratique, AAV, adénovirus ou rétrovirus...), soit synthétiques (en particulier, lipide synthétique...) dans la structure desquels est inséré le gène d'intérêt. La présente invention relève exclusivement du domaine de la thérapie génique mettant en ceuvre des vecteurs rétroviraux.

Tous les génomes rétroviraux possèdent la même structure de base, dont notamment les gènes gag, pol et env. Le gène gag code pour les protéines de structure (capside, matrice et nuc1éocapside), le gène pol code pour les fonctions enzymatiques, tandis que le gène env code pour les protéines d'enveloppe.

Chaque extrémité du génome présente de longues répétitions terminales (LTR, Long Terminal Repeat) contribuant à la réplication, à l'intégration dans la

cellule et à l'expression du génome viral, de même qu'une séquence Y (PSI) responsable de l'encapsidation du génome rétroviral dans l'enveloppe protéique.

In L'une des conditions incontournables pour qu'un vecteur rétroviral puisse être utilisé en thérapie génique est qu'il ne présente aucune capacité à se répliquer. En effet, des rétrovirus compétents pour la réplication (RCR) peuvent induire une invasion massive de l'organisme et consécutivement diverses pathologies. Les travaux de Donahue (1) ont montré que des RCR qui avaient été générés au cours de la production de vecteurs rétroviraux induisaient des leucémies chez les singes rhésus immunodéprimés.

La l génération de vecteurs rétroviraux dérivés de MLV était constituée de la façon suivante : le gène à introduire dans les cellules cibles était placé dans un vecteur de transfert comprenant notamment les LTR (Long Terminal Repeat) et la séquence du virus MLV. Ce vecteur était introduit dans une cellule dite packaging exprimant, à partir d'une seule construction moléculaire dans laquelle la séquence avait été délétée, les gènes gag, pol et env de MLV. Un certain nombre de lignées packaging sur ce modèle ont été proposées telles que par exemple les lignées y 2, y-Am et PA 12. Cependant, il a été montré que des RCR pouvaient être générés dans de telles lignées packaging suite à des recombinaisons entre le vecteur de transfert (contenant le gène d'intérêt) et les séquences virales de la lignée packaging (construction moléculaire permettant l'expression des gènes viraux gag, pol et env) (2).

D'autres modèles de lignées packaging MLV ont été proposés dans lesquels, outre l'absence du signal d'encapsidation \ (/, les LTR étaient délétées partiellement ou totalement. Ces délétions supplémentaires avaient pour objectif de diminuer la probabilité de reconstitution, par recombinaisons, d'un génome rétroviral capable de produire des RCR. De telles lignées correspondent par

exemple à la lignée PA 317. Toutefois il a été montré que ces lignées étaient, comme les précédentes, susceptibles de générer des RCR (3).

Pour diminuer la probabilité des recombinaisons pouvant se produire entre

le vecteur de transfert et le vecteur de la lignée packaging de nouvelles c modifications ont été apportées dans la production des vecteurs MLV. Les séquences virales de la lignée packaging ont été placées sur 2 vecteurs distincts au lieu d'un seul (des recombinaisons supplémentaires étaient alors nécessaires pour que des RCR émergent). En pratique, la modification majeure apportée par rapport aux lignées packaging de type PA 317 est la suivante : les gènes gag et pol sont apportés par un premier plasmide et le gène env par un second plasmide. De telles lignées correspondent par exemple à la lignée GP + Env Am12 (4).

Compte tenu du risque subsistant de recombinaisons entre les séquences virales des lignées packaging et les vecteurs de transfert rétroviraux et des conséquences possibles de telles recombinaisons, la recherche de RCR dans les préparations de vecteurs MLV a été rendue obligatoire par la FDA (Food and Drug Administration) pour les lots de vecteurs MLV destinés à des essais cliniques (5). Les tests requis par la FDA doivent être réalisés sur les cellules productrices de vecteurs, sur leur surnageant ainsi que sur les patients qui ont subi la thérapie génique.

Différentes méthodes peuvent être mises en oeuvre pour la détection des RCR. La plus utilisée pour tester les cellules productrices de vecteurs et les surnageant viraux est un test de mobilisation. Ce test consiste à incuber l'échantillon à tester avec une lignée de mobilisation qui est permissive à l'infection par le vecteur produit par les cellules ou contenu dans le surnageant. La lignée de mobilisation porte un vecteur comprenant notamment les LTR et la séquence q de MLV ainsi qu'un gène de résistance à un antibiotique. Ce vecteur de mobilisation est une sorte de leurre. Lorsque les cellules de mobilisation sont infectées par des RCR, ceux-ci fournissent les protéines virales nécessaires à la

production de particules infectieuses et ces particules intègrent indifféremment leur propre génome ou le vecteur de mobilisation. Le surnageant des cellules de mobilisation est ensuite transféré sur des cellules indicatrices qui sont traitées avec l'antibiotique correspondant au gène de résistance porté par le vecteur de mobilisation. L'existence de cellules indicatrices résistantes à l'antibiotique indique la présence de RCR dans le surnageant ou les cellules productrices testés.

Le document MILLER (6) décrit un plasmide dénommé pAM dont le produit d'expression (le virus) est utilisé comme témoin positif pour la recherche de RCR dans les préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV amphotrope.

Ce virus peut être utilisé comme témoin parce qu'il est semblable aux RCR qui peuvent être générés dans les préparations de vecteurs MLV amphotropes.

L'utilisation de ce témoin positif est aujourd'hui rendue obligatoire par la FDA. Il est commercialisé par l'ATCC (American Type Culture Collection) sous la forme de plasmide (ref VR-1450) et sous la forme d'une lignée cellulaire NIH3T3 exprimant ce plasmide (ref VR-1448). Le plasmide pAM a été obtenu en remplaçant le gène env écotrope du MLV Moloney par le gène env amphotrope du MLV 4070A. La séquence du pAM est répertoriée dans GENBANK sous le numéro d'accession AF 010170. Cette séquence comprend notamment un vecteur de clonage, pBR322, et le génome du virus composé de la façon suivante : LTR 5' (bases 145 à 736), gène gag (bases 1212 à 2828), gène pol (bases 2829 à 6428), gène env (bases 6368 à 8332) et LTR 3' (bases 8374 à 8967).

La construction moléculaire de pAM était relativement aisée du fait des fortes homologies de séquence et de fonction des génomes des deux MLV utilisés pour réaliser cette construction. En effet, grâce à la présence de sites de restriction

alléliques (mêmes sites de restriction aux mêmes endroits des 2 génomes 1 considérés), cette construction a été réalisée par une simple digestion enzymatique du plasmide receveur et du plasmide donneur suivi de la ligation des 2 fragments à associer.

