WO2004092206A1 - 新規ペプチドおよび免疫賦活剤、機能性食品ならびに機能性食品の製造方法 - Google Patents

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WO2004092206A1
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pro
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Tadao Saito
Haruki Kitazawa
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Meiji Dairies Corporation
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a novel peptide having an immunostimulating effect, a novel immunostimulant, a functional food, and a method for producing a functional food.
  • the biggest enemy of healthy longevity is a group of diseases called "lifestyle-related diseases" such as cancer, stroke, 'heart disease', liver disease, kidney disease, and diabetes.
  • lifestyle-related diseases such as cancer, stroke, 'heart disease', liver disease, kidney disease, and diabetes.
  • lifestyle-related factors such as cancer, stroke, 'heart disease', liver disease, kidney disease, and diabetes.
  • Milk protein is not only an excellent source of nitrogen and essential amino acids among the major food proteins, but also promotes bone formation and bone resorption by promoting the absorption of nutrients such as minerals and vitamins.
  • a substance that has a regulating action that activates various functions of the living body such as a substance that has the effect of lowering blood cholesterol level, it is originally taken orally and works on the body in some way. It is designed.
  • Non- Patent Documents 1 and 2 Since Brantle et al. Reported in 1979 that digests of milk casein had obioid agonist activity, peptides with various biological activities were separated and identified from casein digests (non- Patent Documents 1 and 2). Opioid peptides, which are typical peptides derived from milk proteins, have been suggested to be involved not only in analgesic action in the body but also in regulation of intestinal peristalsis and gastrointestinal function. (Non-Patent Document 3).
  • angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide that exerts hypotensive action immunoregulatory peptide that activates macrophage phagocytic activity and immunostimulatory action, platelet aggregation inhibitory peptide, ileal contractile peptide Etc.
  • casein phosphopeptide which has calcium absorption promoting activity
  • s1-casein which has antihypertensive activity
  • milk casein is one of the factors that attracts attention.
  • Non-Patent Document 4 Many substances have been reported to induce chemotaxis of macrophages (Non-Patent Document 4), but those whose chemotactic factor is identified as a peptide component are represented by fMLP. It is a bacterial formylated peptide, a peptide obtained from human peripheral blood lymphocytes (Patent Document 1), and a chemically synthesized peptide made from a peptide library (Non-Patent Document 5). Ovalbumin fragments obtained from egg white are only known as the origin (Patent Document 2).
  • the present inventors aimed at providing a food that exerts a biological defense effect in the intestinal tract, and focused on the immunostimulatory ability of the milk protein component, and found that ⁇ -casein digestion was not achieved. Macrophage migration activity was found in the product, and the present invention was completed.
  • the peptide of the present invention is a novel peptide comprising the following amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the immunostimulant of the present invention comprises, as an active ingredient, a peptide having the following amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and the use of the present invention comprises the following amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 It is characterized in that the peptide is used as an immunostimulant.
  • the functional food of the present invention is characterized in that it contains an amount of 31-potency zein digest that substantially exerts the ability to induce macrophage chemotaxis.
  • the functional food of the present invention is characterized in that it contains an amount of a peptide having the following amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 which substantially exerts the ability to induce macrophage chemotaxis. Tyr—Pro-Val-Glu—Pro
  • the functional food of the present invention may be used in such an amount that the digestive enzyme in the living body produces a peptide having the following amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in an amount that substantially exerts the macrophage transit-inducing ability. It is characterized in that the ⁇ -casein 1118—119 residue bond in it is cleaved by digestive enzymes.
  • the method for producing a functional food according to the present invention comprises a step of digesting ⁇ -potency zein in a food with a digestive enzyme so as to include an amount of a peptide that substantially exhibits macrophage chemotaxis-inducing ability. It is characterized by having. In this case, it is preferable to include a peptide having the following amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the method for producing a functional food of the present invention comprises the step of preparing a peptide having the following amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in an amount such that the in vivo digestive enzyme substantially exerts the ability to induce macrophage chemotaxis. It is characterized in that it has a step of cleaving the / 3_casein 118-119 residue bond in food with an enzyme to such an extent as to cause the occurrence.
  • the method for producing a functional food of the present invention is characterized in that in the above-mentioned production method, actinase is used as a digestive enzyme.
  • FIG. 1 is a photograph showing the PVPF membrane after Giemsa staining.
  • FIG. 1A shows the entire PVPPF membrane, and
  • FIG. B shows the migrated cells observed under a microscope.
  • Figure 2 shows the induction of macrophage chemotaxis by various digestions of ⁇ _casein.
  • FIG. 3 shows SDS polyacrylamide electrophoresis diagrams after various enzyme digestions of / 3-casein.
  • Fig. A shows the electropherogram before enzymatic digestion
  • Fig. B shows the digest (3 kD or less).
  • FIG. 4 is a graph showing induction of macrophage-di-chemotaxis by fractions of various enzyme-digested ⁇ -casein having a molecular weight of 3 kD or less.
  • FIG. 5 shows the induction of chemotaxis of human peripheral blood monocytes by fractionation of various enzymatic digestions—casein with a molecular weight of 3 kD or less
  • Fig. 5A shows the purity of monosites by FACS CaliburTm
  • FIG. 1B is a micrograph showing cells migrated by the digestion with actinase E
  • FIG. 2C is a graph showing the number of cells migrated by the enzyme digest.
  • FIG. 6 is a graph showing the time-dependent change of macrophage chemotaxis expressed by casein E digestion of casein.
  • Figure 7 shows the fractionation of the macrophage chemotactic factor from the ⁇ -forced zine digest by anion exchange chromatography.
  • the upper panel shows the UV absorption and the lower panel shows the chemotaxis. It is a figure by the number of induced cells.
  • Fig. 8 shows the isolation and purification of macrophage chemotactic peptide by high performance liquid chromatography, and Fig. 8 shows the elution with 30% acetonitrile.
  • the lower panel shows the elution of the Q fraction, and FIG. B shows the chemotaxis by the Q1, Q2, and Q3 fractions.
  • FIG. 9 is a diagram of a checkerboard analysis of macrophage chemotactic peptide Q1.
  • FIG. 10 shows the calcium mobilities of macrophage chemotactic peptide Q1, in which the upper row shows a laser microscopic image of macrophages incorporating Ca, and the lower row shows macrophages.
  • FIG. 3 is a view showing a change in Ca uptake of phage.
  • FIG. 11 is a diagram showing the concentration of calcium flowing in macrophages caused by stimulation of macrophage chemotactic peptide Q1.
  • the present invention relates to a novel peptide that induces the chemotactic performance of macrophages.
  • the novel peptide according to the present invention has a Tyr-Pro-Val-Glu-Pro amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. (Hereinafter, the peptide is referred to as “/ 3-casochemotide”.)
  • This peptide corresponds to residues / 3—casein 114-118, and was isolated and identified as an opioid peptide—neocazomorphin (SEQ ID NO: 2: Tyr-Pro-Val-Glu -Pro-Phe, 3-Casein (corresponding to residues 114 to 119) with the C-terminal (Phe) deleted.
  • Power zokemotide is, for example, ⁇ -casein, various actinase (Ac hatase) typified by Actinase E (trade name, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the peptide is obtained by treating with a proteinase such as Papain, and in particular, by treating with actinase, the peptide can be obtained at a high yield.
  • This enzyme treatment does not require treatment under special conditions, and ordinary treatment conditions are selected. For example, optimum p H as shown in the following Table 1, Itaritekiba Ffa not limited by temperature optimum fi 1 erucic ⁇ under these conditions.
  • the peptide can also be obtained by chemical synthesis.
  • the functional food of the present invention includes a food with a health function (food for specified health use, a nutritional function food) and a food product advocating a physiological function, and has an amount of peptide that substantially exhibits macrophage chemotaxis-inducing ability. It contains.
  • the functional food is obtained, for example, by adding a peptide according to the present invention isolated or synthesized from a protein digest of ⁇ -casein to an intended food.
  • the enzymatic digest of ⁇ -casein may be added to the food as it is, so that the peptide contains an amount of peptide that substantially exerts macrophage chemotaxis-inducing ability during the food manufacturing process.
  • ⁇ -casein may be digested using a protein digesting enzyme.
  • raw milk is subjected to an enzyme treatment to produce a milk beverage, and raw milk subjected to the enzyme treatment is used as a raw material to produce milk products such as cheese and yogurt.
  • the protein digesting enzyme used is not particularly limited as long as it produces the desired digest (peptide), but is preferably actinase.
  • actinase AS for example, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
  • actinase AS for example, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.
  • binds 118-119 residue bonds in ⁇ -casein contained in food You may cut it off.
  • the 113-114 residue bond of ⁇ further further cut by indigenous digestive enzymes such as pepsin and trypsin.
  • indigenous digestive enzymes such as pepsin and trypsin.
  • the / 3-casein 113-114 residue bond in the food is cleaved in advance and the amount of macrophage chemotactic inducibility by the digestive enzymes in the body is substantially reduced.
  • Peptides may be generated.
  • the functional food of the present invention various foods can be considered in addition to the above-mentioned dairy products, and the kind and the like are not limited.
  • the present invention is suitable for foods containing a large amount of casein and / or foods made from foodstuffs containing a large amount of / 3-force zein.
  • the content of 8-casein is considered to be the amount that substantially exerts the ability to induce chemotacticity of macula phage, but the standard is about 0.01 to 10 mg per dose, preferably 0 It is about 1 to 5 mg.
  • the same / 3-force zein was treated with the other six proteases (-chymotrypsin, pepsin, sa-molysin, tribcine, protease 1, no, o-no, o-in). Using.
  • the enzyme digest obtained in the above (1) was subjected to ultrafiltration (3000 rpm, 4 ° C) with CENTRIPREP 3 (manufactured by Millipore) to obtain a fraction having a molecular weight of 3,000 or less.
  • digested products of ⁇ -casein having a molecular weight of 300000 or less obtained in (2) above digested with enzyme E, Sep-Pak TM PlusC 18 sodium chloride (War) was used as a C18 reverse phase carrier. After adsorbing on 1Tm, ion-exchanged water, 3 Ov / v% acetonitrile, 60 v / v% acetonitrile, and 9 Ov / v% acetonitrile were passed through 1 Om 1 each, and the eluted fractions from each solution were passed through. Got. Thereafter, acetonitrile was removed by a centrifugal evaporator, lyophilized, and stored at -20 ° C.
  • the 30 v / v% acetonitrile-eluted fraction obtained by the above (3) was subjected to mobile phase A (1 m 1) (solvent angle) using a Bio Logic chromatography system (manufactured by Biorad Laboratories, Inc.). The sample was subjected to ion exchange mouth chromatography under the following conditions.
  • Mobile phase B (5OmM phosphate buffer pH 6.0 containing 1M NaC1) Elution: After holding for 8 minutes in mobile phase A, raise mobile phase B linearly to 50% in 5 minutes, Thereafter, the mobile phase B was raised to 100% in 4 minutes. Flow rate: 5.0ml / min
  • Mobile phase B (60% acetonitrile containing 0.05v / v% TFA) Elution: After linearly increasing from 100% mobile phase A to 100% mobile phase B in 30 minutes, the mixture was kept in mobile phase B for 10 minutes.
  • the peak obtained in this operation is collected, separated, and adsorbed on a Sep-pak TM Plus C18 cartridge, which is a C18 reverse phase carrier, according to the method (3) above, followed by ion exchange.
  • TFA was removed by passing 1 Oml of water and 30% acetonitrile and collecting the eluted fraction of 30% acetonitrile. Furthermore, after removing acetonitrile by a centrifugal evaporator, the solution was freeze-dried and stored at 120 ° C.
  • the gel after electrophoresis was electroplotted on Immobilon-PSQ (manufactured by Millipore), which is a PV DF membrane, using a plotting device SEMI-PH0R TM (manufactured by Hefa Chemical Chemical Instruments). That is, laying two filter papers soaked in Western buffer (2 OmM Tris base, 200 mMGlycin / dH 2 0) in blotting apparatus, pulled out completely bubble. After shaking with 100% methanol for 5 minutes, a PVDF membrane soaked in Western buffer was placed on top, and a separation gel was placed on top of it. Two pieces of filter paper soaked with Western buffer were placed on the gel to completely remove bubbles, and then plotted at 80 mA for 2 hours. The PVDF membrane on which the protein was transferred was stained by shaking with Quick I CBB (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) for 5 minutes, and then the background was decolorized by shaking with 50% methanol. .
  • Immobilon-PSQ
  • a mouse-derived macrophage J774-1 strain (transferred from the Medical Cell Resource Center of the Tohoku University School of Medicine Aging Research Institute) was cultured in RPMI-1640 medium (containing 10% FCS) (manufactured by Sigma) for 10 passages. The experiment was used until the generation.
  • Macrophage J774-1 was cultured in RPMI-1640 medium (containing 10% FCS) (manufactured by Sigma) and washed with RPMI-1640 complete medium (containing 1% BSA) at the time of attachment. were prepared 0 6 cells / m 1.
  • Macrophage chemotaxis was measured according to the method previously reported by the present inventors (Int. J. Food Microbiol., 77, 29-38, (2002)). That is, the sample was diluted 2-fold with RPMI-1640 complete medium and placed in a lower well of a 48-well microchemotaxis chamber (manufactured by Europrobe) in 28 1 (triplicate). 25 x 80 thighs on this, 5.0 ⁇ 111? ⁇ After placing the PF membrane (manufactured by Neuroprobe), a rubber gasket and a lid were placed in this order, fastened with screws, and the macrophage suspension was dispensed in 50 1 portions into the upper well.
  • the front side of PVPF film that is, the cells were seeded side was washed with PB S (manufactured by Okisoi de Co.), the cells in the filter wiper (manufactured by Neuro Probe Inc.)
  • the PVPF membrane was stained with Giemsa using a wipe and a field staining solution (manufactured by Mutoh Chemical). Under microscope The number of macrophages that migrated at a magnification of 200 times was counted in 10 visual fields per sample, and the average number of migrated cells (high power field; HPF) was calculated.
  • MiniMACS force ram (RS +, manufactured by Miltenyi Biotec GmbH) by magnetic cell separation system (hereinafter called “MACS”) (manufactured by Miltenyi Biotec GmbH) After cells (monocytes) was separated.
  • the separated mode Nosaito is obtained by counting the number of viable cells was determined semi Ji Monosai Bok chemotaxis in the methods of the 3. macrophage chemotaxis test (2).
  • the purity of human peripheral blood monosite isolated according to (1) above was determined by FACS Calibur TM flow. cytometer CFACS; manufactured by Becton Dickinson). That is, 1 ml of FACS washing buffer (2% FCS ⁇ 0.02% NaN 3 / PBS) was added to the monosites separated by MACS, washed by pipetting, and centrifuged (3200 rpm, 3 min ⁇ 4. The supernatant was removed by C). After repeating this operation three times, 10 ⁇ 1 of a biotin-labeled mouse anti-human CD11 bMAC-1 antibody (manufactured by Pharmingen) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C. for 15 minutes in the dark.
  • FACS washing buffer 2% FCS ⁇ 0.02% NaN 3 / PBS
  • the chemotaxis of human peripheral blood monocytic cells was determined using ultrafiltration (1. Peptide preparation (2) above) as a test sample and the fraction obtained from RPMI_1640 complete medium (containing 1% BSA) at 1 mgZ '. Using a sample diluted to a concentration of m 1, measurement was carried out using a 48-well microchemotaxis chamber according to 3. Macrophage chemotaxis test (2) above.
  • the macrophage chemotactic factor is a chemokinetic factor (activator induces cell movement at random, non-directional) or a chemotactic factor (directional) 9 Check as shown in the figure. Carbide analysis was performed. In other words, cells prepared by diluting the active peptide obtained in the above 1. Peptide preparation (5) to various concentrations are placed in the well below the Chemotaxis chamber, and the cells prepared using the chemotactic factor dilution in the upper well. The suspension was put. Next, the chemotaxis of macrophages was measured according to the above-mentioned macrophage chemotaxis test (2).
  • Fluo-3AM (0.8 mM) dissolved in dimethylsulfoxide (DMSO, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added in 5 z portions, and the solution was added at 5 ° C. 2 at 37 ° C. After incubation for 2 hours, the plate was washed twice with RPM1-1640 complete medium, and a drop was made again with RPMI-1640 complete medium.
  • the Ca flux was measured using a laser microscope, and when the Fluo-3 AM intensity was stabilized, ionomycin, EGTA, fMLP or the above prepared in the same manner as in 10. Ca ion concentration measurement below. 1.
  • the change in luminance was graphed by adding 5 ⁇ 1 to the active fraction obtained in peptide adjustment (5;).
  • Macrophage suspension (1 ⁇ 10 6 cells / ml) 0.8 mM Fluo-3 in 1 ml
  • A (manufactured by Molecular Probes) was added in an amount of 5 zl, and the mixture was incubated in a thermostat at 37 ° C for 30 minutes. After centrifugation (1500 rpm, 5 min, 4 ° C), remove the supernatant and remove 5% 1 ml of RPMI-1640 containing FCS was added and resuspended.
  • Negative sample measurement The incubated cell suspension was set on a FACS, taken up for about 10 seconds, then removed, and lysed with RPMI-1640 at 6 mM: EGTA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (Manufactured by Co., Ltd.) was added in an amount of 500 ⁇ l, and quickly reset. During this work, data acquisition was continued.
  • the number of migrating cells per visual field was counted using a light microscope at a magnification of 200 times.
  • protease K As compared with the control, protease K :, actinase E, and the degradation products of They migrated about 6.8-fold, 4.3-fold, and 4.0-fold more, and a significant difference was observed (Fig. 2).
  • C and S indicate the undigested enzyme and the digested enzyme, respectively.
  • * Indicates that the difference was significant at the 5% significance level, and ** indicates that the difference was significant at the 1% significance level. means.
  • the result is the average cell number in the HPF10 field.
  • FIGS. 3B and 3A The results of subjecting this low molecular weight peptide and the peptide before ultrafiltration to SDS-PAGE are shown in FIGS. 3B and 3A, respectively.
  • Figures 1 and 10 are molecular weights
  • 2 is ⁇ -chymotrypsin digest
  • 3 is pepsin digest
  • 4 is thermolysin digest
  • 5 is trypsin digest
  • 6 is proteinase digestion.
  • 7 shows the digest of actinase
  • 8 shows the digest of papain
  • 9 shows the undigested ⁇ -casein.
  • the band of angle-forming peptides formed by ⁇ -chymotrypsin and trypsin was extremely reduced after ultrafiltration.
  • no band of the peptide produced by degradation by actinase was detected before or after ultrafiltration.
  • the macrophage chemotaxis was measured for fractions having a molecular weight of 300,000 or less of various enzymatically degraded peptides.
  • the fractions degraded by proteases, actinase E, and papain were compared with the controls.
  • the HPF values were about 5.5-fold, 5.8-fold and 5.1-fold, respectively, indicating a significant difference in the number of migrated macrophages (FIG. 4).
  • Fig. 4 In the figure, * indicates that there was a significant difference at the 5% significance level. The result is the average cell number in the HPF 10 field.