Les vecteurs rétroviraux dérivés de MLV les plus utilisés sont ceux qui portent une enveloppe permettant l'infection des cellules humaines, par exemple une enveloppe amphotrope (issue du virus de souris MLV) ou une enveloppe GaLV (issue d'un virus de singe). L'utilisation d'une enveloppe GaLV plutôt que d'une enveloppe amphotrope présente différents avantages. D'une part, l'enveloppe GaLV pennet l'infection de plus de types cellulaires humains que l'enveloppe amphotrope (7). D'autre part, l'utilisation de vecteurs portant des gènes de structures et un gène d'enveloppe issus d'espèce différentes, comme c'est le cas pour les vecteurs MLV-GaLV, diminue la probabilité de reconstitution, suite à des recombinaisons, d'un génome viral fonctionnel capable de produire des RCR.

Alors que le témoin positif pour la recherche des RCR dans les préparations de vecteurs MLV amphotropes est disponible depuis 1985 (6), aucun

témoin positif semblable aux RCR qui peuvent être générés dans les préparations lt > de vecteurs MLV GaLV n'est actuellement disponible.

Le problème que se propose de résoudre l'invention est donc de développer un témoin positif pour la recherche de RCR dans les préparations de vecteurs MLV GaLV.

Pour ce faire, l'invention propose tout d'abord un plasmide chimère comprenant un génome rétroviral réplicatif.

Ce plasmide se caractérise en ce qu'il contient : des séquences gag et pol provenant du génome d'un virus MLV, - une séquence env chimère comprenant une région correspondant à une

partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus MLV et une It : > région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus GaLV.

Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression génome rétroviral réplicatif , on désigne un génome composé de tous les éléments nécessaires à la production de particules virales compétentes pour la réplication, en particulier, une séquence psi, au moins une séquence LTR, les gènes gag, pol et env et plus généralement tous les gènes présents dans le virus

MLV sauvage.

ZD
En d'autres termes, l'invention consiste à avoir construit un plasmide chimère , c'est à dire un plasmide résultant de l'association de génomes rétroviraux distincts, autrement dit d'espèces différentes. Le plasmide est construit en juxtaposant trois séquences rétrovirales, respectivement une première région comprenant les gènes gag et pol d'un virus MLV, une seconde région comprenant une partie de l'enveloppe d'un virus MLV, et une troisième région comprenant une partie de l'enveloppe d'un virus GaLV.

Selon l'invention, l'enveloppe MLV utilisée peut présenter différents tropismes, en particulier, xénotrope, écotrope, polytrope, 10AI, avantageusement amphotrope.

Selon une première caractéristique de l'invention, la séquence gag code pour la polyprotéine gag correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 1, ou une séquence présentant au moins 70%, avantageusement au moins 80% d'homologie avec la séquence SEQ ID 1.

Dans la suite de la description et dans les revendications, par l'expression "séquence présentant un certain pourcentage d'homologie avec une séquence donnée , on désigne une séquence d'acides aminés ou de nucléotides identique avec la séquence donnée à la hauteur dudit pourcentage. L'identité ou homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de la séquence, par exemple Pairwise BLAST, NCBI.

Le pourcentage d'homologie avec la séquence SEQ ID 1 a été recherché en comparant les acides aminés codés par la séquence gag du plasmide pAMS avec 1 ceux de la séquence gag de différentes souches de virus de type MLV. Les résultats figurent dans le tableau ci-après. Les références indiquées sont celles de GENBANK.

Homologies <SEP> (acides <SEP> aminés <SEP> de <SEP> gag) <SEP> pAMS- > <SEP> gag <SEP> (ref <SEP> AAB64159)
<tb> AKV <SEP> (refJ01998), <SEP> A.A. <SEP> gag <SEP> (refAAB <SEP> 03090) <SEP> 73%
<tb> SL3-3 <SEP> (refAF169256), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> gag <SEP> (ref <SEP> AAD55050) <SEP> 73%
<tb> Friend <SEP> (ref <SEP> M93134), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> gag <SEP> (refCAA46476) <SEP> 74%
<tb> Friend <SEP> FB29 <SEP> (ref <SEP> Z11128), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> gag <SEP> (refCAA77478)'73%
<tb> Moloney <SEP> (ref <SEP> AF033811), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> gag <SEP> (ref <SEP> AAC82566) <SEP> 81%
<tb> MCF <SEP> 1233 <SEP> (ref <SEP> U13766), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> gag <SEP> (ref <SEP> AAA92678) <SEP> 72%
<tb>

De même et selon une autre caractéristique de l'invention, la séquence pol code pour les enzymes virales correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 2, ou une séquence présentant au moins 80%, de préférence au moins 85% avantageusement au moins 90% d'homologie avec la séquence SEQ ID 2.

Le pourcentage d'homologie avec la séquence SEQ ID 2 a été recherché en comparant les acides aminés codés par la séquence pol du plasmide pAMS avec ceux de la séquence pol de différentes souches de virus de type MLV. Les résultats figurent dans le tableau ci-après. Les références indiquées sont celles de GENBANK.

Homologies <SEP> (acides <SEP> aminés <SEP> de <SEP> pol) <SEP> pAMS- > <SEP> pol <SEP> (ref <SEP> AAB64160)
<tb> AKV <SEP> (ref <SEP> J01998), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> pol <SEP> (ref <SEP> AAB <SEP> 03091) <SEP> 87%
<tb> SL3-3 <SEP> (refAF169256), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> pol <SEP> (refAAD55051) <SEP> 87%
<tb> Friend <SEP> (ref93134), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> pol <SEP> (refCAA46477) <SEP> 93%
<tb> Friend <SEP> FB29 <SEP> (ref <SEP> Z11128), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> pol <SEP> (refCAA77477) <SEP> 93%
<tb> Moloney <SEP> (ref <SEP> AF033811), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> pol <SEP> (ref <SEP> AAC82568) <SEP> 94%
<tb> MCF <SEP> 1233 <SEP> (ref13766), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> pol <SEP> (refAAA92679) <SEP> 87%
<tb>

Comme déjà dit, les séquences gag et pol proviennent du génome d'un virus MLV. En pratique, on utilise la souche Moloney bien que d'autres souches puissent être utilisées du fait de la forte homologie des gènes gag et pol entre les différentes souches connues, comme démontré ci-avant.

Selon une autre caractéristique du plasmide de l'invention, la séquence env est une séquence chimère provenant pour partie de l'enveloppe d'un virus MLV et pour partie de l'enveloppe d'un virus GaLV. En pratique, la partie de l'enveloppe du virus GaLV, clouée dans le plasmide, comprend au minimum la région qui a pour fonction de définir la spécificité d'infection ou le tropisme de l'enveloppe virale. En particulier, la partie de l'enveloppe du virus GaLV code pour la partie de la protéine env située entre les acides aminés No. 32 et No. 644 (ci-après dénommé"domaine ID3-GaLV") de la séquence SEQ ID 3 ou une séquence présentant au moins 70%, de préférence au moins 75%, avantageusement au moins 80% d'homologie avec le domaine ID3-GaLV.

Le pourcentage d'homologie avec le domaine ID3-GaLV a été recherché en comparant les acides aminés codés par la séquence env d'un virus GaLV, souche SEATO avec ceux de la séquence env de différentes souches de virus de type GaLV. Les résultats figurent dans le tableau ci-après. Les références indiquées sont celles de GENBANK.

Homologies <SEP> (acides <SEP> aminés <SEP> de <SEP> env) <SEP> Env <SEP> GaLV <SEP> SEATO- > <SEP> env <SEP> (ref
<tb> AAC96083)
<tb> Souche <SEP> GaLV <SEP> SF <SEP> (ref <SEP> AF055063), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> (ref <SEP> AAC <SEP> 96086) <SEP> 76%
<tb> Souche <SEP> GaLV <SEP> Brain <SEP> (refAF055062), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> (ref <SEP> AAC <SEP> 96085) <SEP> 83%
<tb> Souche <SEP> GaLV <SEP> Hall's <SEP> Island <SEP> (ref <SEP> AF055061), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> (ref <SEP> AAC <SEP> 84%
<tb> 96084)
<tb> Souche <SEP> GaLV <SEP> X <SEP> (ref <SEP> U60065), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> (ref <SEP> AAC <SEP> 80265) <SEP> 76%
<tb>

Dans un exemple avantageux de réalisation du plasmide de l'invention, le 1 fragment d'enveloppe GaLV provient de la souche SEATO (GENBANK, ref M26927).

Selon une autre caractéristique du plasmide de l'invention, la séquence env chimère comprend une région correspondant à une partie de l'enveloppe d'un virus MLV présentant un tropisme au choix, amphotrope, xénotrope, écotrope, polytropes ou IOAI. Dans un mode de réalisation avantageux, le virus MLV présente un tropisme amphotrope. En pratique, la partie d'enveloppe du virus amphotrope clonée dans le plasmide est celle qui est nécessaire pour permettre, en association avec la région de l'enveloppe GaLV substituée, l'obtention de particules virales infectieuses et donc la conformation d'une enveloppe virale fonctionnelle. Aucune région spécifique de l'enveloppe amphotrope ne serait donc requise dans le cas où la substitution de l'enveloppe GaLV entière donnerait lieu à la production de particules virales réplicatives, ce qui n'est pas le cas d'après les expériences de complémentation conduites par le Demandeur.

Dans un mode de réalisation avantageux, la partie de l'enveloppe du virus MLV amphotrope code pour les régions de la polyprotéine Env situées d'une part entre les acides aminés No. 1 et 31 domaine ID 3-ampho-1 et d'autre part entre les acides aminés No. 645 et 676 domaine ID 3-ampho-2 ) de la séquence SEQ ID 3 ou une séquence présentant au moins 70%, de préférence au moins 80% avantageusement au moins 85% d'homologie avec les domaines ID 3-ampho-1 et ID 3-ampho-2.

Le pourcentage d'homologie avec les domaines ID 3-ampho-l et ID 3- ampho-2 a été recherché en comparant les acides aminés codés par la séquence env d'un virus MLV amphotrope, souche 4070A avec ceux de la séquence env de

différentes souches de virus de type MLV amphotrope. Les résultats figurent dans 1 le tableau ci-après. Les références indiquées sont celles de GENBANK.

Homologies <SEP> (acides <SEP> aminés <SEP> de <SEP> env) <SEP> Env <SEP> amphotrope <SEP> 4070A- > <SEP> env <SEP> (ref <SEP> AAA
<tb> 46515)
<tb> Souche <SEP> Moloney <SEP> ampho <SEP> MCF <SEP> (refU <SEP> 36991), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> (ref <SEP> AAC <SEP> 72%
<tb> 54626)
<tb> Souche <SEP> Moloney <SEP> ampho <SEP> Delta <SEP> (ref <SEP> U <SEP> 36800), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> (ref <SEP> AAB <SEP> 86%
<tb> 60590)
<tb> Souche <SEP> Moloney <SEP> ampho <SEP> RCR <SEP> (ref <SEP> U <SEP> 36602), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> (ref <SEP> AAC <SEP> 87%
<tb> 54625)
<tb> Souche <SEP> Moloney <SEP> 10AI <SEP> (ref <SEP> M <SEP> 33470), <SEP> A. <SEP> A. <SEP> (ref <SEP> AAA <SEP> 46514) <SEP> 81%
<tb>

Dans un exemple avantageux de réalisation du plasmide de l'invention, le fragment d'enveloppe amphotrope provient de la souche 4070 A.

1
L'invention concerne également une séquence env chimère codant pour la protéine env correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 3 ou une séquence présentant au moins 70 %, de préférence au moins 75 %, avantageusement au moins 80 % d'homologie avec la séquence SEQ ID3. Cette séquence env chimère contient une partie d'enveloppe d'un virus GaLV codant pour la partie de la protéine env située entre les acides aminés No. 32 et No. 644 de la SEQ ID3 et une partie de l'enveloppe d'un virus MLV amphotrope codant

pour les régions de la polyprotéine env située d'une part entre les acides aminés ID No. 1 et 31 de la séquence SEQ ID3 et d'autre part entre les acides aminés No.

645 et 676 de la séquence SEQ ID3.

Comme il ressort de ce qui précède, le Demandeur a constaté que pour construire un plasmide RCR du type MLV GaLV, la simple substitution du gène env d'un plasmide MLV amphotrope par le gène env d'un plasmide GaLV, ne donnait pas lieu à la production de particules virales réplicatives (des expériences de complémentation ont permis de montrer que ce défaut provenait de l'absence de fonctionnalité de l'enveloppe virale). Au vu de ces observations, il n'était pas évident, non seulement de proposer une séquence chimère associant

avantageusement une enveloppe amphotrope avec une enveloppe GaLV, mais au surplus de sélectionner la partie amphotrope et la partie GaLV nécessaires à la réalisation d'un plasmide codant pour un virus réplicatif ayant la même spécificité d'infection que l'enveloppe GaLV.

Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un plasmide chimère comprenant le génome viral correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 4 ou une séquence présentant au moins 60 %, de préférence au moins

70 %, avantageusement au moins 80 % d'homologie avec la séquence SEQ ID 4.

1
Dans un mode de réalisation particulier, un tel plasmide est obtenu à partir du plasmide pAM comprenant les gènes gag et pol ainsi qu'une enveloppe amphotrope et d'une partie d'un plasmide comprenant l'enveloppe GaLV et correspond à la séquence nucléotidique SEQ ID5.

Bien entendu, et de manière générale, les plasmides couverts par l'invention peuvent être obtenus par toutes les techniques usuelles de biologie moléculaire telle que digestions enzymatiques, PCR (Polymerase Chain Reaction), ligations, amplification, clonage, etc...

L'invention concerne également une'bactérie productrice du plasmide chimère de l'invention, notamment d'un plasmide comprenant le génome viral correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 4 précédemment décrite, plus particulièrement le plasmide correspondant à la séquence nucléotidique SEQ ID 5.

Une bactérie avantageuse correspond à E. coli DH10B.

Le génome viral contenu dans le plasmide chimère de l'invention peut être exprimé dans toute lignée cellulaire adéquate telle que par exemple, et de manière non limitative, les cellules humaines ou de singe, de rat, de hamster, de poulet et particulièrement les lignées de fibroblastes.

L'invention concerne également un virion produit par une des lignées cellulaires précédemment décrites.

Plus particulièrement, l'invention concerne un virion contenant le génome viral correspondant à la séquence nuc1éotidique SEQ ID 4 ou une séquence présentant au moins 60 %, de préférence au moins 70 %, avantageusement au

moins 80 % d'homologie avec la séquence SEQ ID 4.

1
Le rétrovirus ainsi produit trouve une application particulière comme témoin positif dans tout test destiné à détecter des RCR dans des préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV GaLV.

Comme déjà dit, ces tests requis par la FDA visent à tester non seulement le surnageant contenant le vecteur rétroviral produit par la lignée cellulaire, mais également la lignée cellulaire elle-même et les patients traités avec les vecteurs de thérapie génique considérés. Dans les deux premiers cas, la détection des RCR doit être précédée par une étape d'amplification des éventuels RCR présents dans l'échantillon à tester. Si l'échantillon considéré est un surnageant, son amplification est réalisée en le mettant en contact avec une lignée cellulaire permissive à l'enveloppe GaLV. Si l'échantillon considéré est la lignée productrice de vecteurs, son amplification est réalisée en la co-cultivant avec la lignée permissive. La FDA requiert de conduire en parallèle un test mettant en oeuvre un témoin positif en l'espèce, le virus produit par la lignée cellulaire exprimant le plasmide objet de l'invention. Différents types de méthodes, mettant en application ce protocole sont connues sous les dénominations XC (7), PG4 S+ L- (8), PCR ou encore test de mobilisation. Le test de mobilisation est le test préféré parmi les tests précités.

Aussi, l'invention concerne un test de mobilisation destiné à détecter des RCR dans des préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV GaLV, et qui consiste :

- tout d'abord à infecter ou co-cultiver une lignée cellulaire permissive à l'enveloppe GaLV avec respectivement le vecteur rétroviral ou la lignée productrice à tester, ladite lignée permissive contenant un vecteur de mobilisation comprenant lui même un gène de résistance à un antibiotique donné, puis à récupérer le surnageant de la culture ou co-culture pour le transférer sur des cellules indicatrices, également permissive à l'enveloppe GaLV et traitées par ledit antibiotique, à rechercher l'éventuelle résistance des cellules indicatrices à l'antibiotique, la résistance à l'antibiotique révélant la présence de RCR dans l'échantillon testé, à conduire en parallèle le même test avec le témoin positif correspondant au virion de l'invention.

En effet chaque échantillon doit être testé d'une part seul et d'autre part additionné du témoin positif pour vérifier que l'échantillon n'exerce pas d'effet inhibiteur sur la détection des RCR. Dans la suite de la description et dans les revendications, l'expression vecteur de mobilisation désigne un vecteur comprenant notamment les LTR et la séquence \} de MLV ainsi qu'un gène de résistance à un antibiotique.

En pratique, les tests de mobilisation sont conduits sur des cellules permissives, des fibroblastes humains par exemple (HT1080 ou HCT116 notamment) contenant le vecteur de mobilisation apportant la résistance à l'hygromycine B.

L'invention concerne également un kit pour la mise en oeuvre du test de 1 mobilisation qui contient : - le virion de l'invention tel que décrit ci-avant, une lignée cellulaire permissive à l'enveloppe GaLV, en particulier les lignées précitées,

les réactifs nécessaires.

La figure 1 représente la carte de restriction du plasmide pAMS La figure 2 représente la carte de restriction du plasmide phCMV GaLV

La figure 3 représente la carte de restriction du plasmide pRCR-GaLV-1 1
La figure 4 représente la carte de restriction du plasmide pRCR-GaLV-2 (plasmide de l'invention) A/Construction du plasmide de l'invention
Cet exemple reflète un mode de réalisation possible de la construction du plasmide de l'invention (pRCR-GaLV-2) dont la séquence correspond à la séquence SEQ ID 5.

I/Etape 1 de la construction :
Pour l'essentiel, la première étape consiste à construire un premier plasmide dénommé pRCR-GaLV-1 résultant de la ligation de 3 fragments, respectivement : un premier fragment Cla I-Sal I de 7392 pb, situé entre les nucléotides
8232 et 4296 de pAMS (figure 1) et contenant donc les gènes gag et une partie du gène pol d'un virus MLV souche Moloney (paragraphe 1-1 ci après) ; un second fragment boût franc - Cla 1 de 1810 pb, situé entre les nucléotides 2499 et 4309 du plasmide phCMV-GaLV (figure 2) et contenant une partie du gène env d'un virus GaLV souche SEATO (paragraphe 1-2 ci après) ; un troisième fragment bout franc-Sal I de 2162 pb, situé entre les nucléotides 4296 et 6457 de pAl\1S et contenant la partie manquante du gène pol du virus MLV souche Moloney et une partie de l'enveloppe d'un virus MLV amphotrope souche 4070A (paragraphe 1-3 ci après).

1-1-Production du fragment Cla I-Sal I de 7392 pb à partir du plasmide pAMS.