  • actinase E was an effective enzyme for inducing chemotactic peptides for both macrophages derived from mice and monosites derived from humans.
  • the induction of chemotaxis in degraded peptides by actinase E was Changes over time were examined.
  • a significant difference was observed in the number of migrating macrophages at 3 hours or more, about 1.6 times at 3 hours and 6 hours, about 2.5 times at 12 hours, and 2 times at 2 hours.
  • At 4 hours about 3.5 times of macrophages migrated, and the chemotactic activity tended to increase with time. From these results, it was found that actinase E is preferable for the degradation of / 3-casein, and it is better to react at 37 ° C for 24 hours. In the following, tests were performed on digests obtained under these conditions.
  • the molecular weights of Q1, Q2, and Q3 fractionated by high performance liquid chromatography were 604, 523, and 751, respectively.
  • the array was obtained.
  • the intracellular Ca 2t fluidity was measured with a laser microscope using a laser indicator ⁇ 1110-330 ⁇ .
  • F MLP known as a potent chemotactic peptide
  • Its activation mechanism in macrophages is that when a chemoattractant binds to its receptor, Ca ions are released from storage organs via inositol phosphate metabolism, and signaling activates adhesion factors such as MacI. It is thought that it will begin to run.
  • chemotactic factors typified by chemokines exert their activity through G protein-related seven transmembrane receptors.
  • the chemotactic peptide Q 1 is a concentration-dependent manner C a flux was observed, significant peak was obtained at 1 X 1 0- 3 M concentration (first 0 FIG lower left panel).
  • the f MLP used as a control lower right figure in the figure. Therefore, when the intracellular Ca concentration was actually measured by tip-cytometry, the intracellular Ca concentration was found to be only about 6 2 At 0 nM, f MLP is about 170 nM, comparable to control, Supporting data from laser microscopy (Fig. 11), it is thought that / 3-force zokemotide may act on macrophages via a receptor different from f MLP.
  • f MLP Ca 2+ fluidity
  • ⁇ -casein may recognize the same receptor as fML ⁇ , but knowledge of its chemotactic peptide sequence and expression of chemotaxis through the receptor different from fMLP
  • the peptide of the present invention is a novel inducer that enhances macrophage chemotaxis.
  • the one-stroke zokemotide of the present invention is a pennin peptide (YPVEP) composed of five amino acids, its steric structure is difficult to change and its chemotaxis is also obtained by HPLC fractionation under high pressure. It can be easily separated without losing the inducibility.
  • the bond between residues 113 (Lys) and 114 (Tyr) of ⁇ -peptide is cleaved with pepsin and trypsin, and the bond between 119 (Phe) and 120 (Thr) is It has been shown to be cleaved by chymotrypsin (Yunden Jinsmaa et al., Peputides, 20, 957-962 (1997)). Therefore, the peptide of the present invention, / 3-force zokemotide, is presumed to not undergo further enzymatic degradation because it is shorter, and can be sufficiently used for oral administration.
  • the peptide is a novel peptide that induces macrophage motility and exhibits an immunostimulatory function.
  • the 118-119 residue bond of / 3-casein is decomposed in advance with Actinase AS (for example, manufactured by Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) approved by the Ministry of Health, Labor and Welfare as a food additive.
  • the peptide can also be produced by digestion of these ingested degradation products.
  • the present invention provides a novel peptide that enhances macrophage chemotaxis.
  • This peptide is highly safe because it is obtained by degrading ⁇ -casein contained in dairy products and other foods with evening digestive enzymes such as actinase E. Then, use the peptide directly or in the digestive tract.
  • a new functional food utilizing an immunostimulatory function of a food-derived component is provided by pre-enzymatically treating the food as described above.

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Abstract

　本発明は腸管内で生体防御作用を発揮する食品を提供することを目的とする。本発明の新規ペプチドは、マクロファージ走行性誘導活性を有し、Tyr−Pro−Val−Glu−Proのアミノ酸配列からなる。このペプチドは牛乳タンパクの一種であるβ−カゼインをアクチナーゼＥ等による酵素処理により得ることができ、マクロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量のペプチドを種々の食品に含有させる。また、生体内の消化酵素によって当該ペプチドを生じさせる程度に、食品中のβ−カゼインの１１８−１１９残基結合を予め消化酵素により切断しておく。

Description

明 細 書
新規べプチドおよび免 賦活剤、 機能性食品ならびに機能性食品の製造方法 技術分野
本発明は、 免疫腑活作用を有する新規ペプチドおよび新規な免疫賦活剤、 機能性 食品ならびに機能性食品の製造方法に関する。
背景技術