La digestion du plasmide pAMS (figure 1) avec les enzymes Cla I et Sal I D 1 > génère 3 fragments de 1275, 2661 et 7392 pb. Cette digestion est réalisée en 2 1 1 temps : une première digestion de 15 u. g de plasmide par 100 unités de l'enzyme 1 D Sal I suivie d'une précipitation de l'ADN digéré et d'une seconde digestion par 80 unités de l'enzyme Cla I. La récupération du fragment de 7392 pb est réalisée de la façon suivante : après migration du produit de la double digestion enzymatique

dans un gel d'agarose à 0, 8%, le morceau de gel contenant le fragment de 7392 pb n 1 est découpé avec un scalpel puis son ADN est extrait par filtration à 0, 2 u. m. Pour cela, un filtre (Acrodisc 0, 2Lm, Réf. 4192, Gelman Sciences) est placé à l'extrémité d'une seringue de 5 ml avant d'être humidifié avec 200 je. l de TE 0,1 X. Le morceau d'agarose est ensuite passé à travers le filtre puis le filtre est rincé avec 400 il de TE 0,1 X. L'ADN recueilli est précipité à l'isopropanol et rincé à l'éthanol 70%.

1-2-Production du fragment boût franc - Cla I de 1810 pb à partir du plasmide phCMV-GaLV.

Une PCR est réalisée sur le plasmide phCMV-GaLV (figure 2) dont la 1 séquence correspond à la séquence SEQ ID 6 à l'aide des oligonucléotides 1 (SEQ ID 7) et 2 (SEQ ID 8).

Oligo 1 (reverse)
SEQ ID 7 : GGTCAACTTGGCCATGGTGGC (21 mer) 4501- > 4481 phCMV-GaLV
Oligo 2 (sens)
SEQ ID 8 : CAGCCCATGACCCTCACTTGG (21 mer)
2499- > 2519 phCMV-GaLV

L'amplification est réalisée avec 40 ng de plasmide, 1,25 unité de la polymérase pfu Turbo (Stratagene, Réf. 600250), 0,2 mM de dNTP, 0, 5 lM de chaque oligonucléotide dans un volume final de 50 pu. Les conditions d'amplification sont les suivantes : 5 min à 91 C + 30* (1 min à 91 C + 45 sec à 71, 6 C + 2 min à 72 C) + 10 min à 72 C. La PCR est réalisée avec le Mastercycler gradient (Eppendorf). Après vérification de la taille (2002 pb) du fragment amplifie grâce à la migration d'un aliquot sur un gel d'agarosc à 0,8%, le produit de la PCR est digéré par 100 unités de l'enzyme Cla I. Cette digestion est déposée dans un gel d'agorose à 0,8% et le morceau de gel contenant le fragment PCR digéré (1810 pb) est récupéré. L'ADN est extrait du gel d'agarose selon la méthode décrite à la fin du paragraphe 1-1.

1-3-Production du fragment bout franc-Sal I de 2162 pb à partir du plasmide pAMS.

Une PCR est réalisée sur le fragment Xho 1 - who 1 (4773 pb) du plasmide pAMS à l'aide des oligonucléotides 3 (SEQ ID 9) et 4 (SEQ ID 10).

Oligo 3 (reverse)
SEQ ID 9 : CCCTACTCCTAACAGGACTCC (21 mer)
6457- > 6437 pAMS
Oligo 4 (sens) SEQID 10 : GTCAGAGATGGCTGACTGAGG (21 mer)
4015- > 4035 pAMS
L'amplification est réalisée avec 20 ng du plasmide digéré, 1,25 unité de la polymérase pfu Turbo (Stratagene, Réf. 600250), 0,2 mM de dNTP, 0, 5 aM de chaque oligonucléotide dans un volume final de 50 fl1. Les conditions d'amplification sont les suivantes : 5 min à 91 C + 30* (1 min à 91 C + 45 sec à

D1 r'+ 9 111111 a 77 C + 10 min à 72 C La PCR est réalisée avec le

Mastercycler gradient (Eppendorf). Après vérification de la taille (2442 pb) du fragment amplifié grâce à la migration d'un aliquot sur un gel d'agarose à 0, 8%, 1 le produit de la PCR est digéré par 80 unités de l'enzyme Sal I. Cette digestion est déposée dans un gel d'agorose à 0,8% et le morceau de gel contenant le fragment PCR digéré (2162 pb) est récupéré. L'ADN est extrait du gel d'agarose selon la méthode décrite à la fin du paragraphe 1-1.

1-4-Ligation des 3 fragments (Cla I-Sal I de 7392 pb + boût ftanc - Cla 1 de 1810 pb + boût franc-Sal I de 2162 pb) et production du plasmide pRCR-GaLV-

1.

Les 3 fragments à assembler sont quantifiés grâce au logiciel Bio Rad (Bio Rad, Quantity one SW, MAC, Réf. 1708609) et la ligation est réalisée avec une proportion de 1/6 du fragment de 7392 pb (qui contient le vecteur plasmidique) et une proportion équivalente de chacun des 2 autres fragments. La ligation est faite avec 40 unités de T4 DNA ligase (Biolabs, Réf. 202S) ; elle est utilisée pour transformer des bactéries E. coli DH10B (Life Technology, Réf. 182979-010) qui sont étalées sur une boîte de LB additionnée d'ampicilline (le vecteur plasmidique contenu dans le fragment de 7392 pb contient en effet un gène de résistance à l'ampicilline). Après une nuit à 37 C la boîte présente 7 colonies qui sont utilisées pour produire les 7 minipreps correspondantes. Ces minipreps sont analysées par restriction enzymatique. Un seul clone présente le profil attendu, il est nommé pRCR-GaLV-1 (figure 3) et correspond à la séquence SEQ ID 11.

On retrouve dans le pRCR-GaLV-1 : le gène gag de pAMS provenant de virus MLV situé entre les nucléotides 1212 et 2828, le gène pol de pAMS provenant de virus MLV situé entre les nucléotides 2829 et 6428, une première partie de l'enveloppe amphotrope de pAMS provenant de virus MLV située entre les nucléotides 6368 et 6457, une partie de l'enveloppe de GaLV située entre les nucléotides 6458 et 8269 et une seconde partie de l'enveloppe amphotrope de pAMS située entre les nucléotides 8270 et 8332.

II/Etape 2 de la construction
Les tests réalisés avec le plasmide pRCR-GaLV-1 ont montré qu'il correspond à un génome viral donnant lieu à des protéines Gag et Pol fonctionnelles et à une enveloppe virale non fonctionnelle. Une petite région supplémentaire de l'enveloppe GaLV est ajoutée à pRCR-GaLV-1 pour construire pRCR-GaLV-2.

II-l-Production du fragment Nco I-Nco I de 1435 pb à partir du plasmide pRCR-GaLV-1.

Une PCR est réalisée sur le plasmide pRCR-GaLV-1 à l'aide des oligonucléotides 5 (SEQ ID 12), 6 (SEQ ID 13), 7 (SEQ ID 14) et 8 (SEQ ID 15).

Oligo 5 (reverse)
SEQ ID12 :
GGGTCATGGGCTGGTGGGGGTTCTTATTTTGCAGACTCGTCATCC
CTACTCCTAACAGGACTCC (64 mer)
6500- > 6437 pRCR-GaLV-2 (la séquence introduite avec cet oligonucléotide est soulignée)
Oligo 6 (sens)
SEQ ID 13
GTTAGGAGTAGGGATGACGAGTCTGCAAAATAAGAACCCCCACC
AGCCCATGACCCTCACTTGG (64 mer)
6445- > 6508 pRCR-GaLV-2 (la séquence introduite avec cet oligonucléotide est soulignée)
Oligo 7 (sens)
SEQ ID 14
CAACTGGCTCTAGAGACTGG (20 mer)

5908- > 5927 pRCR-GaLV-2
Oligo 8 (reverse)
SEQ ID 15
CCTTTCCTATGCACAACCCG (20 mer)
7553- > 7534 pRCR-GaLV-2
L'amplification est réalisée avec 40 ng du plasmide, 1 unité de la polymérase DyNazyme (Ozyme, Réf. F505L), 0,2 mM de dNTP, 0,5 LM de chaque oligonucléotide, 4% de DMSO dans un volume final de 50 Ill. Les conditions d'amplification sont les suivantes : 5 min à 91 C + 35* (1 min à 91 C +

45 sec à 60, 7 C + 1 min 30 sec à 72 C) + 10 min à 72 C. La PCR est réalisée avec le Mastercycler gradient (Eppendorf). Un aliquot du produit de la PCR est déposé sur un gel d'agarose à 1,5%, plusieurs bandes apparaissent présentant approximativement les tailles suivantes : 1.6, 1.1 et 0.6 kb. Le reste du produit de

la PCR est digéré 2 heures à 37 C par 20 unités de Dpn 1 (Ozyme, Réf. R0176L) 1 pour supprimer les éventuelles traces de matrice. Le produit de cette digestion est déposé dans un gel d'agarose à 1,0% et après la migration, les bandes de 1.1 et 0.6 kb sont découpées et extraites selon la méthode décrite à la fin du paragraphe I-1.

Ces 2 fragments correspondent respectivement aux amplifications réalisées par les oligonucléotides 6 et 8 (taille théorique de l'amplification 1108 pb) et par les oligonucléotides 5 et 7 (taille théorique de l'amplification 592 pb). Nous préférons ces 2 fragments à celui de 1.6 kb parce qu'ils contiennent forcément les 30 nucléotides qui doivent être intégrés par les oligonucléotides 5 et 6 alors que le fragment de 1.6 kb pourrait avoir été généré par les seuls oligonucléotides 7 et 8 et donc ne pas contenir ces 30 nucléotides. Une nouvelle PCR avec les seules amorces externes (oligonucléotides 7 et 8) est réalisée sur les fragments de 1.1 et 0.6 kb extraits du gel d'agarose.

L'amplification est réalisée avec 50 ng du fragment de 0.6 kb et 50 ng du

fragment de 1. 1 kb, 1 unité de la polymérase DyNazyme (Ozyme, Réf. F505L), 1

0,2 mM de dNTP, 0, 5 uM de chaque oligonucléotide, 4% de DMSO dans un volume final de 50 j-d. Les conditions d'amplification sont les suivantes : 4 min à

94 C + 35* (1 min à 94 C + 45 sec à 57, 8 C + 1 min 30 sec à 72 C) + 10 min à 72 C. La PCR est réalisée avec le Mastercycler gradient (Eppendorf). Un aliquot du produit de la PCR est déposé sur un gel d'agarose à 1,5%, la taille du fragment amplifié est correcte, environ 1.6 kb (taille théorique 1645 pb).

Une fi-action (20 ul) du produit de la PCR est alors digérée par 40 unités de l'enzyme Nco I. Cette digestion est déposée dans un gel d'agarose à 0,8% et le morceau de gel contenant le fragment PCR digéré (1435 pb) est récupéré. L'ADN

est extrait du gel d'agarose selon la méthode décrite à la fin du paragraphe 1-1.

1 11-2-Production du fragment Nco I-Nco I de 9959 pb à partir du plasmide pRCR-GaLV-1.

La digestion du plasmide pRCR-GaLV-1 avec l'enzyme Nco 1 génère 2 fragments de 1405 et 9959 pb. Cette digestion est réalisée avec de 10 ug de plasmide par 40 unités de l'enzyme Nco I. Après migration du produit de la digestion enzymatique dans un gel d'agarose à 0,8%, le morceau de gel contenant le fragment de 9959 pb est découpé avec un scalpel puis son ADN est extrait selon la méthode décrite à la fin du paragraphe 1-1.

11-3-Ligation des 2 fragments (Nco l - Nco Ide 1435 pb + Nco 1- Nco l de 9959 pb) et production du plasmide pRCR-GaLV-2 (figure 4).

Les 2 fragments à assembler sont quantifiés avec le kit PicoGreen (Molecular Probes, Réf. P-7589). Pour éviter que le fragment de 9959 pb, qui contient le gène de résistance à l'ampicilline) ne se ligue sur lui-même, il est déphosphorylé avant la ligation. La déphosphorylation est réalisée de la façon suivante : incubation 1 heure à 37 C du fragment d'ADN de 9959 pb avec 1 unité de SAP (Shimp alkaline phosphotase, Amersham Life Science, Réf. 70103) pour

5 pmol. La SAP est ensuite inactivée par une incubation de 15 minutes à 65 C. La ligation est réalisée avec une proportion de 1/6 du fragment de 9959 pb (qui contient le vecteur plasmidique) et de 5/6 du fragment de 1435 pb. Elle est faite avec 40 unités de T4 DNA ligase (Biolabs, Réf. 202S). Le produit de la ligation est utilisé pour transfonner des bactéries E. coli DHIOB (Life Technology, Réf.