日本は平均寿命 8 0年という世界有数の長寿国になったが、 誰もが健康的な長寿 をまっとうできるとは限らない。 健康長寿の最大の敵は、 がん ·脳卒中 '心臓病 '肝 臓病 ·腎臓病 ·糖尿病などの 「生活習慣病」 といわれる病気群である。 これは、 生活 習慣に着目した生活習慣病という概念を新たに導入しょうという狙いから、 従来の加 齢に注目した「成人病」 にかわって、平成 8年 1 2月に、 旧厚生省「公衆衛生審議会」 が提唱したものである。 この 「生活習慣病」 の発症と進行には、 生活習慣要因 ·遺伝 要因 ·外部環境要因の 3つの要因が関わっているが、 生活習慣が基礎にある多くの病 気は予防が可能であり、 日常の食生活を改善することによって発病を予防するという 一次予防の重要性が注目されている。
本来、 食品の機能としては、 生命活動を維持するための各種栄養成分の補給とし ての栄養機能 (一次機能）と、 おいしく感じて食べる嗜好感覚機能 (二次機能)があると されてきた。 すなわち、 おいしくて栄養源として優れているものが優れた食品とされ ていた。 ところが、 1 9 8 0年代に、 生体防御機能や病気の予防と回復などに関与す る栄養成分が発見され、 これまでの一次と二次機能に加えて重要な第三の機能として 体の働きを調節する機能、 すなわち免疫力の強化や調節、 各種ホルモン分泌調整、 老 化の抑制など種々の生体調節機能を有する成分が含まれている食品の生理機能カヾ注目 されるようになった。
牛乳タンパク質は、 主要な食品タンパク質の中でも、 窒素や必須アミノ酸の優れ た供給源となるばかりでなく、 ミネラルやビタミンなどの栄養素の吸収を促進するも の、 骨形成促進および骨吸収抑制作用を持つもの、 血中コレステロールレベルの低下 作用を持つもののように、 生体の様々な機能を活発化させるような調節作用を発揮す るものなど、 本来経口的に摂取され、何らかのかたちで身体に働きかけるように設計 されている。
1 9 7 9年、 Brantleらが牛乳カゼィンの消化物がオビオイドアゴニスト活性を持 つ旨報告をして以来、 カゼィン消化物から種々の生物活性を有するぺプチドが分離 · 同定されてきた (非特許文献 1 , 2参照)。 乳タンパク質から誘導される代表的なぺプ チドであるォピオイドペプチドは、 体内での鎮痛作用ばかりでなく、 腸管の蠕動運動 や消化管機能の調節に関与する可能性カヾ示唆されている (非特許文献 3 )。 他にも、血 圧降下作用を発揮するアンジォテンシン I変換酵素阻害べプチド、 マクロファージ貪 食能の活性化作用や免疫促進作用をもつ免疫調節べプチド、血小板凝集阻害べプチド、 回腸収縮べプチドなどが知られている。 それらのぺプチドの中でもカルシウム吸収促 進活性を持つカゼィンホスホぺプチドゃ血圧降下活性を持つ s 1—カゼィンの 2 3 〜 3 4残基域のぺプチドは、 特定保健用食品としてすでに利用されるまでに至ってお り、牛乳カゼィンの新たな利用分野が注目される一因となっている。
しかしながら、 生体の免疫賦活化を誘導し、 生体防御への寄与を狙った食品は未 だ開発されていない。 免疫機能の活性化を表す指標としては、 様々なものがある力^ その中の 1つとしてマクロファージ機能の誘導に関わる走化性力挙げられる。 走化性 因子による遊走は、 免疫応答に重要なマクロファージの機能の 1つであり、 腸管内走 化性因子により刺激されたマクロファージは腸管にお 、て感染部位へ遊走し病原体を 殺傷すると考えられている。 すなわち、 腸管内の生体防御において、 マクロファージ の病原体への遊走は非常に重要な役割を担っていると言える。
マクロファージの走化性を誘導する物質はこれまでにも数多く報告されているが (非特許文献 4 )、 ペプチド成分で走化性因子が同定されているものは、 f ML Pを代 表とする細菌由来のフオルミル化されたぺプチドゃ、 ヒト末梢血リンパ球から得られ たべプチド (特許文献 1 )、ぺプチドライブラリ一から作られた化学合成べプチド (非特 許文献 5 )だけであり、食品由来のものとしては卵白から得られるオボアルブミンフラ グメン卜が知られているにすぎない （特許文献 2 )。
【特許文献 1 ]
特開平 9—2 2 7 5 9 2号 第 2〜9頁
【特許文献 2】
特開平 9 一 1 2 4 7 0号 第 2〜3頁
【非特許文献 1】
ブラントル (V. Brantl)ら，「生理化学」（Hoppe-Seyler' s Z. Physiol. Chem. ), 1 9 7 9年， 第 1 3 6 0号， . 1 2 1 1 - 1 2 1 6
【非特許文献 2】
ェジ一ンズ（Agnes Henschen)ら， 「生理化学」 （Hoppe- Seyler' s Z. Physiol. Chem. ) , 1 9 7 9年， 第 1 3 6 0号， p . 1 2 1 7 - 1 2 2 4
【非特許文献 3】
金丸義敬， 「牛乳'乳成分の新しい機能（タンパク質)」， 乳業技術， 2 0 0 0 年， 第 5 0巻， ρ · 2 2 - 3 7
【非特許文献 4】
義江修ら著、 「ケモカインハンドブック」 , 2 0 0 0年， p . 1 2 I：非特許文献 5】
インイン（Yirigying Le) ¾, 厂免疫学」 （Journal of Immunology), 1 9 9 8 年， 第 1 6 3巻， p . 6 7 7 7— 6 7 8 4
そこで、 本発明者らは、 腸管内で生体防御作用を発揮する食品を提供することを 目的とし、 乳タンパク成分の免疫賦活化能に注目して鋭意努力したところ、 β—カゼ ィンの消化物にマクロファージ遊走活性を見出し、 本発明を完成するに至った。
発明の開示
本発明のぺプチドは、 配列番号 1で示される次のァミノ酸配列からなる新規ぺプ チドである。
Tyr-Pro-Val-Glu-Pro
本発明の免疫賦活剤は、 配列番号 1で示される次のァミノ酸配列を有するぺプチ ドを有効成分とし、 本発明の用法は、 配列番号 1で示される次のァミノ酸配列を有す るべプチドを免疫腑活剤として使用することを特徴としている。
Tyr-Pro-Val-Glu-Pro
本発明の機能性食品は、 マクロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量の 3 一力ゼィン消化物を含有することを特徴としている。
また、 本発明の機能性食品は、 マクロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する 量の配列番号 1で示される次のァミノ酸配列を有するぺプチドを含有することを特徴 としている。 Tyr— Pro - Val - Glu— Pro
さらに、 本発明の機能性食品は、 生体内の消化酵素がマクロファージ走行性誘導 能を実質的に発揮する量の配列番号 1で示される次のアミノ酸配列を有するぺプチド を生じさせる程度に、 食品中の ^一カゼイン 1 1 8— 1 1 9残基結合が消化酵素によ り切断されていることを特徴としている。
Tyr - Pro -Val -Glu- Pro
本発明の機能性食品の製造方法は、 マクロファ一ジ走化性誘導能を実質的に発揮 する量のぺプチドが含まれるように、 食品中の β—力ゼィンを消化酵素により消化す る工程を有することを特徴としている。 この場合において、 配列番号 1で示される次 のアミノ酸配列を有するぺプチドが含まれるようにするのがよい。
Tyr― Pro—Val— Glu— Pro
さらに、 本発明の機能性食品の製造方法は、 生体内の消化酵素がマクロファージ 走化性誘導能を実質的に発揮する量の配列番号 1で示される次のァミノ酸配列を有す るペプチドを生じさせる程度に、 食品中の /3 _カゼイン 1 1 8— 1 1 9残基結合を消 化酵素により切断する工程を有することを特徴としている。
Tyr -Pro -Val -Glu -Pro
また、 本発明の機能性食品の製造方法は、 上記製造方法において、 消化酵素とし てァクチナ一ゼを用いることを特徴としている。
図面の簡単な説明
第 1図は、 ギムザ染色後の P V P F膜を示す写真であって、 同図 Aは P V P F膜 全体を、 同図 Bは顕微鏡観察された遊走細胞を示す。
第 2図は、 β _カゼィンの各種 消化によるマクロファージ走化性の誘導を示 す図である。
第 3図は、 /3—カゼインの各種酵素消化後の S D Sポリアクリルアミ ド電気泳動 図であって、 同図 Aは酵素消化前の泳動図、 同図 Bは消化物（3 k D以下)の泳動図で ある。
第 4図は、 各種酵素消化^一カゼインの分子量 3 k D以下の画分によるマクロフ 了―ジ走化性の誘導を示す図である。
第 5図は、 各種酵素消化 —カゼィンの分子量 3 k D以下の画分によるヒト抹消 血単球の走化性の誘導を示す図であって、 同図 Aは FACS CaliburTmによるモノサイト の純度を示す図、同図 Bはァクチナ一ゼ E消化物により遊走した細胞を示す顕微鏡像、 同図 Cは酵素消化物により遊走した細胞数を示す図である。
第 6図は、 —カゼインのァクチナ一ゼ E消化により発現するマクロファージ走 化性の経時的変化を示す図である。
第 7図は、 β—力ゼィン消化物からの陰ィォン交換ク口マトグラフィ一によるマ クロファ一ジ走化性因子の分画を示す図であって、 上段は紫外吸収による図、 下段は 走化誘導された細胞数による図である。
第 8図は、 マクロファージ走化性べプチドの高速液体ク口マトグラフィ一による 単離 ·精製を示す図であって、 同図 Α上段は 3 0 %ァセトニ卜リルによる溶出を示す 図、 同図 A下段は Qフラクションの溶出を示す図、 同図 Bは Q l、 Q 2、 Q 3フラク ションによる走化性を示す図である。
第 9図は、マクロファージ走化性ぺプチド Q 1のチヱッカーボ一ド解析図である。 第 1 0図は、 マクロファージ走化性ペプチド Q 1のカルシウム流動性を示す図で あって、 上段は C aを取り込んだマクロファージのレ一ザ一顕微鏡像、 下段はマクロ ファージの C a取り込みの変化を示す図である。
第 1 1図は、 マクロファージ走化性ペプチド Q 1の刺激によるマクロファージ内 で流動するカルシゥム濃度を示す図である。
本発明を実施するための最良の形態
本発明は、 マクロファージの走化性能を誘導する新規べプチドに関するもので、 本発明に係る新規べプチドは、配列番号 1で示される Tyr— Pro— Val— Glu— Proのァミ ノ配列を有する（以下、該ペプチドを 「/3—力ゾケモチド（ — casochemotide)」 と称 する。 ）。 このペプチドは、 /3—カゼイン 1 1 4〜1 1 8残基に相当するものであり、 ォピオイドぺプチドとして単離同定された —ネオカゾモルフイン (配列番号 2 ： Tyr - Pro - Val - Glu - Pro - Phe, 3—カゼインの 1 1 4〜1 1 9残基に相当）の C末端 (Phe)が欠損したものである。