182979-010) qui sont étalées sur une boîte de LB additionnée d'ampicilline (le vecteur plasmidique contenu dans le fragment de 9959 pb contient en effet un gène de résistance à l'ampicilline). Après une nuit à 37 C la boîte présente plusieurs dizaines de colonies qui sont analysées par PCR. Sur les 80 colonies analysées, 56 portent l'insert. Trois colonies positives sont sélectionnées pour la poursuite des expérimentations, les plasmides correspondants sont nommés : pRCR-GaLV-2-Cl, pRCR-GaLV-2-D1 et pRCR-GaLV-2-Hl.

B/Production du surnageant viral RCR-GaLV-2 1-Transfection des cellules.

Les lignées cellulaires humaines 293 et HT1080 sont transfectées avec les plasmides pRCR-GaLV-2-Cl, pRCR-GaLV-2-Dl et pRCR-GaLV-2-H1. Ces cellules sont cultivées dans du DMEM (Gibco BRL, Réf. 31966-021) contenant 10% de sérum de veau foetal (Hyclone, Réf. SH 30071.03) et 1% de pénicilline/streptomycine (Gibco BRL, Réf. 15070-063). Les cellules sont ensemencées la veille de la transfection en plaques 6 puits à raison de 6. 105 cellules/puits pour les cellules 293 et de 3. 105 cellules/puits pour les cellules HT1080. Les transfections sont réalisées au phosphate de calcium avec 4,2 ig de plasmide/puits.

2-Collecte du surnageant.

Les cellules transfectées sont maintenues en culture et la reversetranscriptase (enzyme produite par les rétrovirus ; la détection de cette enzyme

permet de mettre en évidence la présence de rétrovirus) est recherchée dans leur sumageant 3 semaines après la transfection. La veille du prélèvement de surnageant, le milieu de culture des cellules transfectées est changé. Le surnageant destiné à la mesure de reverse-transcriptase est filtré à 0, 45 um (Sartorius, Réf. 16555) et stocké à-20 C.

C/Caractérisation du surnageant viral RCR-GaLV-2 1-Mesure de l'activité reverse-transcriptase dans le surnageant des cellules transfectées.

La mesure de l'activité reverse-transcriptase est réalisée avec le mix suivant : Tris 50 mM pH 7,8 ; KC1 7,5 mM ; 5/lg/ml polyA ; 1,57 mg/ml oligodT ; 0, 05% NP40. Juste avant son utilisation, ce mix est additionné de 5 mM MnC12 et de 1 ml dTTp32/ml de mix. Ce mix final est distribué dans les puits d'une plaque 96 puits à raison de 25/lI/puits. A chacun des puits sont ajoutés 5 l de chacun des sumageants à tester. La plaque est alors incubée 1 heure à 37 C.

Après cette incubation, 7 d de chacun des puits sont déposés sous formes de spots sur du papier DE81 puis ce papier est séché dans une étuve. Le dépôt de 7 jj. l du contenu de chaque puits (au même endroit que le dépôt précédent) suivi du séchage du papier est renouvelé 2 fois de façon à déposer 21 J. l du contenu de chaque puits. Le papier DE81 est ensuite lavé 2 fois 5 minutes dans du SSC 2X à température ambiante puis 1 fois 1 à 2 minutes à l'éthanol absolu. Le papier est séché et mis en exposition dans une cassette durant la nuit. Le lendemain, la révélation de l'autoradiographie fait apparaître que le surnageant des cellules 293 transfectées avec les plasmides pRCR-GaLV-2-Cl ou pRCR-GaLV-2-H1 contient de la reverse-trancriptase.

D/Evaluation du tropisme du surnageant RCR-GaLV-2 et de son aptitude à servir de témoin positif pour la recherche de RCR dans les préparations de vecteurs MLV pseudotypés avec l'enveloppe GaLV.

Toutes les cellules utilisées dans le test de mobilisation sont cultivées dans du DMEM (Gibco BRL, Réf. 31966-021) contenant 10% de sérum de veau foetal (Hyclone, Réf. SH 30071.03) et 1% de pénicilline/streptomycine (Gibco BRL, Réf. 15070-063).

La lignée de mobilisation HT1080-pLHL a été constituée par infection de cellules 1 HT1080 avec le surnageant d'une lignée packaging amphotrope transfectées avec le vecteur de mobilisation pLHL (10) puis sélection des cellules avec de l'hygromycine B (Gibco BRL, Réf. 10687-010) puis clonage.

Les cellules HT1080-pLHL sont ensemencées en plaques 12 puits à raison de 6. 104 cellules/puits. Le lendemain ces cellules sont infectées, en présence de 8 ug/ml d'hexadimethrine bromide (Sigma, Réf. H-9268), avec des dilutions sérielles du témoin positif RCR-amphotrope (ATCC, Réf. VR-1450) ou par des dilutions sérielles du surnageant constitué suite à la transfection de cellules 293 avec le plasmide pRCR-GaLV-2-Cl (voir ci-dessus). La gamme de dilution du témoin RCR-amphotrope va de 2. 104 RCR/puits à 2 RCR/puits. Les mêmes dilutions sont effectuées pour le témoin RCR-GaLV ce qui permettra de comparer son titre avec celui du témoin RCR-amphotrope. Le lendemain de l'infection, le surnageant de chaque puits est supprimé et remplacé par du milieu de culture neuf. Le même jour des cellules indicatrices humaines, HCT116, et murines, Mus cluHi, sont ensemencées en plaques 12 puits à raison respectivement de 5. 104 et 5. 103 cellules/puits. Quatre jours après l'infection des cellules HT1080-pLHL, le surnageant de ces cellules est prélevé, filtré 0, 45 am et utilisé pour infecter les cellules indicatrices en présence de 8 u. g/ml d'hexadimethrine bromide (Sigma, Réf. H-9268). Le lendemain de cette infection, le surnageant de chaque puits de cellules HCT116 et lvfus dunni est supprimé et remplacé par du milieu de culture neuf additionné de 0,3 mg/ml d'Hygromycine B (Gibco BRL, Réf. 10687-010).

Ce changement de milieu de culture est renouvelé 2 fois par semaine pendant 3

semaines. Au bout des 3 semaines de sélection, le test est terminé et les cellules résistantes à l'hygromycine B sont identifiées.

Sur les cellules HCT116, infectables à la fois par l'enveloppe amphotrope et par l'enveloppe GaLV, la dernière dilution du témoin positif RCR-GaLV-2-C1 donnant des cellules résistantes à l'hygromycine B est la même que la dernière dilution du témoin positif RCR-amphotrope donnant des cellules résistantes à l'hygromycine B. Pour le témoin RCR-amphotrope, dont on connaît précisément le titre, cette dilution correspond à 20 RCR. D'après cette observation, le titre du témoin RCR-GaLV-2-C1 serait comparable à celui du témoin RCR-amphotrope, (titre de ce dernier témoin 3, 7. 106 particules infectieuses par ml).