/3—力ゾケモチドは、例えば^一カゼインを、ァクチナ一ゼ E (販売名、科研製薬 (株)製）に代表される各種ァクチナ一ゼ (Ac廿 nase)ゃノ、。パイン (Papain)などの蛋白消 化酵素で処理することにより得られ、 特にァクチナ一ゼで処理することによつて高収 率で当該ペプチドが得られる。 この酵素処理は、 特別な条件下で処理を行う必要はな く、 通常の処理条件が選択される。 例えば、 下記表 1に示すような至適 p H、 至適バ ッファー、 至適温度にて fi1えるカ^ この条件下に制限されない。 また、 当該ペプチド は化学合成によっても得ることができる。
このものは、 マクロファージ走化性を誘導する作用を有し、 免疫賦活剤として応 用できる。 /3 _カゾケモチドは、 牛乳等中の^一カゼインを利用して得られ、 牛乳ァ レルギ一を引き起こすアレルゲン中に該ぺプチドと同じ配列を有するものはないので、 その安全性は高！/、と考えられる。 本発明の機能性食品には、 保健機能食品 （特定保健用食品、 栄養機能食品） や生 理機能を標榜した食品カヾ含まれ、 マクロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量 のペプチドを含有する。 該機能性食品は、 例えば、 ； δ—カゼインの蛋白消化物から単 離されあるいは合成された本発明に係るぺプチドを、 目的とする食品に添加して得ら れる。 また、 ^—カゼインの酵素消化物をそのまま食品中に添加してもよく、 食品の 製造工程中にて、 マクロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量のぺプチドが含 まれるように、 蛋白消化酵素を用いて^—カゼインを消化させてもよい。 例えば、 原 乳に酵素処理を行って乳飲料を製造する、 酵素処理を行った原乳を原材料としてチ一 ズ、 ヨーグルトなどの乳製品を製造することカ 示される。 用いられる蛋白消化酵素 は目的とする消化物 (ぺプチド)を産生する限り特に限定されるものではないが、 好ま しくはァクチナ一ゼである。
また、 食品添加物として認められているァクチナ一ゼ A S (例えば科研製薬 (株） 製)などで分解して、食品中に含まれる ^一カゼイン中の 1 1 8— 1 1 9残基結合を切 断しておいてもよい。 そして、 この食品力摂取されると、 例えばペプシンやトリプシ ンなどの常在性の消化酵素によってさらに^一力ゼィンの 1 1 3 _ 1 1 4残基結合が 切断され、 本発明のペプチドが体内にて産生される。 このように、 食品中の /3—カゼ イン 1 1 3— 1 1 4残基結合をあらかじめ切断しておき、 体内の消化酵素によってマ クロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量のぺプチドを生じさせてもよい。
本発明の機能性食品には、 上記した乳製品以外にも種々の食品カ考えられ、 その 種類等は限定されない。 消化酵素による処理工程を加えることを考慮するならば、 本 発明は、 —カゼインを多く含む食品や /3—力ゼィンを多く含む食材を原材料にした 食品に好適である。 ;8—カゼィンの含有量はマク口ファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量とさ れるが、 その目安は 1回摂取量中 0. 0 1〜 1 0 m g程度、 好ましくは 0 · 1〜 5 m g 程度である。
【実施例】
次に、 本発明について以下の実施例に基づいてさらに詳細に説明する。
1. ペプチドの調整 (1 ) —カゼインの酵素分解
/3—カゼィン 1 0 nig (シグマ社製）を、 Amharらの方法 (J. Dairy Science, 81, 3131 — 3138(1998))の方法に従い、表 1に示す至適バッファー 1 0 m 1で溶解し、ァクチナ —ゼ E 0. 5mgを加えて 5%C02、 至適温度で 24時間反応させた。 反応後、 直ち に沸騰水中で 1 0分間加熱して酵素を失活させた後、水冷し、試験試料とした。なお、 参考例として、同じ /3—力ゼィンを他の 6種のプロテアーゼ（ —キモトリプシン、ぺ プシン、サ一モリシン、 トリブシン、プロテア一ゼ1 、ノ、 °ノ、°イン）で処理したものを用 いた。
【表 1】 酵素 ノ ッファー pH 温度 (°c) α-キモトリプリン 0.02Μ CH3C00NH4 7.0 25
ペプシン 0.05M HCI 2.0 25
サ一モリシン 0.02M Tris-HCI* 7.0 37
トリブシン 0.02M Tris-HCI* 7.0 37
プロテアーゼ Κ 0.02M Tris-HCI* 7.0 37
ァクチナ一ゼ Ε 0.02M Tris-HCI* 7.0 37
パパイン 0.02M Sodiumphosphate 7.0 37
* 1 0 mMC a C I 2を含む (2)限外濾過
上記（ 1 )で得られた酵素消化物を CENTRIPREP 3 (ミリポア社製)で限外濾過（ 3 0 0 0 r pm、 4°C)して、 分子量 3 000以下の画分を得た。
(3)C18逆相担体による分画
上記（2)で得られた分子量 3 00 0以下の^ -カゼイン酵素消化物のうちァクチ ナ一ゼ Eによる消化物を、 C18逆相担体である Sep- PakTMPlusC18力一トリッジ（ウォー タ一ズ社製）に吸着させた後に、イオン交換水、 3 Ov/v%ァセトニトリル、 6 0v/v% ァセトニトリル、 9 Ov/v%ァセトニトリルをそれぞれ 1 Om 1通し、各溶液による溶 出画分を得た。 その後、 遠心エバポレーターによってァセトニトリルを除去した後、 凍結乾燥し、 _ 2 0 °Cで保存した。
( 4 )ィォン交換ク口マトグラフィ一による活性成分の分画
上記（ 3 )によって得られた 3 0 v/v%ァセトニトリル溶出画分を移動相 A ( 1 m 1 )ίこ溶角军させヽ Bio Logic chromatography system (ノ ィオラド ラボラ卜リ一社製) により以下の条件でイオン交換ク口マトグラフィ一に供した。
く陽ィォン交換ク口マトグラフィ一条件 >
カラム ： HiTrap™ SP HP (アマシャム ファルマシァ バイォテック A B社製） 溶媒：移動相 A(5 OmMリン酸緩衝液 pH 6. 0)
移動相 B(lMN a C 1を含む 5 OmMリン酸緩衝液 pH 6. 0) 溶出 ：移動相 Aで 8分間保持した後、 5分間で移動相 Bを 5 0%まで直線的 に上昇させ、 その後 4分間で移動相 Bを 1 0 0 %まで上昇させた。 流速 : 5. 0m l /min
分取： 1. 0m l /fraction 温度：室温
検出： 214 nm
く陰イオン交換クロマトグラフィー条件〉
カラム ： HiTrap™ Q HP (アマシャム フアルマシア バイオテック A B社製）
溶媒：移動相 A(2 OmMトリスー塩酸緩衝液 (pH8.2))
移動相B(lMNa C 1を含む 20 mMトリスー塩酸緩衝液（ p H 8.
2))
溶出：移動相 Aで 8分間保持した後、 5分間で移動相 Bを 50%まで直線的 に上昇させ、 その後 4分間で移動相 Bを 100%まで上昇させた。 流速： 5. Om l /min
分取： 1.0m l /fraction
温度：室温
検出： 214 nm
( 5 )高速液体クロマトグラフィ一による活性べプチドの分析および単離 ·精製 上記（ 4 )で得られた活性画分（陰イオンクロマトグラフィ溶出フラクション N 0. 42〜46)をイオン交換水に溶解し、逆相（reversed- phase、以下 RP)モードでの高 速液体クロマトクラフィ一 (High- performance liquid chromatography、以下 H PLC) により分析および分取を行つた。
く RP— HP L C条件 >
カラム ： Mightysil RP-18 GP(5 /zm, 4.6 x 150mm、 関東化学社製） 溶媒：移動相 A(0.05v/v%TFAを含む 30%ァセトニトリル）
移動相 B(0.05v/v%TFAを含む 60%ァセトニトリル） 溶出： 30分間で移動相 A 100 %から移動相 B 100 %に直線的に上昇さ せた後、 移動相 Bで 10分間保持した。
流速： 0.5m l /min
温度： 40。C
検出： 214 nm
本操作で得られたピ一クにっし、て分取して、 上記（ 3 )の方法に準じ C 18逆相担体 である Sep— pakTMPlus C 18カートリッジに吸着させた後に、 イオン交換水、 30%ァ セトニトリルをそれぞれ 1 Om l通し、 30%ァセトニトリルの溶出画分を回収する 事で TFAを除去した。 さらに、 遠心エバポレーターによってァセトニトリルを除去 した後、 凍結乾燥し、 一 20°Cで保存した。
2. 電気泳動分析
上記べプチドの調整（1)および（2)において得た各フラクション 100 1に S D S化試薬を 100 / 1加え、 85°Cで 2分加熱することにより SDS化した。 SD S化したサンプルは 1レーンあたり 1 <d μ 1をアプライし、 125Vの定電圧により 泳動した。なお、ゲルは 4.75%濃縮ゲル、 20%分離ゲルを用い、分子量マーカ一 としてペプチド分子量マ一カー 「第一」 （第一化学薬品 (株)製)および precision prestained standard (パ、ィオラド ラボラトリ一社製）を用いた。 泳動後のゲルは PV D F膜である Immobilon-PSQ(ミリポア社製）にプロッティング装置 SEMI- PH0R™ (へフ ァ一理化学機器社製)を用いてエレクトロプロッティングした。 すなわち、 Western buffer( 2 OmM Tris base、 200 mMGlycin/dH20)で浸した 2枚の濾紙をブロッ ティング装置に敷き、 完全に気泡を抜いた。 その上に、 1 00%メタノールで 5分間 振盪した後 Western bufferで浸した P V D F膜を載せ、 その上に分離ゲルを載せ、 Western bufferで浸した 2枚の濾紙をゲルの上にかぶせて完全に気泡を抜 、た後、 8 0 mAで 2時間プロッティングを行った。タンパク質カ 云写された P VD F膜は Quick 一 CBB (和光純薬工業 (株)製)により 5分間振盪して染色した後、 50 %メタノ一ルで振 盪することによってバックグラウンドを脱色した。
3. マクロファージ走化性試験
(1)マクロファージの調製
マウス由来マクロファ一ジ J 774— 1株 (東北大学医学部加齢研究所付属医用 細胞資源センタ一より譲渡)を、 RPMI - 1640培地（10%FCS含有)（シグマ 社製)で培養し、 10継代目まで実験に供した。
( 2 )マクロファージ走化性の測定
i )マクロファージ J 774— 1を RPMI— 1 640培地（1 0%FCS含 有)（シグマ社製)で培養し、 アツセィ時には RPMI - 1640完全培地（1 %B S A 含有)で洗浄後、 1 x 1 06cells/m 1に調製した。
ii)マクロファージ走化性の測定は、本発明者らが先に報告した方法 (Int. J. Food Microbiol., 77, 29- 38, (2002))に従い行った。すなわち、試料を RPMI - 1 640完 全培地で 2倍希釈し、 48— well microchemotaxis chamber (二ユーロ プロ一ブ社製） の下部 wellに 28 1づっ入れた（3連）。 この上に 25 x 80腿、 5.0〃111の？¥ PF膜 (ニューロ プローブ社製)を載せた後、ゴムのガスケット、蓋を順に載せてねじ で止め、上部の wellにマクロファージ懸濁液を 50 1づっ分注した。 5%C〇2、 37°Cで 2時間培養後、 PVPF膜の表側、つまり細胞を播いた側を PB S (ォキソィ ド社製)で洗浄し、フィルターワイパー（ニューロ プローブ社製)で細胞をぬぐいとり、 フィールド染色液 (武藤化学薬品社製)により P V P F膜をギムザ染色した。 顕微鏡下 (倍率 200倍)で遊走したマクロファージ数を試料当たり 10視野計数し、 平均遊走 数 (high power field； HP F)を算出した。
4. ヒト末梢血モノサイ卜の走化性の測定
(1)ヒト末梢血からのモノサイ卜の分離
へパリン採血した血液 100 m 1を、 HISTOPAQUE— 1077(シグマ ダイァグノステ イツクス社製）を 15 m 1分注した 50 m 1のチューブに 25mlずつ重層し、遠心分 離（1500 r pm、 3 Omin、 20°C)した。単核球層を回収した後、 PB Sを多量に 加えて遠心洗浄（1500 r pm、 5min、 4。ひし、同様の操作を 3回行った後に生細 胞数を計数した。次いで 5 mM EDTA (フロー ラボラトリ一社製 )ヽ 0.5 %B S A (シグマ社製)を含む PBSで 1/20に希釈したピオチン標識マウス抗ヒトー CD 1 1 b抗体（フアルミンゲン社製)を 100〃 1加え、 4。Cで 30分間反応させた。 PB S(5mM EDTA.O.5%B S A含有）を 1.5mlを加え遠心洗浄して上清を除去 した後に、 P B S ( 5 mM、 0.5 %B S A含有） 90〃 1、 MACS streptavidin microbeads(Miltenyi Boitec GmbH社製）を 10 1加え 4。Cで 15分間反応させた。 PBS(5mM EDTA、 0.5 %B S A含有)で洗浄した後、 PBS (5mM EDT A、 0.5 %B S A含有） 500 ^ 1に懸濁し、 magnetic cell separation system (以 下、 「MACS」と称する） （Miltenyi Biotec GmbH社製）により MiniMACS力ラム（ R S +、 Miltenyi Biotec GmbH社製） に吸着した細胞（モノサイト） を分離した。 分離したモ ノサイトは生細胞数を計数した後、上記 3.マクロファージ走化性試験（ 2 )の方法に準 じモノサイ卜走化性を測定した。
( 2 )ヒト末梢血モノサイトの純度検定
上記（1)に従い分離したヒト末梢血モノサイ卜の純度は FACS Calibur™ flow cytometerCFACS；べクトン ディキンソン社製）により検定した。 すなわち、 MACSによ り分離したモノサイトに、 FACS washing buffer ( 2%FCSヽ 0.02%NaN3/PB S)を 1 m 1加えピベッティングにより洗浄後、 遠心分離（3200 r pm、 3minヽ 4。C)により上澄液を除去した。この操作を 3回繰り返した後、ピオチン標識マウス抗 ヒト CD 11 bMAC— 1抗体（ファーミンゲン社製）を 10 β 1加え遮光して 4°Cで 15分間反応させた。 これに FACS washing buf f er( 2 % F C S、 0.02%NaN3/ P B S )を 1 m 1加えピベッティングにより洗浄後、遠心分離（ 3200 r p m、 3 min、 4 °C)により上澄液を除去した後、 R-Phycoerythrin標識ストレブトアビジン（夕一ゴ社 製）を 1 0 β 1を加え、 遮光して 4°Cで 1 5分間反応させた。 これに FACS washing bufferを lm 1加え洗浄後、遠心分離（3200 r p m、 3min、 4 °C)により上澄液を 除去し、 Sheath液（500〃 1 )を加えよく懸濁させた。これを 20 /ζιιιのナイロンメッ シュに通した後に、 FACSによりヒト末梢血モノサイトの純度を検定した。
( 3 )ヒト末梢血モノサイトの走化性の測定
ヒト末梢血モノサイトの走化性は、 試験試料として限外濾過 (上記 1.ペプチド調 整（2))で得た画分を RPMI _ 1640完全培地（ 1 % B S A含有）で 1 m gZ'm 1 の濃度となるように希釈したものを用い、 48 - well microchemotaxis chamberを用 いて、 上記 3.マクロファージ走化性試験（ 2 )に従 、測定した。
5. /3—カゼインのァクチナ一ゼ Eによる分解物におけるマクロファージ走化性 誘導の,柽時的変化
1 0111!^の〇 &〇 12を含むトリス—塩酸緩衝液に /3—カゼインを溶解し、ァクチ ナーゼ Eを加えて 5 % C 02、 37 °Cで 1、 3、 6、 12、 24時間反応後、 CENTRIPREP 3により限外濾過（3000 r pm、 4°C)を行い分子量 3000以下の画分を得た。 これらの画分に対するマクロファージ走化性を、 4 8 - well microchemotaxis chamber を用いて、 上記 3.マクロファージ走化性試験（ 2 )に従 ヽ測定した。
6 . 高速原子衝突質量分析法 (FAB- MS)によるべプチドの分子量測定
溶媒にはイオン交換水、 およびマトリックスにはグリセ口一ノレを選択した。 上記 1 .ぺプチド調整（ 5 )において得た画分は POSITIVEモ一ドおよび低分解能の各種条件 下で、 高速原子衝突質量分析法（fast atom bombardment-mass spect皿 etryヽ 以下 「FAB- MS」 と略す）により、 試料の分子イオンピーク（M+)の検出測定を行った。 測定 機種は、 高性能二重収束質量分析計 J M S - 7 0 0 (日本電子株式会社製)を用いた。
7 . プロティンシーケンサ一によるべプチドのアミノ酸配列分析
上記 1 .ぺプチド調整（ 5 )において得た画分を、 P V D F膜に疎水的に結合させた。 分離カラムには、 P T H- C 18カラム（2 · 1 X 2 2 0 mm；パーキン エルマ一社製）を用 い、プロテインシーケンサー（model 4 9 0 Procise ;パーキン エルマ一、アプライド バイオシステム社製）により、アミノ酸配列分析を行った。 また、溶媒 A 3 ( 3 . 5 %テ トラヒドロフラン水溶液 (パーキン エルマ一社製)）、溶媒 B (ァセトニトリルおよびィ ソプロピルアルコール混合液 (パーキン エルマ一社製)）などを含む 1 4 0 Cマイクロ クラジェン卜送液システム ( 1 4 0 C microgradient delivery system；ァァライド バイオシステム社製） に必要な関連試薬は、アプライド バイオシステム社指定品を使 用した。
8 . 活性画分によるチェッカーボード解析
マクロファージ走化性因子が、 chemokinetic factor (活性化物質により細胞の運 動がァトランダムに激しくなる、 方向性なし）であるのか、 もしくは chemotactic factor (方向性がある）であるのかを確認するために第 9図に示すような方法でチェッ カーボ一ド解析を行つた。すなわち、 Chemotaxis chamber下部の wellに上記 1.ぺプチ ド調整（5)において得た活性べプチドを様々な濃度に希釈したものを入れ、 上部の wellに走化性因子の希釈液で作つた細胞懸濁液を入れた。次 、で、上記 3.マクロファ ―ジ走化性試験（ 2)に準じてマクロファージの走化性を測定した。
9. レーザー顕微鏡によるマクロファージ細胞内 Ca2+流動性（C a flux)の測定 マクロファージ懸濁液（ 1 x 106cells/m I )を 100 1、 Non-Coat 35 mM Dish (松浪硝子工業 (株)製）の中央に入れ、 RPM I— 1640 (10 %FC S含有）を 加えてドロップを作り、 これを 5%C02、 37°Cで 24時間インキュベートする。 マクロファージが Dishの底面に接着している事を確認し 5 % F C Sを含む R PMI - 1 640で 2回洗浄後、再び 5%FC Sを含む RPM 1 - 1640でドロップを作る。 次に、ジメチルスルホシキド（DMSO、和光純薬ェ業(株)製)で溶解したFluo-3AM(0. 8 mM)を 5 z 1ずつ添加し、 5%C02、 37 °Cで 1時間インキュベート後、 RPM 1 - 1 640完全培地で 2回洗浄し、 RPMI— 1640完全培地で再度ドロップを 作った。 C a fluxの測定にはレーザ一顕微鏡を用い、 Fluo- 3 AM強度が安定したとこ ろで、次の 10. C aイオン濃度の測定法と同様に調製したィオノマイシン、 EGTA、 f ML Pまたは上記 1.ぺプチド調整（ 5；)において得た活性画分を 5 β 1入れて輝度 の変化をグラフ化した。
10. マクロファージ中の C aイオン濃度の測定
( 1 )マクロファージへの蛍光色素の取り込み
マクロファージ懸濁液（ 1 X 1 06 cells/ml) 1 m 1に、 0.8 mMの Fluo - 3
A (Molecular Probes社製）を 5 z 1添加し、 30分間 37 °Cの恒温槽でィンキュベー シヨンした。 その後遠心分離（ 1500 r p m、 5min、 4 °C)し、上澄液を除去後 5 % FCSを含む RPMI - 1640を 1 m 1加えて再懸濁した。
( 2 )ネガティブ試料とポジティブ試料の測定
ネガティブ試料の測定；インキュベーションした細胞懸濁液を FACSにセッ卜し、 1 0秒ほど取り込みを行った後、 いったん取り外して、 RPMI— 1640で溶解し た 6 mMの: EG T A (和光純薬工業 (株)製)を 500〃 1添加し、 すばやくセッ卜し直 した。 この作業の間、 データ取り込みは続けたままにした。