Sur les cellules Mus dunni, infectables par l'enveloppe amphotrope mais pas par l'enveloppe GaLV, une seule colonie positive est observée pour la plus faible dilution du témoin positif RCR-GaLV-2-C1 alors que pour le témoin RCR-amphotrope une dilution 1000 fois plus forte (correspondant à 20 RCR) donne des cellules résistantes à l'hygromycine B.

D'après ce test de mobilisation on peut conclure que : - Le témoin RCR-GaLV-2-C1 est capable de mobiliser le vecteur pLHL (puisqu'on obtient des colonies résistantes à l'hygromycine B sur le cellules indicatrices HCT116).

- Le témoin RCR-GaLV-2-Cl n'aurait pas de problème de réplication, puisque son titre est comparable à celui du témoin RCR-amphotrope fabriqué par l'ATCC (d'après comparaison de la dernière dilution de chacun des témoins donnant un résultat positif lorsque le test de mobilisation est révélé sur des cellules indicatrices HCT116).

- Le témoin RCR-GaL V-2-Cl présenterait le même tropisme (spécificité d'infection) que l'enveloppe GaLV, en effet cette enveloppe permet l'infection des cellules humaines (exemple HCT116) mais pas, ou beaucoup moins, l'infection des cellules de souris (exemple Mus dunni).

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Claims

REVENDICATIONS

1/Plasmide chimère comprenant un génome rétroviral réplicatif caractérisé en ce qu'il contient : des séquences gag et pol provenant du génome d'un virus MLV, une séquence env chimère comprenant une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus MLV et une région correspondant à une partie de l'enveloppe provenant du génome d'un virus GaLV.

2/Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enveloppe du virus MLV présente un tropisme soit amphotrope, soit écotrope, soit polytrope, soit 10A1, soitxénotrope.

3/Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence gag code pour la polyprotéine gag correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 1, ou une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec la séquence SEQ ID 1.

4/Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence pol code pour les enzymes virales correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID 2, ou une séquence présentant au moins 80% d'homologie avec la séquence SEQ ID 2.

5/Plasmide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le virus MLV provient de la souche Moloney.

6/Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie de l'enveloppe du virus GaLV comprend au moins la région qui a pour fonction de définir le tropisme de l'enveloppe virale.

7/Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie de l'enveloppe du virus GaLV code pour la partie de la protéine env située entre les acides aminés No. 32 et No. 644 ("domaine ID3-GaLV") de la séquence SEQ ID 3 ou une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec le domaine ID3-GaL V.

8/Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que la partie A de l'env est un fragment d'enveloppe de virus GaLV issu de la souche SEATO.

9/Plasmide selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'enveloppe du virus MLV présente un tropisme amphotrope.

10/Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que la partie de l'enveloppe du virus MLV amphotrope est celle qui est nécessaire pour permettre, en association avec la région de l'enveloppe GaLV substituée, l'obtention de particules virales infectieuses.

11/Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que la partie de l'enveloppe du virus MLV amphotrope code pour les régions de la polyprotéine Env situées d'une part entre les acides aminés No. 1 et 31 domaine ID 3-ampho- 1 et d'autre part entre les acides aminés No. 645 et 676 domaine ID 3-ampho- 2 ) de la séquence SEQ ID 3 ou une séquence présentant au moins 70% d'homologie avec les domaines ID 3-ampho-1 et ID 3-ampho-2.

12/Plasmide selon la revendication 9, caractérisé en ce que la partie d'enveloppe amphotrope provient de la souche 4070 A.

13/Plasmide chimère comprenant le génome viral correspondant à la séquence nuc1éotidique SEQ ID 4 ou une séquence présentant au moins 60 % d'homologie avec la séquence SEQ ID 4.

14/Plasmide chimère correspondant à la séquence nuc1éotidique SEQ ID 5.

15/Bactérie productrice du plasmide objet de l'une des revendications 1 à 14.

16/Bactérie selon la revendication 15, caractérisée en ce qu'il s'agit d'E. coliDHIOB.

17/Lignée cellulaire exprimant le génome rétroviral contenu dans le plasmide chimère objet de l'une des revendications 1 à 14.

18/Lignée cellulaire selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'il s'agit de cellules humaines.

19/Lignée cellulaire, selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'il s'agit de fibroblastes.

20/Virion produit par une lignée cellulaire objet de l'une des revendications 17 à 19.

21/Virion contenant le génome viral correspondant à la séquence nuc1éotidique SEQ ID 4 ou une séquence présentant au moins 60 % d'homologie avec la séquence SEQ ID 4.

22/Utilisation du virion objet de l'une des revendications 20 ou 21 comme témoin positif dans un test destiné à détecter des RCR dans des préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV GaLV.

23/Test de mobilisation destiné à détecter des RCR dans des préparations de vecteurs rétroviraux du type MLV GaLV, et qui consiste : tout d'abord à infecter ou co-cultiver une lignée cellulaire permissive à l'enveloppe GaLV avec respectivement le vecteur rétroviral ou la lignée productrice à tester, ladite lignée permissive contenant un vecteur de mobilisation comprenant lui même un gène de résistance à un antibiotique donné, puis - à récupérer le surnageant de la culture ou co-culture pour le transférer sur des cellules indicatrices, également permissive à l'enveloppe GaLV et traitées par ledit antibiotique, à rechercher l'éventuelle résistance des cellules indicatrices à l'antibiotique, la résistance à l'antibiotique révélant la présence de RCR dans l'échantillon testé, - à conduire en parallèle le même test avec le témoin positif correspondant au virion objet de l'une des revendications 20 ou 21.

24/Kit pour la mise en ceuvre de test de mobilisation objet de la revendication 23, comprenant : - le virion objet de l'une des revendications 20 ou 21, - des cellules de mobilisation permissives à l'enveloppe GaLV, - les réactifs nécessaires.

25/Kit selon la revendication précédente, caractérisé en ce que les cellules permissives sont des cellules HT1080 ou HCT116.

26/Séquence env chimère codant pour la protéine env correspondant à la séquence d'acides aminés SEQ ID3 ou une séquence présentant au moins 70 % d'homologie avec la SEQ ID3.

MANDATAIRE : CABINET LAURENT ET CHARRAS

DEPOSANT : GENETHON III