ポジティブ試料の測定；ィンキュベ一ションした細胞懸濁液を FACSにセットし、 1 0秒ほど取り込みを行った後、 いったん取り外して、 DMSOで溶解した 700〃 Mのィオノマイシン（シグマ社製)を 10〃 1添加し、 すばやくセットし直した。 この 作業の間、 デ一夕取り込みは続けたままにした。
(3)サンプノレデータの測定
上記 1.ぺプチド調整（5)において得た活性画分を 2 X 1 Q-lM, 2 X 1 0—2M、 2 x 1 0— 3Mに段階希釈し、 f MLPは 2 X 1 0— 3M、 2 x l O—4M、 2 x l 0—5Mに段 階希釈した。 インキュベーションした細胞懸濁液を FACSにセッ トし、 1 0秒ほど取り 込みを行った後、 いったん取り外して、 各濃度のサンプルを 1 0 1添加し、 すばや くセットし直した。 この作業の間、 データ取り込みは続けたままにした。
1 1. 試験結果
( 1 )酵素分解により生じたぺプチドに対するマクロファ一ジ走化性
/3—カゼインを 7種類の酵素 —キモトリブシン， ペプシン， サーモリシン， ト リブシン， プロテアーゼ Κ, ァクチナーゼ Ε, パパイン）で分解して生じたペプチドに 対するマクロファージ走化性を、 48— well microchemotaxis chamberを用 、て測定 した。 ギムザ染色法で P VP F膜を染色したところ、 コントロールである未分解の /3 —カゼインのみの場合と比べて、 プロテア一ゼ 、 ァクチナ一ゼ Eおよびハ°パインに よる分解物がかなり濃く染色された (第 1図)。
これを光学顕微鏡を用いて倍率 2 0 0倍で一視野あたりの遊走細胞数を力ゥント したところ、 コントロールと比べて、 プロテア一ゼ K：、 ァクチナ一ゼ Eおよびパパイ ンによる分解物においてそれぞれ、約 6. 8倍、 4. 3倍、 4. 0倍多く遊走し、有意な 差が認められた (第 2図）。 なお、 第 2図中、 C、 Sはそれぞれ酵素未消化物、 酵素消 化物を示し、 *印は 5 %の有意水準で、 * *印は 1 %の有意水準で有意差があつたこ とを意味する。 また、 結果は H P F 1 0視野中の平均細胞数である。
( 2 )限外濾過による各種酵素分解生成べプチドのマクロファージ走化性
( i ) 8—力ゼィンを各種酵素で分解したときに生成するぺプチドを、 CENTRIPREP3 を用いて限外濾過し、 分子量 3 0 0 0以下の画分のみを回収した。 この低分子べプチ ドと限外濾過前のぺプチドを SDS- PAGEに供した結果をそれぞれ第 3図 B、 第 3図 Aに 示す。 各図 1、 1 0は分子量マ一力一、 2は α—キモトリブシン消化物、 3はぺプシ ン消化物、 4はサ一モリシン消化物、 5はトリプシン消化物、 6はプロテア一ゼ Κ消 化物、 7はァクチナ一ゼ消化物、 8はパパイン消化物、 9は未消化の^—カゼインに ついて示す。 α—キモトリプシンとトリプシンによる分角生成べプチドのバンドは、 限外濾過後に極端に減少していた。 また、 ァクチナ一ゼ Εによる分解生成ペプチドの バンドは限外濾過の前後のどちらも検出されなかった。
(ii)各種酵素分解べプチドの分子量 3 0 0 0以下の画分について、 マクロファー ジ走化性を測定したところ、 コントロールと比べて、 プロテア一ゼ 、 ァクチナ一ゼ Eおよびパパインによる分解物においてそれぞれ約 5. 5倍、 5. 8倍、 5. 1倍の H P F値を示し、 遊走マクロファージ数に有意な差力認められた (第 4図)。 なお、 第 4図 中、 *印は 5%の有意水準で有意差があったことを意味する。 また、 結果は HPF 1 0視野中の平均細胞数である。
(3)ヒト末梢血由来モノサイトの^一カゼイン由来べプチドに対する走化性 上記（ 1 )( 2 )に示したように酵素分解物べプチド成分による走化性の誘導がマウ ス由来のマクロファージに対して認められた。 次に、 ヒト由来のモノサイトに対する 走化性を、 上記 4.ヒト末梢血モノサイ卜の走化性の測定法に従って検討した。
HISTPAQUEにより末梢血から分離された単核球のうち、モノサイトは 22.6%であり、 さらに Magnetic Cell Separation SystemCMA C S )による磁気細胞分離法により分離 したモノサイトは、 FACSCaliburTMflowcytometerによる解析で約 97.5%であるこ とを確認した (第 5図 A)。 ギムザ染色法により P VP F膜を染色し、光学顕微鏡によ り倍率 200倍で遊走したモノサイト（第 5図 B：ァクチナ一ゼ Eによる場合を示す） をカウントしたところ、 コントロールである未分解の /3_カゼインのみの場合と比べ て、 パパインとァクチナ一ゼ Eによる分解物に有意差が認められた力、ノ、。パインによ る分解物がコントロールの約 1.9倍のモノサイトを遊走させたのに対して、ァクチナ —ゼ Eによる分解物はコントロールの約 3.3倍と、最も強い走化性カ認められた（第 5図 C)。 なお、 第 5図 C中、 *印は 5%の有意水準で有意差があったことを意味す る。 また、 結果は HP F 10視野中の平均細胞数である。
(4)ァクチナ一ゼ Eによる分解べプチドにおけるマクロファージ走化性誘導の経 時的変化
上記（1)〜（3)の結果から、 マウス由来のマクロファージとヒト由来のモノサイ 卜の両方に対して走化性べプチドを誘導する効果的な酵素は、 ァクチナーゼ Eである ことが判明した。 そこで、 ァクチナ一ゼ Eによる分解ペプチドにおける走化性誘導の 経時的変化を調べた。 その結果、 第 6図に示すように、 3時間以上で遊走マクロファ ―ジ数に有意差が認められ、 3時間と 6時間では約 1 . 6倍、 1 2時間では約 2 · 5倍、 2 4時間では約 3 . 5倍のマクロファージが遊走し、走化活性は経時的に上昇する傾向 を示した。 これらの結果から、 /3—カゼインの分解にはァクチナーゼ Eが好ましく、 3 7 °Cで 2 4時間反応させるのがよいことが見出された。 以下においては、 この条件 で得られた消化物につ 、て試験を行つた。
( 5 ) ^—カゼイン由来べプチドの各分画ステップにおける回収率とマクロファー ジ走化性試験
β _カゼィン由来べプチドを分画するために、 ァクチナ一ゼ Εによる処理物（ 3 7 °C、 2 4時間反応物）について、 限外濾過、 C 18逆相クロマトグラフィーを行った。 それぞれの分画後の回収率を表 2にタンパク含量（％)で示し、 各画分の走化性も測定 した (表 2 )。 その結果、 限外濾過による活性の低下は見られず、 またその後に行った C 18逆相クロマトグラフィーから得られた画分では 3 0 %ァセトニトリル、 6 0 %ァ セトニトリル溶出画分にマクロファージ走化性因子が存在する事が分かった。 しかし ながら、 6 0 %ァセトニトリル溶出画分は収量が 1 . 8 %と非常に低く、それよりもァ セトニトリル濃度が低い 3 0 %ァセトニトリル溶出画分を用いるのが好ましいと判断 された。 【表 2】
収 率 (%) 走化性活性（cells/HPF) 画 分
(タンパク） ( 1 m g/ m 1 ) 全体 100 135 ± 24
限外濾過（濾過分） 86.5 134 ± 14
逆相クロマトグラフィ
素通り画分 30.4 0
吸着画分（溶出溶媒）
ィォン交換水 28.8 0
30 %ァセ トニトリノレ 25.9 106 ± 7
60 %ァセ トニト リノレ 1.8 189 ± 14
90 %ァセトニトリル 0.4 21 ± 3
( 6 )陽イオン交換クロマトグラフィーによる活性べプチド成分の分画とマクロフ ァ—ジ走化性試験
C18逆相ク口マトグラフィ一により得られた 30 %ァセトニトリル溶出画分を陽 イオン交換クロマトグラフィーに供した。その結果、 リン酸塩緩衝液（pH 6. 0)によ る陽ィォン交換クロマトグラフィ一ではほとんどすべてが力ラム素通り成分であり、 それぞれのフラクションについてマクロファージ走化性を 48- well microchemotaxis chamberを用いて測定したところ、カラム素通り画分に走化性が認められた（図示せず) c (7)陰イオン交換クロマトグラフィーによる活性べプチド成分の分画とマクロフ ァージ走化性試験
C 18逆相ク口マトグラフィ一により得られた 30 %ァセトニトリル溶出画分を陰 イオン交換クロマトグラフィーに供した。 その結果、 トリス—塩酸緩衝溶液（pH 8. 2)による陰イオン交換クロマトグラフィーではカラム吸着画分の 2つピークとカラ ム素通り画分とに分離した (第 Ί図上段)。 それぞれのフラクションについてマクロフ ァ―ジ走化性を 48-well microcheraotaxis chamberを用いて測定したところ、 陰イオン 交換ク口マトグラフィ一の素通り画分と吸着画分の最初のピークには有意な活性が認 められなかったのに対し、 吸着画分の 2つ目のピーク：フラクションナンバー（F.N.) 42〜46に走化性が認められた (第 7図下段)。 以下、 このフラクションナンバー 4 2〜46の画分を Q画分と称する。
( 8；)高速液体クロマトグラフィー（HPLC)による活性成分の分析および単離 ·
C18逆相ク口マトグラフィ一で得られた 30 %ァセトニトリル溶出画分と Q画分 を RP—HPLCに供した。 その結果、 30%ァセトニトリル溶出画分からマルチな ピークが検出された (第 8図 A上段)。一方、 Q画分からは主に 3成分 (溶出時間の早い 順に Ql， Q 2および Q 3)が検出され、 その割合は Q 1が 90.7 %、 Q2と Q3が 4.0%であった (第 8図 A下段)。 それぞれの画分を分取、 単離後、 走化性の測定を行 つた結果、 Q 2と Q 3に関しては収量が少なかったために測定には至らなかったが、 Q 1は Q画分とほぼ同程度の活性が認められた (第 8図 B )0
( 9；)高速原子衝突質量分析法 (FAB- MS)によるべプチドの分子量測定
高速液体クロマトグラフィーにより分取した Q 1、 Q2、 Q3の分子量を測定し たところ、 それぞれ 604、 523、 751であった。
(10)Q1、 Q2、 Q 3のアミノ酸配列分析
高速液体クロマトグラフィーにより分取した Ql、 Q2、 Q3についてプロティ ンシーケンサ一によってアミノ酸分析を行った。 これにより、
Q 1 ： Tyr-Pro-Val-Glu- · · ·
Q 2 ： Glu-Met- · · · Q 3 ： Tyr - Pro - X— Glu— · ， ·（X =読解不可能）
という配列カヾ得られた。
さらに、 N末端アミノ酸配列と分子量から、 ^—カゼインの配列と照らし合わせた ところ、 Q l、 Q 2、 Q 3は、 以下に示すように、 ；5—カゼインの 1 0 8〜1 1 9残 基由来のペン夕、 テトラ、 へキサペプチドであることが同定された。 この 3つのぺプ チドの等電点はいずれも 3〜4の値を示し、 そのため陽イオン交換カラムには吸着し なかったと考えられる。
Q 1 ： Tyr-Pro-Val-Glu-Pro( 1 1 4〜； L 1 8残基 M. W. = 6 0 3. 6：配 列番号 1で示される）
Q 2 ： Glu-Met-Pro-Phe( 1 0 8〜； 1 1 1残基 M. W. = 5 2 2. 6 ：配列番 号 3で示される））
Q 3 ： Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe( 1 1 4〜： 1 1 9残基 M. W. = 5 2 2. 6 ：配列番号 2で示される）
なお、 yS—カゼインは不均一性を示すことが知られており、 1 1 7残基目が Gin であるものと 1 1 7残基目が Gluであるものとがあるが、得られた Q 1、 Q 3は、 1 1 7残基目が Gluである ^—ぺプチド由来のものであった。また、収量の多かった Q 1に ついて、 その活^を測定したところ、 H P L C分取後においてもマクロファージ走化 性活性を失わなかった。 走化性活性 (誘導能)の発現には夕ンパク質の高次構造が深く 関与すると考えられており、 H P L C分取すれば高圧によりタンパク質の高次構造が 破壊されるため走化性誘導能を失うという見解もあるが、 得られたぺプチドは 5つの アミノ酸力、らなるペンタぺプチド（Y P V E P )であって、 立体構造が変化しにくかつ たために活性を失わなかつたものと考えられる。 ( 1 1 ) /3 _カゼイン由来マクロファ一ジ走化性ぺプチドのチヱッカーボ一ド解析 Q 1による活性が、 化学運動性によるものか、 走化性によるものかを確認するた めにチェッカ一ボード解析を行った。 その結果、 上部 wellのペプチド濃度が下部 well よりも高いときは、ほとんどマクロファージの遊走が認められなかつた。これに対し、 下部 wellのべプチド濃度が上部 wellよりも高いときには、 1 H P Fあたり 1 9から 1 2 0もの多くのマクロファージが遊走していることが確認できた (第 9図）。 このこと から、 このべプチドはマクロファージに対して走化性を誘導することが確認された。
( 1 2 )マクロファージの細胞内 C a 2+流動性（ C a flux)
まず初めに、〇 &ィンジケ一タ一{^1110- 3 ¾0を用ぃて、 レーザー顕微鏡により細 胞内 C a 2t流動性を測定した。 強力な走化性べプチドとして知られている f M L Pが、 Q 1のコントロールとして用いられた。 最近になって、 そのレセプ夕一が 7回膜貫通 型であったことが明らかにされたためである。 マクロファージにおけるその活性化機 構は、 レセプターに走化性因子が結合すると、 イノシトールリン酸の代謝を介して C aイオンが貯蔵器官から放出され、 シグナリングによって M a c Iのような接着因子 が活性化されて、 遊走を開始すると考えられる。 そして、 近年、 ケモカインに代表さ れる走化性因子は、 Gプロティン関連の 7回膜貫通型レセプ夕一を介し活性を発現さ せることが明らかにされた。 この測定から、 走化性ペプチド Q 1には、 濃度依存的に C a fluxが認められ、 1 X 1 0—3M濃度で顕著なピークが得られた (第 1 0図下段左 図）。一方、コントロールとして用いた f M L Pはまったくピークが認められなかった (同図下段右図)。 そこで、 実際に細胞質内 C a濃度をフ口一サイトメ トリ一により測 定したところ、 計算式から細胞内 C a濃度は、 Q 1で刺激した細胞の細胞内 C a濃度 のみが高く約 6 2 0 n Mで、 f M L Pは約 1 7 0 n Mとコントロールと同程度であり、 レ一ザ一顕微鏡によるデータを支持するものであり（第 1 1図)、 /3—力ゾケモチドは、 f M L Pとは異なるレセプ夕一を介してマクロファージに作用するものと考えられる c 以上の実験結果より、 ァクチナ一ゼ Eによる分解生成ペプチド群のうち、 分子量 3 0 0 0以下の画分が、 マウス由来マクロファージとヒト末梢血モノサイ卜の両者に 対して強 、走化性を示し、 未分解 /3—カゼインと比べるとマクロファージに対して約 5 . 8倍、 ヒトモノサイトに対して約 3. 3倍の細胞数力遊走した。 し力、し、 このぺプ チド群は SDS- PAGEで検出することができなかった。 これは、 ァクチナ一ゼ Eが、 各種 の基質に対して強力な加水分解力を有しているため、 夕ンパク質の各種のぺプチド結 合に作用し、 その結果夕ンパク分解産物としてべプチド成分にとどまらず多量の遊離 アミノ酸を産出するという特性を持ち、 上記実施例においては、 /3—カゼインがァク チナ一ゼ Eによって非常に低分子のぺプチドかアミノ酸レベルにまで分解され、 ゲル を通過してしまったためと考えられる。
マクロファージの細胞内 C a 2+流動性（C a flux)に与える影響について、強力な 走化性べプチドとして知られている f M L Pをコントロールとして測定したところ、 本発明に係るペプチドは、 f M L Pとは異なる流動性が認められた。 α—カゼインが f M L Ρと同じレセプターを認識する可能性を示唆する報告もあるが、 その走化性べ プチド配列に関する知見や、 f M L Pと異なるレセプ夕一を介して走化性を発現する という報告もなく、 本発明のペプチドは、 マクロファージの走化性を亢進する新規な 誘導因子であると言える。
また、本発明の^一力ゾケモチドは、 5つのアミノ酸からなるペン夕ペプチド（Y P V E P )であるので、立体構造が変ィ匕しにくく、高圧が負荷される H P L C分取によ つても走化性誘導能を失うことなく容易に分取できるものである。 β一べプチドの' 1 1 3残基 (Lys) - 1 1 4残基 (Tyr)の結合がペプシンおよびトリ プシンで切断され、 1 1 9 (Phe) - 1 2 0 (Thr)の結合がキモトリブシンで切断され ることが明らかにされている（Yunden Jinsmaaら， Peputides, 20, 957— 962(1997))。 したがって、 本発明のペプチド、 /3—力ゾケモチドは、 それよりも短いのでこれ以上 の酵素分解を受けないものと推定され、 経口投与に十分利用しうるものである。
また、 古くから大きな関心事である牛乳アレルギーを引き起こすアレルゲン中に このペプチドと同じ配列を持つものはない。 各種の走化性因子を用いてラットに皮下 注射をしたところ、 f M L Pではすぐに炎症反応を起こして、 好中球が多く集まって きたのに対して、 /3—力ゼィンではそれほど急激な反応が見られなかったことも知ら れており、 本発明のペプチドは生体にとって有害な物質ではないと考えられる。
このように当該ペプチドは、 マクロファージの走行性を誘導し、 免疫賦活機能を 発揮する新規ペプチドである。 これを食品成分として有効に利用するためには、 該ぺ プチドを食品中に添加したり、 食品中の /3—カゼインをァクチナ一ゼ Eなどの消化酵 素により消化させるのがよい。 また、 あらかじめ /3—カゼインの 1 1 8— 1 1 9残基 結合を、例えば食品添加物として厚生労働省から認可されているァクチナ一ゼ A S (例 えば科研製薬 (株)製)で分解しておき、摂取したこれらの分解物の消化によって該ぺプ チドを生成させることもできる。
産業上の利用可能性
本発明は、 マクロファージ走化性を亢進する新たな新規ペプチドを提供する。 こ のペプチドは、 乳製品を始めとする食品に含まれている ^—カゼインをァクチナ一ゼ Eなどの夕ンパク消化酵素により分解することで得られるので、 非常に安全性の高い ものである。 そして、 当該ペプチドを直接利用しあるいは消化管内で当該ペプチドを 生じやす 、ようにあらかじめ食品を酵素処理することで、 食品由来成分の免疫賦活化 機能を利用した新たな機能性食品が提供される。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 1で示される次のァミノ酸配列からなる新規べプチド。
Tyr-Pro-Val-Glu-Pro
2 . 配列番号 1で示される次のァミノ酸配列を有するぺプチドを有効成分とする免疫 賦活剤。
Tyr-Pro-Val-Glu-Pro
3 . 配列番号 1で示される次のァミノ酸配列を有するぺプチドを免疫賦活剤として使 用する用法。
Tyr-Pro-Val-Glu-Pro
4 . マクロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量の β—カゼィン消化物を含有 する機能性食品。
5 . マクロファ一ジ走化性誘導能を実質的に発揮する量の配列番号 1で示される次の ァミノ酸配列を有するぺプチドを含有する機能性食品。
Tyr-Pro-Val-Glu-Pro
6 . 生体内の消化酵素がマクロファ一ジ走化性誘導能を実質的に発揮する量の配列番 号 1で示される次のアミノ酸配列を有するぺプチドを生じさせる程度に、 食品中の /3 一カゼイン 1 1 8— 1 1 9残基結合が消化酵素により切断されている機能性食品。
Tyr-Pro-Val-Glu-Pro
7 .マクロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量のぺプチドが含まれるように、 食品中の ^—カゼィンを消化酵素により処理する工程を有する機能性食品の製造方法。
8 . 前記ペプチド中に、 配列番号 1で示される次のアミノ酸配列を有するペプチドが 含まれる請求の範囲第 7項に記載の機能性食品の製造方法。 Tyr-Pro-Val-Glu-Pro
9 . 生体内の消化酵素がマクロファージ走化性誘導能を実質的に発揮する量の配列番 号 1で示される次のアミノ酸配列を有するペプチドを生じさせる程度に、 食品中の^ 一力ゼィン 1 1 8— 1 1 9残基結合を消化酵素により切断する工程を有する機能性食 品の製造方法。
Tyr-Pro-Val-Glu- Pro
1 0 . 前記消化酵素は、 ァクチナーゼである請求の範囲第 7項または第 9項のいずれ かに記載の機能性食品の製造方法。
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